JP2002538764A

JP2002538764A - マウスのｓｃｕｒｆｙの表現型を引き起こす遺伝子およびそのヒトのオルソログの同定

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Publication number: JP2002538764A
Application number: JP2000565128A
Authority: JP
Inventors: メアリーイー．ブランカウ，; エリックダブリュー．ジェフリー，; キャサリンエイ．ヘリルド，; フレッドラムズデル，
Original assignee: Darwin Discovery Ltd
Current assignee: Darwin Discovery Ltd
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2002-11-19
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: US20050106601A1; US7135612B2; CA2339409A1; US6683171B1; US7220579B2; JP2010029204A; US6667162B1; US20020168736A1; US6414129B1; ATE495255T1; US6884618B2; JP2009039099A; WO2000009693A2; JP4351807B2; AU5559499A; EP1105479A2; US20080131411A1; US6794145B1; WO2000009693A3; DE69943129D1

Abstract

(57)【要約】Ｆｋｈ^sfをコードする単離された核酸分子およびその変異形態が提供される。このような核酸分子の発現のために適切な発現ベクター、およびこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。本明細書中で開示される核酸配列（およびその変異体形態）に基づくアッセイを利用して、免疫系を調節する多数の分子が同定され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、ならびにより詳細には、
ｓｃｕｒｆｙ関連疾患を診断するために有用な方法および組成物に関し、そして
、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。

【０００２】（発明の背景）マウスの免疫系に影響を与える遺伝した変異は、免疫系の調節に対して重要な
新規の遺伝子の豊富な供給源であることが証明されており、そしてヒトの免疫学
的な障害の重要な動物モデルを提供した。これらとしては、ｘｉｄ（Ｘ連鎖無ガ
ンマグロブリン血症のマウスの等価物）（Ｔｈｏｍａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
６１：３５５、１９９３；Ｒａｗｌｉｎｇｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：３５
８、１９９３）、ｂｅｉｇｅ（チェディアック‐東症候群の等価物）（Ｂａｒｂ
ｏｓａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２：２６２、１９９６）、ｌｐｒおよびｇｌｄ（
ｆａｓおよびｆａｓリガンドの欠損）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（Ｓｕｇａｍｕ
ｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１７９、１９９６）、およ
び造血細胞ホスファターゼ変異体ｍｏｔｈｅａｔｅｎ（ＳＨＰ−１）（Ｂｉｇｎ
ｏｎおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏ
ｐａｔｈｏｌ、７３：１６８、１９９４）が挙げられる。

【０００３】特定の目的の１つのマウスの変異体は、いまだなおクローン化されていないＸ
連鎖マウス変異体、ｓｃｕｒｆｙ（ｓｆ）である。簡潔には、ｓｃｕｒｆｙ変異
について半接合性のマウスは、重篤なリンパ増殖障害を示す。詳細には、ｓｃｕ
ｒｆｙ変異について半接合性の雌性（Ｘ^sf／Ｙ）は、リンパ節、脾臓、肝臓、お
よび皮膚の進行性のリンパ球浸潤を発症し、それによって巨脾腫、肝腫、大いに
肥大したリンパ節、矮小、離脱性皮膚炎、および厚くなった奇形の耳を含む、肉
眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５５２８、１９９１）。他の臨床的な症状とし
ては、増大した白血球数、高ガンマグロブリン血症、および重篤な貧血が挙げら
れる（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２
４３３、１９９０）；罹患した雄性の死亡は、通常は３週齢までに生じる。ｓｆ
遺伝子座は、Ｘ染色体の極めて近位の領域に、ｓｐａｒｓｅ−ｆｕｒ（ｓｐｆ）
（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２４３
３、１９９０；Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ５：６５２、１９９４
）（それ自体が、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子（Ｏｔｃ）内の点変
異（Ｖｅｒｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：４１５、１９８７））についての
遺伝子座からおよそ０．７センチモルガンに、マップされている。ｓｆ遺伝子座
はまた、マウスのＧａｔａ１、Ｔｃｆｅ３、およびＷａｓｐ遺伝子座と密接に連
鎖している（Ｂｌａｉｒら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ５：６５２、１９９４；
Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２９：４７１、１９９５）。ｓｃｕｒｆｙお
よびヒトのＷｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群（ＷＡＳ）との間の類似性が
報告されており（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７、２４３３、１９９０）、そしてマウスのＷａｓｐ遺伝子が、ｓｃｕｒｆ
ｙについての候補として提案されている（Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２４３３、１９９０；Ｄｅｒｒｙら、Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ２９：４７１、１９９５）。より最近の生物学的な実験は、ＷＡＳと
ｓｃｕｒｆｙとの間の有意な差異を明らかにするが、しかし、この２つの遺伝子
座は、対立遺伝子ではないことが実証されている（ＪｅｆｆｅｒｙおよびＢｒｕ
ｎｋｏｗ、公開されていないデータ）。従って、出願人らの発明の以前には、ｓ
ｃｕｒｆｙ遺伝子の正体は、未決定のままであった。

【０００４】本発明は、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患の診断のために有用な方法および組成
物、ならびに、免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法を開示し、そし
てさらに他の関連する利点を提供する。

【０００５】（発明の要旨）本発明は、一般的には、変異した場合に、重大なリンパ増殖障害を生じる新規
の遺伝子の発見に関する。詳細には、変異マウス（「Ｓｃｕｒｆｙ」と命名され
た）が、戻し交配分析、物理的なマッピング、および大規模なＤＮＡの配列決定
を通じたこの障害の原因遺伝子の同定のために使用された。この遺伝子の配列の
分析は、この遺伝子が、関連の遺伝子ファミリー（全てが、翼状（ｗｉｎｇｅｄ
）へリックスＤＮＡ結合ドメインを含有する）に属することを、示した。

【０００６】従って、本発明の１つの局面においては、ＦＫＨ^sfまたはＦｋｈ^sfをコードす
る単離された核酸分子（それらの変異形態を含む）が提供される。特定の実施態
様においては、任意の型のＦｋｈ^sfは、温血動物（例えば、マウスまたはヒト）
に由来し得る。さらなる実施態様においては、単離された核酸分子が提供され、
ここで、この核酸分子は、以下からなる群より選択される：（ａ）配列番号２ま
たは配列番号４を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１も
しくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはその相補物を有する核酸分子に対
してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、および（ｃ）（
ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされるポリペプチドの機能的なフラ
グメントをコードする核酸分子。好ましくは、核酸分子は、ＪＭ２ではない。関
連する局面においては、ベクター（発現ベクターを含む）および組換え宿主細胞
、ならびに上記の核酸分子によってコードされるタンパク質もまた、提供される
。さらに、別のタンパク質のコード領域と上記の核酸分子の少なくとも一部とを
組み合わせた融合タンパク質もまた、提供される。上記の配列に基づくオリゴヌ
クレオチドフラグメント（プローブおよびプライマーを含む）もまた、提供され
る。このようなフラグメントは、少なくとも８、１０、１２、１５、２０、また
は２５ヌクレオチド長であり、そして１００、２００、５００、１０００、１５
００、または２０００ヌクレオチド長にまで及び得る。

【０００７】他の局面においては、Ｆｋｈ^sfタンパク質（任意の型）を産生するために上記
の発現ベクターを使用する方法が提供される。この方法は、（ａ）この発現ベク
ターを含みそしてＦｋｈ^sfタンパク質を産生する組換え宿主細胞を培養する工程
、および（ｂ）培養した組換え宿主細胞からタンパク質を単離する工程、という
一般的な工程を包含する。

【０００８】Ｆｋｈ^sfタンパク質に特異的に結合する抗体および抗体フラグメントもまた、
提供される。このような抗体の代表的な例としては、ポリクローナル抗体および
モノクローナル抗体（マウスのハイブリドーマから得られたかまたはヒトの形態
に誘導されたかにはかかわらず）の両方が挙げられる。抗体フラグメントの代表
的な例としては、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦ
ｖ、および最小認識ユニットまたは相補性決定領域が挙げられる。

【０００９】なお他の局面においては、被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈ^sf核
酸配列の存在を検出するための方法が、提供される。この方法は、以下の工程を
包含する：（ａ）Ｆｋｈ^sf特異的核酸プローブと、（ｉ）上記の生物学的サンプ
ルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成された核酸
分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（ここで
、上記のプローブは、請求項１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認
識する）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブ
リッドの形成を検出する工程。

【００１０】別の関連する実施態様においては、生物学的サンプル中の、Ｆｋｈ^sfまたはそ
の変異形態の存在を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程
を包含する：（ａ）生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈ^sf抗体または抗体フラグメン
トと接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、上記の生物学的サンプルに対
する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる）
、および（ｂ）任意の上記の結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検
出する工程。

【００１１】本発明の他の局面においては、動物に対してＦｋｈ^sf核酸分子を導入する方法
が提供される。この方法は、動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、
またはマウス）に対して、本明細書中に記載されているようなＦｋｈ^sf核酸分子
を投与する工程を包含する。１つの実施態様においては、核酸分子は、ウイルス
ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘ
ルペスウイルスまたはアルファウイルスから少なくとも一部生成されたベクター
）中に含まれ、そしてそれによって発現される。別の実施態様においては、核酸
分子は、プラスミドベクターによって発現されるか、またはその中に含まれる。
このようなベクターは、インビボまたはエキソビボのいずれかで、（例えば、Ｔ
細胞のような造血細胞に）投与され得る。

【００１２】他の実施態様においては、ヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。
ここで、この動物の細胞は、Ｆｋｈ^sfタンパク質をコードする配列を含むトラン
スジーンを発現する。

【００１３】本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
して明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど
）をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示されており、そして
それゆえそれらの全体が、参考として援用されている。

【００１４】（発明の詳細な説明）（定義）本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示すこと、および本明細書中で
以降に使用される略号を列挙しそしてそれらを定義することは、本発明の理解に
役立ち得る。

【００１５】「Ｓｃｕｒｆｙ」は、重篤なリンパ増殖障害を示すマウスにおける遺伝した疾
患をいう（例えば、Ｌｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８７：２４３３、１９９０を参照のこと）。原因遺伝子（その変異形態が、
この疾患の原因である）を、配列番号１および３に示す。

【００１６】「分子」は、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、組換え結合パートナ
ー、所望される結合親和性を有するペプチド）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、キメラ核酸分子、およびＰＮＡのような核酸アナログ）、および有機化合物ま
たは無機化合物を含むと理解されるはずである。

【００１７】「核酸」または「核酸分子」は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核
酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
生成されたフラグメント、ならびに任意の連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用
、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントをいう。核酸
は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチド）、または天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天
然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）であるモノマー、あるい
は両方の組み合わせから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分、お
よび／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分において修飾を有し得
る。糖の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド
基での１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、または糖はエーテルまたは
エステルとして官能化され得る。さらに、全体的な糖部分は、立体構造的に、お
よび電気的に類似の構造（例えば、アザ糖、および炭素環式糖アナログ）で置き
かえられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化されたプリンお
よびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他の周知の
複素環式置換基が挙げられる。核酸のモノマーは、ホスホジエステル結合または
このような連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナ
ログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエ
ート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデ
ート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、いわゆる「
ペプチド核酸」を含む。これは、ポリアミド骨格に対して結合した、天然に存在
するかまたは修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれ
かであり得る。

