JP2010029204A - マウスのscurfyの表現型を引き起こす遺伝子およびそのヒトのオルソログの同定 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明によって、上記課題が解決された。本発明にしたがって、Fkhsfをコードする単離された核酸分子およびその変異形態が提供される。このような核酸分子の発現のために適切な発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。本明細書中で開示される核酸配列(およびその変異体形態)に基づくアッセイを利用して、免疫系を調節する多数の分子が同定され得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、ならびにより詳細には、scurfy関連疾患を診断するために有用な方法および組成物に関し、そして、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。
マウスの免疫系に影響を与える遺伝した変異は、免疫系の調節に対して重要な新規の遺伝子の豊富な供給源であることが証明されており、そしてヒトの免疫学的な障害の重要な動物モデルを提供した。これらとしては、xid(X連鎖無ガンマグロブリン血症のマウスの等価物)(非特許文献1および2)、beige(チェディアック‐東症候群の等価物)(Barbosaら、Nature、382:262、1996)、lprおよびgld(fasおよびfasリガンドの欠損)、X連鎖重症複合免疫不全(Sugamuraら、Annu.Rev.Immunol.14:179、1996)、および造血細胞ホスファターゼ変異体motheaten(SHP−1)(BignonおよびSiminovitch、Clin Immunol Immunopathol、73:168、1994)が挙げられる。
本発明は、scurfyに関連する疾患の診断のために有用な方法および組成物、ならびに、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法を開示し、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
本発明は、以下を提供する:
(項目1) Fkhsfをコードする、単離された核酸分子。
(項目2) 前記FkhsfがマウスのFkhsfである、項目1に記載の単離された核酸分子。
(項目3) 前記FkhsfがヒトのFKHsfである、項目1に記載の単離された核酸分子。
(項目4) 前記核酸分子が、(a)配列番号2または4を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、(b)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその相補物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および(c)(a)または(b)のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子、
からなる群より選択される、項目1に記載の単離された核酸分子。
(項目5) 前記核酸分子が配列番号2のアミノ酸配列をコードする、項目1に記載の単離された核酸分子。
(項目6) 前記核酸分子が配列番号1のヌクレオチド配列を含む、項目5に記載の単離された核酸分子。
(項目7) 項目1に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
(項目8) 前記ベクターがウイルスベクターである、項目7に記載のベクター。
(項目9) 前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルスからなる群より選択されるウイルスから生成される、項目8に記載のベクター。
(項目10) 項目1に記載の単離された核酸分子およびプロモーターを含む発現ベクターであって、ここで、該プロモーターが該核酸分子と作動可能に連結されている、発現ベクター。
(項目11) 項目10に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
(項目12) Fkhsfタンパク質を調製するために項目10に記載の発現ベクターを使用する方法であって、該方法が以下の工程:
(a)該発現ベクターを含み、そして該タンパク質を産生する、組換え宿主細胞を培養する工程、および
(b)該培養した組換え宿主細胞から該タンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
(項目13) 項目1から6のいずれか1項に記載の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
(項目14) 項目1に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
(項目15) 前記抗体が、以下:
(a)ポリクローナル抗体、
(b)マウスのモノクローナル抗体、
(c)(b)から誘導されるヒト化抗体、および
(d)ヒトのモノクローナル抗体、
からなる群より選択される、項目13に記載の抗体。
(項目16) 前記抗体フラグメントが、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、sFv、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目14に記載の抗体フラグメント。
(項目17) 項目13に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
