JP2004500044A - Flowering time qualified - Google Patents

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クリールマン,ロバート
ケディー,ジェームズ
サマハ,レイモンド
ジャン,キャイ−チョン
ハード,ジャクリーン
ラトクリフェ,オリヴァー
リーチマン,ジョセ・ルイス
リューバー,リン
Original Assignee
クリールマン,ロバート
ケディー,ジェームズ
サマハ,レイモンド
ジャン,キャイ−チョン
ハード,ジャクリーン
メンデル・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド
ラトクリフェ,オリヴァー
リーチマン,ジョセ・ルイス
リューバー,リン
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Abstract

植物の開花時期を修飾するための組換えポリヌクレオチドおよび方法が提供される。 Recombinant polynucleotides and methods for modifying the flowering time of a plant is provided. 上記組換えポリヌクレオチドにより形質転換された植物は特定の条件下で加速されたか、遅延されたかまたは誘導された開花時期を有してよい。 A plant transformed with the recombinant polynucleotide or has been accelerated under certain conditions, may have a flowering that is or derived delayed. さらに、形質転換された植物は変更された春化処理の要求を有してよい。 Further, the transformed plant may have a request of the changed vernalization.

Description

【0001】 [0001]
本発明は、US仮出願シリアル番号60/159,464(1999年10月12日に出願);60/164,132(1999年11月8日に出願);60/166,228(1999年11月17日に出願);60/197,899(2000年4月17日に出願);そしてPlant Trait Modification III(2000年8月22日に出願)から、部分的に優先権を主張する。 The present invention, US Provisional Application Serial No. 60 / 159,464 (filed October 12, 1999); (filed November 8, 1999) 60 / 164,132; 60 / 166,228 (1999 11 month filed 17 days); 60 / 197,899 (filed Apr. 17, 2000); from the Plant Trait Modification III (filed August 22, 2000), claims the partial priority.
【0002】 [0002]
発明の属する分野 FIELD OF THE INVENTION
本発明は、植物分子生物学の分野に属し、そして植物の開花時期または春化処理要求性を修飾するための組成物および方法に関する。 The present invention belongs to the field of plant molecular biology and relates to compositions and methods for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant.
【0003】 [0003]
発明の背景 Background of the Invention
繁殖成功率を最大にするために、植物は、好ましい条件下で開花することを確実にするための複雑なメカニズムを進化させてきた。 To the reproductive success rate maximum, plants have evolved a complex mechanism to ensure that flowering under the preferred conditions. シロイヌナズナ(Arabidopsis)における最近の開花変異体および生態型を解析したところ、このようなメカニズムが、80またはそれ以上の遺伝子が含有されている可能性がある、いくつかの遺伝子経路に基づいていることが示された(Martinez−Zapater and Somerville, (1990) Plant Physiol. 92:770−776; Koornneef et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229:57−66; EM Meyerwitz and CR Somerville Eds (1994) Arabidopsis pp 403−433 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。 It was analyzed recent flowering mutants and ecotypes in Arabidopsis (Arabidopsis), that such mechanisms, 80 or more genes might have been contained, based on several gene pathway It was shown (Martinez-Zapater and Somerville, (1990) Plant Physiol 92:... 770-776; Koornneef et al (1991) Mol Gen. Genet 229:. 57-66; EM Meyerwitz and CR Somerville Eds (1994 ) Arabidopsis pp 403-433 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 同時に、これらの座位は、環境的変数(たとえば、日照時間、気温、光質(light quality)、そして栄養吸収率(availability)など)により、そして植物の発生段階により、開花時期を調整する。 At the same time, these loci, environmental variables (e.g., sunshine hours, temperature, light quality (light quality), and nutrient absorption rate (availability), etc.) by, and the developmental stage of the plant, to adjust the flowering time.
【0004】 [0004]
Arabidopsisは、16時間の長日条件下または連続明期条件下で成長させたときに急速に開花するが、8または10時間明期の短日条件下では、ずっとゆっくりと開花する。 Arabidopsis is rapidly flowering when grown under long-day conditions or continuous light period under the conditions of 16 hours, in the short-day conditions of 8 or 10 hours light period, flowering much more slowly. この反応を制御する遺伝子は、光周期経路を構成し、そして長日条件下で開花の遅延を引き起こすが、短日条件においては開花を変化させない変異体により同定された。 Genes controlling this reaction constitutes the photoperiod pathway and cause delays flowering under long-day conditions, but was identified by mutants that do not alter the flowering in short-day conditions. 長日に応答して開花を促進するこの群に由来する例には、CONSTANS(CO)、GIGANTEA(GI)、FT、FWA、FE、FD、およびFHAが含まれる。 Examples derived from this group to promote flowering in response to long days, CONSTANS (CO), GIGANTEA (GI), FT, FWA, FE, FD, and include FHA. LUMINIDEPENDENS(LD)、FCA、FVE、FY、およびFPAを含む遺伝子の第二の群は、全ての日照条件下で活性である自律性経路を形成する。 LUMINIDEPENDENS (LD), FCA, FVE, FY, and a second group of genes, including FPA forms an autonomous pathway which is active in all sunshine conditions. この第二の群の遺伝子についての変異体は、日照条件に関わりなく、野生型対照よりも開花が遅い(Koornneef et al. (1991) Mot Gen. Genet, 229:57−66; EM Meyerwitz and CR Somerville Eds (1994) Arabidopsis pp 403−433 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。 The second variant of the group of genes of, irrespective of insolation conditions, flowering than wild type control is slow (Koornneef et al (1991) Mot Gen. Genet, 229:. 57-66; EM Meyerwitz and CR Somerville Eds (1994) Arabidopsis pp 403-433 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
【0005】 [0005]
日照条件に対するその応答性が異なることに加えて、光周期経路および自律性経路に由来する変異体は、長時間寒冷条件(春化)処理に対してディファレンシャルな応答性を示す(Vince−Prue, (1975) Vernalization. In Photoperiodism in Plants pp 263−291, McGraw Hill, London)。 In addition to its responsiveness to sunlight conditions are different, mutants derived from the photoperiod pathway and autonomic pathways shows Differential responsiveness to prolonged cold conditions (vernalization) processing (Vince-Prue, (1975) Vernalization. in Photoperiodism in Plants pp 263-291, McGraw Hill, London). 春化処理反応を介して、たとえばStockholmなどのより高北緯に由来するArabidopsisの生態型は、寒冷冬季条件さらされることにより、春の開花に適応している。 Through the vernalization response, for example ecotype Arabidopsis derived from higher latitude, such as Stockholm, by being exposed cold winter conditions, it is adapted to flowering spring. このことにより、冬季条件の開始により種子の成熟が短縮される可能性がある場合に、夏の終わりに開花することを回避する(Reeves and Coupland, (2000) Curr. Opin. Plant Biol 3:37−42)。 Thus, when there is a possibility that seed maturation is shortened by the start of winter conditions, avoids flowering late summer (Reeves and Coupland, (2000) Curr. Opin. Plant Biol 3:37 -42). これらの生態型を研究室内で生育させると、それらは遅くに開花するが、種子の発芽期間に4〜6週間の寒冷期間を設けると、ずっと早くに開花しうる。 When growing these ecotype in the laboratory, they are flowering in late, but the provision of the cold period of four to six weeks in germination period of seeds, can be flowering in much faster. 同様に、自律性経路に由来する変異体は、春化処理に供した場合、開花時期の非常に顕著な短縮を示す。 Similarly, mutants derived from the autonomous pathway, when subjected to vernalization treatment, shows a very significant reduction of the flowering time. 対照的に、光周期経路に由来する変異体は、寒冷処理に対してわずかな応答しか示さない(Chandler et al., (1996) Plant J. 10:637−644; Koornneef et al., (1998) Genetics 148:885−892)。 In contrast, mutants derived from the photoperiod pathway exhibit only a slight response to cold treatment (Chandler et al, (1996) Plant J. 10:.. 637-644; Koornneef et al, (1998 ) Genetics 148: 885-892). このように、春化処理により、自律性経路条件についての要求性を克服することができる(Reeves and Thus, by vernalization, you can overcome the requirement for autonomous pathway conditions (Reeves and Coupland, (2000) Curr. Coupland, (2000) Curr. Opin. Opin. Plant Biol 3:37−42)。 Plant Biol 3: 37-42).
【0006】 [0006]
2種類のArabidopsisの遺伝子、FLOWERING LOCUS C(開花座位C、FLC)(FLOWERING LOCUS F、FLFとしても知られる)およびFRIGIDA(FRI)は、一緒になって、春化処理を行わない場合に開花を抑制する様に働く(Napp−Zinn, K. (1957) Indukt. Abstammungs. Verebungsl. 88:253285; Napp−Zinn K. (1985) CRC Handbook of Flowering, Vol. 1, A. H. Halevy, pp 492−503; Clarke and Dean (1994) Mol. Gen. Genet. 248:81−89; Koornneef. et al., (1994) Plant Jo Two Arabidopsis gene, FLOWERING LOCUS C (flowering locus C, FLC) (FLOWERING LOCUS F, also known as FLF) and FRIGIDA (FRI) together, the flowering case without vernalization It acts so as to suppress (Napp-Zinn, K. (1957) Indukt Abstammungs Verebungsl 88:.... 253285; Napp-Zinn K. (1985) CRC Handbook of Flowering, Vol 1, A. H. Halevy, pp 492 . -503; Clarke and Dean (1994) Mol Gen. Genet 248:... 81-89; Koornneef et al, (1994) Plant Jo rnal 6:911−919; Lee et al., (1994) Plant Journal 6:903−909.)。 rnal 6:. 911-919; Lee et al, (1994) Plant Journal 6: 903-909).. FLCおよびFRIの優勢機能的アリルが、PitztalやStockholmなどの北部ヨーロッパArabidopsis生態型において、ともに見つかっている。 Predominant functional allyl of the FLC and FRI is, in northern Europe Arabidopsis ecotype such as Pitztal and Stockholm, they are both found. これらの生態型は、春化処理しない場合に、極端に遅く開花する。 These ecotypes, if not vernalization to flower extremely slow. 広く使用されている研究室生態型Columbiaは、これらの2座位のうちの一つのみに機能的アリルを含有し、そしていずれの遺伝子の機能的アリルも持っていないLandsberg erectaなどの系統に比べていくぶん遅く開花する。 Laboratory ecotype Columbia widely used contains a functional allyl one only of these two loci, and compared to systems such as Landsberg erecta without also has functional allyl any gene somewhat late flowering. FRIGIDAタンパク質配列は、未だ公開されていない。 FRIGIDA protein sequence has not yet been published. しかしながら、FLC遺伝子は、最近クローニングされ、そしてMADS boxタンパク質をコードすることが示された(Sheldon C. et al., 1999, Plant Cell 11:445−458; Michaels S. and Amasino, R., 1999, Plant Cell 11:949−956)。 However, FLC gene was recently cloned and MADS box proteins have been shown to encode (Sheldon C. et al, 1999, Plant Cell 11:. 445-458; Michaels S. and Amasino, R., 1999 , Plant Cell 11: 949-956). FLCの優勢アリルおよび過剰発現により開花が遅れること、そして一方でヌルflc変異体は早期に開花することが報告された(Lee et al., (1994) Plant J. 6:903−909; Michaels and Amasino, (1999) Plant Cell 11:949−956; Sheldon et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:3753−3758)。 Flowering by dominant allyl and overexpression of the FLC is delayed, and while the null flc mutant was reported to flowering early (Lee et al, (1994) Plant J. 6:. 903-909; Michaels and Amasino, (1999) Plant Cell 11:..... 949-956; Sheldon et al, (1999) Proc Natl Acad Sci 97: 3753-3758). このように、FLCは成熟前開花を防止する様に働く。 In this way, FLC works so as to prevent the premature flowering.
【0007】 [0007]
我々は、植物の開花時期または春化処理要求性を制御する転写因子を見いだした。 We have found the transcription factor that controls flowering time or vernalization requirement of the plant. これらの転写因子は、したがって、植物の開花特性を操作するために有用であり得る。 These transcription factors, thus, may be useful to manipulate the flowering characteristics of a plant.
【0008】 [0008]
発明の概要 Summary of the Invention
一側面において、本発明は、組換えポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物に関する。 In one aspect, the present invention relates to a transgenic plant comprising a recombinant polynucleotide. 組換えポリヌクレオチドは、SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)からなるがSEQ ID No: 28を除く群から選択される配列の、少なくとも6の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、組換えポリヌクレオチドの存在は、組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物の同一の特性と比較する場合、トランスジェニック植物の開花時期または春化処理要求性を変化させる。 Recombinant polynucleotide, SEQ ID No: 2N (where N is 1 to 28), but SEQ ID No consists: 28 sequence selected from the group except for a polypeptide comprising consecutive amino acids of at least 6 comprises a nucleotide sequence encoding a presence of a recombinant polynucleotide, when compared to the same characteristics of another plant that does not contain the recombinant polynucleotide, altering flowering time or vernalization requirement of the transgenic plants .
【0009】 [0009]
一態様において、ヌクレオチド配列は、1)局在性ドメイン、2)活性化ドメイン、3)抑制ドメイン、4)オリゴマー化ドメイン、または5)SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)のDNA結合ドメイン、などの保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。 In one aspect, nucleotide sequence, 1) localization domain, 2) activation domain, 3) repression domain, 4) the oligomerization domain or 5) SEQ ID No,: 2N (here N is 1 to 28 DNA binding domain of) encoding a polypeptide comprising a conserved domain like. 別の態様において、組換えポリヌクレオチドは、SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。 In another embodiment, the recombinant polynucleotide, SEQ ID No: the 2N conserved domains (where N is the is 1-28) with high sequence identity than 84% to a sequence selected from the group consisting of It encodes a polypeptide comprising. さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む。 In a further embodiment, the nucleotide sequence further comprises an operably linked promoter to the nucleotide sequence. プロモーターは、構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型であってもよい。 Promoter, either constitutive, or inducible, or may be a tissue activated.
【0010】 [0010]
第二の側面において、本発明は、植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法に関する。 In a second aspect, the present invention relates to a method for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant. この方法は、(a)SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)からなる群から選択した配列の、少なくとも6の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし;(b)トランスフォームされた植物を選択し;そして(c)所望の特性についてトランスフォームした植物を同定する;ことを含む。 This method, (a) SEQ ID No: 2N (here, N is 1-28) sequence selected from the group consisting of a set comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising consecutive amino acids of at least 6 comprising; identifying transformed plants for and (c) the desired properties; by recombinant polynucleotide, the plant transformed; (b) selecting the transformed plant.
【0011】 [0011]
一態様において、ヌクレオチド配列は、1)局在性ドメイン、2)活性化ドメイン、3)抑制ドメイン、4)オリゴマー化ドメイン、または5)SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)であるがSEQ ID No: 28を除くDNA結合ドメインなどの保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。 In one embodiment, the nucleotide sequence 1) localization domain, 2) activation domain, 3) repression domain, 4) the oligomerization domain or 5) SEQ ID No,: 2N (here N is 1 to 28 ) and it is but SEQ ID No: encoding a polypeptide comprising a conserved domain, such as a DNA-binding domain with the exception of 28. 別の態様において、組換えポリヌクレオチドは、SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。 In another embodiment, the recombinant polynucleotide, SEQ ID No: 2N conserved domains (where N is 1 to 28) to a sequence selected from the group consisting of, having a high sequence identity than 84% encoding a polypeptide comprising a. さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む。 In a further embodiment, the nucleotide sequence further comprises an operably linked promoter to the nucleotide sequence. プロモーターは、構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型であってもよい。 Promoter, either constitutive, or inducible, or may be a tissue activated.
【0012】 [0012]
第三の側面において、本発明は、開花時期または植物の春化処理要求性と関連する植物の特性を変更するための別の方法に関する。 In a third aspect, the present invention relates to another method for changing the characteristics of a plant associated with the vernalization requirement of flowering or plant. この方法は、(a)SEQ ID No: 2N−1(ここでNは1〜28である)からなるがSEQ ID No: 27を除く群から選択される配列の、少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし;そして(b)前記トランスフォームされた植物を選択する;ことを含む。 This method, (a) SEQ ID No: the sequence selected from the group except the 27, at least 18 contiguous nucleotides: 2N-1 (where N is 1 to 28), but SEQ ID No consisting the recombinant polynucleotide comprising a nucleotide sequence comprising, a plant transformed; comprising; and (b) said selecting transformed plant.
【0013】 [0013]
さらに別の側面において、本発明は、植物の開花時期または春化処理要求性を変更するさらに別の方法である。 In yet another aspect, the present invention is yet another way to change the flowering or vernalization requirement of the plant. この方法は、(a)データベース配列を準備し;(b)そのデータベース配列を、SEQ ID No: 2N(ここでNは1〜28である)から選択されるポリペプチドと比較し;(c)選択された配列分類に合致するデータベース配列を選択し、;そして(d)前記データベース配列を植物中にトランスフォームする;ことを含む。 This method, (a) preparing a database sequences; (b) the database sequence, SEQ ID No: 2N (where N is a is 1 to 28) compared to a polypeptide selected from; (c) select the database sequences matching the selected sequence classification; comprises; a and; (d) a database sequence transformed into plants. あるいは、このデータベース配列は、SEQ ID No: 2N−1(ここでNは1〜28である)から選択されるポリヌクレオチドと比較してもよい。 Alternatively, the database sequence, SEQ ID No: 2N-1 (where N is 1 to 28) may be compared with polynucleotide selected from.
【0014】 [0014]
発明の詳細な説明 Detailed Description of the Invention
定義 Definition
“組換えポリヌクレオチド”は、遺伝子コード配列またはその断片を含むヌクレオチド配列である(少なくとも18の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも30の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも50の連続したヌクレオチドを含む)。 "Recombinant polynucleotide" is a nucleotide sequence comprising the gene coding sequence or a fragment thereof (comprising at least 18 consecutive nucleotides, preferably at least 30 contiguous nucleotides, and more preferably at least 50 contiguous nucleotides) . さらに、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、5'または3'非翻訳領域、リポーター遺伝子、選択可能マーカーなどを含んでもよい。 Furthermore, the polynucleotide promoter, an intron, an enhancer region, a polyadenylation site, a translation initiation site, 5 'or 3' untranslated regions, a reporter gene may include such selectable marker. ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAを含んでもよい。 Polynucleotide may comprise a DNA or RNA single stranded or double stranded. ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾バックボーンを含んでもよい。 A polynucleotide may comprise modified bases or modified backbones. ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、転写物配列(たとえばmRNA)またはプロセスされたヌクレオチド配列(たとえば、cDNA)を含んでもよい。 Polynucleotides, genomic sequences, transcript sequences (e.g. mRNA) or process nucleotide sequences (e.g., cDNA) may contain. ポリヌクレオチドは、センス方向かまたはアンチセンス方向かの、いずれかで配列を含んでもよい。 Polynucleotide, whether sense orientation or in antisense orientation, may comprise a sequence in either.
【0015】 [0015]
“組換えポリヌクレオチド”は、天然の状態では存在しないポリヌクレオチドであり、たとえば、ポリヌクレオチドが天然では見いだされないヌクレオチド配列を含むか、またはポリヌクレオチドが典型的には近接しているヌクレオチド配列と分離している場合、または典型的には近接していないヌクレオチド配列と隣接している場合である。 "Recombinant polynucleotide" is a polynucleotide that does not exist in a natural state, for example, a nucleotide sequence or polynucleotide comprises a nucleotide sequence not found in nature, or the polynucleotide is typically in close proximity If separate, or typically the case that is adjacent to a nucleotide sequence that is not close.
【0016】 [0016]
“組換えポリペプチド”は、組換えポリヌクレオチドの翻訳に由来するポリペプチドであるか、または野生型細胞において天然の状態であるポリペプチドよりも細胞内で増加している、たとえば5%以上増加している、10%以上増加している、または20%以上増加しているものであり、そして野生型植物の天然の反応の結果ではなく、または典型的には細胞中で結合しているその他の構成物質とは分離される。 "Recombinant polypeptide" increase recombinant polynucleotide whether a polypeptide derived from translation, or than the polypeptide is a natural state in a wild-type cells has increased in a cell, for example more than 5% It is, has increased by 10% or more, or those have increased more than 20%, and not the result of a natural response of a wild-type plant, or other that is typically attached in cells the constituents are separated.
【0017】 [0017]
“トランスジェニック植物”は、同一種の野生型植物中、または天然に存在する品種中、または栽培品種中、には通常は見いだされず、そしてヒトの操作により植物中に導入された、遺伝的物質を含有する植物である。 "Transgenic plant" is a wild-type plant of the same species, or variety of a naturally occurring, or a cultivar, usually not found in, and is introduced into the plant by human manipulation, genetic material is a plant that contains. トランスジェニック植物は、発現ベクターまたはカセットを含有していてもよい植物である。 Transgenic plants are good plant also contain expression vectors or cassettes. 発現カセットは、遺伝子コード配列を含み、そして遺伝子コード配列の発現を可能にする。 Expression cassette comprises a gene coding sequence, and allows the expression of the gene coding sequence. 発現カセットは、トランスフォームにより、または親植物のトランスフォームの後に交配により、導入することができる。 Expression cassette, the transform, or by crossing after transform parent plants can be introduced.
【0018】 [0018]
トランスジェニック植物は、全体の植物のことだけでなく、たとえば、種子、果実、葉、または根などの植物の部分、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、またはいずれか他の植物物質、そしてその子孫のことをいう。 Transgenic plants are not only a whole plant, for example, seeds, fruits, leaves or parts of plants such as roots, plant tissue, plant cells, protoplasts or any other plant material, and the progeny thereof say that.
