JP2010019765A - 検出方法、検出用試料セルおよび検出用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】被検出物質の量を検出する検出方法において、一分子レベルでの高感度検出を可能とする。
【解決手段】金属層１２を含むセンサ部１４に試料Ｓを供給し、励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを発生せしめ、蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆと１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いる。そして、この蛍光増強微粒子Ｍと、上記光電場Ｄ、金属層１２、または近傍にある他の蛍光増強微粒子Ｍとの相互作用等により、蛍光標識から生じる蛍光Ｌｆを増強する
【選択図】図１
【解決手段】金属層１２を含むセンサ部１４に試料Ｓを供給し、励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを発生せしめ、蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆと１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いる。そして、この蛍光増強微粒子Ｍと、上記光電場Ｄ、金属層１２、または近傍にある他の蛍光増強微粒子Ｍとの相互作用等により、蛍光標識から生じる蛍光Ｌｆを増強する
【選択図】図１
Description
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法、検出用試料セルおよび検出用キットに関するものである。
バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光材料ではない場合、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。
上記蛍光法において、試料を流しながら特定の被検出物質のみを効率よく検出できる等の理由から、以下に示す２つの方法により被検出物質をセンサ部表面に固定し、その後蛍光検出を行う手法が一般的である。このような手法の１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原を特異的に結合させ、次いで、蛍光標識が付与された、抗原と特異的に結合する２次抗体を、さらに上記抗原に結合させることにより、１次抗体―抗原―２次抗体という結合状態を形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂サンドイッチ法である。また、もう１つは、例えば被検出物質が抗原である場合に、センサ部表面に固定された１次抗体に、抗原と蛍光標識が付与された２次抗体（前述の２次抗体と異なり、１次抗体と特異的に結合する）とを、競合的に１次抗体と結合させ、競合的に結合した２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出する、所謂競合法である。
また、蛍光検出においてＳ／Ｎ比を向上できる等の理由から、上記のような方法によって間接的にセンサ部に固定された蛍光標識を、エバネッセント光により励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセント蛍光法は、励起光をセンサ部裏面から入射し、センサ部表面に染み出すエバネッセント光により蛍光標識を励起して、その蛍光標識から生じる蛍光を検出するものである。
一方、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が、特許文献１、非特許文献１などに提案されている。この表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、センサ部に金属層を設け、この金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎ比を向上させるものである。
また、エバネッセント蛍光法において、表面プラズモン増強蛍光法と同様に、センサ部の電場を増強する効果を有する方法として、光導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、センサ部に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、この光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
また、特許文献２および非特許文献３には、上記に示した蛍光法のように蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)を検出する方法が提案されている。
以上のように、バイオ測定等においては、被検出物質を検出するための方法として、励起光の照射により、プラズモン共鳴や光導波モードを生じさせ、これらによって増強された電場で蛍光標識を励起させ、この蛍光標識の励起に起因して生じる光を検出する種々の方法が提案されている。
しかしながら、上記のような方法では分子の個数に換算すると未だ１０５個レベルであり、一分子の検出には程遠いのが現状である。
そこで、非特許文献４に示されているように、一分子レベルでの検出が可能である金属プローブを用いたラマン分光法が注目されている。これは、金属プローブ先端に光を入射して、この先端に局在プラズモンを生じさせ、これにより基板とプローブの間に生じる局所的な電場増強場を利用するものである。これにより、プローブ直下にある分子によるラマン過程の散乱断面積を実効的に増大し、理論的には入射光強度の数１０倍から１０６倍の増強度が得られると考えられている（非特許文献４ ｐｐ．２７７ ２．２．１節）。
特開平１０−３０７１４１号公報
米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
2007年春季 応用物理学会 予稿集 Ｎo.３,P.1378
Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
井上康志、河田聡，分光研究，第５１巻，第６号，ｐ．２７６−２８５（２００２）
しかしながら、ラマン信号は、溶媒などの被検出物質が置かれている状態及び環境に大きく左右され、また夾雑物の振動もスペクトルに現れるため、定性分析としては有用であるが定量性は期待できない。また、金属プローブによる局所的な強電場の幅はせいぜい数十ｎｍ程度であって測定できる領域が小さいため、金属プローブの走査が必要となり測定が面倒である。さらには、一般的にラマン分光装置は、大型かつ高価であり操作性も良くない。
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、ラマン分光法より容易かつ低コストの検出方法によって、一分子レベルでの高感度検出を可能とし、かつ広い検出範囲を有する検出方法を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は上記検出方法に用いられる検出用試料セルおよび検出用キットを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明による検出方法は、誘電体プレートの一面に、この誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
センサ部に試料を接触させることにより、試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、
センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
増強した光電場により、蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する検出方法において、
蛍光標識として、複数の蛍光色素分子および１以上の蛍光増強微粒子を、複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とするものである。
センサ部に試料を接触させることにより、試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、
センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
増強した光電場により、蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する検出方法において、
蛍光標識として、複数の蛍光色素分子および１以上の蛍光増強微粒子を、複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とするものである。
ここで、「金属層を含む積層構造」とは、金属層を含み少なくとも１以上の層からなる構造を意味するものとする。つまり、上記積層構造は、金属層のみでもよい。なお、ここで言う「層」とは、必ずしも一面を覆うものである必要はなく、例えば、微小開孔を有するものや粗密のあるものであってもよい。
「蛍光標識結合物質」は、被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する蛍光標識された結合物質を意味するものとする。例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と蛍光標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光標識とから構成される。
蛍光標識の「励起に起因して生じる光」とは、蛍光標識が励起することにより直接的または間接的に生じる光であって、その光の発生量と励起した蛍光標識の数量との間に相関性を有するものを意味するものとする。
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無の検出を含み、定性的な量のみならず、定量的な量を検出することも意味するものとする。
