JP2010051297A - 植物における糖鎖構造の改変方法及びその植物体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の転写、翻訳を、posttranscriptional gene silencing(PTGS)、ウイルス誘導ジーンサイレンシング(VIGS)、又はtranscriptional gene silencing(TGS)により阻害し、植物細胞内におけるGDP−フコース量を減少させることにより、糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、オリゴ糖、多糖等を含む糖鎖へのフコース修飾を減少・抑制させる。
【効果】アレルゲンとなり得るフコース修飾が除去された糖蛋白質等の生産が可能となり、植物で生産させた医療用糖蛋白質の臨床応用が可能となる。
【選択図】図1
Description
(1)糖ヌクレオチドの一種であるGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、GDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物体もしくは植物細胞に感染させることにより、GDP−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のN−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のDNA配列、当該DNA配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するDNA配列、あるいは、当該遺伝子と50%以上の相同性を持つDNA配列を用いることを特徴とする糖鎖構造の改変方法。
(2)上記植物型のN−結合型糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制が、植物の糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、又は、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制である、前記(1)に記載の方法。
(3)糖ヌクレオチドの一種であるGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を、該遺伝子の転写、翻訳を、transcriptional gene silencing(TGS)、post−transcriptional gene silencing(PTGS)、又はウイルス誘導ジーンサイレンシング(Virus−induced gene silencing;VIGS)により阻害することにより、GDP−フコースの細胞内での合成を阻害し、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する、前記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)上記GDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、GDP−D−mannose−4,6−dehydratase(GMD)遺伝子、又は、GDP−keto−6−deoxymannose 3,5−epimerase/4−reductase(GER)遺伝子である、前記(1)から(3)のいずれかに記載の方法。
(5)上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクターを用いる、前記(1)から(4)のいずれかに記載の方法。
(6)上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物形質転換用ベクターを用いる、前記(1)から(4)のいずれかに記載の方法。
(7)前記(1)から(6)のいずれかに記載の方法で得られた、GDP−フコース合成酵素遺伝子発現が抑制され、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
(8)上記植物形質転換体、植物細胞、又は植物体が、植物細胞、植物体、又はその子孫である、前記(7)に記載の植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
(9)前記(8)に記載の植物細胞、植物体、又はその子孫より得られた糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、又は糖鎖。
(10)前記(7)又は(8)に記載の植物形質転換体を宿主として、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された糖蛋白質を合成することを特徴とする糖蛋白質の合成方法。
本発明は、糖ヌクレオチドの一種であるGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、GDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物もしくは植物細胞に感染させることにより、GDP−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のN−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のDNA配列、当該DNA配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するDNA配列、あるいは、当該遺伝子と50%以上の相同性を持つDNA配列を用いることを特徴とするものである。
(1)植物における糖蛋白質N−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制して植物型糖鎖構造の改変方法を提供することができる。
(2)糖蛋白質N−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制させた植物形質転換体を調製し、提供することができる。