【００１８】「単離された核酸分子」は、生物体のゲノムＤＮＡ中には組み込まれていない
核酸分子である。例えば、真核生物細胞のゲノムＤＮＡから分離されている遺伝
子をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分
子の別の例は、生物体のゲノム中には組み込まれていない、化学的に合成された
核酸分子である。

【００１９】「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。
代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５
’領域中に配置される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合は、転写
速度は、誘導剤に応答して増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモー
ターである場合は、転写の速度は、誘導剤によっては調節されない。

【００２０】「ベクター」は、所望されるタンパク質の発現を指向し得るアセンブリをいう
。ベクターは、目的の遺伝子に対して作動可能に連結された転写プロモーターエ
レメントを含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」
）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、またはこの２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリ
アデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例え
ば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベ
クターに依存して、他の遺伝的なエレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸
制限部位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択マーカー）も
また、本明細書中に記載されているベクター中に取りこまれ得る。

【００２１】「単離された」は、タンパク質またはポリペプチドの場合においては、他の生
物学的巨大分子の実質的非存在下に存在し、そしてクマシーブルー染色を用いて
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に名目上単一のバンドとして出現する分子をいう。「単
離された」は、有機分子について言及する場合は、その化合物が、当該分野で周
知の方法（例えば、ＮＭＲ、融点）を利用して９０％よりも純粋であることを意
味する。

【００２２】「クローニングベクター」は、宿主細胞中で自律複製する能力を有する、プラ
スミド、コスミド、またはバクテリオファージのような核酸分子をいう。クロー
ニングベクターは、代表的には、１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部
位（ここでは、外来のヌクレオチド配列が、ベクターの本質的な生物学的な機能
の損失を伴わずに、決定可能な様式で挿入され得る）およびクローニングベクタ
ーで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切であるマーカー遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子としては、代表的に
は、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が挙げられ
る。

【００２３】「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子を
いう。代表的には、遺伝子の発現は、プロモーターの制御下に配置され、そして
必要に応じて、少なくとも１つの調節エレメントの制御下に配置される。このよ
うな遺伝子は、プロモーター「に対して作動可能に連結された」といわれる。同
様に、調節エレメントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの
活性を調節する場合は、作動可能に連結される。

【００２４】「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含
む、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。この用語はまた、宿主細胞
の染色体またはゲノム中のクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作され
ている、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。

【００２５】真核生物においては、ＲＭＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを産生するように
、構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型を
含むように設計され得、ここで、ＲＮＡ転写物は、特異的なｍＲＮＡの配列に対
して相補的である配列を有する。このＲＮＡ転写物は、「アンチセンスＲＮＡ」
と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、「アンチセンス
遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合し得、そ
れによってｍＲＮＡの翻訳の阻害を生じる。

【００２６】「Ｆｋｈ^sfに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈ^sfア
ンチセンスオリゴヌクレオチド」は、（ａ）遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成
し得るか、または（ｂ）ｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列
を有するオリゴヌクレオチドである。同様に、「Ｆｋｈ^sfに特異的なアンチセン
スオリゴヌクレオチド」または「Ｆｋｈ^sfアンチセンスオリゴヌクレオチド」は
、（ａ）Ｆｋｈ^sf遺伝子の一部と安定な三重鎖を形成し得るか、または（ｂ）Ｆ
ｋｈ^sf遺伝子のｍＲＮＡ転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列を有する
オリゴヌクレオチドである。

【００２７】「リボザイム」は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素
、自己スプライシングＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、およびこれらの触媒機能を行う
核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と
呼ばれる。

【００２８】略号：ＹＡＣ、酵母人工染色体；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して最初の工程でＲＮＡが最初にＤＮＡに転写さ
れるＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ、ＤＮＡ形態にＲＮＡ配列をコピーすることによ
って作成される、任意のＤＮＡ。本明細書中で利用される場合は、「Ｆｋｈ^sf」
は、（この遺伝子が、ヒト、哺乳動物、または任意の他の温血動物から得られた
かどうかにはかかわらず）Ｆｋｈ^sf遺伝子の遺伝子産物をいう。「ＦＫＨ^sf」と
大文字になっている場合は、この遺伝子産物（および遺伝子）は、ヒトに由来す
ると理解されるべきである。

【００２９】上記のように、本発明は、一般的には、薬学的な生成物および方法、そしてよ
り詳細には、ｓｃｕｒｆｙに関連する疾患を診断するために有用な方法および組
成物、ならびに免疫系を調節し得る化合物を同定するための方法に関する。

【００３０】従って、以下により詳細に議論されるように、この発見は、免疫系のアゴニス
トまたは、あるいはアンタゴニストとして作用し得る分子を選択するために利用
され得るアッセイの開発を導いた。さらに、このようなアッセイは、免疫系を調
節することにおいて同様に活性である、他の遺伝子および遺伝子産物を同定する
ために利用され得る。

【００３１】（ＳＣＵＲＦＹ）簡潔には、本発明は、Ｆｋｈ^sfをコードする遺伝子における変異が稀な状態（
ｓｃｕｒｆｙ）を生じるという予想外の発見に基づく。この状態は、リンパ節、
脾臓、肝臓、および皮膚の進行性のリンパ球浸潤によって特徴付けられ、それに
よって巨脾腫、肝腫、大いに肥大したリンパ節、矮小、脱離性皮膚炎、および厚
くなった奇形の耳を含む、肉眼的な形態学的な症状を生じる（Ｇｏｄｆｒｅｙら
、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９、１９９１；Ｇｏｄｆｒｅｙ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５５２８、１９９
１）。この翼状ヘリックスのファミリーの新規のメンバーは、免疫系の新規の成
分を示す。

【００３２】ｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子を発見するために利用された方法は、以下の実施例
１に提供される。マウスのｓｃｕｒｆｙの原因遺伝子、およびヒトのオルソログ
をクローニングするための方法は、実施例２および３において以下に提供される
。トランスジェニックマウスを使用して決定されるような、遺伝子の正体および
遺伝子機能との相関の確認のための方法もまた、実施例において提供される。

【００３３】Ｆｋｈ^sf遺伝子および遺伝子産物の存在を決定するための方法もまた、本発明
によって提供される。１つの実施態様においては、このような方法は、以下の一
般的な工程を包含する：（ａ）Ｆｋｈ^sf特異的核酸プローブと、（ｉ）生物学的
サンプルから単離された試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成され
た核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程（
ここで、プローブは、Ｆｋｈ^sfのヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する
）、および（ｂ）上記の核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッド
の形成を検出する工程。種々の方法（例えば、ＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７−１２０２、１９８８；Ｋｒａｍ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：４０１−４０２、１９８９；Ｌｏｍｅｌｉら、
ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ．３５（９）：１８２６−１８３１、１９８９；米
国特許第４，７８６，６００号を参照のこと）、およびポリメラーゼ連鎖反応（
「ＰＣＲ」）を利用する核酸の増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４
，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと）、逆転写
酵素ＰＣＲおよびＣＰＴ（米国特許第４，８７６，１８７号および同第５，０１
１，７６９号を参照のこと）を含む）が、選択された配列を増幅するために利用
され得る。

【００３４】あるいは、抗体は、Ｆｋｈ^sf遺伝子産物の存在を検出するために利用され得る
。より詳細には、１つの実施態様においては、生物学的サンプル中のＦｋｈ^sfペ
プチドまたはその変異体形態の存在を検出するための方法が提供される。この方
法は、以下の工程を包含する：（ａ）抗Ｆｋｈ^sf抗体または抗体フラグメントと
生物学的サンプルとを接触させる工程（ここで、上記の接触工程は、生物学的サ
ンプルに対する上記の抗体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で
行われる）、および（ｂ）任意の結合した抗体または結合した抗体フラグメント
を検出する工程。

【００３５】このような方法は、例えば、向流免疫電気泳動（Ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎ
ｔＩｍｍｕｎｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＣＩＥＰ）、放射免疫ア
ッセイ、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロ
ットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイを含む、
広範な種々のアッセイ形式において達成され得る（米国特許第４，３７６，１１
０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、前出もまた参照のこと）。

【００３６】（核酸分子、タンパク質、およびタンパク質の産生方法）種々のＦＫＨ^sfまたはＦｋｈ^sfのタンパク質および核酸分子（またはその一部
）が本明細書中で提供されているが、本発明の状況においては、１つ以上のこれ
らのタンパク質に関する言及は、実質的に類似の活性のタンパク質を含むと理解
されるべきであると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合は、タ
ンパク質は、（ａ）これらがこのタンパク質をコードする遺伝子のコード領域に
由来するヌクレオチド配列（例えば、この配列の一部、またはこの配列の対立遺
伝子改変体を含む）によってコードされる；（ｂ）このヌクレオチド配列が、中
程度、高い、または非常に高いストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、
第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）の下で本発明のヌクレオチド配列に対し
てハイブリダイゼーションし得るか、または本明細書中で開示されている配列に
対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％
、もしくはそれより高い相同性を有する；あるいは（ｃ）このＤＮＡ配列が、（
ａ）または（ｂ）において定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果とし
て縮重している場合に、「実質的に類似」であると考えられる。さらに、本明細
書中で開示されている核酸分子は、配列が、他の点では本明細書中に示される基
準を満たす限りは、相補配列および非相補配列の両方を含む。本発明の状況にお
いては、高いストリンジェンシーは、標準的なハイブリダイゼーション条件（例
えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、またはそれに等価なもの
）を意味する。ハイブリダイゼーションの目的のためには、アミノ末端ドメイン
、ジンクフィンガードメイン、中央ドメイン、またはフォークヘッドドメイン（
実施例１０を参照のこと）をコードする核酸分子が、利用され得る。

【００３７】本明細書中に記載されている核酸分子によってコードされるタンパク質の構造
は、例えば、Ｐ／Ｃ遺伝子またはＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓＳｕｉｔｅ
（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）の疎水性プロット関数を使用して、またはＫｙｔｅおよびＤｏｏｌ
ｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２、１９８２）によ
って記載されている方法に従って、一次翻訳産物から推定され得る。

【００３８】本発明のタンパク質は、酸の塩もしくは塩基の塩の形態で、または中性の形態
で、調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改
変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸の
配列に対して行われ得、その正味の影響は、変異体または野生型のタンパク質の
生物学的な活性を維持するか、またはさらに増強もしくは減少させる。さらに、
遺伝コードの縮重に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列におけるかなりのバリエーションが存在し得る。

【００３９】本明細書中に開示されているタンパク質の他の誘導体としては、他のタンパク
質またはポリペプチドとのタンパク質の結合体が挙げられる。これは、例えば、
タンパク質の精製または同定を容易にするために付加され得る、Ｎ末端融合タン
パク質またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る（米国特許第４
，８５１，３４１号を参照のこと、また、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ６：１２０４、１９８８をもまた参照のこと）。あるいは、融合タンパ
ク質（例えば、ＦＫＨもしくはＦｋｈ−ルシフェラーゼ、またはＦＫＨもしくは
Ｆｋｈ−ＧＦＰ）が、タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために構
築され得る。

【００４０】本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されている広範な種々の技術を使用
して構築され得る。さらに、変異は、天然の配列のフラグメントに対する連結を
可能にする制限部位に隣接した、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成す
ることによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築され
た配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードす
る。