【0019】 [0019]
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現に関して“変化した発現”という言い回しは、野生型植物における発現パターンとは異なるトランスジェニック植物における発現パターンのことをいい;あるいは、たとえば、野生型植物において配列が発現される細胞型とは異なる細胞型において発現されること、または野生型植物において配列が発現される時期とは異なる時期に発現されること、またはホルモンや環境シグナルなどの異なる誘導性物質に反応すること、または野生型植物において見られる発現レベルと比較して異なる発現レベル(より高い場合かより低い場合かのいずれか)であること、などである。 The phrase "altered expression" for expression of a polynucleotide or polypeptide, refers to the expression pattern in different transgenic plants as expression pattern in a wild type plant; or, for example, is expressed sequence in wild-type plants that the cell type is expressed in different cell types, or the sequence in wild-type plants is expressed at different times than the time expressed, or to respond to different inducing agent, such as hormones or environmental signals, or wild-type found in plant expression level compared to different expression levels (either when a higher lower than or case), and the like. この用語はまた、検出レベル以下まで発現レベルを低下させること、または発現を完全になくすこともいう。 The term also be used to reduce the expression level to the detection level or less, or even be completely eliminated expression say. 結果として得られる発現パターンは、一過性であってもまたは安定的であってもよく、構成的であってもまたは誘導性であってもよい。 The resulting expression pattern can be a well or stably be transient, it may be also or inducible be constitutive.
【0020】 [0020]
“転写因子”(TF)は、1またはそれ以上の遺伝子の発現を、遺伝子コード配列と結合する1またはそれ以上のヌクレオチド配列を結合することにより直接的に、または遺伝子コード配列と結合する1またはそれ以上のヌクレオチド配列と直接的に調節するかまたは間接的に実際に結合するその他のポリペプチドのレベルまたは活性に影響を与えることにより間接的に調節する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことをいう。 "Transcription factor" (TF) is the expression of one or more genes, directly by combining one or more nucleotide sequences that bind to the gene coding sequence, or 1 or binds to the gene coding sequence indirectly adjusted by influencing the more nucleotide sequences and directly modulate or indirectly other polypeptides level or activity that actually bind, it refers to a polynucleotide or polypeptide. TFは、この定義においては、単一の遺伝子または複数の遺伝子の転写を活性化することができるかまたは抑制することができる、いずれかのポリペプチドを含む。 TF, in this definition, it is possible that the or suppress it possible to activate the transcription of a single gene or multiple genes, including any of polypeptides. このポリペプチドの群には、DNA結合タンパク質、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、GTP−結合タンパク質および受容体が含まれるが、これらのものには限定されない。 This is the group of polypeptides, DNA binding proteins, protein kinases, protein phosphatases, including but GTP- binding proteins and receptors, not limited to the these.
【0021】 [0021]
転写因子配列は、コード配列の全体またはコード配列の断片またはドメインを含んでもよい。 Transcription factor sequence may include fragments or domains of whole or coding sequence of the coding sequence. ポリペプチドに関して述べる場合“断片またはドメイン”は、無傷のポリペプチドの少なくとも一つの生物学的機能を、無傷のポリペプチドが機能を発揮するのと実質的に同一の方法でまたは同様の程度まで、発揮するポリペプチドの部分であってもよい。 If described with respect to polypeptide "fragment or domain" is at least one biological function of the intact polypeptide, to a substantially or similar degree of the same method to exert the intact polypeptide function, it may be a portion of a polypeptide that exhibits. 断片は、たとえば、特異的なDNAプロモーター領域に結合するDNA結合ドメイン、活性化ドメインまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのドメインを含んでもよい。 Fragments, for example, DNA-binding domains that bind to specific DNA promoter region, an activation domain or protein - may contain a domain for protein interactions. 断片は、わずか6アミノ酸から無傷のポリペプチドの長さまでのサイズで変化してもよく、しかし好ましくは、長さが少なくとも30アミノ酸、そしてより好ましくは長さが少なくとも60アミノ酸である。 Fragment may vary in sizes from only 6 amino acids up to a length of the intact polypeptide, but preferably at least 30 amino acids in length, and more preferably at least 60 amino acids in length. ヌクレオチド配列について述べる場合、“断片”は、本明細書中で提供される配列のうちのいずれかの、少なくとも連続した18ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、の配列のいずれかのことをいう。 If we describe the nucleotide sequence, "a fragment" includes any herein of the sequences provided in either, at least contiguous 18 nucleotides, preferably at least 30 nucleotides, more preferably at least 50 nucleotides, the sequence of It refers to Kano it.
【0022】 [0022]
典型的なポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、配列表中に提供される以下の配列が含まれる:SEQ ID No: 1:G157(cDNA);SEQ ID No: 2:G157(タンパク質);SEQ ID No: 3:G859(cDNA);SEQ ID No: 4:G859(タンパク質);SEQ ID No: 5:G859.1(cDNA);SEQ ID No: 6:G859.1(タンパク質);SEQ ID No: 7:G859.2(cDNA);SEQ ID No: 8:G859.2(タンパク質);SEQ ID No: 9:G1842(cDNA);SEQ ID No: 10:G1842(タンパク質);SEQ ID No: 11:G1842.2(cDNA);SEQ ID No: 12:G1842.2(タンパク質) Typical polynucleotides and polypeptides, include the following sequences provided in the Sequence Listing: SEQ ID No: 1: G157 (cDNA); SEQ ID No: 2: G157 (protein); SEQ ID No : 3: G859 (cDNA); SEQ ID No: 4: G859 (protein); SEQ ID No: 5: G859.1 (cDNA); SEQ ID No: 6: G859.1 (protein); SEQ ID No: 7 : G859.2 (cDNA); SEQ ID No: 8: G859.2 (protein); SEQ ID No: 9: G1842 (cDNA); SEQ ID No: 10: G1842 (protein); SEQ ID No: 11: G1842 .2 (cDNA); SEQ ID No: 12: G1842.2 (protein) SEQ ID No: 13:G1842.6(cDNA);SEQ ID No: 14:G1842.6(タンパク質);SEQ ID No: 15:G1842.7(cDNA);SEQ ID No: 16:G1842.7(タンパク質);SEQ ID No: 17:G1843(cDNA);SEQ ID No: 18:G1843(タンパク質);SEQ ID No: 19:G1844(cDNA);SEQ ID No: 20:G1844(タンパク質);SEQ ID No: 21:G1844.2(cDNA);SEQ ID No: 22:G1844.2(タンパク質);SEQ ID No: 23:G861(cDNA);SEQ ID No: 24:G861(タンパク質);SEQ ID No: 25:G861.1(cDNA);SEQ SEQ ID No: 13: G1842.6 (cDNA); SEQ ID No: 14: G1842.6 (protein); SEQ ID No: 15: G1842.7 (cDNA); SEQ ID No: 16: G1842.7 (Protein ); SEQ ID No: 17: G1843 (cDNA); SEQ ID No: 18: G1843 (protein); SEQ ID No: 19: G1844 (cDNA); SEQ ID No: 20: G1844 (protein); SEQ ID No: 21: G1844.2 (cDNA); SEQ ID No: 22: G1844.2 (protein); SEQ ID No: 23: G861 (cDNA); SEQ ID No: 24: G861 (protein); SEQ ID No: 25: G861.1 (cDNA); SEQ D No: 26:G861.1(タンパク質);SEQ ID No: 27:G1759(cDNA);SEQ ID No: 28:G1759(タンパク質);SEQ ID No: 29:G192(cDNA);SEQ ID No: 30:G192(タンパク質);SEQ ID No: 31:G234(cDNA);SEQ ID No: 32:G234(タンパク質);SEQ ID No: 33:G361(cDNA);SEQ ID No: 34:G361(タンパク質);SEQ ID No: 35:G486(cDNA);SEQ ID No: 36:G486(タンパク質);SEQ ID No: 37:G748(cDNA);SEQ ID No: 38:G748(タンパク質);SEQ ID No: 39:G994(cDNA);SEQ D No: 26: G861.1 (protein); SEQ ID No: 27: G1759 (cDNA); SEQ ID No: 28: G1759 (protein); SEQ ID No: 29: G192 (cDNA); SEQ ID No: 30 : G192 (protein); SEQ ID No: 31: G234 (cDNA); SEQ ID No: 32: G234 (protein); SEQ ID No: 33: G361 (cDNA); SEQ ID No: 34: G361 (protein); SEQ ID No: 35: G486 (cDNA); SEQ ID No: 36: G486 (protein); SEQ ID No: 37: G748 (cDNA); SEQ ID No: 38: G748 (protein); SEQ ID No: 39: G994 (cDNA); SEQ D No: 40:G994(タンパク質);SEQ ID No: 41:G1335(cDNA);SEQ ID No: 42:G1335(タンパク質);SEQ ID No: 43:G562(cDNA);SEQ ID No: 44:G562(タンパク質);SEQ ID No: 45:G736(cDNA);SEQ ID No: 46:G736(タンパク質);SEQ ID No: 47:G1073(cDNA);SEQ ID No: 48:G1073(タンパク質);SEQ ID No: 49:G1435(cDNA);SEQ ID No: 50:G1435(タンパク質);SEQ ID No: 51:G180(cDNA);SEQ ID No: 52:G180(タンパク質);SEQ ID No: 53:G592(cDNA);SE D No: 40: G994 ​​(protein); SEQ ID No: 41: G1335 (cDNA); SEQ ID No: 42: G1335 (protein); SEQ ID No: 43: G562 (cDNA); SEQ ID No: 44: G562 (protein); SEQ ID No: 45: G736 (cDNA); SEQ ID No: 46: G736 (protein); SEQ ID No: 47: G1073 (cDNA); SEQ ID No: 48: G1073 (protein); SEQ ID No: 49: G1435 (cDNA); SEQ ID No: 50: G1435 (protein); SEQ ID No: 51: G180 (cDNA); SEQ ID No: 52: G180 (protein); SEQ ID No: 53: G592 ( cDNA); SE ID No: 54:G592(タンパク質);SEQ ID No: 55:G208(cDNA);and SEQ ID No: 56:G208(タンパク質)。 ID No: 54: G592 (protein); SEQ ID No: 55: G208 (cDNA); and SEQ ID No: 56: G208 (protein).
【0023】 [0023]
「保存されたドメイン」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを他の植物からの相同な遺伝子又はタンパク質と比較したとき、配列レベルで他の断片よりも保存されたポリヌクレオチド又はポリペプチド断片を指す。 "Conserved domain" refers to when the polynucleotide or polypeptide in comparison to homologous genes or proteins from other plants, refers to a polynucleotide or polypeptide fragments stored than other fragments at the sequence level. この保存されたドメインは1)局在化(localization)ドメイン、2)活性化(activation)ドメイン、3)抑制(repression)ドメイン、4)ジメリゼーション(dimerization)又はオリゴメリゼーション(oligomerization)ドメイン、5)DNA結合ドメインあるいはそれらの組合せであってよい。 The conserved domain 1) localization (localization) domains, 2) activation (activation) domain, 3) inhibition (repression) domain, 4) di telomerization (Dimerization) or oligomerization (oligomerization) domain, 5) may be a DNA-binding domain, or a combination thereof. MADSタンパク質については、保存されたドメインは典型的にはDNA結合ドメインである。 The MADS proteins, conserved domain is typically DNA binding domain.
【0024】 [0024]
塩基配列が他の塩基配列と機能的な関係に置かれている場合、「操作可能に結合されている(operably linked)」。 If the nucleotide sequence is placed into a functional relationship with another nucleotide sequence, "operably linked (operably linked)." 例えばプロモーターやエンハンサーは、プロモーターやエンハンサーの存在によりその遺伝子をコードする配列の発現レベルが増加する場合、遺伝子をコードする配列と操作可能に結合されている。 For example, a promoter or enhancer is when the expression level of the sequence encoding the gene by the presence of a promoter or enhancer is increased, is operably linked to a sequence encoding a gene.
【0025】 [0025]
「形質(trait)」は植物や特定の植物材料あるいは細胞の生理的、形態的、生化学的、あるいは物理的性質を指す。 "Traits (trait)" refers to physiological, morphological, biochemical or physical properties, of plant and certain plant material or cell. この性質は、種子や植物の大きさのようにヒトの目に見えるものであるか、種子や葉のタンパク質、澱粉、あるいは油分含量にように、生化学的技法により、あるいはノーザン、RTPCR、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイあるいはレポータージーン発現系を利用した遺伝子発現レベルの観察により計測されるものであるか、ストレス耐性、収量あるいは病害抵抗性のような農業的観察により計測されるものであってよい。 This property, or those visible to the human eye as the size of the seeds and plants, protein seeds and leaves, starch or, as the oil content, by biochemical techniques, or Northern, RTPCR, microarray or are those measured by gene expression assays or reporter gene expression systems of gene expression levels using observation, stress tolerance, may be one that is measured by agricultural observations such as yield or disease resistance.
【0026】 [0026]
「形質改変(trait modification)」は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現が改変された形質転換植物における性質の、そうでない植物(野生型植物のような)と比較した検出可能な差をいう。 "Traits modified (trait modification)" is the nature of the polynucleotide or transformed plant expressing the polypeptide has been modified according to the present invention, a detectable difference in comparison to plants not (such as wild-type plants) Say. 形質改変は、観察される形質(差)の少なくとも5%の増加又は減少、少なくとも10%の差、少なくとも20%の差、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも100%、あるいはさらに大きな差に帰結してもよい。 Trait modification, at least 5% increase or decrease of traits observed (difference), the difference of at least 10%, a difference of at least 20%, at least 30%, at least 50%, at least 70%, at least 100%, or even it may result in a big difference. 改変された形質には自然のばらつきがあろうということは知られている。 The altered trait It is known that it would be natural variation. したがって、観察された形質改変は、野生型植物で観察される分布と比較した、形質転換植物における形質の正常な分布の変化を伴う。 Accordingly, traits modifications was observed, compared with the distribution observed in wild-type plants, involving a change in the normal distribution of the trait in the transformed plant.
【0027】 [0027]
特定の形質改変は、種子(胚)、果実、根、花、葉、茎、軸、若木などの形質改変であり、以下のようなものを含む:凍結、寒冷、熱、渇水、水分飽和、放射、オゾンを含む環境条件への増強された耐性;微生物、菌、ウイルスによる病気への増強された耐性;線虫類への耐性、減少した除草剤感受性、増強された重金属耐性(あるいは増強された重金属取り込み能力)、貧しい光条件下での増強された生育(例えば弱い光/あるいは短い昼時間)、あるいは特定の遺伝子の発現レベルの変化。 The particular trait modification, seeds (embryo), a trait modification of fruit, roots, flowers, leaves, stems, shaft, etc. saplings, including as follows: freezing, cold, heat, drought, water saturation, radiation, enhanced resistance to environmental conditions including ozone; microorganisms, bacteria, enhanced resistance to diseases caused by viruses; resistance to nematodes, decreased herbicide sensitivity is enhanced heavy metal tolerance (or enhanced heavy metals uptake capacity), poor enhanced growth under light conditions (e.g., low light / or short day time), or changes in the expression levels of specific genes. 改変されるかもしれない他の表現形は、タキソール、トコフェロール、トコトリエノール、ステロール、フィトステロール、ビタミン、ワックスモノマー、抗酸化剤、アミノ酸、リグニン、セルロース、タンニン、プレニルリピッド(クロロフィルやカロチノイドのような)、グルコシノレート、及びテルペノイドの生産におけるばらつきのような植物代謝物の生産、増強されたあるいは成分が変化したタンパク質や脂質の生産(特に種子における)、あるいは改変された糖(不溶性あるいは可溶性)及び/又は澱粉の組成、に関する。 Other phenotypic which may be altered include taxol, tocopherol, tocotrienol, sterols, phytosterols, vitamins, wax monomers, anti-oxidants, amino acids, lignin, cellulose, tannin, prenyl lipid (such as chlorophyll and carotenoids), glucosinolates, and production of plant metabolites, such as variations in the production of terpenoids, enhanced or component is a protein or lipid varied production (especially in seeds), or modified sugar (insoluble or soluble) and / or the composition of starch, about. 改変されてもよい物理的な植物の性質は、細胞の発達(例えば突起様構造の数)、果実や種子の大きさ及び数、茎や葉や根のような植物の一部の収量、保存中の種子の安定性、種子のさやの性質(例えば壊れやすさ)、根毛の長さと量、節間距離、あるいは種子殻の質などである。 Properties of the modified good physical plant also includes cell development (e.g., the number of projections like structures), fruit and seed size and number, some of the yield of a plant such as stems and leaves and roots, save stability of seeds in, sheath nature of the seed (e.g. fragility), and the like length and quantity, internode distances, or the quality of the seed husks of root hairs. 改変されてもよい植物の生育上の性質は、生長速度、種子の発芽速度、植物及び幼植物の勢い、葉及び花の老化、雄性不能、アポミクシス、開花時間、花器官脱離、窒素取り込み速度、バイオマスあるいは蒸散の特徴、並びに、頂部優性、分岐パターン、器官の数、器官の独自性、器官の形と多きさ、などの植物構造の性質、を含む。 Growth on the nature of the modifications which may be plants, growth rate, germination rate of seeds, plants and seedlings momentum, leaves and flowers of aging, male impossible, apomixis, flowering time, flower abscission, nitrogen uptake rate , including biomass or transpiration characteristics, as well as, top dominant branch patterns, the number of organ, uniqueness of organs, shape and Oki of organs, the nature of the plant structure, such as, a.
【0028】 [0028]
特に興味深いものは、昼間時間に反応した、温度に反応した、光の質に反応した開花時間の変化や、栄養分利用可能性、及び植物の発達段階などのような、改変された春化処理要求や開花時間の特徴に関する形質である。 Of particular interest are reacted in the day time, in response to temperature changes and flowering time in response to the quality of the light, nutrient availability, and the like developmental stage of a plant, altered vernalization required it is a trait on the characteristics of and flowering time.
【0029】 [0029]
1. 1. 配列我々は、植物の開花時間を改変させるのに利用できる特定の植物転写因子(TFs)を見出した。 Sequences We found particular plant transcription factors available to alter the flowering time of a plant (TFs). つまり、本発明のTFsを利用すれば特定の条件下で植物の開花時間を減少させたり、増加させたり、誘導可能にしたりできる。 That, or reduce the flowering time of plants under certain conditions by utilizing the TFs of the present invention, or increase, can or to inducible. さらに、この転写因子は植物の春化処理要求を改変するのに利用できる。 Furthermore, the transcription factor can be used to alter the vernalization requirements of plants.