(項目18) 被験体に由来する生物学的サンプル中のFkhsf核酸配列の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)Fkhsf特異的核酸プローブと、(i)該生物学的サンプルから単離した試験核酸分子、または(ii)RNA分子から合成した核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該プローブが、項目1に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する、工程、および
(b)該核酸プローブと(i)または(ii)とのハイブリッドの形成を検出する工程、
を包含する、方法。
(項目19) 前記試験核酸分子が、RT−PCRによって得られる、項目18に記載の方法。
(項目20) 生物学的サンプル中のFkhsfまたはその変異形態の存在を検出する方法であって、以下の工程:
(a)該生物学的サンプルを、抗Fkhsf抗体または抗体フラグメントと接触させる工程であって、ここで、該接触工程が、該生物学的サンプルに対する該抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる、工程、および
(b)任意の該結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程、
を包含する、方法。
(項目21) 前記抗体または前記抗体フラグメントが、以下:
(a)ポリクローナル抗体、
(b)マウスのモノクローナル抗体、
(c)(b)から誘導されるヒト化抗体、
(d)ヒトのモノクローナル抗体、および
(e)(b)、(c)、または(d)から誘導される抗体フラグメント、
からなる群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目22) 前記抗体フラグメントが、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、sFv、および最小認識ユニットからなる群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目23) 前記抗体または前記抗体フラグメントが、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生体発光標識、およびコロイド状の金からなる群より選択される検出可能な標識をさらに含む、項目20に記載の方法。
(項目24) 項目1に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、単離されたオリゴヌクレオチド。
(項目25) 検出可能な標識をさらに含む、項目24に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目26) 動物に対して項目1に記載のFkhsf核酸分子を投与する工程を包含する、動物に対してFkhsf核酸分子を導入する方法。
(項目27) 前記核酸分子がウイルスベクターによって発現される、項目26に記載の方法。
(項目28) 前記核酸分子がプラスミドベクターによって発現される、項目26に記載の方法。
(項目29) 前記核酸分子がインビボで動物に投与される、項目26に記載の方法。
(項目30) 前記核酸分子がエキソビボで細胞に投与され、次いで該細胞が前記動物に投与される、項目26に記載の方法。
(項目31) 前記細胞が造血細胞である、項目26に記載の方法。
(項目32) 前記造血細胞がT細胞である、項目26に記載の方法。
(項目33) 前記動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスからなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(項目34) その細胞がFkhsfタンパク質をコードする配列を含むトランスジーンを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物。
本発明は、一般的には、変異した場合に、重大なリンパ増殖障害を生じる新規の遺伝子の発見に関する。詳細には、変異マウス(「Scurfy」と命名された)が、戻し交配分析、物理的なマッピング、および大規模なDNAの配列決定を通じたこの障害の原因遺伝子の同定のために使用された。この遺伝子の配列の分析は、この遺伝子が、関連の遺伝子ファミリー(全てが、翼状(winged)へリックスDNA結合ドメインを含有する)に属することを、示した。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物(例えば、プラスミドなど)をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示されており、そしてそれゆえそれらの全体が、参考として援用されている。
(定義)
本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示すこと、および本明細書中で以降に使用される略号を列挙しそしてそれらを定義することは、本発明の理解に役立ち得る。
広範な種々の分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。より詳細に以下で議論される代表的な例としては、有機分子、タンパク質またはペプチド、および核酸分子が挙げられる。
多数の有機分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る。例えば、本発明の1つの実施態様においては、適切な有機分子が、化学的なライブラリー(ここでは、化合物が別々にアッセイされる)から、またはコンビナトリアル化学ライブラリー(ここでは、複数の化合物が一度にアッセイされ、次いで、最も活性な化合物を決定および単離するために取り組まれる)から、のいずれかから選択され得る。