「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場を意味するものとする。
「増強した光電場を生じさせる」とは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものとする。なお、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴の励起による増強であってもよいし、光導波モードの励起による増強であってもよい。
蛍光物質の透光材料により包含される蛍光色素分子の数は、１個でもよいが、複数であることがより好ましい。なお、蛍光物質が複数の蛍光色素分子を備えるものである場合には、少なくとも１つの蛍光色素分子が透光材料により包まれていればよく、他の蛍光色素分子の一部が透光材料の外部に露出していてもよい。
「蛍光増強微粒子」とは、この蛍光増強微粒子と、上記光電場、金属層、または近傍にある他の蛍光増強微粒子との相互作用等により、蛍光標識から生じる蛍光を増強するものを意味するものとする。
さらに、本発明による検出方法において、蛍光増強微粒子は、散乱性微粒子であることが好ましい。
また、蛍光増強微粒子は、金属微粒子であることが好ましく、金属ナノロッドであることがより好ましい。
そして、蛍光増強微粒子の粒径は、１０〜２００ｎｍであることが好ましい。
ここで、金属微粒子の「粒径」とは、微粒子の最大径を意味するものとする。
「ナノロッド」とは、形状がロッド状（棒状）のナノ微粒子であって、縦軸と横軸との長さの比（アスペクト比）が概ね１〜２０であるものを意味するものとする。
さらに、「蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、この励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を検出するものであってもよいし、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光を検出するものであってもよい。具体的には、以下の方法（１）〜（４）が挙げられる。
（１）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（２）励起光の照射により金属層にプラズモンを励起し、プラズモンによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
（３）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光を検出する方法。
（４）センサチップとして、積層構造が光導波層を備えるものを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードによって増強した光電場を発生せしめ、蛍光標識の励起に起因して生じる光として、この励起によって蛍光標識から生じる蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対し上記一面と対向する他面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する方法。
なお、（１）および（２）において、プラズモンの励起は、金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度で励起光を入射し、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよい。一方、プラズモンの励起は、金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体、あるいは励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、励起光の照射により金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。
さらに、本発明による検出用試料セルは、上記に記載の検出方法においてセンサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなることを特徴とするものである。
液体試料が流下される流路を有する基台と、
流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、
流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、
注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなることを特徴とするものである。
そして、本発明による検出用試料セルにおいて、蛍光標識結合物質をセンサ部上に固定するための第１の結合物質であって、センサ部上に固定されているものを備えることが好ましい。
また、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちいずれか一方の結合物質と、この一方の結合物質が修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質であって、センサ部より上流側の流路内に配置されている蛍光標識結合物質を備えることが好ましい。
なお、本発明による検出用試料セルは、上記の蛍光標識結合物質が、第２の結合物質と蛍光標識とからなる場合にはサンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、第３の結合物質と蛍光標識とからなる場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
そして、積層構造は、光導波層を備えることが好ましい。
さらに、本発明による検出用キットは、上記に記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、蛍光標識結合物質をセンサ部上に固定するための、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなる、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される標識用溶液であって、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質と、この一方の結合物質が修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
液体試料が流下される流路を有する基台と、流路の上流側に設けられた流路に液体試料を注入するための注入口と、流路の下流側に設けられた、注入口から注入された液体試料を下流側に流すための空気孔と、注入口と空気孔との間の流路に設けられたセンサチップ部であって、流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、蛍光標識結合物質をセンサ部上に固定するための、センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、センサ部が、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなる、センサチップとして使用される検出用試料セル、および
液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される標識用溶液であって、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質と、この一方の結合物質が修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質を含む標識用溶液を備えてなることを特徴とするものである。
なお、本発明による検出用キットは、標識用溶液に含まれる蛍光標識結合物質が、第２の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合にはサンドイッチ法によるアッセイを行うのに好適なものとなり、第３の結合物質と蛍光標識とからなるものを備えている場合には競合法によるアッセイを行うのに好適なものとなる。
そして、本発明による検出用キットにおいて、積層構造は、金属層上に光導波層を備えることが好ましい。
ここで、検出用試料セルおよび検出用キットにおいて、「蛍光物質」は、上記と同様に、複数の蛍光色素分子および１以上の蛍光増強微粒子を、複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなるものである。
本発明による蛍光検出方法では、蛍光増強微粒子が、蛍光標識である蛍光物質中の蛍光色素分子の近傍に存在する状態で検出を行っている。したがって、この蛍光増強微粒子と、上記光電場、金属層、または近傍にある他の蛍光増強微粒子との相互作用等により、蛍光標識から生じる蛍光を増強することができる。そして、蛍光標識の励起に起因して生じる光を上記蛍光の増強によって、直接的に或は間接的に増強することができる。この結果、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
「検出方法および検出装置」
＜第１の実施形態＞
本発明の検出方法は、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１の一面に金属層１２を含むセンサ部１４を有してなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを、該センサ部１４上に結合させ、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射し、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上の光電場を増強させ、該増強された光電場Ｄ内における、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法であって、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆおよび１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いることを特徴とするものである。
