JP2010057402A - Method of controlling flowering time of plant - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of controlling flowering time of transgenic plants on a basis of copper ion dependence by inducing the expression of an exogenous gene involved in the control of flowering time, using an inductive system which may induce the expression of exogenous gene with high inducibility. <P>SOLUTION: A gene structure contains a base sequence which encodes a transcriptional factor which is activated by copper ion and induces transfer of exogenous gene related to the control of flowering time of plants (provided that the transcriptional factor contains a DNA joint region of the first transcriptional factor activated by copper ion and a transfer activation region of at least one different transcriptional factor from the first transcriptional factor). Copper ion is brought into contact with a plant to which the gene structure is introduced so that the flowering time of the plant can be controlled. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、化学物質による植物の開花時期制御方法等に関するものである。   The present invention relates to a method for controlling the flowering time of a plant using a chemical substance.

植物の開花時期は、通常、品種特有の内的要因の他、日長時間や気温、栄養状態などの外的要因により決定される。このため、植物の開花時期を制御するためには、現状、環境を調節できる特別な施設を利用する必要があり、光照射装置や温度調節装置等の設備費及び照明費や空調費等、コスト面の問題がある。また、品種により播種時期や栽培地が限定され、生産性の向上に大きな障害となっている。   The flowering time of plants is usually determined by internal factors specific to the variety, as well as external factors such as day length, temperature, and nutritional status. For this reason, in order to control the flowering time of plants, it is currently necessary to use special facilities that can adjust the environment, such as equipment costs such as light irradiation devices and temperature control devices, lighting costs, air conditioning costs, etc. There is a problem with the surface. In addition, the seeding time and cultivation place are limited depending on the variety, which is a great obstacle to improving productivity.

近年、植物の開花時期制御に関わる遺伝子（例えば、非特許文献１参照）が多数同定され、これらの遺伝子を導入して開花時期を改変した形質転換植物が作製されている。それらの多くは恒常的に発現する構成的プロモーターを用いて開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現させたものである。   In recent years, many genes (for example, see Non-Patent Document 1) related to plant flowering time control have been identified, and transformed plants in which the flowering time is modified by introducing these genes have been produced. Many of them express foreign genes involved in flowering time control using constitutive promoters that are constitutively expressed.

開花時期制御に関わる外来遺伝子を誘導発現して形質転換植物の開花時期を制御するには、誘導倍率が高く厳密な制御が可能な誘導性システムが必要である。即ち、非誘導条件においては目的とする外来遺伝子の発現を低く抑え、誘導条件においては目的とする外来遺伝子の発現を活性化できる誘導性システムが必要である。誘導性システムのひとつとして知られている銅イオン誘導性システム（例えば、非特許文献２参照）は、誘導剤が安価で施用しやすく野外での使用が可能である。しかしながら、従来知られている銅イオン誘導性システムは、例えば非特許文献３に述べられているように、銅イオン誘導性システムは、非誘導条件における外来遺伝子の発現を十分に低く抑えることができない、誘導条件における外来遺伝子の発現が十分に活性化できない、誘導剤である銅イオンを高濃度で長時間処理する必要があり薬害が顕著となる等の問題があった。   In order to control the flowering time of a transformed plant by inducing and expressing a foreign gene related to flowering time control, an inducible system with a high induction ratio and capable of precise control is required. That is, an inducible system that can suppress the expression of a target foreign gene under non-inducing conditions and activate the expression of a target foreign gene under inducing conditions is required. A copper ion inductive system known as one of inductive systems (see, for example, Non-Patent Document 2) can be used outdoors because the inducer is inexpensive and easy to apply. However, as described in Non-Patent Document 3, for example, a conventionally known copper ion-inducible system cannot sufficiently suppress the expression of a foreign gene under non-induction conditions. However, there are problems that the expression of foreign genes under induction conditions cannot be activated sufficiently, copper ions as an inducer need to be treated at a high concentration for a long time, and phytotoxicity becomes remarkable.

Kobayashi Y et al、1999、Science 286、1960-1962Kobayashi Y et al, 1999, Science 286, 1960-1962 Mett VL et al、1993、Proc Natl Acad Sci 90、4567-4571Mett VL et al, 1993, Proc Natl Acad Sci 90, 4567-4571 Padidam M、2003、Current Opin Plant Biol 6、169-177Padidam M, 2003, Current Opin Plant Biol 6, 169-177

開花時期制御に関わる外来遺伝子を誘導発現して形質転換植物の開花時期を制御するには、誘導倍率が高く厳密な制御が可能な誘導性システムが必要である。本発明では、外来遺伝子を高い誘導倍率で誘導発現し得る誘導性システムを用いて、開花時期制御に関わる外来遺伝子を誘導発現させ、形質転換植物の開花時期を銅イオン依存的に制御する方法等を提供することを課題としている。   In order to control the flowering time of a transformed plant by inducing and expressing a foreign gene related to flowering time control, an inducible system with a high induction ratio and capable of precise control is required. In the present invention, by using an inducible system capable of inducing and expressing a foreign gene at a high induction ratio, a method for inducing and expressing a foreign gene involved in flowering time control and controlling the flowering time of a transformed plant in a copper ion-dependent manner, etc. It is an issue to provide.

本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．下記の遺伝子構築物が導入されてなる植物に銅イオンを接触させることを特徴とする前記植物の開花時期を制御する方法（以下、本発明誘導発現方法と記すこともある。）；
遺伝子構築物；
銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列を含有する遺伝子構築物。前記転写因子が銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する。：
２．銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前項１記載の方法：
３．銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項１〜２のいずれかに記載の方法：
＜転写因子群＞
（１）真核生物由来の転写因子
（２）酵母由来の転写因子
（３）酵母ACE1由来の転写因子
４．第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項１〜３のいずれかに記載の方法：
＜転写因子群＞
（１）ウイルス由来の転写因子
（２）シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
（３）単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
（４）単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写因子
５．開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする前項１〜４のいずれかに記載の方法：
＜外来遺伝子群＞
（１）植物由来の遺伝子
（２）被子植物由来の遺伝子
（３）双子葉植物由来の遺伝子
（４）アブラナ科植物由来の遺伝子
（５）シロイヌナズナ由来の遺伝子
（６）シロイヌナズナＦＴ由来の遺伝子
６．記の遺伝子構築物が、銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項１〜５のいずれかに記載の方法：
７．植物の開花時期を制御するための遺伝子構築物であって、
（ａ）銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子であって、前記転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前記転写因子をコードする塩基配列と、
（ｂ）前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現する遺伝子発現カセットと
を有するように構築可能に調製されてなることを特徴とする遺伝子構築物（以下、本発明遺伝子構築物と記すこともある。）：
８．銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域を含有する、前項７記載の遺伝子構築物：
９．銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項７又は８に記載の遺伝子構築物：
＜転写因子群＞
（１）真核生物由来の転写因子
（２）酵母由来の転写因子
（３）酵母ACE1由来の転写因子
１０．第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする前項７〜９のいずれかにに記載の遺伝子構築物：
＜転写因子群＞
（１）ウイルス由来の転写因子
（２）シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
（３）単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
（４）単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写因子
１１．開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする前項７〜１０のいずれかに記載の遺伝子構築物：
＜外来遺伝子群＞
（１）植物由来の遺伝子
（２）被子植物由来の遺伝子
（３）双子葉植物由来の遺伝子
（４）アブラナ科植物由来の遺伝子
（５）シロイヌナズナ由来の遺伝子
（６）シロイヌナズナＦＴ由来の遺伝子
１２．銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする前項７〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物：
１３．前項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換植物（以下、本発明形質転換植物と記すこともある。）：
等を提供するものである。 As a result of intensive studies under such circumstances, the present inventors have reached the present invention.
That is, the present invention
1. A method for controlling the flowering time of the plant, which comprises contacting a copper ion with a plant into which the following gene construct has been introduced (hereinafter also referred to as the induced expression method of the present invention);
Genetic constructs;
A gene construct containing a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. The transcription factor contains a DNA binding region of a first transcription factor activated by copper ions and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor. :
2. Transcription factors that are activated by copper ions and induce transcription of foreign genes involved in plant flowering time control are the DNA binding region and the transcriptional activation region of the first transcription factor activated by copper ions and the first The method according to item 1 above, which comprises a transcription activation region of at least one transcription factor different from the transcription factor:
3. The method according to any one of items 1 to 2, wherein the first transcription factor activated by copper ions is a transcription factor selected from the following transcription factors:
<Transcription factors>
(1) transcription factor derived from eukaryote (2) transcription factor derived from yeast (3) transcription factor derived from yeast ACE1 The method according to any one of items 1 to 3, wherein the transcription factor different from the first transcription factor is a transcription factor selected from the following transcription factors:
<Transcription factors>
(1) Transcription factor derived from virus (2) Transcription factor derived from virus belonging to the genus of simplex virus (3) Transcription factor derived from herpes simplex virus (4) VP16 transcription factor derived from herpes simplex virus The method according to any one of items 1 to 4, wherein the foreign gene involved in flowering time control is a foreign gene selected from the following foreign gene group:
<Foreign gene group>
(1) genes derived from plants (2) genes derived from angiosperms (3) genes derived from dicotyledons (4) genes derived from cruciferous plants (5) genes derived from Arabidopsis (6) genes derived from Arabidopsis FT The gene construct described above is a gene construct constructed by adding a promoter upstream of a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. The method according to any one of items 1 to 5, wherein:
7). A genetic construct for controlling the flowering time of a plant,
(A) A transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control, wherein the transcription factor is a DNA binding of a first transcription factor that is activated by copper ions A nucleotide sequence encoding the transcription factor, comprising a region and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor;
(B) a gene construct characterized in that it is constructed so as to be capable of being constructed so as to have a gene expression cassette that induces transcription by the transcription factor and expresses a foreign gene involved in plant flowering time control Sometimes referred to as an invented gene construct.):
8). Transcription factors that are activated by copper ions and induce transcription of foreign genes involved in plant flowering time control are the DNA binding region and the transcriptional activation region of the first transcription factor activated by copper ions and the first 8. The gene construct according to item 7, which contains a transcription activation region of at least one transcription factor different from the transcription factor:
9. 9. The gene construct according to item 7 or 8, wherein the first transcription factor activated by copper ions is a transcription factor selected from the following transcription factors:
<Transcription factors>
(1) transcription factors derived from eukaryotes (2) transcription factors derived from yeast (3) transcription factors derived from yeast ACE1 The gene construct according to any one of items 7 to 9, wherein the transcription factor different from the first transcription factor is a transcription factor selected from the following transcription factors:
<Transcription factors>
(1) Transcription factor derived from virus (2) Transcription factor derived from virus belonging to the genus of simplex virus (3) Transcription factor derived from herpes simplex virus (4) VP16 transcription factor derived from herpes simplex virus The gene construct according to any one of items 7 to 10 above, wherein the foreign gene involved in flowering time control is a foreign gene selected from the following foreign gene group:
<Foreign gene group>
(1) genes derived from plants (2) genes derived from angiosperms (3) genes derived from dicotyledons (4) genes derived from cruciferous plants (5) genes derived from Arabidopsis (6) genes derived from Arabidopsis FT A gene construct that is constructed by adding a promoter upstream of a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and that induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. The gene construct according to any one of 7 to 11:
13. A transformed plant obtained by introducing the gene construct according to any one of items 7 to 12 above (hereinafter sometimes referred to as a transformed plant of the present invention):
Etc. are provided.