【００４１】あるいは、オリゴヌクレオチドによって指向される部位特異的（またはセグメ
ント特異的）変異誘発手順が、要求される置換、欠失、または挿入に従って変更
された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供するために使用され得る。
上記に示される変更を作成する例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ４
２：１３３、１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ３７：７３、１９８５）；
Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８５年１月、１２−１９）；Ｓ
ｍｉｔｈら（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、１９８１）：およびＳ
ａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって開示されている。タンパク質の欠失誘導体ま
たは短縮誘導体（例えば、可溶性の細胞外部分）もまた、所望される欠失に対し
て隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、構築さ
れ得る。制限消化に続いて、突出がフィルインされ得、そしてＤＮＡが再連結さ
れ得る。上記に示される変更を作成する例示的な方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９８９）によって開示されている。

【００４２】本発明の核酸分子中に作成される変異は、好ましくは、コード配列のリーディ
ングフレームを保存する。さらに、変異は、好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳に有害
な影響を与える二次的なｍＲＮＡ構造（例えば、ループまたはヘアピン）を生じ
るようにハイブリダイズし得る相補性領域を作成しない。変異部位は予め決定さ
れ得るが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位で
変異体の最適の特徴について選択するためには、ランダムな変異誘発が標的のコ
ドンで行われ得、そして発現された変異体が表示生物学的活性についてスクリー
ニングされ得る。あるいは、変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能
にする制限部位に隣接した変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成すること
によって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列
は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。変
異は、タンパク質の活性を保存するかもしくは増大させる、またはタンパク質（
例えば、変異体Ｆｋｈ）を減少させるかもしくは不能にする目的のために導入さ
れ得る。

【００４３】本発明のタンパク質をコードする核酸分子もまた、ＰＣＲ変異誘発、化学的変
異誘発の技術（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ、ＰＮＡＳ
８３：３４０２−３４０６、１９８６）を利用して、ヌクレオチドの誤った取り
こみを強制することによって（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ、Ｇｅｎｅ８
８：１０７−１１１、１９９０）、またはランダムに変異誘発したオリゴヌクレ
オチドの使用によって（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｇｅｎｏｍｅ３：１１２−１１７
、１９８９）、構築され得る。

【００４４】本発明はまた、上記に記載されている遺伝子を発現し得るベクターを含有する
宿主細胞を培養することによって、上記に記載されている遺伝子の操作および発
現を提供する。このようなベクターまたはベクター構築物は、適切な転写調節エ
レメントまたは翻訳調節エレメントに対して作動可能に連結された所望のタンパ
ク質をコードする、合成核酸分子またはｃＤＮＡから誘導される核酸分子のいず
れかを含む。適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、昆虫
、または植物の遺伝子を含む種々の供給源から誘導され得る。適切な調節エレメ
ントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして当業者によって容易に達成
され得る。調節エレメントの例としては、以下が挙げられる：転写プロモーター
およびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター
、およびリボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）。

【００４５】上記に記載されている任意のタンパク質をコードする核酸分子は、細菌、哺乳
動物、酵母もしくは他の真菌、ウイルス、または植物細胞を含む、広範な種々の
原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞によって容易に発現され得る。このよ
うな細胞を外来ＤＮＡを発現するように形質転換またはトランスフェクトするた
めの方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４
，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙら、米国特許第
４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３５，３４９号；
Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、米国特許第４，
３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、米国特許第４，７６６，０７５号；およ
びＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと；植物細胞について
は、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．、１０４：
１０６７−１０７１、１９９４；およびＰａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。

【００４６】本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙
げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、ＤＨ５αが挙げられる（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。

【００４７】細菌の発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で機能するプロモーター、１
つ以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌の複製起点を含む。代表的なプ
ロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースの
プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５、１９７
８を参照のこと）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら
、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、λプロモータ
ー（Ｅｌｖｉｎら、Ｇｅｎｅ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロ
モーター（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ１０１：１５５、１９８３）、およびｔａｃプロモーター（Ｒｕ
ｓｓｅｌｌら、Ｇｅｎｅ２０：２３１、１９８２）が挙げられる。代表的な選
択マーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性
遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）が挙げられる。宿主細胞を形質転換する
ために適切な多くのプラスミドが、当該分野で周知であり、中でも、ｐＢＲ３２
２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵＣ
プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０１：２０−７７、１９８３
、ならびにＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６
８、１９８２を参照のこと）、ならびにｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
ａ、ならびにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪ
ｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる。

【００４８】本発明を実行するために適切な酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、中
でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属
、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種々の種（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許
第４，９３５，３４９号）が挙げられる。酵母および真菌についての適切な発現
ベクターとしては、中でも、酵母についてはＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ第３７４１９
号）、およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：１６９、１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：１０３５−１０３９
、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ８：１２１−１３３、
１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ
２７５：１０４−１０８、１９７８）およびそれらの誘導体が挙げられる。

【００４９】酵母中での使用に好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖遺伝子に由来す
るプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２
０７３−１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９−４３４、１９８２）またはアルコール
デヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ
，ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ．
１０１：１９２−２０１、１９８３）が挙げられる。真菌ベクターについての有
用なプロモーターの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ解
糖遺伝子に由来するプロモーター（例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉ
ｇｈｔら、ＥＭＢＯＪ．４：２０９３−２０９９、１９８５）が挙げられる。
発現ユニットはまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの
例は、ａｄｈ３ターミネーターである（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書、１９８５）
。

【００５０】細菌のベクターを用いる場合は、酵母のベクターは、一般的には、表現型アッ
セイが存在して形質転換体が選択されることを可能にする優性表現型を示す任意
の数の遺伝子の１つであり得る、選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーは
、宿主細胞の栄養要求性を相補するか、抗生物質耐性を提供するか、または細胞
が特定の炭素源を利用することを可能にするものであり、そしてｌｅｕ２（Ｂｒ
ｏａｃｈら、同書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ８：１７、１
９７９）、またはｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）を含む。別の適切な選択マ
ーカーは、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を付与する、ｃａｔ遺伝
子である。

【００５１】真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、
Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ７５：１９２９−１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１７４０−１７４７、１９８４
）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ３０１：１６７−１６９、１９８３
）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する
選択マーカーによって相補される遺伝的な欠損を含み得る。特定の宿主および選
択マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。

【００５２】酵母を形質転換するためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば
、形質転換は、ＤＮＡを用いた酵母スフェロプラストの調製によるか（Ｈｉｎｎ
ｅｎら、ＰＮＡＳＵＳＡ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）、または
ＬｉＣｌのようなアルカリ塩での処理による（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ１５３：１６３、１９８３を参照のこと）かのいずれかによって、
容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ５：３６９、１９８７）によって記載されているようにポリエ
チレングリコールを使用して行われ得る。

【００５３】ウイルスベクターとしては、上記に記載されているような所望のタンパク質を
コードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターが
挙げられる。以下を含む広範な種々のプロモーターが、本発明の状況において利
用され得る：例えば、ＭｏＭＬＶＬＴＲ、ＲＳＶＬＴＲ、ＦｒｉｅｎｄＭ
ｕＬＶＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６５：７８１−７８４、１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
プロモーター／エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎ
ｇら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、Ｈ
ｅｒｐｅｓＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩ
ａ遺伝子エンハンサー／プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモー
ター、およびサイトメガロウイルス即時後期プロモーターのようなプロモーター
。本発明の特定の好ましい実施態様においては、プロモーターは、組織特異的プ
ロモーターである（例えば、第ＷＯ９１／０２８０５号；第ＥＰ０，４１５，
７３１号；および第ＷＯ９０／０７９３６号を参照のこと）。適切な組織特異的
プロモーターの代表的な例としては、神経特異的エノラーゼプロモーター、血小
板由来増殖因子βプロモーター、ヒトα１−キマエリン（ｃｈｉｍａｅｒｉｎ）
プロモーター、シナプシンＩプロモーター、およびシナプシンＩＩプロモーター
が挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター
（例えば、レトロウイルスプロモーター（上記のプロモーターおよびＨＩＶプロ
モーターのような他のプロモーターを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ
）、および細菌、真菌、または寄生生物（例えば、マラリア）特異的プロモータ
ー）が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染した特異的な細胞または
組織を標的化するために利用され得る。

【００５４】本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞としては、中でも以下が挙げられ
る：ＰＣ１２（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７２１号）、Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫、
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ神経芽細胞腫、ＳＨＳＹ５アドレナリン作動性神経芽細
胞腫、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスコリン作用性細胞株、またはラ
ットのＦ２後根神経節株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５０号または
同第１６５１号）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ６２８１号；ＢＨＫ５
７０細胞株（登録番号第ＣＲＬ１０３１４号のもとで、アメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託された））、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ６１号）、Ｈｅ
Ｌａ（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＣＬ２号）、２９３（ＡＴＣＣ第１５７３号；Ｇｒ
ａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２、１９７７）、および
ＮＳ−１細胞。以下を含む他の哺乳動物細胞株が、本発明において使用され得る
：ラットのＨｅｐ１（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６００号）、ラットのＨｅｐＩＩ（Ａ
ＴＣＣ第ＣＲＬ１５４８号）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ１３９号）、ヒトの
肺（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ７５．１号）、ヒトの肝ガン（ＡＴＣＣ第ＨＴＢ−５２号
）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ第ＨＢ８０６５号）、マウスの肝臓（ＡＴＣＣ第Ｃ
ＣＬ２９．１号）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ９．１号）、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ第１５８１号）、ＨＩＴ−Ｔ１５（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ
１７７７号）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ第Ｔｉｂ１５２号）、およびＲＩＮｍ
５ＡＨＴ₂Ｂ（ＯｒｓｋｏｖおよびＮｉｅｌｓｅｎ、ＦＥＢＳ２２９（１）
：１７５−１７８、１９８８）。

【００５５】本発明を実行することにおける使用のための哺乳動物の発現ベクターとしては
、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙
げられる。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性
のプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウ
イルス即時初期プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ４１：５２１−５
３０、１９８５）、サイトメガロウイルス即時後期プロモーター、ＳＶ４０プロ
モーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−
８６４、１９８１）、ＭＭＴＶＬＴＲ、ＲＳＶＬＴＲ、メタロチオネイン−
１、アデノウイルスＥ１ａが挙げられる。細胞性のプロモーターとしては、マウ
スのメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，
５７９，８２１号）、マウスＶ_Kプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７０４１−７０４５、１９８３）
；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：５４９６、１９８７）
、およびマウスＶ_Hプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ３３：８５−９３、１
９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部、所望される発
現のレベル、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存する。

【００５６】このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流、および目的のペプチド
またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置された、ＲＮＡスプライ
ス部位のセットを含み得る。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルス
および／または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列の下流
に配置されたポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる。適切
なポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポリア
デニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同書）、アデノウイルス
５Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナルおよびヒト成長ホルモン遺伝
子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：３７１
９−３７３０、１９８１）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとＲＮ
Ａスプライス部位との間に配置された、アデノウイルス２三分節（ｔｒｉｐａ
ｒｔｉｌｅ）リーダーのような、非コードウイルスリーダー配列を含み得る。好
ましいベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列を含み
得る。発現ベクターはまた、アデノウイルスのＶＡＲＮＡをコードする配列を
含み得る。適切な発現ベクターは、商業的供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得ることができる。