(3)上記植物形質転換体を宿主として利することにより糖蛋白質の糖鎖構造を改変した糖蛋白質を合成することが可能となる。
(4)本発明の植物形質転換体を利用することで、生体内に投与した際にアレルゲンになる可能性がある植物特有のフコース修飾を減少、抑制した糖蛋白質を生産することが可能となる。
(5)遺伝子組換え植物で、アレルゲン性を低下させた医療用糖蛋白質を生産し、提供することが可能となる。
タバコの一種であるNicotiana benthamiana葉試料を、液体窒素中で磨砕し、RNeasy Plant Mini Kit(Quiagen社)により、total RNA試料を精製した。本RNA試料及びオリゴdTプライマーを用い、Ready−To−Go RT−PCR Beads(GEヘルスケア)により、1本鎖cDNAを合成した。
単離したGMD遺伝子を鋳型として、制限酵素MluIサイトを有するプライマーCM−NbMD−F(配列番号3:5’−TAGTTAACGCGTAGTTCTTGGAGATGGCATTCAG)及びCM−NbMD−R(配列番号4:5’−TAGTTAACGCGTTAACTCAATATCCTCGTCCACC)を用い、KOD−plus−Ver.2(TOYOBO)によるPCRにより、約200bpの遺伝子断片を得た。PCRは、94℃で3分処理後、98℃(30秒)→56℃(15秒)→68℃(1分)のサイクルを35回繰り返した。
本実施例で用いたCMVベクターは、3種のプラスミドpCY1、pCY2(N)、pCY3より構成され、このうち、pCY2(N)は、遺伝子断片を挿入するためのマルチクローニングサイトを有する(図2及び特開2005−013164号公報)。
植物において、VIGSを誘導するには、ウイルスを植物体に感染させる必要がある。キュウリモザイクウイルスは、RNAウイルスであるため、RNAを植物体に接種することとなる。
N.benthamianaへのRNAの接種(CMVベクターの感染)は、以下のように行った。pCY1、pCY3に由来するRNAの混合溶液に対し、GMD−pCY2(N)SもしくはGMD−pCY2(N)Aに由来するRNA溶液を混合し、接種用のRNA溶液を調製した。同様に、ネガティブコントロールとして、pCY1、pCY2(N)、pCY3に由来するRNA溶液を混合し、接種用のRNA溶液を調製した。
植物由来N−結合型糖鎖の調製は、以下のように行った。葉試料50mgを、乳鉢・乳棒を用い磨砕し、磨砕物を2mlの100mM Tris−HClバッファー(pH7.5)へ懸濁した。懸濁液を3,000rpmで10分間遠心後、上澄をミニザルトシリンジフィルター(0.2μm、Sartorius)で濾過した。
1μlの糖鎖試料溶液と、0.5μlの2,5−Dihydroxybenzooic Acid(DHB)水溶液(5mg/ml)を、MTP AnchorChipTM 600/384 T Fプレート(ブルカーダルトニクス)上のターゲットにおいて混合し、風乾した。測定は、Autoflex II TOF/TOF(ブルカーダルトニクス、reflectronモード、positive ion モード)で行い、観測された各糖鎖のピーク面積の割合(%)を以下の式で算出した。
ウイルスベクター未接種及び接種植物体由来糖鎖試料において、各糖鎖の割合を比較し、植物型糖鎖修飾抑制効果を評価した。
GMD遺伝子抑制用CMVベクターを接種した植物体において、N−結合型糖鎖へのα−1,3−フコースの修飾が、約70%から20%へと低下することが観察された(図3及び表1)。
ウイルス未接種株、CMVベクター接種株(抑制用遺伝子の挿入は無し)、GMD遺伝子抑制用CMVベクター接種株より、ウイルス接種後3週目に、葉試料を採取し、それぞれの葉試料を、液体窒素中で磨砕し、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)によりtotal RNAを精製した。
total RNA試料を5μg及びオリゴdTプライマーを用い、Ready−To−Go RT−PCR Beads(GEヘルスケア)により、1本鎖cDNAを合成した。本cDNA溶液1μlを試料として、GoTaq Green Master Mix(Promega)及びT−personal Thermal Cycler(Biometra)を用いたPCRを行った。PCRは、94℃で3分処理後、94℃(30秒)→56℃(30秒)→72℃(1分30秒)のサイクルを35回繰り返した。
(1)GMD遺伝子抑制用遺伝子断片の調製
単離したGMD遺伝子を鋳型として、制限酵素サイトを有するプライマーペアとして、Nb−iMD−F(Xba)(配列番号7:TAGTTATCTAGACAATCATGAATCTCCTAGGCGG)及びNb−iMD−R(Bam)(配列番号8:TAGTTAGGATCCTAACTCAATATCCTCGTCCACCATC)、Nb−iMD−F(Sac)(配列番号9:TAGTTAGAGCTCCAATCATGAATCTCCTAGGCGG)及びNb−iMD−R(Sma)(配列番号10:TAGTTACCCGGGTAACTCAATATCCTCGTCCACCATC)を用い、KOD−plus−Ver.2(TOYOBO)を用いたPCRにより、約400bpの遺伝子断片NbiMD(Xba−Bam)及びNbiMD(Sma−Sac)を得た。PCRは、94℃で3分処理後、98℃(30秒)→56℃(15秒)→68℃(1分30秒)のサイクルを35回繰り返した。
Arabidopsis thaliana葉試料より、DNeasy Plant Mini Kit(Quiagen社)により、DNA試料を精製した。本DNA試料より、既知のβ−1,2−キシロース転移酵素遺伝子配列(Accession number NM124932)を元に設計したプライマーAtX(F)(配列番号11:5’−ATGAGTAAACGGAATCCGAAGATTCTG)及びAtX(R)(配列番号12:5’−TTAGCAGCCAAGGCTCTTCATG)を用いたPCRにより、β−1,2−キシロース転移酵素遺伝子を単離した。PCRには、KOD−plus−Ver.2(TOYOBO)を用い、94℃で3分処理後、98℃(30秒)→56℃(15秒)→68℃(2分)のサイクルを35回繰り返した。