本発明により、開花時期制御に関わる外来遺伝子が導入されてなる形質転換植物について、銅イオン依存的に開花時期の制御を行う方法等を提供することが可能となる。その結果、環境や播種時期、栽培地に左右されず、所望する時期に開花を誘導できるようになり、ニーズを的確に捉えた計画的な収穫や出荷、Ｆ１ハイブリッド種子の効率的な生産、遺伝子組換え作物からの遺伝子流出防止、葉菜類や根菜類の効率的な生産、花卉の生産性向上、世代間隔の短縮化による品種改良の効率化、収量増加等が期待される。 According to the present invention, it is possible to provide a method for controlling flowering time in a copper ion-dependent manner for a transformed plant into which a foreign gene related to flowering time control has been introduced. As a result, the environment and sowing time, without being affected by the plantations, it will be able to induce flowering in the desired time, planned harvesting and shipping that accurately the needs, F 1 hybrid seed of efficient production, It is expected to prevent gene runoff from genetically modified crops, to efficiently produce leafy vegetables and root vegetables, to improve the productivity of florets, to improve the efficiency of cultivar improvement by shortening the generation interval, and to increase the yield.

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明遺伝子構築物は、植物において、化学物質により開花時期制御に関わる外来遺伝子を誘導発現させ、植物の開花時期を制御するために利用することができる。当該遺伝子構築物は、
（ａ）銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子（以下、本転写因子と記すこともある。）であって、前記転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前記転写因子をコードする塩基配列と、
（ｂ）前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子（以下、本開花制御遺伝子と記すこともある。）を発現する遺伝子発現カセットと、
を有するように構築可能に調製すればよい。このようにして、本発明遺伝子構築物を得ることができる。尚、遺伝子発現カセットとは、宿主細胞中で本開花制御遺伝子等の構造遺伝子が発現可能な一つのユニットである。具体的には例えば、構造遺伝子の上流にプロモーターを、構造遺伝子の下流にターミネーターを付加したものである。 The present invention is described in detail below.
The gene construct of the present invention can be used for controlling the flowering time of a plant by inducing and expressing a foreign gene related to flowering time control with a chemical substance in a plant. The gene construct is
(A) a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control (hereinafter, also referred to as the present transcription factor), wherein the transcription factor is copper ion A base sequence encoding the transcription factor, which comprises a DNA binding region of the first transcription factor activated by and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor;
(B) a gene expression cassette that expresses a foreign gene whose transcription is induced by the transcription factor and that is involved in plant flowering time control (hereinafter sometimes referred to as the present flowering control gene);
It may be prepared so as to be capable of being constructed. In this way, the gene construct of the present invention can be obtained. The gene expression cassette is one unit capable of expressing a structural gene such as a main flowering control gene in a host cell. Specifically, for example, a promoter is added upstream of the structural gene and a terminator is added downstream of the structural gene.

本発明遺伝子構築物は、前記（ａ）及び前記（ｂ）の各要素を有するように構築可能に調製すればよい。即ち、１つのベクター上に前記（ａ）及び前記（ｂ）の各要素を有するように構築してもよいし、また２つのベクター上の、１つのベクターとして前記（ａ）の要素を有するように構築し、且つ、他の１つのベクターとして前記（ｂ）の要素を有するように構築してもよい。
このようなベクターの構築は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよい。尚、２つのベクターとして構築する場合には、例えば、前記（ａ）を第一ベクターとして構築し、また前記（ｂ）を第二ベクターとして構築してもよい。 What is necessary is just to prepare the gene construct of this invention so that it can construct | assemble so that it may have each element of said (a) and said (b). That is, it may be constructed so as to have each of the elements (a) and (b) on one vector, or it may have the element (a) as one vector on two vectors. And may be constructed so as to have the element (b) as another vector.
Construction of such a vector may be performed using a normal genetic engineering technique. When constructing as two vectors, for example, the above (a) may be constructed as a first vector, and the above (b) may be constructed as a second vector.

本発明遺伝子構築物としては、好ましくは、本転写因子をコードする塩基配列の上流に任意のプロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物等を挙げることができる。当該プロモーターとしては、例えば、後述するような通常使用されるプロモーター等を挙げることができる。
また更に、本発明遺伝子構築物としては、好ましくは、任意のターミネーターを本転写因子をコードする塩基配列の下流に付加され構築されてなる遺伝子構築物等を挙げることができる。当該ターミネーターとしては、例えば、NOSターミネーター、CR16ターミネーター（特開2000-166577）、ダイズ種子グリシニンターミネーター（特開06-189777）等を挙げることができる。 Preferred examples of the gene construct of the present invention include a gene construct constructed by adding an arbitrary promoter upstream of the base sequence encoding the transcription factor. Examples of the promoter include usually used promoters as described below.
Furthermore, the gene construct of the present invention preferably includes a gene construct constructed by adding an arbitrary terminator downstream of the base sequence encoding the transcription factor. Examples of the terminator include NOS terminator, CR16 terminator (JP 2000-166577), soybean seed glycinin terminator (JP 06-189777), and the like.

本発明遺伝子構築物を、例えば、宿主植物へ導入し、当該遺伝子構築物の誘導発現を行う。本発明遺伝子構築物の宿主植物への導入は、宿主植物夫々に適用可能な方法に応じて、通常の遺伝子工学的手法を用いて行えばよい。
具体的には例えば、前記（ａ）及び前記（ｂ）の各要素を有するように構築した１つのベクターを用いて本発明遺伝子構築物を導入してもよいし、前記（ａ）を有するように構築した第一ベクターと前記（ｂ）を有するように構築した第二ベクターを混合して本発明遺伝子構築物を導入してもよい。また、第一ベクター又は第二ベクターのいずれかを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した宿主植物に、再度、他方のベクターを用いて残りの本発明遺伝子構築物を導入してもよい。さらに、第一ベクターを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した個体と第二ベクターを用いて本発明遺伝子構築物の一部を導入した個体とを交配してもよい。第二ベクターを複数種類構築して本発明遺伝子構築物の一部を導入することで、複数種類の開花時期制御に関わる外来遺伝子を同時に誘導発現することも可能である。 The gene construct of the present invention is introduced into a host plant, for example, and the gene construct is inducibly expressed. Introduction of the gene construct of the present invention into the host plant may be carried out using ordinary genetic engineering techniques depending on the method applicable to each host plant.
Specifically, for example, the gene construct of the present invention may be introduced using one vector constructed so as to have each of the elements (a) and (b). The gene construct of the present invention may be introduced by mixing the constructed first vector and the second vector constructed so as to have the above (b). Further, the remaining gene construct of the present invention may be introduced again into the host plant into which a part of the gene construct of the present invention has been introduced using either the first vector or the second vector, using the other vector. Furthermore, an individual into which a part of the gene construct of the present invention has been introduced using the first vector may be mated with an individual into which a part of the gene construct of the present invention has been introduced using the second vector. By constructing a plurality of types of the second vector and introducing a part of the gene construct of the present invention, it is possible to simultaneously induce and express a plurality of types of foreign genes involved in flowering time control.

本発明遺伝子構築物の導入方法としては、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ウイルスベクター法等の各種の公知方法を用いることができる。   As a method for introducing the gene construct of the present invention, various known methods such as the Agrobacterium method, the particle gun method, the electroporation method, the calcium phosphate method, and the virus vector method can be used.

宿主植物には、農業上及び園芸上重要な種、ゲノム解析等遺伝学上有用な種等が挙げられる。例えば、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ、ミヤコグサ、クローバ、ピーナッツ、スイートピー、クルミ、チャ、ワタ、コショウ、キュウリ、スイカ、カボチャ、メロン、ダイコン、ナタネ、キャノーラ、テンサイ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、シロイヌナズナ、タバコ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、キクイモ、トマト、ホウレンソウ、アスパラガス、ニンジン、ゴマ、エンダイブ、キク、フウロウソウ、キンギョソウ、カーネーション、ナデシコ、ニチニチソウ、ブバルディア、カスミソウ、ガーベラ、トルコキキョウ、チューリップ、ストック、スターチス、シクラメン、ユキノシタ、ノースポール、スミレ、バラ、サクラ、リンゴ、ブドウ、イチゴ、ウメ、ミカン、ボケ、サツキ、ツツジ、ナンヨウアブラギリ、キャッサバ、アブラヤシ、ココヤシ、オリーブ、リンドウ、コスモス、アサガオ、ヒマワリ、イチョウ、スギ、ヒノキ、ポプラ、マツ、セコイア、オーク、ヤナギ、ユーカリ、ケナフ、スイレン、トチュウ、ブナ、ヒマ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム、シバ、トールフェスキュー、スイッチグラス、ススキ、ネギ、タマネギ、ニンニク、ユリ、オニユリ、ラン、グラジオラス、パイナップルである。   Examples of host plants include agriculturally and horticulturally important species, genetically useful species such as genome analysis, and the like. For example, soybeans, peas, green beans, alfalfa, clover, peanuts, sweet peas, walnuts, tea, cotton, pepper, cucumber, watermelon, pumpkin, melon, radish, rapeseed, canola, sugar beet, lettuce, cabbage, broccoli, cauliflower, Arabidopsis, Tobacco, Eggplant, Potato, Sweet potato, Sweet potato, Jerusalem artichoke, Tomato, Spinach, Asparagus, Carrot, Sesame, Endive, Chrysanthemum, Pepper, Snapdragon, Carnation, Nadesico, Periwinkle, Bubaldia, Gypsophila, Gerbera, Eustoma Stock, statice, cyclamen, saxifrage, north pole, violet, rose, cherry, apple, grape, strawberry, ume, mandarin, bokeh, satsuki, tsutsu Di, Nanyou Abagiri, Cassava, Oil palm, Coco palm, Olive, Gentian, Cosmos, Morning Glory, Sunflower, Ginkgo, Sugi, Cypress, Poplar, Pine, Sequoia, Oak, Willow, Eucalyptus, Kenaf, Water lily, Eucommia, Beech, Castor, Sugar cane , Rice, wheat, barley, rye, oat, corn, sorghum, buckwheat, tall fescue, switchgrass, Japanese pampas grass, leek, onion, garlic, lily, tiger lily, orchid, gladiolus, pineapple.