【0030】 [0030]
これらの植物転写因子は以下の転写因子ファミリーのひとつに属するであろう: These plants transcription factors will belong to one of the transcription factor family of the following:
AP2 (APETALA2) ドメイン 転写因子ファミリー (Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol. Chem. 379:633−646); the MYB 転写因子ファミリー (Martin and Paz−Ares, (1997) Trends Genet. 13:67−73); the MADS ドメイン 転写因子ファミリー (Riechmann and Meyerowitz (1997) Biol. Chem. 378:1079−1101); the WRKY protein family (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244:563−571); the ankyrin−repeat protein family AP2 (APETALA2) domain transcription factor family (Riechmann and Meyerowitz (1998) Biol Chem 379:.. 633-646); the MYB transcription factor family (. Martin and Paz-Ares, (1997) Trends Genet 13: 67-73) ; the MADS domain transcription factor family (Riechmann and Meyerowitz (1997) Biol Chem 378:.. 1079-1101); the WRKY protein family (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol Gen. Genet 244:.. 563-571); the ankyrin-repeat protein family Zhang et al. (1992) Plant Ce114:1575−1588); the zinc finger protein (Z) family (Klug and Schwabe (1995) FASEB J. 9: 597−604); the homeobox (HB) protein family (Duboule (1994) Guidebook to the Homeobox Genes, Oxford University Press); the CART−element binding proteins (Forsburg and Guarente (1989) Genes Dev. 3:1166−1178); the squamosa promoter binding proteins (SPB . Zhang et al (1992) Plant Ce114: 1575-1588); the zinc finger protein (Z) family (Klug and Schwabe (1995) FASEB J. 9: 597-604); the homeobox (HB) protein family (Duboule ( 1994) Guidebook to the Homeobox Genes, Oxford University Press); the CART-element binding proteins (Forsburg and Guarente (1989) Genes Dev 3:. 1166-1178); the squamosa promoter binding proteins (SPB (Klein et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 1996 250:7−16); the NAM protein family (Souer et al. (1996) Cell 85:159−170); the IAA/AUX proteins (Rouse et al. (1998) Science 279:13711373); the HLH/MYC protein family (Littlewood et al. (1994) Prot. Profile 1:639−709); the DNAbinding protein (DBP) family (Tucker et al. (.. Klein et al (1996) Mol Gen. Genet 1996 250:. 7-16); the NAM protein family (Souer et al (1996) Cell 85:. 159-170); the IAA / AUX proteins (Rouse et . al (1998) Science 279: 13711373); the HLH / MYC protein family (Littlewood et al (1994.) Prot Profile 1:. 639-709); the DNAbinding protein (DBP) family (Tucker et al. (1994) EMBO J. (1994) EMBO J. 13:2994−3002); the bZIP family of transcription factors (Foster et al. (1994) FASEB J. 8:192−200); the Box P−binding protein (the BPF−1) family (da Costa e Silva et al. (1993) Plant J. 4:125−135); the high mobility group (HMG) family (Bustin and Reeves (1996) Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 54:35−100); the scarecrow (SCR) family (Di Laurenzio et al. (1996) Cell 86:423 13: 2994-3002); the bZIP family of transcription factors (Foster et al (1994.) FASEB J. 8: 192-200); the Box P-binding protein (the BPF-1) family (da Costa e Silva et . al (1993) Plant J. 4: 125-135); the high mobility group (HMG) family (Bustin and Reeves (1996) Prog Nucl Acids Res Mol Biol 54:..... 35-100); the scarecrow (SCR) family (Di Laurenzio et al (1996) Cell 86:. 423 −433); the GF14 family (Wu et al. (1997) Plant Physiol. 114:1421−1431); the polycomb (PCOMB) family (Kennison (1995) Annu. Rev. Genet. 29:289−303); the teosinte branched (TEO) family (Luo et al. (1996) Nature 383:794−799; the AB13 family (Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4:1251−1261); the triple helix (TH) family (Dehesh et al. (1990) Science 250:1397−1399); the EIL -433); the GF14 family (Wu et al (1997.) Plant Physiol 114:. 1421-1431); the polycomb (PCOMB) family (Kennison (1995) Annu Rev. Genet 29:.. 289-303); the teosinte branched (TEO) family (Luo et al (1996) Nature 383:. 794-799; the AB13 family (Giraudat et al (1992) Plant Cell 4:. 1251-1261); the triple helix (TH) family (Dehesh . et al (1990) Science 250: 1397-1399); the EIL family (Chao et al. (1997) Cell 89:1133−44); the AT−HOOK family (Reeves and Nissen (1990) Journal of Biological Chemistry 265:8573−8582); the S1 FA family (Zhou et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:11651169); the bZIPT2 family (Lu and Ferl (1995) Plant Physiol. family (Chao et al (1997) Cell 89:. 1133-44); the AT-HOOK family (Reeves and Nissen (1990) Journal of Biological Chemistry 265: 8573-8582); the S1 FA family (Zhou et al (. 1995) Nucleic Acids Res 23:. 11651169); the bZIPT2 family (Lu and Ferl (1995) Plant Physiol. 109:723); the YABBY family (Bowman et al. (1999) Development 126:2387−96); the PAZ family (Bohmert et al. (1998) EMBO J. 17:170−80); a family of miscellaneous (MISC) transcription factors including the DPBF family (Kim et al. (1997) Plant J. 11:1237−1251) and the SPF1 family (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244:563−571); the golden (GLD) family (Hall et 109: 723); the YABBY family (Bowman et al (1999.) Development 126: 2387-96); the PAZ family (Bohmert et al (1998.) EMBO J. 17: 170-80); a family of miscellaneous ( MISC) transcription factors including the DPBF family (. Kim et al (1997) Plant J. 11: 1237-1251) and the SPF1 family (Ishiguro and Nakamura (1994) Mol Gen. Genet 244:.. 563-571); the golden (GLD) family (Hall et l. (1998) Plant Cell 10:925−936), and the TUBBY family (Boggin et al, (1999) Science 286:2119−2125) . L (1998) Plant Cell 10: 925-936), and the TUBBY family (Boggin et al, (1999) Science 286: 2119-2125)
特に、我々の見出した、開花時間や春化に関係するTFsはMADS転写ファミリー、MYBファミリー、WRKYファミリー、HLH/MYCファミリー、GLDファミリー、AT−HOOKファミリー、CAATファミリー、bZIPファミリーのメンバー、及び亜鉛協調タンパク質ファミリー(Z−Dof,D−CLDSH,及びZ−CH2H2)のメンバーを含む。 In particular, our headline was, TFs involved in flowering time and vernalization is MADS transcription family, MYB family, WRKY family, HLH / MYC family, GLD family, AT-HOOK family, CAAT family, members of the bZIP family, and zinc including members of the cooperative protein family (Z-Dof, D-CLDSH, and Z-CH2H2). 実際に、我々は植物の開花時間の改変に関連したWRKY,CAAT,bZIP,AT−HOOK,及びHLH/MYCファミリーの第一のメンバーを同定した:G192及びG190(WRKY)、G486(CAAT)、G562(bZIP)、G1073(AT−HOOK)及びG592(HLH/MYC)。 In fact, we have identified WRKY related to the modification of the flowering time of plants, CAAT, bZIP, AT-HOOK, and the first member of HLH / MYC family: G192 and G190 (WRKY), G486 (CAAT), G562 (bZIP), G1073 (AT-HOOK) and G592 (HLH / MYC).
【0031】 [0031]
これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドは塩基配列表に載せてあり、図1に作表してある。 These polynucleotides and polypeptides and lists the nucleotide sequence listing, are tabulated in FIG. 図1は塩基配列番号、対応するGID番号、その配列がポリヌクレオチドかポリペプチド配列か、を示し、保存されたドメインを示している。 Figure 1 is the nucleotide sequence number corresponding GID number, the sequence or polynucleotide or polypeptide sequences, indicates, shows the conserved domains. 我々は、塩基配列表の各塩基配列に由来するドメイン又は断片も同定した。 We domain or a fragment derived from the nucleotide sequence of the nucleotide sequence listing were also identified. 断片は配列のいずれの場所からのものでもよく、その配列の長さまでのどのような長さのものであってもよく、タンパク質については6残基、DNAについては18塩基ほどに短いものであってよい。 Fragment may be from anywhere in the array may be of any length up to the length of the sequence, 6 residues for protein, be those short enough 18 bases for DNA it may be. DNA配列の断片の例は、以下の様である:1−50、51−100、101−200、201−218、218−300、301−450、及び450−600;そしてタンパク質配列の断片は以下の様である:1−50、51−100、101−200、201−206、206−250、251−300。 Examples of fragments of DNA sequence is the following manner: 1-50,51-100,101-200,201-218,218-300,301-450, and 450-600; and fragments of the protein sequence is less it is like: 1-50,51-100,101-200,201-206,206-250,251-300. DNA配列に関しては、数はDNAの5'あるいは3'末端から測定された。 For the DNA sequence, the number was determined from the 5 'or 3' termini of DNA. タンパク質配列に関しては、断片の場所はタンパク質のN末端あるいはC末端から決定され、隣接するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号2番のように記載された断片のN末端あるいはC末端方向にさらに10、20、40、60または100アミノ酸を含む。 With respect to protein sequences, the location of the fragments is determined from the N-terminus or C-terminus of the protein, includes contiguous amino acid sequence, for example the N-terminal or C-terminal direction fragments described as SEQ ID No. 2 additional 10, including the 20, 40, 60 or 100 amino acids.
【0032】 [0032]
同定されたポリペプチド断片は他の転写因子由来の断片あるいは配列に結合され、Short、PCT公開WO9827230号”Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”あるいはPattenら、PCT公開WO9923236号”Method of DNA Shuffling”、あるいはMinshullとStemmer、US特許5837458号に記載された方法を用いて、さらに新規な配列が生成される。 Identified polypeptide fragments bound to a fragment or sequences from other transcription factors, Short, PCT Publication WO9827230 No. "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering" or Patten et al, PCT Publication No. WO9923236 "Method of DNA Shuffling", or Minshull and Stemmer, using the method described in US patent 5,837,458, further new sequence is generated. あるいは同定された断片は転写活性化ドメインに結合されてもよい。 Alternatively identified fragments may be linked to a transcription activation domain. 転写活性化ドメインはDNA結合部位からの転写開始を助ける。 Transcriptional activation domain helps initiate transcription from DNA-binding sites. いくつかの活性化ドメインの共通の性質は過剰の正又は負の電荷を持つ両親媒性のアルファヘリックスを形成するようにするということである(Giniger and Ptashne (1987) Nature 330:670−672, Gill and Ptashne (1987) Cell 51:121−126, Estruch et al (1994) Nucl. Acids Res. 22:3983−3989)。 Some of the common property of activating domain is that so as to form an amphipathic alpha helix having excess positive or negative charge (Giniger and Ptashne (1987) Nature 330: 670-672, Gill and Ptashne (1987) Cell 51: 121-126, Estruch et al (1994) Nucl Acids Res 22:.. 3983-3989). 例としてはVP16あるいはGAL4の転写活性化領域(Moore et al. (1998) HYPERLINK http://Proc.Natl.Acad.Sci.USA Proc. Transcriptional activation region of VP16 or GAL4 Examples (Moore et al (1998) HYPERLINK http:. //Proc.Natl.Acad.Sci.USA Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 95: 376−381; and Aoyama et al. USA 95: 376-381; and Aoyama et al. (1995) Plant Cell 7:1773−1785)、細菌の配列由来のペプチド(Ma and Ptashne (1987) Cell 51; 113−119)、及び合成ペプチド(Giniger and Ptashne, 同上)が挙げられる。 (1995) Plant Cell 7: 1773-1785), peptides derived from bacterial sequences (Ma and Ptashne (1987) Cell 51; 113-119), and synthetic peptides (Giniger and Ptashne, ibid.) Can be mentioned.
【0033】 [0033]
単離されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、改変された植物が野生型植物よりも有利な形質を持つように、植物の発生、生理、あるいは生化学を改変するのに利用されてよい。 Isolated polynucleotides and polypeptides, modified plants to have a favorable traits than wild-type plants, plant development, may be utilized to alter physiology or biochemistry. 同定されたポリヌクレオチド断片は核酸プローブやプライマーとしても有用である。 Polynucleotide fragments identified are also useful as nucleic acid probes and primers. 核酸プローブはマイクロアレイ実験のプロトコールを含むハイブリダイゼーションプロトコールで有用である。 The nucleic acid probe is useful in hybridization protocols, including protocols microarray experiments. プライマーは核酸ハイブリダイゼーションにより相補的なターゲットDNA鎖にアニールし、プライマーとターゲットDNA鎖間のハイブリッドを形成し、DNAポリメラーゼ酵素によりターゲットDNAに沿って伸長する。 Primers annealed to a complementary target DNA strand by nucleic acid hybridization to form a hybrid between the primer and the target DNA strand, extending along the target DNA by DNA polymerase enzyme. プライマー対は例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や他の核酸増幅法による核酸配列の増幅に利用することができる。 Primer pairs can be used for amplification of nucleic acid sequences, for example by polymerase chain reaction (PCR) or other nucleic acid amplification methods. Sambrookら、Molecular Cloning. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Ed. A Laboratory Manual, Ed. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)及び Ausubel et al. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) and Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)を参照されたい。 (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, see John Wiley & Sons (1998).
【0034】 [0034]
2. 2. 相同配列(Homologs)の同定 The identification of homologous sequences (Homologs)
Arabidopsis Arabidopsis thalianaあるいは他の植物由来の塩基配列表に載せたものと相同な配列が植物の形質を改変するために利用されてもよい。 thaliana or those placed on the base sequence table from other plants and homologous sequences may be utilized to alter the traits of a plant. 相同配列は、単子葉植物及び双子葉植物を含むいずれの植物由来であってもよく、限定するものではないが特に以下のような農業上重要な植物種が含まれる、大豆、麦、とうもろこし、じゃがいも、米、ナタネ(カノーラを含む)、ヒマワリ、アルファルファ、サトウキビ及び芝のような穀物;バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、いちご、及びラズベリー、カンタロープ、にんじん、カリフラワー、コーヒー、きゅうり、ナス、ぶどう、ハネジュー、レタス、マンゴー、メロン、たまねぎ、パパイヤ、豆、コショウ、パイナップル、ほうれんそう、かぼちゃ、スイートコーン、タバコ、とまと、すいか、バラ科の果物(りんご、もも、なし、さくらんぼう、プラムなど)、及びアブラナ属の野菜(ブロッコリ、キャベツ、カリフラワー Homologous sequences can be derived from any plant including monocots and dicots include, but are not limited to include, among others, the following agricultural important plant species, such as, soybean, wheat, corn, potatoes, rice, (including canola) rapeseed, sunflower, alfalfa, grain, such as sugar cane and turf; banana, blackberry, blueberry, strawberry, and raspberry, cantaloupe, carrots, cauliflower, coffee, cucumber, eggplant, grapes, Haneju, lettuce, mango, melon, onion, papaya, beans, pepper, pineapple, spinach, squash, sweet corn, tobacco, tomato, watermelon, fruit of the rose family (apple, peach, pear, cherry, plum, etc.), and Brassica vegetables (broccoli, cabbage, cauliflower 芽キャベツ、コールラビなど)のような果物や野菜。 Brussels sprouts, kohlrabi, etc.) fruits and vegetables, such as. 他の穀物、果物及び野菜で表現型を変えられる物には、大麦、カラント、アボガド、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、タンジェリンのような柑橘系の果物、アーチチョーク、さくらんぼう、クルミやピーナッツのようなナッツ、エンダイブ、ニラネギ、アロールート、ビーツ、キャッサバ、かぶ、ラディッシュ、ヤムイモ、さつまいものような根菜、及び豆類が含まれる。 Other grains, to those that can change the phenotype in fruits and vegetables, such as barley, currant, avocado, orange, lemon, grapefruit, citrus fruits such as tangerine, artichoke, cherry, walnut and peanuts nuts, endive, leek, arrowroot, beet, cassava, turnip, radish, yam, root, such as sweet potatoes, and a legumes. 相同配列はマツ、ポプラ、ユーカリのような樹木種に由来してもよい。 Homologous sequences pine, poplar, may be derived from tree species such as eucalyptus.
【0035】 [0035]
配列表に示す配列へ導入される置換、欠失および挿入も、本発明の範囲内に含まれる。 Substitutions are introduced into the sequences shown in the sequence listing, also deletions and insertions are included within the scope of the present invention. そのような配列の修飾は、部位特異的変異により工学的に導入することができる(Wu (ed.) Meth. Enzymol. (1993)vol. 217, Academic Press)。 Such modifications of the sequence can be introduced engineered by site-directed mutagenesis (Wu (ed.) Meth. Enzymol. (1993) vol. 217, Academic Press). アミノ酸置換は、典型的には一残基置換である;挿入は一般的には約1から10アミノ酸残基のオーダーである;および欠失は約1から30残基の範囲である。 Amino acid substitutions are typically is Ichizanmoto substituted; insert is typically of the order of about 1 10 amino acid residues; and deletions will range from about 1 to 30 residues. 好ましい態様では、欠失または挿入は、隣接する組で行なわれ、例えば2残基の欠失または2残基の挿入である。 In preferred embodiments, deletions or insertions are made in adjacent pairs, a deletion of 2 residues or insertion of example 2 residues. 置換、欠失、挿入またはそれらのあらゆる組み合わせは、配列中で組み合わせで起こり得る。 Substitutions, deletions, insertions or any combination thereof can take place in combination in the sequence. 転写因子をコードするポリヌクレオチド中で作られる変異は、その配列をリーディングフレームの外に置くものであってはならず、また2次mRNA構造となる相補領域を生じてはならない。 Mutations made in the polynucleotide encoding the transcription factor should not be one place the sequence out of reading frames and must not produce complementary region to be a secondary mRNA structure.
【0036】 [0036]
置換とは、アミノ酸配列中の少なくとも1残基が除去され、その場所に一つの異なった残基が挿入されることである。 Substituted with at least one residue in the amino acid sequence has been removed, it is that one different residue inserted in its place. そのような置換は、遺伝子の機能にはほとんど影響を与えない保存的なものであり、例えばアラニンのセリンへの置換、アルギニンのリジンへの置換、グルタメートのアスパルテートへの置換および同類の置換によるものである。 Such substitutions are the conservative ones have little effect on the function of the gene, for example, substitution of alanine serine, substitution of lysine arginine, by substitution and related substitution of glutamate for aspartate it is intended. 保存的でなくタンパク質の特性に大きな変化を生ずるであろう置換は、(a)親水性の残基(例えばセリルまたはトレオニル)の疎水性基(例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル)への置換;(b)システインまたはプロリンの他の残基への置換;(c)電気陽性の側鎖を有する残基(例えばリジル、アルギニル、またはヒスチジル)の電気陰性残基(例えばグルタミル、またはアスパルチル)への置換;または(d)大きな側鎖を有する残基(例えばフェニルアラニン)の側鎖を有していない残基(グリシン)への置換である。 Will result in significant changes in the properties of the protein rather than conservative substitutions, (a) a hydrophobic group (e.g., leucyl hydrophilic residue (e.g., seryl or threonyl), isoleucyl, phenylalanyl, valyl or alanyl, substitution of); (b) substitution of other residues of cysteine ​​or proline; (c) a residue having an electropositive side chain-positive (e.g. lysyl, arginyl, or histidyl) electronegative residue (eg glutamyl, or substitution of aspartyl) which is a substitution of or (d) residues not having a side chain of a residue having a bulky side chain (e.g., phenylalanine) (glycine).
【0037】 [0037]
更に、”相同配列”という語には、化学的または酵素的手段により修飾されたポリペプチド配列が含まれる。 Furthermore, the term "homologous sequence" includes a polypeptide sequence that has been modified by chemical or enzymatic means. 相同配列は、脂質、糖、ペプチド、有機または無機化合物により修飾された配列、または修飾されたアミノ酸の使用による修飾された配列などであってもよい。 Homologous sequences, lipids, sugars, peptides, may be a modified sequence by use of modified sequences by organic or inorganic compounds, or modified amino acids. タンパク修飾技術は Ausubel et al. Protein modification techniques are Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)に示されている。 (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, shown in John Wiley & Sons (1998).
【0038】 [0038]
相同配列類もまた、データベースサーチ、配列アラインメントおよび比較として利用可能な配列解析プログラム(例えば、BLAST, FASTA, PILEUP, FINDPATTERNS 等のWisconsin Package Version 10.0 (GCG, Madision, WI)から)を使用することによって決定されるアラインメントの後、実質的に配列同一性とされるパーセントを有する2つの配列を意味する。 Homologous sequences of any kind also database search, sequence alignment and the available sequence analysis programs as a comparison (e.g., BLAST, FASTA, PILEUP, Wisconsin Package Version 10.0, such FINDPATTERNS (GCG, Madision from, WI)) using the after the alignment is determined by means of two sequences with the percent that is substantially sequence identity. GenBank, EMBL, Swiss−Prot および PIR のような公共配列データベース、またはPhytoSeq (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)のような私的配列データベースにてサーチすることができる。 GenBank, EMBL, can be searched in private sequence databases, such as in public sequence databases such as Swiss-Prot and PIR or PhytoSeq, (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). 比較のための配列アラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム (1981) Adv. Alignment of sequences for comparison are the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) Adv. App/. App /. Math. Math. 2:482によって、Needleman および Wunschの相同性アルゴリズム(1970) J. 2: by 482, Needleman and Wunsch homology algorithm of (1970) J. Mol. Mol. Biol. Biol. 48:443によって、Pearson および Lipman の類似性サーチ方法によって(1988) Proc. 48: 443, by analogy search method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. U. U. S. S. A. A. 85: 2444、それらのアルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションによって、行なうことができる。 85: 2444, by computer implementation of the algorithms can be performed. アラインメントの後、2つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は典型的には、比較領域全体を、配列類似な局所領域を同定しかつ比較することにより2つの配列の配列比較をすることによって行なわれる。 After alignment, the sequence comparison typically between two or more polynucleotide or polypeptide, the entire comparison region, the alignment of the two sequences by identify and compare sequence similarity local area performed by. 比較領域は少なくとも約20連続位置のセグメントであってよく、一般的には約50から約200、より一般的には約100から150連続位置のセグメントである。 Comparison area may be at least about 20 contiguous positions segments, typically from about 50 to about 200, and more typically from about 100 150 consecutive position segment. 該方法は、Ausubel et al. The method, Ausubel et al. (eds) (1999) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonsに記載されている。 (Eds) (1999) Current Protocols in Molecular Biology, are described in John Wiley & Sons.
【0039】 [0039]
記載配列のホモログである転写因子は、典型的には少なくとも40%アミノ酸配列同一性を共有する。 Transcription factor homologue according sequences typically share at least 40% amino acid sequence identity. より密接に関係するTFsは、記載配列と少なくとも50%、60%、65%、70%、75%または80% 配列同一性を有する。 More closely related TFs are described sequence having at least 50%, with 60%, 65%, 70%, 75% or 80% sequence identity. 開示配列ともっとも密接に関係する因子は、少なくとも85%、90%または95%の配列同一性を有する。 Factors most closely related to the disclosed sequences has at least 85%, 90% or 95% sequence identity to. ヌクレオチドのレベルでは、配列は典型的には少なくとも40%ヌクレオチド配列同一性を有し、好ましくは少なくとも50%、60%、70%または80%の配列同一性を有し、およびより好ましくは85%、90%、95%または97%配列同一性を有する。 At the level of nucleotide sequence typically has at least 40% nucleotide sequence identity is preferably at least 50%, 60%, have a 70% or 80% sequence identity, and more preferably 85% , 90%, 95% or 97% sequence identity. 遺伝コードの縮重は、コードするタンパク質のアミノ酸配列を維持しつつポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中に主な多様性を持たせることを可能にする。 Degeneracy of the genetic code, thereby permitting a major diversity in the nucleotide sequence of the polynucleotide while maintaining the amino acid sequence of a protein encoded.
