JP2010046073A - 動的遺伝子発現プロファイリング方法及びシステム - Google Patents
動的遺伝子発現プロファイリング方法及びシステム Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】cDNAの合成のため、及び合成したcDNAのその後の増幅のために、試料特異的配列タグを含む試料特異的プライマーを用いること、cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、異なって発現された遺伝子の確認のために、試料間において、遺伝子の存在量の水準を比較することからなる。
【選択図】図4
Description
(a)試料特異的配列タグを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第1の試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグはその5’末端においてGCに富みその3’末端においてAtに富むこと、
(b)少なくともcDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は2つの試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第1の試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、第1オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくともcDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は2つの試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグが、従来のヌクレオチドを超える、もう一つの人工ヌクレオチドとの塩基対選択性を示す少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくともcDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法も提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグが、従来のヌクレオチドを超える、もう一つの人工ヌクレオチドとの塩基対選択性を示す少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法を提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)少なくともcDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくともcDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法も提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成すること、
(c)第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料をモジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成すること、
(c)第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量が試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)モジュレーターとの接触前の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、モジュレーター接触後の試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節するモジュレーターを示すこと
を含んでなる方法を提供する。
ここで用いられる「試料」という用語は、その天然環境から単離されポリヌクレオチドを含む生物学的材料を意味する。本発明による「試料」は、精製または単離されたポリヌクレオチドからなる、またはこれは、組織試料のような生物学的試料、生物学的流体試料もしくはポリヌクレオチドを含む細胞試料を含み得る。生物学的流体試料は、血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液及び白血球泳動試料を含む。本発明の試料は、ポリヌクレオチドを含むいかなる植物、動物、バクテリアまたはウイルス材料であってもよい。
本発明は、ここに定義のような二つまたはそれ以上の試料における標的ポリヌクレオチドの発現を検出、測定及び比較する方法を提供する。本発明の試料は、少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、または標的ポリヌクレオチドそれ自体であり得る。ポリヌクレオチドの配列情報の従来の知識は、特別の用途に依存して必要または必要でない。本発明による有用な試料は、限定はされないが、標的ポリヌクレオチド(ゲノムDNA、cDNAまたはRNA)の試料、細胞、有機体、組織、流体、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、関節液、尿、涙、便;皮膚、気道、腸管及び尿生殖管の外分泌液;唾液、血球、腫瘍、器官、組織、試験管内細胞培養成分の試料、天然単離物(例えば、飲料水、海水、個体材料)、微生物検体、及びポリヌクレオチドトレーサー分子で「マークした」対象または検体を含む。
本方法は、二つまたはそれ以上の試料中の遺伝子の発現を測定または比較する。本発明の一つの局面において、転写水準における遺伝子の発現を測定または比較する。
本発明による有用なオリゴヌクレオチドプライマーを、ここに記載の当該分野でよく知られている一般的指針、及び、本発明の方法の各ステップ用に以下に記載の特定の要求に従って設計することができる。
オリゴヌクレオチドプライマーは5〜100ヌクレオチド、好ましくは17〜45ヌクレオチド長であるが、異なる長さのプライマーが有用である。cDNAを合成するためのプライマーは、好ましくは10〜45ヌクレオチドであり、増幅用のプライマーは、好ましくは約17〜25ヌクレオチドである。本発明に有用なプライマーは、溶融温度推定の方法により特定の溶融温度(Tm)を有するようにも設計される。Oligo(登録商標),Primer Designを含む市販プログラム及び、Primer3及びOligo Calculatorを含むインターネットで利用できるプログラムを用いて、本発明で有用なポリヌクレオチド配列のTmを計算することができる。好ましくは、例えばOligo Calculatorにより計算される本発明で有用な増幅プライマーのTmは、好ましくは、約45〜65℃、より好ましくは約50〜60℃である。