【００５７】クローン化されたＤＮＡ配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシ
ウムによって媒介されるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１
４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ
ＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶ
ａｎｄｅｒＥｂ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６、１９７３）、エレクト
ロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ．１：８４１−８４５、１９
８２）、またはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，
ＮＹ，１９８７）によって、培養された哺乳動物細胞中に導入され得る。クロー
ン化されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーが一
般的には、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞中に導入される。培養され
た哺乳動物細胞における使用に好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、
ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与す
る遺伝子が挙げられる。他の選択マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＢＦＰ（青色蛍光タンパク質））が挙げら
れる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能
な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。適切
なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、ＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、
ＭＡ、これは、本明細書中で参考として援用されている）によって概説されてい
る。

【００５８】適切なベクターを含有する哺乳動物細胞は、目的のＤＮＡ配列（単数または複
数）の発現を開始するために、一定の期間（代表的には、１〜２日間）増殖させ
ることが可能である。次いで、薬物選択が、安定な様式で選択マーカーを発現す
る細胞の増殖について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーでト
ランスフェクトされている細胞については、薬物濃度が、クローン化された配列
の増大したコピー数について選択するために、段階的な様式で増大させられ得、
それによって発現レベルを増大させる。導入された配列を発現する細胞が選択さ
れ、そして所望の形態または所望のレベルでの目的のタンパク質の産生について
スクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローン化され得
、そして産生のためにスケールアップされ得る。細胞はまた、フローサイトメー
ターを使用してＧＦＰ陽性細胞について分類することによって、それらのＧＦＰ
発現に基づいて、トランスフェクションについて選択され得る。

【００５９】哺乳動物細胞のトランスフェクションのためのプロトコールは、当業者に周知
である。代表的な方法としては、リン酸カルシウムによって媒介されるトランス
フェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、
アデノウイルス、およびプロトプラスト融合によって媒介されるトランスフェク
ション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）が挙げられる。裸のベクター
構築物もまた、筋肉細胞または他の適切な細胞によって取りこまれ得、続いて、
哺乳動物（または他の動物）の筋肉中に注射され得る。

【００６０】当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明にお
いて有用であり得る。例えば、昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベ
クターとしてのバキュロウイルスの使用が、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ
．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４、１９９０）によって概説されている。

【００６１】当該分野で公知の多数の植物宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明にお
いて有用であり得る。例えば、植物細胞中での遺伝子の発現のためのベクターと
してのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用が、Ｓｉｎｋ
ａｒら（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８、１９８
７）によって概説されている。

【００６２】本発明の関連する局面においては、所望のタンパク質をコードし、そして遺伝
子の発現に有効なプロモーターに対して作動可能に連結されている遺伝子をその
生殖細胞および体細胞が含むトランスジェニック動物中で本発明のタンパク質は
発現され得る。あるいは、類似の様式においては、所望の遺伝子を欠失している
トランスジェニック動物が、調製され得る（例えば、「ノックアウト」マウス）
。このようなトランスジェニックは、ヒト以外の種々の動物（マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタを含む）において調製され得る（Ｈａ
ｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１５：６８０−６８３、１９８５、Ｐａｌｍｉｔ
ｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２２：８０９−８１４、１９８３、Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８−４４
４２、１９８５、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ、Ｃｅｌｌ４１：
３４３−３４５、１９８５、ならびに米国特許第５，１７５，３８３号、同第５
，０８７，５７１号、同第４，７３６，８６６号、同第５，３８７，７４２号、
同第５，３４７，０７５号、同第５，２２１，７７８号、および同第５，１７５
，３８４号を参照のこと）。簡潔には、発現される核酸分子を、適切に配置され
た発現制御配列とともに含む発現ベクターは、例えば、マイクロインジェクショ
ンによって、受精卵の前核中に導入される。注入されたＤＮＡの組込みは、組織
サンプルから、ＤＮＡのブロット分析によって検出される。導入されたＤＮＡが
、動物の生殖列系中に取りこまれ、その結果、その動物の子孫に伝達されること
が、好ましい。組織特異的な発現は、組織特異的プロモーターの使用を通じて、
またはトランスジーンの調節された発現を可能にする誘導性プロモーター（例え
ば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、
同書））の使用を通じて、達成され得る。

【００６３】天然に存在するｓｃｕｒｆｙ変異体（「ｓｆ」）以外のＦｋｈ^sfの変異体形態
を産生するか、または天然に存在する変異体とは異なる遺伝的なバックグラウン
ドにある動物は、本明細書中に提供される開示を考慮して容易に産生され得る。

【００６４】タンパク質は、数ある方法の中でも、本発明の組換え翻訳産物を産生するため
に適切な宿主およびベクターシステムを培養することによって単離され得る。次
いで、このような細胞株に由来する上清、またはタンパク質が上清中には分泌さ
れない場合はタンパク質封入物もしくは細胞全体が、所望のタンパク質を単離す
るために種々の精製手順によって処理され得る。例えば、上清は、市販のタンパ
ク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌ
ｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮され得る。濃縮後、濃縮物
は、適切な精製マトリックス（例えば、適切な支持体に結合させられた抗タンパ
ク質抗体のような）に対して適用され得る。あるいは、陰イオン交換樹脂または
陽イオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために使用され得る。さらに別のも
のとしては、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工
程が、タンパク質をさらに精製するために使用され得る。本発明のタンパク質を
単離する他の方法は、当該分野で周知である。

【００６５】タンパク質は、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、
続いてクマシーブルーでの染色によって検出されない場合は、本発明の状況にお
いて「単離された」と考えられる。他の実施態様においては、所望されるタンパ
ク質は、従って、他の（所望されない）タンパク質が、ＳＤＳ−ＡＧＥ分析、続
いて銀染色によって検出されないように、単離され得る。

【００６６】（免疫系を調節する分子を選択するためのアッセイ）上記のように、本発明は、免疫系を調節し得る分子を選択および／または単離
するための方法を提供する。適切なアッセイの代表的な例としては、酵母および
哺乳動物の２−ハイブリッドシステム（例えば、Ｄａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．１１：９５４、１９９１；Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７９５８、１９９２）、ＤＮＡ結合アッセイ
、アンチセンスアッセイ、伝統的なタンパク質結合アッセイ（例えば、¹²⁵Ｉま
たは時間消散蛍光を利用する）、ゲル電気泳動と組み合わせた免疫沈降、および
直接的なタンパク質配列決定、Ｆｋｈ^sfによって調節される遺伝子の転写分析、
サイトカイン産生、ならびに増殖アッセイが挙げられる。

【００６７】例えば、１つの実施態様においては、Ｆｋｈ^sfと直接相互作用するタンパク質
は、酵母の２−ハイブリッド結合システム（例えば、米国特許第５，２８３，１
７３号、同第５，４６８，６１４号、同第５，６１０，０１５号、および同第５
，６６７，９７３号を参照のこと）のようなアッセイによって検出され得る。簡
潔には、２−ハイブリッドシステムにおいては、ＤＮＡ−結合ドメイン−Ｆｋｈ ^sf タンパク質の融合体（例えば、ＧＡＬ４−Ｆｋｈ^sf融合体）が構築され、そし
て選択マーカー遺伝子に連結されたＧＡＬ４結合部位を含む細胞中にトランスフ
ェクトされる。全Ｆｋｈ^sfタンパク質またはＦｋｈ^sfのサブ領域が、使用され得
る。ＧＡＬ４活性化ドメインに対して融合されたｃＤＮＡのライブラリーもまた
、構築され、そして同時トランスフェクトされる、ｃＤＮＡ−ＧＡＬ４活性化ド
メイン融合体中のｃＤＮＡがＦｋｈ^sfと相互作用するタンパク質をコードする場
合は、選択マーカーが発現される、次いで、ｃＤＮＡを含有する細胞が増殖させ
られ、構築物が単離され、そして特徴付けられる。他のアッセイもまた、相互作
用するタンパク質を同定するために使用され得る。このようなアッセイとしては
、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、同時免疫沈降、インビトロでの転写
／翻訳分析などが挙げられる。

【００６８】本発明の別の局面においては、選択された分子が免疫系を調節し得るかどうか
を決定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ
）Ｆｋｈ^sfまたはＦｋｈ^sfの変異体を発現する細胞に対して選択された候補分子
を曝露する工程、および（ｂ）この分子がＦｋｈ^sfの活性を調節するかどうかを
決定する工程、およびそれによって上記の分子が免疫系を調節するかどうかを決
定する工程。このような試験のための細胞は、（ａ）正常なリンパ球、（ｂ）Ｆ
ＫＨ^sf（もしくはＦｋｈ^sf）タンパク質（またはその変異形態）を過剰発現する
ように操作された細胞株、あるいは（ｃ）上記のタンパク質を発現するように操
作されたトランスジェニック動物に由来し得る。このようなトランスジェニック
マウスに由来する細胞は、減少した細胞数および種々の刺激に対する減少した応
答性を含む、低応答性（ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）状態によって、一部特
徴付けられる（例えば、実施例８）。

【００６９】本明細書中に記載されている方法は、個々の試験分子の分析を言及し得るが、
本発明がそのようには限定されるべきでないことが、注意されるべきである。特
に、選択された分子は、化合物の混合物中に含まれ得る。従って、記載されてい
る方法は、さらに、所望される分子を単離する工程を包含し得る。さらに、候補
分子が、多数のパラメーター（例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生など
を含む）によって、免疫系を調節するそれらの能力について評価され得る。

【００７０】（候補分子）広範な種々の分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得
る。より詳細に以下で議論される代表的な例としては、有機分子、タンパク質ま
たはペプチド、および核酸分子が挙げられる。

【００７１】（１．有機分子）多数の有機分子が、免疫系を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る
。例えば、本発明の１つの実施態様においては、適切な有機分子が、化学的なラ
イブラリー（ここでは、化合物が別々にアッセイされる）から、またはコンビナ
トリアル化学ライブラリー（ここでは、複数の化合物が一度にアッセイされ、次
いで、最も活性な化合物を決定および単離するために取り組まれる）から、のい
ずれかから選択され得る。