【0040】 [0040]
2つの核酸分子が密接に関係しているか否かを決定する一つの方法は、ストリンジェントな条件下で2つの分子が互いにハイブリダイズするかである。 One way of two nucleic acid molecules determines whether closely related is if two molecules under stringent conditions to hybridize to each other. 一般的に、ストリンジェントな条件は、決められたイオン強度およびpH下にて特定配列の熱融解温度(Tm)から約5℃から20℃低い条件が選択される。 Generally, stringent conditions are determined ionic strength and the thermal melting point for the specific sequence under pH (Tm) of from about 5 ° C. from a low 20 ° C. conditions are selected. Tmとは、標的配列の50%が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度(決められたイオン強度およびpH下)である。 The Tm, is the temperature (under-determined ionic strength and pH) that the 50% of the target sequence hybridizes to a probe perfectly matched. 核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、Sambrook et al. Calculation of conditions and stringency of nucleic acid hybridization, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Ed. A Laboratory Manual, Ed. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、および Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry、および Molecular Biology−− Hybridization with nucleic acid Probes Part I, Elsevier, New Yorkに記載されている。 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, and Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry, and Molecular Biology-- Hybridization with nucleic acid Probes Part I, Elsevier, are described in New York. ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には完全長cDNA またはそのcDNA の選択された部分に基づくプローブと、0.2x SSC から2.0 x SSC、 0.1 % SDS、50−65℃での洗浄、たとえば 0.2 x SSC、0.1 % SDS、65℃の洗浄条件でハイブリダイズする。 Nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions, typically a probe based on the full-length cDNA or selected portions of the cDNA, 2.0 x SSC from 0.2x SSC, 0.1% SDS, 50 washed at -65 ° C., for example 0.2 x SSC, it hybridizes under wash conditions of 0.1% SDS, 65 ℃. より低い関係にあるホモログの検出では、洗浄は50℃で行なうこともできる。 In the detection of homologues in lower relationship, washing may be performed at 50 ° C..
【0041】 [0041]
通常のハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションプローブを放射活性ラベルのような検出ラベルと結合させ、そして該プローブは少なくとも20ヌクレオチド長であるのが好ましい。 In a typical hybridization, the hybridization probe is conjugated to a detectable label such as a radioactive label, and the probe is preferably at least 20 nucleotides in length. 当業者によく知られているように、ハイブリダイゼーションプローブの長さを長くすることは、特異性を増加させる。 As is well known to those skilled in the art, it increases the specificity to increase the length of the hybridization probe. Arabidopsis ヌクレオチド配列由来のラベル化プローブは、植物cDNAまたはゲノムライブラリーおよび当業者に知られた手段で検出されたハイブリダイゼーションシグナルとハイブリダイズすることができる。 Labeled from Arabidopsis nucleotide sequence probes capable of hybridizing signals hybridized detected by means known to the plant cDNA or genomic libraries and those skilled in the art. ハイブリダイズしたコロニーもしくはプラークを(使用したライブラリーのタイプに依存する)精製し、コロニーもしくはプラークを含むクローン化された配列を分離し、性質を調べる。 Hybridized colonies or plaques (depending on the type of library used) and purified to separate cloned sequences containing colonies or plaques, examine the properties. ホモログは(インバースPCRまたはRACEのような)PCRに基づいた技術により、変性プライマーを使用して解析できる。 Homologs can be analyzed using techniques by, the degenerate primers based on (such as inverse PCR or RACE) PCR. Ausubel et al. Ausubel et al. (eds) (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons参照。 (Eds) (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons reference.
【0042】 [0042]
さらに、TF ホモログは発現ライブラリーの免疫スクリーニングによっても得ることができる。 Furthermore, TF homologues may also be obtained by immunoscreening of expression libraries. 記載TF核酸配列が提供されれば、該ポリペプチドは非相同発現システム(例えばE. coli)によって発現し、精製することができ、そして該TFに特異的な抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を生産するのに使用することもできる。 If according TF nucleic acid sequences is provided, wherein the polypeptide expressed by heterologous expression system (e.g., E. coli), can be purified and the production of specific antibodies (monoclonal or polyclonal) to the TF It can also be used to. 抗体は、TFアミノ酸配列から得られた合成ペプチドに対して生産させることもできる。 Antibodies can also be produced for the obtained synthetic peptide from TF amino acid sequence. 抗体産生方法は、当業者に周知であり、そして Harlow および Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkに記載されている。 Antibody production methods are well known to those skilled in the art, and Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, are described in New York. そのような抗体は、上述の方法を用いて、TFホモログをクローン化したい植物から作られた発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。 Such antibodies can be used with the method described above, for screening expression libraries made from a plant to be cloned TF homologs. 選択されたcDNAは、配列解析および生物活性によって確認することができる。 Selected cDNA can be confirmed by sequence analysis and biological activity.
【0043】 [0043]
3. 3. 改良された転写因子の発現いずれの同定された配列も、植物での発現のためにカセットまたはベクターに挿入される。 Any of the identified sequences expressed in improved transcription factors are also inserted into the cassette or vector for expression in plants. 植物細胞の適切な形質転換に適した、または形質転換植物の樹立に適した数種の発現ベクターが、Weissbach および Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, および Gelvin et al. Suitable for appropriate transformation of plant cells, or several expression vectors suitable for the establishment of transformed plants, Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, and Gelvin et al. , (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishersに記載されているものを含み、報告されている。 Include those described in (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, it has been reported. 特徴的な例としては、Agrobacterium tumefaciens のTiプラスミドから得られたもの、並びにHerrera−EstrelIa, L. The characteristic example, those obtained from Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens, as well as Herrera-EstrelIa, L. , et al. , Et al. , (1983) Nature 303: 209, Bevan, M. , (1983) Nature 303: 209, Bevan, M. , Nucl. , Nucl. Acids Res. Acids Res. (1984) 12: 8711−8721, Klee, H. (1984) 12: 8711-8721, Klee, H. J. J. , (1985) BiolTechnology 3: 637〜642によって記載されているものであって双子葉植物用のものが含まれる。 , (1985) BiolTechnology 3: contains 637-642 be those described by one for dicotyledonous plants. Ti由来プラスミドは、単子葉植物および双子葉植物の双方に、Agrobacterium 仲介形質転換を使用して形質転換することができる(Ishida et al (1996) Nat. Biotechnol. 14:745−50; Barton et al. (1983) Cell 32:1033−1043)。 Ti-derived plasmids, both monocotyledonous and dicotyledonous plants can be transformed using Agrobacterium-mediated transformation (Ishida et al (1996) Nat Biotechnol 14:.. 745-50; Barton et al . (1983) Cell 32: 1033-1043).
【0044】 [0044]
あるいは、非Tiベクターを、フリーDNA移入技術を使用して、植物および細胞内にDNAを移入するのに使用することができる。 Alternatively, non-Ti vectors, using free DNA transfer techniques can be used to transfer DNA into plants and the cell. そのような方法には、例えばリポソーム、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクティルボンバートメント(microprojectile bombardment)、シリコンカーバイドウィスカー(silicon carbide wiskers)、およびウイルスの使用が含まれる。 Such methods, for example, liposomes, electroporation, micro projector Kuti carboxylic Bad Instrument (microprojectile bombardment), silicon carbide whiskers (silicon carbide wiskers), and include the use of viruses. それらの技術を使用して、形質転換植物、たとえばコムギ、米(Christou, P., (1991) BiolFechnology 9:957−962)、およびコーン(Gordon−Kamm, W., (1990) Plant Cell 2: 603−618)を作ることができる。 Using these techniques, a transformed plant, for example wheat, rice (Christou, P., (1991) BiolFechnology 9: 957-962), and corn (Gordon-Kamm, W., (1990) Plant Cell 2: 603-618) can be made. 粒子ガンを使用した直接DNA移入技術(Weeks, T. et al., (1993) Plant Physiol. 102: 1077−1084; Vasil, V., (1993) BiolTechnology 10: 667−674; Wan, Y. および Lemeaux, P., (1994) Plant Physiol. 104: 37−48、およびAgrobacterium仲介DNA形質転換 (Ishida et al., (1996) Nature Biotech. 14: 745−750)では、未熟胚が単子葉植物でのよいターゲットである。 Direct DNA transfer techniques using particle gun (Weeks, T. et al, (1993) Plant Physiol 102:.. 1077-1084; Vasil, V., (1993) BiolTechnology 10: 667-674; Wan, Y. and Lemeaux, P., (1994) plant Physiol 104:. 37-48 and Agrobacterium mediated DNA transformation, (Ishida et al, (1996) Nature Biotech 14:.. 745-750) in, immature embryos in monocots it is a good target of.
【0045】 [0045]
典型的には、植物形質転換ベクターは、5' および 3'制御配列および優性選択マーカーの転写コントロール下にある、一つ以上のクローン化された植物コード配列(ゲノムもしくはcDNA)を含む。 Typically, plant transformation vectors, 5 'and 3' is under the transcriptional control of regulatory sequences and a dominant selectable marker, including one or more cloned plant coding sequence (genomic or cDNA). そのような植物形質転換ベクターは、典型的にはプロモーター(例えば、発現が誘導的であるか構成的であるか、環境支配的制御か発生支配的制御か、または細胞または組織特異的であるかをコントロールしている制御領域)、転写開始部位、(イントロンスプライス部位のような)RNAプロセスシグナル、転写終止部位および/またはポリアデニレーションシグナルも含む。 Such plant transformation vectors, typically a promoter (e.g., whether expression is constitutive or is inducible, or environmental dominant control or generate dominant control or a cell or tissue specific control regions that control), transcription initiation site, (introns such as splice sites) RNA process signals, transcriptional termination sites and / or polyadenylation signal comprises.
【0046】 [0046]
TF配列を発現するのに使用できる構成性植物プロモーターの例としては、ほとんどの植物組織で構成的で高レベル発現を与えるカリフラワーモザイクウイルス(CaMV) 35S プロモーター(例えば、Odel et al., (1985) Nature 313:810参照);ノパリン(nopaline)合成プロモーター(An et al., (1988) Plant Physiol. 88:547);およびオクトピン(octopine)合成プロモーター(Fromm et al., (1989) Plant Cell 1: 977)が含まれる。 Examples of constitutive plant promoters which can be used to express TF sequence, most cauliflower mosaic virus giving constitutive high level expression in plant tissues (CaMV) 35S promoter (e.g., Odel et al., (1985) Nature 313: 810 references); nopaline (nopaline) synthetic promoters (An et al, (1988.) Plant Physiol 88:. 547); and octopine (. octopine) synthetic promoters (Fromm et al, (1989) Plant Cell 1: 977) is included.
【0047】 [0047]
環境、ホルモン、化学物質、発生シグナルに反応して、そして組織活性様式で遺伝子発現を制御する、様々な植物遺伝子プロモーターが植物でのTFの発現のために使用することができ、以下に示すものなどがある。 Environmental, hormonal, chemical, in response to developmental signals, and controls the gene expression in tissues active manner, can various plant gene promoter is used for expression of TF in plants, those shown below and so on. US Pat. US Pat. No. No. 5,773,697に記載されている、ナピン(napin)、ファセオリン(phaseolin)またはDC3プロモーターのような、種子特異的プロモーター、US Patent Nos. 5,773,697 are described in, napin (napin), such as phaseolin (phaseolin) or DC3 promoter, seed-specific promoter, US Patent the Nos. 5,618,988, 5,837,848 および 5,905,186に記載されているような根特異的プロモーター;dru 1 プロモーター(US Pat. No. 5,783,393)、または2A11プロモーター(US Pat. No. 4,943,674)およびトマトポリガラクツロナーゼプロモーター(Bird et al. (1988) Plant Mol. Biol. 11:651)、のような果実熟成期に活性な果実特異的プロモーター、US Patent Nos. 5,618,988, 5,837,848 and root-specific promoters such as those described in 5,905,186; dru 1 promoter (. US Pat No. 5,783,393), or 2A11 promoter (US . pat No. 4,943,674) and the tomato polygalacturonase promoter (Bird et al (1988.) Plant Mol Biol 11:.. 651), active in fruit ripening, such as fruit-specific promoters, US Patent Nos. 5,618,988, 5,837,848および5,905,186に記載されているような根特異的プロモーター、PTA29, PTA26 および PTA13 (US Pat. No. 5,792,929)のような花粉活性化プロモーター、維管束組織で活性なプロモーター(Ringli および Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37:977−988)、 花特異的(Kaiser et al, (1995) Plant Mol. Biol. 28:231−243)、花粉(Baerson et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1947−1959)、心皮(Ohl et al. (1990) Plant Cell 2:837−848)、花粉および発育初期の種子(Bae 5,618,988, root-specific promoters such as those described in 5,837,848 and 5,905,186, PTA29, pollen such as PTA26 and PTA13 (US Pat. No. 5,792,929) activation promoter, vascular tissue in active promoter (Ringli and Keller (1998) Plant Mol Biol 37:.. 977-988).., flower-specific (Kaiser et al, (1995) Plant Mol Biol 28: 231- 243), pollen (Baerson et al (1994.) Plant Mol Biol 26:.. 1947-1959), carpel (Ohl et al (1990.) Plant Cell 2: 837-848), pollen and early development of seed ( Bae son et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:255−267)、van der Kop et al (1999) Plant Mol. ... Son et al (1993) Plant Mol Biol 22: 255-267), van der Kop et al (1999) Plant Mol. Siol. Siol. 39:979−990 またはBaumann et al. 39: 979-990 or Baumann et al. (1999) Plant Cell 11:323−334)に記載されているようなオーキシン誘導性プロモーター、サイトカイニン誘導性プロモーター(Guevara−Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38:743−753)、ジベレリンに反応するプロモーター(Shi et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:1053−1060, Willmott et al. (1998) 38:817−825) 、およびそのようなもの。 (1999) Plant Cell 11: auxin-inducible promoters as described in 323-334), cytokinin-inducible promoter (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol Biol 38:.. 743-753), responsive to gibberellin promoter (Shi et al (1998) Plant Mol Biol 38:... 1053-1060, Willmott et al (1998) 38:. 817-825), and such. 更なるプロモーターの例として、熱 (Ainley, et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 13−23)、光(例えば、エンドウrbcS−3Aプロモーター、Kuhlemeier et al., (1989) Plant Cell 1:471、およびトウモロコシrbcSプロモーター、Schaffner および Sheen, (1991) Plant Cell 3: 997); 外傷(例えば、 wunl, Siebertz et al., (1989) Plant Cell 1: 961);病原菌耐性、およびメチルジャスモンまたはサリチル酸のような化学物質(Gatz et al., (1997) Plant Mol. Biol. 48: 89−108) に応答して発現が誘導されるプロモー Examples of additional promoter, heat. (Ainley, et al (1993) Plant Mol Biol 22:... 13-23), light (e.g., pea rbcS-3A promoter, Kuhlemeier et al, (1989) Plant Cell 1 : 471, and maize rbcS promoter, Schaffner and Sheen, (1991) Plant Cell 3: 997); trauma (e.g., wunl, Siebertz et al, (1989.) Plant Cell 1: 961); pathogen resistance, and methyl jasmonic or chemicals such as salicylic acid (Gatz et al, (1997) Plant Mol Biol 48:... 89-108) promoter whose expression in response is induced ーがある。 There is over. 更に、種子発達後期で作用するようなプロモーターを使用することによって、発現のタイミングをコントロールすることもできる(Odel et al. (1994) Plant Physiol. 106:447−458)。 Furthermore, the use of promoters, such as to act in seed development later, it is also possible to control the timing of expression (Odel et al (1994) Plant Physiol 106:.. 447-458).
【0048】 [0048]
植物発現ベクターは、コード配列の上流または下流内に位置するRNAプロセスシグナルを含むこができる。 Plant expression vectors may this containing RNA process signal located upstream or in downstream of the coding sequence. 更に、発現ベクターは、植物遺伝子の3'未翻訳領域、例えばジャガイモのPI−IIターミネーター領域、またはオクトピンまたはノパリン(nopaline)シンターゼ 3' ターミネーター領域のような、mRNAの安定性を増加させる3'ターミネーター領域から、更なる制御配列含むことができる。 Furthermore, the expression vector 3 'untranslated region, e.g., PI-II terminator region of potato or the octopine or nopaline (nopaline) synthase 3' plant genes such as the terminator region, 3 'terminator of increasing the stability of the mRNA from the area, it can include additional regulatory sequences.
【0049】 [0049]
最後に、上記したように、植物の発現ベクターは、形質転換体の迅速な選択を可能にする優性選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。 Finally, as described above, expression vectors of plants, may comprise a dominant selectable marker gene to allow rapid selection of transformants. このような遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシン又はスペクチノマイシンに耐性)や除草剤耐性遺伝子(例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ)をコードする遺伝子を含む。 Such genes, antibiotic resistance genes (e.g., hygromycin, kanamycin, bleomycin, G418, streptomycin or resistance to spectinomycin) and herbicide resistance genes (e.g., phosphinothricin acetyltransferase) a gene encoding a including.
【0050】 [0050]
植物の形質を改変するためのトランスジェニック植物におけるTF発現の減少は、TFcDNAに基づくアンチセンス構築体を植物に導入することによって得ることができる。 Reduction of TF expression in transgenic plants for altering traits of a plant, an antisense construct which is based on TFcDNA can be obtained by introducing into a plant. アンチセンス抑制のためにTFcDNAは発現ベクターのプロモーター配列に対して逆向きに配置される。 TFcDNA For antisense suppression is arranged in the opposite direction relative to the promoter sequence of the expression vector. 導入される配列は全長のTFcDNA又は遺伝子である必要はなく、TFcDNA又はトランスフォームされるべき植物のタイプに見られる遺伝子と同一である必要もない。 Introduced sequence need not be TFcDNA or full length genes, need not be identical to the gene found in the type of plant to be TFcDNA or transform. しかしながら、導入される配列がより短い場合、有効なアンチセンス抑制のためには通常天然のTF配列に対してより相同性が高いことが必要とされるであろう。 However, if the introduced sequence is shorter, it will be appreciated more highly homologous with respect to the normal native TF sequence for effective antisense suppression is required. 好ましくは、ベクター中の導入されるアンチセンス配列の長さは少なくとも30ヌクレオチドであり、アンチセンス抑制の向上は典型的にはアンチセンス配列の長さが増加するにつれて観察されるであろう。 Preferably, the length of the antisense sequence introduced in a vector is at least 30 nucleotides, improved antisense suppression will typically the length of the antisense sequence is observed as an increase. ベクター中のアンチセンス配列の長さは100ヌクレオチド以上であることが好ましい。 The length of the antisense sequence in the vector is preferably 100 nucleotides or more. 上記のように、アンチセンス構築体の転写はRNA分子の産生をもたらし、これは植物細胞中の内在TF遺伝子から転写されたmRNA分子と逆向きに相補的である。 As described above, the transcription of the antisense construct leads to the production of RNA molecules, which is complementary to an mRNA molecule and reverse transcribed from endogenous TF gene in plant cells. 内在TF遺伝子発現の抑制はリボザイムの使用により達成することもできる。 Suppression of endogenous TF gene expression can also be achieved by the use of ribozymes. リボザイムは高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成RNA分子である。 Ribozymes are synthetic RNA molecules that possess highly specific endoribonuclease activity. リボザイムの産生及び使用はCechの米国特許第4,987,071号及びHaselhoffの米国特許第5,543,508号に開示されている。 Production and use of ribozymes are disclosed in U.S. Patent No. 5,543,508 U.S. Patent No. 4,987,071 and Haselhoff of Cech. アンチセンスRNA内のリボザイム配列の誘導はアンチセンスRNAに対するRNA分解活性を付与するために用いることができる。 Induction of ribozyme sequences within antisense RNA can be used to confer RNA degradation activity against antisense RNA. それにより、アンチセンスRNAに結合する内在mRNA分子が分解され、アンチセンスによる内在遺伝子発現阻害が高まる。 Thereby, the degradation endogenous mRNA molecules that bind to antisense RNA, endogenous gene expression inhibition with antisense is increased.
【0051】 [0051]
TFcDNA(又はその変異体)にコードされるRNAを過剰発現するベクターを使用して、Jorgensenの米国特許第5,231,020号に記載の方法で内在TF遺伝子の共抑制することもできる。 TFcDNA (or variants thereof) using a vector overexpressing RNA encoded, it is also possible to co-suppression of endogenous TF gene by the method described in U.S. Patent No. 5,231,020 of Jorgensen. このような共抑制(センス抑制ともいう)は、完全TFcDNAを植物細胞に導入することを必要とせず、導入される配列が内在TF遺伝子と正確に同一であることも必要としない。 Such co-suppression (also referred to as sense suppression) is completely TFcDNA the without the need to be introduced into plant cells, does not require that the sequence is to be introduced is exactly the same as the endogenous TF gene. しかしながら、アンチセンス抑制の場合のように、(1)導入する配列が長く、(2)導入する配列と内在TF遺伝子との配列相同性が増すほど抑制効率は高まるであろう。 However, as in the case of antisense suppression, (1) introduction sequence is long, (2) inhibition efficiency increases sequence homology with the sequences and endogenous TF gene to be introduced increases will increase.
【0052】 [0052]
翻訳不可能な形態のTFmRNAを発現するベクターを用いて内在TF活性の発現を抑制し、形質を転換することもできる。 With a vector expressing TFmRNA untranslatable form to suppress expression of endogenous TF activity may also be converted traits. このような構築体を産生する方法はDoughertyらの米国特許第5,583,021号に記載されている。 Methods for producing such constructs are described in U.S. Patent No. 5,583,021 of Dougherty et al. 好ましくは、このような構築体はTF遺伝子に早期ストップコドンを導入することで作製される。 Preferably, such constructs are made by introducing premature stop codon in the TF gene. あるいは、2本鎖RNAを用いて遺伝子を沈黙させることにより植物の形質を改変することもできる(Sharp (1999) Genes and Development 13: 139−141)。 Alternatively, it is also possible to modify the traits of a plant by silence genes using double-stranded RNA (Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141). このアプローチは、それによりベクターが調製され、cDNA又は遺伝子が重複様式で配置され、発現の際にヘアピン構造を有する2本鎖RNA分子の生成を可能にする。 This approach, which vector is prepared by, cDNA or genes are arranged in an overlapping manner, allows the generation of double-stranded RNA molecule with a hairpin structure upon expression. この方法は植物の遺伝子活性を改変するために用いられている(Chuang and Meyerowitz (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 4985−9490)。 This method is used to alter gene activity in plants (Chuang and Meyerowitz (1999) Proc Natl Acad Sci 97:.... 4985-9490).
