JP2010043103A - 治療的タンパク質の亜細胞標的化 - Google Patents
治療的タンパク質の亜細胞標的化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010043103A JP2010043103A JP2009229060A JP2009229060A JP2010043103A JP 2010043103 A JP2010043103 A JP 2010043103A JP 2009229060 A JP2009229060 A JP 2009229060A JP 2009229060 A JP2009229060 A JP 2009229060A JP 2010043103 A JP2010043103 A JP 2010043103A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- igf
- receptor
- therapeutic agent
- item
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 93
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title abstract description 92
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 57
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 177
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 158
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 92
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 abstract description 59
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 44
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 6
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract 3
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 abstract 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 144
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 144
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 116
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 116
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 104
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 89
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 67
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 59
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 48
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 44
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 40
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 39
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 39
- 102000057877 human IGF2 Human genes 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 32
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 32
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 31
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 31
- 102000038460 IGF Type 2 Receptor Human genes 0.000 description 30
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 29
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 24
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 23
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 22
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 101001028831 Homo sapiens Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 17
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 13
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 102220576120 Oligodendrocyte transcription factor 1_Y27W_mutation Human genes 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- -1 mannose carbohydrate Chemical class 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 9
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 9
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 9
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 8
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 6
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 6
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 6
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 6
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 5
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 4
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 3
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000091577 Mexicana Species 0.000 description 3
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 108010056760 agalsidase beta Proteins 0.000 description 3
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 229940014516 fabrazyme Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 3
- OIIXDDNIXWMHPG-YTLIFORHSA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OIIXDDNIXWMHPG-YTLIFORHSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710145225 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100037182 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007979 Glycocholic Acid Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001092933 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Phosphatidylinositol-3-phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000004617 QSAR study Methods 0.000 description 2
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004504 Urokinase Plasminogen Activator Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010042352 Urokinase Plasminogen Activator Receptors Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N glycocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 2
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 description 2
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 102000008490 2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase Procollagen-Lysine Human genes 0.000 description 1
- 108010020504 2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase Procollagen-Lysine Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIHKVMHPDDJIIP-UHFFFAOYSA-N 2-methylperoxybenzoic acid Chemical compound COOC1=CC=CC=C1C(O)=O CIHKVMHPDDJIIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000020322 Gaucher disease type I Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000016871 Hexosaminidase A Human genes 0.000 description 1
- 108010053317 Hexosaminidase A Proteins 0.000 description 1
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001044927 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000004375 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000957 Insulin-like growth factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004883 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001014 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010030685 KDEL receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000222734 Leishmania mexicana Species 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010056893 Mucopolysaccharidosis VII Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101100449945 Oryza sativa subsp. japonica GLU9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- JEGFCFLCRSJCMA-IHRRRGAJSA-N Phe-Arg-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JEGFCFLCRSJCMA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 101001076287 Rattus norvegicus Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001828 Sly syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 108700029631 X-Linked Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229940005553 analgesics and anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 102000028740 cation-dependent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010090156 cation-dependent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000003674 cytoplasmic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940081104 fibrinogen / thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000000266 injurious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 229940010004 lysine / phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000007932 molded tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 208000025919 mucopolysaccharidosis type 7 Diseases 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000003947 protein internalization Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000003797 solvolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003106 tissue adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003158 yeast two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
- A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/06—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a lysosomal/endosomal localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】治療剤を細胞区画に標的化するための、新規で、より単純で、より効率的で、かつ、より費用有効な方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。本発明は、リソソームのような特定の亜細胞区画に局在する標的化治療剤を提供する。この標的化治療剤は、治療薬剤および細胞の外側表面上のレセプターに結合する標的性部分を含み、レセプターの内在化の際に、標的化治療剤の適切な亜細胞局在を可能にする。本発明の実施に関する、核酸、細胞および方法もまた、提供される。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。本発明は、リソソームのような特定の亜細胞区画に局在する標的化治療剤を提供する。この標的化治療剤は、治療薬剤および細胞の外側表面上のレセプターに結合する標的性部分を含み、レセプターの内在化の際に、標的化治療剤の適切な亜細胞局在を可能にする。本発明の実施に関する、核酸、細胞および方法もまた、提供される。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許第60/287,531号(2001年4月30日出願);同第60/304,609号(2001年7月10日出願);同第60/329,461号(2001年10月15日出願)、および同第60/351,276号(2002年1月23日出願)の利益を主張し、それらの内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、哺乳動物細胞の標的化亜細胞区画にタンパク質を特異的に送達する手段を提供する。亜細胞区画にタンパク質を標的化する能力は、代謝疾患(例えば、リソソーム蓄積症(特に、リソソーム酵素を欠いているかまたは欠乏する40を超える遺伝的疾患のクラス))の処置において非常に有用である。
(背景)
細胞区画(例えば、ゴルジ、小胞体およびリソソーム)における酵素欠乏は、広範なヒト疾患を生じる。例えば、リシルヒドロキシラーゼ(これは、通常、小胞体の管腔内の酵素)は、コラーゲンの適切なプロセッシングに必要とされ;この酵素を欠くことで、エーレルス−ダンロー症候群VI型(重篤な結合組織障害)が生じる。GnT II(通常、ゴルジ中で見出される)は、タンパク質の正常なグリコシル化に必要とされ、GnT IIを欠くことで、脳発達における欠陥誘導する。40を超えるリソソーム蓄積症(LSD)が、リソソームにおける1つ以上のタンパク質を欠くことによって、直接的にかまたは間接的に引き起こされる。
細胞区画(例えば、ゴルジ、小胞体およびリソソーム)における酵素欠乏は、広範なヒト疾患を生じる。例えば、リシルヒドロキシラーゼ(これは、通常、小胞体の管腔内の酵素)は、コラーゲンの適切なプロセッシングに必要とされ;この酵素を欠くことで、エーレルス−ダンロー症候群VI型(重篤な結合組織障害)が生じる。GnT II(通常、ゴルジ中で見出される)は、タンパク質の正常なグリコシル化に必要とされ、GnT IIを欠くことで、脳発達における欠陥誘導する。40を超えるリソソーム蓄積症(LSD)が、リソソームにおける1つ以上のタンパク質を欠くことによって、直接的にかまたは間接的に引き起こされる。
哺乳動物のリソソーム酵素は、この酵素がN連結高マンノース型炭水化物でグリコシル化される、サイトゾルおよびトラバース小胞体で合成される。ゴルジにおいて、高マンノース炭水化物は、リソソームタンパク質をリソソームに標的化するマンノース−6−リン酸(M6P)の添加によって、このリソソームタンパク質で改変される。M6P改変化タンパク質は、2つのM6Pレセプターのいずれかとの相互作用を介して、リソソームに送達される。改変物の最も都合の良い形態は、二つのM6Pが高マンノース炭水化物に添加される場合である。
リソソーム蓄積症(LSD)のための酵素置換治療は、活発に探求されている。ゴシェ病を除く治療は、一般的に、LSDタンパク質が取り込まれ、そして、M6P依存様式で種々の細胞型のリソソームに送達されることを必要とする。1つの可能なアプローチは、LSDタンパク質を精製すること、および、このタンパク質が、M6Pを炭水化物部分に組み込むように改変することを包含する。この改変化物質は、細胞表面上でのM6Pレセプターとの相互作用に起因して、非改変化LSDよりもより効率的に細胞によって取り込まれ得る。しかし、亜細胞標的化における使用のためにタンパク質を調製、精製および改変するために必要とされる時間および費用に起因して、治療剤を細胞区画に標的化するための、新規で、より単純で、より効率的で、かつ、より費用有効な方法についての必要性が、依然としてある。
(発明の要旨)
本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。例えば、本発明の標的化治療剤は、融合タンパク質を正確な亜細胞区画に標的化する治療ドメインおよびドメインを含む融合タンパク質として、合成され得る(本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」は、同じポリペプチド中に通常存在しない、少なくとも2つのドメインを有する単一のポリペプチドをいう。従って、天然に存在するタンパク質は、本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」ではない)。融合タンパク質としての合成は、治療ドメインを所望の亜細胞区画に、例えば、別個の治療剤および標的ドメインの化学的架橋に関連する複雑さなしに、標的化することを可能にする。
本発明は、治療剤が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療剤を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療剤の調製を簡単にする。例えば、本発明の標的化治療剤は、融合タンパク質を正確な亜細胞区画に標的化する治療ドメインおよびドメインを含む融合タンパク質として、合成され得る(本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」は、同じポリペプチド中に通常存在しない、少なくとも2つのドメインを有する単一のポリペプチドをいう。従って、天然に存在するタンパク質は、本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」ではない)。融合タンパク質としての合成は、治療ドメインを所望の亜細胞区画に、例えば、別個の治療剤および標的ドメインの化学的架橋に関連する複雑さなしに、標的化することを可能にする。
本発明はまた、M6P非依存様式で、治療剤をリソソームに標的化することも可能にする。従って、標的化治療剤は、哺乳動物中で合成されることを必要としないが、化学的に合成され得、またはグリコシル化パターンにかかわらず、細菌、酵母、原生生物もしくは他の生物中で合成され得、高収率でかつ比較的低コストでの標的化治療剤の生成を容易にする。この標的化治療剤は、融合タンパク質として合成され得、さらに生成を簡単にするか、または、独立して合成された治療剤と標的部分を結合することによって、生成され得る。
本発明は、高マンノース炭水化物へのM6Pの添加を必要としないで、リソソームが治療剤の標的となることを可能にする。このことは、これら2つのM6Pレセプターの1つがまた、高親和性で他のリガンドに結合するという知見に、部分的に基づいている。例えば、カチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターはまた、このレセプターが高親和性でIGF−IIに結合するので、インスリン様増殖因子2(IGF−II)として公知である。この低分子量ポリペプチドは、3つのレセプター(インスリンレセプター、IGF−IレセプターおよびM6P/IGF−IIレセプター)と相互作用する。前者の2つのレセプターとの相互作用を主に介して、その生物学的効果が発揮すると考えられている一方、カチオン非依存性M6Pレセプターとの相互作用は、リソソーム(ここで、IGF−IIが分解される)に輸送されるIGF−IIを優勢に生じると考えられる。
従って、本発明は、哺乳動物リソソームで治療的に活性である標的部分および治療剤を含む、標的化治療剤の一つの局面に関する。本明細書中で使用される場合「治療的に活性な」は、酵素活性が欠乏する細胞、またはその区画に酵素活性を提供する、少なくともポリペプチドまたは他の分子を含む。「治療的に活性な」はまた、細胞中の生化学的欠乏を改善または補充することが意図される他のポリペプチドまたは他の分子を含むが、主として細胞傷害性または細胞増殖抑制性である分子(例えば、化学療法剤)を含まない。
1つの実施形態において、標的部分は、レセプターが標的細胞の原形質膜に存在する場合、M6P非依存性の様式で、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターの細胞外ドメインに結合するための手段(例えば、分子)である。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターの細胞外ドメインに結合する、非グルコシル化リソソーム標的ドメインである。いずれかの実施形態において、標的部分としては、例えば、IGF−II;レチノイン酸もしくはこの誘導体;ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプターのドメインに少なくとも70%同一なアミノ酸配列を有するタンパク質;このレセプターを認識する抗体の可変ドメイン;またはこれらの改変体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、標的部分は、pH7.4または約pH7.4で、マイクロモル以下の解離定数(例えば、10−8M未満、10−9M未満、10−10M未満、または10−7Mと10−11Mとの間)、およびpH5.5または約pH5.5で、少なくとも10−6Mの解離定数、ならびにpH7.4または約pH7.4で少なくとも10倍の解離定数でレセプターに結合する。特定の実施形態において、結合するための手段は、pH7.4または約pH7.4でよりも、pH5.5または約pH5.5で、少なくとも10倍弱く(less avidly)(すなわち、少なくとも10倍高い解離定数)細胞外ドメインに結合する;1つの実施形態において、pH5.5または約pH5.5での解離定数は、少なくとも10−6Mである。さらなる実施形態において、標的化治療剤と結合手段との結合は、pH7.4または約pH7.4〜pH5.5または約pH5.5のpH変化によって不安定化される。
