JP2010154805A - 水溶性多糖類からバイオエタノールを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物作用により、水溶性多糖類の糖化と、C5糖/C6糖並行アルコール発酵とを行い、バイオエタノールを生成する。
【選択図】なし
Description
(1)水溶性多糖類からバイオエタノールを製造する方法であって、
微生物作用により、水溶性多糖類の糖化と、C5糖/C6糖並行アルコール発酵とを行い、バイオエタノールを生成する工程を含んでなる方法。
(2)水溶性多糖類が森林バイオマス由来である、第1項に記載の方法。
(3)水溶性多糖類がカラマツ及び/又はクマザサ由来である、第2項に記載の方法。
(4)水溶性多糖類がアラビノガラクタン及び/又はキシログルカンである、第1〜3項のいずれかに記載の方法。
(5)ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)由来のβ−グルコシダーゼを用いて水溶性多糖類の糖化を行う、第1〜4項のいずれかに記載の方法。
(6)黒麹黴を用いて水溶性多糖類の糖化を行う、第1〜5項のいずれかに記載の方法。
(7)β−グルコシダーゼ産生能を有するアルコール発酵酵母を用いて、水溶性多糖類の糖化及びアルコール発酵を行う、第1〜6項のいずれかに記載の方法。
(8)β−グルコシダーゼ産生能を有するアルコール発酵酵母が、β−グルコシダーゼ遺伝子でサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC7323を形質転換した株である、第7項に記載の方法。
(9)カンジダ・アラビノ・フェルメンタス(Candida arabino fermentans)JCM10727T及び/又はカンジダ・シャハタエ・シャハタエ変種(Candida shehatae var. shehatae)JCM9840Tを用いてC5糖アルコール発酵を行う、第1〜8項のいずれかに記載の方法。
(10)ザイモモナス・モビリス・モビリス亜種(Zymomonas mobilis subsp. mobilis)NBRC13756を用いてC6糖アルコール発酵を行う、第1〜9項のいずれかに記載の方法。
森林バイオマスから水溶性多糖類を効率的に抽出する手法の検討を行った。
まず、森林バイオマスとしてカラマツ芯材を用い、水溶性多糖類であるアラビノガラクタンの抽出を試みた。
(1)振盪抽出液〔振盪機(IUCHIPI301型)を用いて、室温で5時間振盪後、1.3krpmで5分間遠心分離して得られた上清液〕
(2)ストマッカー抽出液〔ストマッカー(オルガノBA6021型)を用いて、室温で1時間ホモゲナイズ後、(1)と同様に遠心分離して得られた上清液〕
(3)ミキサー抽出液〔ミキサー(ZOJIRUSHI BM−FG08型)を用いて,室温で5分間ミキシング後、(1)と同様に遠心分離して得られた上清液〕
(4)スターラー抽出液〔スターラー(ADVANTEC SR500型)を用いて,室温で5分間攪拌後、(1)と同様に遠心分離して得られた上清液〕
(5)攪拌機器を用いずに調製した抽出液〔10分おきに1回、ガラス棒で1分間の攪拌処理を1時間にわたって加えた後、(1)と同様に遠心分離して得られた上清液〕
試験管にサンプル(上記(1)〜(5)のカラマツ抽出液)100μLをとり、これに5%フェノールを0.5mL加えてよく混合し、得られた溶液に濃硫酸2.5mLを勢いよく注入した。サンプル中に糖が存在する場合には黄〜茶褐色となる。490nmの吸光度を測定し、標準物質にガラクトースを用いて同様にして得られた検量線に基づいて、サンプル中の全糖濃度を算出した。検出限界は0.01mg/mLである。
森林バイオマス由来水溶性多糖類が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属(ビフィズス菌)由来のβ−グルコシダーゼによってどの程度、加水分解されるかについて確認した。まず、β−グルコシダーゼ活性の強い優良なビフィドバクテリウム属のスクリーニングを行った。その結果を表4に示す。表4から明らかなように、B.ブレビ(B. breve )JCM1273が強い活性を有することが明らかになった。
植物系バイオマス多糖にはグルコースやガラクトースなどのヘキソース(C6糖と略す)に加えて、アラビノースやキシロースなどのペントース(C5糖と略す)が共存していることから、これらを同時に発酵させる技術(C5/C6並行発酵)の確立が求められる。本実施例では、C6糖発酵微生物の代表である酒母(サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2373)に加えて、エタノール生産細菌(ザイモモナス・モビリス・モビリス亜種(Zymomonas mobilis subsp. mobilis)NBRC13756)も利用した。また、バイオマスに含まれるアラビノースやキシロースといったC5糖を発酵するために、本実施例ではアラビノース発酵酵母(カンジダ・アラビノ・フェルメンタス(Candida arabino fermentans)JCM10727T)及びキシロース発酵酵母(カンジダ・シャハタエ・シャハタエ変種(Candida shehatae var. shehatae)JCM9840T、パチソレン・タノフィラス(Pachysolen tannophilus)JCM1633T、ピキア・セゴビエンシス(Pichia segobiensis)JCM10740T)を用いた。イースト・ニトロジェン・ベース(Yeast nitrogen base)にN源として硫酸アンモニウムを加え、これにアラビノース又はキシロースを5%(w/v)加えて30℃で2日間、静置培養した。