【0053】 [0053]
遺伝子の発現を無効にする他の方法は、Agrobacterium tumefaciensのT−DNAを用いた挿入突然変異誘発によるものである。 Another way to disable the expression of a gene is by insertion mutagenesis using T-DNA of Agrobacterium tumefaciens. 挿入変異体の生成後、変異体をスクリーニングし、TF遺伝子内に挿入を含む変異体を同定することができる。 After generating the insertion mutants, were screened variants can be identified variants comprising inserting into the TF gene. 所望の遺伝子に単一変異イベントを含む変異体は、変異のために交配させてホモ接合型植物を生成することもできる(Koncz et al. (1992) Methods in Arabidopsis Research. World Scientific)。 Desired mutants containing a single mutation event in gene can also generate bred for mutation homozygous plants (Koncz et al. (1992) Methods in Arabidopsis Research. World Scientific).
【0054】 [0054]
植物の形質はをcre−loxシステムを用いて改変することもできる(例えば、米国特許第5,658,772号に記載されている)。 Traits of a plant can also be a modifying using cre-lox system (for example, as described in U.S. Pat. No. 5,658,772). 植物ゲノムは第1及び第2lox部位を含むように改変することもできる。 Plant genome can also be modified to include first and second 2lox site. そしてこれらの部位をCreレコンビナーゼと接触させる。 And contacting these sites with Cre recombinase. これらのlox部位が同一向きにあれば、2つの部位間の介在DNA配列が切除される。 These lox sites if the same direction, intervening DNA sequence between the two sites is excised. これらのlox部位が逆向きであれば、介在配列は反転する。 If these lox sites inverted, intervening sequence is inverted.
【0055】 [0055]
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、内在遺伝子の活性又は発現レベルを他の手段で操作することにより、発現カセットの非存在下で植物中に発現させることもできる。 Polynucleotides and polypeptides of the present invention, by operating the activity or expression level of endogenous gene by other means, can also be expressed in plants in the absence of the expression cassette. 例えば、T−DNA活性化タグにより遺伝子を異所性に発現させることによる(Ichikawa et al., (1997) Nature 390 698−701, Kakimoto et al., (1996) Science 274: 982−985)。 For example, a gene by T-DNA activation tag by expressing ectopically (Ichikawa et al, (1997) Nature 390 698-701, Kakimoto et al, (1996) Science 274:.. 982-985). この方法は植物を複数の転写エンハンサーを含む遺伝子タグでトランスフォームすることを必要とし、タグがゲノムに挿入されるとフランキング遺伝子コード配列の発現が脱制御される。 This method requires that the transforming gene tag containing multiple transcriptional enhancers plants, tag expression when inserted into the genome flanking gene coding sequence is deregulated. 他の例では、植物の転写機構を、本発明のポリヌクレオチドの転写レベルが増加するように改変することができる(DNA結合モチーフ内の特定のアミノ酸を変えることによるジンクフィンガータンパク質のDNA結合特異性の改変を記載するPCT公報のW09606166及びWO9853057を参照されたい)。 In another example, the transfer mechanism of the plant, DNA binding specificity of polynucleotide transcription levels can be modified to increase (zinc finger protein by altering particular amino acids in the DNA binding motif present invention see W09606166 and WO9853057, PCT publication describing the modification).
【0056】 [0056]
トランスジェニック植物は、例えば活性化状態に維持するためにポリペプチドのリン酸化状態を変えることにより、内在遺伝子にコードされるポリペプチドの活性を発現又は変化させるために必要な機構を含むこともできる。 Transgenic plants, for example in order to maintain the activation state by changing the phosphorylation state of the polypeptide, may also include a mechanism necessary for exhibiting or changing the activity of a polypeptide encoded by the endogenous gene .
【0057】 [0057]
4. 4. 改変されたTF発現を有するトランスジェニック植物本発明のTF遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを構築すると、植物の形質を改変するために、標準技術を用いてポリヌクレオチドを植物に導入することができる。 When constructing an expression cassette comprising a polynucleotide encoding the TF gene of the transgenic plants present invention having a modified TF expression, to modify the trait of a plant, to a polynucleotide is introduced into plants using standard techniques can. 植物は裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物を含むいかなる高等植物であってもよい。 Plants gymnosperms may be any higher plants, including monocotyledonous and dicotyledonous plants. 好適なプロとコールはLeguminosae(アルファルファ、ダイズ、クローバーなど)、Umbelliferae(ニンジン、セロリ、パースニップ)、Cruciferae(キャベツ、ラディッシュ、ナタネ、ブロッコリーなど)、Curcurbitaceae(メロン及びキュウリ)、Gramineae(コムギ、コーン、コメ、オオムギ、キビなど)、Solanaceae(ジャガイモ、トマト、タバコ、コショウなど)、及び他の種々の作物に有用である。 Suitable pro and calls Leguminosae (alfalfa, soybean, clover, etc.), Umbelliferae (carrot, celery, parsnip), Cruciferae (cabbage, radish, rapeseed, broccoli, etc.), Curcurbitaceae (melons and cucumber), Gramineae (wheat, corn, rice, barley, millet, etc.), Solanaceae (potato, tomato, tobacco, pepper, etc.), and for the other various crops. Ammirato et al. Ammirato et al. (1984) Handbook of Plant Cell Culture − Crop Species. (1984) Handbook of Plant Cell Culture - Crop Species. Macmillan Publ. Macmillan Publ. Co. Co. Shimamoto et al. Shimamoto et al. (1989) Nature 338: 274−276; Fromm et al. (1989) Nature 338: 274-276; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833−839; 及びVasil et al. (1990) Bio / Technology 8: 833-839; and Vasil et al. (1990) Bio/Technology 8: 429−434に記載のプロトコールを参照されたい。 (1990) Bio / Technology 8: 429-434 see the protocol described in.
【0058】 [0058]
単子葉植物細胞及び双子葉植物細胞のトランスフォーメーション及び再生は今やルーチン化されており、最適なトランスフォーメーション技術の選択は実務者によって決定されるであろう。 Transformation and regeneration of monocotyledonous plant cells and dicots cells is now routine of selection of the optimal transformation technology will be determined by the practitioner. 方法の選択はトランスフォームされるべき植物のタイプによって様々であり、当該技術に熟練した者は与えられた植物のタイプのための特定の方法の好適性を認識するであろう。 Selection methods are different depending on the type of plant to be transformed, the person skilled in the art will recognize suitability of a particular method for the type of a given plant. 好適な方法は:植物のプロトプラストのエレクトロポーレーション;リポソーム介在トランスフォーメーション;ポリエチレングリコール(PEG)介在トランスフォーメーション;ウイルスを用いたトランスフォーメーション;植物細胞のマイクロインジェクション;植物細胞のmicro−projectile bombardment;真空浸潤法;及びAgrobacterium tumeficiens介在トランスフォーメーションを含むが、これらに限定されるものではない。 Suitable methods are: electroporation of plant protoplasts; liposome-mediated transformation; vacuum infiltration; micro-projectile bombardment of plant cells; microinjection of plant cells; Transformation with viral, polyethylene glycol (PEG) mediated transformation law; and including Agrobacterium Tumeficiens mediated transformation, but the invention is not limited thereto. トランスフォーメーションとは、その配列の安定な又は一過性の発現を引き起こすような方法で植物にヌクレオチド配列を導入することを意味する。 The transformation means introducing nucleotide sequences into plants in such a way as to cause stable or transient expression of that sequence.
【0059】 [0059]
本分野の現在の知識を具体的に示すのに役立ち、本明細書中に援用される、クローン化配列によるトランスフォーメーションを特徴とする植物改変の成功例としては、米国特許第5,571,706号;第5,677,175号;第5,510,471号;第5,750,386号;第5,597,945号;第5,589,615号;第5,750,871号;第5,268,526号;第5,780,708号;第5,538,880号;第5,773,269号;第5,736,369号及び第5,610,042号が挙げられる。 Useful current knowledge in this field to indicate specifically, is incorporated herein, as a successful example of a plant modification characterized by transformation by cloned sequences are described in U.S. Patent No. 5,571,706 Nos; No. 5,677,175; No. 5,510,471; No. 5,750,386; No. 5,597,945; No. 5,589,615; No. 5,750,871; include Nos 5,736,369 and No. 5,610,042 are; No. 5,268,526 Patent; No. 5,780,708; No. 5,538,880; No. 5,773,269 .
【0060】 [0060]
トランスフォーメーションの後、植物を、トランスフォーメーションベクターに導入された優性選択マーカーを用いて選択することが好ましい。 After transformation, plants are preferably selected using a dominant selectable marker has been introduced into the transformation vector. 典型的には、このようなマーカーはトランスフォームされた植物に抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与するであろう。 Typically, such a marker will confer antibiotic or herbicide resistance on the plants that have been transformed. そして、形質転換体の選択は、適当な濃度の抗生物質又は除草剤に植物を曝すことにより達成される。 The selection of the transformants is accomplished by exposing the plants to antibiotics or herbicides in appropriate concentrations.
【0061】 [0061]
トランスフォームされた植物が選択され、成熟した後、改変した形質を示すこれらの植物を同定する。 It is selected the transformed plants, after mature, to identify those plants showing a modified trait. 改変した形質は上記したいかなる形質でもよい。 Modified trait may be any trait described above. さらに、改変した形質が、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベル又は活性の変化によるものであることを、ノーザンブロット、RT−PCR若しくはマイクロアレイを用いてmRNAの発現を解析することにより、又はイムノブロット、ウエスタンブロット若しくはゲルシフトアッセイを用いてタンパク質の発現を解析することにより確認することができる。 Furthermore, modified trait, that is by the expression level or activity of a change in a polypeptide or polynucleotide of the present invention, Northern blotting, by analyzing the expression of mRNA using RT-PCR or microarrays, or it can be confirmed by analyzing the expression of the protein using immunoblot, Western blot or gel shift assays.
【0062】 [0062]
5. 5. ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの商業的応用本発明の遺伝子についての具体的な応用は、植物の開花時期または春化処理反応におけるその潜在的な役割に関する。 Specific applications for gene commercial applications present invention polynucleotides and polypeptides, to their potential role in flowering or vernalization response of plants. 最も近代的な穀物(crop)品種は、大規模な交配プログラムの結果であり、そして多世代の戻し交配が所望の特質を導入するために必要とされる場合がある。 The most modern grain (crop) variety is the result of extensive breeding program, and there are cases where multiple generations of backcrossing are required to introduce the desired characteristics. 開花を促進するシステムは、それらにより世代時間が非常に早くすることができるため、このようなプログラムにおいて貴重な応用性を有する可能性がある。 System to promote flowering, since they makes it possible generation time is very fast, can have a valuable applicability in such programs. さらに、いくつかの事例においては、より早い世代時間により、所定の生育シーズンの中でさらに穀物の収穫を得ることが可能になる。 Further, in some cases, the earlier generation time, it is possible to obtain a further harvest crop in a given growing season. たとえばギネアアブラヤシ(oil palm)、プラ(aspen)、マツ、およびユーカリノキなどの樹木種についてのトランスフォームシステムの出現により、森林バイオテクノロジーが興味の領域として成長しつつある。 For example oil palm (oil palm), plastics (aspen), pine, and the advent of the transform system of the tree species such as eucalyptus, forestry biotechnology growing as a region of interest.
【0063】 [0063]
同様に、植物の栄養器官の一部が穀物を構成し、そして生殖組織が廃棄される、テンサイなどの種においては、開花を遅延させたり抑制したりすることは都合のよいことであろう。 Similarly, some of the vegetative organs of the plant constitutes a cereal, and reproductive tissue is discarded, in species such as sugar beet, or to or suppressed to delay flowering would be convenient. 栄養器官の発生を拡張することは、収量を大幅に増大することを引き起こす。 Expanding the occurrence of vegetative organs causes that greatly increases the yield.
【0064】 [0064]
さらに、誘導性のプロモーターを使用して、開花時期調節遺伝子の発現を制御することにより、潜在的には、開花を所望するように引き起こすことができる(たとえば、化学誘導物質を使用することにより)。 Further, by using an inducible promoter, by controlling the expression of the flowering regulatory genes, potentially, can cause to desired flowering (e.g., by using a chemical inducer) . このことにより、たとえば、穀物を通じて開花を同調させることができ、そしてより効率的な収穫を促進することができる。 Thus, for example, it is possible to tune the flowering through grains and can facilitate more efficient harvesting. このような誘導可能なシステムを使用して、穀物品種の開花を異なる緯度に適合させることができる。 Using such inducible systems can be adapted flowering crop varieties different latitudes. 現在のところ、ダイズおよびワタなどの種が、その開花時期に基づいて異なる緯度に適している一連の成熟群として利用可能である(それは、日照時間により制御される)。 Currently, species such as soybeans and cotton, based on its flowering time is available as a series of mature groups suitable for different latitudes (which is controlled by the daylight hours). 開花を化学的に調節することができるシステムにより、単一の高収率の北部成熟群をいずれの緯度においても生育させることができる様になる。 The system can adjust the flowering chemically, it becomes like can be grown at any latitude Northern maturation groups single high yield. 南部領域においては、このような植物をより長く生育させることができ、それにより、開花を誘導する前に、収率を増加させることができる。 In southern regions, such plants can be grown longer, thereby prior to induce flowering, it is possible to increase the yield. より北部の地域では、誘導を使用して、穀物が最初の冬季氷結(winter frosts)の前に開花することを確実にすることができる。 In more northern part of the region, using the induction, it is possible to ensure that bloom in front of the grain is the first winter freezing (winter frosts). 現在は、異なる緯度について一連の成熟群が存在することが、新しい貴重な特質を導入するための主要な障壁に相当する。 Currently, the presence of a series of mature groups for different latitudes, corresponding to a main barrier to introducing new valuable qualities.
【0065】 [0065]
多くの穀物種について、高収率冬季品種は、冬季シーズンが持続し、春化反応を引き起こすために十分なほど寒冷である、温帯性の領域においてのみ増殖することができる。 For many crop species, high yield winter varieties, and sustained winter season, a cold enough to cause vernalization reaction, can only be grown in temperate regions. 本発明の遺伝子の変化した発現は、遅れて開花するArabidopsisの生態型における春化処理を埋め合わせることができた。 Altered expression of the gene of the present invention were able to compensate for vernalization in ecotype Arabidopsis to delay flowering. 同様の効果を、穀物植物において達成することができる。 Similar effects can be achieved in crop plants. たとえば、その後、G157(またはコムギのオルトログ)を過剰発現するコムギの冬季品種を、その方法以外では、暖かすぎて効率的な春化処理ができない、南部カリフォルニアなどの地域で生育させることができる。 For example, after the winter varieties of wheat overexpressing G157 (or orthologs of wheat), other than the method can not efficiently vernalization too warm, it can be grown in areas such as Southern California. このシステムの第二の用途は、サクランボ(Prunus)におけるものである。 The second application of this system is in the cherries (Prunus). 地方的に生育するサクラは、冬季が春化処理には暖かすぎて生じないため、カリフォルニアの早春には利用することができない。 Sakura that grow in local manner, the winter is because it does not cause too much warmth is much more processing, can not be used in the early spring of California.
【0066】 [0066]
さらなる応用がイチゴ(Fragaria)において存在する。 Further applications exist in strawberry (Fragaria). イチゴは、開花の開始、休眠、果実の成長およびつるの成長のうまく規定された永久のサイクルを有する。 Strawberry has the start of flowering, dormancy, the well-defined permanent cycle of growth of fruit and vine growth. 温帯の欧州の国では、初春に植物が開花し、そして果実が5月または6月に生産される。 In the European countries of the temperate zone, the plant is flowering in early spring, and fruit is produced in May or June. 果実がなった後に、つるが生成し、根を採る苗木を運ぶ。 After the fruit has become, vine produces, carries the seedlings to take root. 次に、植物は全て晩夏から秋に休眠する。 Then, the plant is dormant all from late summer to autumn. 植物が冬の冷却処理を受けた後に春の後までは、開花を繰り返すことができない。 Until after the spring after the plant is subjected to a cooling process of the winter, it is impossible to repeat flowering. この春化処理の要求を開扉する計はイチゴの2番目の秋の果実が春の果実に加えて収穫されることを可能にするかもしれない。 Meter of door opening the request for the vernalization might allow the second fall of the fruit of strawberries are harvested in addition to the spring of the fruit.
【0067】 [0067]
最後に、遺伝子それら自体の直接の応用に加え、それらの制御領域も価値があり得る。 Finally, in addition to the gene directly applications of their own, it may also be worth their control region. これらの遺伝子のプロモーターが低温に応答性であれば、凍結に対する寛容を授与する遺伝子の制御のための発現系にそれらを取り込むことができる。 If the promoter is responsive to the low temperature of these genes can be incorporated them into expression systems for regulation of genes conferring tolerance to freezing. そのような遺伝子は次に必要なときに特別にアップ制御されて、それによりそれらの構成的発現によりもたらされるあらゆる毒性作用を最少にする。 Such genes are specifically up control when next required, thereby minimizing any toxic effects caused by their constitutive expression.
【0068】 [0068]
6. 6. ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの他の利用性本発明により提供される転写因子のコーディングは、転写因子の発現に影響するかもしれず且つ開花時期に影響するかもしれない外因性または内因性分子を同定するために使用してよい。 Polypeptides and coding transcription factors provided by another utility present invention polynucleotides to identify exogenous or endogenous molecules may and affect flowering time without might affect the expression of the transcription factor it may be used to. これらの分子は有機または無機化合物を含んでよい。 These molecules may contain organic or inorganic compounds.
【0069】 [0069]
例えば、上記の方法は植物または植物細胞に接触して分子を最初に配置することを必要としてよい。 For example, it may require that the above method is to place the first molecules in contact with the plant or plant cell. 上記の分子は局所投与、例えばスプレーまたは植物の浸潤により導入してよく、そしてTFポリペプチドの発現または活性あるいはポリヌクレオチドの発現に対する分子の効果を監視する。 Additional molecules topical administration, for example may be introduced by infiltration of spray or plant, and to monitor the effects of molecules on the expression of the expression or activity, or a polynucleotide of the TF polypeptide. TFポリペプチドの発現の変化はポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ゲル電気泳動等の使用により監視してよい。 TF changes in the expression of the polypeptide polyclonal or monoclonal antibodies may be monitored by use of such gel electrophoresis. 対応するポリヌクレオチド配列の発現の変化はマイクロアレイ、ノーザンまたはmRNA発現の変化を監視する他のあらゆる技術の使用により検出してよい。 Changes in the expression of the corresponding polynucleotide sequence microarrays, may be detected by use of any other technique for monitoring changes in Northern or mRNA expression. これらの技術はAusubel et al. These techniques Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)に例示される。 (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, illustrated in John Wiley & Sons (1998). 発現レベルのそのような変化は修飾された植物の特色に相関するかもしれず、そして即ち同定された分子は、果物、野菜および穀物を浸潤するかまたはスプレーすることにより植物の特色を修飾するために使用してよい。 Shirezu be such a change in the expression level is correlated to features of the modified plant, and namely identified molecule fruit, by or sprayed infiltrating vegetables and grains to modify the characteristics of plants it may be used.
【0070】 [0070]
転写因子は相互作用するかもしれないプロモーター配列を同定するために用いてもよい。 Transcription factor may be used to identify promoter sequences which might interact. プロモーター配列を同定した後に、プロモーター配列中の特定のヌクレオチドまたはプロモーター配列に相互作用して植物の特色を変化させる転写因子中の特定のアミノ酸を変化させることにより、転写因子とプロモーター配列の間の相互作用を修飾してよい。 After identifying a promoter sequence, cross between interact in a specific nucleotide or promoter sequence of the promoter sequence by changing particular amino acids in the transcription factor that changes the characteristics of the plant, transcription factors and promoter sequences it may be modified the action. 典型的には、転写因子のDNA結合部位をゲルシフトアッセイにより同定する。 Typically, the DNA binding sites for transcription factors identified by gel shift assay. プロモーター領域を同定した後に、プロモーター領域の配列を二本鎖DNAアレイにおいて用いることにより、TFsとそれらのプロモーターとの相互作用に影響する分子を同定してよい(Bulyk et al.(1999)Nature Biotechnology 17:573−577)。 After identifying the promoter regions, by using the double-stranded DNA arrays to sequence of the promoter region, it may identify molecules that affect the interaction of the TFs and their promoters (Bulyk et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 573-577).
【0071】 [0071]
同定された転写因子は、該転写因子の活性を調整するタンパク質の同定にも有用である。 Identified transcription factors are also useful to identify proteins that modulate the activity of the transcription factor. そのような調整は、リン酸化あるいはタンパク質−タンパク質(ホモあるいはヘテロポリマー)相互作用のような、共有結合による修飾により引き起こされる。 Such adjustments, phosphorylated or protein - protein (homo or hetero polymers), such as the interaction is caused by covalent modification. タンパク質−タンパク質相互作用の検出に適したどんな方法でも適用してよい。 Protein - may be applied in any method suitable for detecting protein interactions. 適用してもよい方法には共免疫沈降、架橋と勾配またはクロマトグラフィーカラムによる共精製、およびツーハイブリッドイーストシステムがある。 The method, which may apply co-immunoprecipitated, co-purify by crosslinking with gradients or chromatographic columns, and there is a two-hybrid yeast system.