＜第１の実施形態＞
本発明の検出方法は、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１の一面に金属層１２を含むセンサ部１４を有してなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを、該センサ部１４上に結合させ、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射し、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上の光電場を増強させ、該増強された光電場Ｄ内における、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識の励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法であって、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆおよび１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用いることを特徴とするものである。
また、本発明の検出装置１は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１９と、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射により生じる、被検出物質Ａに応じた量の光を検出する光検出手段３０とを備えている。
本発明は、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、その増強した光電場Ｄにおいて蛍光標識が励起されることによって生じる光を検出するものである。しかしながら、光電場Ｄを増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるもの（第４の実施形態参照）であってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光Ｌｆを検出してもよいし、その蛍光Ｌｆが金属層１２に新たに表面プラズモンを誘起することによって生じる放射光Ｌｐを検出してもよい（第３の実施形態参照）。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。なお、本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場Ｄを増強させ、増強された光電場Ｄにおいて励起された蛍光Ｌｆを検出する蛍光検出方法および装置である。
本検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に金属層１２が設けられてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用いる。
センサチップ１０は、ガラス板などの誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属層１２として金属膜が成膜されたものである。誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより好ましい。金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクを誘電体プレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光Ｌｏの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１２として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１２の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。なお、「主成分」とは、含量９０質量％以上の成分と定義する。
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質である。そして、蛍光標識結合物質ＢＦは、図１で示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ２と蛍光標識とから構成されるものであり、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質Ａと競合する第３の結合物質と蛍光標識とから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０として、センサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定されてなるものを用いた場合、サンドイッチ法では、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この結合物質が修飾された蛍光標識とからなる蛍光標識結合物質ＢＦが用いられる。一方、同様の場合において競合法では、被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この結合物質が修飾された蛍光標識とからなる蛍光標識結合物質が用いられる。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質として所謂１次抗体を用いることができる。
蛍光物質Ｆは、図１の一部に拡大して示すように、複数の蛍光色素分子ｆおよび１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、該複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する透光材料１６により包含してなるものである。蛍光物質Ｆは、以下のようにして作製することができる。
まず、上記の蛍光増強微粒子Ｍを内包する透光材料１６を形成する方法について２つの例を説明する。第１の方法は、透光材料１６をＳｉＯ２被膜から形成するものであり、大きく分けて次の（１）〜（３）の工程からなる。
（１）金微粒子となる金コロイドの合成
（２）金コロイド表面分散剤の置換（クエン酸→シロキサン）
５×＝１０−４ｍｏｌの金コロイド水溶液５００ｍｌ（ミリ・リットル）に、ＡＰＳ（（3-Aminopropyl)trimethoxysilane）水溶液（２．５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
（３）金コロイド表面のＳｉＯ２修飾
ｐＨ１０〜１１に調整したsodium silicate ０．５４重量％水溶液２０ｍｌを工程（２）の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。２４時間経過すると、厚さが約４ｎｍのＳｉＯ２被膜が形成される。この溶液を遠心分離により３０ｍｌまで濃縮した溶液に、１７０ｍｌのエタノールを添加する。さらに０．６ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２８％）を滴下し、８０μｌ（マイクロ・リットル）のＴＥＳ（テトラエトキシシラン）を添加し、２４時間ゆっくり攪拌すると、厚さ２０ｎｍのＳｉＯ２被膜からなる透光材料１６が形成される。
（１）金微粒子となる金コロイドの合成
（２）金コロイド表面分散剤の置換（クエン酸→シロキサン）
５×＝１０−４ｍｏｌの金コロイド水溶液５００ｍｌ（ミリ・リットル）に、ＡＰＳ（（3-Aminopropyl)trimethoxysilane）水溶液（２．５ｍｌ、１ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
（３）金コロイド表面のＳｉＯ２修飾
ｐＨ１０〜１１に調整したsodium silicate ０．５４重量％水溶液２０ｍｌを工程（２）の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。２４時間経過すると、厚さが約４ｎｍのＳｉＯ２被膜が形成される。この溶液を遠心分離により３０ｍｌまで濃縮した溶液に、１７０ｍｌのエタノールを添加する。さらに０．６ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２８％）を滴下し、８０μｌ（マイクロ・リットル）のＴＥＳ（テトラエトキシシラン）を添加し、２４時間ゆっくり攪拌すると、厚さ２０ｎｍのＳｉＯ２被膜からなる透光材料１６が形成される。
次に第２の方法として、透光材料１６をポリマー被覆から形成する場合について説明する。この方法は、大きく分けて次の（１）〜（２）の工程からなる。
（１）金微粒子となる金ナノ粒子のＤＭＦへの再分散
平均粒径が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約３６０ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含む水分散液を１ｍｌ用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み０.９５ｍｌを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を１ｍｌのＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）に再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、ＤＭＦを加える前に水で洗浄した方が良い。
（２）金ナノ粒子のカプセル化