【００７２】このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表的な例としては、以下に
記載されているものが挙げられる：Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら「Ｓｙｓｔｅｍａ
ｎｄｍｅｔｈｏｄｏｆａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙｇｅｎｅｒａｔｉｎ
ｇｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｉｔｈｄｅｓｉｒｅｄｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ」、米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，
Ｒ．Ｗ．、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｒｒ
ａｙｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅ
ｕｓｅｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｏ
ｒｉａｌａｒｒａｙｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」、第ＷＯ９５／０２５６６号；Ｂ
ａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ
ｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅ」、第ＷＯ９５／２４１８６号；Ｂａｌｄｗｉ
ｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｄｅｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐ
ｙｒａｎｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／３０６４２号；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ
．、「Ｎｅｗｋｉｔｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉ
ａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第ＷＯ９５／１６９１８号；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ
．ら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｌｉｂｒａｒｙｏｆｒｅｓｉｎ−
ｂｏｕｎｄａｒｏｍａｔｉｃｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
」、第ＷＯ９５／１６７１２号；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．、「Ｓｏｌｉｄｐｈ
ａｓｅａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｂ
ｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｏｎａｓｏｌｉｄｓ
ｕｐｐｏｒｔ」、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら、「
Ｎｏｖｅｌｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｌｉｂｒａｒｉ
ｅｓ」、第ＷＯ９５／１６２０９号：Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら、「Ｅｎｃｏｄｅｄ
ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｃｈｅｍｉｃａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、第
ＷＯ９３／２０２４２号；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒ．ら、「Ａｍｅｔｈｏｄｆｏ
ｒｐｒｅｐａｒｉｎｇａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｎｇ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌｌｙｕｓｅｆｕｌｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
ｆｒｏｍａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙｄｉｖｅｒｓｅｕｎｉｖｅｒｓａ
ｌｌｉｂｒａｒｙ」、第ＷＯ９５／０４２７７号；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．
Ｅ．およびＤ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ、「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ
ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｉｂｒａｒｙａｎｄｍｅｔｈｏｄ」、米国
特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ
ｔｈｅＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＴｉａｚｏｌ
ｉｄｉｎｏｎｅｓ、Ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，ａｎｄＤｅｒｉｖａｔ
ｉｖｅｓｔｈｅｒｅｏｆ」、第ＷＯ９６／００１４８号；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，
Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ、「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉ
ｓｏｆＢｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ３７：
４８８７−９０、１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄ，Ｂ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐ
ｏｒｔｅｄＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＳｔｒ
ｕｃｔｕｒａｌｌｙＤｉｖｅｒｓｅ β−Ｌａｃｔａｍｓ」Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３−４、１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら、「Ｔ
ｈｅＩｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ
−１Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｆｒｏｍ４−ＴｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅＣ
ｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＬｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＢｉｏｏｒｇａｎｄＭ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ６：７０７−１２、１９９６。

【００７３】（２．タンパク質およびペプチド）広範なタンパク質およびペプチドは、同様に、免疫系を調節するための候補分
子として利用される。

【００７４】（ａ．コンビナトリアルペプチドライブラリー）免疫系を調節するペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーの
スクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によっ
て調製され得る（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号、および同第４，３
５９，５３５号、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／１５６７９号、同第ＷＯ
９２／１５６７７号、同第ＷＯ９０／０７８６２号、同第ＷＯ９０／０２８０９
号を参照のこと）か、または市販の供給源（例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏｌａｂｓＰｈ．Ｄ．^TM ＰｈａｒｇｅＤｉｓｐｌａｙＰｅｐｔｉｄ
ｅＬｉｂｒａｒｙＫｉｔ）から購入され得るかのいずれかであり得る。

【００７５】（ｂ．抗体）免疫系を調節する抗体は、本明細書中に提供されている開示を考慮すれば、容
易に調製され得る。本発明の状況においては、抗体は、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ
およびＦ（ａｂ’）₂、Ｆｖ可変領域、または相補性決定領域）を含むことが理
解される。上記で議論されているように、抗体は、それらが、１０⁷Ｍよりも大
きいかまたはそれと同等である、好ましくは、１０⁸Ｍよりも大きいかまたはそ
れと同等であるＫａを有して結合する場合は、Ｆｋｈ^sfに対して特異的であると
理解される。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合
の阻害は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．
Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。

【００７６】簡潔には、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス
、またはラットのような種々の温血動物から、当業者によって容易に生成され得
る。代表的には、Ｆｋｈ^sfまたは１３−２０アミノ酸のその特有のペプチド（好
ましくは、グルタルアルデヒドでの架橋によってキーホルリンペットヘモシアニ
ンに対して結合体化される）が、フロイト完全アジュバントまたはフロイント不
完全アジュバントのようなアジュバントと組み合わせて、腹腔内、筋肉内、眼内
、または皮下注射を通じて動物を免疫するために利用される。数回の追加免疫後
、血清のサンプルが回収され、そしてタンパク質またはペプチドに対する反応性
について試験される。特に好ましいポリクローナル抗血清は、少なくともバック
グラウンドよりも３倍大きい、これらのアッセイの１つに対するシグナルを生じ
る。一旦、タンパク質に対するその反応性に関して、動物の力価がプラトーに到
達すると、より大量の抗血清が、毎週の採血によるか、または動物を瀉血するか
のいずれかによって、容易に得られ得る。

【００７７】モノクローナル抗体はまた、従来技術を使用して容易に生成され得る（米国特
許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９
号、および同第４，４１１，９９３号（これらは、本明細書中で参考として援用
されている）を参照のこと；ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｍｃ
ＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（
編）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓ，１９８８（これもまた、本明細書中で参考として援用されている）もまた
参照のこと）。

【００７８】他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（Ｗｉｌ
ｌｉａｍＤ．Ｈｕｓｅら、「ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａＬａｒｇｅ
ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＬｉｂｒａｒｙｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＰｈａｇｅＬａｍｂｄａ」、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１、１９８９年１２月を参照のこと
；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙら、「ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＥｓｃｈｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆ
ｏｒＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＣａｔａｌｙｔｉ
ｃＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａＨｅａｖｙ
ＣｈａｉｎＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎ−ＳｐｅｃｉｆｉｃｃＤＮＡ
Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：
５７２８−５７３２、１９８９年８月もまた参照のこと；ＭｉｃｈｅｌｌｅＡ
ｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＥｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＬｉｂｒａｒｉｅｓ：ＡＲａｐｉｄＡｌｔｅｒｎａｔｉｖ
ｅｔｏＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ３：１−９、１９９０年１月もまた参照のこと）。

【００７９】以下を含む広範な種々のアッセイが、Ｆｋｈ^sf（または本明細書中に記載され
ているＦｋｈ^sfの変異形態）に対して反応性である抗体の存在を決定するために
利用され得る：例えば、向流免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降、
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウェスタ
ンブロット、免疫沈降、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ
（米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこ
と；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８もまた参照のこと）。

【００８０】一旦、適切な抗体が得られると、それらは、当業者に周知の多くの技術によっ
て単離または精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと）
。適切な技術としては、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰ
ＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム上での精
製、または任意のこれらの技術の組み合わせが挙げられる。

【００８１】本発明の抗体は、免疫系を調節するためだけではなく、診断試験のため（例え
ば、ＦＫＨ^sfまたはＦｋｈ^sfのタンパク質またはペプチドの存在を決定するため
）、治療目的のため、またはタンパク質の精製のためにも利用され得る。

【００８２】（ｃ．変異体Ｆｋｈ^sf）本明細書中および以下の実施例において記載されているように、Ｆｋｈ^sfの改
変されたバージョンが、Ｆｋｈ^sfの正常な活性を阻害し、それによって免疫系を
調節するために利用され得る（一般的には、上記の核酸分子およびタンパク質を
参照のこと）。

【００８３】ＦＫＨ^sfまたはＦｋｈ^sfのさらなる変異体または改変された形態は、広範な種
々のインビトロでのアッセイのため（例えば、種々のモデルにおいてこのような
タンパク質の影響を試験するため）、または抗体の開発のために、利用され得る
。

【００８４】（３．核酸分子）本発明の他の局面においては、免疫系を調節し得る核酸分子が提供される。例
えば、１つの実施態様においては、ＦＫＨ^sfもしくはＦｋｈ^sfの核酸配列、また
は変異体ＦＫＨ^sfもしくはＦｋｈ^sfの発現を特異的に阻害するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド分子が、提供される（一般的には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲＮＡ：ＮｅｗＰｅｒｓｐｅｃｔｉ
ｖｅｓ（Ｍ．ＩｎｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ．編、１９８７Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｅｎ
ｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９、ＭａｃＭｉｌｌ
ａｎＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２６１：１００４−１０１２、１９９３；第ＷＯ９５／１０６０７号；米
国特許第５，３５９，０５１号；同第ＷＯ９２／０６６９３号；およびＥＰ−Ａ
２−６１２８４４号を参照のこと）。簡潔には、このような分子は、それらが、
転写されるＦｋｈ^sfのｍＲＮＡ配列の領域と相補的であり、そしてワトソン−ク
リック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖の核酸は、ｍＲ
ＮＡの続くプロセシングを妨害し、それによってタンパク質の合成を妨げる。

【００８５】本発明の他の局面においては、ＦＫＨ^sfもしくはＦｋｈ^sf、またはＦＫＨ^sfも
しくはＦｋｈ^sfの変異形態を阻害し得るリボザイムが提供される。本明細書中で
使用される場合、「リボザイム」は、特異的認識のためのアンチセンス配列およ
びＲＮＡ−切断酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むことが意図される。触媒的な鎖
は、化学量論的な濃度を超える濃度で、標的ＲＮＡの特異的な部位を切断する。
広範な種々のリボザイムが、本発明の状況において利用され得る。これは例えば
、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃ
ｅｌｌ４８：２１１−２２０、１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａ
ｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５９６−６００、１９８８；Ｗａｌｂｏｔおよび
Ｂｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：１９６、１９８８、Ｈａｓｅｌｏｆ
ｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５、１９８８によって記
載されている）；ヘアピンリボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９３
年１０月１９日に発行された米国特許第５，２５４，６７８号、Ｈｅｍｐｅｌら
、１９９０年３月２６日に公開された、欧州特許公開番号第０３６０２５７
号によって記載されている）；およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａのリボソームＲＮ
Ａに基づくリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参照の
こと）を含む。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡから構成されるが、
ＤＮＡ、核酸アナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそれらのキメラ
（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。

【００８６】（４．標識）ＦＫＨ^sfもしくはＦｋｈ^sf（ならびにそれらの変異形態）、または上記または
下記の任意の候補分子が、以下を含む種々の化合物で標識され得る：例えば、蛍
光分子、毒素、および放射性核種。蛍光分子の代表的な例としては、フルオレセ
イン、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉタンパク質（例えば、フィコエリトリン）、ローダミ
ン、テキサスレッド、およびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表的な例と
しては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカ
ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａが挙げられる。放射性核種の代表的な例としては
、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｚｒ−８９、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９
ｍ、Ｒｈ−１０５、Ｐｄ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ
−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８，Ａｕ−１９８、Ａｕ−１９９，Ｐｂ−
２０３、Ａｔ−２１１、Ｐｂ−２１２、およびＢｉ−２１２が挙げられる。さら
に、上記の抗体もまた、標識され得るか、またはリガンド結合対の１つのパート
ナーに対して結合体化され得る。代表的な例としては、アビジン−ビオチン、お
よびリボフラビン−リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。

【００８７】上記の代表的な標識と本明細書中に記載されている分子とを結合体化または標
識するための方法は、当業者によって容易に達成され得る（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅ
ｃｅｎｅＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第４，７４４，９
８１号；Ａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ、米国特許第５，１０６，９５
１号；ＦｌｏｒｏｇｅｎｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、米国特許第４，０１８，８８４号；ＭｅｔａｌＲａ
ｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅＬａｂｅｌｅｄＰｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒＤｉａｇ
ｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ、米国特許第４，８９７，２５５号；およ
びＭｅｔａｌＲａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅＣｈｅｌａｔｉｎｇＣｏｍｐｏｕ
ｎｄｓｆｏｒＩｍｐｒｏｖｅｄＣｈｅｌａｔｉｏｎＫｉｎｅｔｉｃｓ、
米国特許第４，９８８，４９６号を参照のこと；Ｉｎｍａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第３４巻、ＡｆｆｉｎｉｔｙＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰａｒｔＢ、Ｊａｋｏｂｙ
およびＷｉｌｃｈｅｋ（編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、３０頁、１９７４をもまた参照のこと；ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、
「ＴｈｅＡｖｉｄｉｎ−ＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘｉｎＢｉｏａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７
１：１−３２、１９８８をもまた参照のこと）。