本発明誘導発現方法は、本発明形質転換植物に銅イオンを接触させることを特徴とする。当該接触方法等としては、例えば、本発明形質転換植物を培地で生育させたり水耕栽培したりする場合には、培地や栄養溶液への銅イオンの混合する（具体的には例えば、銅イオン濃度１μＭ〜２４ｍＭ）等の方法を挙げることができる。また、本発明形質転換植物を土壌で栽培する場合には、土壌や本発明形質転換植物の茎葉への銅イオンの散布（具体的には例えば、銅イオン量１ｎｍｏｌ/個体〜２．４ｍｍｏｌ/個体、銅イオン濃度１μＭ〜２４ｍＭ）等の方法が挙げられる。宿主植物の種類や使用場面に応じて適宜選択することが望ましい。本発明誘導発現方法では、銅イオンを本開花制御遺伝子を誘導発現させたい植物の細胞の中に浸透させればよく、施用する銅イオンを錯体にする等製剤を工夫したり、ボルドー（住友化学）、ジーファイン（八洲化学）、トモノＺボルドー（トモノアグリカ）、リドミルプラス（日本農薬）、ハイカッパー（住化武田農薬）、クプラビットホルテ（バイエルクロップサイエンス）、コサイドボルドー（デュポン）、キノンドー（アグロカネショウ）、ヨネポン（米澤化学）等、農業用途に使用される銅剤や、グルコン酸銅（和光純薬）等、食品添加物用途に使用される銅剤を所望の濃度に調整して用いてもよい。また施用に際して展着剤等を混合してもよい。
前記銅イオンの本発明形質転換植物への接触は、通常の農業用の有害生物防除剤（殺虫剤、殺菌剤、除草剤、植調剤等）や肥料と混合して行うことができる。また、本発明形質転換植物への潅水を兼ねて行うこともできる。 The inductive expression method of the present invention is characterized by bringing a copper ion into contact with the transformed plant of the present invention. As the contact method, for example, when the transformed plant of the present invention is grown in a medium or hydroponically cultivated, copper ions are mixed into the medium or nutrient solution (specifically, for example, copper ions Examples of the method include a concentration of 1 μM to 24 mM). In addition, when the transformed plant of the present invention is cultivated in soil, copper ions are sprayed onto the soil and the foliage of the transformed plant of the present invention (specifically, for example, the amount of copper ion is 1 nmol / individual to 2.4 mmol / individual). , Copper ion concentration of 1 μM to 24 mM). It is desirable to select appropriately according to the type of host plant and the usage scene. In the inductive expression method of the present invention, copper ions may be permeated into the cells of a plant where the flowering control gene is to be induced and expressed, and a formulation such as complexing the applied copper ions may be devised, or Bordeaux (Sumitomo Chemical). ), G Fine (Yasu Chemical), Tomono Z Bordeaux (Tomono Aggreca), Ridomil Plus (Nippon Agricultural Chemicals), High Copper (Sumika Takeda Agricultural Chemicals), Cuprabit Holte (Bayer Crop Science), Colloside Bordeaux (DuPont), Quinone Doe ( Agro-Kanesho), Yonepon (Yonezawa Chemical) and other copper agents used for agricultural purposes, and copper agents used for food additives such as copper gluconate (Wako Pure Chemicals) are adjusted to the desired concentration. May be. Moreover, you may mix a spreading agent etc. in the case of application.
The contact of the copper ions with the transformed plant of the present invention can be performed by mixing with a normal agricultural pesticide (insecticide, fungicide, herbicide, planting agent, etc.) or fertilizer. Moreover, it can also serve as irrigation to the present transformed plant.

使用される本転写因子は、銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子（即ち、本開花制御遺伝子）の転写を誘導する。当該転写因子は、銅イオンが存在しない状態においては不活性型であり本開花制御遺伝子の転写を実質的に誘導しないが、銅イオンが存在する状態においては活性型に変化し本開花制御遺伝子の転写を誘導することができる。
因みに、転写因子は、通常、ＤＮＡ結合領域と転写活性化領域とを有している。転写活性化領域は、宿主植物の細胞内において、RNAポリメラーゼ複合体のメディエーターをリクルートし、標的遺伝子の転写を活性化するはたらきを有する。本発明誘導発現方法及び本発明遺伝子構造物において、本転写因子は、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する。また、本転写因子は、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有していてもよい。本転写因子に、第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域を含有させることにより、目的とする外来遺伝子の発現の誘導倍率を高める効果を実現し得る。本発明形質転換植物の開花時期を制御するためには、本開花制御遺伝子の発現の誘導倍率は高いほど好ましい。 The present transcription factor used is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control (ie, this flowering control gene). The transcription factor is inactive in the absence of copper ions and does not substantially induce transcription of the main flowering control gene, but changes to the active form in the presence of copper ions, and Transcription can be induced.
Incidentally, a transcription factor usually has a DNA binding region and a transcription activation region. The transcription activation region recruits a mediator of the RNA polymerase complex and activates transcription of the target gene in the host plant cell. In the inductive expression method of the present invention and the gene structure of the present invention, the transcription factor is a transcription of at least one transcription factor different from the DNA binding region of the first transcription factor activated by copper ions and the first transcription factor. And an activation region. The transcription factor also contains a DNA binding region and a transcription activation region of the first transcription factor activated by copper ions and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor. You may do it. By including the transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor in the transcription factor, the effect of increasing the induction ratio of the expression of the target foreign gene can be realized. In order to control the flowering time of the transformed plant of the present invention, the higher the induction ratio of expression of the present flowering control gene, the better.

本転写因子としては、前述のように、例えば、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子を挙げることができる。
＜転写因子群＞
（１）真核生物由来の転写因子
（２）酵母由来の転写因子
（３）酵母ACE1由来の転写因子
また例えば、candida glabrataのAMT1（Thorvaldsen JL et al、1993、J Biol Chem 268、12512-12518）、Yarrowia lipolyticaのCRF1（Garcia S、2002、J Biol Chem 277、37359-37368）、トウモロコシのSOD遺伝子群を銅イオン依存的に誘導発現させる転写因子（Ruzsa SM et al、2003、Biochemistry 42、1508-1516）等を挙げることができる。 Examples of the transcription factor include a transcription factor selected from the following transcription factors as described above.
<Transcription factors>
(1) transcription factors derived from eukaryotes (2) transcription factors derived from yeast (3) transcription factors derived from yeast ACE1 or AMT1 from candida glabrata (Thorvaldsen JL et al, 1993, J Biol Chem 268, 12512-12518) ), Yarrowia lipolytica CRF1 (Garcia S, 2002, J Biol Chem 277, 37359-37368), a transcription factor (Ruzsa SM et al, 2003, Biochemistry 42, 1508) that induces the SOD gene group of maize to depend on copper ions. -1516).

使用される植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子（即ち、本開花制御遺伝子）は、開花を促進する遺伝子であってもよく、開花を遅延する遺伝子であってもよく、使用目的に応じて適宜選択することが望ましい。即ち、本発明誘導発現方法における「開花時期の制御」とは、本開花制御遺伝子の性質によって、「開花の促進」と「開花の遅延」との両方を意味する。例えば、以下にシロイヌナズナ由来の遺伝子を挙げるが、他の植物種でもこれらの相同遺伝子が一部同定されている。具体的には、例えば、シロイヌナズナ由来FT遺伝子（Kobayashi Y et al、1999、Science 286、1960-1962）の相同遺伝子が、イネでHd3a遺伝子（Tamaki S et al、2007、Science 316、1033-1036）として同定されている。この他にも、アサガオ、ミカン、ポプラ、オオムギ、ブドウ、リンゴ等でも同様に相同遺伝子が同定されている。また、シロイヌナズナ由来FT遺伝子以外にも、開花時期制御に関わる遺伝子は多くの植物種で多数同定されている。これらの開花制御に関わる遺伝子は、植物種を越えて機能するものも存在する。導入対象の植物種由来の遺伝子を利用することが好ましいが、他の植物種由来の遺伝子でも開花時期を制御できれば、植物種に限定されることはない。
開花を促進する遺伝子としては、例えば、FT、CO、GI、SOC1、AGL24、LD、FCA、FUL、LFY、AP1、TSF、FD等を挙げることができるが、さらに任意の開花を促進する遺伝子が含まれる。また、後述のような開花を遅延する遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子をも挙げることができる。より好ましくは、例えば、光周期依存的促進経路、自立的促進経路、春化依存的促進経路、ジベレリン依存的促進経路などの開花時期決定に関わる夫々の経路を統合する遺伝子であるFT、SOC1、LFY等を利用することが望ましい。より好ましくは、フロリゲンの原因遺伝子であるFT及びその相同遺伝子を利用することが望ましい。
開花を遅延する遺伝子としては、例えば、FLC、FRI、PIE1、TFL2、VIP1-7、LHY、SVP、SPA、CDF1等を挙げることができるが、さらに任意の開花を遅延する遺伝子が含まれる。また、前述のような開花を促進する遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子をも挙げることができる。より好ましくは、例えば、光周期依存的促進経路、自立的促進経路、春化依存的促進経路、ジベレリン依存的促進経路などの開花時期決定に関わる夫々の経路を統合する遺伝子であるFT、SOC1、LFY等の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発する遺伝子を利用することが望ましい。より好ましくは、フロリゲンの原因遺伝子であるFT及びその相同遺伝子の優勢劣性変異やアンチセンス遺伝子及びRNAiを誘発するを利用することが望ましい。
なお、上述の開花時期制御に関わる遺伝子の詳細については、総説（Kobayashi Y and Weigel D、2007、Genes Dev 21、2371-84、及びPutterill J et al、2004、Bioessays 26、363-373等）に記載されている。 The foreign gene involved in controlling the flowering time of the plant to be used (that is, the present flowering control gene) may be a gene that promotes flowering or may be a gene that delays flowering. It is desirable to choose. That is, “control of flowering time” in the induced expression method of the present invention means both “promoting flowering” and “delaying flowering” depending on the nature of the present flowering control gene. For example, the genes derived from Arabidopsis thaliana are listed below, but some of these homologous genes have been identified in other plant species. Specifically, for example, a homologous gene of FT gene derived from Arabidopsis (Kobayashi Y et al, 1999, Science 286, 1960-1962) is Hd3a gene in rice (Tamaki S et al, 2007, Science 316, 1033-1036). Has been identified as In addition, homologous genes have been similarly identified in morning glory, mandarin orange, poplar, barley, grape, apple and the like. In addition to FT genes derived from Arabidopsis thaliana, many genes related to flowering time control have been identified in many plant species. Some of these genes involved in flowering control function across plant species. Although it is preferable to use a gene derived from a plant species to be introduced, it is not limited to a plant species as long as the flowering time can be controlled by a gene derived from another plant species.
Examples of genes that promote flowering include FT, CO, GI, SOC1, AGL24, LD, FCA, FUL, LFY, AP1, TSF, and FD. included. Moreover, the dominant recessive mutation of the gene which delays flowering as mentioned later, the gene which induces an antisense gene and RNAi can also be mentioned. More preferably, for example, FT, SOC1, which is a gene that integrates respective pathways related to flowering time determination such as a photoperiod-dependent promotion pathway, a self-sustained promotion pathway, a vernalization-dependent promotion pathway, and a gibberellin-dependent promotion pathway. It is desirable to use LFY. More preferably, it is desirable to use FT that is a causative gene of florigen and its homologous gene.
Examples of genes that delay flowering include FLC, FRI, PIE1, TFL2, VIP1-7, LHY, SVP, SPA, CDF1, and the like, and further include genes that delay any flowering. In addition, dominant recessive mutations in genes that promote flowering as described above, antisense genes, and genes that induce RNAi can also be mentioned. More preferably, for example, FT, SOC1, which is a gene that integrates respective pathways related to flowering time determination such as a photoperiod-dependent promotion pathway, a self-sustained promotion pathway, a vernalization-dependent promotion pathway, and a gibberellin-dependent promotion pathway. It is desirable to use dominant recessive mutations such as LFY, antisense genes and genes that induce RNAi. More preferably, it is desirable to utilize FT, which is a causative gene of florigen, and dominant recessive mutation of the homologous gene, inducing antisense gene and RNAi.
For details on the genes involved in the flowering time control described above, see reviews (Kobayashi Y and Weigel D, 2007, Genes Dev 21, 2371-84, and Putterill J et al, 2004, Bioessays 26, 363-373). Are listed.