上記（１）の工程で得られた、平均粒径が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を約６４８ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含むＤＭＦ分散液１ｍｌに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体(ポリスチレンが約１００量体、ポリアクリル酸が約１３量体)のＤＭＦ溶液(約１０−２ｇ/ｍｌ) １０μｌを加え、シリンジポンプにより８.３μｌ／ｍｉｎの流量で水２００μｌを加えて激しく撹拌する。１０分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで１重量％のドデカンチオールＤＭＦ溶液５μｌを加え、２４時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、２ｍｌ／ｈの流量で水３ｍｌを加える。
次に透析により２４時間かけてＤＭＦを除去する。次いで撹拌しながら７２μｌのＥＤＣ溶液（水に対して０．１重量％：２４ｎｍｏｌ）を一気に添加し、３０分撹拌したところで１４４μｌのＥＤＯＤＥＡ溶液（水に対して０．１重量％：９６ｎｍｏｌ）を一気に添加し、撹拌する。
その後、透析により２４時間かけて試薬を除去し、次いで４０００Ｇで３０分間遠心分離を行い、体積で８０％に相当する上澄みを捨てる。次に捨てた上澄みと同体積の水を加えて同様に遠心分離を行う。この遠心分離から遠心分離までの操作を３回以上繰り返すことにより、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体の架橋物からなる被膜が金ナノ粒子（金微粒子）の周りに透光材料１６として形成される。
平均粒径が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約３６０ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含む水分散液を１ｍｌ用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み０.９５ｍｌを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を１ｍｌのＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）に再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、ＤＭＦを加える前に水で洗浄した方が良い。
（２）金ナノ粒子のカプセル化
上記（１）の工程で得られた、平均粒径が約３０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を約６４８ｐｍｏｌ（＝７×１０−１１重量％）含むＤＭＦ分散液１ｍｌに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体(ポリスチレンが約１００量体、ポリアクリル酸が約１３量体)のＤＭＦ溶液(約１０−２ｇ/ｍｌ) １０μｌを加え、シリンジポンプにより８.３μｌ／ｍｉｎの流量で水２００μｌを加えて激しく撹拌する。１０分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで１重量％のドデカンチオールＤＭＦ溶液５μｌを加え、２４時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、２ｍｌ／ｈの流量で水３ｍｌを加える。
次に透析により２４時間かけてＤＭＦを除去する。次いで撹拌しながら７２μｌのＥＤＣ溶液（水に対して０．１重量％：２４ｎｍｏｌ）を一気に添加し、３０分撹拌したところで１４４μｌのＥＤＯＤＥＡ溶液（水に対して０．１重量％：９６ｎｍｏｌ）を一気に添加し、撹拌する。
その後、透析により２４時間かけて試薬を除去し、次いで４０００Ｇで３０分間遠心分離を行い、体積で８０％に相当する上澄みを捨てる。次に捨てた上澄みと同体積の水を加えて同様に遠心分離を行う。この遠心分離から遠心分離までの操作を３回以上繰り返すことにより、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体の架橋物からなる被膜が金ナノ粒子（金微粒子）の周りに透光材料１６として形成される。
そして、上記の工程で作成した蛍光増強微粒子Ｍを包含する蛍光物質Ｆに蛍光色素分子ｆを含浸させる。この工程は以下の通りである。上記の工程で作成した蛍光増強微粒子Ｍを包含する蛍光物質Ｆを調整して０．１％Ｓｏｌｉｄ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
以上の工程により、蛍光色素分子ｆおよび１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素分子ｆを含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ１５０ｎｍ）となる。
次に、蛍光色素分子（林原生物化学研究所、ＮＫ−２０１４、励起波長：７８０ｎｍ）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。
以上の工程により、蛍光色素分子ｆおよび１以上の蛍光増強微粒子Ｍを、蛍光色素分子ｆから生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素分子ｆを含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ１５０ｎｍ）となる。
蛍光物質Ｆは、複数の蛍光色素分子ｆを内包するものであるため、従来の蛍光色素分子ｆ単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。また、蛍光物質Ｆは、拡散時間の点から粒径が５３００ｎｍ以下のものが好ましい。また、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から１００ｎｍ〜７００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。透光材料１６としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ２などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
蛍光増強微粒子Ｍは、上記光電場、金属層、または近傍にある他の蛍光増強微粒子との相互作用等により、蛍光Ｌｆを増強するものである。蛍光増強微粒子Ｍは、特に限定されるものではないが、散乱性材料からなる散乱性微粒子であることが好ましい。散乱性微粒子としては、例えば、量子ドット等の無機微粒子や散乱性ポリマー等からなる有機微粒子が挙げられる。さらに、蛍光増強微粒子Ｍは、金属微粒子であることが好ましく、金属ナノロッドであることがより好ましい。金属ナノロッドの場合には、複数の微粒子を充填するときに、充填率を上げることができるためである。金属微粒子の粒径は、局在プラズモンを効果的に誘起することから、励起光Ｌｉの波長より小さいことが好ましく、４０〜２００ｎｍが特に好ましい。なお、ここで言う粒径とは微粒子の最大径を意味する。
なお、本実施形態においては、センサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部１３が備えられ、センサチップ１０と試料保持部１３により液体試料Ｓを保持可能な箱状セルが構成されている。なお、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部１３を備えない態様であってもよい。
励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面で励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で界面に対して入射させる。
光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。
収容部１９は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップ１０のセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出器３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１９に対しセンサチップ１０は、図中矢印Ｘ方向に出し入れすることができる。
以下、本実施形態における検出方法および検出装置の作用を説明する。
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
センサチップ１０として、金属膜１２上に、抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が修飾されているものを用意する。
まず、試料保持部１３中に検査対象である試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と、蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦとを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と、蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２とは、被検出物質である抗原Ａに対してそれぞれ別の部位（エピトープ）に結合するものを用いる。なお、蛍光標識Ｆとして、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを用いている（図１）。試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、サンドイッチが形成される。その後、結合物と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦを分離するため、バッファ溶液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