別の実施形態において、標的部分は、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターの細胞外ドメインに結合するが、アミノ酸1572がイソロイシンからスレオニンに変化されるレセプターのムテインには結合しないか、または少なくとも10倍弱い親和性(すなわち、少なくとも10倍高い解離定数で)でムテインに結合する、リソソーム標的ドメインである。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターのリピート10〜15から本質的になるレセプタードメインに結合し得るリソソーム標的ドメインである;このリソソーム標的ドメインは、タンパク質が、このリソソーム標的ドメインに結合する他の部分を含まない場合でさえも、リピート10〜15を含むタンパク質に結合し得る。好ましくは、このリソソーム標的ドメインは、ヒトカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターのリピート10〜13から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。より好ましくは、このリソソーム標的ドメインは、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターのリピート11〜12、リピート11またはアミノ酸1508〜1566から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。これらの実施形態の各々において、このリソソーム標的ドメインは、好ましくは、pH7.4または約pH7.4でマイクロモル以下の解離定数で、レセプターまたはレセプタードメインに結合する。1つの好ましい実施形態において、このリソソーム標的ドメインは、約10−7Mの解離定数で結合する。別の好ましい実施形態において、この解離定数は、10−7未満である。
別の実施形態において、標的部分は、ヒトIGF−IIの十分に重複する結合部分であり、その結果、この結合部分は、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターに結合する。この結合部分は、IGF−IIの少なくとも一部に十分に相同であるアミノ酸配列を含むことによって、またはIGF−IIの少なくとも一部に十分相当する分子構造を含むことによって十分に重複し得、その結果、この結合部分は、カチオン非依存性M6Pレセプターに結合する。この結合部分は、IGF−IIの少なくとも一部(例えば、ヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55、またはヒトIGF−IIのアミノ酸8、48、49、50、54および55からなる群から選択される少なくとも3つのアミノ酸)に相当する三次元形状を有する有機分子であり得る。好ましい有機分子は、ヒトIGF−IIのアミノ酸48に相当する部分にて疎水性部分を有し、そして、ヒトIGF−IIのアミノ酸49に相当する部分にて、pH7.4または約pH7.4で、正の荷電を有する。1つの実施形態において、この結合部分は、5以下のアミノ酸によって分離される逆平行のαへリックスを有するポリペプチドを含む、ポリペプチドである。別の実施形態において、この結合部分は、アミノ酸55〜56が変更し、そして/またはアミノ酸1〜4が欠失または変化される、IGF−IまたはIGF−Iのムテインのアミノ酸を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、この結合部分は、ヒトIGF−IIに少なくとも60%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む;ヒトIGF−IIの54位および55位に対応する位置でのアミノ酸は、好ましくは、pH7.4または約pH7.4で、荷電していないか、または負に荷電される。
1つの実施形態において、この標的部分は、アミノ酸配列のフェニルアラニン−アルギニン−セリンを含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55に対して少なくとも75%相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的部分は、単一のポリペプチドまたは別個のポリペプチド上に、ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28および41〜61を含む。別の実施形態において、この標的部分は、ヒトIGF−IIのアミノ酸41〜61、ならびにアミノ酸9、19、26および/または27にてヒト配列とは異なる、ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28のムテインを含む。
いくつかの実施形態において、治療剤と標的部分との結合は、pH5.5または約pH5.5で不安定である。好ましい実施形態において、この標的部分と治療剤との結合は、5.5〜7.4の間のpKaを有するタンパク質アクセプター(例えば、イミダゾールまたはヒスチジンのようなこの誘導体)によって媒介される。好ましくは、治療剤または標的部分の一方は金属に連結され、そして他方は、pH依存性金属結合部分に連結される。
別の局面において、本発明は、治療ドメインおよび亜細胞標的ドメインを含む治療的融合タンパク質に関する。この亜細胞標的ドメインは、細胞の外部表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合する。このレセプターの内部移行の際に、亜細胞標的ドメインは、治療ドメインの亜細胞区画(例えば、リソソーム、エンドソーム、小胞体(ER)またはゴルジ複合体)への局在化を可能にして、ここで、この治療ドメインは、治療的に活性である。1つの実施形態において、このレセプターは、構成的エンドサイトーシスを受ける。別の実施形態において、この治療ドメインは、治療的酵素活性を有する。この酵素活性は、好ましくは、(細胞または細胞の特定の区画における)その欠損がヒト疾患(例えば、リソソーム蓄積症)に関連する活性である。
さらなる局面において、本発明は、治療タンパク質をコードする核酸およびこれらの核酸を含む細胞(例えば、哺乳細胞、昆虫細胞、酵母細胞、原生生物、または細菌)に関する。本発明はまた、これらの細胞に、タンパク質の発現を可能にする条件を(例えば、インビトロ培養との関連で、または、細胞を哺乳動物体内に維持することによって)提供することによって、このタンパク質を生成する方法を提供する。このタンパク質は、(例えば、インビトロで生成される場合)その後回収され得るか、または(例えば、患者においてインビボで生成される場合)回収工程を介在することなく、使用され得る。従って、本発明はまた、(注入、インサイチュ合成、その他によって)治療タンパク質を投与することによってか、このタンパク質をコードする核酸を投与することによって(これによって、インビボでのタンパク質合成が可能になる)か、または、このタンパク質をコードする核酸を含む細胞を投与することによって、患者を治療する方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、標的化治療剤を合成する工程、ならびに、この標的化治療剤を患者に投与する工程を包含し、この標的化治療剤は、哺乳動物のリソソーム、およびマンノース−6−リン酸非依存性様式で、ヒトカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターを結合する標的部分において治療的に活性である治療剤を含む。この方法または、(例えば、組み換えディスプレイ技術(例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイもしくは酵母2ハイブリッド)によってか、または、要求性結合特性についてライブラリーをスクリーニングすることによって)標的部分を同定する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ヒトIGF−IIの少なくとも一部に相当する三次元形状を規定する分子モデルを(例えば、コンピューター上に)提供する工程;IGF−IIの少なくとも一部(例えば、アミノ酸48〜55)に相当する三次元形状を有する候補IGF−IIアナログを同定する工程、ならびに、哺乳動物のリソソームで活性であり、この候補IGF−IIアナログに直接的にかまたは間接的に結合される治療剤を生成する工程を包含する。この方法はまた、この候補IGF−IIアナログが、ヒトカチオン非依存性M6Pレセプターに結合するか否かを決定する工程も包含し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
結合用手段であって、マンノース−6−リン酸に非依存性な様式で、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合するための、手段
を含む、標的化治療剤。
(項目2)
前記結合用手段が、レイチノイン酸またはその誘導体を含む、項目1の標的化治療剤。
(項目3)
項目1の標的化治療剤であって、ここで、前記結合用手段が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプターのドメインと少なくとも70%同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、標的化治療剤。
(項目4)
前記結合用手段がIGF−IIまたは抗体可変ドメインを含む、項目1の標的化治療剤。
(項目5)
前記治療薬剤と前記結合用手段との結合が、約pH7.4から約pH5.5へのpH変化によって不安定化される、項目1の標的化治療剤。
(項目6)
前記結合用手段が約pH7.4でマイクロモル以下の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目1の標的化治療剤。
(項目7)
前記解離定数が10 −8 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目8)
前記解離定数が10 −9 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目9)
前記解離定数が10 −10 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目10)
前記解離定数が10 −7 Mと10 −11 Mとの間である、項目6の標的化治療剤。
(項目11)
前記結合用手段が、約pH5.5では約pH7.4での解離定数の少なくとも10倍の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目6の標的化治療剤。
(項目12)
前記解離定数が、約pH5.5で少なくとも10 −6 Mである、項目11の標的化治療剤。
(項目13)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
非グリコシル化リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
(項目14)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;ならびに
リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合し、そして
(i) ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターのアミノ酸1572位がイソロイシンからスレオニンに変更された場合に、ムテインに結合せず、
(ii) ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合に関する解離定数の少なくとも10倍の解離定数でムテインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
(項目15)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
リソソーム標的性ドメインであって、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの10〜15の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、ドメイン
含む、標的化治療剤。
(項目16)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの10〜13の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、項目15に記載の標的化治療剤。
(項目17)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの11〜12の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目16に記載の標的化治療剤。
(項目18)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの11の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目17に記載の標的化治療剤。
(項目19)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターのアミノ酸1508〜1566位からなるレセプタードメインに結合する、項目18に記載の標的化治療剤。
(項目20)
前記リソソーム標的性ドメインが、pH7.4でマイクロモル以下の解離定数でレセプタードメインに結合する、項目15に記載の標的化治療剤。
(項目21)
前記解離定数が約10 −7 Mである、項目20に記載の標的化治療剤。
(項目22)
前記解離定数が約10 −7 M未満である、項目20に記載の標的化治療剤。
(項目23)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ヒトIGF−IIに十分に重複する結合部分であって、その結果、該結合部分がヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する、結合部分
含む、標的化治療剤。
(項目24)
前記結合部分が、IGF−IIの少なくとも一部を代表する三次元形状を有する有機分子である、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目25)
前記IGF−IIの一部がヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55位を含む、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目26)
前記IGF−IIの一部が、ヒトIGF−IIのアミノ酸8位、48位、49位、50位、54位および55位からなる群より選択される少なくとも3つのアミノ酸を含む、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目27)
前記有機分子が、ヒトIGF−IIのアミノ酸48位を代表する位置において疎水性部分を有し、そしてヒトIGF−IIのアミノ酸49位を代表する位置において約pH7.4で正電荷を有する、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目28)
前記結合部分が、IGF−IまたはIGF−Iムテインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで、
(i) アミノ酸55位および56位が変更されているか、
(ii) アミノ酸1〜4位が除去されるかまたは変更されているか、または
(iii) アミノ酸55位および56位が変更されて、かつアミノ酸1〜4位が除去されるかもしくは変更されている、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目29)
前記結合部分が、ヒトIGF−IIに少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目30)
前記アミノ酸配列が、ヒトIGF−IIのアミノ酸54位および55位に対応する位置で、pH7.4にて各々が荷電しないかまたは負電荷を帯びるアミノ酸を含む、項目29に記載の標的化治療剤。
(項目31)
前記結合部分が、5以下のアミノ酸によって区切られる逆平行α−ヘリックスを有するペプチドを含む、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目32)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ポリペプチドであって、フェニルアラニン−アルギニン−セリンのアミノ酸配列を含むポリペプチド
含む、標的化治療剤。
(項目33)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ポリペプチドであって、ヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55位に少なくとも75%の相同性があるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド
含む、標的化治療剤。
(項目34)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;
ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28位;および
ヒトIGF−IIのアミノ酸41〜61位
含む、標的化治療剤。
(項目35)
前記アミノ酸配列8〜28位および41〜61位が単一のポリペプチド中に存在する、項目34に記載の標的化治療剤。
(項目36)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;
ヒトIGF−IIのアミノ酸41〜61位;および
ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28位のムテインであって、アミノ酸9位、アミノ酸19位、アミノ酸26位およびアミノ酸27位からなる群より選択される位置で、ヒトIGF−IIと異なる、ムテイン
含む、標的化治療剤。
(項目37)
治療的融合タンパク質であって、以下:
治療的ドメイン、および
亜細胞標的性ドメインであって、細胞の外側表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合し、そしてレセプターの内部移行の際、該治療的ドメインが治療的に活性である亜細胞区画への該治療的ドメインの局在を可能にする、ドメイン
を含む、治療的融合タンパク質。
(項目38)
前記亜細胞区画が、リソソーム、エンドソーム、小胞体およびゴルジ体からなる群より選択される、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目39)
前記亜細胞区画がリソソームである、項目38に記載の治療的融合タンパク質。
(項目40)
前記レセプターが継続的なエンドサイトーシスを受ける、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目41)
前記治療的ドメインが治療的酵素活性を有する、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目42)
前記酵素活性における細胞または亜細胞の欠損がヒトの疾患に関連する、項目41に記載の治療的融合タンパク質。
(項目43)
前記ヒトの疾患がリソソーム蓄積症である、項目42に記載の治療的融合タンパク質。
(項目44)
項目37に記載の治療的融合タンパク質をコードする、核酸。
(項目45)
項目44に記載の核酸を含む、細胞。
(項目46)
治療的融合タンパク質を作製する方法であって、項目45に記載の前記細胞に対して、該治療的融合タンパク質の発現を可能とする状態を提供する工程を包含する、方法。
(項目47)
前記細胞をインビトロで培養する工程を包含する、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記細胞を哺乳動物の体内で維持する工程を包含する、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記治療的融合タンパク質を回収する工程をさらに包含する、項目46に記載の方法。
(項目50)
患者を処置する方法であって、
項目37に記載の治療的融合タンパク質を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目51)
患者を処置する方法であって、項目44に記載の核酸を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目52)
患者を処置する方法であって、項目45に記載の細胞を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目53)
患者を処置する方法であって、以下:
(i) 哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性な治療剤、およびマンノース−6−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する標的性部分を含む標的化治療剤を、合成する工程;および
(ii) 該患者に標的化治療剤を投与する工程、
を包含する、方法。
(項目54)
項目53に記載の方法であって、工程(i)の前に、以下:
マンノース−6−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する標的性部分を、同定する工程
をさらに含む、方法。
(項目55)
前記標的性部分が、核酸ライブラリーまたはペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定される、項目54に記載の方法。
(項目56)
標的化治療剤を作製する方法であって、以下の工程:
(a) ヒトIGF−IIの少なくとも一部を代表する三次元形状を規定する分子モデルを提供する工程;
(b) ヒトIGF−IIの少なくとも一部を代表する該三次形状に一致する三次元形状を有する、候補IGF−IIアナログを同定する工程;および
(c) 該候補IGF−IIアナログに直接的にか、または間接的に結合される該治療剤を作製する工程であって、該治療剤が哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤を作製する工程
を含む、方法。
(項目57)
前記工程cにおいて作製される化合物が、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目56に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
結合用手段であって、マンノース−6−リン酸に非依存性な様式で、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合するための、手段
を含む、標的化治療剤。
(項目2)
前記結合用手段が、レイチノイン酸またはその誘導体を含む、項目1の標的化治療剤。
(項目3)
項目1の標的化治療剤であって、ここで、前記結合用手段が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプターのドメインと少なくとも70%同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、標的化治療剤。
(項目4)
前記結合用手段がIGF−IIまたは抗体可変ドメインを含む、項目1の標的化治療剤。
(項目5)
前記治療薬剤と前記結合用手段との結合が、約pH7.4から約pH5.5へのpH変化によって不安定化される、項目1の標的化治療剤。
(項目6)
前記結合用手段が約pH7.4でマイクロモル以下の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目1の標的化治療剤。
(項目7)
前記解離定数が10 −8 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目8)
前記解離定数が10 −9 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目9)
前記解離定数が10 −10 M未満である、項目6の標的化治療剤。
(項目10)
前記解離定数が10 −7 Mと10 −11 Mとの間である、項目6の標的化治療剤。
(項目11)
前記結合用手段が、約pH5.5では約pH7.4での解離定数の少なくとも10倍の解離定数で細胞外ドメインに結合する、項目6の標的化治療剤。
(項目12)
前記解離定数が、約pH5.5で少なくとも10 −6 Mである、項目11の標的化治療剤。
(項目13)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
非グリコシル化リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
(項目14)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;ならびに
リソソーム標的性ドメインであって、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合し、そして
(i) ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターのアミノ酸1572位がイソロイシンからスレオニンに変更された場合に、ムテインに結合せず、
(ii) ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの細胞外ドメインに結合に関する解離定数の少なくとも10倍の解離定数でムテインに結合する、ドメイン
を含む、標的化治療剤。
(項目15)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
リソソーム標的性ドメインであって、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの10〜15の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、ドメイン
含む、標的化治療剤。
(項目16)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの10〜13の反復からなるレセプタードメインに結合し得る、項目15に記載の標的化治療剤。
(項目17)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの11〜12の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目16に記載の標的化治療剤。
(項目18)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターの11の反復からなるレセプタードメインに結合する、項目17に記載の標的化治療剤。
(項目19)
前記リソソーム標的性ドメインが、本質的に、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターのアミノ酸1508〜1566位からなるレセプタードメインに結合する、項目18に記載の標的化治療剤。
(項目20)
前記リソソーム標的性ドメインが、pH7.4でマイクロモル以下の解離定数でレセプタードメインに結合する、項目15に記載の標的化治療剤。
(項目21)
前記解離定数が約10 −7 Mである、項目20に記載の標的化治療剤。
(項目22)
前記解離定数が約10 −7 M未満である、項目20に記載の標的化治療剤。
(項目23)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ヒトIGF−IIに十分に重複する結合部分であって、その結果、該結合部分がヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する、結合部分
含む、標的化治療剤。
(項目24)
前記結合部分が、IGF−IIの少なくとも一部を代表する三次元形状を有する有機分子である、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目25)
前記IGF−IIの一部がヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55位を含む、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目26)
前記IGF−IIの一部が、ヒトIGF−IIのアミノ酸8位、48位、49位、50位、54位および55位からなる群より選択される少なくとも3つのアミノ酸を含む、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目27)
前記有機分子が、ヒトIGF−IIのアミノ酸48位を代表する位置において疎水性部分を有し、そしてヒトIGF−IIのアミノ酸49位を代表する位置において約pH7.4で正電荷を有する、項目24に記載の標的化治療剤。
(項目28)
前記結合部分が、IGF−IまたはIGF−Iムテインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで、
(i) アミノ酸55位および56位が変更されているか、
(ii) アミノ酸1〜4位が除去されるかまたは変更されているか、または