る。複数の因子がハイブリッド形成の過酷度に影響を与えるので、パラメーターの組み合わせが、単一因子の絶対測定より、一層重要である。
オリゴヌクレオチドプライマー自体が、当該分野でも良く知られている技術を用いて合成される。特定の配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は当該分野で知られており、例えば、適当な配列のクローニング及び制限消化分析、及び直接化学的合成を含む。一旦設計すると、オリゴヌクレオチドは、例えば、Narangら著、1979年,Methods in Enzymology,第68巻:90頁に記載のホスホトリエステル法、Brownら著、1979年,Methods in Enzymology,第68巻:109頁に開示のホスホジエステル法、Beaucageら著、1981年,Tetrahedron Letters,第22巻:1859頁に開示のジエチルホスホルアミデート法、米国特許第4,458,066号に開示の固体支持体法を含む適当な化学的合成法、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成器(市販されている)またはVLSIPS(登録商標)技術を用いる他の化学的方法により調製される。
本方法のcDNA合成及び増幅反応のための特定のオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、標的配列を認識しアニーリングすることができる配列の選択を含む。オリゴヌクレオチドのTmは、オリゴヌクレオチド長及びGC含量の分析により最適化される。
本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、一つまたは二つ以上の変性塩基、例えば、前述の塩基からなる変性配列を含み得る。そのような変性オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼ、DNAリガーゼ、及び他の修飾性酵素(Hill,F.Loakes,D.及びBrown D.M.,1998年,Proc Natl Acad Sci USA.,第95巻:4258〜4263頁)用の正常基材として働く。変性ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列中、任意の位置、すなわち、5’、3’または内部に組み込むことができる。変性した塩基は、当該分野で知られており、異なる変性を示すために異なるコードが用いられる(例えば、表I)。
本発明の方法において、第1cDNA鎖の合成のために第1オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。一つの態様において、増幅産物を生成するための他のプライマー用の鋳型として作用する配列を有する第1オリゴヌクレオチドプライマーも設計される。第1オリゴヌクレオチドプライマーは、20〜100ヌクレオチド長、好ましくは30〜60ヌクレオチド長、より好ましくは30〜45ヌクレオチド長、さらにより好ましくは34〜42ヌクレオチド長であり得る。
異的配列タグB2)20〜24T12〜16CN−3’,5’−(特異的配列タグB3)20〜24T12〜16GN−3’。
コードされたアダプターの有するオリゴヌクレオチドタグにより決める。
本発明の方法は、第1cDNA鎖を発生させた後、第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて第2cDNA鎖を合成することを含む。この場合、合成された第2cDNA鎖または二本鎖cDNAが、その後の増幅のための鋳型として用いられる。あるいは、合成された第1cDNA鎖を、増幅用の鋳型として直接用いて、第2cDNA鎖を合成することができる。
組み込むことが知られている。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、前述のように、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、酵素学的または化学的手段により検出可能な部分を組み込むすることにより標識することができる。オリゴヌクレオチドプライマーに標識を結合または共役させる方法は、もちろん、用いられる標識の型及び、プライマー上の標識の位置に依存する。本発明で有用なプライマーは、5’末端、3’末端で標識、またはプライマーの長さ全体において標識することができる。
本発明の方法により、cDNAを調製し増幅に用いることができる。一部の態様において、第1のcDNA鎖を調製し、その後の増幅反応及び分析に直接用いる。本発明の好ましい態様において、第1cDNAと第2cDNAの両方が合成される。合成された第1及び第2cDNA鎖をその後の増幅反応に用い、第2cDNA鎖を、第1cDNA鎖から分離して増幅反応に用いることができる。
合成したcDNA(例えば、第1鎖、第2鎖または二本鎖)を用いて、分析用の増幅産物を産生する。本発明において、当該分野で知られている他の増幅方法(例えば、LCR及びNSBA)も用いることができるが、PCR増幅が好ましい。
予定の時間またはサイクル(例えば、第5サイクル、第8サイクル、第10サイクル、または他のサイクル)から出発するPCR増幅中、少量、例えば、1%〜40%(v/v)の反応混合物が、各サイクル後に自動的に引き出され、反応混合物には、dNTP、蛍光標識したプライマー及びDNAポリメラーゼのような等体積の新しい成分が補給される。引き出された試料は、次に、分離され分析される。ポリヌクレオチドの存在または存在量を検出する方法は、当該分野でよく知られており、定量的分析を同時に行い得ることが好ましいが個々のポリヌクレオチドを分離することができる限り、それらのいずれかを、本発明の方法で用いることができる。増幅産物の分離及び分析のために有用な方法は、限定はされないが、電気泳動(例えば、キャピラリー電気泳動(CE))、クロマトグラフィー(dHPCL)及び質量分析を含む。
Log(複製数)=aCt+b ここで、a及びbは定数である。
本発明は、本発明の種々の態様を実施するための組成及びキットを含む。好ましくは、本発明のキットは第1オリゴヌクレオチドプライマーを含み、第1オリゴヌクレオチドプライマーは試料特異的配列タグを含み、試料特異的配列タグはその5末端においてGCに富みその3末端においてAtに富む。好ましくは、第1オリゴヌクレオチドは固体支持体に付着される。さらに、本発明のキットは、さらに、第2オリゴヌクレオチドプライマー、第3オリゴヌクレオチドプライマーまたは第4オリゴヌクレオチドプライマーを含むことができ、第2オリゴヌクレオチドプライマーは任意配列タグを含むことができる。キットは、さらに、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、反応緩衝剤、及びdNTPからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分を含み得る。