まず、試料保持部１３中に検査対象である試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と、蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質ＢＦとを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と、蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２とは、被検出物質である抗原Ａに対してそれぞれ別の部位（エピトープ）に結合するものを用いる。なお、蛍光標識Ｆとして、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを用いている（図１）。試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、サンドイッチが形成される。その後、結合物と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦを分離するため、バッファ溶液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
以上の工程はセンサチップ１０を検出装置１の収容部１９にセットする前に行ってもよいし、セット後に行ってもよい。また、被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識を添加しておいてもよい。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、センサチップ１０の誘電体プレート１１の所定領域に向けて、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に増強された光電場Ｄが形成される。このとき、増強された光電場Ｄによって、その蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて、蛍光Ｌｆが発生する。ここで、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。そして、この蛍光Ｌｆを光検出器３０により検出することにより、蛍光標識結合物質ＢＦと結合した被検出物質Ａの有無および／または量を検出することができる。
さらに、本発明においては、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することにより、効率よく蛍光色素分子ｆから蛍光Ｌｆを生じせしめるため、通常の表面プラズモン蛍光法等に比して、より高感度に蛍光Ｌｆを検出することができる。このような蛍光増強微粒子Ｍの蛍光量増大への寄与は、大きく分けて図２Ａ〜図２Ｄに示す４つの効果によるものである。
（１）蛍光増強微粒子Ｍに散乱されたエバネッセント光の散乱光による効果
図２Ａに示すように、蛍光増強微粒子Ｍによる散乱光ＳＬを二次的な励起光として用いることにより、蛍光色素分子ｆをさらに効率的に照明することができる。前述したように光電場Ｄは、センサ部１４の表面から離れるにしたがって、急激に減衰する。したがって、センサ部１４の表面から離れた蛍光色素分子ｆは、励起するに充分な光を吸収することができない。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このような蛍光色素分子ｆを励起する二次的な励起光として、上記の散乱光を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
図２Ａに示すように、蛍光増強微粒子Ｍによる散乱光ＳＬを二次的な励起光として用いることにより、蛍光色素分子ｆをさらに効率的に照明することができる。前述したように光電場Ｄは、センサ部１４の表面から離れるにしたがって、急激に減衰する。したがって、センサ部１４の表面から離れた蛍光色素分子ｆは、励起するに充分な光を吸収することができない。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このような蛍光色素分子ｆを励起する二次的な励起光として、上記の散乱光を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
（２）蛍光増強微粒子Ｍの表面近傍に生じる近接場光による効果
図２Ｂに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、光電場Ｄと金属微粒子Ｍとの相互作用により、局在プラズモンが生じ、その結果、この局在プラズモンによって増強された近接場光ＮＬが金属微粒子Ｍの周囲に染み出すこととなる。そして、蛍光増強微粒子Ｍの近傍にある蛍光色素分子ｆが、この近接場光ＮＬに励起されることとなる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このような近接場光ＮＬを生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。なお、励起光Ｌｏの波長に応じて局在プラズモンを誘起できるように、金属微粒子Ｍの粒径は適宜選択することができる。
図２Ｂに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、光電場Ｄと金属微粒子Ｍとの相互作用により、局在プラズモンが生じ、その結果、この局在プラズモンによって増強された近接場光ＮＬが金属微粒子Ｍの周囲に染み出すこととなる。そして、蛍光増強微粒子Ｍの近傍にある蛍光色素分子ｆが、この近接場光ＮＬに励起されることとなる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このような近接場光ＮＬを生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。なお、励起光Ｌｏの波長に応じて局在プラズモンを誘起できるように、金属微粒子Ｍの粒径は適宜選択することができる。
（３）蛍光増強微粒子Ｍと金属層１２との間に生じるホットスポットＨＳ１による効果
図２Ｃに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、金属微粒子Ｍの近傍に金属膜１２が存在するとき、金属微粒子Ｍ−金属膜１２間の隙間にホットスポットＨＳ１が生じる。「ホットスポット」とは、微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域である。したがって、このホットスポットＨＳ１内に存在する蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを増強することができる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このようなホットスポットＨＳ１を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
図２Ｃに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、金属微粒子Ｍの近傍に金属膜１２が存在するとき、金属微粒子Ｍ−金属膜１２間の隙間にホットスポットＨＳ１が生じる。「ホットスポット」とは、微小構造の物質に静電気力が集中（電界集中）する結果形成される局所的な強い電場領域である。したがって、このホットスポットＨＳ１内に存在する蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを増強することができる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このようなホットスポットＨＳ１を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
（４）複数の蛍光増強微粒子Ｍの間に生じるホットスポットＨＳ２による効果
図２Ｄに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、複数の金属微粒子Ｍが近傍に存在するとき、金属微粒子Ｍ−金属微粒子Ｍの隙間にホットスポットＨＳ２が生じる。したがって、このホットスポットＨＳ２内に存在する蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを増強することができる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このようなホットスポットＨＳ２を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
図２Ｄに示すように、例えば蛍光増強微粒子Ｍが金属微粒子である場合には、複数の金属微粒子Ｍが近傍に存在するとき、金属微粒子Ｍ−金属微粒子Ｍの隙間にホットスポットＨＳ２が生じる。したがって、このホットスポットＨＳ２内に存在する蛍光色素分子ｆからの蛍光Ｌｆを増強することができる。つまり、蛍光増強微粒子Ｍは、このようなホットスポットＨＳ２を生じせしめることにより、蛍光量増大に寄与する。
さらに、上記（１）〜（４）の効果による相乗効果も、実際には蛍光量増大に寄与する。両ホットスポットＨＳ１・ＨＳ２と上記（２）の局在プラズモンとが同時に生じた場合には、上記（２）の局在プラズモンによって増強された電場が集中し、巨大な電場が形成されるとともに、それによって相手側の局在プラズモンをさらに強く誘起し合うという相乗効果が生じるため、他の場合（例えば粒子が単独で存在する場合や非金属の粒子が近接する場合）に較べ格段に強く増強された光電場Ｄが形成される。
以上により、本発明に係る方法によれば、金属微粒子−金属微粒子間の隙間もしくは金属微粒子−金属膜間の隙間に生じるホットスポット等の効果によって、蛍光標識から生じる蛍光を増強することができる。この結果、ラマン分光法より容易かつ低コストの蛍光法を用いても、一分子レベルでの高感度検出が可能となる。一方、本発明に係る方法によれば、複数の蛍光増強微粒子Ｍを検出部上に広く分散させているため、上記ホットスポットは広い範囲にわたり形成させることができる。この結果、増強された光電場が金属プローブの先端付近に限られるラマン分光法に比べて、広い範囲にわたる測定を短時間で行うことが可能となる。