広範なタンパク質およびペプチドは、同様に、免疫系を調節するための候補分子として利用される。
免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製され得る(例えば、米国特許第4,528,266号、および同第4,359,535号、ならびにPCT公開番号第WO92/15679号、同第WO92/15677号、同第WO90/07862号、同第WO90/02809号を参照のこと)か、または市販の供給源(例えば、New England Biolabs Ph.D.TM Pharge Display Peptide Library Kit)から購入され得るかのいずれかであり得る。
免疫系を調節する抗体は、本明細書中に提供されている開示を考慮すれば、容易に調製され得る。本発明の状況においては、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2、Fv可変領域、または相補性決定領域)を含むことが理解される。上記で議論されているように、抗体は、それらが、107Mよりも大きいかまたはそれと同等である、好ましくは、108Mよりも大きいかまたはそれと同等であるKaを有して結合する場合は、Fkhsfに対して特異的であると理解される。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得る(Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660−672,1949を参照のこと)。
本明細書中および以下の実施例において記載されているように、Fkhsfの改変されたバージョンが、Fkhsfの正常な活性を阻害し、それによって免疫系を調節するために利用され得る(一般的には、上記の核酸分子およびタンパク質を参照のこと)。
。
本発明の他の局面においては、免疫系を調節し得る核酸分子が提供される。例えば、1つの実施態様においては、FKHsfもしくはFkhsfの核酸配列、または変異体FKHsfもしくはFkhsfの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、提供される(一般的には、Hirashimaら、Molecular Biology of RNA:New Perspectives(M.InouyeおよびB.S.Dudock.編、1987 Academic Press,San Diego、401頁);Oligonucleotides:Antisense Inhibitors of Gene Expression(J.S.Cohen編、1989、MacMillan Press、London);SteinおよびCheng、Science、261:1004−1012、1993;第WO95/10607号;米国特許第5,359,051号;同第WO92/06693号;およびEP−A2−612844号を参照のこと)。簡潔には、このような分子は、それらが、転写されるFkhsfのmRNA配列の領域と相補的であり、そしてワトソン−クリック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖の核酸は、mRNAの続くプロセシングを妨害し、それによってタンパク質の合成を妨げる。
FKHsfもしくはFkhsf(ならびにそれらの変異形態)、または上記または下記の任意の候補分子が、以下を含む種々の化合物で標識され得る:例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセイン、Phycobiliタンパク質(例えば、フィコエリトリン)、ローダミン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Shigella毒素、およびPseudomonas外毒素Aが挙げられる。放射性核種の代表的な例としては、Cu−64、Ga−67、Ga−68、Zr−89、Ru−97、Tc−99m、Rh−105、Pd−109、In−111、I−123、I−125、I−131、Re−186、Re−188,Au−198、Au−199,Pb−203、At−211、Pb−212、およびBi−212が挙げられる。さらに、上記の抗体もまた、標識され得るか、またはリガンド結合対の1つのパートナーに対して結合体化され得る。代表的な例としては、アビジン−ビオチン、およびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。
上記のように、本発明はまた、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤とともに、免疫系を調節する上記の分子の1つを含む、種々の薬学的組成物を提供する。一般的には、このようなキャリアは、使用される投与量および濃度では、レシピエントに対しては非毒性である。通常は、このような組成物の調製は、緩衝液、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物(グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む))、キレート化剤(例えば、EDTA、グルタチオンなど)、安定剤、および賦形剤と、治療薬との混合を含む。中性の緩衝化生理食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。好ましくは、薬学的組成物(または「医薬品」)は、滅菌の、発熱物質を含まない形態で提供される。