植物形質転換用ベクターであるpBE2113を、制限酵素SmaIとSacIで処理後精製し、更に、E.coli Alkaline Phosphatase(TOYOBO)により、DNA末端を脱リン酸化した。
pBE2113ΔGUSに対し、DNA Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ)により、GMD遺伝子断片NbiMD(S−S)を挿入した。ライゲーション反応液は、そのままEscherichia coli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ)の形質転換に用いた。GMD遺伝子抑制用遺伝子断片が挿入されたベクターGMD−pBE2113は、菌体より、Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Promega)により、精製後、挿入遺伝子断片のシーケンスを確認した。
タバコ(N.benthamiana)の形質転換は、Agrobacterium tumefaciens LBA4404株を用い、リーフディスク法により行った。殺菌処理を行ったタバコの葉から、直径約1cmのリーフディスクを、コルクポーラーにより切り抜き、GMDinv−pBE2113を有するAgrobacterium tumefacience LBA4404株の菌液に浸して、2日間MS寒天培地上で共存培養(23℃、16時間照明)して、タバコ葉にAgrobacteriumを感染させた。
得られた形質転換植物体より、N−結合型糖鎖を精製し、MALDI−TOF−MSによる糖鎖構造解析を行い、フコース修飾抑制の程度を評価した。その結果、MDi−11株において、N−結合型糖鎖へのα−1,3−フコースの修飾が70%から5%へと低下することが観察された(図7及び表2)。
total RNA試料を3μg及びオリゴdTプライマーを用い、Ready−To−Go RT−PCR Beads(GEヘルスケア)により、1本鎖cDNAを合成した。本cDNA溶液1μlを試料として、GoTaq Green Master Mix(Promega)及びT−personal Thermal Cycler(Biometra)を用いたPCRを行った。PCRは、94℃で3分処理後、94℃(30秒)→56℃(30秒)→72℃(1分30秒)のサイクルを35回繰り返した。
Claims (10)
- 糖ヌクレオチドの一種であるGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物形質転換用ベクターを、植物体もしくは植物細胞に導入して該植物の形質転換を行うこと、あるいは、GDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を抑制する遺伝子断片を挿入した植物ウイルスベクターを、植物体もしくは植物細胞に感染させることにより、GDP−フコース合成酵素遺伝子の発現を抑制して、植物における植物型のN−結合型糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する糖鎖構造の改変方法であって、上記遺伝子断片として、上記酵素をコードする遺伝子のDNA配列、当該DNA配列の変異体、アレル、バリアント、又はホモログに相当するDNA配列、あるいは、当該遺伝子と50%以上の相同性を持つDNA配列を用いることを特徴とする糖鎖構造の改変方法。
- 上記植物型のN−結合型糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制が、植物の糖蛋白質糖鎖、糖脂質糖鎖、又は、オリゴ糖もしくは多糖を含む糖鎖へのフコース修飾の減少、抑制である、請求項1に記載の方法。
- 糖ヌクレオチドの一種であるGDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子発現を、該遺伝子の転写、翻訳を、transcriptional gene silencing(TGS)、post−transcriptional gene silencing(PTGS)、又はウイルス誘導ジーンサイレンシング(Virus−induced gene silencing;VIGS)により阻害することにより、GDP−フコースの細胞内での合成を阻害し、糖鎖へのフコース修飾を減少、抑制する、請求項1又は2に記載の方法。
- 上記GDP−フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、GDP−D−mannose−4,6−dehydratase(GMD)遺伝子、又は、GDP−keto−6−deoxymannose 3,5−epimerase/4−reductase(GER)遺伝子である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物ウイルスベクターを用いる、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 上記遺伝子の抑制を誘導するためのベクターとして、植物形質転換用ベクターを用いる、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から6のいずれかに記載の方法で得られた、GDP−フコース合成酵素遺伝子発現が抑制され、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
- 上記植物形質転換体、植物細胞、又は植物体が、植物細胞、植物体、又はその子孫である、請求項7に記載の植物形質転換体、植物細胞、又は植物体。
- 請求項8に記載の植物細胞、植物体、又はその子孫より得られた糖蛋白質、糖ペプチド、糖脂質、又は糖鎖。
- 請求項7又は8に記載の植物形質転換体を宿主として、糖鎖へのフコース修飾が減少、抑制された糖蛋白質を合成することを特徴とする糖蛋白質の合成方法。
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