本開花制御遺伝子としては、前述のように、例えば、下記の本開花制御遺伝子から選ばれてなる外来遺伝子を挙げることができる。
＜外来遺伝子に係る塩基配列群＞
（１）植物由来の遺伝子
（２）被子植物由来の遺伝子
（３）双子葉植物由来の遺伝子
（４）アブラナ科植物由来の遺伝子
（５）シロイヌナズナ由来の遺伝子
（６）シロイヌナズナFT由来の遺伝子 Examples of the main flowering control gene include a foreign gene selected from the following main flowering control genes as described above.
<Base sequence groups related to foreign genes>
(1) Gene derived from plant (2) Gene derived from angiosperm (3) Gene derived from dicotyledonous plant (4) Gene derived from Brassicaceae plant (5) Gene derived from Arabidopsis (6) Gene derived from Arabidopsis FT

本開花制御遺伝子には、好ましくは、その上流に、前記の本転写因子が銅イオン存在下において転写を誘導しうる塩基配列からなるプロモーター領域（以下、本プロモーター領域と記すこともある。）が連結される。誘導条件下における宿主細胞中で、本開花制御遺伝子が発現可能であればよい。好ましくは、例えば、酵母のMRE配列（Mett VL et al、1993、Proc Natl Acad Sci 90、4567-4571）等を含むようなものを挙げることができる。具体的には、通常使用されるプロモーター領域に存在するTATA配列の上流に、酵母のMRE配列等を繰返し配置してなるものが挙げられる。尚、本開花制御遺伝子とその上流のプロモーター領域との間に、任意の外来遺伝子の５’−非翻訳領域を連結する必要はなく、例えば、実質的に直結されていてよい。   The present flowering control gene preferably has a promoter region (hereinafter sometimes referred to as the present promoter region) composed of a base sequence that allows the transcription factor to induce transcription in the presence of copper ions. Connected. What is necessary is just to be able to express this flowering control gene in the host cell under induction conditions. Preferable examples include those containing yeast MRE sequence (Mett VL et al, 1993, Proc Natl Acad Sci 90, 4567-4571). Specific examples include those in which a yeast MRE sequence or the like is repeatedly arranged upstream of a TATA sequence present in a commonly used promoter region. Note that it is not necessary to link the 5'-untranslated region of any foreign gene between the present flowering control gene and the upstream promoter region, and for example, it may be substantially directly connected.

尚、前記の通常使用されるプロモーターは、構成的プロモーターでもよいし、組織特異的プロモーターや、ある刺激により転写が誘導される誘導性プロモーターでもよい。使用場面に応じて適宜選択することが望ましい。
構成的プロモーターとしては、例えば、CaMV 35Sプロモーター、PG10-90（特開09-131187）、ユビキチンプロモーター（国際公開01/094394）、アクチンプロモーター（国際公開00/070067）等を挙げることができる。また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、ダイズ種子グリシニンプロモーター（特開06-189777）、プロラミンプロモーター（国際公開2004/056993）、インゲンマメ種子ファゼオリンプロモーター（国際公開91/013993）、ナタネ種子ナピンプロモーター（国際公開91/013972）、シロイヌナズナSultr2;2プロモーター（Takahashi H et al、2000、Plant J 23、171-82）、アグロバクテリウムrolCプロモーター（Almon E et al、1997、Physiol 115、1599-1607）等を挙げることができる。 The usually used promoter may be a constitutive promoter, a tissue-specific promoter, or an inducible promoter whose transcription is induced by a certain stimulus. It is desirable to select appropriately according to the usage scene.
Examples of the constitutive promoter include CaMV 35S promoter, PG10-90 (JP 09-131187), ubiquitin promoter (International Publication 01/094394), actin promoter (International Publication 00/070067) and the like. Examples of tissue-specific promoters include soybean seed glycinin promoter (JP 06-189777), prolamin promoter (International Publication 2004/056993), kidney bean seed phaseolin promoter (International Publication 91/013993), rapeseed seed Pin promoter (International Publication 91/013972), Arabidopsis Sultr2; 2 promoter (Takahashi H et al, 2000, Plant J 23, 171-82), Agrobacterium rolC promoter (Almon E et al, 1997, Physiol 115, 1599- 1607).

第一の転写因子とは異なる好ましい転写因子としては、例えば、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子を挙げることができる。
＜転写活性化領域に係る塩基配列群＞
（１）ウイルス由来の転写因子
（２）シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
（３）単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
（４）単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写因子（Triezenberg SJ et al、1988、Genes Dev 2(6)、718-29）
また例えば、GAL4転写因子（Gill G、Ptashne M、1987、Cell 51(1)、121-126）、転写活性化能力を有する人工的に合成されたペプチドAH（Ansari AZ et al、2001、Chem Biol 8(6)、583-592）等を挙げることもできる。 As a preferable transcription factor different from the first transcription factor, for example, a transcription factor selected from the following transcription factors can be mentioned.
<Base sequence group related to transcription activation region>
(1) Transcription factor derived from virus (2) Transcription factor derived from virus belonging to the genus of simplex virus (3) Transcription factor derived from herpes simplex virus (4) VP16 transcription factor derived from herpes simplex virus (Triezenberg SJ et al, 1988, Genes Dev 2 (6), 718-29)
Further, for example, GAL4 transcription factor (Gill G, Ptashne M, 1987, Cell 51 (1), 121-126), artificially synthesized peptide AH having transcription activation ability (Ansari AZ et al, 2001, Chem Biol 8 (6), 583-592) and the like.

本発明誘導発現方法で使用される遺伝子構築物は、例えば、前述のような本発明遺伝子構築物である。また、本発明誘導発現方法で使用される転写因子は、前述のような本転写因子であり、銅イオンにより活性化するものである。また、本発明誘導発現方法で使用される植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子は、前述のような本開花制御遺伝子であり、銅イオンで活性化される転写因子により転写を誘導される。また、本発明誘導発現方法で使用される転写活性化領域は、前述のような本転写活性化領域であり、銅イオンで活性化される転写因子に含有されてなる。   The gene construct used in the inductive expression method of the present invention is, for example, the gene construct of the present invention as described above. The transcription factor used in the inductive expression method of the present invention is the above-described transcription factor as described above, and is activated by copper ions. In addition, the foreign genes involved in plant flowering time control used in the induced expression method of the present invention are the above-mentioned flowering control genes as described above, and transcription is induced by a transcription factor activated by copper ions. In addition, the transcription activation region used in the induced expression method of the present invention is the above-described transcription activation region as described above, and is contained in a transcription factor activated by copper ions.

本発明形質転換植物は、上述のように、本発明遺伝子構築物が導入されてなる形質転換植物である。   The transformed plant of the present invention is a transformed plant into which the gene construct of the present invention has been introduced as described above.

本発明の応用例として、以下のようなことを挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。本開花制御遺伝子が開花を促進する遺伝子の場合、開花を促進する遺伝子への変異導入やRNAi、開花を遅延する遺伝子の過剰発現等により開花が起こり難い又は全く開花しない植物へ本発明遺伝子構築物を導入することで、より厳密に開花を制御することが可能となる。反対に、本開花制御遺伝子が開花を遅延する遺伝子の場合、開花を遅延する遺伝子への変異導入やRNAi、開花を促進する遺伝子の過剰発現等により開花が早期に起こる植物へ本発明遺伝子構築物を導入することで、より厳密に開花を制御することが可能となる。   Although the following can be mentioned as an application example of this invention, It is not specifically limited to these. In the case where the present flowering control gene is a gene that promotes flowering, the gene construct of the present invention is applied to a plant in which flowering hardly occurs due to mutation introduction into the gene that promotes flowering, RNAi, overexpression of a gene that delays flowering, or the like that does not occur at all. By introducing it, it becomes possible to control flowering more strictly. On the other hand, when the present flowering control gene is a gene that delays flowering, the gene construct of the present invention is applied to a plant in which flowering occurs early due to mutation introduction into the gene that delays flowering, RNAi, overexpression of a gene that promotes flowering, etc. By introducing it, it becomes possible to control flowering more strictly.

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態に夫々開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention.

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ （導入ベクターの作製）
（１）転写因子遺伝子発現カセットの構築
YPD培地（1% 酵母エキス、2% ポリペプトン、2% グルコース）中、30℃で2日間振とう培養した出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae strain AH22）から、ゲノムＤＮＡ抽出キット「Genとるくん」（タカラバイオ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型に、２種の特異的プライマー（ACE1-1F、ACE1-1RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、ACE1転写因子遺伝子を増幅した。増幅されたACE1転写因子遺伝子を、pBI221（Clontech）のGUS遺伝子と置換し、p35S-ACE1-NOSを作製した。次に、p35S-ACE1-NOSに含まれるNOSターミネーターを、CR16ターミネーター（特開2000-166577）に置換し、p35S-ACE1-CRを作製した。 Example 1 (Production of transfer vector)
(1) Construction of transcription factor gene expression cassette
Genomic DNA extraction kit “Gentori-kun” (Takara Bio) from Saccharomyces cerevisiae strain AH22 cultured in YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) with shaking at 30 ° C for 2 days Was used to extract genomic DNA. The extracted ACE1 transcription factor gene was amplified by PCR using the extracted genomic DNA as a template and using two kinds of specific primers (ACE1-1F, ACE1-1RC). The amplified ACE1 transcription factor gene was replaced with the GUS gene of pBI221 (Clontech) to prepare p35S-ACE1-NOS. Next, the NOS terminator contained in p35S-ACE1-NOS was replaced with a CR16 terminator (JP 2000-166577) to prepare p35S-ACE1-CR.