本発明はまた、免疫系を調節するための方法を提供する。免疫系を調節する、本明細書中に記載されている分子の使用を通じて、温血動物中の広範な種々の状態が、容易に処置され得るかまたは予防され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物(例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含む)の両方が挙げられる。このような方法は、変更された免疫系を有する患者において治療的な価値があり得る。これは、種々の免疫不全症候群、ならびにT細胞媒介自己免疫疾患を有する患者の、化学療法を受けている患者を含む。治療的な価値はまた、ワクチンアジュバントとしての有用性によって認識され得る。
(実施例1)
(SCURFY変異体の原因である遺伝子の同定)
(A.SCURFY遺伝子のクローニング)
もともとのscurfy変異は、Oak Ridge National Laboratory(ORNL)に1949年にストックされた一部近交系のMRにおいて自発的に生じた。戻し交配分析を、マウスScurfy変異を含むX染色体の動原体周辺領域(peri−centromeric region)を詳細にマップするために使用した。同じ領域をカバーする物理的なマップを、重複している酵母および細菌の人工染色体(YACおよびBAC)の単離を通じて並行して生成した。一旦、候補領域が、約500キロ塩基対(kb)にまで狭められると、大規模なDNA配列決定を、4個の重複するBACクローンについて行った。この500kbの領域内の全ての転写ユニットを、配列データベースの検索とコンピューターによるエキソン予想プログラムの適用との組合せにより同定した。次いで、候補遺伝子を、正常なおよびScurfyに由来するRNAサンプルからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)手順によって得たcDNAの配列を比較することによって、Scurfy特異的変異についてスクリーニングした。Fkhsfと本明細書中で呼ばれる1つの遺伝子においては、2塩基対(bp)の挿入が、正常なcDNAと比較してScurfy cDNAのコード領域中に見出された。挿入を、いくつかのマウスの株(Scurfy変異体を含む)のゲノムDNAに由来するPCR産物のDNA配列を比較することによって確認した。再び、2bpの挿入を、Scurfyサンプル中でのみ見出し、これによって、これをScurfy欠失の原因である可能性があると確定した。
Scurfy表現型の真の原因としてのFkhsf遺伝子の実態を、トランスジェニックマウスにおいて確認した。簡潔には、Fkhsf遺伝子の約7kbのコード領域、ならびに隣接する配列の上流の約20kb、および下流の配列の約4kb(図5)を含む正常なゲノムDNAの30kbのフラグメントを、正常なマウスの1細胞胚中にマイクロインジェクションした。それぞれが別々のインテグリンを有する5匹の個々の崩壊させた動物を生成し、そして各トランスジェニック株に由来する雄性の動物を、雌性のsfキャリアと交配した。トランスジーン(正常なFkhsf)およびsf変異(変異Fkhsf)の両方を有する雄性の子孫を、分析した。
(FKHsf cDNAの生成)
完全なマウスのFkhsfタンパク質をコードする相補的DNA(cDNA)は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)手順によって得られ得る。より詳細には、第1鎖のcDNAが、適切な供給源(例えば、マウスの脾臓)に由来する5μgの全RNAを、オリゴdTプライミングすること、および標準的な条件下で逆転写酵素を用いて伸張すること(例えば、Gibco/BRL SuperScriptキット)によって、生成する。次いで、第1鎖のcDNAのアリコートを、正方向および逆方向プライマー(正方向プライマー:GCAGATCTCC TGACTCTGCC TTC;逆方向プライマー:GCAGATCTGACAAGCTGTGT CTG)(0.2mMの最終濃度))、60mMのTris−HCl、15mMの硫酸アンモニウム、1.5mMの塩化マグネシウム、0.2mMの各dNTP、および1ユニットのTaqポリメラーゼの存在下での、35サイクルのPCR(94℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて2分間)に供する。
(マウスのFkhsfに対するヒトのオルソログの生成)
完全なFKHsfタンパク質をコードするヒトFKHsf cDNAは、実施例2に記載されているものと本質的に同じ手順によって得ることができる。詳細には、全脾臓RNAを用いて開始し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマー(正方向プライマー:AGCCTGCCCT TGGACAAGGA C;逆方向プライマー:GCAAGACAGT GGAAACCTCA C)、および60℃のアニーリング温度を除いて上記と同じPCR条件を利用する。
(SCURFY変異体を検出するための方法)
上記のように、Scurfy変異体を、最初に、sfのRT−PCRによって誘導されたcDNAおよび正常なマウスのRNAサンプルを直接配列決定することによって発見し、そしてゲノムDNAに由来する同じ領域を配列決定することによって確認した。変異の性質(すなわち、2bpの挿入)は、それ自体を、多数の種々の変異検出アッセイに導く。これは、最初に、オリゴヌクレオチドプローブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このような、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、対立遺伝子特異的発現の定量的な分析を可能にし得る。
DMO5985(正方向):CTACCCACTGCTGGCAAATG(図1のntd.825−844)
DMO6724(逆方向):GAAGGAACTATTGCCATGGCTTC(ntd 1221−1199)。