さらに、本実施形態のように、センサ部１４の表面に金属層１２を有している場合には、この金属層１２による蛍光色素分子ｆの金属消光の影響が強くなるため、金属層１２と蛍光色素分子ｆとの距離を精密に制御する必要がある。金属消光の影響の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが好ましい。このような制御は、一般的にはポリマー膜、ＳｉＯ２膜、ＳＡＭ膜もしくはＣＭＤ膜のようなバリア層を金属層上に設けることにより行われているが、面倒かつ煩雑であり実用にはあまり向いていない。しかしながら、本発明において、蛍光物質Ｆが、蛍光色素分子ｆを充分多く含有する場合には、金属層１２上に金属消光防止のための膜を設けなくても、必然的に金属層１２と多くの蛍光色素分子ｆとの距離をある程度離間させることができる。これにより従来、金属消光防止のために必要であったＣＭＤ膜およびＳＡＭ膜を形成する手間をなくすことができ、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止すると共に、安定して蛍光信号を検出することができる。
（設計変更例）
上述第１の実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図３に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。したがって、上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図３に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。また、以上のことは後述する第２〜第５の実施形態においても同様である。
上述第１の実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図３に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。したがって、上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図３に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。また、以上のことは後述する第２〜第５の実施形態においても同様である。
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図４を参照して説明する。図４は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および検出装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。なお、以下においては、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
第２の実施形態である検出方法および装置について図４を参照して説明する。図４は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および検出装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。なお、以下においては、第１の実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
図４に示す蛍光検出装置２は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
センサチップ１０’は誘電体プレート１１上に設けられる金属層１２’として、励起光の照射を受けて所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えている。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光Ｌｏを金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はない。したがってここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート１１上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
センサチップ１０’の具体例を図５Ａ〜Ｃに斜視図で示し説明する。
図５Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該誘電体プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該誘電体プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該誘電体プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。
図５Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
図５Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
蛍光検出装置２を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせる工程は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態においても同様とする。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、センサチップ１０’の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。光源２１から出射された励起光Ｌｏはハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌｏの照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。この局在プラズモンにより金属層１２’上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場内にある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。この蛍光Ｌｆを光検出器３０により検出をすることにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせる工程は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態においても同様とする。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、センサチップ１０’の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。光源２１から出射された励起光Ｌｏはハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌｏの照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。この局在プラズモンにより金属層１２’上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場内にある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。この蛍光Ｌｆを光検出器３０により検出をすることにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することにより、効率よく蛍光色素分子ｆから蛍光Ｌｆを生じせしめるため、通常の表面プラズモン蛍光法等に比して、より高感度に蛍光Ｌｆを検出することができ、第１の実施形態と同様の効果を得ることが可能である。
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図６を参照して説明する。図６は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出するものである。
第３の実施形態の検出方法および装置について図６を参照して説明する。図６は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出するものである。
図６に示す放射光検出装置３は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置３においては、蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起することによって、誘電体プレートに対して金属層形成面と反対の面側へ放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように、光検出器３０が配置されている。
検出装置３を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場Ｄにある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強される。金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜１２表面に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場Ｄにある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強される。金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