(iii) アミノ酸55位および56位が変更されて、かつアミノ酸1〜4位が除去されるかもしくは変更されている、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目29)
前記結合部分が、ヒトIGF−IIに少なくとも60%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目30)
前記アミノ酸配列が、ヒトIGF−IIのアミノ酸54位および55位に対応する位置で、pH7.4にて各々が荷電しないかまたは負電荷を帯びるアミノ酸を含む、項目29に記載の標的化治療剤。
(項目31)
前記結合部分が、5以下のアミノ酸によって区切られる逆平行α−ヘリックスを有するペプチドを含む、項目23に記載の標的化治療剤。
(項目32)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ポリペプチドであって、フェニルアラニン−アルギニン−セリンのアミノ酸配列を含むポリペプチド
含む、標的化治療剤。
(項目33)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;および
ポリペプチドであって、ヒトIGF−IIのアミノ酸48〜55位に少なくとも75%の相同性があるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド
含む、標的化治療剤。
(項目34)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;
ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28位;および
ヒトIGF−IIのアミノ酸41〜61位
含む、標的化治療剤。
(項目35)
前記アミノ酸配列8〜28位および41〜61位が単一のポリペプチド中に存在する、項目34に記載の標的化治療剤。
(項目36)
標的化治療剤であって、以下:
治療剤であって、ヒトのリソソーム中で治療的に活性である、治療剤;
ヒトIGF−IIのアミノ酸41〜61位;および
ヒトIGF−IIのアミノ酸8〜28位のムテインであって、アミノ酸9位、アミノ酸19位、アミノ酸26位およびアミノ酸27位からなる群より選択される位置で、ヒトIGF−IIと異なる、ムテイン
含む、標的化治療剤。
(項目37)
治療的融合タンパク質であって、以下:
治療的ドメイン、および
亜細胞標的性ドメインであって、細胞の外側表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合し、そしてレセプターの内部移行の際、該治療的ドメインが治療的に活性である亜細胞区画への該治療的ドメインの局在を可能にする、ドメイン
を含む、治療的融合タンパク質。
(項目38)
前記亜細胞区画が、リソソーム、エンドソーム、小胞体およびゴルジ体からなる群より選択される、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目39)
前記亜細胞区画がリソソームである、項目38に記載の治療的融合タンパク質。
(項目40)
前記レセプターが継続的なエンドサイトーシスを受ける、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目41)
前記治療的ドメインが治療的酵素活性を有する、項目37に記載の治療的融合タンパク質。
(項目42)
前記酵素活性における細胞または亜細胞の欠損がヒトの疾患に関連する、項目41に記載の治療的融合タンパク質。
(項目43)
前記ヒトの疾患がリソソーム蓄積症である、項目42に記載の治療的融合タンパク質。
(項目44)
項目37に記載の治療的融合タンパク質をコードする、核酸。
(項目45)
項目44に記載の核酸を含む、細胞。
(項目46)
治療的融合タンパク質を作製する方法であって、項目45に記載の前記細胞に対して、該治療的融合タンパク質の発現を可能とする状態を提供する工程を包含する、方法。
(項目47)
前記細胞をインビトロで培養する工程を包含する、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記細胞を哺乳動物の体内で維持する工程を包含する、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記治療的融合タンパク質を回収する工程をさらに包含する、項目46に記載の方法。
(項目50)
患者を処置する方法であって、
項目37に記載の治療的融合タンパク質を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目51)
患者を処置する方法であって、項目44に記載の核酸を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目52)
患者を処置する方法であって、項目45に記載の細胞を該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目53)
患者を処置する方法であって、以下:
(i) 哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性な治療剤、およびマンノース−6−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する標的性部分を含む標的化治療剤を、合成する工程;および
(ii) 該患者に標的化治療剤を投与する工程、
を包含する、方法。
(項目54)
項目53に記載の方法であって、工程(i)の前に、以下:
マンノース−6−リン酸に非依存性の様式でヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合する標的性部分を、同定する工程
をさらに含む、方法。
(項目55)
前記標的性部分が、核酸ライブラリーまたはペプチドライブラリーのスクリーニングによって同定される、項目54に記載の方法。
(項目56)
標的化治療剤を作製する方法であって、以下の工程:
(a) ヒトIGF−IIの少なくとも一部を代表する三次元形状を規定する分子モデルを提供する工程;
(b) ヒトIGF−IIの少なくとも一部を代表する該三次形状に一致する三次元形状を有する、候補IGF−IIアナログを同定する工程;および
(c) 該候補IGF−IIアナログに直接的にか、または間接的に結合される該治療剤を作製する工程であって、該治療剤が哺乳動物のリソソーム中で治療的に活性である、治療剤を作製する工程
を含む、方法。
(項目57)
前記工程cにおいて作製される化合物が、ヒトのカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目56に記載の方法。
(発明の詳細な説明)
本明細書中で使用される場合、「グリコシル化非依存性リソソーム標的」および「GILT」は、マンノース−6−リン酸非依存性であるリソソーム標的化をいう。
本明細書中で使用される場合、「GILT構築物」は、哺乳動物のリソソームにおいて有効な、マンノース−6−リン酸非依存性のリソソーム標的部分および治療部分を含む構築物をいう。
本明細書中で使用される場合、「グリコシル化非依存性リソソーム標的」および「GILT」は、マンノース−6−リン酸非依存性であるリソソーム標的化をいう。
本明細書中で使用される場合、「GILT構築物」は、哺乳動物のリソソームにおいて有効な、マンノース−6−リン酸非依存性のリソソーム標的部分および治療部分を含む構築物をいう。
本明細書中で使用される場合、「GUS」は、β−グルクロニダーゼ(例示的な治療部分)をいう。
本明細書中で使用される場合、「GUS−GILT」は、IGF−II標的部分に連結されたGUSを有するGILT構築物をいう。
IGF−II中のアミノ酸位置への全ての参照は、成人IGF−IIにおける位置をいう。従って、例えば、1位、2位および3位は、各々、アラニン、チロシンおよびアルギニンによって占められる。
本発明は、細胞の外に提供される場合に、この細胞に侵入して、標的化治療剤が活性である亜細胞区画に局在する標的化治療剤を提供することによって、代謝性疾患の処置を容易にする。この標的化治療剤は、少なくとも治療剤および標的部分(例えば、タンパク質の亜細胞標的ドメイン)、または、リソソーム標的化のために、ヒトカチオン非依存性マンノース−6−リン酸レセプターに結合するための手段(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドアナログまたは有機化学物質)を含む。
(治療剤と標的部分との間の結合)
治療剤および標的部分は、直接的または間接的に必ず結合される。1つの実施形態において、治療剤および標的部分は、非共有結合される。この結合は、好ましくは、pH7.4または約pH7.4で安定である。例えば、標的部分は、ビオチン化され得、そして、治療剤と結合したアビジンに結合する。あるいは、この標的部分および治療剤は、各々、多量体タンパク質の異なるサブユニットに(例えば、融合タンパク質として)結合され得る。別の実施形態において、この標的部分および治療剤は、(例えば、化学的架橋剤を使用して)互いに架橋される。
治療剤および標的部分は、直接的または間接的に必ず結合される。1つの実施形態において、治療剤および標的部分は、非共有結合される。この結合は、好ましくは、pH7.4または約pH7.4で安定である。例えば、標的部分は、ビオチン化され得、そして、治療剤と結合したアビジンに結合する。あるいは、この標的部分および治療剤は、各々、多量体タンパク質の異なるサブユニットに(例えば、融合タンパク質として)結合され得る。別の実施形態において、この標的部分および治療剤は、(例えば、化学的架橋剤を使用して)互いに架橋される。
好ましい実施形態において、この治療剤は、融合タンパク質として、標的部分に融合される。この標的部分は、この融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端であり得るか、この標的部分の存在が、治療剤の治療活性を過度に干渉しない位置にて、治療剤の配列内に挿入され得る。
治療剤がヘテロマータンパク質である場合、サブユニットの1つ以上は、標的部分に結合され得る。ヘキソサミニダーゼA(例えば、テイ−サックス病において作用されるリソソームタンパク質)は、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。このαサブユニット、βサブユニット、またはこれらの両方は、本発明に従って、標的部分に結合され得る。例えば、このαサブユニットが標的部分に結合され、そして、βサブユニットと同時発現される場合、活性複合体は、適切に形成され、そして(例えば、リソソームに)標的化される。
治療剤のリソソームへの標的化のために、この治療剤は、pHを、pH7.4または約pH7.4〜5.5または約5.5に下げることにより混乱される相互作用を介して、標的部分に結合され得る。この標的部分は、細胞の外部のレセプターに結合する;この選択されたレセプターは、エンドサイトーシスを受けそして、後期エンドソーム(これは、約5.5のpHを有する)を通るレセプターである。従って、後期エンドソームにおいて、治療剤は、標的部分から解離して、そして、リソソームに向かい、ここで、治療剤が作用する。例えば、治療部分は、金属イオン(例えば、ニッケル)に強固に結合するキレート剤(例えば、EDTA、EGTAまたはトリニトリロトリ酢酸)を取り込むように、化学的に改変され得る。この標的部分(例えば、GUS)は、融合タンパク質として、(例えば、アミノ末端か、カルボキシ末端か、または、表面に接近可能な可塑性のあるループにおいて)6つのヒスチジンタグと共に発現され得る。pH7.4または約pH7.4で、この6つのヒスチジンタグは、実質的に脱プロトン化されて、金属イオン(例えば、ニッケル)に、高親和性で結合する。pH5.5または約pH5.5で、この6つのヒスチジンタグは、実質的にプロトン化されて、ニッケルの放出を導き、結果的に、標的部分から治療剤を放出する。
(治療剤)
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を生成して、亜細胞区画に送達するのに有用であるが、本発明は、代謝疾患を処置するための遺伝子産物を送達するのに、特に有用である。
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を生成して、亜細胞区画に送達するのに有用であるが、本発明は、代謝疾患を処置するための遺伝子産物を送達するのに、特に有用である。
好ましいLSD遺伝子は、表1に示され、そして、ゴルジ欠損または小胞体欠損に関連する、好ましい遺伝子は表2に示される。好ましい実施形態において、野生型LSD遺伝子産物は、同じLSD遺伝子の欠損に罹患する患者に送達され得る。代替の実施形態において、LSD遺伝子の機能配列または種改変体が使用される。さらなる実施形態において、LSD遺伝子欠損をレスキューし得る、異なる酵素をコードする遺伝子が、本発明の方法に従って使用される。
(亜細胞標的化ドメイン)
本発明は、タンパク質、またはこのタンパク質の細胞レセプターに特異的に結合するタンパク質のアナログを使用して、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。細胞表面の外部は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、および小胞体区画と位相幾何学的に同等である。従って、適切なレセプターとの相互作用を介する分子のエンドサイトーシスは、膜を横切ることなくこれらの区画のいずれかへの分子の輸送を可能にする。遺伝欠損は、これらの区画のいずれかにおける特定の酵素活性の欠失を生じ、治療的タンパク質の送達は、適切なレセプターに対するリガンドとのこのタンパク質のタグ化によって達成され得る。
本発明は、タンパク質、またはこのタンパク質の細胞レセプターに特異的に結合するタンパク質のアナログを使用して、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。細胞表面の外部は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、および小胞体区画と位相幾何学的に同等である。従って、適切なレセプターとの相互作用を介する分子のエンドサイトーシスは、膜を横切ることなくこれらの区画のいずれかへの分子の輸送を可能にする。遺伝欠損は、これらの区画のいずれかにおける特定の酵素活性の欠失を生じ、治療的タンパク質の送達は、適切なレセプターに対するリガンドとのこのタンパク質のタグ化によって達成され得る。
原形質膜からゴルジおよび/または小胞体に、レセプター結合タンパク質を指向させる複数の経路が特徴付けられている。従って、例えば、SV40、コレラ毒素、または植物性リシン毒素(これらの各々は、これらの細胞輸送経路の1つ以上を選出する)由来の標的化部分を使用することによって、治療剤は、細胞内の所望の位置に標的化され得る。各々の場合において、取りこみは、細胞の外側への物質の結合によって開始される。例えば、SV40は、MHCクラスIレセプターに結合し、コレラ毒素は、GM1ガングリオシド分子に結合し、そしてリシンは、細胞の表面上の、末端ガラクトースを有する糖脂質および糖タンパク質に結合する。この初期の工程に続いて、分子は種々の経路によってERに達する。例えば、SV40は、小胞エンドサイトーシスを起こし、そしてゴルジをバイパスする2段階のプロセスにおいてERに達するのに対し、コレラ毒素は、小胞エンドサイトーシスを起こすが、ERに達する前にゴルジを横切る。
コレラ毒素またはリシンに関連する標的化部分が使用される場合、コレラ毒素またはリシンの毒性が回避されることが重要である。コレラ毒素およびリシンの両方は、ヘテロマーのタンパク質であり、そしてその細胞表面結合ドメインおよび毒性を担う触媒活性は、別々のポリペプチド上に存在する。従って、レセプター結合ポリペプチドを含むが、毒性の原因であるポリペプチドは含まない、標的化部分が構築され得る。例えば、リシンの場合において、Bサブユニットは、タンパク質の内在化の原因であるガラクトース結合活性を有する。Aサブユニットのさらなる存在が亜細胞局在を改善する場合、適切に折りたたまれるが触媒的に不活性であるA鎖の変異バージョン(ムテイン)は、Bサブユニット−治療剤融合タンパク質と共に提供され得る。
ゴルジに送達されたタンパク質は、ゴルジに逃げているER標的化タンパク質を回収するKDELレセプターを介して小胞体(ER)に移送され得る。従って、治療タンパク質をゴルジに配向する標的化ドメインの末端にKDELモチーフを含ませることは、ERへの引き続く局在化を可能にする。例えば、標的化部分(例えば、抗体、またはファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、チップベース(chip−based)アッセイのようなハイスループットスクリーニングおよび溶液ベースアッセイによって同定されたペプチド)は、pH7.4またはそのあたり、およびpH5.5またはそのあたりの両方で、カチオン非依存性M6Pレセプターに結合し、この標的化部分は、ゴルジに対する治療剤の標的化を可能にし;さらにKDELモチーフの付加が、ERに対する標的化を可能にする。
(リソソーム標的化部分)
本発明は、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。標的化は、例えば、後にリソソームを通過する原形質膜レセプターの結合を介して生じ得る。あるいは、標的化は、後に後期(late)エンドソームを通過する原形質レセプターの結合を介して生じ得;ついで、治療剤は、後期エンドソームからリソソームへ移動し得る。好ましいリソソーム標的化機構は、カチオン非依存性M6Pレセプターへの結合を含む。
本発明は、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。標的化は、例えば、後にリソソームを通過する原形質膜レセプターの結合を介して生じ得る。あるいは、標的化は、後に後期(late)エンドソームを通過する原形質レセプターの結合を介して生じ得;ついで、治療剤は、後期エンドソームからリソソームへ移動し得る。好ましいリソソーム標的化機構は、カチオン非依存性M6Pレセプターへの結合を含む。
(カチオン非依存性M6Pレセプター)
カチオン非依存性M6Pレセプターは、哺乳動物組織中で遍在的に発現される275kDaの単鎖膜貫通糖タンパク質である。それは、M6Pに結合する2つの哺乳動物レセプターのうちの1つであり;2番目は、カチオン依存性M6Pレセプターとよばれる。このカチオン依存性M6Pレセプターは、M6P結合のために二価のカチオンを必要とするが;カチオン非依存性M6Pレセプターは、必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるM6P部分の認識によって、リソソーム酵素の輸送に重要な役割を果たす。カチオン非依存性M6Pレセプターの細胞外ドメインは、レセプター上の別個の位置に様々な群のリガンドに結合する15個の相同ドメイン(「リピート」)を含む。
カチオン非依存性M6Pレセプターは、哺乳動物組織中で遍在的に発現される275kDaの単鎖膜貫通糖タンパク質である。それは、M6Pに結合する2つの哺乳動物レセプターのうちの1つであり;2番目は、カチオン依存性M6Pレセプターとよばれる。このカチオン依存性M6Pレセプターは、M6P結合のために二価のカチオンを必要とするが;カチオン非依存性M6Pレセプターは、必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるM6P部分の認識によって、リソソーム酵素の輸送に重要な役割を果たす。カチオン非依存性M6Pレセプターの細胞外ドメインは、レセプター上の別個の位置に様々な群のリガンドに結合する15個の相同ドメイン(「リピート」)を含む。
カチオン非依存性M6Pレセプターは、M6Pのための2つの結合部位を含む:1つはリピート1〜3に位置し、そして他方は、リピート7〜9に位置する。このレセプターは、おそらくレセプターオリゴマー化に起因して、nM範囲の解離定数を有する二価のM6Pリガンドに結合したまま、μM範囲の解離定数を有する一価のM6Pリガンドに結合する。レセプターによるIGF−IIの取りこみは、レセプターに対する、リソソーム酵素のような多価のM6Pリガンドの随伴性の結合によって増強される。
カチオン非依存性M6Pレセプターはまた、少なくとも3つの別々のリガンドについての結合部位を含み、これは、標的化部分として使用され得る。カチオン非依存性M6Pレセプターは、主に、リピート11との相互作用を介して、pH7.4またはそのあたりで、約14nMの解離定数でIGF−IIに結合する。リソソームへのIGF−IIの標的化におけるその機能と一致して、解離定数は、酸性後期エンドソームにおいてIGF−IIの解離を促進するpH5.5またはそのあたりで、約100倍に増加する。このレセプターは、高分子量のO−グリコシル化IGF−II形態と結合し得る。
カチオン非依存性M6Pレセプターのためにさらに有用なリガンドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は、2.5nMの解離定数でレセプターに結合する。カチオン非依存性M6Pレセプターの、レチノイン酸との親和性光標識は、レセプターへのIGF−IIの結合もM6Pの結合も妨害せず、レチノイン酸が、レセプター上の別々の部位に結合することを示す。レチノイン酸のレセプターへの結合は、細胞質小胞中のレセプターのより大きい蓄積を有するレセプターの細胞内分布を変更し、また、M6P修飾β−グルクロニダーゼの取りこみを増強する。レチノイン酸は、カチオン非依存性M6Pレセプターに結合するその能力を妨害することなく、治療剤に結合するために使用され得る光活性化可能部分を有する。
このカチオン非依存性M6Pレセプターはまた、9μMの解離定数でウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター(uPAR)に結合する。uPARは、ほとんどの細胞型の表面上のGPI−アンカーレセプターであり、ここで接着分子として、およびプラスミノーゲンおよびTGF−βのタンパク分解性活性化において機能する。uPARのCI−M6Pレセプターへの結合は、CI−M6Pレセプターをリソソームに標的化し、それによって、その活性を改変する。従って、カチオン非依存性M6Pレセプターに結合し得るuPARの細胞外ドメインまたはその一部の治療剤への融合は、リソソームに対する薬剤の標的化を可能にする。
(IGF−II)
好ましい実施形態において、リソソーム標的化部分は、タンパク質、ペプチド、またはマンノース−6−ホスフェート−非依存性様式で、カチオン非依存性M6P/IGF−IIレセプターに結合する他の部分である。有利なことに、この実施形態は、LSDタンパク質の取りこみについての通常の生物学的機構を模倣するが、マンノース−6−ホスフェートに依存しない様式でこれを行なう。
好ましい実施形態において、リソソーム標的化部分は、タンパク質、ペプチド、またはマンノース−6−ホスフェート−非依存性様式で、カチオン非依存性M6P/IGF−IIレセプターに結合する他の部分である。有利なことに、この実施形態は、LSDタンパク質の取りこみについての通常の生物学的機構を模倣するが、マンノース−6−ホスフェートに依存しない様式でこれを行なう。
例えば、成熟IGF−IIポリペプチドをコードするDNAを、LSD遺伝子カセットの3’末端に融合することによって、種々の細胞型によって取り込まれ、リソソームに輸送され得る融合タンパク質が作製される。この方法は、一旦タンパク質が単離されると、さらなる改変がなされる必要がないので、単純さおよびコスト効率を含め、グリコシル化を含む方法よりも多くの利点を有する。
IGF−IIは、好ましくは、M6Pレセプターに特異的に標的化される。IGF−IIポリペプチドにおける特に有用な変異は、高い親和性でM6Pレセプターに結合するタンパク質を生じるが、感知可能な親和性で他の2つのレセプターにはもはや結合しない。IGF−IIはまた、IGF−II/GILT構築物の隔離を避けるために、血清IGF−結合タンパク質への結合を最小化するように改変され得る(Baxter(2000)Am.J.Physiol Endocrinol Metab.278(6):967−76)。多くの研究によって、IGF−結合タンパク質に結合するために必要なIGF−IおよびIGF−II中の残基が特定された。これらの残基での変異を有する構築物は、M6P/IGF−IIレセプターへの高親和性結合の保持について、およびIGF−結合タンパク質に対する親和性の減少についてスクリーニングされ得る。例えば、IGF−IIのPHE26の、SERでの置換は、M6P/IGF−IIレセプターへの結合に影響を及ぼさずに、IGFBP−1およびIGFBP−6についてのIGF−IIの親和性を減少させることが報告されている(Bachら(1993)J.Biol.Chem,268(13):9246−54)。PHE19からSERへ、およびGLU9からLYSへのような他の置換もまた、有利であり得る。類似の変異は、IGF−IIと共に高度に保存されたIGF−I中の領域において、別々に、または組み合わせて、IGF−BP結合における大きな減少を生じる(Mageeら(1999)Biochemistry38(48):15863−70)。
代替的なアプローチは、M6P/IGF−IIレセプターに高親和性で結合し得るIGF−IIの最小領域を同定することである。M6P/IGF−IIレセプターに結合するIGF−IIに関与する残基は、ほとんどがIGF−IIの1つの面でクラスター形成する(Tarasawaら(1994)EMBO J.13(23):5590−7)。IGF−IIの3次構造は、通常、3つの分子内ジスルフィド結合によって維持され、IGF−IIの表面に結合するM6P/IGF−IIレセプター上のアミノ酸配列を取りこむペプチドは、適当に折りたたみ、そして結合活性を有するように設計され得る。このような最小結合ペプチドは、高度に好ましい標的化部分である。アミノ酸48〜55周辺の領域に基づいて設計されたペプチドは、M6P/IGF−IIレセプターに対する結合について試験され得る。あるいは、ペプチドのランダムライブラリーは、酵母ツーハイブリッドアッセイを介して、またはファージディスプレイ型アッセイを介してのいずれかで、M6P/IGF−IIレセプターに結合する能力についてスクリーニングされ得る。
(血液脳関門)
リソソーム蓄積症のための治療における1つの挑戦は、これらの疾患の多くが、有意な神経学的関与を有していることである。血流に投与される治療酵素は、一般的に血液脳関門を横切らず、従って、この疾患と関連する神経学的症状を軽減し得ない。しかし、IGF−IIは、トランスサイトーシスを介して血液脳関門を横切る輸送を促進することが報告されている(Bickelら(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.46(1−3:247−79)。従って、適切に設計されたGILT構築物は、血液脳関門を横切ることが可能であるべきであり、リソソーム蓄積症と関連する神経学的症状を処置する手段を初めて提供する。この構築物は、実施例7(後述)に記載されるようにGUSマイナスマウスを使用して試験され得る。血液から神経組織に達し得る標的化された治療剤の設計、構築物および試験に関するさらなる詳細は、米国シリアル番号60/329,650(2001年10月16日出願)および米国シリアル番号10/_(代理人事件番号SYM−008)(2002年4月30日出願)に開示される。
リソソーム蓄積症のための治療における1つの挑戦は、これらの疾患の多くが、有意な神経学的関与を有していることである。血流に投与される治療酵素は、一般的に血液脳関門を横切らず、従って、この疾患と関連する神経学的症状を軽減し得ない。しかし、IGF−IIは、トランスサイトーシスを介して血液脳関門を横切る輸送を促進することが報告されている(Bickelら(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.46(1−3:247−79)。従って、適切に設計されたGILT構築物は、血液脳関門を横切ることが可能であるべきであり、リソソーム蓄積症と関連する神経学的症状を処置する手段を初めて提供する。この構築物は、実施例7(後述)に記載されるようにGUSマイナスマウスを使用して試験され得る。血液から神経組織に達し得る標的化された治療剤の設計、構築物および試験に関するさらなる詳細は、米国シリアル番号60/329,650(2001年10月16日出願)および米国シリアル番号10/_(代理人事件番号SYM−008)(2002年4月30日出願)に開示される。
(IGF−IIの構造)