NASC（Nottingham Arabidopsis Stock Centre）より購入した組換えシロイヌナズナ種子（No.N70016）を改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天）に播種した。23℃で3週間生育させた組換えシロイヌナズナの本葉から、植物ゲノムＤＮＡ抽出キット「DNeasy Plant mini kit」（QIAGEN）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型に、２種の特異的プライマー（VP16-1F、VP16-1RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、単純ヘルペスウイルスのVP16転写因子の転写活性化ドメイン（VP16AD）遺伝子を増幅した。増幅されたVP16AD遺伝子を、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングし、pCR2.1-VP16ADを作製した。pCR2.1-VP16ADを鋳型に、２種の特異的プライマー（VP16-2F、VP16-2RC）を用いてＰＣＲを行い、VP16AD遺伝子内のSacIサイトに変異を導入し、pCR2.1-VP16AD(dSacI)を作製した。その後、pCR2.1-VP16AD(dSacI)を鋳型に、２種の特異的プライマー（VP16-3F、VP16-3RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、VP16AD(dSacI)遺伝子の５’末端にXhoIサイトを付加し３’末端にSacIサイトを付加した。また、pCR2.1-VP16AD(dSacI)を鋳型に、２種の特異的プライマー（VP16-4F、VP16-3RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、VP16AD(dSacI)遺伝子の５’末端にBglIIサイトを付加し３’末端にSacIサイトを付加した。   Recombinant Arabidopsis seeds (No.N70016) purchased from NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center) were sown on a modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamins, 2% sucrose, 0.8% agar). Genomic DNA was extracted from the true leaves of recombinant Arabidopsis thaliana grown at 23 ° C. using a plant genomic DNA extraction kit “DNeasy Plant mini kit” (QIAGEN). By using the extracted genomic DNA as a template and performing PCR using two specific primers (VP16-1F, VP16-1RC), the herpes simplex virus VP16 transcription factor transcription activation domain (VP16AD) gene Amplified. The amplified VP16AD gene was TA cloned into pCR2.1 (Invitrogen) to prepare pCR2.1-VP16AD. Using pCR2.1-VP16AD as a template, PCR was performed using two specific primers (VP16-2F, VP16-2RC), mutations were introduced into the SacI site within the VP16AD gene, and pCR2.1-VP16AD (dSacI ) Was produced. After that, PCR is performed using pCR2.1-VP16AD (dSacI) as a template and two specific primers (VP16-3F, VP16-3RC), so that the XhoI site is located at the 5 ′ end of the VP16AD (dSacI) gene. And a SacI site was added to the 3 ′ end. In addition, by performing PCR using pCR2.1-VP16AD (dSacI) as a template and two kinds of specific primers (VP16-4F, VP16-3RC), a BglII site is located at the 5 ′ end of the VP16AD (dSacI) gene. And a SacI site was added to the 3 ′ end.

p35S-ACE1-CRを鋳型に、２種の特異的プライマー（ACE1-1F、ACE1-2RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、ACE1転写因子遺伝子の終始コドンを除去しXhoIサイトを付加した。３’末端にXhoIサイトを付加したACE1転写因子遺伝子の下流に、５’末端にXhoIサイトを付加したVP16AD(dSacI)遺伝子を読み枠が合うように連結し、p35S-ACE1/VP16AD-CRを作製した。また、p35S-ACE1-CRを制限酵素BglII及びSacIで処理し、ACE1AD遺伝子を切り出した。ACE1AD遺伝子を切り出したACE1DBD転写因子遺伝子の下流に、５’末端にBglIIサイトを付加したVP16AD(dSacI)遺伝子を読み枠が合うように連結し、ACE1AD遺伝子と置換、p35S-ACE1DBD/VP16AD-CRを作製した。   PCR was performed using p35S-ACE1-CR as a template and two kinds of specific primers (ACE1-1F, ACE1-2RC), thereby removing the termination codon of the ACE1 transcription factor gene and adding the XhoI site. The VP16AD (dSacI) gene with the XhoI site added at the 5 'end is ligated downstream of the ACE1 transcription factor gene with the XhoI site added at the 3' end so that the reading frame fits, and p35S-ACE1 / VP16AD-CR is prepared. did. In addition, p35S-ACE1-CR was treated with restriction enzymes BglII and SacI to excise the ACE1AD gene. VP16AD (dSacI) gene with a BglII site added at the 5 'end is ligated to fit the reading frame downstream of the ACE1DBD transcription factor gene from which the ACE1AD gene was excised, and replaced with the ACE1AD gene. Replace p35S-ACE1DBD / VP16AD-CR Produced.

ACE1-1F：5'-atggatccatggtcgtaattaacggg-3'（配列番号１）
ACE1-1RC：5'-tggagctcttattgtgaatgtgagttatg-3'（配列番号２）
ACE1-2RC：5'-aactcgagttgtgaatgtgagttatgcg-3’（配列番号３）
VP16-1F：5'-acggctccaccgaccgacgtc-3'（配列番号４）
VP16-1RC：5'-ctacccaccgtactcgtcaattc-3'（配列番号５）
VP16-2F：5'-ggacgaactccacttagacgg-3'（配列番号６）
VP16-2RC：5'-ccgtctaagtggagttcgtcc-3'（配列番号７）
VP16-3F：5'-tactcgagtcaacggctccaccgaccgacgt-3'（配列番号８）
VP16-3RC：5'-aagagctcttacccaccgtactcgtcaattccaag-3'（配列番号９）
VP16-4F：5'-taagatctatcaacggctccaccgaccgacgt-3'（配列番号１０） ACE1-1F: 5'-atggatccatggtcgtaattaacggg-3 '(SEQ ID NO: 1)
ACE1-1RC: 5'-tggagctcttattgtgaatgtgagttatg-3 '(SEQ ID NO: 2)
ACE1-2RC: 5'-aactcgagttgtgaatgtgagttatgcg-3 '(SEQ ID NO: 3)
VP16-1F: 5'-acggctccaccgaccgacgtc-3 '(SEQ ID NO: 4)
VP16-1RC: 5'-ctacccaccgtactcgtcaattc-3 '(SEQ ID NO: 5)
VP16-2F: 5'-ggacgaactccacttagacgg-3 '(SEQ ID NO: 6)
VP16-2RC: 5'-ccgtctaagtggagttcgtcc-3 '(SEQ ID NO: 7)
VP16-3F: 5'-tactcgagtcaacggctccaccgaccgacgt-3 '(SEQ ID NO: 8)
VP16-3RC: 5'-aagagctcttacccaccgtactcgtcaattccaag-3 '(SEQ ID NO: 9)
VP16-4F: 5'-taagatctatcaacggctccaccgaccgacgt-3 '(SEQ ID NO: 10)

（２）sGFP遺伝子発現カセットの構築
プラスミドCaMV35S-sGFP(S65T)-NOS3'（「植物の細胞を観る実験プロトコール」 福田裕穂他監修、1997年、秀潤社、ISBN 4-87962-170-6）からsGFP遺伝子を切り出し、アダプター（NS-1F、NS-1RC）を使用して、pBI221のGUS遺伝子と置換、p35S-sGFPを作製した。p35S-sGFPに含まれるCaMV35Sプロモーターの-830bpから-91bpまでの領域を、合成オリゴヌクレオチド（MRE-1F、MRE-1RC）に置換し、pMRE/35S(-90)-sGFPを作製した。
pMRE/35S(-90)-sGFPを制限酵素EcoRVで処理した後、「Calf intestine Alkaline Phosphatase」（タカラバイオ）で脱リン酸化した。そこへ、「Blunting Kination Ligation kit」（タカラバイオ）を用いて平滑末端化及びリン酸化した合成オリゴヌクレオチド（MRE-1F、MRE-1RC）を挿入することで、MRE配列を順向きに2回繰返して配置させた。得られたMRE配列の2回繰返し部分を切り出し、上記と同様の方法で平滑末端化し、再度EcoRVサイトに挿入した。これにより、MRE配列を順向きに4回繰返して配置させたpMRE4/35S(-90)-sGFPを作製した。 (2) Construction of sGFP gene expression cassette Plasmid CaMV35S-sGFP (S65T) -NOS3 '("Experimental protocol for watching plant cells" supervised by Hiroho Fukuda et al., 1997, Shujunsha, ISBN 4-87962-170-6) The sGFP gene was excised from the DNA and replaced with the GUS gene of pBI221 using adapters (NS-1F, NS-1RC) to prepare p35S-sGFP. The region from −830 bp to −91 bp of the CaMV35S promoter contained in p35S-sGFP was replaced with synthetic oligonucleotides (MRE-1F, MRE-1RC) to prepare pMRE / 35S (−90) -sGFP.
pMRE / 35S (-90) -sGFP was treated with the restriction enzyme EcoRV and then dephosphorylated with “Calf intestine Alkaline Phosphatase” (Takara Bio). By inserting a synthetic oligonucleotide (MRE-1F, MRE-1RC) blunt-ended and phosphorylated using “Blunting Kination Ligation kit” (Takara Bio), the MRE sequence is repeated twice in a forward direction. Arranged. The twice-repeated portion of the obtained MRE sequence was cut out, blunt-ended by the same method as described above, and inserted again into the EcoRV site. As a result, pMRE4 / 35S (-90) -sGFP in which the MRE sequence was repeatedly arranged four times in the forward direction was prepared.

さらに、pBI221を鋳型に、２種の特異的プライマー（46bp-1F、46bp-1RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、CaMV35Sプロモーターの-46bpから-1bpまでの領域を含むDNA断片を増幅した。増幅されたDNA断片を、pMRE4/35S(-90)-sGFPの4回繰返し配置させたMRE配列の下流に位置するCaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域と置換し、pMRE4/35S(-46)-sGFPを作製した。
他方では、CaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域に存在するas-1サイト（Benfey PN & Chua NH、1990、Science 250、959-966）に変異が導入された配列と置換した。まず、NASCより購入した組換えシロイヌナズナ（No.N70016）からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型に、２種の特異的プライマー（90m-1F、90m-1RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、as-1サイトに変異を持つ35S（-90m）配列をpCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングし、pCR2.1-35S(-90m)を作製した。pCR2.1-35S(-90m)を鋳型に、２種の特異的プライマー（90m-2F、90m-2RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、５’末端にEcoRVサイトを付加し３’末端にXbaIサイトを付加した。得られたDNA断片を、pMRE4/35S(-90)-sGFPの4回繰返し配置させたMRE配列の下流に位置するCaMV35Sプロモーターの-90bpから-1bpまでの領域と置換し、pMRE4/35S(-90m)-sGFPを作製した。
pMRE4/35S(-46)-sGFP又はpMRE4/35S(-90m)-sGFPを夫々制限酵素HindIIIで処理した後、「Blunting Kination Ligation kit」を用いて平滑末端化及びリン酸化し、そこへ合成オリゴヌクレオチド（KXS-1F、KXS-1RC）を挿入、pKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP又はpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPを作製した。 Furthermore, PCR was performed using pBI221 as a template and two kinds of specific primers (46bp-1F, 46bp-1RC) to amplify a DNA fragment containing the region from -46 bp to -1 bp of the CaMV35S promoter. The amplified DNA fragment was replaced with a region from -90 bp to -1 bp of the CaMV35S promoter located downstream of the MRE sequence in which pMRE4 / 35S (-90) -sGFP was repeatedly arranged 4 times, and pMRE4 / 35S (- 46) -sGFP was prepared.
On the other hand, it was replaced with a sequence in which a mutation was introduced into the as-1 site (Benfey PN & Chua NH, 1990, Science 250, 959-966) existing in the region from -90 bp to -1 bp of the CaMV35S promoter. First, genomic DNA was extracted from recombinant Arabidopsis thaliana (No. N70016) purchased from NASC. By using the extracted genomic DNA as a template and performing PCR using two kinds of specific primers (90m-1F, 90m-1RC), a 35S (-90m) sequence having a mutation at the as-1 site is pCR2. TA cloning into 1 (Invitrogen) produced pCR2.1-35S (-90m). PCR was performed using pCR2.1-35S (-90m) as a template and two specific primers (90m-2F, 90m-2RC) to add an EcoRV site to the 5 'end and to the 3' end. Added XbaI site. The obtained DNA fragment was replaced with a region from -90 bp to -1 bp of the CaMV35S promoter located downstream of the MRE sequence in which pMRE4 / 35S (-90) -sGFP was repeatedly arranged 4 times, and pMRE4 / 35S (- 90m) -sGFP was prepared.
pMRE4 / 35S (-46) -sGFP or pMRE4 / 35S (-90m) -sGFP were each treated with the restriction enzyme HindIII, then blunted and phosphorylated using `` Blunting Kination Ligation kit '', and then synthesized oligo Nucleotides (KXS-1F, KXS-1RC) were inserted to prepare pKXS-MRE4 / 35S (-46) -sGFP or pKXS-MRE4 / 35S (-90m) -sGFP.