1.発生及び信号導入経路
異なる生物学的試料の発現プロフィールの比較は、正常発生プロセスの研究に非常に重要である。
本発明は、異なる生物学的試料の発現プロフィールを比較する方法を提供し、これはさらなる研究及び発展のために有能な薬剤標的を確認するための非常に価値のある手段、及び特定の病状のための有用な診断マーカーを提供する。
転写プロファイリングの単純な方法が非常に有用である他の領域は、遺伝的に修飾された細胞及び有機体の特徴解析である(例えば、修飾された遺伝子、過発現遺伝子またはミス遺伝子(ノックアウト)を有するトランスジェニック動物。そのような細胞及び有機体は、標的遺伝子の修飾された機能の結果、あるいは補償効果として、しばしば、変化し転写プロフィールを示す。そのような変化は、異なって発現された遺伝子の同一性により定められる特別の経路に置くことにより、遺伝子の機能を示すことができる。これは、特別の遺伝子における変化の転写サインを定めること及び、転写サインのデータベースに対して、疾患の影響を受けている有機体から得られる細胞または組織における転写変化を比較することにより特別の疾患における遺伝子修飾を決めるためにそのようなサインを用いることに役立つ。
本発明は、薬学的ビジネスを行うためのビジネス法も提供する。薬剤標的の確認及び実証は、薬剤開発プロセスにおける重要な速度制限ステップである。本発明は、疾患の発現プロフィールを正常組織と迅速に比較して、それにより、薬剤設計のための有能なリード分子を確認するプロセスの速度を著しく上昇させる方法を提供する。関連する高処理手段は、薬剤スクリーニング及び薬剤最適化プロセスの速度を上昇させることにも役立つ。さらに、多くの信頼性のある診断マーカーを確認し、さらに、診断目的で開発することができる。これは、これらの薬剤標的またはマーカーの確認及び開発を行うために薬学ビジネスの基礎のみならず、これらの初期の発見の権利を第三者に許可し、選択された標的をさらに研究及び開発させる機会も提供する。さらに、本発明の専売技術を用いて、そのような標的またはマーカーを確認及び開発する業務を提供することも可能である。
RNAを、以下の手順に従って、Trizol試薬及びQiagen製のRNeasy Midi/Maxi Kitを用いて製造することができる。
RNA試料(1〜5μl)を、dNTP溶液(10mM)1μl及び第1オリゴヌクレオチド0.0005〜0.5μM(20μl混合物中の最終濃度)と混合し、70℃で7分間加熱し、4℃で2分間冷却した。前記混合物を、次に、反応混合物(RT緩衝剤(250mM Tris−HCl(pH8.3:25℃),375mM KCl,15mM MgCl2)4μl、0.1M DTT 2μL,RNAse阻害剤(Ambion)1μL及びSuperScriptII逆転写酵素(Invitrogen)1μl及び水5〜10μl)と混合し、合計体積20μlとした。逆転写反応液を45℃で1〜2時間インキュベートし、65℃で10分間加熱することにより完了させた。試料(5〜20μl)を、PCRにより直接分析した。任意に、PCR増幅の前に、RNAse H酵素(Invitrogen)を用いてインキュベーションすることによりRNA鋳型を変性させた。
a.ビーズへのオリゴヌクレオチドのカップリング
Ultralink(登録商標)ヨードアセチルビーズ(Pierce)(100〜1,000μl)を、5×TE緩衝剤(50mM Tris,5mM EDTA,pH8.0)で4回洗い、チオール化(5’チオール)オリゴヌクレオチド(1〜10μM)の溶液と混合した。カップリング反応を、還元剤TCEP(Tris(2−カルボキシエチル)ホスフィン)(100〜500μM)を添加することにより開始し、室温で連続的に混合しつつ1〜2時間行った。ビーズ上の未反応活性基を、βメルカプトエタノール1%を添加することにより10分間急冷した。オリゴビーズを、各10倍体積の5×TE緩衝剤で4回、5×TE緩衝剤で2回(75℃)、RT緩衝剤で2回(85℃)、2×RT緩衝剤及びRT緩衝剤(95℃)で順次洗った。調製したビーズを、RT緩衝剤中4℃で維持した。
RNA試料(1〜5μl)を、dNTP溶液(10mM)1μl及びオリゴ−ビーズ6〜10μlと混合し、70℃で7分間加熱し、4℃で2分間冷却し、反応混合物(RT緩衝剤(250mM Tris−HCl(pH8.3:25℃),375mM KCl,15mM MgCl2)4μl、0.1M DTT2μL,RNAse阻害剤(Ambion)1μL及びSuperScriptII逆転写酵素(Invitrogen)1μl及び水0〜4μl))と混合した。逆転写反応液を45℃で1〜2時間インキュベートした。65℃で10分間加熱することにより反応を完了させた。ビーズをPCR緩衝剤で2回洗った。RNA鋳型を、RNAse H酵素(Invitrogen)とのインキュベーション、またはアルカリ加水分解により破壊した。後者の反応は、反応混合物に0.5M NaOH3.5μlを添加し、65℃で5分間インキュベーションし、1M Tris(pH7.5)3.5μlで中和することにより行った。ビーズを、PCR緩衝剤で2回洗った。
結合したDNAの第2鎖の合成を、Taqポリメラーゼ(Hot−start Taq、Qiagen製)(0.5〜1.5μ)及びPwo DNAポリメラーゼ(Roche製)(0.25〜0.5μ)の混合物を用いて、PCR熱サイクラーにおいて、95℃で30秒、56℃で30秒及び72℃で2分間行った。反応混合物は、RT反応からのオリゴビーズ上のcDNA6〜10μl、10×PCR緩衝剤(Hot−start Taq,Qiagan製)または10×RT−PCR緩衝剤(500mM Tris,200mM KCl,100mM (NH4)2SO4,2.5mM Mg2Cl,pH8.5)5μl、dNTP0.1mM、第2プライマー0.5〜1μl(100μM)を合計体積50μlで含んだ。合成した第2DNA鎖を、96℃でビーズから除去し、さらなる増幅に用いた。