IGF−IIのNMR構造は、2つのグループによって解かれている(Terasawaら(1994)EMBO J.13(23):5590−7;Torresら(1995)J.Mol.Biol.248(2):385−401)(例えば、Protein Data Bank記録1IGLを参照のこと)。IGF−II構造の一般的な特徴は、IGF−Iおよびインスリンと類似である。IGF−IIのAドメインおよびBドメインは、インスリンのA鎖およびB鎖に対応する。2次構造特徴は、残基26〜28中の短いβ鎖へと残基22〜25の逆行ターンによって接続される、B領域の残基11〜21からのαヘリックスを含む。残基25〜27は、小さい逆平行βシートを形成するようであり;残基59〜61および残基26〜28はまた、分子間βシート形成に関与し得る。IGF−IIのAドメインにおいて、αヘリックスは、B−ドメインヘリックスと垂直な逆平行立体配置に配置される残基42〜49および53〜59におよぶ。3つのジスルフィド架橋のうちの2つおよび保存された疎水性残基によって形成される疎水性クラスターは、これらの2次構造特徴を安定化する。N末端およびC末端は、残基31〜40の間の領域として不充分に規定されたままである。
IGF−IIのNMR構造は、2つのグループによって解かれている(Terasawaら(1994)EMBO J.13(23):5590−7;Torresら(1995)J.Mol.Biol.248(2):385−401)(例えば、Protein Data Bank記録1IGLを参照のこと)。IGF−II構造の一般的な特徴は、IGF−Iおよびインスリンと類似である。IGF−IIのAドメインおよびBドメインは、インスリンのA鎖およびB鎖に対応する。2次構造特徴は、残基26〜28中の短いβ鎖へと残基22〜25の逆行ターンによって接続される、B領域の残基11〜21からのαヘリックスを含む。残基25〜27は、小さい逆平行βシートを形成するようであり;残基59〜61および残基26〜28はまた、分子間βシート形成に関与し得る。IGF−IIのAドメインにおいて、αヘリックスは、B−ドメインヘリックスと垂直な逆平行立体配置に配置される残基42〜49および53〜59におよぶ。3つのジスルフィド架橋のうちの2つおよび保存された疎水性残基によって形成される疎水性クラスターは、これらの2次構造特徴を安定化する。N末端およびC末端は、残基31〜40の間の領域として不充分に規定されたままである。
IGF−IIは、比較的高い親和性でIGF−II/M6PおよびIGF−Iレセプターに結合し、そしてインスリンレセプターへはより低い親和性で結合する。IGF−IIはまた、多くの血清IGFBPと相互作用し得る。
(IGF−II/M6Pレセプターへの結合)
IGF−IIの残基48〜50(Phe Arg Ser)の、インスリン由来の対応する残基(Thr Ser Ile)での置換、または残基54〜55(Ala Leu)の、IGF−I由来の対応する残基(Arg Arg)での置換は、IGF−II/M6Pレセプターへの減少された結合を生じるが、IGF−Iおよびインスリンレセプターへの結合は保持する(Sakanoら(1991)J.Biol.Chem.266(31):20626−35)。
IGF−IIの残基48〜50(Phe Arg Ser)の、インスリン由来の対応する残基(Thr Ser Ile)での置換、または残基54〜55(Ala Leu)の、IGF−I由来の対応する残基(Arg Arg)での置換は、IGF−II/M6Pレセプターへの減少された結合を生じるが、IGF−Iおよびインスリンレセプターへの結合は保持する(Sakanoら(1991)J.Biol.Chem.266(31):20626−35)。
IGF−IおよびIGF−IIは、残基48〜50の領域における同一の配列および構造を共有するが、IGF−IIレセプターについての親和性においては1000倍もの差異を有する。このNMR構造は、IGF−IIの残基53〜58(IGF−Iの残基54〜59)の領域におけるIGF−IとIGF−IIとの間の構造的差異を表し:このαヘリックスは、IGF−IにおいてよりもIGF−IIにおいてよりよく規定され、そしてIGF−Iとは異なり、残基53と54の周りの骨格に曲がりが存在しない(Torresら(1995)J.Mol.Biol.248(2):385−401)。この構造的差異は、IGF−IIにおけるAla54およびLeu55のIGF−IにおけるArg55とArg56での置換と相関する。IGF−IIレセプターへの結合が、この領域における荷電した残基の存在によって直接的に破壊されることか、または荷電した残基によって引き起こされる構造中の変化が、IGF−IIレセプターに対する結合における変化を生じることのいずれかが可能である。いずれの場合においても、IGF−I中の2つのArg残基の非荷電残基での置換は、IGF−IIレセプターについてのより高い親和性を生じた(Cacciariら(1987)Pediatrician 14(3):146−53)。従って、これらの位置における正に荷電した残基の存在は、IGF−IIレセプターへの結合の喪失と関連する。
IGF−IIは、カチオン非依存性M6Pレセプターのリピート11に結合する。実際に、リピート11のみがカチオン非依存性M6Pレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されるミニレセプターは、(全長レセプターの約10分の1の親和性で)IGF−IIに結合し得、かつIGF−IIの内在化およびリソソームへの、その送達を媒介し得る(Grimmeら(2000)J.Biol.Chem.275(43):33697−33703)。M6Pレセプターのドメイン11の構造は公知である(タンパク質データベース登録番号1GP0および1GP3;Brownら(2002)EMBO J.21(5):1054−1062)。この推定IGF−II結合部位は、IGF−IIの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり;IGF−IIの候補アミノ酸としては、ロイシン8、フェニルアラニン48、アラニン54、およびロイシン55が挙げられる。リピート11は、IGF−II結合には十分であるが、構築物は、カチオン非依存性M6Pレセプターのより大きい部分(例えば、リピート10〜13、または1〜15)を含み、一般的により大きい親和性で、および増加されたpH依存性でIGF−IIに結合する(例えば、Linnellら(2001)J.Biol.Chem.276(26):23986−23991を参照のこと)。
(IGF−Iレセプターへの結合)
IGF−IIの残基Tyr27をLeuで、Leu43をValでまたはSer26をPheでの置換は、IGF−Iレセプターに対するIGF−IIの親和性を、それぞれ94倍、56倍、および4倍、減少させる(Torresら(1995)J.Mol.Biol.248(2):385−401)。ヒトIGF−IIの残基1〜7の欠失は、ヒトIGF−Iレセプターに対する親和性において30倍の減少を生じ、そしてラットIGF−IIレセプターに対する親和性において随伴性の12倍の増加を生じた(Hashimotoら(1995)J.Biol.Chem.270(30):18013−8)。IGF−IIのNMR構造は、Thr7が、残基48Pheおよび50Serの近く、ならびに9Cys−47Cysジスルフィド架橋の近くに位置することを示す。これらの残基とのThr7の相互作用は、IGF−Iレセプター結合に必要な可撓性のN−末端ヘキサペプチドを安定化し得ることが考えられる(Terasawaら(1994)EMBO J.13(23)5590−7)。同時に、この相互作用は、IGF−IIレセプターへの結合を調節し得る。IGF−IIのC末端(残基62〜67)の短縮はまた、IGF−Iレセプターに対するIGF−IIの親和性を5倍低くするようである(Rothら(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181(2):907−14)。
IGF−IIの残基Tyr27をLeuで、Leu43をValでまたはSer26をPheでの置換は、IGF−Iレセプターに対するIGF−IIの親和性を、それぞれ94倍、56倍、および4倍、減少させる(Torresら(1995)J.Mol.Biol.248(2):385−401)。ヒトIGF−IIの残基1〜7の欠失は、ヒトIGF−Iレセプターに対する親和性において30倍の減少を生じ、そしてラットIGF−IIレセプターに対する親和性において随伴性の12倍の増加を生じた(Hashimotoら(1995)J.Biol.Chem.270(30):18013−8)。IGF−IIのNMR構造は、Thr7が、残基48Pheおよび50Serの近く、ならびに9Cys−47Cysジスルフィド架橋の近くに位置することを示す。これらの残基とのThr7の相互作用は、IGF−Iレセプター結合に必要な可撓性のN−末端ヘキサペプチドを安定化し得ることが考えられる(Terasawaら(1994)EMBO J.13(23)5590−7)。同時に、この相互作用は、IGF−IIレセプターへの結合を調節し得る。IGF−IIのC末端(残基62〜67)の短縮はまた、IGF−Iレセプターに対するIGF−IIの親和性を5倍低くするようである(Rothら(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181(2):907−14)。
(IGF−IIの欠失変異)
IGF−Iおよびカチオン非依存性M6Pレセプターに対する結合表面は、IGF−IIの別々の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトIGF−IIよりも実質的に小さい機能性カチオン非依存性M6P結合ドメインが、構築され得る。例えば、アミノ末端アミノ酸1〜7および/またはカルボキシ末端残基62〜67は、欠失または置換され得る。さらに、アミノ酸29〜40は、ポリペプチドの残りの部分の折りたたみまたはカチオン非依存性M6Pレセプターへの結合を変更することなく除去または置換されるようであり得る。従って、アミノ酸8〜28および41〜61を含む標的化部分が、構築され得る。アミノ酸のこれらのストレッチは、おそらく直接的に結合され得るかまたはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸8〜28および41〜61は、別々のポリペプチド鎖上に提供され得る。IGF−IIと相同であり、そしてIGF−IIの構造に近い3次構造を有するインスリンの匹敵するドメインは、別々のポリペプチド鎖に存在する場合でさえ、適切な3次構造への適切な再折りたたみを可能にする十分な構造情報を有する(Wangら(1991)Trends Biochem.Sci.279−281)。従って、例えば、アミノ酸8〜28、またはその保存的置換改変体は、治療剤に融合され得;生じる融合タンパク質は、アミノ酸41〜61またはその保存的置換改変体と混合され得、そして患者に投与され得る。
IGF−Iおよびカチオン非依存性M6Pレセプターに対する結合表面は、IGF−IIの別々の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトIGF−IIよりも実質的に小さい機能性カチオン非依存性M6P結合ドメインが、構築され得る。例えば、アミノ末端アミノ酸1〜7および/またはカルボキシ末端残基62〜67は、欠失または置換され得る。さらに、アミノ酸29〜40は、ポリペプチドの残りの部分の折りたたみまたはカチオン非依存性M6Pレセプターへの結合を変更することなく除去または置換されるようであり得る。従って、アミノ酸8〜28および41〜61を含む標的化部分が、構築され得る。アミノ酸のこれらのストレッチは、おそらく直接的に結合され得るかまたはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸8〜28および41〜61は、別々のポリペプチド鎖上に提供され得る。IGF−IIと相同であり、そしてIGF−IIの構造に近い3次構造を有するインスリンの匹敵するドメインは、別々のポリペプチド鎖に存在する場合でさえ、適切な3次構造への適切な再折りたたみを可能にする十分な構造情報を有する(Wangら(1991)Trends Biochem.Sci.279−281)。従って、例えば、アミノ酸8〜28、またはその保存的置換改変体は、治療剤に融合され得;生じる融合タンパク質は、アミノ酸41〜61またはその保存的置換改変体と混合され得、そして患者に投与され得る。
(IGF結合タンパク質への結合)
IGF−IIおよび関連する構築物は、IGFBPに対する親和性を減少するように改変され得、それによって、タグ化タンパク質のバイオアベイラビリティーを増加する。
IGF−IIおよび関連する構築物は、IGFBPに対する親和性を減少するように改変され得、それによって、タグ化タンパク質のバイオアベイラビリティーを増加する。
IGF−IIの残基フェニルアラニン26のセリンでの置換は、IGFBP1〜5への結合を、1/5〜1/75に減少させる(Bachら(1993)J.Biol.Chem.268(13):9246−54)。IGF−IIの残基48〜50のスレオニン−セリン−イソロイシンでの置換は、IGFBPの大分部への結合を1/100未満に減少させる(Bachら(1993)J.Biol.Chem.268(13):9246−54);しかし、これらの残基はまた、カチオン非依存性マンノース−6−ホスフェートレセプターへの結合に重要である。IGF−Iレセプターへの結合を破壊するY27L置換は、IGFBP3および酸不安定性サブユニットを有する3次複合体の形成を妨害する(Hashimotoら(1997)J.Biol.Chem.272(44):27936−42);この3次複合体は、循環におけるIGF−IIの大部分を占める(Yuら(1999)J.Clin.Lab Anal.13(4):166−72)。IGF−IIの始めの6残基の欠失はまた、IGFBP結合を妨害する(Luthiら(1992)Eur.J.Biochem.205(2):483−90)。
IGF−IのIGFBPとの相互作用の研究は、さらに、フェニルアラニン16の、セリンでの置換が、2次構造に影響を及ぼさないがIGFBP結合を1/40〜1/300倍の間、減少させることを明らかにした(Mageeら(1999)Biochemistry 38(48):15863−70)。グルタミン酸9の、リジンへの変化はまた、IGFBP結合に有意な減少を生じた。さらに、リジン9/セリン16の2重変異は、IGFBPに対するより低い親和性を示した。これらの変異体は、IGF−IIにおいて以前に試験されていないが、IGF−IおよびIGF−IIのこの領域間の配列の保存は、類似の変異(グルタミン酸12リジン/フェニルアラニン19セリン)がIGF−II中に作製される場合に類似の効果が観察されることを示唆する。
(IGF−IIホモログ)
ヒトIGF−IIのアミノ酸配列またはカチオン非依存性M6Pレセプターへの結合に作用するその一部分は、候補配列が本発明の方法において妥当な成功見込みを有するに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを決定するための参照配列として使用され得る。好ましくは、改変体配列は、ヒトIGF−IIに対して、少なくとも70%類似または60%同一であり、より好ましくは、少なくとも75%類似または65%同一であり、そして最も好ましくは、80%類似または70%同一である。
ヒトIGF−IIのアミノ酸配列またはカチオン非依存性M6Pレセプターへの結合に作用するその一部分は、候補配列が本発明の方法において妥当な成功見込みを有するに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを決定するための参照配列として使用され得る。好ましくは、改変体配列は、ヒトIGF−IIに対して、少なくとも70%類似または60%同一であり、より好ましくは、少なくとも75%類似または65%同一であり、そして最も好ましくは、80%類似または70%同一である。
候補ペプチド領域がヒトIGF−IIに対して必要な百分率の類似性または同一性を有するか否かを決定するために、この候補アミノ酸配列およびヒトIGF−IIは、まず、HenikoffおよびHenikoff(1992)PNAS 89:10915〜10919の図2に記載されるBLOSUM62置換行列と組み合わせた、SmithおよびWaterman(1981)J.Mol.Biol.147:195〜197に記載される動的プログラミングアルゴリズムを用いて整列される。本発明について、ギャップ挿入ペナルティーに対する適切な値は−12であり、そしてギャップ伸長ペナルティーに対する適切な値は−4である。Smith−WatermanのアルゴリズムおよびBLOSUM62行列を使用する整列を実施するコンピュータプログラム(例えば、GCGプログラム一式(Oxford Molecular Group,Oxford,England))は、市販されており、そして当業者によって広範に使用されている。
一旦、候補配列と参照配列との間の整列が作製されると、類似性スコアパーセントが計算され得る。各々の配列の個々のアミノ酸は、互いに対するそれらの類似性に従って順次比較される。2つの整列されたアミノ酸に対応するBLOSUM62行列における値が、ゼロまたは負の数である場合、このペアワイズ類似性スコアはゼロであるか;そうでなければ、このペアワイズ類似性スコアは1.0である。未処理の類似性スコアは、整列されたアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを計算するために、各々の配列の整列されたアミノ酸は、再び順次比較される。アミノ酸が同一でない場合、ペアワイズ同一性スコアはゼロであるか;そうでなければ、ペアワイズ同一性スコアは1.0である。未処理の同一性スコアは、同一の整列アミノ酸の合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性パーセントおよび同一性パーセントを計算する目的で無視される。従って、ギャップペナルティーは、この計算において使用されないが、これらは、最初の整列において使用される。
(IGF−II構造アナログ)
ヒトIGF−IIおよびカチオン非依存性M6Pレセプターの既知の構造は、米国特許第6,226,603号および同第6,273,598号で考察されるようなコンピュータ支援設計原理を用いた、IGF−IIアナログおよび他のカチオン非依存性M6Pレセプター結合タンパク質の設計を可能にする。例えば、IGF−IIの既知の原子座標は、従来のコンピュータモデリングプログラム(例えば、Biosym,Technologies Inc.から市販されるINSIGHTII、DISCOVER、もしくはDELPHI、またはMolecular Simulations,Inc.から市販されるQUANTAもしくはCHARMM)を備えたコンピュータへ提供され得る。これらおよび他のソフトウェアプログラムは、分子構造の解析ならびに構造および分子間相互作用に対する分子的変化の効果を推定するシミュレーションを可能にする。例えば、このソフトウェアは、標的レセプターに対するアナログの親和性を改善する、付加的な分子間の水素結合またはイオン結合を形成する能力を有する改変されたアナログを同定するために使用され得る。
ヒトIGF−IIおよびカチオン非依存性M6Pレセプターの既知の構造は、米国特許第6,226,603号および同第6,273,598号で考察されるようなコンピュータ支援設計原理を用いた、IGF−IIアナログおよび他のカチオン非依存性M6Pレセプター結合タンパク質の設計を可能にする。例えば、IGF−IIの既知の原子座標は、従来のコンピュータモデリングプログラム(例えば、Biosym,Technologies Inc.から市販されるINSIGHTII、DISCOVER、もしくはDELPHI、またはMolecular Simulations,Inc.から市販されるQUANTAもしくはCHARMM)を備えたコンピュータへ提供され得る。これらおよび他のソフトウェアプログラムは、分子構造の解析ならびに構造および分子間相互作用に対する分子的変化の効果を推定するシミュレーションを可能にする。例えば、このソフトウェアは、標的レセプターに対するアナログの親和性を改善する、付加的な分子間の水素結合またはイオン結合を形成する能力を有する改変されたアナログを同定するために使用され得る。
ソフトウェアはまた、IGF−IIのカチオン非依存性M6Pレセプター結合面の表面の少なくとも一部に示される同一の特徴を模倣する構造的特徴および化学的特徴を有するペプチドおよび有機分子の設計を可能にする。レセプター結合表面への主な寄与は、レセプター結合表面をともに規定するアミノ酸の側鎖内に存在する化学的に相互作用性の部分の空間的配置であるので、本発明の好ましい実施形態は、IGF−IIのカチオン非依存性M6Pレセプター結合面を構成するアミノ酸側鎖に対して配置された化学的部分の空間的関係を模倣する空間的関係において化学的に相互作用性の部分を保有するフレームワークを有する合成有機分子を設計および作製することに関する。好ましい化学的部分としては、IGF−IIのカチオン非依存性M6Pレセプター結合面を構成するアミノ酸のアミノ酸側鎖によって規定される化学的部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、IGF−IIアナログのレセプター結合表面は、そこに配置されたアミノ酸残基を含む必要はないが、化学部分を含む必要があることが理解される。
例えば、関連する化学基が同定されたら、従来のコンピュータプログラムを使用する当業者は、適切なキャリアフレームワーク上に配置されたレセプター相互作用性化学部分を有する低分子を設計し得る。有用なコンピュータプログラムは、例えば、Dixon(1992)Tibtech 10:357〜363;Tschinkeら(1993)J.Med.Chem.36:3863〜3870;およびEisenら(1994)Proteins:Structure,Function,and Genetics 19:199〜221(これらの開示は、本明細書中に参考として援用される)に記載されている。
「CAVEAT」という名の1つの特定のコンピュータプログラムは、化学部分の望ましい空間的配向を有する構造について、データベース(例えば、Cambridge Structural Database)を検索する(Bartlettら(1989)「Molecular Recognition:Chemical and Biological Problems」(Roberts,S.M.編)182〜196頁)。このCAVEATプログラムは、テンダミスタット(tendamistat)(α−アミラーゼの74残基のインヒビター)の三次元構造における選択されたアミノ酸側鎖の配向に基づいて、テンダミスタットのアナログを設計するために使用されている(Bartlettら(1989)前出)。
あるいは、IGF−IIのカチオン非依存性M6Pレセプター結合活性を模倣する一連のアナログが同定されたら、当業者は、当業者が定量的構造活性関係(QSAR)を開発するのを支援し、そして付加的なモルフォゲンアナログのデノボ設計をさらに支援する、種々のコンピュータプログラムを使用し得る。他の有用なコンピュータプログラムは、例えば、Connolly−Martin(1991)Methods in Enzymology 203:587〜613;Dixon(1992)前出;およびWaszkowyczら(1994)J.Med.Chenm.37:3994〜4002に記載されている。
(標的化部分の親和性)
好ましい標的化部分は、それらの標的レセプターに対してマイクロモル濃度未満の解離定数で結合する。一般的には、より低い解離定数(例えば、10−7M未満、10−8M未満、または10−9M未満)が、ますます好ましい。解離定数の決定は、好ましくは、Linnellら(2001)J.Biol.Chem.276(26):23986〜23991に記載されるように表面プラズモン共鳴によって決定される。標的レセプターの細胞外ドメインの可溶性形態(例えば、カチオン非依存性M6Pレセプターの反復部1〜15)が作製され、そしてアビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定化される。この標的化部分を、チップ上に通過させ、そして速度定数および平衡定数が、チップ表面に関する質量の変化を測定することによって検出および計算される。
好ましい標的化部分は、それらの標的レセプターに対してマイクロモル濃度未満の解離定数で結合する。一般的には、より低い解離定数(例えば、10−7M未満、10−8M未満、または10−9M未満)が、ますます好ましい。解離定数の決定は、好ましくは、Linnellら(2001)J.Biol.Chem.276(26):23986〜23991に記載されるように表面プラズモン共鳴によって決定される。標的レセプターの細胞外ドメインの可溶性形態(例えば、カチオン非依存性M6Pレセプターの反復部1〜15)が作製され、そしてアビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定化される。この標的化部分を、チップ上に通過させ、そして速度定数および平衡定数が、チップ表面に関する質量の変化を測定することによって検出および計算される。
(核酸および発現系)
キメラ融合タンパク質は、インビトロの翻訳系およびインタクトな細胞を含む種々の発現系において発現され得る。M6Pの改変は、標的化のために欠くことができないわけではないので、タンパク質をグリコシル化しない種々の発現系(酵母系、バキュロウイルス系および原核生物系(例えば、E.coli)でさえも含む)は、標的化治療タンパク質の発現に適切である。実際に、グリコシル化されたタンパク質は、肝臓の洞様毛細血管内皮におけるマンノースレセプターに対する結合を介して循環から迅速に除去されるので、グリコシル化されていないタンパク質は、一般的に、改善されたバイオアベイラビリティーを有する。
キメラ融合タンパク質は、インビトロの翻訳系およびインタクトな細胞を含む種々の発現系において発現され得る。M6Pの改変は、標的化のために欠くことができないわけではないので、タンパク質をグリコシル化しない種々の発現系(酵母系、バキュロウイルス系および原核生物系(例えば、E.coli)でさえも含む)は、標的化治療タンパク質の発現に適切である。実際に、グリコシル化されたタンパク質は、肝臓の洞様毛細血管内皮におけるマンノースレセプターに対する結合を介して循環から迅速に除去されるので、グリコシル化されていないタンパク質は、一般的に、改善されたバイオアベイラビリティーを有する。
あるいは、哺乳類細胞発現系におけるキメラ標的化リソソーム酵素の生成は、カチオン非依存性M6Pレセプターに対する複数の結合決定基を有するタンパク質を生成する。2つ以上のカチオン非依存性M6Pレセプターリガンド(例えば、M6PおよびIGF−II、またはM6Pおよびレチノイン酸)間の相乗作用が、利用され得る:多価リガンドは、レセプター架橋によってレセプターに対する結合を増強することが示されている。
一般的には、キメラ治療タンパク質をコードする遺伝子カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、イントロン、またはコドン使用頻度を最適化するためのコード配列における変更を含む最適な発現のために必要な配列を組込むために特定の発現系に対して調整され得る。このタンパク質は、好ましくは、産生細胞から分泌されるので、発現系と適合性のシグナルペプチドをコードするDNAは、内因性シグナルペプチドに対して置換され得る。例えば、LeishmaniaにおいてIGF−IIでタグ化されたβ−グルクロニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼAについて、Leishmaniaシグナルペプチド(GP63またはSAP)をコードするDNAカセットは、最適な発現を達成するために内因性シグナルペプチドをコードするDNAの代わりに挿入される。哺乳類発現系において、内因性シグナルペプチドが利用され得るが、IGF−IIタグがコード配列の5’末端で融合される場合、IGF−IIシグナルペプチドを使用することが所望され得る。
CHO細胞は、治療タンパク質の生成のために好ましい哺乳類宿主である。CHO細胞からの高収率な発現を達成するための伝統的な方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を欠損するCHO細胞株(例えば、CHO株DUKX(O’Dellら(1998)Int.J.Biochem.Cell Biol.30(7):767〜71))を使用することである。CHO細胞のこの株は、増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とする。別個のプラスミドに対してかまたは単一のプラスミドでの、DHFR遺伝子カセットで過剰発現される遺伝子の同時トランスフェクションは、DHFR遺伝子についての選択を可能にし、そして一般的に、選択した組換えタンパク質も発現するクローンの単離を可能にする。例えば、プラスミドpcDNA3は、目的の遺伝子の発現を駆動するためのサイトメガロウイルス(CMV)初期領域調節性領域プロモーターおよびDHFRの発現を促進するためのpSV2DHFRを用いる。組換え遺伝子カセットを有する細胞の、漸増濃度の葉酸アナログメトトレキサートに対する引き続いての曝露は、DHFR遺伝子および同時トランスフェクトされた遺伝子の両方の遺伝子のコピー数の増幅をもたらす。