【0072】 [0072]
ツーハイブリッドシステムはタンパク質相互作用をin vivoで検出し、Chien ら、(1991)、Proc. Two-hybrid system detects protein interactions in in vivo, Chien et al., (1991), Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA,88,9578−9582に記載され、Clontech(Palo Alto,Calif.)から購入可能である。 USA, is described in 88,9578-9582 be purchased Clontech (Palo Alto, Calif.) From. このシステムでは、プラスミドは二つのハイブリッドタンパク質をコードするように構築される:片方はTFポリペプチドと融合した転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインからなり、もう一方はcDNAライブラリーの一部としてプラスミドに組み換えたcDNAによってコードされた未知タンパク質と融合した転写アクチベータタンパク質の活性化ドメインからなる。 In this system, plasmid is constructed to encode two hybrid proteins: one consists of the DNA binding domain of a transcription activator protein fused with TF polypeptide, a plasmid other as part of a cDNA library consisting activation domains of the transcription activator protein fused to the encoded unknown proteins by recombinant was cDNA. DNA結合ドメイン融合プラスミドおよびcDNAライブラリーは、転写アクチベーター結合サイトを制御領域に有するレポーター遺伝子(たとえば、LacZ)を有する酵母サッカロマイセス セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)の菌種に形質転換される。 DNA-binding domain fusion plasmid and the cDNA library are transformed into bacterial species of the reporter gene with a transcriptional activator binding site in the control region (e.g., LacZ) yeast Saccharomyces cerevisiae having the (Saccharomyces cerevisiae). いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化できない。 It can not activate transcription of the reporter gene alone any hybrid proteins. 二つのハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的なアクチベータータンパク質を再構築し、結果としてレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される、レポーター遺伝子の発現がおこる。 Interaction of the two hybrid proteins reconstructs the functional activator protein, resulting is detected by assay of a reporter gene product, the expression of the reporter gene occurs. その後、レポーター遺伝子発現を行うことができるライブラリープラスミドは単離し、ライブラリープラスミドによってコードされたタンパク質を同定するために配列同定する。 Then, the library plasmids can be carried out reporter gene expression are isolated and sequence identification to identify the proteins encoded by the library plasmids. 転写因子と相互作用するタンパク質を同定した後、TFタンパク質―タンパク質相互作用を阻害する化合物のアッセイを行ってもよい。 After identifying proteins that interact with the transcription factor, TF protein - may be assayed for compounds that inhibit protein interactions.
【0073】 [0073]
以下の例は本発明を説明するものであるが、限定するものではない。 The following examples illustrate the present invention but not limiting.
方法 すべての実験は他に示さない限りは生態型ColumbiaのArabidopsisを用いて行った。 Methods All experiments unless indicated otherwise was performed using Arabidopsis ecotype Columbia. Stockholm(CS6863)およびPitztal(CS6832)系列はオハイオ州立大学のABRCより調達した。 Stockholm (CS6863) and Pitztal (CS6832) series has raised from ABRC of Ohio State University. すべての実験において、種子は2分間のエタノール処理につづいて30分間30%ブリーチ/0.01%Tweenにつけ、そして蒸留水で5回洗浄して滅菌した。 In all experiments, seeds attached to subsequently 30 minutes 30% bleach /0.01%Tween ethanol for 2 minutes, and sterilized by washing 5 times with distilled water. 種子は0.1%アガロースのMS寒天培地に植え付け、20−25℃の温度の生育室に移す前に、4℃で3−5日間層の間に保存した。 Seeds planted in MS agar medium 0.1% agarose, before being transferred to the growth chamber at a temperature of 20-25 ° C., and stored between 3-5 days layer at 4 ° C.. MS培地には形質転換した植物の選択のため50mg/lカナマイシンを添加した。 The MS medium was supplemented with 50 mg / l kanamycin for selection of transformed plants. 植物はプレート上で7日間栽培した後、土に植え替えた。 Plants After cultivation on a plate for seven days, was planted in the soil. 春化処理には、種子をMS寒天プレートに植え付け、微孔テープでシールし、低光量の4℃の低温室で6−8週間置いた。 The vernalization treatment, planting seeds on MS agar plates, sealed with a microporous tape was placed 6-8 weeks in a cold room for 4 ° C. in low light. プレートはその後植え付けたばかりの春化処理していないコントロールを含むプレートと並べ、生育室に移した。 Plate plate and side by side, including a control that is not vernalization just then planting, were transferred to the growth chamber. 生長力のある苗全体は6から9週間後に遺伝子発現解析を行うために収穫した。 Overall there vegetative seedlings were harvested in order to perform gene expression analysis after 6 9 weeks. 約3cmの認識できる開花が明らかになったとき、ロゼット葉を数えた。 When recognizable flowering about 3cm revealed were counted rosette leaves. プロジェニー(progeny)茎上のロゼットと全体の葉の数は開花のタイミングときっちりとした相関がある(Koornneef ら(1991)Mol.Gen.Genet. 229:57−66)。 Progeny (progeny) number of leaves of whole rosettes on stems is tight and correlation with the timing of flowering (Koornneef et al. (1991) Mol.Gen.Genet 229:. 57-66).
【0074】 [0074]
実施例I. Example I. 全長遺伝子の同定とクローニング以下の例において、G157は配列ID番号1および2を参照し、G859は配列ID番号3−8を参照し、G1842は配列ID番号9−16を参照し、G1843は配列ID番号17および18を参照し、G1844は配列ID番号19−22を参照し、G861は配列ID番号23−26を参照し、そしてFLCあるいはG1759は配列ID番号27,28を参照する。 In the example of identifying and cloning the following full-length gene, G157 refers to SEQ ID NO: 1 and 2, G859 refers to SEQ ID NO: 3-8, G1842 refers to SEQ ID NO: 9-16, G1843 array refers to the ID numbers 17 and 18, G1844 refers to SEQ ID NO: 19-22, G861 refers to SEQ ID NO: 23-26, and FLC or G1759 refers to SEQ ID NO: 27 and 28.
【0075】 [0075]
既知の転写因子に関連した推定の転写因子の配列(ゲノム中のまたはESTs)は、デフォルトパラメータおよび問題の配列の長さによって−4または−5またはそれ以下のP値カットオフしきい値を用いて、tblastn配列解析プログラムを用いてアラビドプシス サリアナ(Alabidopsis thaliana)GenBankデータベースで同定した。 Sequence of the transcription factor estimation related to known transcription factor (in genomic or ESTs) is using default parameters and the length of the sequence of interest 4 or -5 or less P value cutoff threshold Te, were identified in Arabidopsis thaliana (Alabidopsis thaliana) GenBank database using the tblastn sequence analysis program. それから推定の転写因子配列にヒットするものを、特定の配列鎖を含むものを同定するために調べた。 Then those that hit the transcription factor sequence of the putative were examined to identify those containing particular sequence strand. もしヒットした配列がそのような配列鎖を含む場合は、該配列は転写因子であることを確認した。 If if hit sequences comprising such sequences chains, it was confirmed that the sequence is a transcription factor.
【0076】 [0076]
たとえば、我々はFLCに関連したタンパク質をコードすると予測されていた、染色体I中のBAC F22K20(GenBankアクセス AC002291)の中からMADS box遺伝子G157を同定した。 For example, it has been predicted to encode a protein associated with FLC, were identified MADS box gene G157 from the BAC in the chromosome I F22K20 (GenBank access AC002291). G157の872bp cDNAクローンは葉のmRNA由来のライブラリーから単離されたクローンから同定した。 872bp cDNA of the G157 clone was identified from clones isolated from the library derived from mRNA of leaf. コードされたタンパク質は196アミノ酸の長さで、全アミノ酸配列の62%の部分がFLCと一致し、MADS DNA結合ドメインとは82%一致した。 Encoded protein is the length of 196 amino acids, 62% of the portion of the total amino acid sequence matches the FLC, the MADS DNA-binding domain was consistent 82%.
【0077】 [0077]
G157はまた、しっかりとつながったクラスターとして、染色体Vの下流、約22kbを占有し、MXK3、F1505、およびMQN23(それぞれ、GenBankアクセス番号AB019236、AB026633、およびAB013395)の3つの隣接したクローンにまたがって一緒に位置するG859、G1842、G1843、およびG1844とも関連する。 G157 also as tightly linked cluster, downstream of chromosome V, occupies about 22kb, MXK3, F1505, and MQN23 (respectively, GenBank Accession No. AB019236, AB026633, and AB013395) across three adjacent clones located together G859, G1842, G1843, and related G1844 both. G859、G1842、G1843、およびG1844は複製の課程で創造されるようである;これはそれらの遺伝子制御の異なる側面への発散を許容するものである。 G859, G1842, G1843, and G1844 are as created by the course of replication; this is intended to permit the divergence of the different aspects of their genetic control. それらの物理的な近接は、共通の制御因子によって制御される単位であるように働いていることを示している。 Their physical proximity shows that working to be a unit that is controlled by a common regulator.
【0078】 [0078]
FLC、G157、G859、G1842、G1843、およびG1844の57アミノ酸MADSドメインの1対1の比較は表1に示した。 FLC, G157, G859, G1842, G1843, and one-to-one comparison of the 57 amino acids MADS domain of G1844 are shown in Table 1. 該表は、アミノ酸配列の一致の割合を示し、括弧内は、保存性のアミノ酸置換も考慮に入れたときの配列一致の割合を示す。 It said surface shows a rate of coincidence of amino acid sequence, in parentheses indicates the percentage of sequence identity when taking into consideration conservative amino acid substitutions. G859、G1842、G1843、およびG1844にコードされるタンパク質の該MADSドメインはFLCおよびG157のそれと高度に保存され:以下に示した1対1の比較によると、これらのタンパク質は75%から91%のアミノ酸配列の同一性を共有する。 G859, G1842, G1843, and are the MADS domain of the protein encoded by the G1844 is therewith highly conserved of the FLC and G157: According to a one-to-one comparisons presented below, these proteins 91% 75% to share the identity of the amino acid sequence. 保存性のアミノ置換が起こったときは、これらのタンパク質のMADSドメインは88%−99%お互いに一致する(括弧内に示した)。 When conservative amino substitution occurs, the MADS domain of these proteins (shown in brackets) matches the 88% -99% each other.
【0079】 [0079]
【表1】 [Table 1]
【0080】 [0080]
FLCのアミノ酸残基30およびG157、G859、G1842、G1843、およびG1844に関しては酸性残基(EまたはD)である一方、これまでに同定された他のすべてのアラビドプシス(Arabidopsis)MADSドメインタンパク質においては、その位置はプラスに帯電したリジン残基で占められている。 FLC amino acid residues 30 and G157, G859, G1842, G1843, and one is an acidic residue (E or D) with respect to G1844, in all other Arabidopsis (Arabidopsis) MADS domain protein identified so far , its position is occupied by charged lysine residues positively. DNAに結合したヒトSRF MADSドメインの結晶構造ではリジン残基(これは、酵母MCM1およびヒトMEF2Aタンパク質においても保存されている)がDNAターゲットサイトのリン酸バックボーンと接触していることが示されている(Pellegrini ら、(1995)Nature 376:490−498)。 Lysine residue in the crystal structure of the human SRF MADS domain bound to DNA (which is also conserved in yeast MCM1 and human MEF2A protein) is shown to be in contact with the phosphate backbone of the DNA target site are (Pellegrini et al., (1995) Nature 376: 490-498). そのアミノ酸の違いはしたがって、FLCおよびG157、G859、G1842、G1843、およびG1844に関してのDNA結合は、他のアラビドプシス(Arabidopsis)MADSドメインタンパク質とは異なる性質を与えるしれない。 Differences in the amino acid therefore, DNA binding with respect FLC and G157, G859, G1842, G1843, and G1844 are may give different properties than other Arabidopsis (Arabidopsis) MADS domain proteins. したがって、位置30に酸性残基を持つMADSドメインタンパク質は特に植物の開花の調整および春化処理の応答に有用であってよい。 Therefore, it MADS domain proteins with acidic residue at position 30 may be particularly useful for the response of the adjustment and vernalization flowering plants.
【0081】 [0081]
これらの遺伝子からの転写物は3'RACE(Rapid Amplification cDNA Ends)によって解析し、対応するcDNAはアラビドプシス(Arabidopsis)組織(Clumbia生態型)の混合サンプル中からRT−PCRにより単離した。 Transcripts from these genes was analyzed by 3'RACE (Rapid Amplification cDNA Ends), the corresponding cDNA was isolated by RT-PCR from the mixing samples of Arabidopsis (Arabidopsis) tissue (Clumbia ecotype). この分析の間、G859、G1842、およびG1844の転写物はマルチプルアルタネイティブリースプライストフォームとして検出された。 During this analysis, G859, G1842, and transcripts of G1844 were detected as multiple Alta native lease price platforms.
【0082】 [0082]
実施例II 開花時期関連遺伝子同定された各配列のコード領域内の遺伝子特異的プライマーを用い、リバーストランスクリプターゼPCRを行った。 With gene-specific primers within the coding region of Example II flowering related genes identified each sequence was performed reverse transcriptase PCR. 可能な場合は、プライマーは最初に同定された各コード配列の3'領域の近くにデザインした。 When possible, primers were designed close to the 3 'region of the first respective coding sequences were identified.
【0083】 [0083]
全RNAを植物組織から単離して、CTAB法で抽出した。 Total RNA was isolated from plant tissue, and extracted with CTAB method. 抽出した全RNAは全ての組織タイプについて濃度を標準化し、28Sのバンドを参照して、各組織のPCR反応に同じ量のcDNAテンプレートが使われるようにした。 The extracted total RNA was normalized concentration for all tissue types, with reference to the band of 28S, and as cDNA template with the same amount of PCR reactions for each tissue is used. Poly A Poly A + は、Qiagen Oligotex キットバッチのプロトコールを修正したプロトコールを用いて精製した。 It was purified using the protocol that fixes protocol Qiagen Oligotex kit batches. cDNAは標準的プロトコールを用いて合成した。 cDNA was synthesized using standard protocols. 第一鎖cDNA合成の後、アクチン2 のプライマーを用いて、組織タイプにわたってcDNAの濃度を標準化した。 After first strand cDNA synthesis using primers of actin 2 were normalized concentration of cDNA over tissue type. アクチン2 は、Arabidopsis の組織タイプにわたって、ほぼ同じレベルで構成的に発現していることが分かっている。 Actin 2, over tissue type Arabidopsis, has been found to be expressed constitutively at approximately the same level.
【0084】 [0084]
RT PCRのために、cDNAテンプレートは、対応するプライマーおよびTaqポリメラーゼと混合した。 For RT PCR, cDNA template was mixed with corresponding primers and Taq polymerase. 各反応は、0.2μl cDNAテンプレート、2μl 10X トリシンバッファー、および16.8μl 水、5pmolプライマー1、5pmolプライマー2、0.3μl Taqポリメラーゼ、200μM dNTPおよび8.6μl の水で構成した。 Each reaction, 0.2 [mu] l cDNA template, 2 [mu] l 10X Tricine buffer, and 16.8μl water, 5 pmol primer 1,5pmol primer 2,0.3Myueru Taq polymerase was composed of water 200 [mu] M dNTPs and 8.6μl.
【0085】 [0085]
96穴のプレートをマイクロフィルムで覆い、熱循環装置にセットして、下記の反応サイクルを開始した。 Cover plates 96 in microfilm, is set to heat the circulating device, it was initiated following reaction cycle. ステップ1 93℃ 3分、ステップ2 93℃ 30秒、ステップ3 60−65℃ 1分、ステップ4 72℃ 2分。 Step 1 93 ° C. 3 min, Step 2 93 ° C. 30 seconds, Step 3 60-65 ° C. 1 min, Step 4 72 ° C. 2 minutes. ステップ2、3および4は20〜35サイクル繰り返した。 Step 2, 3 and 4 were repeated 20 to 35 cycles. ステップ5 72℃ 5分およびステップ6 4℃。 Step 5 72 ° C. 5 minutes and Step 6 4 ° C.. ある場合にはPCRプレートを熱循環装置に戻して、非常に発現の低い遺伝子の同定のために5〜15回の追加サイクルで、反応産物の量を多くした。 Back in thermal cycling device of the PCR plate if, at 5 to 15 times the additional cycle for the identification of very low expressed genes were increasing the amount of reaction product. その反応サイクルは次のとおりとした。 The reaction cycle was as follows. ステップ2 93℃ 30秒、ステップ3 65℃ 1分、およびステップ4 72℃ 2分,8サイクルの繰り返し、およびステップ4 4℃。 Step 2 93 ° C. 30 seconds, Step 3 65 ° C. 1 min, and Step 4 72 ° C. 2 minutes, repeated for 8 cycles, and step 4 4 ° C.. 21および36サイクルの間に、8マイクロリットルのPCR産物および1.5μl の負荷染料を1.2%アガロースゲルに負荷して分析した。 Between 21 and 36 cycles were analyzed by loading the PCR product and 1.5μl of loading dye 8 microliters 1.2% agarose gel. 特定の転写物が、PCRの35サイクルより遅くやっと検出されたなら、それらの発現レベルは低いと考えられる。 Specific transcripts, if slower than 35 cycles of PCR were detected finally, their expression levels are considered to be low. 観察されたアクチン2 の転写レベルと比較した転写レベルに応じて、発現レベルは中または高と考えられる。 Depending on the level of transcription was compared with the observed actin second transfer level, the expression level is considered medium or high.
【0086】 [0086]
一例として、G157植物中でのG157 mRNAレベルを評価するため、プライマー5'−GGCATAACCCTTATCGGAGATTTGAAGC−3' (SEQ ID No. 57)および 5'−ACACAAACTCTGATCTTGTCTCCGAAGG−3' (SEQ ID No. 58) を用いて、25サイクルにわたるPCRを行った。 As an example, to assess the G157 mRNA levels in G157 plants, using primers 5'-GGCATAACCCTTATCGGAGATTTGAAGC-3 '(SEQ ID No. 57) and 5'-ACACAAACTCTGATCTTGTCTCCGAAGG-3' (SEQ ID No. 58), PCR was carried out over 25 cycles. 野生型植物から抽出した別々の組織のmRNAレベルを評価するため、プライマー5'−GCATAACCCTTATCGGAGATTTGAAGCCAT−3' (SEQ ID No. 59)および 5'−AACATTCCTCTCTCATCATCTGTTGCCAGC−3' (SEQ ID No. 60) を用いて、25または30サイクルのPCRを行った。 To evaluate the mRNA levels of different tissue extracted from wild-type plants, using primers 5'-GCATAACCCTTATCGGAGATTTGAAGCCAT-3 '(SEQ ID No. 59) and 5'-AACATTCCTCTCTCATCATCTGTTGCCAGC-3' (SEQ ID No. 60) were 25 or 30 cycles of PCR. FLCのPCRは、プライマー5'−AACGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC−3' (SEQ ID No. 61)および5'−CTCACACGAATAAGGTACAAAGTTCATC−3' (SEQ ID No. 62)を用いて35回にわたり、または5'−TTAGTATCTCCGGCGACTTGAACCCAAACC−3' (SEQ ID No. 63)および5' AGATTCTCAACAAGCTTCAACATGAGTTCG−3' (SEQ ID No. 64)を用いて30回にわたり行った。 FLC The PCR primers 5'-AACGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3 '(SEQ ID No. 61) and 5'-CTCACACGAATAAGGTACAAAGTTCATC-3' over 35 times with (SEQ ID No. 62), or 5'-TTAGTATCTCCGGCGACTTGAACCCAAACC-3 ' It was performed for (SEQ ID No. 63) and 5 'AGATTCTCAACAAGCTTCAACATGAGTTCG-3' (SEQ ID No. 64) 30 times with. プライマーの特異性は、RT−PCR産物の配列決定によた確認された。 Specificity of the primers was confirmed was good for sequencing of RT-PCR products. サンプルは、アクチンプライマーを用いた20〜25サイクルのPCRにより標準化した。 Samples were normalized by 20-25 cycles of PCR with actin primers.
【0087】 [0087]
実施例III . Example III. 発現ベクターの構築ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーからの配列を、コード領域の上流および下流の配列に特異的なプライマーを用いて、増幅した。 Sequences from construction genomic or cDNA libraries of expression vectors, using primers specific to sequences upstream and downstream of the coding region was amplified. 発現ベクターはpMEN20またはpMEN65であり、両者ともpMON316 (Sanders et al, (1987) Nucleic Acids Research 15:1543−58) に由来して、トランス遺伝子を発現するためのCaMV 35Sプロモーターを含んでいる。 Expression vectors are pMEN20 or PMEN65, Both pMON316 (Sanders et al, (1987) Nucleic Acids Research 15: 1543-58) derived from, includes a CaMV 35S promoter to express transgenes. 配列をベクター中にクローニングするため、pMEN20および増幅したDNA断片の両者を別々にSalIおよびNotI制限酵素で37℃2時間消化した。 Since the sequence is cloned into the vector it was digested 37 ° C. 2 hours separately SalI and NotI restriction enzymes both pMEN20 and amplified DNA fragments. 消化産物を0.8%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。 The digestion products were electrophoresed on a 0.8% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining. この配列および直線化プラスミドを含むDNA断片を切り出し、Qiaquick gel extraction kit (Qiagen,CA) を用いて精製した。 Excised DNA fragment containing this sequence and linearized plasmid was purified using Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, CA). 興味対象の断片を3:1(ベクター対挿入片)の比率で連結した。 The fragment of interest 3: were ligated in a ratio of 1 (vector pair insert). T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, MA)を用いて、連結反応を16℃16時間行った。 T4 DNA ligase (New England Biolabs, MA) was carried out using the ligation reaction 16 ° C. 16 hours. 連結したDNAを、熱ショック法を用いて、E. The ligated DNA, using a heat shock method, E. coli DH5 アルファ株のコンピテント細胞に形質転換した。 It was transformed into competent cells of coli DH5 alpha strain. 形質転換体は、50mg/lのスペクチノマインシ(Sigma) を含むLBプレートにまいた。 Transformants were plated on LB plates containing spectinomycin Main sheet of 50mg / l (Sigma).