合成されたcDNA(5〜20μl)のPCR増幅を、10×PCR緩衝剤または10×RT−PCR緩衝剤(前記参照)10μl、2〜3mM MgCl2、0.05〜0.2mM dNTPs、FAM、RoxまたはHexで標識した0.1〜1μM第3プライマー、0〜1μM非標識第3プライマー、第4プライマー1〜2μl、DMSO 0〜5%、校正DNAポリメラーゼ(PwoまたはTgo(Roche))0.5〜2μ、及びhot−start DNAポリメラーゼ(例えば、Hot−Start Taqポリメラーゼ(Qiagen製))1.5〜3μの存在下に行った。増幅を、「I−サイクラー」(BioRad)または「PCR Express」(Thermo Hybaid)熱サイクラーを使用して、以下のサイクルプログラムを用いて行った:95℃で30秒、56〜60℃で15〜30℃、72℃で1分30秒、合計30〜40サイクル。10〜15回目のサイクルで出発して延長ステップ(72℃)の最後に各サイクル後に少量の試料(典型的に25μl)を引き出した。プライマー、ポリメラーゼ及びdNTPを含む等体積のPCR混合物を、各試料除去後に反応混合物に入れた。集めた試料を、Spectrumedix(SCE−9610 Genetic Analysis System)またはABI(3700 Prism System)からのCEシステムを用いて分析
した。
キャピラリー電気泳動を、製造者の指示に従ってSpectrumedix Corporation製のSCE9610完全自動化96−キャピラリー電気泳動遺伝子分析システムで行った。
前述の態様は、実施した実験及び、本発明を製造し実施する際に本発明者が考えた技術を示す。これらの態様は、本発明の実施技術を示しその有用性を示すために役立つ技術の開示を含むと考えられる。当業者は、ここに記載の技術及び態様は、好ましい技術であり、通常、種々の同様の方法及び技術を用いて同じ結果を達成し得ると考える。
Claims (73)
- 2種以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第1の試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグはその5’末端においてGCに富みその3’末端においてAtに富むこと、
(b)少なくとも前記cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、存在量は前記第1試料中の一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違は2つの試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すことを含んでなる方法。 - 前記ステップ(a)が、二つまたはそれ以上の試料供給源からのRNAを第1cDNA鎖に逆転写することを含み、そのcDNAはそれらの供給源に従って異なって標識される請求項1の方法。
- 前記複数の第1cDNA鎖が、前記第1試料由来の全RNAまたはmRNAを用いる逆転写により合成される請求項1の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第3オリゴヌクレオチドプライマーを、前記増幅のために用いて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生する請求項1の方法。
- 前記二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、正常試料、疾患試料、所定の発生段階または状態における試料、所定の処理段階または状態の前の試料、所定の処理段階または状態の後の試料及び所定の培養段階または状態における試料からなる群より誘導される請求項1の方法。
- 前記二つまたはそれ以上の試料の少なくとも一つが、動物、器官、組織型及び細胞型からなる群より誘導される請求項1の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーにおける前記試料特異的配列が15〜30ヌクレオチド長である請求項1の方法。
- 前記試料特異的配列が20〜24ヌクレオチド長である請求項1の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが、さらに、5’オリゴ(dT)nVN3’の配列を含み、nは少なくとも5であり、VがdATP、dGTPまたはdCTPであり、NがdTTP(またはdUTP)、dATP、dGTPまたはdCTPである請求項1の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが、[5’−(特異的配列タグ)20−24T12−16AN−3’、5’−(特異的配列タグ)20−24T12−16CN−3’及び5’−(特異的配列タグ)20−24T12−16GN−3’]を含むプライマーの混合物として提供され、前記特異的配列タグが前記混合物中の各プライマーについて同一または異なる請求項1の方法。
- nが12〜16である請求項10の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、前記試料特異的配列タグがオリゴ(dT)nVNの5’に配される請求項10の方法。
- 第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成することをさらに含んでなり、ステップ(b)が少なくとも前記第2cDNA鎖のサブセットを増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生する請求項1の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマーが、さらに、前記第1cDNA鎖のサブセットに相補的な第2配列を含み、それにより一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成させる請求項13の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマーにおいて、前記第2配列が前記第1任意配列の3’に配される請求項14の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドが、さらに、前記第1及び第2配列の間に(Z)mの配列を含み、Zが、A、T、GまたはCのいずれかと塩基対を形成することができるヌクレオチドであり、mが少なくとも2である請求項14の方法。
- mが4である請求項16の方法。
- 前記第2配列が5〜10ヌクレオチド長である請求項14の方法。
- 前記第2配列が6〜7ヌクレオチド長である請求項18の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第1任意配列が15〜30ヌクレオチド長である請求項13の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第1任意配列がA−Tに富む領域とG−Cに富む領域とを含む請求項13の方法。
- 前記G−Cに富む領域が、前記A−Tに富む領域の5’に配される請求項21の方法。
- 前記用いられる第2オリゴヌクレオチドプライマーが、前記比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである請求項13の方法。