本実施形態においても、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することにより、効率よく蛍光色素分子ｆから蛍光Ｌｆを生じせしめ、この増強された蛍光Ｌｆに起因する放射光Ｌｐを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。
第４の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する検出方法および装置である。
図７に示す検出装置４の構成は、第１の実施形態の検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、電場増強のメカニズムが異なる。
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
蛍光検出装置４を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場にある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場にある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出器３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することにより、効率よく蛍光色素分子ｆから蛍光Ｌｆを生じせしめるため、通常の表面プラズモン蛍光法等に比して、より高感度に蛍光Ｌｆを検出することができ、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、光導波モードの励起により生じる増強された光電場Ｄは、通常の表面プラズモン蛍光法により生じる増強された光電場と比較して表面からの距離に伴う電場減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆを内包する径の大きな蛍光物質Ｆを用いた場合、通常の表面プラズモン蛍光法による電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
第５の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する検出方法および装置である。
図８に示す本実施形態の検出装置５は、第３の実施形態の検出装置３と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場Ｄにある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０”の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態では、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として用いている。そして、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起されることにより、光導波層１２ｂ上に増強された光電場Ｄが形成される。そして、増強された光電場Ｄにある、蛍光物質Ｆ中の蛍光色素分子ｆが励起されて蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる電場増強の効果により蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０”の金属膜形成面と反対側へ特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出器３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
本実施形態においても、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することにより、効率よく蛍光色素分子ｆから蛍光Ｌｆを生じせしめ、この増強された蛍光に起因する放射光Ｌｐを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
さらに、光導波モードの励起により増強された光電場を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
なお、上記第１〜第５の実施形態においては、蛍光標識として、図９に示すように、さらに、透光材料１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属被膜Ｍｃが設けられたものを用いてもよい。金属被膜Ｍｃは、透光材料１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜Ｍｃの材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
蛍光物質Ｆの表面に金属被膜Ｍｃを備えた場合、センサチップ１０・１０’の金属層１２・１２’に発生した表面プラズモンまたは局在プラズモン、あるいはセンサチップ１０”の光導波層１２ｂに発生した光導波モードが、蛍光物質Ｆの金属被膜Ｍｃのウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質Ｆのような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
蛍光物質Ｆへの金属被膜方法の一例を以下に示す。
まず、前述手順により蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
まず、前述手順により蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
「検出用試料セル」
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
本発明の検出方法のセンサチップとして使用される検出用試料セルについて説明する。
＜第１の実施形態の検出用試料セル＞
図１０Ａは、第１の実施形態の検出用試料セル５０の構成を示す平面図、図１０Ｂは検出用試料セル５０の側断面図である。
検出用試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上にそれぞれ設けられた金属層５８ａ、５９ａからなるセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
図１０Ａは、第１の実施形態の検出用試料セル５０の構成を示す平面図、図１０Ｂは検出用試料セル５０の側断面図である。
検出用試料セル５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上にそれぞれ設けられた金属層５８ａ、５９ａからなるセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。
本実施形態においては、基台５１が誘電体プレートから構成され、センサ部の誘電体プレートを兼ねているが、基台としては、センサ部が構成される部分のみ誘電体プレートで構成されたものを用いてもよい。検出用試料セル５０は、上述した第１〜第３のいずれの実施形態の検出装置および方法におけるセンサチップとして、使用することができる。また、検出用試料セル５０は、被検出物質に応じて、該被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質をセンサ部に適宜固定して使用することができる。さらに、被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および被検出物質と競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちいずれか一方の結合物質と、この一方の結合物質が修飾された蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質であって、センサ部より上流側の流路内に配置されている蛍光標識結合物質を備えることができる。
本実施形態に係る検出用試料セルでは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として予め備えているため、本発明に係る検出装置および方法における効果と同様に、蛍光標識の励起に起因して生じる光を容易に増強することができる。この結果、本実施形態に係る検出用試料セルを用いて被検出物質の検出を行うことによって、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが容易に可能となる。
＜第２実施形態の検出用試料セル＞
図１１は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第２の実施形態の検出用試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ａにおいては、標識２次抗体吸着エリア５７と、第１のセンサ部５８と、第２のセンサ部５９とが、基台５１上に流路５２上流側から順に設けられている。ここで、標識２次抗体吸着エリア５７には、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と、該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＢＦ（蛍光標識結合物質）が物理吸着によって配置されている。そして、第１のセンサ部５８には、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定されている。また、第２のセンサ部５９には、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定されている。本例では、流路５２内に２つのセンサ部を設けた例を挙げているが、センサ部は１つのみであってもよい。なお、蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包するものである。