【0088】 [0088]
個々のコロニーを、50mg/lのスペクチノマインシを含む5mlのLBブロスで一夜、37℃で増殖させた。 Individual colonies overnight at 5ml of LB broth containing spectinomycin Main sheet of 50 mg / l, were grown at 37 ° C.. プラスミドDNAはQiaquick Mini Prep kits (Qiagen,CA)を用いて精製した。 Plasmid DNA was purified using Qiaquick Mini Prep kits (Qiagen, CA).
【0089】 [0089]
実施例 IV発現ベクターによるAgrobacteriumの形質転換遺伝子を含有するプラスミドベクターを構築した後、このベクターを使用して遺伝子産物を発現するAgrobacterium tumefaciens細胞を形質転換した。 After building a plasmid vector containing the transforming gene of Agrobacterium according to Example IV expression vector, and the Agrobacterium tumefaciens cells expressing the gene products using this vector was transformed. Agrobacterium tumefaciens細胞の形質転換用保存株は、Nagel et al. Stocks for transformation of Agrobacterium tumefaciens cells, Nagel et al. FEMS Microbiol Letts 67: 325−328 (1990)の記載に従って作製した。 FEMS Microbiol Letts 67: was prepared according to the description of 325-328 (1990). 吸光度(A 600 )が0.5〜1.0に達するまで、Agrobacterium GV3101株を250mlのLB培地(Sigma)中にて一晩28℃で振盪培養した。 Absorbance until (A 600) reached 0.5-1.0, and cultured with shaking overnight at 28 ℃ the Agrobacterium GV3101 strain in LB medium (Sigma) in 250 ml. 4,000×gで15分間4℃にて遠心分離を行うことにより細胞を回収した。 Cells were harvested by centrifuging for 15 minutes at 4 ° C. at 4,000 × g. 次いで細胞を、250μlの氷冷バッファー(1mM HEPES、KOHにてpHを7.0に調整)へ再懸濁させた。 Cells were then resuspended in ice-cold buffer of 250 [mu] l (Adjustment 1 mM HEPES, and the pH at KOH to 7.0). 細胞を上述のように再度遠心分離し、125μlの氷冷バッファーへ再懸濁させた。 Cells were centrifuged again as above, resuspended to the ice-cold buffer of 125 [mu] l. 次いで遠心分離と再懸濁をさらに2回繰り返した。 Then repeated two more times resuspension and centrifugation. その際、上述と同一のHEPESバッファー100μlおよび750μlへ細胞を懸濁させた。 At that time, it was suspended cells to the same HEPES buffer 100μl and 750μl and above. 次いで、再懸濁した細胞を40μlずつ分注し、液体窒素中にて急速冷凍させて−80℃で保存した。 Then, aliquoted resuspended cells by 40μl min, and stored at -80 ° C. and flash frozen in liquid nitrogen.
【0090】 [0090]
Nagel et al. Nagel et al. FEMS Microbiol Letts 67: 325−328 (1990)に記載のプロトコールに従い、上述のように調製したプラスミドでAgrobacterium細胞を形質転換した。 FEMS Microbiol Letts 67: according to the protocol described in 325-328 (1990), and the Agrobacterium cells were transformed with plasmids prepared as described above. 形質転換すべき各DNA構築物当たり、50〜100ngのDNA(通常、10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0へ再懸濁)をAgrobacterium細胞40μlと混合した。 Each DNA construct per to be transformed, DNA of 50~100ng (typically, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, resuspended to pH8.0) was mixed with Agrobacterium cells 40 [mu] l. 次いで、氷冷キュベット(電極間隔2mm)へDNA/細胞混合物を移し、Gene Pulser II装置(Bio−Rad)を用いて25μFおよび200μFにて2.5kVの電圧を印加した。 Then, ice-cold to the cuvette (electrode gap 2 mm) transferred DNA / cell mixtures were applied with a voltage of 2.5kV at 25μF and 200μF using a Gene Pulser II apparatus (Bio-Rad). エレクトロポレーション後、細胞を1.0mlのLB培地へ直ちに再懸濁させ、抗生物質による選別を行わずに、振盪インキュベーター内で2〜4時間28℃にて細胞を回復させた。 After electroporation, cells were immediately resuspended into LB medium 1.0 ml, without sorting by antibiotics, the cells were allowed to recover at 2-4 hours 28 ℃ in a shaking incubator. 回復後、スペクチノマイシン(Sigma)を100μg/ml含有するLBブロス選択培地へ細胞を播種し、24〜48時間28℃にてインキュベートした。 After recovery, cells were seeded spectinomycin (Sigma) to LB broth selective medium containing 100 [mu] g / ml, and incubated at 24-48 hours 28 ° C.. 次いで単一コロニーを拾い、新鮮な培地へ接種した。 Then picked single colonies were inoculated into fresh medium. プラスミド構築物の完全性をPCR増幅および配列分析によって確認した。 The integrity of the plasmid constructs were confirmed by PCR amplification and sequence analysis.
【0091】 [0091]
実施例 発現ベクターを保有するAgrobacterium tumefaciensによるArabidopsis植物体の形質転換遺伝子を含有するプラスミドベクターでAgrobacterium tumefaciensを形質転換した後、単一のAgrobacteriumコロニーを同定および培養し、Arabidopsis植物体の形質転換に使用した。 After transformation of Agrobacterium tumefaciens with plasmid vectors containing the transforming gene of Arabidopsis plants by Agrobacterium tumefaciens carrying the Example V expression vectors were identified and cultured single Agrobacterium colony, for the transformation of Arabidopsis plants used. 簡単に言うと、スペクチノマイシンを50mg/l含有するLB培地の500ml培養物にコロニーを接種し、吸光度(A 600 )が2.0を超えるまで28℃で2日間振盪培養を行った。 Briefly, inoculated with colonies spectinomycin 500ml cultures of LB media containing 50 mg / l, the absorbance (A 600) was subjected to shaking cultured for 2 days at 28 ℃ to greater than 2.0. 次いで、4,000×gにて10分間遠心分離を行うことにより細胞を回収し、浸潤用培地(1/2×Murashige and Skoog塩 (Sigma)、1×Gamborg's B−5ビタミン(Sigma)、5.0%(w/v)スクロース(Sigma)、0.044μM ベンジルアミノプリン(Sigma)、200μl/L Silwet L−77 (Lehle Seeds))中に、吸光度(A 600 )が0.8になるまで再懸濁させた。 Cells were then harvested by centrifuging 10 minutes at 4,000 × g, infiltration medium (1/2 × Murashige and Skoog salts (Sigma), 1 × Gamborg's B-5 vitamins (Sigma) , 5.0% (w / v) sucrose (Sigma), 0.044μM benzylaminopurine (Sigma), in 200μl / L Silwet L-77 ( Lehle Seeds)), the absorbance (a 600) 0.8 made until resuspended.
【0092】 [0092]
形質転換を行う前に、ガラス繊維メッシュ(18mm×16mm)で覆ったPro−Mix BX注封材(Hummert International)上へ、4インチ鉢1つ当たり植物体が約10体となるような密度にてArabidopsis thalianaの種子(生態型:コロンビア)を蒔いた。 Before transformation, covered with fiberglass mesh (18mm × 16mm) Pro-Mix BX Chufuzai to (Hummert International) above, the density as 4 inches pots one per plant is about 10 bodies Te Arabidopsis thaliana seeds (ecotype: Colombia) were plated. 連続照明下(50〜75μE/m /秒)、22〜23℃および相対湿度65〜70%にて植物体を栽培した。 Continuous under illumination (50~75μE / m 2 / sec) were cultivated plants at 22-23 ° C. and a relative humidity of 65-70%. 約4週間後、一次花序茎(primary inflorescence stem)を刈り取り、二次茎が多く育つようにした。 After about 4 weeks, mowing the primary inflorescence stems (primary inflorescence stem), and so grow more secondary stems. 成熟二次茎が開花した後、長角果と開花した花を全て取り除くことにより植物体を形質転換用に調整した。 After mature secondary stems flowered was adjusted plant for transformation by removing all the flowers that bloom with siliques.
【0093】 [0093]
次いで、上述のAgrobacterium浸潤培地混合物中へ鉢を上下逆さにして30秒間浸漬し、プラスチック製のラップで覆った1フィート×2フィートの平面上で鉢を横にして水分を切った。 Then the pot upside down into the aforementioned Agrobacterium infiltration medium mixture was immersed for 30 seconds, turn off the water to the bowl laterally in the plane of the covered one foot × 2 feet plastic wrap. 24時間後、プラスチックラップを外し、鉢を起こした。 After 24 hours, remove the plastic wrap, it caused the pot. 1週間後に浸漬手順を繰り返し、1鉢につき合計で2回浸漬を行った。 To repeat the dipping procedure after one week, it was carried out for 2 times immersed in total per pot. 次いで、形質転換の済んだ各鉢から種子を回収し、後述のプロトコールに従って分析を行った。 Then, the seeds were harvested from each pot having undergone the transformation were analyzed according to the protocol described below.
【0094】 [0094]
実施例 VI Arabidopsisの一次形質転換体の同定形質転換の済んだ鉢から回収した種子を、基本的に下記のようにして滅菌した。 EXAMPLE VI Arabidopsis primary transformants seeds collected from finished it pot of identifying transformation were sterilized essentially as follows. 0.1%(v/v)Triton X−100(Sigma)と滅菌水を含む溶液へ種子を分散させ、20分間懸濁液を振盪させることで種子を洗浄した。 0.1% (v / v) Triton X-100 (Sigma) and seeds were the dispersed into a solution containing sterile water, washing the seeds by which shaking for 20 minutes the suspension. 次いで、洗浄溶液を捨てて新しい洗浄溶液と交換し、振盪させながら種子を20分間洗浄した。 Then, discard the wash solution was replaced with fresh wash solution, seeds were washed for 20 minutes with shaking. 2回目の洗浄溶液を除去した後、0.1%(v/v)Triton X−100と70%エタノール(Equistar)を含む溶液を種子へ添加し、懸濁液を5分間振盪した。 After removal of the second wash solution was added to 0.1% (v / v) Triton X-100 and 70% ethanol solution containing a (Equistar) seeds was shaken a suspension for 5 minutes. エタノール/洗剤溶液を除去した後、0.1%(v/v)Triton X−100と30%(v/v)漂白剤(Clorox)を含む溶液を種子へ添加し、懸濁液を10分間振盪した。 After removal of the ethanol / detergent solution, 0.1% (v / v) Triton X-100 and 30% (v / v) of a solution containing a bleaching agent (Clorox) was added to the seeds, suspension 10 minutes shaking was. 漂白剤/洗剤溶液を除去した後、次いで種子を滅菌蒸留水中で5回洗浄した。 After removal of the bleach / detergent solution, then washed 5 times the seed with sterile distilled water. 最終洗浄水中にて種子を4℃で2日間、暗所にて保存した後、抗生物質選択培地(1×Murashige and Skoog塩(1M KOHにてpHを5.7に調整)、1×Gamborg's B−5ビタミン、0.9%phytagar (Life Technologies)、および50 mg/Iカナマイシン)へ播種した。 2 days at 4 ° C. Seeds in the final wash water was stored in the dark, adjusted to pH 5.7 by antibiotic selection medium (1 × Murashige and Skoog salts (1M KOH), 1 × Gamborg ' s B-5 vitamins, were seeded to 0.9% phytagar (Life Technologies), and 50 mg / I kanamycin). 連続照明下(50〜75μE/m /秒)、22〜23℃にて種子を発芽させた。 Continuous under illumination (50~75μE / m 2 / sec) were germinated seeds at 22-23 ° C.. このような条件で7〜10日間育成した後、カナマイシン耐性一次形質転換体(T 世代)を黙視で確認して取得した。 After training for 7-10 days under such conditions, it was acquired to confirm kanamycin-resistant primary transformants (T 1 generation) in Mokushi. これらの実生を、まず、新しい選択プレートへ移してさらに3〜5日間育成し、次いで土壌(Pro−Mix BX注封材)へ移した。 These seedlings, first, to foster further 3-5 days transferred to new selection plates, then transferred to soil (Pro-Mix BX Chufuzai).
【0095】 [0095]
一次形質転換体を自家受粉させ、後代種子(T2)を回収した。 Primary transformants were self-pollinated to recover the progeny seed (T2). T2後代種子を上述のようにカナマイシン上で発芽させ、カナマイシン耐性実生を選別して土壌へ移し、分析を行った。 The T2 progeny seeds germinated on kanamycin as described above, by selecting kanamycin resistant seedlings were transferred to soil and analyzed.
【0096】 [0096]
実施例 VIIトランスジェニックArabidopsis植物体の分析第1の実験では、G157植物体(即ち、G157トランスジーンを発現する植物体)を12時間照明下にて栽培した。 In Example VII Transgenic Arabidopsis plants analyzed first experiment, G157 plants (i.e., plants expressing the G157 transgene) were cultivated under illumination for 12 hours. 40系統のうち30系統が、対照ベクターで形質転換した対照植物よりも早く開花した。 30 strains among the 40 strains, flowered earlier than the control plants transformed with a control vector. 早咲きのT1系統の平均ロゼット葉数は12.4±0.8であり、対照系統のロゼット葉数は27±1.2であった。 Mean rosette leaves number of T1 lines of early flowering is 12.4 ± 0.8, rosette leaves the number of control lines was 27 ± 1.2. 40系統のT1植物体のうち2系統が対照と同時に開花し、40系統のうち7系統は遅咲きであって、野生型よりも2〜3週間遅れて花序が確認された。 Two systems of T1 plants 40 strains bloom control at the same time, 7 strains among 40 strains is a late-blooming, inflorescence was confirmed late 2-3 weeks than wild-type.
【0097】 [0097]
さらなる実験では、24時間照明下、20〜25℃にて植物体を栽培した。 In a further experiment, under illumination for 24 hours and cultivated plants at 20-25 ° C.. このような条件下では、非形質転換対照植物体は、花芽形成前の一次苗条の平均合計葉数が14.3±0.7であった。 Under such conditions, non-transformed control plants, the average total leaf number of the primary shoots before flower bud formation was 14.3 ± 0.7. 花芽は、種を蒔いてから平均で21.1±0.5日後に初めて確認された(誤差の値は、95%信頼限界を与える標準誤差を表す)。 Flower buds, was first identified in 21.1 ± 0. 5 days on average from sowing (value of the error represents the standard error giving 95% confidence limits). G859の場合は、T1植物体の14/19が早咲きであり(平均合計葉数は6.4±0.7、花芽は播種後12.9±0.7日目に確認)、3/19が野生型であり、2/19が野生型に比べて若干遅咲きであった(平均合計葉数は19、花芽は27日目に確認)。 In the case of G859 is a 14/19 of T1 plants is early flowering (average total number of leaves is 6.4 ± 0.7, flower buds after seeding 12.9 ± 0. Confirmation on day 7), 3/19 there is a wild-type, 2/19 and slightly was the late-blooming compared to wild-type (the average total number of leaves 19, flower buds confirmed on day 27, 2007). RT発現研究からは、遅咲きの個体のトランスジーン発現量が最も高いことが判明した。 From RT expression studies, it was found that transgene expression amount of an individual's late-blooming is the highest. これらの結果はG157の場合と非常に似通っている。 These results are very similar to the case of the G157. G1842の場合には、T1植物体の7/10が早咲きであり(平均合計葉数は7.9±0.6、花芽は13.9±1.0日目に確認)、3/10が野生型であった。 In the case of the G1842 is a 7/10 is early flowering of the T1 plants (check the average total number of leaves is 7.9 ± 0.6, flower buds to 13.9 ± 1. 0 day), 3/10 It was wild type. また、G1842の短鎖スプライス変異体をコードするcDNAを用いて過剰発現研究を行った。 In addition, we over-expression studies using cDNA encoding short splice variant of G1842. G1842.2(185のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード)の場合には、T1植物体の15/18が早咲きであり(平均合計葉数は6.9±0.9、花芽は14.5±0.6日目に確認)、3/18が野生型であった。 G1842.2 in the case of (encoding splice variant consisting of 185 amino acids) is 15/18 of the T1 plants are early flowering (average total number of leaves 6.9 ± 0.9, flower buds 14.5 ± 0. confirmation on day 6), 3/18 was a wild type. G1842.6(77のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード)の場合には、T1植物体の8/10が早咲きであり(平均合計葉数は6.8±1.6、花芽は13.9±0.9日目に確認)、2/10が野生型であった。 G1842.6 in the case of (encoding splice variant consisting of 77 amino acids) is 8/10 of T1 plants is early flowering (average total number of leaves 6.8 ± 1.6, floral 13.9 ± 0. confirmation on day 9), 2/10 was a wild type. G1842.7(118のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード)の場合には、T1植物体の8/10が早咲きであり(正確な葉数は未計測)、2/10が野生型であった。 If the G1842.7 (118 encode splice variant consisting of amino acids) is 8/10 the early flowering of T1 plants (exact leaf number is unmeasured), 2/10 was wild type . このように、G1842スプライス変異体では、過剰発現した場合には、完全長cDNAクローンに匹敵する効果が得られた。 Thus, in the G1842 splice variant, when overexpression effect comparable to full-length cDNA clones were obtained. G1843の場合には、7/11が早咲きであり(平均合計葉数は6.4±0.5、花芽は16.0±1.6日目に確認)、2/11が野生型の開花期を示した。 If the G1843 is 7/11 is early flowering (average total number of leaves 6.4 ± 0.5, check flower buds on day 16.0 ± 1. 6, 2009), flowering 2/11 wild-type It showed the period. しかしながら、G1843のT1植物体は生育が悪く、一部の器官の発達が遅れていた。 However, T1 plants of the G1843 has poor growth, the development of some of the organs had been delayed. このことから、G1843は、過剰発現した場合には不測の毒性作用を示すことが示唆される。 Therefore, G1843, when overexpressed is suggested to exhibit unexpected toxic effects. G1844の場合には、T1植物体の6/10が早咲きであり(平均合計葉数は6.8±1.7、花芽は14.7±1.3日目に確認)、4/10が野生型であった。 If the G1844 is 6/10 the early flowering of T1 plants (confirmation average total number of leaves 6.8 ± 1.7, flower buds to 14.7 ± 1. 3 day), 4/10 It was wild type. 同様に、G1844の短鎖スプライス変異体をコードするcDNAを用いて過剰発現研究を行った。 Similarly, it was over-expression studies using cDNA encoding short splice variant of G1844. G1844.2(184のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード)を過剰発現させた場合には、T1植物体の6/19が早咲きであり(平均合計葉数は7.8±1.7、花芽は15.7±1.3日目に確認)、13/19が野生型であった。 G1844.2 when (184 splice variant code consisting of amino acids) to the over-expression are 6/19 of T1 plants is early flowering (average total number of leaves 7.8 ± 1.7, bud confirmation to 15.7 ± 1. 3 days), 13/19 was a wild type. G859、G1842、G1843およびG1844の過剰発現データは、これらが開花期を制御する役割を担っているとの仮説を裏付けるものである。 G859, G1842, G1843 and overexpression data G1844 is to support the hypothesis that they are responsible for controlling flowering time.
【0098】 [0098]
RT−PCRはG157特異的プライマーを用いて約25サイクルにてG157植物からの材料上において実施した。 RT-PCR was performed on the material from G157 plants at about 25 cycles using the G157-specific primers. 高いレベルのG157発現が、遅く開花する個々の植物または遅く開花する個々を含んだ保存された苗からのサンプル中に検出された。 G157 expression high levels were detected in the samples from the stored including individual flowering individual plant or late flowering late seedlings. 野生型に比較して中度または低いレベルの過剰発現しか示さなかった植物はわずかに開花が早いかまたは正常であた。 Compared to wild-type moderate or low levels of over-expression showed only plants slightly flowering per a fast or normal.
【0099】 [0099]
G157における増加がArabidopsisの遅い開花生態型における開花時期に影響するか否かを試験するため、我々は、遅い開花生態型のStockholmおよびPiztalにおいてG157を過剰発現させた。 Since the increase in G157 to test whether affecting flowering time in late flowering ecotypes of Arabidopsis, we have overexpressed G157 in Stockholm and Piztal late flowering ecotypes. この実験において、各生態型からの32の第一期形質転換体を連続光条件下で対照を散りばめて生育させた。 In this experiment, it was grown studded controls 32 of the first stage transformants in continuous light conditions from each ecotype. 両生態型において、約50%の形質転換体が対処よりも早く開花し、そして少数のPiztalおよびStockholm形質転換体が対照に比較して明らかに遅い開花であった。 In both ecotype, about 50% of the transformants flowered earlier than cope, and few Piztal and Stockholm transformants was clearly slower flowering compared to control.
【0100】 [0100]
G157トランス遺伝子発現と開花時期の相関もG157 StockholmおよびPiztal T1植物において観察された。 G157 transgene expression and flowering time correlation was also observed in the G157 Stockholm and Piztal T1 plants. RT−PCRを、各バックグラウンドにおいて2つの早い開花系列及び2つの遅い開花系列を用いて実施した。 The RT-PCR, was carried out using two earlier flowering sequence and two late flowering sequence in each background. 再び、遅い開花系列は高いレベルのG157発現を含んだ。 Again, late flowering series included a high level of G157 expression. 即ち、上記因子は定量性様式において開花時期に影響するらしい;中レベルの過剰発現が早い開花を誘因し、開花の遅延が大きく増加する。 That is, the agent will likely affect flowering in a quantitative fashion; to trigger the overexpression earlier flowering medium level, the delay of flowering is greatly increased.