【００８８】（薬学的組成物）上記のように、本発明はまた、薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、
賦形剤、または希釈剤とともに、免疫系を調節する上記の分子の１つを含む、種
々の薬学的組成物を提供する。一般的には、このようなキャリアは、使用される
投与量および濃度では、レシピエントに対しては非毒性である。通常は、このよ
うな組成物の調製は、緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、低分子量（
約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコー
ス、スクロース、またはデキストリンを含む））、キレート化剤（例えば、ＥＤ
ＴＡ、グルタチオンなど）、安定剤、および賦形剤と、治療薬との混合を含む。
中性の緩衝化生理食塩水または非特異的な血清アルブミンと混合した生理食塩水
は、例示的な適切な希釈剤である。好ましくは、薬学的組成物（または「医薬品
」）は、滅菌の、発熱物質を含まない形態で提供される。

【００８９】さらに、本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製
され得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、このような薬学的組成物の使用に
関する説明書を提供するパッケージング材料とともに、容器内に配置され得る。
一般的には、このような説明者は、試薬の濃度、ならびに特定の実施態様におい
ては、薬学的組成物の再構成のために必要とされ得る賦形剤成分または希釈剤（
例えば、水、生理食塩水、もしくはＰＢＳ）の相対的な量を記載する具体的な表
現を含む。

【００９０】（処置方法）本発明はまた、免疫系を調節するための方法を提供する。免疫系を調節する、
本明細書中に記載されている分子の使用を通じて、温血動物中の広範な種々の状
態が、容易に処置され得るかまたは予防され得る。処置され得る温血動物の例と
しては、脊椎動物および哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、
イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含む）の両方が挙げられる。このような方
法は、変更された免疫系を有する患者において治療的な価値があり得る。これは
、種々の免疫不全症候群、ならびにＴ細胞媒介自己免疫疾患を有する患者の、化
学療法を受けている患者を含む。治療的な価値はまた、ワクチンアジュバントと
しての有用性によって認識され得る。

【００９１】治療用分子は、分子の型に依存して、種々の処方物において種々の経路を介し
て投与され得る。例えば、１つの実施態様においては、有機分子が、経口もしく
は鼻内経路によって送達され得るか、または注射（例えば、筋肉内、静脈内など
）によって送達され得る。

【００９２】１つの局面においては、免疫系を調節するための方法が提供される。この方法
は、免疫系を調節する分子の発現を指向するベクターを、リンパ系細胞中に導入
する工程、および温血動物にベクターを含有する細胞を投与する工程を包含する
。他の関連する実施態様においては、このベクターは、所望される標的の位置（
例えば、骨髄）に直接投与され得る。

【００９３】ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を含む、広範な種々のベク
ターが、このような治療目的のために利用され得る。適切なウイルスベクターの
代表的な例としては、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８
８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、第ＷＯ９４／２６９１４号
、第ＷＯ９３／９１９１号、第ＷＯ９９／２０７７８号、第ＷＯ９９／２０７７
３号；第ＷＯ９９／２０７７９号；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ９１（１）：２１
５−２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ９０（２４）：
１１４９８−５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８
８（６）：２８３８−４８、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３
（６）：１２０２−１２０７、１９９３；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、７５（２
）：２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．４（４
）：４０３−４０９、１９９３：Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａ
ｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ
．Ｇｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８、１９９２；およびＬｅｖｒｅｒｏら
、Ｇｅｎｅ、１０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ随伴ウイルス
ベクター（第ＷＯ９５／１３３６５号；Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ９０（２２
）：１０６１３−１０６１７、１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボ
ウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．５：
４５７−４６３、１９９４）、ポックスウイルスベクター（Ｐａｎｉｃａｌｉお
よびＰａｏｌｅｔｔｉ、ＰＮＡＳ、７９：４９２７−４９３１，１９８２；およ
びＯｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３
（２）：６５３−６６０、１９９３）、およびレトロウイルス（例えば、第ＥＰ
０，４１５，７３１号；第ＷＯ９０／０７９３６号；第ＷＯ９１／０２８５号、
第ＷＯ９４／０３６２２号；第ＷＯ９３／２５６９８号；第ＷＯ９３／２５２３
４号；米国特許第５，２１９，７４０号；第ＷＯ９３／１１２３０号；第ＷＯ９
３／１０２１８号）が挙げられる。同様に、種々のウイルスまたは非ウイルス供
給源に由来する種々のエレメント（例えば、プロモーター、エンベロープ配列な
ど）の混合物を含むウイルスベクターが、構築され得る。種々の実施態様におい
ては、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含むウイルス粒子のい
ずれかが、以下に記載されている方法および組成物において利用され得る。

【００９４】本発明の他の実施態様においては、免疫系を調節する分子（例えば、変異体Ｆ
ｋｈ^sf、またはアンチセンスもしくはＦｋｈ^sfを切断するリボザイム分子）をコ
ードする核酸分子が、以下を含む種々の別の技術によって投与され得る：例えば
、ポリ−Ｌ−リジンＤＮＡ複合体と結合体化したアシアロオソムコイド（ＡＳＯ
Ｒ）の投与（Ｃｒｉｓｔａｎｏら、ＰＮＡＳ９２１２２−９２１２６，１９９
３）、殺傷したアデノウイルスに連結されたＤＮＡ（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、１９９２）、サイトフェクチ
ンによって媒介される導入（ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ、Ｖｉｃａｌ、Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ）、直接的なＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：８
１５−８１８、１９９１）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．ｏｆＢｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６４；１６９８５−１６９８７、１９８９）；リポフェクション（Ｆ
ｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４
１３−７４１７、１９８９）；リポソーム（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、Ｃｉｒｃ、
８９（１）：１３−２１、１９９４；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ、８４：７８
５１−７８５５、１９８７）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ、８８：２７２６−２７３０、１９９１）；および
タンパク質自体をコードする核酸分子の、単独（ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａ
ｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３）またはＰＥＧ−核酸
複合体を利用するかのいずれかである直接的な送達。

【００９５】本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例としては、リボザイ
ムおよびアンチセンス分子（これらのそれぞれは、以下により詳細に議論されて
いる）が挙げられる。

【００９６】当業者に明らかであるように、投与の量および頻度は、もちろん、処置される
徴候の性質および重篤度、所望される応答、患者の状態のような因子に依存する
。代表的には、組成物は、上記のような種々の技術によって投与され得る。

【００９７】以下の実施例は、例示によって付与され，そして限定によっては与えられない
。

【００９８】（実施例）（実施例１）（ＳＣＵＲＦＹ変異体の原因である遺伝子の同定）（Ａ．ＳＣＵＲＦＹ遺伝子のクローニング）もともとのｓｃｕｒｆｙ変異は、ＯａｋＲｉｄｇｅＮａｔｉｏｎａｌＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＯＲＮＬ）に１９４９年にストックされた一部近交系のＭ
Ｒにおいて自発的に生じた。戻し交配分析を、マウスＳｃｕｒｆｙ変異を含むＸ
染色体の動原体周辺領域（ｐｅｒｉ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎ）
を詳細にマップするために使用した。同じ領域をカバーする物理的なマップを、
重複している酵母および細菌の人工染色体（ＹＡＣおよびＢＡＣ）の単離を通じ
て並行して生成した。一旦、候補領域が、約５００キロ塩基対（ｋｂ）にまで狭
められると、大規模なＤＮＡ配列決定を、４個の重複するＢＡＣクローンについ
て行った。この５００ｋｂの領域内の全ての転写ユニットを、配列データベース
の検索とコンピューターによるエキソン予想プログラムの適用との組合せにより
同定した。次いで、候補遺伝子を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙに由来するＲＮＡ
サンプルからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得た
ｃＤＮＡの配列を比較することによって、Ｓｃｕｒｆｙ特異的変異についてスク
リーニングした。Ｆｋｈ^sfと本明細書中で呼ばれる１つの遺伝子においては、２
塩基対（ｂｐ）の挿入が、正常なｃＤＮＡと比較してＳｃｕｒｆｙｃＤＮＡの
コード領域中に見出された。挿入を、いくつかのマウスの株（Ｓｃｕｒｆｙ変異
体を含む）のゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を比較することに
よって確認した。再び、２ｂｐの挿入を、Ｓｃｕｒｆｙサンプル中でのみ見出し
、これによって、これをＳｃｕｒｆｙ欠失の原因である可能性があると確定した
。

【００９９】マウスのＦｋｈ^sf遺伝子は、ＢＡＣクローン８Ｃ２２中に含まれ、そして完全
に配列決定されている。これは約１４ｋｂにまたがり、そして１１個のコードエ
キソンを含む。エキソン中断の位置は、ＧｅｎＳｃａｎエキソン推定プログラム
を使用して、ゲノムＤＮＡ配列のコンピューターによる分析によって最初に同定
した；次いで、エキソンの位置を、ゲノム配列に対する正常なマウスの組織に由
来するｃＤＮＡ配列の直接的な比較によって確認した。

【０１００】得られたｃＤＮＡの長さは、２１６０ｂｐである；コード領域は、その１２８
７ｂｐにまたがり、４２９アミノ酸のタンパク質をコードする。図１はマウスの
Ｆｋｈ^sf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す；翻訳は、２５９位で開始し、そ
して１５４６位で終結すると推定される。図２は、マウスのＦｋｈ^sfのアミノ酸
配列を示す。

【０１０１】（ｂ．Ｆｋｈ^sfトランスジェニックマウスの生成）Ｓｃｕｒｆｙ表現型の真の原因としてのＦｋｈ^sf遺伝子の実態を、トランスジ
ェニックマウスにおいて確認した。簡潔には、Ｆｋｈ^sf遺伝子の約７ｋｂのコー
ド領域、ならびに隣接する配列の上流の約２０ｋｂ、および下流の配列の約４ｋ
ｂ（図５）を含む正常なゲノムＤＮＡの３０ｋｂのフラグメントを、正常なマウ
スの１細胞胚中にマイクロインジェクションした。それぞれが別々のインテグリ
ンを有する５匹の個々の崩壊させた動物を生成し、そして各トランスジェニック
株に由来する雄性の動物を、雌性のｓｆキャリアと交配した。トランスジーン（
正常なＦｋｈ^sf）およびｓｆ変異（変異Ｆｋｈ^sf）の両方を有する雄性の子孫を
、分析した。

【０１０２】分析は、倭小（ｒｕｎｔｉｎｇ）、鱗状の皮膚、毛皮の異常、およびｓｃｕｒ
ｆｙ表現型の他の特徴についての動物の試験からなる。さらに、リンパ系組織（
胸腺、脾臓、および結節）を回収し、そしてそれらの大きさおよび細胞数を試験
し、そして正常な動物およびｓｃｕｒｆｙマウスの両方について比較した。全て
の５個のトランスジェニック株について、トランスジーンを保有した雄性のｓｆ
子孫は、大きさおよび重量において正常であり、そして全ての点で健常であるよ
うに見えた。これらのトランスジェニックマウスにおけるリンパ節の大きさは、
正常な動物にものと類似（またはそれよりも小さい）であり（図６）、そして活
性化されたＴ細胞の徴候はなかった。これらのパラメーターは、ｓｆマウスとは
極端に異なり、そして正常なＦｋｈ^sf遺伝子の添加が、ｓｃｕｒｆｙマウス中に
見出される欠損を克服し得ることを示す。従って、これによって、Ｆｋｈ^sf遺伝
子中の変異がＳｃｕｒｆｙ疾患の原因であることを確認する。