NS-1F：5'-ggccgcgagctcagt-3'（配列番号１１）
NS-1RC：5'-gactgagctcgc-3'（配列番号１２）
MRE-1F：5'-agcttagcgatgcgtcttttccgctgaaccgttccagcaaaaaagactagat-3'（配列番号１３）
MRE-1RC：5'-atctagtcttttttgctggaacggttcagcggaaaagacgcatcgcta-3'（配列番号１４）
46bp-1F：5'-tagatatcgcaagacccttcctctatataagg-3'（配列番号１５）
46bp-1RC：5'-atcctctagagtcccccgtgttc-3'（配列番号１６）
90m-1F：5'-gctatgaccatgattacgccaagcttg-3'（配列番号１７）
90m-1RC：5'-cattgttatatctccttggatccgtcg-3'（配列番号１８）
90m-2F：5'-tagatatctccacgtccataagggac-3'（配列番号１９）
90m-2RC：5'-aatctagactgcaggtcgtcctctcca-3'（配列番号２０）
KXS-1F：5'-ggtacctcgagtcgac-3'（配列番号２１）
KXS-1RC：5'-gtcgactcgaggtacc-3'（配列番号２２） NS-1F: 5'-ggccgcgagctcagt-3 '(SEQ ID NO: 11)
NS-1RC: 5'-gactgagctcgc-3 '(SEQ ID NO: 12)
MRE-1F: 5'-agcttagcgatgcgtcttttccgctgaaccgttccagcaaaaaagactagat-3 '(SEQ ID NO: 13)
MRE-1RC: 5'-atctagtcttttttgctggaacggttcagcggaaaagacgcatcgcta-3 '(SEQ ID NO: 14)
46bp-1F: 5'-tagatatcgcaagacccttcctctatataagg-3 '(SEQ ID NO: 15)
46bp-1RC: 5'-atcctctagagtcccccgtgttc-3 '(SEQ ID NO: 16)
90m-1F: 5'-gctatgaccatgattacgccaagcttg-3 '(SEQ ID NO: 17)
90m-1RC: 5'-cattgttatatctccttggatccgtcg-3 '(SEQ ID NO: 18)
90m-2F: 5'-tagatatctccacgtccataagggac-3 '(SEQ ID NO: 19)
90m-2RC: 5'-aatctagactgcaggtcgtcctctcca-3 '(SEQ ID NO: 20)
KXS-1F: 5′-ggtacctcgagtcgac-3 ′ (SEQ ID NO: 21)
KXS-1RC: 5'-gtcgactcgaggtacc-3 '(SEQ ID NO: 22)

（３）ＦＴ遺伝子発現カセットの構築
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia）を改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天）に播種し、23℃で3週間生育させた。得られた植物を、予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させた。移植後2週間目の植物の花芽及び本葉から、植物RNA抽出キット「RNeasy Plant Mini Kit」（QIAGEN）を用いて全RNAを抽出した。抽出された全RNAから、cDNA合成キット「ReverTra Ace」（TOYOBO）を用いてcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型に、２種の特異的プライマー（FT-1F、FT-1RC）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＦＴ遺伝子（GenBank Accession Number AB027504）を増幅した。増幅されたＦＴ遺伝子を、pBI221（Clontech）のGUS遺伝子と置換した。このようにして得られたプラスミドを鋳型に、６種の特異的プライマー（FT-2F、FT-2RC、FT-3F、FT-3RC、FT-4F、FT-1RC）を用いてfusion ＰＣＲを行うことにより、ＦＴ遺伝子内部に存在するBamHIサイト及びEcoRIサイトにアミノ酸置換を伴わない変異を導入し且つ５’末端のXbaIサイトをBamHIサイトに変更した。このようにして得られた改変ＦＴ遺伝子を、pKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPのsGFP遺伝子と置換することにより、pKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを作製した。 (3) Construction of FT gene expression cassette Arabidopsis thaliana ecotype Columbia was seeded on modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamin, 2% sucrose, 0.8% agar) and grown at 23 ° C for 3 weeks . The obtained plant was transplanted to a pot previously filled with culture soil and grown in an artificial weather device. Total RNA was extracted from the flower buds and true leaves of the plants 2 weeks after transplantation using a plant RNA extraction kit “RNeasy Plant Mini Kit” (QIAGEN). CDNA was synthesized from the extracted total RNA using a cDNA synthesis kit “ReverTra Ace” (TOYOBO). The FT gene (GenBank Accession Number AB027504) was amplified by PCR using the synthesized cDNA as a template and two kinds of specific primers (FT-1F, FT-1RC). The amplified FT gene was replaced with the GUS gene of pBI221 (Clontech). Using the plasmid thus obtained as a template, fusion PCR is performed using six specific primers (FT-2F, FT-2RC, FT-3F, FT-3RC, FT-4F, FT-1RC). Thus, a mutation without amino acid substitution was introduced into the BamHI site and EcoRI site present in the FT gene, and the XbaI site at the 5 ′ end was changed to a BamHI site. The modified FT gene thus obtained was replaced with the sGFP gene of pKXS-MRE4 / 35S (-90m) -sGFP to prepare pKXS-MRE4 / 35S (-90m) -FT.

FT-1F：5'-taatctagaatgtctataaatataagagaccctc-3'（配列番号２３）
FT-1RC：5'-atagagctcctaaagtcttcttcctccg-3'（配列番号２４）
FT-2F：5'-taaggatccatgtctataaatataagagaccctc-3'（配列番号２５）
FT-2RC：5'-gaacatctggatcgaccataaccaaagta-3'（配列番号２６）
FT-3F：5'-tactttggttatggtcgatccagatgttc-3'（配列番号２７）
FT-3RC：5'-gacacgatgaatacctgcagtggga-3'（配列番号２８）
FT-4F：5'-tcccactgcaggtattcatcgtgtc-3'（配列番号２９） FT-1F: 5′-taatctagaatgtctataaatataagagaccctc-3 ′ (SEQ ID NO: 23)
FT-1RC: 5'-atagagctcctaaagtcttcttcctccg-3 '(SEQ ID NO: 24)
FT-2F: 5'-taaggatccatgtctataaatataagagaccctc-3 '(SEQ ID NO: 25)
FT-2RC: 5'-gaacatctggatcgaccataaccaaagta-3 '(SEQ ID NO: 26)
FT-3F: 5'-tactttggttatggtcgatccagatgttc-3 '(SEQ ID NO: 27)
FT-3RC: 5'-gacacgatgaatacctgcagtggga-3 '(SEQ ID NO: 28)
FT-4F: 5'-tcccactgcaggtattcatcgtgtc-3 '(SEQ ID NO: 29)

（４）転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセット又はＦＴ遺伝子発現カセットとの連結
転写因子遺伝子発現カセットを含むp35S-ACE-CR又はp35S-ACE1DBD/VP16AD-CR、p35S-ACE1/VP16AD-CRを制限酵素HindIII及びEcoRIで処理し、転写因子遺伝子発現カセットを切り出した。また、sGFP遺伝子発現カセットを含むpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFP又はpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFP、ＦＴ遺伝子発現カセットを含むpKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを制限酵素KpnI及びEcoRIで処理し、夫々sGFP遺伝子発現カセット又はＦＴ遺伝子発現カセットを切り出した。
一方、pBI121（Clontech）に含まれるGUS遺伝子発現カセットを、合成オリゴヌクレオチド（HEK-1F、HEK-1RC）に置換し、pBI121-HEKを作製した。pBI121-HEKを制限酵素HindIII及びKpnIで処理した。制限酵素HindIII及びKpnIで処理したpBI121-HEKに、切り出した転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセット又はＦＴ遺伝子発現カセットとをライゲーションすることにより、転写因子遺伝子発現カセットとsGFP遺伝子発現カセット又はＦＴ遺伝子発現カセットとが、夫々のターミネーター側で連結したバイナリーベクターを得た（図１参照）。p35S-ACE1-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(a)、p35S-ACE1DBD/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(b)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-46)-sGFPを由来とするものをベクター(c)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-90m)-sGFPを由来とするものをベクター(d)、p35S-ACE1/VP16AD-CRとpKXS-MRE4/35S(-90m)-FTを由来とするものをベクター(e)とした。 (4) Linkage of transcription factor gene expression cassette and sGFP gene expression cassette or FT gene expression cassette p35S-ACE-CR or p35S-ACE1DBD / VP16AD-CR, p35S-ACE1 / VP16AD-CR containing transcription factor gene expression cassette The transcription factor gene expression cassette was excised by treatment with restriction enzymes HindIII and EcoRI. In addition, pKXS-MRE4 / 35S (-46) -sGFP containing sGFP gene expression cassette or pKXS-MRE4 / 35S (-90m) -FT containing FT gene expression cassette Treatment with restriction enzymes KpnI and EcoRI cut out the sGFP gene expression cassette or FT gene expression cassette, respectively.
On the other hand, the GUS gene expression cassette contained in pBI121 (Clontech) was replaced with synthetic oligonucleotides (HEK-1F, HEK-1RC) to prepare pBI121-HEK. pBI121-HEK was treated with restriction enzymes HindIII and KpnI. Transcription factor gene expression cassette and sGFP gene expression cassette or FT gene are ligated with pBI121-HEK treated with restriction enzymes HindIII and KpnI with the excised transcription factor gene expression cassette and sGFP gene expression cassette or FT gene expression cassette A binary vector linked to the expression cassette on each terminator side was obtained (see FIG. 1). A vector derived from p35S-ACE1-CR and pKXS-MRE4 / 35S (-46) -sGFP and a vector derived from p35S-ACE1DBD / VP16AD-CR and pKXS-MRE4 / 35S (-46) -sGFP Vector (b), p35S-ACE1 / VP16AD-CR and pKXS-MRE4 / 35S (-46) -sGFP derived vector (c), p35S-ACE1 / VP16AD-CR and pKXS-MRE4 / A vector (d) was derived from 35S (-90m) -sGFP, and a vector (e) was derived from p35S-ACE1 / VP16AD-CR and pKXS-MRE4 / 35S (-90m) -FT.