カビは好気性のため、これをそのまま発酵システムに用いることはできない。糖化能に優れた麹カビを用いて糖化酵素を大量に含む種麹(麹スターター)を調製する必要がある。そこで本実施例では、オートクレーブ(121℃、1.2atm、15分)滅菌した粒径1〜2mmのカラマツ芯材チップに黒麹黴(A. awamori NBRC 4388)胞子を噴霧したものを28℃で3日間培養して、カラマツ芯材種麹(麹スターター)を製造した。以下の酵母との並行複発酵では、森林バイオマス由来の水溶性多糖類にこの麹スターター及びアルコール発酵微生物を加え、糖化と発酵を同時に行なわせた。
ビフィズス菌B.ブレビ(B. breve)JCM1273由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を大腸菌に発現させ、組換え酵素を調製した。得られた組換えβ−グルコシダーゼのβ−グルカン分解スペクトラムを調べた。その結果を以下の表5に示す。表5から明らかなように、β1→2、β1→3、β1→4のいずれのベータ結合でも、50%以上の分解性を示すことが明らかになった。また、基質特異性にはバラエティーがあり、pNP−β−D−ガラクトシドは約50%、pNP−β−D−キシロシドは5%であった。
ビフィズス菌B.ブレビ(B. breve)JCM1273由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)の菌体外分泌ベクターであるpGAPαベクターのGAPプロモーター下流に導入してβ−グルコシダーゼ分泌ベクターを作成し、かかるβ−グルコシダーゼ分泌ベクターでサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC7323を形質転換することにより、β−グルカン糖化能を有するアルコール発酵酵母(形質転換サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae ON); NITE AP-682)を創出した。この組換え酵母を用いて、アラビノガラクタンを唯一のC源として含有する5%アラビノガラクタン培地〔イースト・ニトロジェン・ベース(Yeast nitrogen Base)W/O(Difco)1.7g、(NH4)2SO45.0g、アラビノガラクタン5g、水100mL〕で30℃、静置という条件下で5日間培養し、培養後の培養液を高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)で分析したところ、図2に示すように、エタノールの生産が確認された。
使用カラム:Shodex SH1011(昭和電工)
流速:1.0ml/分
検出器:RI-1530
溶出溶媒:0.01N H2SO4
水溶性森林バイオマス多糖の並行複発酵系におけるβ−グルコシダーゼ遺伝子組換え酵母の応用を検証すべく、上記項目1で得られたカラマツ抽出液(5)(攪拌機器を用いずに調製した抽出液)に対して、上記表1に示す微生物種の組合せを用いて糖化・発酵を行い、エタノール生産を試みた。糖化・発酵は、水溶性多糖類に対して上記表1に示す微生物種の組合せを加え、30℃、静置という条件下で5日間培養することにより実施した。培養後、培養液を高速液体クロマトグラフィー法(HPLC)で分析した。得られたHPLCチャートを図4に示す。図4から明らかなように、エタノールの生産が確認された。
使用カラム:Shodex SH1011(昭和電工)
流速:1.0ml/分
検出器:RI-1530
溶出溶媒:0.01N H2SO4
以上の実施例で検証した手法は、シラカバやカエデのように、水溶性多糖類を多く含有し、それらを容易に抽出できる可能性のある樹種に対しても、そのまま適用することができることが予想される。
Claims (10)
- 水溶性多糖類からバイオエタノールを製造する方法であって、
微生物作用により、水溶性多糖類の糖化と、C5糖/C6糖並行アルコール発酵とを行い、バイオエタノールを生成する工程を含んでなる方法。 - 水溶性多糖類が森林バイオマス由来である、請求項1に記載の方法。
- 水溶性多糖類がカラマツ及び/又はクマザサ由来である、請求項2に記載の方法。
- 水溶性多糖類がアラビノガラクタン及び/又はキシログルカンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)由来のβ−グルコシダーゼを用いて水溶性多糖類の糖化を行う、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 黒麹黴を用いて水溶性多糖類の糖化を行う、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- β−グルコシダーゼ産生能を有するアルコール発酵酵母を用いて、水溶性多糖類の糖化及びアルコール発酵を行う、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- β−グルコシダーゼ産生能を有するアルコール発酵酵母が、β−グルコシダーゼ遺伝子でサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC7323を形質転換した株である、請求項7に記載の方法。
- カンジダ・アラビノ・フェルメンタス(Candida arabino fermentans)JCM10727T及び/又はカンジダ・シャハタエ・シャハタエ変種(Candida shehatae var. shehatae)JCM9840Tを用いてC5糖アルコール発酵を行う、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ザイモモナス・モビリス・モビリス亜種(Zymomonas mobilis subsp. mobilis)NBRC13756を用いてC6糖アルコール発酵を行う、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101235289B1 (ko) | 2011-01-24 | 2013-02-20 | 건국대학교 산학협력단 | 김치유래의 베타 글루코시다아제 생산 신규한 효모 사카로마이세스 서바지 ku 244 균주 |
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