【０１０３】（実施例２）（ＦＫＨ^sf ｃＤＮＡの生成）完全なマウスのＦｋｈ^sfタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は
、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）手順によって得られ得る。
より詳細には、第１鎖のｃＤＮＡが、適切な供給源（例えば、マウスの脾臓）に
由来する５μｇの全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライミングすること、および標準的
な条件下で逆転写酵素を用いて伸張すること（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬＳ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔキット）によって、生成する。次いで、第１鎖のｃＤＮＡ
のアリコートを、正方向および逆方向プライマー（正方向プライマー：ＧＣＡＧ
ＡＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣ；逆方向プライマー：ＧＣＡＧＡ
ＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧ）（０．２ｍＭの最終濃度））、６０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグ
ネシウム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼの
存在下での、３５サイクルのＰＣＲ（９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間
、７２℃にて２分間）に供する。

【０１０４】（実施例３）（マウスのＦｋｈ^sfに対するヒトのオルソログの生成）完全なＦＫＨ^sfタンパク質をコードするヒトＦＫＨ^sf ｃＤＮＡは、実施例２
に記載されているものと本質的に同じ手順によって得ることができる。詳細には
、全脾臓ＲＮＡを用いて開始し、そして以下のオリゴヌクレオチドプライマー（
正方向プライマー：ＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ；逆方向
プライマー：ＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＣ）、および６０
℃のアニーリング温度を除いて上記と同じＰＣＲ条件を利用する。

【０１０５】図４は、今日までに得られた１８６９ｂｐのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（１
２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、１８９位で開始し、そして１
４８２位で終結すると推定される。図４は、４３１アミノ酸のヒトＦＫＨ^sfタン
パク質の配列を示す。マウスｃＤＮＡ配列に対するヒト遺伝子の推定されるコー
ド領域の比較は、ほぼ同一であるエキソン構造、および全タンパク質にわたる８
６．１％のアミノ酸配列同一性を明らかにする。

【０１０６】（実施例４）（ＳＣＵＲＦＹ変異体を検出するための方法）上記のように、Ｓｃｕｒｆｙ変異体を、最初に、ｓｆのＲＴ−ＰＣＲによって
誘導されたｃＤＮＡおよび正常なマウスのＲＮＡサンプルを直接配列決定するこ
とによって発見し、そしてゲノムＤＮＡに由来する同じ領域を配列決定すること
によって確認した。変異の性質（すなわち、２ｂｐの挿入）は、それ自体を、多
数の種々の変異検出アッセイに導く。これは、最初に、オリゴヌクレオチドプロ
ーブのディファレンシャルハイブリダイゼーションに基づく。このような、ハイ
ブリダイゼーションに基づくアッセイは、対立遺伝子特異的発現の定量的な分析
を可能にし得る。

【０１０７】一例としては、３６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴを使用して
、第１鎖のｃＤＮＡから増幅する：ＤＭＯ５９８５（正方向）：ＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧ（図
１のｎｔｄ．８２５−８４４）ＤＭＯ６７２４（逆方向）：ＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴ
Ｃ（ｎｔｄ１２２１−１１９９）。

【０１０８】ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜に移し、そ
してＳｃｕｒｆｙ特異的な２ｂｐの挿入部位に対応する領域に相補的である末端
標識オリゴヌクレオチドで標識する。２つの別々のハイブリダイゼーション反応
を、正常なおよびＳｃｕｒｆｙＰＣＲ産物を検出するために、以下のオリゴヌ
クレオチド（２ｂｐの挿入部位を太字で示す）を使用して行う：正常：ＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧＤＭＯ７４３９Ｓｃｕｒｆｙ：ＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＤＭＯ６９１９。

【０１０９】Ｓｃｕｒｆｙ変異はまた、冷却一本鎖立体構造多形性（ｃＳＳＣＰ）アッセイ
によっても検出され得る。このアッセイにおいては、上記と同じＰＣＲ産物を、
２０％のアクリルアミド（ＴＢＥ）ゲル上で、鎖の変性後に泳動する。Ｓｃｕｒ
ｆｙの挿入は、正常な配列と比較して鎖の移動においてシフトを生じ、そして別
の鎖が、エチジウムブロマイドでの染色後に検出される。

【０１１０】（実施例５）（ＦＫＨ^SF遺伝子の発現）半定量的なＲＴ−ＰＣＲが、広範な種々の組織および細胞株中におけるマウス
およびヒトのＦｋｈ^sf遺伝子の発現パターンを分析するために使用されている。
発現のレベルは、偏在して発現されるＤＡＤ−１遺伝子について正規化される。
簡潔には、Ｆｋｈ^sf遺伝子は、非常に低いレベルではあるが、これまでに試験さ
れたほぼ全ての組織（胸腺、脾臓、分類されたＣＤ４＋およびＣＤ４−ＣＤ８−
、Ｔリンパ球、ならびに腎臓、脳、ならびに種々のマウスおよびヒトのＴ細胞株
、ならびにヒト腫瘍を含む）中で発現される。しかし、発現がないことが、新た
に分類したマウスのＢ細胞において注目された。

【０１１１】予想されるように、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける正常な組織対Ｓｃｕｒｆｙ
組織において、発現レベルにおける差異は観察されなかった。

【０１１２】（実施例６）（インビトロでのＦＫＨ^SFの発現）全長のマウスおよびヒトのＦｋｈ^sf ｃＤＮＡ、ならびに種々のｃＤＮＡのサ
ブ領域を、哺乳動物細胞（たとえば、ヒトのＪｕｒｋａｔＴ細胞株）、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、または酵母中での発現が可能であるベクター中にクローン化した。Ｅ．
ｃｏｌｉ系または酵母系を、Ｆｋｈ^sf特異的抗体を惹起する目的のためのタンパ
ク質の産生に使用し得る（以下を参照のこと）。

【０１１３】（実施例７）（抗ＦＫＨ^SF抗体の生成）実施例６に記載されているベクターから発現されるタンパク質を、ＦＫＨ^sf特
異的抗体の産生のために適切な動物を免疫化するために使用する。全長または短
縮されたタンパク質のいずれかを、この目的のために使用し得る。タンパク質を
、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から、入
手し得る。動物種としては、マウス、ウサギ、モルモット、ニワトリ、または他
のものが挙げられ得る。ＦＫＨ^sfに対して特異的なウサギ抗血清は、生化学的な
特徴によって決定されるように、生成されている（免疫沈降およびウェスタンブ
ロッティング）。

【０１１４】（実施例８）（ＦＫＨ^SF遺伝子の機能についてのアッセイ）ＦＫＨ^sfタンパク質の機能の欠損が、ｓｃｕｒｆｙ動物において観察される表
現型（るいそう、敏感な免疫応答、および死）を生じるので、ＦＫＨ^sfタンパク
質の過剰な発現を評価するためのアッセイを記載する。トランスジェニック動物
（実施例１に記載されている）を、それらの免疫応答能力の状態について、いく
つかの異なるパラメーターを使用して試験する。動物を、リンパ節および胸腺中
に存在するリンパ系細胞の数について（図７）、およびインビトロでの刺激に対
するＴ細胞の応答性について（図８）試験する。

【０１１５】Ｓｃｕｒｆｙ変異動物は、正常な動物のそれらのリンパ節中の細胞よりもほぼ
２倍多い細胞を有する。しかし、正常なＦＫＨ^sfタンパク質の過剰なレベルを発
現するマウスは、ほぼ３倍多い細胞を含む（図７）。さらに、標準的な抗血清を
使用するフローサイトメトリーによって評価される場合に、それらの細胞表面の
表現型である場合（示さない）は、胸腺細胞の数は正常であり（図７）、このこ
とは、過剰のＦＫＨ^sfタンパク質に関連する発達的欠損が存在しないことを示す
。

【０１１６】正常なｓｃｕｒｆｙ動物およびトランスジェニック動物はさらに、Ｔ細胞の刺
激に対するそれらの増殖性応答について試験される。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ３お
よびＣＤ２８に対する抗体と反応し、そしてそれらの増殖性応答が、放射活性チ
ミジンの取りこみを使用して測定される。ｓｃｕｒｆｙ細胞は、刺激の非存在下
でのみ分裂するが、正常な細胞は、刺激の後に十分応答する。ＦＫＨ^sfトランス
ジェニック細胞もまた刺激に対して応答するが、応答は、正常な細胞のものより
も有意に少ない（図８）。このことは、過剰のＦＫＨ^sfを発現するＣＤ４＋Ｔ細
胞が、刺激に対して応答する能力を低下させられたことを示す。

【０１１７】（実施例９）（ＪＭ２に関連するヒトのＦＫＨ^SF ｃＤＮＡ配列）ヒトＦＫＨ^sf ｃＤＮＡ配列の改変されたバージョンが、ＧｅｎＢａｎｋによ
って公開されている配列データベース中に存在する。この配列は、ＪＭ２と呼ば
れ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１号）、そしてＦＫＨ^sf遺伝子を
含むゲノム配列に対するエキソン推定プログラムの適用の結果である（Ｓｔｒｏ
ｍ，Ｔ．Ｍ．ら、未公開−ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＪ００５８９１を参照の
こと）。対称的に、ＦＫＨ^sf ｃＤＮＡの構造は、実験によって決定された。Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｕ
ＳＡ）、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＧＡＰプログラムを、２つの
配列を比較するために使用し、そして差異を図９に示す。２つの配列の５’末端
は、ゲノムＤＮＡ配列の状況におけるそれらの位置において異なり、ＦＫＨ^sfの
第２のコードエキソンがＪＭ２から欠落しており、そしてＦＫＨ^sf遺伝子の最後
のイントロンが、ＪＭ２配列中ではスプライシングされない。これらの差異は、
ＦＫＨ^sfと比較して、より短いアミノ末端ドメイン、カルボキシ末端でのフォー
クヘッドドメイン（以下を参照のこと）中への大きい挿入を有するＪＭ２タンパ
ク質を生じる。

【０１１８】（実施例１０）（ＦＫＨ^sfタンパク質は種を超えて保存されている）ＦＫＨ^sfタンパク質は、機能的ドメインを示し得る配列モチーフに基づいて、
サブ領域に分けられ得る。ＦＫＨ^sf中の２つの重要なモチーフは、タンパク質の
中央部分中のＣ₂ＩＩ₂クラスの単一のジンクフィンガー（ＺＮＦ）、およびタン
パク質の最もカルボキシ末端での二股の矢じりまたは翼状のへリックスドメイン
である。ＦＫＨ^sfと他のタンパク質との間での相同性の程度を特徴付ける目的の
ために、本発明者らは、タンパク質を以下の４つの領域に分けた：アミノ末端ドメイン：図２の残基１−１９７図４の残基１−１９８ジンクフィンガードメイン：図２の残基１９８−２２１図４の残基１９９−２２２中央ドメイン：図２の残基２２２−３３６図４の残基２２３−３３６フォークヘッドドメイン：図２の残基３３７−４２９図４の残基３３７−４３１。