HEK-1F：5'-agcttgaattcgtcgacggtacctaggacgagctc-3'（配列番号３０）
HEK-1RC：5'-aattgagctcgtcctaggtaccgtcgacgaattca-3'（配列番号３１） HEK-1F: 5'-agcttgaattcgtcgacggtacctaggacgagctc-3 '(SEQ ID NO: 30)
HEK-1RC: 5'-aattgagctcgtcctaggtaccgtcgacgaattca-3 '(SEQ ID NO: 31)

実施例２ （組換えタバコ培養細胞におけるGFPの蓄積量解析）
（１）組換えタバコ培養細胞の作製及び選抜
実施例１で作製されたベクター(a)、(b)、(c)、及び(d)がコーティングされた直径1.0μmの金粒子を用いたパーティクルガン法（森川弘道ら著、1992年、植物細胞工学 Vol.4 No.1 p.47-52、秀潤社）により、前記ベクターをそれぞれタバコ培養細胞（BY-2）に導入した。金粒子1mg当たりのDNA量は0.1μgとした。遺伝子導入されたタバコ培養細胞の細胞懸濁液を、遺伝子導入操作後3〜5日目に、30 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地（MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天）に広げた。培養1ヵ月間後に、30 mg/L カナマイシンに耐性を示す細胞塊を選抜し、選抜された細胞塊をその後1〜2週間毎に新しい寒天培地に植え継ぎながら4〜8週間培養した。培養条件は、暗下、23〜25℃とした。 Example 2 (Analysis of GFP accumulation in recombinant tobacco cultured cells)
(1) Production and selection of recombinant tobacco cultured cells Particles using 1.0 μm diameter gold particles coated with vectors (a), (b), (c), and (d) produced in Example 1 The vectors were each introduced into tobacco cultured cells (BY-2) by the cancer method (written by Hiromichi Morikawa et al., 1992, Plant Cell Engineering Vol.4 No.1 p.47-52, Shujunsha). The amount of DNA per 1 mg of gold particles was 0.1 μg. The cell suspension of the transgenic tobacco cells into which the gene has been introduced is modified MS agar medium (MS inorganic salts, 3% sucrose, 1 μM 2,4 containing 30 mg / L kanamycin 3 to 5 days after the gene introduction operation. -D, 1 mg / L thiamin · HCl, 100 mg / L myo-inositol, 200 mg / L KH 2 PO 4 , 0.8% agar). After 1 month of culturing, cell masses resistant to 30 mg / L kanamycin were selected, and the selected cell masses were then cultured for 4 to 8 weeks while being transferred to a new agar medium every 1-2 weeks. The culture conditions were 23-25 ° C. in the dark.

（２）蛍光プレートリーダーによるGFPの蓄積量解析
得られた細胞塊を、誘導発現処理区として100μM CuSO4を含む改変MS寒天培地（MS無機塩類、3% ショ糖、1μM 2,4-D、1 mg/L thiamin・HCl、100 mg/L myo-inositol、200 mg/L KH2PO4、0.8 % 寒天）に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理（以下、誘導発現処理と記すこともある。）を行った（尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。）。
その後、当該誘導発現処理３日間後の細胞塊について、蛍光顕微鏡（Nikon）にて、GFPの蛍光発光状態を調べた。 (2) Analysis of accumulated amount of GFP using a fluorescent plate reader The obtained cell mass was subjected to a modified MS agar medium (MS inorganic salts, 3% sucrose, 1 μM 2,4-D, 100 μM CuSO 4 as an inducible expression treatment group). 1 mg / L thiamin · HCl, 100 mg / L myo-inositol, 200 mg / L KH 2 PO 4 , 0.8% agar), treatment for induced expression of the desired foreign gene with copper ions (Hereinafter, it may also be referred to as inducible expression treatment.) (A modified MS agar medium not containing CuSO 4 was used as the non-inducible expression treatment section).
Thereafter, the fluorescence emission state of GFP was examined with a fluorescence microscope (Nikon) for the cell mass 3 days after the induced expression treatment.

GFPの蛍光発光の増大が観察された細胞塊を液体窒素で凍結した後、当該凍結物にガラスビーズ（0.25〜0.5 mm）及び抽出バッファー（1×PBS(-)、5 mM DTT、1 mM PMSF、0.1 % protease inhibitor cocktail）を加えて、破砕装置「ミキサーミル」（QIAGEN）にて破砕処理した。得られた破砕物を卓上遠心機にて15000 rpm、4℃で5分間遠心することにより上清を回収した後、得られた上清を蛋白質抽出液とした。次いで、当該蛋白質抽出液を適宜、1×PBS(-) で希釈し、得られた希釈液におけるGFPの蛍光強度を、マルチラベルカウンタ「wallac 1420 ARVOMX」（パーキンエルマー）を用いて測定した。尚、標準サンプルとしては、リコンビナントGFP（コスモバイオ）を1×PBS(-)で希釈して得られる希釈液を用いた。測定された蛍光強度から可溶性蛋白質量当たりのGFP換算量を算出し、対照となる野生型の細胞塊での対応値をバックグランドとして差し引くことにより、GFPの蓄積量を算出した。尚、蛋白質抽出液の中の蛋白質濃度はBradford法により定量した。   After freezing the cell mass in which an increase in the fluorescence emission of GFP was observed with liquid nitrogen, glass beads (0.25 to 0.5 mm) and extraction buffer (1 × PBS (−), 5 mM DTT, 1 mM PMSF) were added to the frozen product. , 0.1% protease inhibitor cocktail) was added, and the mixture was crushed with a crusher “Mixer Mill” (QIAGEN). The supernatant was recovered by centrifuging the obtained crushed material at 15000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes in a tabletop centrifuge, and the obtained supernatant was used as a protein extract. Subsequently, the protein extract was appropriately diluted with 1 × PBS (−), and the fluorescence intensity of GFP in the obtained diluted solution was measured using a multi-label counter “wallac 1420 ARVOMX” (Perkin Elmer). As a standard sample, a diluted solution obtained by diluting recombinant GFP (Cosmo Bio) with 1 × PBS (−) was used. The amount of GFP accumulated was calculated by calculating the amount of GFP equivalent per soluble protein mass from the measured fluorescence intensity and subtracting the corresponding value in the wild-type cell mass as a control as the background. The protein concentration in the protein extract was quantified by the Bradford method.

表１に、銅イオン誘導性sGFP遺伝子発現ベクターが導入されてなる組換えタバコ培養細胞における、GFPの蓄積量（GFPの蛍光強度から算出したGFP換算量）の定量の結果を示す。誘導倍率とは、非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量に対する、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量の割合を示している。
ベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して2倍（以下、ベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。）であった。ACE1転写因子のACE1ADをVP16ADに置換したベクター(b)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して4倍（以下、ベクター(b)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。）であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して2倍の改善が認められた。
一方、ACE1転写因子にVP16ADが付加されたベクター(c)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して18倍（以下、ベクター(c)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。）であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して9倍の改善が認められた。
また、as-1サイトに変異を持つ35S（-90m）配列が用いられたベクター(d)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞では、誘導発現処理区でのGFPの蓄積量が非誘導発現処理区でのGFPの蓄積量と比較して18倍（以下、ベクター(d)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と記すこともある。）であり、またベクター(a)が導入されてなる組換えタバコ培養細胞における誘導倍率と比較して9倍の改善が認められた。 Table 1 shows the results of quantification of the amount of GFP accumulated (the amount converted to GFP calculated from the fluorescence intensity of GFP) in cultured recombinant tobacco cells into which a copper ion-inducible sGFP gene expression vector has been introduced. The induction factor indicates the ratio of the accumulated amount of GFP in the induced expression treatment group to the accumulated amount of GFP in the non-induced expression treatment group.
In recombinant tobacco cultured cells into which vector (a) has been introduced, the amount of GFP accumulated in the inducible expression treatment group is twice that in the non-inducible expression treatment group (hereinafter referred to as vector (a). ) May be referred to as the induction ratio in a recombinant tobacco cultured cell into which is introduced). In recombinant tobacco cultured cells into which the vector (b) in which the ACE1 transcription factor ACE1AD is replaced with VP16AD is introduced, the amount of GFP accumulated in the inducible expression treatment group is compared with the amount of GFP accumulated in the non-inducible expression treatment group In the recombinant tobacco cultured cells into which the vector (a) has been introduced, and 4 times (hereinafter also referred to as the induction ratio in the recombinant tobacco cultured cells into which the vector (b) has been introduced). A 2-fold improvement was observed compared to the induction factor.
On the other hand, in the recombinant tobacco cultured cells in which the vector (c) in which VP16AD is added to the ACE1 transcription factor is introduced, the amount of GFP accumulated in the inducible expression treatment group is the same as the amount of GFP accumulated in the non-inducible expression treatment group. Recombinant tobacco cultured cells in which the vector (a) is introduced, and 18 times in comparison (hereinafter referred to as the induction ratio in the recombinant tobacco cultured cells into which the vector (c) is introduced). A 9-fold improvement was observed compared to the induction ratio in.
In addition, in recombinant tobacco cultured cells into which a vector (d) using a 35S (-90m) sequence having a mutation at the as-1 site has been introduced, the accumulated amount of GFP in the inducible expression treatment group is non-inducible 18 times the amount of GFP accumulated in the treated area (hereinafter, also referred to as induction ratio in recombinant tobacco cultured cells into which vector (d) has been introduced), and vector (a) A 9-fold improvement was observed compared to the induction factor in the introduced recombinant tobacco cultured cells.

Figure 2010057402
Figure 2010057402

実施例３ （組換えシロイヌナズナの開花誘導）
（１）組換えシロイヌナズナの作製及び選抜
実施例１で作製されたベクター(e)をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens strain C58C1）に導入した。得られたアグロバクテリウムを50 mg/L カナマイシン、100 mg/L アンピシリン、100 mg/L リファンピシンを含むLB寒天培地（0.5% 酵母エキス、1.0% バクトトリプトン、0.5% 食塩、1% 寒天）で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することにより、組換えアグロバクテリウムを得た。得られた組換えアグロバクテリウムを、モデル植物ラボマニュアル（岩渕雅樹他編集、2000年、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、ISBN 4-431-70881-2 C3045）に記載される方法に準じて、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia）に感染させることにより、遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたシロイヌナズナから採取されたT1種子を、20 mg/L ベンレート、200 mg/L クラフォラン、25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、1% ショ糖、0.8 % 寒天）に播種し生育した後、カナマイシンに耐性を示す植物個体を選抜した。選抜された植物個体を予め培土が入れられたポットに移植し、人工気象器内で生育させることにより、Ｔ２種子を得た。得られたＴ２種子を25 mg/L カナマイシンを含む改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天）に播種し生育した後、χ2検定に基づいた５％の有意水準において、カナマイシンに耐性を示す植物個体が3:1の割合で出現するラインを選抜した。尚、植物個体の生育のための培養条件は、明期23時間、暗期1時間、23〜25℃とした。 Example 3 (Flowering induction of recombinant Arabidopsis thaliana)
(1) Production and selection of recombinant Arabidopsis thaliana The vector (e) produced in Example 1 was introduced into Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens strain C58C1). The resulting Agrobacterium was LB agar medium (0.5% yeast extract, 1.0% bactotryptone, 0.5% salt, 1% agar) containing 50 mg / L kanamycin, 100 mg / L ampicillin, 100 mg / L rifampicin. Recombinant Agrobacterium was obtained by culturing and selecting drug-resistant colonies. According to the method described in the model plant lab manual (edited by Masaki Iwasaki et al., 2000, Springer Fairlark Tokyo, ISBN 4-431-70881-2 C3045), the obtained recombinant Agrobacterium, Gene transfer was performed by infecting Arabidopsis thaliana ecotype Columbia. T 1 seed collected from transgenic Arabidopsis thaliana was prepared using a modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamins, 1% sucrose, 20 mg / L benrate, 200 mg / L claforan, 25 mg / L kanamycin, After planting and growing on 0.8% agar), plant individuals resistant to kanamycin were selected. Transplanted selected plant individual culture soil was previously placed the pot, by growth in a climate, to obtain T 2 seeds. The resulting T 2 seeds modified MS agar medium containing 25 mg / L kanamycin (MS inorganic salts, B5 vitamin, 2% sucrose, 0.8% agar) after seeding and grown to 5% based on the chi 2 test At the significance level, a line in which plant individuals resistant to kanamycin appear at a ratio of 3: 1 was selected. The culture conditions for plant growth were 23 hours light, 1 hour dark, and 23-25 ° C.