この系における真核生物発現についての好ましいプラスミドは、CMVのような強力なプロモーターの下流に配置された目的の遺伝子を含む。イントロンは、遺伝子カセットの3’側(flank)に配置され得る。DHFRカセットは、同一のプラスミド由来かまたは別個のプラスミド由来の第2のプロモーターによって駆動され得る。さらに、これは、プラスミド中にさらなる選択マーカー(例えば、G418に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)を組込むために有用であり得る。
あるいは、組換えタンパク質は、エプスタイン−バーウイルス(EBV)複製系に基づく発現系を用いて、ヒトHEK293細胞株中で生成され得る。これは、EBV複製起点oriPおよびEBV ori結合タンパク質EBNA−1から構成される。oriPに対するEBNA−1の結合は、染色体外プラスミドの複製および引き続く増幅を惹起する。この増幅は次に、プラスミド内に収容された遺伝子カセットの高レベルの発現をもたらす。oriPを含むプラスミドは、EBNA−1形質転換HEK293細胞(Invitrogenから市販)中にトランスフェクトされ得るか、または代替的に、EBNA−1の発現を駆動し、そしてEBV oriPを含むプラスミド(例えば、pCEP4(Invitrogenから市販))が利用され得る。
E.coliにおいて、治療タンパク質は、好ましくは、細胞周辺腔中に分泌される。これは、細菌性シグナルペプチド(例えば、ompAシグナル配列)をコードする核酸カセットで、LSDタンパク質の内因性シグナルペプチドをコードするDNAを置換することによって達成され得る。発現は、任意の多くの強力な誘導性プロモーター(例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、またはtacプロモーター)のいずれかによって駆動され得る。1つの適切なベクターは、pBAD/gIII(Invitrogenから市販)であり、これは、Gene IIIシグナルペプチドおよびaraBADプロモーターを使用する。
(インビトロでのリフォールディング)
1つの有用なIGF−II標的化部分は、3つの分子内ジスルフィド結合を有する。E.coliにおけるGILT融合タンパク質(例えば、GUS−GILT)が、構築され得、これは、細胞周辺腔へタンパク質を指向する。別のタンパク質のC末端に融合される場合、IGF−IIは、E.coliのペリプラズムにおいて活性な形態で分泌され得る(Wadenstenら(1991)Biotechnol.Appl.Biochem.13(3):412〜21)。IGF−II部分の最適なフォールディングを容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオンが、好ましくは、細胞性環境にジスルフィド結合形成を促進するために添加される。ジスルフィド結合を有する融合タンパク質が不完全に可溶性である場合、任意の不溶性物質は、好ましくは、変性したタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤(例えば、尿素)で処理され、そして適切なジスルフィド結合の形成を容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオン、または他の酸化剤および還元剤を有する緩衝液中でリフォールドされる(Smithら(1989)J.Biol.Chem.264(16):9314〜21)。例えば、IGF−Iは、IGF−IIの変性および還元のための6Mグアニジン−HClおよび0.1Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン還元剤を用いてリフォールドされている(Yangら(1999)J.Biol.Chem.274(53):37598〜604)。タンパク質のリフォールディングは、1mM酸化型グルタチオン、10mM還元型グルタチオン、0.2M KClおよび1mM EDTAを含有する0.1MTris−HCl緩衝液(pH8.7)中で達成された。
1つの有用なIGF−II標的化部分は、3つの分子内ジスルフィド結合を有する。E.coliにおけるGILT融合タンパク質(例えば、GUS−GILT)が、構築され得、これは、細胞周辺腔へタンパク質を指向する。別のタンパク質のC末端に融合される場合、IGF−IIは、E.coliのペリプラズムにおいて活性な形態で分泌され得る(Wadenstenら(1991)Biotechnol.Appl.Biochem.13(3):412〜21)。IGF−II部分の最適なフォールディングを容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオンが、好ましくは、細胞性環境にジスルフィド結合形成を促進するために添加される。ジスルフィド結合を有する融合タンパク質が不完全に可溶性である場合、任意の不溶性物質は、好ましくは、変性したタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤(例えば、尿素)で処理され、そして適切なジスルフィド結合の形成を容易にするために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオン、または他の酸化剤および還元剤を有する緩衝液中でリフォールドされる(Smithら(1989)J.Biol.Chem.264(16):9314〜21)。例えば、IGF−Iは、IGF−IIの変性および還元のための6Mグアニジン−HClおよび0.1Mトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン還元剤を用いてリフォールドされている(Yangら(1999)J.Biol.Chem.274(53):37598〜604)。タンパク質のリフォールディングは、1mM酸化型グルタチオン、10mM還元型グルタチオン、0.2M KClおよび1mM EDTAを含有する0.1MTris−HCl緩衝液(pH8.7)中で達成された。
(インビボでの発現)
治療タンパク質(好ましくは、分泌される治療タンパク質)をコードする核酸は、疾患で苦しむ患者に直接的に有利に提供され得るか、またはエキソビボでの細胞に続いて、患者にこの生細胞を投与することによって提供され得る。当該分野で公知のインビボでの遺伝子治療法としては、精製されたDNAを(例えば、プラスミド中におけるように)提供すること、ウイルス性ベクターでDNAを提供すること、またはリポソームもしくは他の小胞でDNAを提供することが挙げられる(例えば、遺伝子治療で使用するための脂質キャリアを開示する米国特許第5,827,703号、および遺伝子治療に有用なアデノウイルスベクターを提供する米国特許第6,281,010号を参照のこと)。
治療タンパク質(好ましくは、分泌される治療タンパク質)をコードする核酸は、疾患で苦しむ患者に直接的に有利に提供され得るか、またはエキソビボでの細胞に続いて、患者にこの生細胞を投与することによって提供され得る。当該分野で公知のインビボでの遺伝子治療法としては、精製されたDNAを(例えば、プラスミド中におけるように)提供すること、ウイルス性ベクターでDNAを提供すること、またはリポソームもしくは他の小胞でDNAを提供することが挙げられる(例えば、遺伝子治療で使用するための脂質キャリアを開示する米国特許第5,827,703号、および遺伝子治療に有用なアデノウイルスベクターを提供する米国特許第6,281,010号を参照のこと)。
組換えタンパク質を発現するために改変された細胞を移植することによって疾患を処置するための方法はまた周知である。例えば、ヒトへの導入のために始原ヒト細胞への核酸を導入するための方法を開示している米国特許第5,399,346号を参照のこと。エキソビボでの治療のためのヒト細胞の使用は、いくつかの実施形態において好ましいが、他の細胞(例えば、細菌性細胞)が、患者の脈管構造に移植されて、連続的に治療剤を放出し得る。例えば、米国特許第4,309,776号および同第5,704,910号を参照のこと。
本発明の方法は、精製工程を必要とすることなく、亜細胞区画に直接的にタンパク質を標的化するために特に有用である。1つの実施形態において、IGF−II融合タンパク質は、宿主に投与される共生または弱毒化した寄生生物中で発現される。発現されたIGF−II融合タンパク質は、この生物によって分泌され、宿主細胞によって取り込まれ、そして宿主細胞のリソソームに標的化される。
本発明のいくつかの実施形態において、GILTタンパク質は、感染したマクロファージのリソソームへこのタンパク質を分泌する生きたLeishmaniaを介してインサイチュで送達される。この小器官から、このタンパク質はその細胞を離れ、そしてそのマクロファージの直系でない隣接細胞によって取り込まれる。従って、GILTタグおよび治療剤は、このタンパク質が、マクロファージリソソーム中に存在する間、必然的にインタクトなままである。よって、GILTタンパク質がインサイチュで発現される場合、これらは、好ましくは、リソソームの環境との適合性を確実にするために改変される。ヒト−β−グルクロニダーゼ(ヒト「GUS」)(例示的な治療部分)は、通常、リソソームにおいてか、またはリソソームへの輸送の間のいずれかでC末端ペプチド切断を受ける(例えば、GUSにおける残基633と残基634との間)。従って、GUS−GILT構築物がマクロファージリソソームにおいてLeishmaniaによって発現される実施形態において、ヒトGUSが、好ましくは、このタンパク質に切断に対する耐性を与えるために改変されるか、または残基633に続く残基が、好ましくは、GILT融合タンパク質から単に取り除かれる。同様に、IGF−II(例示的な標的化部分)が、好ましくは、タンパク質分解に対するその耐性を増加させるために改変されるか、または最小の結合ペプチド(例えば、ファージディスプレイまたは酵母ツーハイブリッドによって同定されるような)が、野生型IGF−II部分に対して置換される。
(投与)
本発明に従って発見された標的化治療剤は、任意の経路によって哺乳類宿主に投与され得る。従って、必要に応じて、投与は、経口、または静脈内および腹腔内の投与経路を含む非経口であり得る。さらに、投与は、治療剤のボーラスの定期的な注射によってであり得るか、または外部(例えば、i.v.バッグ)であるレザバからの静脈内もしくは腹腔内の投与によってより連続的になされ得る。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、製薬等級であり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与のために要求される純度の規格および品質管理に従う。獣医学の適用もまた、本明細書中で使用されるような意図される意義の範囲内である。
本発明に従って発見された標的化治療剤は、任意の経路によって哺乳類宿主に投与され得る。従って、必要に応じて、投与は、経口、または静脈内および腹腔内の投与経路を含む非経口であり得る。さらに、投与は、治療剤のボーラスの定期的な注射によってであり得るか、または外部(例えば、i.v.バッグ)であるレザバからの静脈内もしくは腹腔内の投与によってより連続的になされ得る。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、製薬等級であり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与のために要求される純度の規格および品質管理に従う。獣医学の適用もまた、本明細書中で使用されるような意図される意義の範囲内である。
本発明に従う治療剤の獣医学的使用およびヒト医学的使用のための両方の処方物は、代表的には、そのための薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の成分と関連してこのような治療剤を含む。キャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに有害でないという意味で「受容可能」であり得る。この点で、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的投与に適合性の任意ならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である範囲以外で、この組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物(本発明に従って同定され、そして/または当該分野で公知である)もまたこの組成物中に組込まれ得る。処方物は、都合よく、投薬単位形態で提示され得、そして薬学/微生物学の当該分野において周知の任意の方法によって調製され得る。一般的には、いくつかの処方物は、治療剤を液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたは両方と関連させ、必要に応じて、次いで所望の処方物に生成物を形づくることによって調製される。
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、経口または非経口(例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮(局所)、経粘膜、および直腸の投与)が挙げられる。非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る:滅菌した希釈剤(例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒);抗菌剤(例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン);抗酸化剤(アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム);キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸);緩衝液(例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート)および張度の調整のための薬剤(例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖)。pHは、酸または塩基(例えば、塩酸または水酸化ナトリウム)で調整され得る。
経口投与または非経口投与のための有用な溶液は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,(Gennaro,A.編),Mack Pub.,1990に記載される、製薬分野において周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方物はまた、頬側投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチラート、または膣投与のためのクエン酸(cutric acid)を含み得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジもしくは複数回投与バイアル中に封入され得る。直腸投与のための座剤はまた、薬物を非刺激性の賦形剤(例えば、カカオ脂、他のグリセリド、または室温で固体であり、そして体温で液体である他の組成物)と混合することによって調製され得る。処方物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリエチレングリコール)、植物起源のオイル、水素添加されたナフタレンなどを含み得る。直接投与のための処方物は、グリセロールおよび高粘度の他の組成物を含み得る。これらの治療剤について他の潜在的に有用な非経口キャリアとしては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含み得るか、または例えば、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液、または点鼻剤の形態での投与のための油性溶液、または鼻腔内に塗布するためのゲルとしてであり得る。保持浣腸もまた、直腸送達のために使用され得る。
経口投与のために適切な本発明の処方物は、別個の単位の形態(例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、薬袋(sachet)、錠剤、トローチ、または口内錠(各々が所定量の薬物を含む));散剤または顆粒剤の形態;水性液体または非水性液体中の溶液もしくは懸濁液の形態;あるいは水中油乳剤または油中水乳剤の形態であり得る。この治療剤はまた、ボーラス、舐剤またはパスタ剤の形態で投与され得る。錠剤は、薬物を、必要に応じて1つ以上の副成分とともに、圧縮するかまたは成形することによって作製され得る。圧縮された錠剤は、自由に流れる形態(例えば、散剤または顆粒剤)における薬物を適切な機械で、必要に応じて、結合剤、潤沢剤、不活性な希釈剤、界面活性剤または分散剤で混合されて、圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の薬物および適切なキャリアの混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。
経口組成物は、一般には、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤とともに組込まれ得る。うがい薬として使用するために流体キャリアを用いて調製される経口組成物は、流体キャリア中に化合物を含み、そして経口的に適用され、音を立てられ、そして吐かれるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および/またはアジュバント物質は、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の賦形剤、または同様な性質の化合物を含み得る:結合剤(例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン);賦形剤(例えば、スターチまたはラクトース);崩壊剤(例えば、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチ);潤沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはSterote);潤滑剤(glidant)(例えば、コロイド状二酸化ケイ素);甘味剤(例えば、スクロースまたはサッカリン);または香味剤(例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料)。
注射可能な使用に適切な薬学的組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散系の即席調製物のための、滅菌された水溶液(水溶性の場合)または分散系および滅菌された散剤を包含する。静脈投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌性水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、滅菌され得、容易に注射可能である程度に、流動性であり得る。この組成物は、製造および保存の条件下で安定であり得、微生物(例えば、細菌および真菌)の汚染作用に対して保存され得る。このキャリアは、溶媒または分散系媒体であり得、これらとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング(例えば、レシチン)の使用によって、分散系の場合に必要な分子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなど)によって達成され得る。多くの場合において、等張剤(例えば、糖、ポリアルコール(例えば、マンニトール)、ソルビトール、および組成物中の塩化ナトリウム)を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間の吸収性は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を含めることによって成し遂げられ得る。
滅菌された注射可能な溶液は、1つまたは上に列挙された成分の組合せを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組込むことによって調製され得、必要な場合、続いて、フィルター濾過を行う。一般的に、分散系は、滅菌されたビヒクル中に活性化合物を組込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体および上記に列挙される成分から必要な他の成分を含む。滅菌された注射可能な溶液の調製物について滅菌された散剤の場合、調製の方法は、活性成分の散剤および前に濾過滅菌されたこの成分の溶液からの任意のさらなる成分の散剤を生じる真空乾燥工程および凍結乾燥工程を包含する。
関節内投与に適した処方物は、微晶質形態であり得る、滅菌された水性治療調製物の形態、例えば、水性微晶質懸濁物の形態であり得る。リポソーム処方物または生体分解性ポリマー系はまた、関節内投与および眼内投与の両方に関する治療剤を提供するために使用され得る。
局所投与(眼の処置を含む)に適切な処方物としては、液体調製物または半液体調製物(例えば、リニメント、ローション、ゲル、散布剤、水中油または油中水エマルジョン(例えば、クリーム、軟膏またはペースト);あるいは溶液または懸濁液(例えば、ドロップ))が挙げられる。皮膚表面への局所投与のための処方物は、皮膚科学的に受容可能なキャリア(例えば、ローション、クリーム、軟膏または石鹸)を有する治療剤を散布することによって調製され得る。いくつの実施形態において、塗布を局在化し除去を防止するために、皮膚の上にフィルムまたは層を形成することが可能なキャリアが、有用である。組織の表面への接着が所望される場合、組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン組成物または他の生体接着剤中に分散する治療剤を含有し得る。次いで、治療剤は、所望される組織表面に、塗布(paint)されるか、スプレーされるかまたはそうでなければ塗布(apply)され得る。内部組織表面への局所投与について、薬剤は、液体組織接着剤または組織表面への吸着を強化することが公知である他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン/トロンビン溶液が、有利に使用され得る。あるいは、組織コーティング溶液(例えば、ペクチン含有処方物)が使用され得る。
吸入処置(例えば、喘息に対する)について、スプレー缶、ネブライザ、またはアトマイザで分配された散剤(自己推進処方物またはスプレー処方物)の吸入が、使用され得る。そのような処方物は、散剤吸入デバイスからの肺投与のための微細に粉砕された散剤の形態または自己推進散剤分配処方物の形態であり得る。自己推進溶液およびスプレー処方物の場合、効果は、所望のスプレー特性(すなわち、所望の粒子径を有するスプレーを生成し得る特性)を有するバルブの選択によってかまたは制御された粒子径の懸濁された散剤として活性成分を組込むことによってのいずれかで達成され得る。吸入による投与に関して、治療剤はまた、適切な推進剤(例えば、気体(例えば、二酸化炭素)、またはネブライザ)を含む、加圧容器またはディスペンサから、エアロゾルスプレー形態で送達され得る。点鼻薬もまた使用され得る。
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段であり得る。経粘膜的投与または経皮的投与に関して、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤を、処方物に使用する。このような浸透剤は、当該分野で一般的に公知であり、そのような浸透剤としては、例えば、経粘膜的投与については、界面活性剤、胆汁塩、およびフィルシジン酸誘導体が挙げられる。経皮的投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成され得る。経皮的投与に関して、治療剤は、代表的には、当該分野で一般的に公知である軟膏(ointment)、軟膏(salve)、ゲル、またはクリーム中に処方される。
1つの実施形態では、治療剤は、身体からの急速な排除を保護する、キャリア(例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出処方)と共に調製される。生分解性の、生体適合性ポリマー(例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸)が用いられ得る。このような処方物の調製方法は、当業者に理解される。材料もまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から市販のものを入手し得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ミクロソールおよび微粒子もまた、使用され得る。
経口組成物または非経口組成物は、投与を容易にするおよび投薬を均一にするために、投薬単位形態で処方され得る。投薬単位形態とは、単一の投薬として、処置されるべき被験体に適した物理的に分散した単位をいい;各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての仕様は、個体の処置のための活性化合物のように、活性化合物の固有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに配合の分野に固有の制限によって、およびこれらに直接的に依存して、決定される。
一般的に、本発明に従って同定された治療剤は、例えば、治療的に有効な量(例えば、適切な濃度の薬物を標的組織に対して、所望の効果を誘導するのに十分な時間提供する量)で、ヒトまたは他の哺乳動物に対する非経口投与または経口投与のために処方され得る。さらに、本発明の治療剤は、単独、または特定の疾患もしくは目的の症状に対する有益な効果を有することが公知の他の分子との組み合わせで投与され得る。単なる例示として、有用な補因子としては、症状緩和補因子(消毒剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む)、ならびに鎮痛剤および麻酔剤が挙げられる。
治療組成物中に送達されるべきである本発明に従って同定された治療剤の有効濃度は、投与される薬物の最終の所望の投薬量および投与の経路を含む、多数の因子に依存して変化する。投与される好ましい投薬量はまた、処置される疾患または症状の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達される治療剤の相対的な生物学的効力、治療剤の処方、処方物中の賦形剤の存在および型、ならびに投与の経路のような変動に依存すると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明の治療剤は、最も最近に記載された非ヒト霊長類およびげっ歯類を用いた哺乳動物研究から推定された代表的な投薬単位を用いて個体に提供され得る。上記のように、投薬単位は、単一性(すなわち、患者に投与され得る単回用量、および治療剤自体または固体もしくは液体の薬学的希釈剤もしくはキャリアとの混合物のいずれかを含む、生理学的および生物学的に安定な単位用量として残る、容易に扱われかつ充填され得る単回用量)をいう。
特定の実施形態では、生物は、本発明に従って同定された治療剤を産生するように操作される。これらの生物は、収集するために治療剤を放出し得るか、または患者に直接導入され得る。別の一連の実施形態では、細胞を利用して、本発明に従って同定された治療剤のキャリアとして作用し得る。
本発明の治療剤としてはまた、「プロドラッグ」誘導体が挙げられる。用語プロドラッグは、活性成分を放出または活性化する生物内で自発的かまたは酵素学的かのいずれかで生体内変化を必要とする親分子の、薬理学的に不活性な(または部分的に不活性な)誘導体をいう。プロドラッグは、代謝条件の下で切断可能な基を有する本発明の治療剤の改変体または誘導体である。プロドラッグは、これらが生理学的条件下で加溶媒分化を受けるか、または酵素分解を受ける場合、インビボで薬学的に活性である本発明の治療剤となる。本発明のプロドラッグは、生物内の活性な薬物成分を放出もしくは活性化するために必要とされる多数の生体内変化に依存して、単一、二重、三重などと呼ばれ得、そして、このことは、前駆体型形態で存在する官能基の数を示す。プロドラッグ形態は、しばしば、哺乳動物生物において、可溶性、組織適合性、または遅延された放出の利点を提供する(Bundgard,Design of Prodrugs,7−9頁,21−24頁,Elsevier,Amsterdam 1985およびSilverman,The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action,352−401頁,Academic Press,San Diego,Calif.,1992を参照のこと)。さらに、本発明に従うプロドラッグ誘導体は、バイオアベイラビリティーを増大させる他の特徴と組合され得る。