【0101】 [0101]
結論として、G157の過剰発現または同族の遺伝子の何れかが植物において開花時期を修飾する:中レベルの過剰発現が早い開花を誘引し、多くが開花を遅延させる。 In conclusion, either overexpression or cognate gene G157 modifies the flowering in plants: Overexpression of middle level to attract earlier flowering, many delays flowering.
【0102】 [0102]
上記実施例に記載されたのと類似または同一の方法論を用いて、その変化した発現が開花の遅延または加速に相関した別のArabidopsis遺伝子を同定した。 Using in which they were similar or the same methodology described in the above embodiments, the altered expression were identified different Arabidopsis genes correlated with the delay or acceleration of flowering. これらの遺伝子を表2にそれらの特定の配列番号およびそれらの開花時期への影響と共に図表作成した。 These genes were created charts with effects on a particular SEQ ID number and their flowering time their in Table 2.
【0103】 [0103]
【表2】 [Table 2]
【0104】 [0104]
春化処理の応答も調査した。 Response of vernalization was also investigated. 遅い開花の春化処理応答性の生態型および変異体は高い定常レベルのFLC転写物を有し、春化処理による開花の促進の間は低下する(Michaels and Amasino,(1999)Plant Cell 11:949−956;Sheldon et al.,(1999)Plant Cell 11:445−458;Sheldon et al.,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:3735−3758)。 Slow vernalization response ecotypes and mutants of flowering have FLC transcript higher steady-state level, during the promotion of flowering by vernalization decreases (Michaels and Amasino, (1999) Plant Cell 11: . 949-956; Sheldon et al, (1999) Plant Cell 11:. 445-458; Sheldon et al, (2000) Proc.Natl.Acad.Sci.97: 3735-3758). FLCとは対照的に、G157転写物レベルは遅い開花のStockholmおよびPiztal生態型における春化処理の応答と一致した相関は示さない。 In contrast to the FLC, G157 transcript levels show no correlation consistent with the response of vernalization in Stockholm and Piztal ecotype late flowering. さらに、我々は、G157の過剰発現がFLCレベルに影響しなかったことを見いだした。 Furthermore, we have found that overexpression of G157 did not affect the FLC level. G861,G(59,G1843,およびG1844の発現に対する春化処理の効果も試験した。Columbia、Piztal,Stockholm、constans−1、およびfca−9の発芽種子をMS寒天プレート上で4℃コールドルームにおいて8週間春化処理し、そして次に連続光生育ルームに移した。春化処理した種子および新たに撒いた非春化処理の対照からの全組織を移し換えから9日後に採集した。RT−PCRをFLC,G157,G859,G1842,G1843,G1844およびG861及びアクチンに関して実施した。FLCとG157を比較すると、どの遺伝子も5つの別々のサンプルセットにおける春化処理に際して明確な一致した低下を示さなかった。しかしながら、G1844はFLCに対 G861, G (59, G1843, and G1844 .Columbia was also tested the effect of vernalization on the expression of, Piztal, Stockholm, constans-1, and fca-9 of the germinated seed at 4 ° C. cold room on MS agar plates and 8 weeks vernalization treatment, and then was collected and transferred to a continuous light growth room. from was transferred the entire organization from the control of vernalization seeds and new non-vernalization was seeded after 9 days .RT- When PCR the FLC, G157, G859, G1842, G1843, comparing G1844 and G861 and .FLC and G157 was conducted with respect to actin, showed a decrease in the clear match during which genes also vernalization in five separate sample sets It was. However, G1844 is against the FLC て発現の逆パターンを示した:G1844レベルは春化処理と一致して増加した。これは、春化処理の応答の対照においてG1844を直接に連座させるように、特別顕著である。即ち、G1844は開花を活性化し、そしてFLCと反対の役割を有する可能性がある。 Showed an inverse pattern of expression Te:.. G1844 levels increased consistent with vernalized This way is implicated directly the G1844 in control response vernalization, a special remarkable words, G1844 It activates flowering, and may have a role opposite the FLC.
【0105】 [0105]
G157の過剰発現が春化処理に匹敵する効果を有するか否かを探索するため、野生型PiztalおよびStockholm苗のバッチを6週間4℃において冷却処理し、次にG157 T1 Piztal、G157 T1 Stockholmおよび非春化処理の野生型植物の第2選択に対して生育させた。 Since overexpression of G157 to explore whether an effect comparable to vernalization, a batch of wild-type Piztal and Stockholm seedlings cooling process at 6 weeks 4 ° C., then G157 T1 Piztal, G157 T1 Stockholm and It was grown to the second selection of wild-type plant of the non-vernalization. 予測されたとおり、春化処理はPiztalおよびStockholm野生型植物の両方において開花時期を顕著且つ一律に縮めた。 As expected, vernalization treatment was shortened significantly and uniformly flowering in both Piztal and Stockholm wild type plants. G157 Stockholm系列の間では、もっとも早い開花のT1グループ(8/23系列)は春化処理された植物と識別不可能であった。 In between the G157 Stockholm series, was the earliest T1 group (8/23 series) of flowering is indistinguishable from plants that have been vernalization. Piztalに関しては、しかしながら、早い開花のT1植物は春化処理した植物よりも平均して下限に近いほど遅かった。 Regarding Piztal, however, T1 plants early flowering was slow closer to the lower limit on the average than plants vernalization. よって、G157の過剰発現は遅い開花の生態型における春化処理の要求を実質上減少させる。 Therefore, overexpression of G157 are substantially reduces the demand for vernalization in ecotype late flowering.
【0106】 [0106]
さらに、我々は、遅い開花のG157系列がFLC発現とは独立しており、そして春化処理に応答しないことを観察した。 In addition, it, G157 series of slow flowering is independent of the FLC expression and observed to not respond to vernalization. しかしながら、遅い開花のG157植物は光周期に応答性である。 However, G157 plants slow flowering is responsive to photoperiod. 8時間の光の短日条件下で実施した実験においては、我々は、野生型対照より1カ月遅くに及んで開花した、多数のG157 Columbia T1植物を得た(データは示さず)。 In the experiments performed under short-day conditions of light 8 hours, we were flowering extends late one month than wild type controls, to obtain a large number of G157 Columbia T1 plants (data not shown). G157発現により引き起こされた遅い開花の効果がFLC転写とは独立であったのか否かを確認するため、我々は、遅い開花のG157 Columbia植物が春化処理に応答性であったか否かを試験した。 The effect of late flowering caused by G157 expression is confirmed whether was independent of FLC transcription, we, G157 Columbia plants late flowering was tested whether a response to vernalization . 開花時期における顕著な変化は記録されなかった:連続光条件下で系列4の春化処理したT2植物は、全体で、春化処理した場合の30.1+/−1.3に比べて31.3+/−1.8を有した。 Significant changes in flowering time were recorded: vernalization treated T2 plants series 4 consecutive light conditions, the whole, as compared to 30.1 +/- 1.3 in the case of vernalization 31. It had a 3 +/- 1.8. 対照のfca植物は、上記の処理が有効であったことを立証した:春化処理した植物は非春化処理の対照の40より多い葉に比較して、たった10.3+/−0.9の葉の後に開花した。 Control fca plants have demonstrated that the above process was effective: vernalized plants compared to leafy than 40 controls the non-vernalization, only 10.3 +/- 0.9 It flowered after the leaves. 即ち、G157により引き起こされた遅い開花の表現型は、FLC発現における変化とは独立して遅延が起こったか否かが予測されたように、春化処理により克服することができなかった。 That slow flowering phenotype caused by G157, as whether occurred independently of the delay of changes in the FLC expression was expected, could not be overcome by vernalization.
【0107】 [0107]
実施例IX. Example IX. 相同配列の同定Arabidopsis以外の植物種の相同体をデータベースサーチツール、例えばBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−410;およびAltschul et al.(1997)Nucl.Acid Res.25:3389−3402)を用いて同定した。 Homologous sequences plant species homologues a database search tool other than the identified Arabidopsis, such as, for example, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al (1990) J.Mol.Biol.215:. 403-410; and Altschul et al . (1997) Nucl.Acid Res.25: 3389-3402) were identified using. tblastx配列分析プログラムはBLOSUM−62スコアリングマトリックスを用いて実施した(Henikoff,S.and Henikoff,J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915−10919)。 tblastx sequence analysis programs were performed using BLOSUM-62 scoring matrix (Henikoff, S.and Henikoff, J.G (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:. 10915-10919).
【0108】 [0108]
全部のNCBIジェンバンクデータベースをArabidopsis thaliana以外の全ての植物からの配列に関してフィルターを通したが、NCBI分類ID33090(Viridiplantae;全ての植物)を付随したNCBIジェンバンクデータベース中の全てを選択し、そして3701(Arabidopsis thaliana)に付随した全体を排除することによった。 While all of the NCBI GenBank database through a filter with respect to the sequence from all plants except Arabidopsis thaliana, NCBI classification ID33090; select all the NCBI Genbank in the bank database that concomitantly (Viridiplantae all plants), and 3701 It was by eliminating the entire accompanying the (Arabidopsis thaliana). これらの配列をワシントン大学TBLASTX計算式(バージョン2.0a19MP)を用いてSEQ IDs 1−56の遺伝子を表す配列と2000年9月26日に比較した。 These sequences using the University of Washington TBLASTX equation (version 2.0a19MP) were compared to the sequence and September 26, 2000 representing the gene of SEQ IDs 1-56. SEQ IDs 1−56の各遺伝子に関して個々の比較を確率スコア(P−値)により整列させたが、但し上記スコアは特定の整列が偶然に起こった確率を反映する。 While the individual comparisons were aligned by probability score (P- value) for each gene of SEQ and IDs 1-56, where the score reflect the probability that a particular alignment occurred by chance. 例えば、3.6e−40のスコアは3.6 x 10 −40である。 For example, the score of 3.6e-40 is 3.6 x 10 -40. 10種までに関しては、もっとも低いP値を有する遺伝子(および、従って、最もありそうな相同体)を図2に掲載する。 With respect to up to 10 species, genes with the lowest P value (and, therefore, the most likely homolog) Share in FIG.
【0109】 [0109]
P値に加え、パーセンテージ同一性による比較もスコアした。 In addition to the P value, the comparison by the percentage identity were also scored. パーセンテージ同一性は、2つのDNAまたは蛋白質のセグメントが特定の長さにわたり同一である程度を反映する。 The percentage identity is the two DNA or protein segment reflects a degree in identical over a particular length. 図2に示す非Arabidopsis遺伝子と配列表の中のArabidopsis遺伝子の間のパーセント同一性の範囲は、SEQ ID No. Percent identity ranging between Arabidopsis genes in the non-Arabidopsis genes sequence listing shown in FIG. 2, SEQ ID No. 1:54%−67%;SEQ ID Nos. 1: 54% -67%; SEQ ID Nos. 3,5,7:37%−47%;SEQ ID Nos. 3,5,7: 37% -47%; SEQ ID Nos. 9,11,13,15:54%−62%;SEQ ID No. 9,11,13,15: 54% -62%; SEQ ID No. 17:62%−71%;SEQ ID Nos. 17: 62% -71%; SEQ ID Nos. 19,21:50%−67%;SEQ ID Nos. 19,21: 50% -67%; SEQ ID Nos. 23,25:75%−91%;SEQ ID No. 23,25: 75% -91%; SEQ ID No. 27:46%−69%;SEQ ID No. 27: 46% -69%; SEQ ID No. 29:44%−90%;SEQ ID No. 29: 44% -90%; SEQ ID No. 31:57%−89%;SEQ ID No. 31: 57% -89%; SEQ ID No. 33:37%−79%;SEQ ID No. 33: 37% -79%; SEQ ID No. 35:50%−71%;SEQ ID No. 35: 50% -71%; SEQ ID No. 37:39%−63%;SEQ ID No. 37: 39% -63%; SEQ ID No. 39:58%−70%;SEQ ID No. 39: 58% -70%; SEQ ID No. 41:45%−73%;SEQ ID No. 41: 45% -73%; SEQ ID No. 43:42%−84%;SEQ ID No. 43: 42% -84%; SEQ ID No. 45:47%−81%;SEQ ID No. 45: 47% -81%; SEQ ID No. 47:31%−71%;SEQ ID No. 47: 31% -71%; SEQ ID No. 49:40%−67%;SEQ ID No. 49: 40% -67%; SEQ ID No. 51:69%−51%;SEQ ID No. 51: 69% -51%; SEQ ID No. 53:43%−86%;そしてSEQ ID No. 53: 43% -86%; and SEQ ID No. 55:79%−89%。 55: 79% -89%.
【0110】 [0110]
表2の中の遺伝子のArabidopsisの相同体もBLASTを使用して同定した。 Homologs of Arabidopsis genes in Table 2 were also identified using BLAST. これらの遺伝子は、以下のArabidopsis BAC配列において見いだされ。 These genes are found in Arabidopsis BAC sequences below. それらのジェンバンク配列NID番号:2827698(234相同体)、3241917(G748相同体)、2618604(G994相同体)、6598548(G1335相同体)、7340331(G736相同体)、6523051(G1435相同体)、6598491(G208相同体)および3172156(G208相同体)により確認される。 These GenBank SEQ NID NO: 2827698 (234 homolog), 3,241,917 (G748 homolog), 2,618,604 (G994 homolog), 6598548 (G1335 homolog), 7,340,331 (G736 homolog), 6,523,051 (G1435 homolog), It is confirmed by 6598491 (G208 homolog) and 3,172,156 (G208 homolog).
【0111】 [0111]
全ての文献(刊行物および特許)はアユるもくてきの為にそれらの全体を引用により本明細書に取り込む。 All references (publications and patents) are incorporated herein by reference in their entirety for Ayuru purposes.
発明は上記態様および実施例を参照して記載されてきたが、発明の精神を逸脱することなく様々な修飾がなされ得ることは理解されるべきである。 The invention has been described with reference to the above embodiments and examples, the various modifications may be made without departing from the spirit of the invention should be understood. 従って、発明は以下の請求の範囲のみにより限定される。 Accordingly, the invention is limited only by the following claims.
【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】図1は、本発明の典型的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の表を提供する。 [1] Figure 1 provides a table of exemplary polynucleotide and polypeptide sequences of the present invention. この表には、左から右に、それぞれの配列について、SEQ ID No、内部コード参照番号、配列がポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のいずれであるか、そしてポリペプチド配列についてのいずれかの保存ドメインの同定、が含まれる。 The table from left to right, for each of the sequences, SEQ ID No, internal code reference number, sequence whether it is a polynucleotide or polypeptide sequences, and any conserved domains for the polypeptide sequences identification, are included.
【図2】図2は、配列表中に提供する配列と相同な配列の表を提供する。 Figure 2 provides a table of sequences homologous sequences provided in the sequence listing. この表には、左から右に、SEQ ID No、内部コード参照番号、独自のGenbank配列番号(NID)、比較が偶然に生成される蓋然性(P−値)、そして相同遺伝子が同定された種、が含まれる。 The table from left to right, SEQ ID No, internal code reference number, unique Genbank SEQ ID NO: (NID), the probability (P- value) generated for comparison accidentally, and phase species the gene is identified , it is included.

Claims (16)

  1. SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなるがSEQ ID No: 28を除く群から選択される配列の、少なくとも6の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物であって、 SEQ ID No: 2N (Here, N is 1-28) is SEQ ID No consists: 28 sequence selected from the group except for the nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising consecutive amino acids of at least 6 the including, a transgenic plant comprising a recombinant polynucleotide,
    (i) 組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物と比較して修飾された開花時期を有するか、または(ii) 組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物と比較して修飾された春化処理要求性を有する、前記トランスジェニック植物。 (I) either have a flowering that is modified as compared to another plant that does not contain the recombinant polynucleotide, or (ii) vernalized which is modified as compared to another plant that does not contain the recombinant polynucleotide with the required properties, the transgenic plants.
  2. ヌクレオチド配列が、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)の保存ドメインからなる群から選択される保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項1に記載のトランスジェニック植物。 Nucleotide sequence, SEQ ID No: 2N (where, N is the 1-28) encodes a polypeptide comprising a conserved domain selected from the group consisting of storage domains, the transgenic plant of claim 1 .
  3. 組換えポリヌクレオチドが前記ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項1に記載のトランスジェニック植物。 Further comprising a promoter recombinant polynucleotide is linked to function to the nucleotide sequence, transgenic plant of claim 1.
  4. 前記プロモーターが構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型である、請求項3に記載のトランスジェニック植物。 It said promoter is either a constitutive, or inducible, or tissue-activated, transgenic plant of claim 3.
  5. 前記組換えポリヌクレオチドが、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項1に記載のトランスジェニック植物。 Wherein said recombinant polynucleotide, SEQ ID No: poly 2N (where, N represents a is 1 to 28) containing to a sequence selected from the group consisting of a conserved domain with high sequence identity than 84% encoding a peptide, transgenic plant of claim 1.
  6. 植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、 A method for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant,
    (a) SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなるがSEQ ID No: 28を除く群から選択される配列の、少なくとも6の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし; (A) SEQ ID No: coding of a sequence selected from the group except for 28, a polypeptide comprising consecutive amino acids of at least 6: 2N (where, N represents a 1-28) consists of SEQ ID No the recombinant polynucleotide comprising a nucleotide sequence, transformed plants;
    (b) 前記トランスフォームされた植物を選択し;そして(c) 開花時期が変更されたトランスフォームされた植物を同定する; Identifying and (c) flowering time has been changed transformed plants; (b) the select transformed plant;
    ことを含む、前記方法。 Comprising the method.
  7. ヌクレオチド配列が、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)の保存ドメインからなる群から選択される保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項6に記載の方法。 Nucleotide sequence, SEQ ID No: 2N (where, N represents a 1-28) encodes a polypeptide comprising a conserved domain selected from the group consisting of storage domains, the method according to claim 6.
  8. 組換えポリヌクレオチドが前記ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項6に記載の方法。 Further comprising a promoter recombinant polynucleotide is linked to function to the nucleotide sequence A method according to claim 6.
  9. 前記プロモーターが構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型である、請求項8に記載の方法。 It said promoter is either a constitutive, or inducible, or tissue active, The method of claim 8.
  10. 前記組換えポリヌクレオチドが、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項6に記載の方法。 Wherein said recombinant polynucleotide, SEQ ID No: poly 2N (where, N represents a is 1 to 28) containing to a sequence selected from the group consisting of a conserved domain with high sequence identity than 84% encoding the peptide the method of claim 6.
  11. 植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、 A method for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant,
    (a) SEQ ID No: 2N−1(ここで、Nは1〜28である)からなるがSEQ ID No: 27を除く群から選択される配列の、少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし;そして(b) 前記トランスフォームされた植物を選択する; (A) SEQ ID No: 2N-1 (Here, N is 1-28) is SEQ ID No consists: 27 sequence selected from the group except for the nucleotide sequence comprising at least 18 contiguous nucleotides the recombinant polynucleotide comprising, a plant transformed; selecting and (b) said transformed plant;
    ことを含む、前記方法。 Comprising the method.
  12. 前記組換えポリヌクレオチドが、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項11に記載の方法。 Wherein said recombinant polynucleotide, SEQ ID No: poly 2N (where, N represents a is 1 to 28) containing to a sequence selected from the group consisting of a conserved domain with high sequence identity than 84% encoding the peptide the method of claim 11.
  13. 植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、 A method for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant,
    (a) データベース配列を準備し; (A) Prepare the database sequences;
    (b) 前記データベース配列を、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)から選択されるポリペプチドと比較し; (B) the database sequence, SEQ ID No: 2N (where, N represents a 1-28) compared to the polypeptide selected from;
    (c) 選択した配列分類に合致するデータベース配列を選択し;そして(b) 前記選択されたデータベース配列を植物中にトランスフォームする; (C) selecting a database sequence matches the selected sequences classified; and (b) the selected database sequences transformed into the plant;
    ことを含む、前記方法。 Comprising the method.
  14. 前記組換えポリヌクレオチドが、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項13に記載の方法。 Wherein said recombinant polynucleotide, SEQ ID No: poly 2N (where, N represents a is 1 to 28) containing to a sequence selected from the group consisting of a conserved domain with high sequence identity than 84% encoding the peptide the method of claim 13.
  15. 植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、 A method for modifying the flowering time or vernalization requirement of the plant,
    (a) データベース配列を準備し; (A) Prepare the database sequences;
    (b) 前記データベース配列を、SEQ ID No: 2N−1(ここで、Nは1〜28である)から選択されるポリヌクレオチドと比較し; (B) the database sequence, SEQ ID No: 2N-1 (Here, N is 1-28) compared to the polynucleotide selected from;
    (c) 選択した配列分類に合致するデータベース配列を選択し;そして(b) 前記選択されたデータベース配列を植物中にトランスフォームする; (C) selecting a database sequence matches the selected sequences classified; and (b) the selected database sequences transformed into the plant;
    ことを含む、前記方法。 Comprising the method.
  16. 前記組換えポリヌクレオチドが、SEQ ID No: 2N(ここで、Nは1〜28である)からなる群から選択される配列に対して、84%より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項15に記載の方法。 Wherein said recombinant polynucleotide, SEQ ID No: poly 2N (where, N represents a is 1 to 28) containing to a sequence selected from the group consisting of a conserved domain with high sequence identity than 84% encoding the peptide the method of claim 15.
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