（２）組換えシロイヌナズナの開花誘導
選抜されたラインについて、Ｔ２種子を、改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8% 寒天）に播種した。明期23時間、暗期1時間、23〜25℃の条件下で11日間生育させた植物個体を誘導発現処理区として50μM CuSO4を含む改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天）に移植することにより、銅イオンによる目的とする外来遺伝子の誘導発現のための処理（以下、誘導発現処理と記すこともある。）を行った（尚、非誘導発現処理区として CuSO4を含まない改変MS寒天培地を用いた。）。 (2) Flowering induction selected by the line of recombinant Arabidopsis, a T 2 seeds, modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamin, 2% sucrose, 0.8% agar) was inoculated into. Modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamins, 2%) containing 50 μM CuSO 4 as an induced expression treatment plant plant grown for 11 days under conditions of 23 hours light period, 1 hour dark period, 23-25 ° C. Transplanted into sucrose (0.8% agar) for treatment of induced expression of the desired foreign gene with copper ions (hereinafter sometimes referred to as induced expression treatment) (Non-induced expression) A modified MS agar medium containing no CuSO 4 was used as the treatment section.)

当該誘導発現処理6時間後の植物個体を、CuSO4を含まない改変MS寒天培地（MS無機塩類、B5ビタミン、2% ショ糖、0.8 % 寒天）に移植した。当該誘導発現処理後5日目の植物個体を観察した。その結果、誘導発現処理区では、非誘導発現処理区と比較して、早期に開花が誘導された（図２参照）。 The plant individual 6 hours after the induced expression treatment was transplanted to a modified MS agar medium (MS inorganic salts, B5 vitamin, 2% sucrose, 0.8% agar) not containing CuSO 4 . Plant individuals on the fifth day after the induced expression treatment were observed. As a result, flowering was induced earlier in the inducible expression treatment group than in the non-inducible expression treatment group (see FIG. 2).

本発明により、開花時期制御に関わる外来遺伝子が導入されてなる形質転換植物について、銅イオン依存的に開花時期の制御を行う方法等を提供することが可能となる。   According to the present invention, it is possible to provide a method for controlling flowering time in a copper ion-dependent manner for a transformed plant into which a foreign gene related to flowering time control has been introduced.

図１は、銅イオン誘導性sGFP遺伝子発現ベクター及び銅イオン誘導性ＦＴ遺伝子発現ベクターのT-DNA領域の構造を示す模式図である。図中の＊印は、as-1サイトへの変異導入部位を示している。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the T-DNA region of a copper ion-inducible sGFP gene expression vector and a copper ion-inducible FT gene expression vector. The * mark in the figure indicates the site for introducing a mutation into the as-1 site. 図３は、銅イオン誘導性ＦＴ遺伝子発現ベクターが導入されてなる組換えシロイヌナズナにおける、開花時期の相違を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the difference in flowering time in recombinant Arabidopsis thaliana into which a copper ion-inducible FT gene expression vector has been introduced.

配列番号１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
置換ＤＮＡ断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
置換ＤＮＡ断片のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３１
アダプターのために設計されたオリゴヌクレオチド SEQ ID NO: 1
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 2
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 4
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 5
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 6
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 7
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 8
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 9
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 10
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 11
Oligonucleotide designed for adapter SEQ ID NO: 12
Oligonucleotide designed for adapter SEQ ID NO: 13
Oligonucleotide designed for replacement DNA fragment SEQ ID NO: 14
Oligonucleotide designed for replacement DNA fragment SEQ ID NO: 15
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 16
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 17
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 18
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 19
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 20
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 21
Oligonucleotide designed for adapter SEQ ID NO: 22
Oligonucleotide designed for adapter SEQ ID NO: 23
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 24
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 25
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 26
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 27
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 28
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 29
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 30
Oligonucleotide designed for adapter SEQ ID NO: 31
Oligonucleotides designed for adapters

Claims (13)

下記の遺伝子構築物が導入されてなる植物に銅イオンを接触させることを特徴とする前記植物の開花時期を制御する方法。
遺伝子構築物；
銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列を含有する遺伝子構築物。前記転写因子が銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する。 A method for controlling the flowering time of the plant, which comprises bringing a copper ion into contact with a plant into which the following gene construct is introduced.
Genetic constructs;
A gene construct comprising a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. The transcription factor contains a DNA binding region of a first transcription factor activated by copper ions and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor. 銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、請求項１記載の方法。   Transcription factors that are activated by copper ions and induce transcription of foreign genes involved in plant flowering time control are the DNA binding region and the transcriptional activation region of the first transcription factor activated by copper ions and the first The method according to claim 1, comprising a transcription activation region of at least one transcription factor different from the transcription factor. 銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
＜転写因子群＞
（１）真核生物由来の転写因子
（２）酵母由来の転写因子
（３）酵母ACE1由来の転写因子 The method according to claim 1, wherein the first transcription factor activated by copper ions is a transcription factor selected from the following transcription factors.
<Transcription factors>
(1) Eukaryotic transcription factor (2) Yeast-derived transcription factor (3) Yeast ACE1-derived transcription factor 第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
＜転写因子群＞
（１）ウイルス由来の転写因子
（２）シンプレックスウイルス属に属するウイルス由来の転写因子
（３）単純ヘルペスウイルス由来の転写因子
（４）単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６転写因子 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the transcription factor different from the first transcription factor is a transcription factor selected from the following transcription factors.
<Transcription factors>
(1) Transcription factor derived from virus (2) Transcription factor derived from virus belonging to the genus of simplex virus (3) Transcription factor derived from herpes simplex virus (4) VP16 transcription factor derived from herpes simplex virus 開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
＜外来遺伝子群＞
（１）植物由来の遺伝子
（２）被子植物由来の遺伝子
（３）双子葉植物由来の遺伝子
（４）アブラナ科植物由来の遺伝子
（５）シロイヌナズナ由来の遺伝子
（６）シロイヌナズナＦＴ由来の遺伝子 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the foreign gene involved in flowering time control is a foreign gene selected from the following foreign gene group.
<Foreign gene group>
(1) Gene derived from plant (2) Gene derived from angiosperm (3) Gene derived from dicotyledonous plant (4) Gene derived from Brassicaceae plant (5) Gene derived from Arabidopsis (6) Gene derived from Arabidopsis FT 前記の遺伝子構築物が、銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 The gene construct is a gene construct constructed by adding a promoter upstream of a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. A method according to any of claims 1 to 5, characterized in that 植物の開花時期を制御するための遺伝子構築物であって、
（ａ）銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子であって、前記転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域とを含有する、前記転写因子をコードする塩基配列と、
（ｂ）前記転写因子により転写を誘導され且つ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子を発現する遺伝子発現カセットと
を有するように構築可能に調製されてなることを特徴とする遺伝子構築物。 A genetic construct for controlling the flowering time of a plant,
(A) A transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control, wherein the transcription factor is a DNA binding of a first transcription factor that is activated by copper ions A nucleotide sequence encoding the transcription factor, comprising a region and a transcription activation region of at least one transcription factor different from the first transcription factor;
(B) A gene construct characterized in that it is prepared so as to be capable of being constructed so as to have a gene expression cassette that is induced by the transcription factor and expresses a foreign gene involved in plant flowering time control. 銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子が、銅イオンにより活性化される第一の転写因子のＤＮＡ結合領域及び転写活性化領域と第一の転写因子とは異なる少なくとも一つの転写因子の転写活性化領域を含有する、請求項７記載の遺伝子構築物。   Transcription factors that are activated by copper ions and induce transcription of foreign genes involved in plant flowering time control are the DNA binding region and the transcriptional activation region of the first transcription factor activated by copper ions and the first The gene construct according to claim 7, comprising a transcription activation region of at least one transcription factor different from the transcription factor. 銅イオンにより活性化される第一の転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする請求項７又は８に記載の遺伝子構築物。
＜転写因子群＞
（１）真核生物由来の転写因子
（２）酵母由来の転写因子
（３）酵母ACE1由来の転写因子 The gene construct according to claim 7 or 8, wherein the first transcription factor activated by copper ions is a transcription factor selected from the following transcription factors.
<Transcription factors>
(1) Eukaryotic transcription factor (2) Yeast-derived transcription factor (3) Yeast ACE1-derived transcription factor 第一の転写因子とは異なる転写因子が、下記の転写因子から選ばれてなる転写因子であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかにに記載の遺伝子構築物。
＜転写因子群＞
（１）ウイルスの転写因子
（２）シンプレックスウイルス属に属するウイルスの転写因子
（３）単純ヘルペスウイルスの転写因子
（４）単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６転写因子 The gene construct according to any one of claims 7 to 9, wherein the transcription factor different from the first transcription factor is a transcription factor selected from the following transcription factors.
<Transcription factors>
(1) Transcription factor of virus (2) Transcription factor of virus belonging to the genus of simplex virus (3) Transcription factor of herpes simplex virus (4) VP16 transcription factor of herpes simplex virus 開花時期制御に関わる外来遺伝子が、下記の外来遺伝子群から選ばれてなる外来遺伝子であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の遺伝子構築物。
＜外来遺伝子群＞
（１）植物由来の遺伝子
（２）被子植物由来の遺伝子
（３）双子葉植物由来の遺伝子
（４）アブラナ科植物由来の遺伝子
（５）シロイヌナズナ由来の遺伝子
（６）シロイヌナズナＦＴ由来の遺伝子 The gene construct according to any one of claims 7 to 10, wherein the foreign gene involved in flowering time control is a foreign gene selected from the following foreign gene group.
<Foreign gene group>
(1) Gene derived from plant (2) Gene derived from angiosperm (3) Gene derived from dicotyledonous plant (4) Gene derived from Brassicaceae plant (5) Gene derived from Arabidopsis (6) Gene derived from Arabidopsis FT 銅イオンにより活性化されかつ植物の開花時期制御に関わる外来遺伝子の転写を誘導する転写因子をコードする塩基配列の上流に、プロモーターを付加され構築されてなる遺伝子構築物であることを特徴とする請求項８〜１３のいずれかに記載の遺伝子構築物。   A gene construct which is constructed by adding a promoter upstream of a base sequence encoding a transcription factor that is activated by copper ions and induces transcription of a foreign gene involved in plant flowering time control. Item 14. The gene construct according to any one of Items 8 to 13. 請求項７〜１２のいずれかに記載の遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換植物。   A transformed plant comprising the gene construct according to any one of claims 7 to 12 introduced therein.
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