(実施例1.GILT構築物)
IGF−IIカセットを、一連の重複するオリゴの連結により合成し、そしてPir1−SAT(標準的なLeishmania発現ベクター)中にクローン化した。4つのIGF−IIカセットを作製した:1つは、野生型の成熟ポリペプチドをコードし、1つはΔ1−7欠失を有し、1つはY27L変異を有し、そして1つは両方の変異を有する。これらの変異は、他のレセプターに対するIGF−IIの結合を減少させるが、M6Pレセプターに対する結合を生じないことが報告されている。
IGF−IIカセットを、一連の重複するオリゴの連結により合成し、そしてPir1−SAT(標準的なLeishmania発現ベクター)中にクローン化した。4つのIGF−IIカセットを作製した:1つは、野生型の成熟ポリペプチドをコードし、1つはΔ1−7欠失を有し、1つはY27L変異を有し、そして1つは両方の変異を有する。これらの変異は、他のレセプターに対するIGF−IIの結合を減少させるが、M6Pレセプターに対する結合を生じないことが報告されている。
ヒトIGF−IIのコード配列を、図1に示す。タンパク質は、アミノ末端に24個の単一のペプチド、および89個のアミノ酸のカルボキシ末端領域を有するプレ−プロ−タンパク質として合成され、これらの両方は、O’Dellら(1998)Int.J.Biochem Cell Biol.30(7):767−71に総説されるように、翻訳後に取り除かれる。成熟タンパク質は、67個のアミノ酸である。変異体IGF−IIのLeishmaniaコドン最適化バージョンは、図2に示される(Langfordら(1992)Exp.Parasitol 74(3):360−1)。このカセットを、重複するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより構築した。このオリゴヌクレオチドの配列を、表2に示す。変異体ポリペプチドのアミノ酸1〜7の欠失(Δ1−7)、チロシンからロイシンへの残基27の変異(Y27L)、または両方の変異(Δ1−7、Y27L)を含むさらなるカセットを、以下に記載されるような、所望のレセプターについてのみ特異性を有するIGF−IIカセットを生じるように作製した。野生型IGF−IIカセットを作製するために、オリゴGILT1−9を、アニーリングおよび連結した。Y27Lカセットを作製するために、オリゴ1、12、3、4、5、16、7、8および9を、アニーリングおよび連結した。連結後、2つのカセットをカラム精製した。野生型カセットおよびY27Lカセットを、オリゴGILT20および10ならびに適切なテンプレートを用いてPCRにより増幅した。Δ1−7欠失を組み込むために、2つのテンプレートを、オリゴGILT11および10を用いて増幅した。得られた4つのIGF−IIカセット(野生型、Y27L、Δ1−7およびY27LΔ1−7)を、カラム精製し、XbaIで消化し、ゲル精製し、そしてXbaIに連結してPir1−SATを切断した。
次いで、遺伝子カセットを、リーディングフレームを保存するような方法でベクター中のXbaIの上流のXmaI部位(示さず)とAscI部位との間にクローニングした。3’XbaI部位の重複するDAMメチラーゼ部位は、クローニングのためのXmaI部位の代わりに5’XbaI部位の使用を可能にした。このAscI部位は、3つのアミノ酸残基のブリッジを加える。
(表3.Pir−GILTベクターの構築に用いたオリゴヌクレオチド)
IGF−IIの殆どの著しい生物学的効果(例えば、その分裂促進効果)は、CIM6P/IGF−IIレセプターよりむしろ、IGF−Iレセプターを介して媒介される((Ludwigら(1995)Trends in Cell Biology 5:202−206)において総説され、(Kornerら(1995)J.Biol.Chem.270(1):287−95)もまた参照のこと)。CIM6P/IGF−IIレセプターに対するIGF−IIの結合の最初の結果は、引き続いての分解のためのリソソームへの輸送であると考えられる。このことは、IGF−IIレベルを制御する重要な手段を表し、そしてなぜCIM6P/IGF−IIレセプターのヌル変異を有するマウスは、IGF−IIがまた欠失されない限り、出生前の死を示すのかを説明する(Lauら(1994)Genes Dev.8(24):2953−63);(Wangら(1994)Nature 372(6505);464−7);(Ludwigら(1996)Dev.Biol.177(2):517−35)。本発明の方法において、IGF−II融合タンパク質をCIM6P/IGF−IIレセプターに結合させることが望ましい。Y27LおよびΔ1−7変異は、CIM6P/IGF−IIレセプターに対するアフィニティーを変化させることなく、IGF−Iおよびインスリンレセプターに対するIGF−II結合を低下させる(Sakanoら(1991)J.Biol.Chem.266(31):20626−35);(Hashimotoら(1995)J.Biol.Chem.270(30):18013−8)。従って、本発明に従って、これらのIGF−IIの変異形態は、CIM6P/IGF−IIレセプターに対して特異的に融合タンパク質を標的化する手段を提供する。
1つの実験において、適切な配列を有する4つの異なるIGF−IIカセット(野生型、Δ1−7、Y27LおよびΔ1−7/Y27L)を作製した。β−GUSカセットを、IGF−IIカセットに融合し、これらの構築物を寄生生物に置いた。α−ガラクトシダーゼカセットもまた、IGF−IIカセットに融合する。GUS融合物を試験し、そして酵素学的に活性なタンパク質を産生することを示した。
図3に示される、1つの好ましい構築物は、L.mexicana分泌酸ホスファターゼ(SAP−1)のシグナルペプチドを含み、単一のSalI部位が除去された改変型Pir1−SATのXbaI部位へとクローニングされる。インフレームで融合されるものは、変異体β−GUS配列であり、これは3つのアミノ酸ブリッジによりIGF−IIタグに接続される。
(実施例2.GILTタンパク質調製)
β−GUSを発現および分泌するL.mexicanaを、100mlのStandard Promastigote培地(40mM HEPES、pH7.5、0.1mM アデニン、0.0005%ヘミン、0.0001%ビオチン、5%ウシ胎児血清、5%胚流体、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよび50μg/mlナルセオスリシン(nourseothricin)を含むM199)中、26℃で増殖させた。約5×106無鞭毛型細胞/mlの密度に到達した後、これら無鞭毛型細胞を、室温で10分間の1000×gにおける遠心分離によって集めた;これらの無鞭毛型細胞を用いて、室温で、1リットルの低タンパク質培地(0.1mMアデニン、0.0001%ビオチン、50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンで補填したM199)に接種した。この1リットルの培養物は、滅菌攪拌バーを備えた2リットルのキャップ付フラスコ中に含められ、この培養物は、穏やかな攪拌とともに26℃でインキュベートされ得た。この1リットルの培養は、層流フード中にそれらを移動させること、キャップを取り除くこと、およびキャップを置き換える前に激しく旋回することにより1日に2度通気した。この培養物が、2−3×107無鞭毛型細胞/mlの密度に到達したとき、上記のようにこの培養物を遠心分離した。ただし、無鞭毛型細胞ペレットは棄て、そして培地は滅菌フラスコにデカントした。1リットルあたり434g(NH4)2SO4の添加は、培地から活性GUSタンパク質を沈殿させ;この塩折培地を4℃で一晩貯蔵した。沈殿したタンパク質を、10,500×gにおける30分間の遠心分離か、またはGelman Supor−800膜を通じる濾過のいずれかにより回収した;このタンパク質を、10mM Tris pH8、1mM CaCl2中に再懸濁し、そして透析まで−80℃で貯蔵した。数リットルの培地からの粗沈殿物を融解し、プールし、透析チューブ(Spectra/Por−7、MWCO 25,000)中に置き、そして2つの1リットル容量の重炭酸塩を含むDMEM(Dulbeccoの改変Eagle培地)に対して一晩透析した。
β−GUSを発現および分泌するL.mexicanaを、100mlのStandard Promastigote培地(40mM HEPES、pH7.5、0.1mM アデニン、0.0005%ヘミン、0.0001%ビオチン、5%ウシ胎児血清、5%胚流体、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよび50μg/mlナルセオスリシン(nourseothricin)を含むM199)中、26℃で増殖させた。約5×106無鞭毛型細胞/mlの密度に到達した後、これら無鞭毛型細胞を、室温で10分間の1000×gにおける遠心分離によって集めた;これらの無鞭毛型細胞を用いて、室温で、1リットルの低タンパク質培地(0.1mMアデニン、0.0001%ビオチン、50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンで補填したM199)に接種した。この1リットルの培養物は、滅菌攪拌バーを備えた2リットルのキャップ付フラスコ中に含められ、この培養物は、穏やかな攪拌とともに26℃でインキュベートされ得た。この1リットルの培養は、層流フード中にそれらを移動させること、キャップを取り除くこと、およびキャップを置き換える前に激しく旋回することにより1日に2度通気した。この培養物が、2−3×107無鞭毛型細胞/mlの密度に到達したとき、上記のようにこの培養物を遠心分離した。ただし、無鞭毛型細胞ペレットは棄て、そして培地は滅菌フラスコにデカントした。1リットルあたり434g(NH4)2SO4の添加は、培地から活性GUSタンパク質を沈殿させ;この塩折培地を4℃で一晩貯蔵した。沈殿したタンパク質を、10,500×gにおける30分間の遠心分離か、またはGelman Supor−800膜を通じる濾過のいずれかにより回収した;このタンパク質を、10mM Tris pH8、1mM CaCl2中に再懸濁し、そして透析まで−80℃で貯蔵した。数リットルの培地からの粗沈殿物を融解し、プールし、透析チューブ(Spectra/Por−7、MWCO 25,000)中に置き、そして2つの1リットル容量の重炭酸塩を含むDMEM(Dulbeccoの改変Eagle培地)に対して一晩透析した。
(実施例3.GILT取り込みアッセイ)
皮膚線維芽細胞株GM4668(ヒト、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)は、VII型ムコ多糖体沈着症の患者由来である;従って、細胞は、β−GUS活性をほとんど有さないかまたはそれを有さない。従って、GM4668細胞は、ヒト細胞中へのGUS−GILT構築物の取り込みを試験するために特に有用である。GM4668細胞を、12ウェル組織培養プレート中、15%(v/v)子ウシ血清を補填したDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)で、5%CO2中37℃で培養した。線維芽細胞は、実施例2で記載のように調製された、Leishmaniaで発現したヒトβ−グルクロニダーゼ(GUS)、GUS−IGF−II融合タンパク質(GUS−GILT)、または変異体GUS−IGF−II融合タンパク質(GUSΔ−GILT)の約150単位の存在下で一晩培養した。コントロールウェルは、添加された酵素を含まなかった(DMEM培地ブランク)。インキュベーションの後、培地をウェルから取り除き、そしてGUS活性を3回重複してアッセイした。ウェルを、1mlの37℃のリン酸緩衝化生理食塩水で5回洗浄し、次に0.2mlの溶解緩衝液(10mM Tris pH7.5、100mM NaCl、5mM EDTA、2mM 4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライドハイドロクロライド(AEBSF、Sigma)、および1% NP−40)中、室温で15分間インキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心チューブに移し、次に13,000rmpで5分間遠心分離し、細胞残渣を取り除いた。溶解物の3つの10μLのアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした(Pierce Micro BCAタンパク質アッセイ、Pierce、IL)。
皮膚線維芽細胞株GM4668(ヒト、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)は、VII型ムコ多糖体沈着症の患者由来である;従って、細胞は、β−GUS活性をほとんど有さないかまたはそれを有さない。従って、GM4668細胞は、ヒト細胞中へのGUS−GILT構築物の取り込みを試験するために特に有用である。GM4668細胞を、12ウェル組織培養プレート中、15%(v/v)子ウシ血清を補填したDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)で、5%CO2中37℃で培養した。線維芽細胞は、実施例2で記載のように調製された、Leishmaniaで発現したヒトβ−グルクロニダーゼ(GUS)、GUS−IGF−II融合タンパク質(GUS−GILT)、または変異体GUS−IGF−II融合タンパク質(GUSΔ−GILT)の約150単位の存在下で一晩培養した。コントロールウェルは、添加された酵素を含まなかった(DMEM培地ブランク)。インキュベーションの後、培地をウェルから取り除き、そしてGUS活性を3回重複してアッセイした。ウェルを、1mlの37℃のリン酸緩衝化生理食塩水で5回洗浄し、次に0.2mlの溶解緩衝液(10mM Tris pH7.5、100mM NaCl、5mM EDTA、2mM 4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライドハイドロクロライド(AEBSF、Sigma)、および1% NP−40)中、室温で15分間インキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心チューブに移し、次に13,000rmpで5分間遠心分離し、細胞残渣を取り除いた。溶解物の3つの10μLのアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした(Pierce Micro BCAタンパク質アッセイ、Pierce、IL)。
溶解物の3つの38μLのアリコートを、(Wolfeら(1996)Protocols for Gene Transfer in Neuroscience:Towards Gene Therapy of Neurological Disorders 263−274)から適合された標準的な蛍光定量的アッセイを用いて、GUS活性についてアッセイした。アッセイは、廃棄可能な蛍光定量キュベット中で行なう。150μlの反応混合物を各キュベットに添加する。1mlの反応混合物は、860μlのH2O、100μlの1M酢酸ナトリウム、40μlの25×β−GUS基質混合物である。25×β−GUS基質混合物は、デシケーター中−20℃で貯蔵された4.55mlのエタノール中の250mg 4−メチルウムベリフェリル−β−Dグルクロニドの懸濁物である。38μlのサンプルをこの反応混合物に添加し、そして反応物を37℃でインキュベートする。反応を、2mlの停止溶液(10.6g Na2CO3、12.01g グリシン、H2Oで500mlに、pH10.5)の添加により終結する。次いで、蛍光出力を蛍光定量計で測定する。
取り込み実験の結果は、細胞会合GUS−GILTの量が、非改変GUSのそれより10倍大きいことを示す(図4)。二重変異体構築物は、非改変GUSより約5倍効果的である。これらの結果は、GILT技術が取り込みのためにリソソーム酵素を標的にする効果的な手段であることを示す。取り込みはまた、標準的な免疫蛍光技法を用いて確認され得る。
(実施例4.競争実験)
GILT媒介取り込みが、カチオン非依存性M6Pレセプター上のIGF−II結合性部位を経由して生じることを確認するために、組換えIGF−IIを用いて競争実験を実施した。実験デザインは、GM4668線維芽細胞が、血清を含まないDMEM+2%BSA中で約18時間指定のタンパク質とインキュベートしたことを除いて上記に記載のデザインと同じであった。各β−GUS誘導体を150U/ウェルで添加した。競争のために、2.85μgのIGF−IIを各ウェルに添加した。これは、GILT−GUSに対し約100倍モル過剰に相当し、M6P/IGF−IIレセプターへの結合について競合するに十分な濃度である。
GILT媒介取り込みが、カチオン非依存性M6Pレセプター上のIGF−II結合性部位を経由して生じることを確認するために、組換えIGF−IIを用いて競争実験を実施した。実験デザインは、GM4668線維芽細胞が、血清を含まないDMEM+2%BSA中で約18時間指定のタンパク質とインキュベートしたことを除いて上記に記載のデザインと同じであった。各β−GUS誘導体を150U/ウェルで添加した。競争のために、2.85μgのIGF−IIを各ウェルに添加した。これは、GILT−GUSに対し約100倍モル過剰に相当し、M6P/IGF−IIレセプターへの結合について競合するに十分な濃度である。
競争実験の結果を図5に示す。IGF−IIの非存在下、24単位を超えるGILT−GUS/mg溶解物が検出された。IGF−IIの添加に際し、細胞会合GILT−GUSの量は5.4Uまで落ちた。このレベルは、線維芽細胞により取り込まれる非改変GUSのレベルと同様である。従って、GILTタンパク質取り込みの大部分(bulk)は、IGF−IIによって競争され得、これは、この取り込みが実際に特異的レセプター−リガンド相互作用を通じて生じていることを示す。
(実施例5.血清を含まない培地中の遺伝子産物発現)
発現産物はまた、血清を含まない培地から単離され得る。一般に、発現株を血清を含む培地中で増殖させ、血清を含まない培地中に希釈し、そして発現産物を単離する前に、数世代の間(好ましくは2−5世代)増殖させる。例えば、分泌された標的治療タンパク質の産生は、最初75cm2フラスコ中の50mlの1×M199培地中27℃で培養されるLeishmania mexicana無鞭毛型細胞から単離され得る。細胞密度が1−3×107/mlに達するとき、この培養を用いて1.2LのM199培地に接種する。この培養の密度が約5×106/mlに到達するとき、細胞を遠心分離により回収し、180mlの上清液中に再懸濁し、そして16Lのスピナーフラスコ中の12Lの「Zima」培地に接種するために用いる。この培養の初期細胞密度は、代表的には約5×105/mlである。この培養を、約1.0−1.7×10e7細胞/mlの細胞密度まで増殖させる。この細胞密度に到達するとき、細胞を遠心分離により培養培地から分離し、そして上清液を4℃で0.2μlフィルターを通じて濾過し、残存する無鞭毛型細胞を取り除く。濾過された培地を、タンデム流れ濾過デバイス(MILLIPORE Prep/Scale−TFFカートリッジ)を用いて12.0Lから500mlに濃縮した。
発現産物はまた、血清を含まない培地から単離され得る。一般に、発現株を血清を含む培地中で増殖させ、血清を含まない培地中に希釈し、そして発現産物を単離する前に、数世代の間(好ましくは2−5世代)増殖させる。例えば、分泌された標的治療タンパク質の産生は、最初75cm2フラスコ中の50mlの1×M199培地中27℃で培養されるLeishmania mexicana無鞭毛型細胞から単離され得る。細胞密度が1−3×107/mlに達するとき、この培養を用いて1.2LのM199培地に接種する。この培養の密度が約5×106/mlに到達するとき、細胞を遠心分離により回収し、180mlの上清液中に再懸濁し、そして16Lのスピナーフラスコ中の12Lの「Zima」培地に接種するために用いる。この培養の初期細胞密度は、代表的には約5×105/mlである。この培養を、約1.0−1.7×10e7細胞/mlの細胞密度まで増殖させる。この細胞密度に到達するとき、細胞を遠心分離により培養培地から分離し、そして上清液を4℃で0.2μlフィルターを通じて濾過し、残存する無鞭毛型細胞を取り除く。濾過された培地を、タンデム流れ濾過デバイス(MILLIPORE Prep/Scale−TFFカートリッジ)を用いて12.0Lから500mlに濃縮した。
この方法のために好適な増殖培地は、M199増殖培地および「Zima」増殖培地である。しかし、その他の血清含有培地および血清非含有培地もまた有用である。M199増殖培地は以下のようである:(1Lバッチ)=200ml 5×M199(フェノールレッドpH指示薬を含む)+637ml H2O、50.0ml FBS、50.0ml EF、20.0mlの50μg/ml SAT、2.0mlの50%トリエタノールアミン中0.25%ヘミン、10mlの50mM Hepes pH7.5中10mM アデニン、40.0mlの1M Hepes pH7.5、1mlの95%エタノール中0.1%ビオチン、10.0mlのペニシリン/ストレプトマイシン。用いたすべての血清は熱により不活性化する。最終容量=1Lそして滅菌濾過する。「Zima」改変M199培地は以下のようである:(20.0Lバッチ)=217.8g M199粉末(−)フェノールレッド+7.0g重炭酸ナトリウム、200.0mlの50mM Hepes pH7.5中10mMアデニン、800.0mlのHepes遊離酸pH7.5、20.0mlの95%エタノール中0.1%ビオチン、200.0mlペニシリン/ストレプトマイシン、最終容量=20.0Lそして滅菌濾過される。
標的治療タンパク質は、好ましくは、ConcanavalinA(ConA)クロマトグラフィーにより精製される。例えば、培養物が1.0×107無鞭毛型細胞/mlを超える密度に到達するとき、L.mexicanaを遠心分離、500×gで10分により取り除く。回収された培養培地を0.2μmフィルターを通過させ、ConA−アガロースカラム(4%架橋ビーズ状アガロース、Sigma)上に直接ロードする前に粒子を取り除く。このConA−アガロースカラムは、1M NaCl、20mM Tris pH7.4、5mMの各CaCl2、MgCl2およびMnCl2で前処理し、そして次に5容量のカラム緩衝液(20mM Tris pH7.4、1mM CaCl2、および1mM MnCl2、および1mM MnCl2)で平衡化されている。培養培地中の合計179,800単位(nmol/時間)のGUS活性(2L中)を、22mlのConAアガロースカラム上にロードする。フロースルーまたは洗浄中に活性は検出可能ではない。GUS活性は、200mMメチルマンノピラノシドを含むカラム緩衝液で溶出される。活性ピークを含む溶出フラクションをプールしそして濃縮する。取り込みおよび競争実験を実施例3および4に記載のように実施した。但し、生物は、血清を含まない培地中で増殖させ、そしてConAで精製した;約350−600単位の酵素を線維芽細胞に付与した。結果を図7に示す。
(実施例6.競争物として変性IGF−IIを用いる競争実験)
実施例4における実験を、競争物として正常または変性IGF−IIのいずれかを用いて繰り返す。実施例4におけるように、細胞会合GUS−GILTの量は、競争に効果的である正常IGF−II濃度と同時インキュベートされるとき減少するが、匹敵する濃度で、変性IGF−IIはほとんど影響を有しないか、または影響を有さない。
実施例4における実験を、競争物として正常または変性IGF−IIのいずれかを用いて繰り返す。実施例4におけるように、細胞会合GUS−GILTの量は、競争に効果的である正常IGF−II濃度と同時インキュベートされるとき減少するが、匹敵する濃度で、変性IGF−IIはほとんど影響を有しないか、または影響を有さない。
(実施例7.結合取り込みおよび半減期の実験)
線維芽細胞上のM6P/IGF−IIレセプターに対するGUS−GILTタンパク質の結合を測定し、そして取り込み速度を公開された方法(Yorkら、(1999)J.Biol.Chem.274(2):1164−71)と同様に検証する。上記のように12ウェル培養ディッシュにおいて培養したGM4668線維芽細胞を、1% BSAを含む、氷冷した無血清培地中で洗浄した。リガンド(GUS、GUS−GILTまたはGUS−ΔGILTのいずれか、あるいはコントロールタンパク質)を冷やした1%BSA添加の無血清培地中の細胞に添加した。リガンド添加の際、プレートを氷上で30分間インキュベートした。30分後、リガンドを除去して、そして細胞を氷冷した培地で素早く5回洗浄した。0時点のウェルに1mlの氷冷ストリップ緩衝液(0.2M 酢酸、pH3.5、0.5M NaCl)を入れる。次いで、プレートを37°の水浴に浮かべて、そして0.5mlの予め加温した培地を添加して、取り込みを開始させる。全ての停止点で、1mlのストリップ緩衝液を添加する。実験終了時に、ストリップ緩衝液のアリコートを、実施例3に記載されるようにβ−グルクロニダーゼ活性の蛍光定量的なアッセイのために保存する。次いで、細胞を上記のように溶解して、そして溶解物をβ−グルクロニダーゼ活性についてアッセイする。
線維芽細胞上のM6P/IGF−IIレセプターに対するGUS−GILTタンパク質の結合を測定し、そして取り込み速度を公開された方法(Yorkら、(1999)J.Biol.Chem.274(2):1164−71)と同様に検証する。上記のように12ウェル培養ディッシュにおいて培養したGM4668線維芽細胞を、1% BSAを含む、氷冷した無血清培地中で洗浄した。リガンド(GUS、GUS−GILTまたはGUS−ΔGILTのいずれか、あるいはコントロールタンパク質)を冷やした1%BSA添加の無血清培地中の細胞に添加した。リガンド添加の際、プレートを氷上で30分間インキュベートした。30分後、リガンドを除去して、そして細胞を氷冷した培地で素早く5回洗浄した。0時点のウェルに1mlの氷冷ストリップ緩衝液(0.2M 酢酸、pH3.5、0.5M NaCl)を入れる。次いで、プレートを37°の水浴に浮かべて、そして0.5mlの予め加温した培地を添加して、取り込みを開始させる。全ての停止点で、1mlのストリップ緩衝液を添加する。実験終了時に、ストリップ緩衝液のアリコートを、実施例3に記載されるようにβ−グルクロニダーゼ活性の蛍光定量的なアッセイのために保存する。次いで、細胞を上記のように溶解して、そして溶解物をβ−グルクロニダーゼ活性についてアッセイする。
一旦、温度を37°に移すと、GUS−GILTが線維芽細胞によって数分以内に直ちに取り込まれる(Yorkら、(1999)J.Biol.Chem.274(2):1164−71)こと、およびその酵素活性が亜細胞で長時間持続することが予想される。
(実施例8.インビボ治療剤)
B6.C−H−2bml/ByBIR−gusmps/+ マウスのヘテロ接合性メイティングによって作製されたGUS欠損マウス(Birkenmeierら(1989)J.Clin.Invest 83(4):1258−6)を使用して、酵素置換治療剤におけるGUS−GILTまたはその誘導体の効果を検証する。2つの形式を使用する。1つの形式では、3〜4匹の動物に、100μlの酵素希釈緩衝液(150mM NaCl、10mM Tris,pH7.5)中の20,000Uの酵素の単回注入を施す。マウスを72〜96時間後に屠殺して、この治療剤の有効性を検証する。2つ目の形式では、マウスに、3〜4週間にわたって20,000Uの毎週投与を施し、そして最終投与の1週間後に屠殺する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、公開された方法(Birkenmeierら(1991)Blood 78(11):3081−92);(Sandsら(1994)J.Clin.Invest 93(6):2324−31);(Dalyら(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5):2296−300)によって実施する。治療剤の非存在下では、GUS欠損マウス細胞(例えば、マクロファージおよびクプファー細胞)は、リソソーム中の廃棄物の蓄積から起因する巨大な亜細胞蓄積区画を発達させる。GUS−GILT構成物で処置されたマウスの細胞において、これらの区画のサイズが見分可能に低下するか、またはこの区画がもはや光学顕微鏡では見えないまでに収縮することが、予想される。