正常:ATGCAGCAAGAGCTCTTGTCCATTGAGG
DMO7439
Scurfy:GCAGCAAGAGCTCTTTTGTCCATTGAGG
DMO6919。
(FKHSF遺伝子の発現)
半定量的なRT−PCRが、広範な種々の組織および細胞株中におけるマウスおよびヒトのFkhsf遺伝子の発現パターンを分析するために使用されている。発現のレベルは、偏在して発現されるDAD−1遺伝子について正規化される。簡潔には、Fkhsf遺伝子は、非常に低いレベルではあるが、これまでに試験されたほぼ全ての組織(胸腺、脾臓、分類されたCD4+およびCD4−CD8−、Tリンパ球、ならびに腎臓、脳、ならびに種々のマウスおよびヒトのT細胞株、ならびにヒト腫瘍を含む)中で発現される。しかし、発現がないことが、新たに分類したマウスのB細胞において注目された。
(インビトロでのFKHSFの発現)
全長のマウスおよびヒトのFkhsf cDNA、ならびに種々のcDNAのサブ領域を、哺乳動物細胞(たとえば、ヒトのJurkat T細胞株)、E.coli、または酵母中での発現が可能であるベクター中にクローン化した。E.coli系または酵母系を、Fkhsf特異的抗体を惹起する目的のためのタンパク質の産生に使用し得る(以下を参照のこと)。
(抗FKHSF抗体の生成)
実施例6に記載されているベクターから発現されるタンパク質を、FKHsf特異的抗体の産生のために適切な動物を免疫化するために使用する。全長または短縮されたタンパク質のいずれかを、この目的のために使用し得る。タンパク質を、例えば、E.coliのような細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から、入手し得る。動物種としては、マウス、ウサギ、モルモット、ニワトリ、または他のものが挙げられ得る。FKHsfに対して特異的なウサギ抗血清は、生化学的な特徴によって決定されるように、生成されている(免疫沈降およびウェスタンブロッティング)。
(FKHSF遺伝子の機能についてのアッセイ)
FKHsfタンパク質の機能の欠損が、scurfy動物において観察される表現型(るいそう、敏感な免疫応答、および死)を生じるので、FKHsfタンパク質の過剰な発現を評価するためのアッセイを記載する。トランスジェニック動物(実施例1に記載されている)を、それらの免疫応答能力の状態について、いくつかの異なるパラメーターを使用して試験する。動物を、リンパ節および胸腺中に存在するリンパ系細胞の数について(図7)、およびインビトロでの刺激に対するT細胞の応答性について(図8)試験する。
(JM2に関連するヒトのFKHSF cDNA配列)
ヒトFKHsf cDNA配列の改変されたバージョンが、GenBankによって公開されている配列データベース中に存在する。この配列は、JM2と呼ばれ(GenBank登録番号第AJ005891号)、そしてFKHsf遺伝子を含むゲノム配列に対するエキソン推定プログラムの適用の結果である(Strom,T.M.ら、未公開−GenBank登録番号第AJ005891を参照のこと)。対称的に、FKHsf cDNAの構造は、実験によって決定された。Genetics Computer Group(GCG;Madison,USA)、Wisconsin配列分析パッケージのGAPプログラムを、2つの配列を比較するために使用し、そして差異を図9に示す。2つの配列の5’末端は、ゲノムDNA配列の状況におけるそれらの位置において異なり、FKHsfの第2のコードエキソンがJM2から欠落しており、そしてFKHsf遺伝子の最後のイントロンが、JM2配列中ではスプライシングされない。これらの差異は、FKHsfと比較して、より短いアミノ末端ドメイン、カルボキシ末端でのフォークヘッドドメイン(以下を参照のこと)中への大きい挿入を有するJM2タンパク質を生じる。
(FKHsfタンパク質は種を超えて保存されている)
FKHsfタンパク質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づいて、サブ領域に分けられ得る。FKHsf中の2つの重要なモチーフは、タンパク質の中央部分中のC2II2クラスの単一のジンクフィンガー(ZNF)、およびタンパク質の最もカルボキシ末端での二股の矢じりまたは翼状のへリックスドメインである。FKHsfと他のタンパク質との間での相同性の程度を特徴付ける目的のために、本発明者らは、タンパク質を以下の4つの領域に分けた:
アミノ末端ドメイン :図2の残基1−197
図4の残基1−198
ジンクフィンガードメイン :図2の残基198−221
図4の残基199−222
中央ドメイン :図2の残基222−336
図4の残基223−336
フォークヘッドドメイン :図2の残基337−429
図4の残基337−431。
(新規のFKHSFに関連する遺伝子の同定)
FKHsf遺伝子配列の特有の特徴を利用して、二股の矢じりを含む分子の同じサブクラスに入る他の新規の遺伝子(およびタンパク質)を同定し得る。FKHsfタンパク質は、それが、フォークヘッドドメインに対して単一のジンクフィンガードメインのアミノ末端を、そしてフォークヘッドドメインの最もカルボキシ末端に有する点で、特有である。縮重PCRアプローチを、フォークヘッドドメインの上流にジンクフィンガー配列を含む新規の遺伝子を単離するために行い得る。例えば、以下の縮重プライマーを合成した(縮重の位置を括弧で示し、そして「I」はヌクレオシドイノシンを示す):
正方向プライマー:CA(TC)GGIGA(GA)TG(CT)AA(GA
)TGG
逆方向プライマー:(GA)AACCA(GA)TT(AG)TA(AGT)
AT(CT)TC(GA)TT。
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