- 前記増幅が、さらに、前記第2オリゴヌクレオチドプライマーの前記第1任意配列タグを含む第4オリゴヌクレオチドプライマーを用いることを含む請求項4の方法。
- 前記用いられる第4オリゴヌクレオチドプライマーが、前記比較すべき二つまたはそれ以上の試料について同じである請求項24の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第2配列が遺伝子ファミリー特異的である請求項14の方法。
- 前記第2オリゴヌクレオチドプライマー中の前記第2配列が、蛋白ファミリーに特異的であるペプチドをコードする配列である請求項14の方法。
- 前記第2配列が、特異的蛋白ファミリー用のサイン配列モチーフをコードする配列を含む請求項27の方法。
- 前記蛋白ファミリーが、受容体チロシンキナーゼ、G蛋白共役受容体、7回膜通過受容体、イオンチャンネル、サイトカイン受容体、腫瘍マーカー、MAPKカスケードキナーゼ、転写因子、GTPアーゼ、ATPアーゼ、及び発生蛋白マーカーからなる群より選択される請求項28の方法。
- 前記第1cDNA鎖が、固体支持体に付着することなく溶液中で合成される請求項1の方法。
- 前記第1cDNA鎖が、固体支持体に付着されて合成される請求項1の方法。
- 前記固体支持体が微粒子または反応管の内壁である請求項31の方法。
- 前記方法が、さらに、前記一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖の増幅前に、前記複数の第1cDNA鎖から前記一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を分離することを含む請求項13の方法。
- 前記第3オリゴヌクレオチドプライマーが検出可能な標識に結合される請求項4の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識、放射性標識、比色標識、磁気標識及び酵素標識からなる群より選択される請求項34の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識である請求項35の方法。
- 前記二つまたはそれ以上の試料の各々について用いられる前記第3オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的標識で標識される請求項34の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物が、増幅中、所定の時間にまたは周期的間隔をおいてサンプリングされる請求項1の方法。
- 各サンプリングした増幅産物について存在量を検出する請求項38の方法。
- 前記方法が、さらに、前記一つまたは二つ以上の増幅産物の存在量を検出する前に、前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離することを含む1の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量をクロマトグラフィーにより検出する請求項40の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を蛍光測定により検出する請求項40の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を光学的濃度測定により検出する請求項40の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物を分離し、それらの存在量を質量分析により検出する請求項40の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物を電気泳動により分離する請求項40の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の増幅産物をキャピラリー電気泳動により分離する請求項45の方法。
- 前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールにおける前記相違を、二つまたはそれ以上の試料間の前記遺伝子からの増幅産物上の試料特異的検出可能標識の比により測定する請求項1の方法。
- 前記方法が、さらに、増幅プロットを発生させること、前記一つまたは二つ以上の遺伝子の各々について増幅のCtを計算すること、及び前記Ctの比により発現プロフィールにおける相違を測定することを含む請求項1の方法。
- 前記方法が、さらに、異なって発現される一つまたは二つ以上の遺伝子を集めること、及びDNA塩基配列決定により前記一つまたは二つ以上の遺伝子の配列同一性を確認することを含む請求項1の方法。
- 前記増幅をPCRにより行う請求項1の方法。
- 二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくとも前記cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。 - 二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグが少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくとも前記cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。 - 二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。 - 二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。 - 二つまたはそれ以上の試料の遺伝子発現プロフィールを比較する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、第1試料から複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグが少なくとも一つの人工ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記第1cDNA鎖に相補的な一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を選択的に合成すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記第1試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)前記第1試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを第2試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、二つの試料における前記一つまたは二つ以上の遺伝子の異なる発現を示すこと