【０１１９】ＤＮＡＳｔａｒ配列分析パッケージによるＭｕｌｔｉｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを使用して、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ
アルゴリズムを、これらの４つのドメインにわたる、ヒトＦＫＨ^sfとマウスＦｋ
ｈ^sfタンパク質との間での類似性の程度を決定するために使用した。結果を、図
１０に示す。類似性は、８２．８％から９６．４％までの範囲を示し、このこと
は、このタンパク質が非常に高度に種をこえて保存されていることを示す。

【０１２０】（実施例１１）（新規のＦＫＨ^SFに関連する遺伝子の同定）ＦＫＨ^sf遺伝子配列の特有の特徴を利用して、二股の矢じりを含む分子の同じ
サブクラスに入る他の新規の遺伝子（およびタンパク質）を同定し得る。ＦＫＨ ^sf タンパク質は、それが、フォークヘッドドメインに対して単一のジンクフィン
ガードメインのアミノ末端を、そしてフォークヘッドドメインの最もカルボキシ
末端に有する点で、特有である。縮重ＰＣＲアプローチを、フォークヘッドドメ
インの上流にジンクフィンガー配列を含む新規の遺伝子を単離するために行い得
る。例えば、以下の縮重プライマーを合成した（縮重の位置を括弧で示し、そし
て「Ｉ」はヌクレオシドイノシンを示す）：正方向プライマー：ＣＡ（ＴＣ）ＧＧＩＧＡ（ＧＡ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ
）ＴＧＧ逆方向プライマー：（ＧＡ）ＡＡＣＣＡ（ＧＡ）ＴＴ（ＡＧ）ＴＡ（ＡＧＴ）
ＡＴ（ＣＴ）ＴＣ（ＧＡ）ＴＴ。

【０１２１】正方向プライマーは、ジンクフィンガー配列中の領域に対応し、そして逆方向
プライマーは、フォークヘッドドメインの中央の領域に対応する。これらのプラ
イマーを使用して、種々のヒト組織（肝臓、脾臓、脳、肺、腎臓などを含む）か
ら実施例２のように産生した第１鎖のｃＤＮＡを増幅した。以下のＰＣＲ条件：
０．２ｍＭの最終濃度の正方向プライマーおよび逆方向プライマー、６０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭの硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウ
ム、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼ、を使用
し３５サイクル（９４℃にて３０秒間、５０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間
）に供した。ＰＣＲ産物を、１．８％のアガロースゲル（１×ＴＡＥ中で泳動）
上で可視化し、そしてＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にサブクローン化した；個々のクローンを配列決定し、
そして全長ｃＤＮＡのさらなる特徴付けのために使用した。

【０１２２】あるいは、ＦＫＨ^sf遺伝子の特有の領域（すなわち、「アミノ末端」ドメイン
および「中央」ドメイン）を、ハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングのために使用し得る。種々のヒトおよび／またはマウスの
組織に由来し、そしてλファージベクター（例えば、λｇｔ１１）中で増殖させ
たｃＤＮＡライブラリーをアガロース上にプレートし、プラークをナイロン膜に
移し、そしてＦＫＨ^sf遺伝子の特有の領域に由来するフラグメントを用いてプロ
ーブした。高ストリンジェンシーの条件（例えば、６５℃にて、５×ＳＳＰＥ、
５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、
６５℃にて、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中での洗浄）下では、密接に
関連するごくわずかな配列のみが、ハイブリダイズすると予想した（すなわち、
９０−１００％の相同性）。上記と同じ緩衝液中での４５−５５℃でのこのよう
なハイブリダイゼーションおよび洗浄のような低いストリンジェンシーの下では
、ＦＫＨ^sfに関連する遺伝子（６５−９０％の相同性）が同定され得る。ＦＫＨ ^sf の特有の配列を用いて公開されているデータベースの検索によって得られる結
果に基づくと、低いストリンジェンシーから中程度のストリンジェンシーまでの
ハイブダイゼーション実験を通じて同定される任意の遺伝子が、「ＦＫＨ^sfファ
ミリー」の新規のメンバーを提示すると予想される。

【０１２３】上記から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的のために本明細書中で記載
されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ
得ることが、理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合
を除いて、限定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１は、マウスのＦｋｈ^sf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示
す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。

【図１Ｂ】図１は、マウスのＦｋｈ^sf ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示
す；翻訳は、２５９位で始まり、そして１５４６位で終わると推定される。

【図２】図２は、マウスのＦｋｈ^sfのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図３Ａ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド
配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位
で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。

【図３Ｂ】図３は、ヒトのＦＫＨｓｆｃＤＮＡに対応する１７３５ｂｐのヌクレオチド
配列（配列番号３、１２９３ｂｐのコード領域を含む）を示す；翻訳は、５５位
で始まり、そして１３４８位で終わると推定される。

【図４】図４は、ヒトのＦＫＨ^sfタンパク質の４３１アミノ酸の配列（配列番号４）を
示す。

【図５】図５は、ＦＫＨ^sfトランスジェニックマウスの生成のためのベクターを模式的
に示す。

【図６】図６は、ＦＫＨ^sfトランスジーンが、ｓｃｕｒｆｙ動物における欠損を修復す
ることを示す写真である。

【図７】図７は、ＦＫＨ^sf ｔｇマウスが、正常な細胞と比較して、減少したリンパ節
細胞を有することを示すグラフである。

【図８】図８は、ＦＫＨ^sfトランスジェニックマウスがインビトロでの刺激にほとんど
応答しないことを示すグラフである。

【図９】図９は、ＦＫＨ^sfとＪＭ２とのｃＤＮＡの比較である。

【図１０】図１０は、ヒトのＦＫＨ^sfとマウスのＦｋｈ^sfとの種々の領域における相同性
を比較する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 33/532 ＡＧ０１Ｎ 33/53 33/543 ５０１Ａ 33/532 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/543 ５０１Ｃ１２Ｒ 1:91 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジェフリー，エリックダブリュー．アメリカ合衆国ワシントン 98117，シアトル， 17ティーエイチアベニューエヌ．ダブリュー． 7327 (72)発明者ヘリルド，キャサリンエイ．アメリカ合衆国ワシントン 98110，ベインブリッジアイランド，グロウアベニューエヌ．ダブリュー． 1161 (72)発明者ラムズデル，フレッドアメリカ合衆国ワシントン 98110，ベインブリッジアイランド，エヌイーデイロード 9891 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA43 BA61 CA03 CA04 CA09 CA11 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 GA12 HA14 HA15 4B063 QA01 QA07 QA17 QA18 QA19 QQ08 QQ42 QR32 QR56 QR62 QR79 QR80 QR84 QS05 QS25 QS34 QS36 QX07 4B064 AG01 AG26 AG27 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA90X AA91Y AA93X AA93Y AB01 BA02 BA04 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｆｋｈ^sfをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】前記Ｆｋｈ^sfがマウスのＦｋｈ^sfである、請求項１に記載の
単離された核酸分子。
【請求項３】前記Ｆｋｈ^sfがヒトのＦＫＨ^sfである、請求項１に記載の単
離された核酸分子。
【請求項４】前記核酸分子が、（ａ）配列番号２または４を含むアミノ酸
配列をコードする核酸分子、（ｂ）配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を
有する核酸分子、またはその相補物に対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする核酸分子、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコ
ードされるポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸分子、からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】前記核酸分子が配列番号２のアミノ酸配列をコードする、請
求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求
項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項８】前記ベクターがウイルスベクターである、請求項７に記載の
ベクター。
【請求項９】前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス
、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアルファウイルスからなる群
より選択されるウイルスから生成される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】請求項１に記載の単離された核酸分子およびプロモーター
を含む発現ベクターであって、ここで、該プロモーターが該核酸分子と作動可能
に連結されている、発現ベクター。
【請求項１１】請求項１０に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞
。
【請求項１２】Ｆｋｈ^sfタンパク質を調製するために請求項１０に記載の
発現ベクターを使用する方法であって、該方法が以下の工程：（ａ）該発現ベクターを含み、そして該タンパク質を産生する、組換え宿主細
胞を培養する工程、および（ｂ）該培養した組換え宿主細胞から該タンパク質を単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】請求項１から６のいずれか１項に記載の核酸分子によって
コードされるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプ
チドと特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】前記抗体が、以下：（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、および（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、からなる群より選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１６】前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、
Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択
される、請求項１４に記載の抗体フラグメント。
【請求項１７】請求項１３に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質
。
【請求項１８】被験体に由来する生物学的サンプル中のＦｋｈ^sf核酸配列
の存在を検出する方法であって、以下の工程：（ａ）Ｆｋｈ^sf特異的核酸プローブと、（ｉ）該生物学的サンプルから単離し
た試験核酸分子、または（ｉｉ）ＲＮＡ分子から合成した核酸分子のいずれかと
を、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該プロ
ーブが、請求項１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を認識する、工程
、および（ｂ）該核酸プローブと（ｉ）または（ｉｉ）とのハイブリッドの形成を検出
する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】前記試験核酸分子が、ＲＴ−ＰＣＲによって得られる、請
求項１８に記載の方法。
【請求項２０】生物学的サンプル中のＦｋｈ^sfまたはその変異形態の存在
を検出する方法であって、以下の工程：（ａ）該生物学的サンプルを、抗Ｆｋｈ^sf抗体または抗体フラグメントと接触
させる工程であって、ここで、該接触工程が、該生物学的サンプルに対する該抗
体または抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われる、工程、および（ｂ）任意の該結合した抗体または結合した抗体フラグメントを検出する工程
、を包含する、方法。
【請求項２１】前記抗体または前記抗体フラグメントが、以下：（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）マウスのモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）から誘導されるヒト化抗体、（ｄ）ヒトのモノクローナル抗体、および（ｅ）（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）から誘導される抗体フラグメント、からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、
Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、および最小認識ユニットからなる群より選択
される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】前記抗体または前記抗体フラグメントが、放射性同位元素
、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生体発光標識、およびコロイド状の金か
らなる群より選択される検出可能な標識をさらに含む、請求項２０に記載の方法
。
【請求項２４】請求項１に記載の核酸分子にハイブリダイズし得る、単離
されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】検出可能な標識をさらに含む、請求項２４に記載のオリゴ
ヌクレオチド。
【請求項２６】動物に対して請求項１に記載のＦｋｈ^sf核酸分子を投与す
る工程を包含する、動物に対してＦｋｈ^sf核酸分子を導入する方法。
【請求項２７】前記核酸分子がウイルスベクターによって発現される、請
求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記核酸分子がプラスミドベクターによって発現される、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】前記核酸分子がインビボで動物に投与される、請求項２６
に記載の方法。
【請求項３０】前記核酸分子がエキソビボで細胞に投与され、次いで該細
胞が前記動物に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】前記細胞が造血細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】前記造血細胞がＴ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】前記動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラット、およびマ
ウスからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】その細胞がＦｋｈ^sfタンパク質をコードする配列を含むト
ランスジーンを発現する、ヒト以外のトランスジェニック動物。