B6.C−H−2bml/ByBIR−gusmps/+ マウスのヘテロ接合性メイティングによって作製されたGUS欠損マウス(Birkenmeierら(1989)J.Clin.Invest 83(4):1258−6)を使用して、酵素置換治療剤におけるGUS−GILTまたはその誘導体の効果を検証する。2つの形式を使用する。1つの形式では、3〜4匹の動物に、100μlの酵素希釈緩衝液(150mM NaCl、10mM Tris,pH7.5)中の20,000Uの酵素の単回注入を施す。マウスを72〜96時間後に屠殺して、この治療剤の有効性を検証する。2つ目の形式では、マウスに、3〜4週間にわたって20,000Uの毎週投与を施し、そして最終投与の1週間後に屠殺する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、公開された方法(Birkenmeierら(1991)Blood 78(11):3081−92);(Sandsら(1994)J.Clin.Invest 93(6):2324−31);(Dalyら(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(5):2296−300)によって実施する。治療剤の非存在下では、GUS欠損マウス細胞(例えば、マクロファージおよびクプファー細胞)は、リソソーム中の廃棄物の蓄積から起因する巨大な亜細胞蓄積区画を発達させる。GUS−GILT構成物で処置されたマウスの細胞において、これらの区画のサイズが見分可能に低下するか、またはこの区画がもはや光学顕微鏡では見えないまでに収縮することが、予想される。
同様に、リソソーム蓄積症を患うヒトを、そのヒトのリソソームに対して適切な治療剤部分を標的化する構成物を使用して処置する。いくつかの例において、処置は、GILTタンパク質の定期的な(例えば、毎週の)注入形態をとる。他の例においては、患者内で、GILTタンパク質のインビボ発現を持続し得る核酸の投与によるか、またはGILTタンパク質を発現する細胞(例えば、ヒト細胞、または単一細胞の器官)の投与により、処置を達成する。例えば、米国特許第6,020,144号(2000年2月1日に公開);米国特許仮出願第60/250,446号;および米国特許仮出願事務所処理番号SYM−005PRA,「Protozoan Expression Systems for Lysosomal Storage Disease Genes」(2001年5月11日出願)に記載されるLeishmaniaベクターを使用して、GILTタンパク質をインサイチュで発現し得る。
(実施例9.)
これらの実験の目的は、ファブリー病の酵素置換治療として、GILT修飾α‐ガラクトシターゼA(α−GAL A)の有効性を評価することである。
これらの実験の目的は、ファブリー病の酵素置換治療として、GILT修飾α‐ガラクトシターゼA(α−GAL A)の有効性を評価することである。
ファブリー病は、α−GAL A(GL−3および他の神経スフィンゴ脂質から末端のガラクトースを除去すること担う酵素)の不十分な活性から起因する、リソソーム蓄積症である。この酵素活性の減少は、X連鎖遺伝子における種々のミスセンス変異およびナンセンス変異に起因して起こる。GL−3の蓄積は、心臓、肝臓、腎臓、皮膚および脳の血管内皮細胞のリソソームにおいて最も優勢であるが、他の細胞および組織においても起こる。血管内皮細胞におけるGL−3の蓄積は、最終的に、心疾患および腎不全を導く。
酵素置換治療は、ファブリー病に対する効果的な処置であり、そしてその成功は、この治療酵素の、GL−3が蓄積する細胞のリソソームによって取り込まれる能力に依存する。Genzyme産物であるFabrazymeは、この実証された有効性に起因してヨーロッパにおいてファブリー病の患者の処置について認可されている、DUKX B11
CHO細胞で生産された組換えα−GAL Aである。
CHO細胞で生産された組換えα−GAL Aである。
Fabrazymeの、細胞により取り込まれる能力、およびリソソームに送達される能力は、N連結した炭水化物上のマンノース 6−ホスフェート(M6P)の存在に起因する。Fabrazymeは、大部分の細胞型の細胞表面に存在する、マンノース−6−ホスフェート/IGF−IIレセプター(M6P/IGF−Iir)との結合、そしてその後のレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して、リソソームへと送達される。Fabrazymeは、報告によると、ASN残基108位、161位および184位に、に3つのN連結性グリコシル化部位を有する。これら3つの位置で優勢な炭水化物は、それぞれ、フコシル化二方向アンテナの二重シアリル化複合体(fucosylated biantennary bisialylated complex)、モノリン酸化マンノース−7 オリゴマンノース、および二重リン酸化マンノース−7 オリゴマンノースである。
本発明のグリコシル化非依存性のリソソーム標的化(GILT)技術は、M6P/IGF−Iirとの異なる相互作用を介して,リソソームに対して治療タンパク質を直接的に標的化する。標的化リガンドは、成熟したヒトIGF−IIに由来し、これはまた、M6P/IGF−Iirに対して高い親和性で結合する。現在の適用において、架橋を含む他の構成が可能であるが、IGF−IIタグは、治療的タンパク質とのc末端融合物として提供される。GILT修飾酵素の亜細胞への取り込みについての能力は、GILT修飾β−グルクロニダーゼを使用して確立され、このGILT修飾β−グルクロニダーゼは、過剰なIGF−IIと競合的であるプロセスにおいて、線維芽細胞によって効率的に取り込みまれる。GILT修飾の利点は、M6P/IGF−IIレセプターへの結合の増加、標的細胞のリソソーム内への取り込みの増強、薬理動態の変更または改善、および組織分布範囲の拡大、変更または改善である。組織分布範囲の改善は、IGFタンパク質が血液脳関門を実際に通過するので、GILT修飾α−GAL Aの血液脳関門を横切る送達を包含し得る。
GILT系の別の利点は、M6P修飾が起こらない非哺乳動物の発現系において、取り込み適合性のタンパク質を生成する能力である。特定の実施形態において、GILT修飾タンパク質は、主に、CHO細胞において生成される。特定の他の実施形態において、このGILTタグは、α−GAL Aのc末端に配置されるが、本発明はこのようには限定されない。
(参考文献による援用)
本明細書中で開示された特許文献、科学的刊行物およびタンパク質データバンクの記録、ならびに米国特許仮出願第60/250,446号(2000年11月30日出願);米国特許仮出願第60/287,531号(2001年4月30日出願);米国特許仮出願第60/290,281号(2001年5月11日出願);米国特許仮出願第60/304,609,(2001年7月10日出願);米国特許仮出願第60/329,461号(2001年10月15日出願);国際特許出願第 PCT/US01/44935号(2001年11月30日出願);米国特許仮出願第60/351,276号(2002年1月23日出願);および米国第10/___号(事務所処理番号SYM−008)(2002年4月30日出願)は、本出願中でこれらの全体が参考として援用される。
本明細書中で開示された特許文献、科学的刊行物およびタンパク質データバンクの記録、ならびに米国特許仮出願第60/250,446号(2000年11月30日出願);米国特許仮出願第60/287,531号(2001年4月30日出願);米国特許仮出願第60/290,281号(2001年5月11日出願);米国特許仮出願第60/304,609,(2001年7月10日出願);米国特許仮出願第60/329,461号(2001年10月15日出願);国際特許出願第 PCT/US01/44935号(2001年11月30日出願);米国特許仮出願第60/351,276号(2002年1月23日出願);および米国第10/___号(事務所処理番号SYM−008)(2002年4月30日出願)は、本出願中でこれらの全体が参考として援用される。
Claims (1)
- 本明細書中に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28753101P | 2001-04-30 | 2001-04-30 | |
US30460901P | 2001-07-10 | 2001-07-10 | |
US32946101P | 2001-10-15 | 2001-10-15 | |
US35127602P | 2002-01-23 | 2002-01-23 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002584862A Division JP4641705B2 (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-30 | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010043103A true JP2010043103A (ja) | 2010-02-25 |
Family
ID=27501465
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002584862A Expired - Lifetime JP4641705B2 (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-30 | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 |
JP2009229060A Pending JP2010043103A (ja) | 2001-04-30 | 2009-09-30 | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002584862A Expired - Lifetime JP4641705B2 (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-30 | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7396811B2 (ja) |
EP (2) | EP1974752B1 (ja) |
JP (2) | JP4641705B2 (ja) |
AT (1) | ATE384736T1 (ja) |
AU (2) | AU2002256423B2 (ja) |
CA (1) | CA2445577C (ja) |
DE (1) | DE60224816T2 (ja) |
ES (1) | ES2300439T3 (ja) |
HK (1) | HK1124549A1 (ja) |
IL (3) | IL158623A0 (ja) |
WO (1) | WO2002087510A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011149094A1 (ja) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | シャープ株式会社 | 表示装置および表示方法 |
Families Citing this family (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7723296B2 (en) | 2001-01-18 | 2010-05-25 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof |
US7629309B2 (en) * | 2002-05-29 | 2009-12-08 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
US7560424B2 (en) | 2001-04-30 | 2009-07-14 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
EP1974752B1 (en) | 2001-04-30 | 2012-09-26 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Subcellular targeting of therapeutic proteins |
IL161352A0 (en) * | 2001-10-16 | 2004-09-27 | Symbiontics Inc | Methods and compositions for targeting underglycosylated proteins across the blood brain barrier |
US20030072761A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-04-17 | Lebowitz Jonathan | Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier |
CA2481334A1 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Anthony C. Stevens | Tissue-specific endothelial membrane proteins |
CA2487815A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-11 | Symbiontics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
JP4828121B2 (ja) * | 2002-05-29 | 2011-11-30 | バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 標的化治療的タンパク質 |
WO2004064750A2 (en) * | 2003-01-22 | 2004-08-05 | Duke University | Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides |
US7442372B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-10-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues |
JP4914224B2 (ja) | 2004-02-10 | 2012-04-11 | バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド | 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント |
US8889127B2 (en) * | 2004-07-01 | 2014-11-18 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Targeted protein replacement for the treatment of lysosomal storage disorders |
US20120269886A1 (en) * | 2004-12-22 | 2012-10-25 | Nitto Denko Corporation | Therapeutic agent for pulmonary fibrosis |
US20060188945A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-08-24 | Vendela Parrow | Screening methods |
US7341720B2 (en) | 2005-04-06 | 2008-03-11 | Genzyme Corporation | Targeting of glycoprotein therapeutics |
US9181184B2 (en) | 2005-05-17 | 2015-11-10 | Amicus Therapeutics, Inc. | Method for the treatment of pompe disease using 1-deoxynojirimycin and derivatives |
GB0524987D0 (en) * | 2005-12-08 | 2006-01-18 | Ge Healthcare Ltd | Novel imaging agents for fibrosis |
EP1818395A1 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-15 | Diatos | Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases |
CA2669347A1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-05-29 | Zystor Therapeutics, Inc. | Methods for treating pompe disease |
LT2457920T (lt) | 2007-01-18 | 2018-02-12 | Genzyme Corporation | Oligosacharidai, apimantys aminooksigrupę, ir jų konjugatai |
EP2164960A2 (en) | 2007-05-25 | 2010-03-24 | North Carolina State University | Viral nanoparticle cell-targeted delivery platform |
EP2997976A1 (en) | 2007-07-27 | 2016-03-23 | Armagen Technologies, Inc. | Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns |
AU2009244148B2 (en) | 2008-05-07 | 2014-10-09 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Lysosomal targeting peptides and uses thereof |
JP5658167B2 (ja) | 2008-12-16 | 2015-01-21 | ジェンザイム・コーポレーション | オリゴ糖−タンパク複合体 |
EP3075386B1 (en) | 2009-06-17 | 2019-10-16 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Formulations for lysosomal enzymes |
EP2445536B1 (en) | 2009-06-22 | 2016-06-08 | Burnham Institute for Medical Research | Methods and compositions using peptides and proteins with c-terminal elements |
PT3482767T (pt) | 2009-08-28 | 2021-12-29 | Icahn School Med Mount Sinai | Terapia de substituição enzimática com escaladas de dose para tratamento de deficência da esfingomielinase ácida |
CA2800173C (en) | 2010-05-21 | 2019-05-14 | Ulrik Nielsen | Bi-specific fusion proteins |
EP2585105B1 (en) | 2010-06-25 | 2017-08-09 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Treatment of sanfilippo syndrome type b |
PT2585104T (pt) | 2010-06-25 | 2019-10-30 | Shire Human Genetic Therapies | Métodos e composições de arilsulfatase a para a administração no snc |
UA115649C2 (uk) | 2010-06-25 | 2017-12-11 | Шае Хюмен Дженетік Терапіс, Інк. | Способи та композиції для доставки до цнс ідуронат-2-сульфатази |
KR102283671B1 (ko) | 2010-06-25 | 2021-07-30 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 치료제들의 cns 전달 |
ME03647B (me) | 2010-06-25 | 2020-07-20 | Shire Human Genetic Therapies | Postupci i kompozicije za isporuku arilsulfataze a u cns |
KR20140005842A (ko) | 2010-06-25 | 2014-01-15 | 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. | 헤파란 n-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들 |
WO2012118778A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated car peptides and methods and compositions using truncated car peptides |
WO2012166585A2 (en) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Airware, Inc. | Re-calibration of ab ndir gas sensors |
US10179801B2 (en) | 2011-08-26 | 2019-01-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides |
DK2753346T3 (da) | 2011-09-07 | 2020-05-25 | Sinai School Medicine | Ceramidase og celledifferentiering |
WO2013065690A1 (ja) * | 2011-10-31 | 2013-05-10 | 国立大学法人 長崎大学 | ウイルス感染症の予防又は治療剤 |
WO2013096899A2 (en) | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a |
WO2013118165A1 (en) * | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical agents fused with atf for improved bioavailability |
WO2013134530A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | Amicus Therapeutics, Inc. | High concentration alpha-glucosidase compositions for the treatment of pompe disease |
RS61598B1 (sr) | 2012-05-03 | 2021-04-29 | Amicus Therapeutics Inc | Režimi doziranja za tretman pompeove bolesti |
EP3679923B1 (en) | 2012-06-01 | 2021-08-04 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Ceramide levels in the treatment and prevention of infections |
CN104822701B (zh) | 2012-11-27 | 2018-09-21 | 生物马林药物股份有限公司 | 靶向治疗性溶酶体酶融合蛋白及其用途 |
JP6832158B2 (ja) | 2013-03-14 | 2021-02-24 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | 治療用酸性セラミダーゼ組成物ならびにそれを作製および使用する方法 |
CN107075468B (zh) | 2014-09-30 | 2021-12-24 | 阿米库斯治疗学公司 | 具有增强的碳水化合物的高强度酸性α-葡糖苷酶 |
JP7005019B2 (ja) | 2015-10-02 | 2022-02-04 | シルバー・クリーク・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 組織修復のための二重特異性治療用タンパク質 |
US20170189497A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Amicus Therapeutics, Inc. | Augmented Acid Alpha-Glucosidase For The Treatment Of Pompe Disease |
MX2018010196A (es) | 2016-02-24 | 2018-11-19 | Biomarin Pharm Inc | Proteinas de fusion de enzimas lisosomales terapeuticas dirigidas, formulaciones asociadas y usos de las mismas. |
PE20190127A1 (es) | 2016-03-30 | 2019-01-17 | Amicus Therapeutics Inc | Metodo para seleccionar proteinas recombinantes ricas en m6p |
CA3019128A1 (en) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | Amicus Therapeutics, Inc. | Formulations comprising recombinant acid alpha-glucosidase |
WO2017180587A2 (en) | 2016-04-11 | 2017-10-19 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Regulated biocircuit systems |
NL2017294B1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-14 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides. |
US11981752B2 (en) | 2017-05-02 | 2024-05-14 | Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute | Tumor associated monocyte/macrophage binding peptide and methods of use thereof |
BR112020005271A2 (pt) | 2017-10-02 | 2020-09-15 | Denali Therapeutics Inc. | proteína, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um polipeptídeo, métodos de tratamento de um distúrbio, de diminuição do acúmulo, de monitoramento, de transporte de um agente e de tratamento de um lsd e composição farmacêutica |