を含んでなる方法。 - 試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)少なくとも前記cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。 - 試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)少なくとも前記cDNAのサブセットを選択的に増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(c)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(d)前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。 - 試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、前記試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成すること、
(c)前記第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産
生すること、
(d)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。 - 試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現を調節するモジュレーターを確認する方法であって、
(a)試料特異的配列タグを含む第1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記試料を前記モジュレーターに接触させる前に、複数の第1cDNA鎖を合成し、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含むこと、
(b)第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一つまたは二つ以上の第2cDNA鎖を合成すること、
(c)前記第2cDNA鎖を増幅させて一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物を産生すること、
(d)前記一つまたは二つ以上の試料特異的増幅産物の存在量を検出し、前記存在量が前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを決めること、及び
(e)前記モジュレーターとの接触前の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールを、前記モジュレーター接触後の前記試料中の前記一つまたは二つ以上の遺伝子の発現プロフィールと比較し、発現プロフィールにおける相違が、前記試料における一つまたは二つ以上の遺伝子発現を調節する前記モジュレーターを示すこと
を含んでなる方法。 - 遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第1オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富む組成物。
- 第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項60の組成物。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第3オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項61の組成物。
- 前記第1任意配列タグを含む第4オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項62の組成物。
- 前記第2プライマーが、前記第1cDNA鎖の配列に相補的な第2配列をさらに含む請求項60の組成物。
- 逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、前記逆転写酵素用の反応緩衝剤、前記DNAポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びdNTPからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分をさらに含む請求項60の組成物。
- 遺伝子発現の水準を検出するための組成物であって、第1オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含む組成
物。 - 遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第1オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記試料特異的配列タグがその5’末端においてGCに富みその3’末端においてATに富み、また、その包装材料を含んでなるキット。
- 第1任意配列タグを含む第2オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項67のキット。
- 前記第1オリゴヌクレオチドプライマーの前記配列特異的配列タグを含む第3オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項67のキット。
- 前記第1任意配列タグを含む第4オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む請求項68のキット。
- 前記第2プライマーが、前記第1cDNA鎖の配列に相補的な第2配列をさらに含む請求項68の組成物。
- 逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、前記逆転写酵素用の反応緩衝剤、前記DNAポリメラーゼ用の反応緩衝剤、及びdNTPからなる群より選択される一つまたは二つ以上の成分をさらに含む請求項67の組成物。
- 遺伝子発現の水準を検出するためのキットであって、第1オリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが試料特異的配列タグを含み、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも一つの変性ヌクレオチドを含み、また、その包装材料を含んでなるキット。
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