US10874750B2 (en) | 2018-04-30 | 2020-12-29 | Amicus Therapeutics, Inc. | Gene therapy constructs and methods of use |
US20220403001A1 (en) | 2018-06-12 | 2022-12-22 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
BR112021006829A2 (pt) | 2018-10-10 | 2021-07-20 | Amicus Therapeutics, Inc. | composições de polipeptídeos estabilizados com ligações dissulfeto e métodos de uso |
EP3870600A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-09-01 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
JP7458404B2 (ja) | 2018-12-20 | 2024-03-29 | アーマジェン・インコーポレイテッド | イズロン酸-2-スルファターゼ免疫グロブリン融合タンパク質の精製 |
EP3921329A1 (en) | 2019-02-04 | 2021-12-15 | University of Tartu | Bi-specific extracellular matrix binding peptides and methods of use thereof |
AU2020235865A1 (en) | 2019-03-08 | 2021-09-23 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation |
CN114450308A (zh) | 2019-06-12 | 2022-05-06 | 黑曜石疗法公司 | 用于调节性调控的ca2组合物和方法 |
EP3983537A1 (en) | 2019-06-12 | 2022-04-20 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Ca2 compositions and methods for tunable regulation |
US20230092895A1 (en) | 2019-08-30 | 2023-03-23 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Tandem cd19 car-based compositions and methods for immunotherapy |
WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
Family Cites Families (65)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4309776A (en) | 1980-05-13 | 1982-01-12 | Ramon Berguer | Intravascular implantation device and method of using the same |
US4749570A (en) | 1981-12-31 | 1988-06-07 | The Governors Of The University Of Alberta | Targeting conjugates of albumin and therapeutic agents |
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
WO1986000619A1 (en) | 1984-07-13 | 1986-01-30 | Chiron Corporation | Prepro insulin-like growth factors i and ii |
US4801575A (en) * | 1986-07-30 | 1989-01-31 | The Regents Of The University Of California | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
US4902505A (en) | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
US5470828A (en) | 1987-12-24 | 1995-11-28 | Gropep Pty. Ltd. | Peptide analogs of insulin-like growth factor II |
US5817623A (en) | 1995-03-06 | 1998-10-06 | Univ Colorado State Res Found | Method for treating diabetic peripheral neuropathy with IGF-I or IGF-II |
US6451600B1 (en) | 1989-12-22 | 2002-09-17 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
US5236838A (en) | 1988-12-23 | 1993-08-17 | Genzyme Corporation | Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase |
US5549892A (en) | 1988-12-23 | 1996-08-27 | Genzyme Corporation | Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5977307A (en) | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
US5672683A (en) | 1989-09-07 | 1997-09-30 | Alkermes, Inc. | Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein |
WO1991004014A1 (en) | 1989-09-21 | 1991-04-04 | Synergen, Inc. | Method for transporting compositions across the blood brain barrier |
US5356804A (en) | 1990-10-24 | 1994-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York | Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A |
US5401650A (en) | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
US5633235A (en) | 1991-04-19 | 1997-05-27 | Regents Of The University Of Michigan | Triciribine and analogs as antiviral drugs |
US5736363A (en) | 1991-07-29 | 1998-04-07 | British Bio-Technology Limited | IGF-II analogues |
AU2752892A (en) | 1991-09-26 | 1993-04-27 | Oklahoma Medical Research Foundation | Fusion proteins targeted to lysosomes, for the treatment of aids |
US6270989B1 (en) | 1991-11-05 | 2001-08-07 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and delivery |
US5258453A (en) | 1992-01-21 | 1993-11-02 | University Of Utah | Drug delivery system for the simultaneous delivery of drugs activatable by enzymes and light |
EP0646178A1 (en) | 1992-06-04 | 1995-04-05 | The Regents Of The University Of California | expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host |
US5981194A (en) | 1992-07-10 | 1999-11-09 | University Of British Columbia | Use of p97 and iron binding proteins as diagnostic and therapeutic agents |
US5476779A (en) | 1992-09-30 | 1995-12-19 | University Of Maryland At College Park | DNA encoding insulin-like growth factor II isolated from rainbow trout |
EP0599303A3 (en) | 1992-11-27 | 1998-07-29 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Peptide conjugate |
US5633234A (en) | 1993-01-22 | 1997-05-27 | The Johns Hopkins University | Lysosomal targeting of immunogens |
US5798366A (en) | 1993-05-13 | 1998-08-25 | Monsanto Company | Method for treatment of CNS-involved lysosomal storage diseases |
US5704910A (en) | 1995-06-05 | 1998-01-06 | Nephros Therapeutics, Inc. | Implantable device and use therefor |
US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
US5817789A (en) | 1995-06-06 | 1998-10-06 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells |
US6118045A (en) | 1995-08-02 | 2000-09-12 | Pharming B.V. | Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals |
US20020013953A1 (en) | 1995-08-02 | 2002-01-31 | Reuser Arnold J. | Compositions and methods for treating enzyme deficiency |
US20010006635A1 (en) | 1995-09-29 | 2001-07-05 | D. Clark Bennett | Use of heparinase to decrease inflammatory responses |
US6348194B1 (en) | 1995-11-13 | 2002-02-19 | Ixsys Incorporated | Tumor specific internalizing antigens and methods for targeting therapeutic agents |
US6344436B1 (en) | 1996-01-08 | 2002-02-05 | Baylor College Of Medicine | Lipophilic peptides for macromolecule delivery |
CA2244228A1 (en) | 1996-01-22 | 1997-07-24 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen analogs and methods for producing them |
US6458574B1 (en) | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
US6020144A (en) | 1996-09-12 | 2000-02-01 | Symbiontics, Inc. | Sustained delivery device comprising a Leishmania protozoa and methods of making and using the same |
US6083725A (en) | 1996-09-13 | 2000-07-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein |
US6235874B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | Academia Sinica | Production of biologically active recombinant insulin-like growth factor II polypeptides |
US6329501B1 (en) | 1997-05-29 | 2001-12-11 | Auburn University | Methods and compositions for targeting compounds to muscle |
EP1025521B1 (en) | 1997-06-02 | 2007-04-11 | The Johns Hopkins University | Computer method utilizing free energy calculations for ligand design and the prediction of binding targets |
US6472140B1 (en) | 1997-09-05 | 2002-10-29 | The General Hospital Corporation | α-2- macroglobulin therapies and drug screening methods for Alzheimer's disease. |
CA2305768A1 (en) | 1997-10-29 | 2000-02-24 | Genzyme Corporation | Compositions and methods for treating lysosomal storage disease |
NZ510358A (en) | 1998-08-11 | 2002-09-27 | Large Scale Biology Corp | Method for recovering proteins from the interstitial fluid of plant tissues |
CA2353522A1 (en) | 1998-12-07 | 2000-06-15 | Pharming Intellectual Property B.V. | Treatment of pompe's disease |
US6596500B1 (en) | 1998-12-08 | 2003-07-22 | The General Hospital Corporation | Binding of retinoids to M6P/IGF-II receptor |
US6638727B1 (en) | 1999-01-26 | 2003-10-28 | Cytyc Health Corporation | Methods for identifying treating or monitoring asymptomatic patients for risk reduction or therapeutic treatment of breast cancer |
US6537785B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-03-25 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Methods of treating lysosomal storage diseases |
US6569661B1 (en) | 1999-11-12 | 2003-05-27 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof |
US20020081654A1 (en) | 2000-04-07 | 2002-06-27 | Sandrin Mauro Sergio | Targeting hydrolase enzymes |
PT3449934T (pt) | 2000-07-18 | 2020-06-25 | Univ Duke | Tratamento de doença de armazenanto de glicogénio tipo ii |
AU2002241540A1 (en) | 2000-11-30 | 2002-06-11 | Symbiontics, Inc. | Protozoan expression systems for lysosomal storage disease genes |
US20020142299A1 (en) | 2001-01-09 | 2002-10-03 | Davidson Beverly L. | PTD-modified proteins |
US7723296B2 (en) | 2001-01-18 | 2010-05-25 | Genzyme Corporation | Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof |
US7320793B2 (en) | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
US20030004236A1 (en) | 2001-04-20 | 2003-01-02 | Meade Thomas J. | Magnetic resonance imaging agents for detection and delivery of therapeutic agents and detection of physiological substances |
EP1974752B1 (en) | 2001-04-30 | 2012-09-26 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Subcellular targeting of therapeutic proteins |
IL161352A0 (en) | 2001-10-16 | 2004-09-27 | Symbiontics Inc | Methods and compositions for targeting underglycosylated proteins across the blood brain barrier |
EP1463512B1 (en) | 2002-01-11 | 2014-05-28 | biOasis Technologies Inc. | Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes |
AU2003224880A1 (en) | 2002-04-05 | 2003-10-27 | Genzyme Corporation | Methods of enhancing lysosomal storage disease therapy |
CA2487815A1 (en) | 2002-05-29 | 2003-12-11 | Symbiontics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
WO2004064750A2 (en) | 2003-01-22 | 2004-08-05 | Duke University | Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides |
US20050026823A1 (en) | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues |
-
2002
- 2002-04-30 EP EP08000935A patent/EP1974752B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 EP EP02725886A patent/EP1436316B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 AT AT02725886T patent/ATE384736T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-30 US US10/136,841 patent/US7396811B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 JP JP2002584862A patent/JP4641705B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 WO PCT/US2002/013835 patent/WO2002087510A2/en active IP Right Grant
- 2002-04-30 IL IL15862302A patent/IL158623A0/xx unknown
- 2002-04-30 CA CA2445577A patent/CA2445577C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 DE DE60224816T patent/DE60224816T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 ES ES02725886T patent/ES2300439T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 AU AU2002256423A patent/AU2002256423B2/en not_active Expired
-
2003
- 2003-10-27 IL IL158623A patent/IL158623A/en active IP Right Grant
-
2008
- 2008-10-20 AU AU2008230016A patent/AU2008230016A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-03-02 IL IL197348A patent/IL197348A0/en unknown
- 2009-04-01 HK HK09103084.2A patent/HK1124549A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2009-09-30 JP JP2009229060A patent/JP2010043103A/ja active Pending
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN6009014227; BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 181(2), 1991, P.907-914 * |
JPN6009014228; HORM. METAB. RES. 31(2-3), 1999, P.242-246 * |
JPN7009001616; J. BIOL. CHEM. 274(2), 1999, P.1164-1171 * |
JPN7009001619; J. CLIN. INVEST. 93(6), 1994, P.2324-2331 * |
JPN7009001620; J. BIOL. CHEM. 270(30), 1995, P.18013-18018 * |
JPN7009001621; J. BIOL. CHEM. 266(31), 1991, P.20626-20635 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011149094A1 (ja) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | シャープ株式会社 | 表示装置および表示方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20030082176A1 (en) | 2003-05-01 |
ATE384736T1 (de) | 2008-02-15 |
AU2008230016A1 (en) | 2008-11-13 |
EP1436316B1 (en) | 2008-01-23 |
IL197348A0 (en) | 2009-12-24 |
WO2002087510A3 (en) | 2004-05-06 |
JP4641705B2 (ja) | 2011-03-02 |
US7396811B2 (en) | 2008-07-08 |
DE60224816D1 (de) | 2008-03-13 |
JP2004535791A (ja) | 2004-12-02 |
ES2300439T3 (es) | 2008-06-16 |
CA2445577C (en) | 2012-07-03 |
EP1436316A2 (en) | 2004-07-14 |
HK1124549A1 (en) | 2009-07-17 |
IL158623A0 (en) | 2004-05-12 |
EP1974752B1 (en) | 2012-09-26 |
EP1974752A1 (en) | 2008-10-01 |
WO2002087510A2 (en) | 2002-11-07 |
DE60224816T2 (de) | 2009-01-22 |
CA2445577A1 (en) | 2002-11-07 |
EP1436316A4 (en) | 2004-08-18 |
IL158623A (en) | 2009-09-22 |
AU2002256423B2 (en) | 2008-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4641705B2 (ja) | 治療的タンパク質の亜細胞標的化 | |
US10300113B2 (en) | Targeted therapeutic proteins | |
AU2002256423A1 (en) | Subcellular targeting of therapeutic proteins | |
US8207114B2 (en) | Targeted therapeutic proteins | |
AU2003237314B2 (en) | Targeted therapeutic proteins | |
JP2009203241A (ja) | 血液脳関門をわたる過小グリコシル化タンパク質の標的化のための方法および組成物 | |
US20040005309A1 (en) | Targeted therapeutic proteins | |
JP4828121B2 (ja) | 標的化治療的タンパク質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100910 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20110425 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120607 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121107 |