図１１は、サンドイッチ法によるアッセイに適した第２の実施形態の検出用試料セルの側断面を示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ａにおいては、標識２次抗体吸着エリア５７と、第１のセンサ部５８と、第２のセンサ部５９とが、基台５１上に流路５２上流側から順に設けられている。ここで、標識２次抗体吸着エリア５７には、被検出物質である抗原と特異的に結合する２次抗体（第２の結合物質）Ｂ２と、該２次抗体Ｂ２が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＢＦ（蛍光標識結合物質）が物理吸着によって配置されている。そして、第１のセンサ部５８には、被検出物質である抗原と特異的に結合する１次抗体（第１の結合物質）Ｂ１が固定されている。また、第２のセンサ部５９には、被検出物質である抗原Ａとは結合せず標識２次抗体ＢＦと特異的に結合する１次抗体Ｂ０が固定されている。本例では、流路５２内に２つのセンサ部を設けた例を挙げているが、センサ部は１つのみであってもよい。なお、蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包するものである。
基台５１上の第１のセンサ部５８および第２のセンサ部５９にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１のセンサ部５８のＡｕ膜５８ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１が固定され、第２のセンサ部５９のＡｕ膜５９ａ上にはさらに１次抗体Ｂ１とは異なる１次抗体Ｂ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は、第１のセンサ部５８と第２のセンサ部５９は同一の構成である。第２のセンサ部５９に固定されている１次抗体Ｂ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＢＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体ＢＦの量、活性など反応に関する変動要因と、励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因とを検出し、較正に利用することができる。なお、第２のセンサ部には１次抗体Ｂ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体Ｂ２により表面修飾された蛍光物質Ｆと同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質Ｆであってもよい。さらには金属微粒子などであってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金膜５８ａ、５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２のセンサ部５９に標識２次抗体ＢＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは、較正目的および方法によって適宜定めればよい。
検出用試料セル５０Ａは、上述した第１〜第３のいずれの実施形態の検出装置および方法においても、センサチップとして使用することができる。検出用試料セル５０は、収容部１９において、励起光照射光学系２０および光検出器３０に相対的にＸ方向に移動可能とされており、第１のセンサ部５８からの蛍光もしくは放射光の検出測定の後、第２のセンサ部５９を検出位置に移動させて第２のセンサ部５９からの蛍光もしくは放射光の検出を行うように構成されている。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１２を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１２中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと流路５２内に配置された標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、第１のセンサ部５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２のセンサ部５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１２中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと流路５２内に配置された標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、第１のセンサ部５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６：抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は第２のセンサ部５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１のセンサ部５８上に抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１のセンサ部５８からの蛍光信号或いは放射光信号（以下、検出信号）を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２のセンサ部５９からの検出信号を検出できるように試料セルをＸ方向に移動させ、第２のセンサ部５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２のセンサ部５９からの検出信号は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した蛍光信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１のセンサ部５８からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、既述の通り、第２のセンサ部５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２のセンサ部５９からの光信号をリファレンスとして第１のセンサ部５８からの検出信号を補正することができる。
本実施形態に係る検出用試料セルでも、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として予め備えている。したがって、本実施形態においても、第１実施形態の検出用試料セルと同様の効果を得ることができる。
＜第３実施形態の検出用試料セル＞
図１３は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の検出用試料セルを示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ｂにおいては、標識２次抗体吸着エリア５７’と、第１のセンサ部５８’と、第２のセンサ部５９’とが、基台５１上に流路５２上流側から順に設けられている。ここで、標識２次抗体吸着エリア５７’には、被検出物質である抗原とは結合せず後述の１次抗体Ｃ１と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と、該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＣＦ（蛍光標識結合物質）が物理吸着によって配置されている。そして、第１のセンサ部５８’には、被検出物質である抗原および２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定されている。また、第２のセンサ部５９’には、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体ＣＦと特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定されている。本例では、流路５２内に２つのセンサ部を設けた例を挙げているが、センサ部は１つのみであってもよい。なお、蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包するものである。
図１３は、競合法によるアッセイに適した第３の実施形態の検出用試料セルを示すものである。本実施形態の検出用試料セル５０Ｂにおいては、標識２次抗体吸着エリア５７’と、第１のセンサ部５８’と、第２のセンサ部５９’とが、基台５１上に流路５２上流側から順に設けられている。ここで、標識２次抗体吸着エリア５７’には、被検出物質である抗原とは結合せず後述の１次抗体Ｃ１と特異的に結合する２次抗体Ｃ３（第３の結合物質）と、該２次抗体Ｃ３が表面修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＣＦ（蛍光標識結合物質）が物理吸着によって配置されている。そして、第１のセンサ部５８’には、被検出物質である抗原および２次抗体Ｃ３と特異的に結合する１次抗体Ｃ１（第１の結合物質）が固定されている。また、第２のセンサ部５９’には、被検出物質である抗原とは結合せず標識２次抗体ＣＦと特異的に結合する１次抗体Ｃ０が固定されている。本例では、流路５２内に２つのセンサ部を設けた例を挙げているが、センサ部は１つのみであってもよい。なお、蛍光物質Ｆは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包するものである。
基台５１上の第１のセンサ部５８’および第２のセンサ部５９’にはそれぞれ金属層として、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａが形成されている。第１のセンサ部５８’のＡｕ膜５８ａ上にさらに１次抗体Ｃ１が固定され、第２のセンサ部５９’のＡｕ膜５９ａ上にさらに１次抗体Ｃ１とは異なる１次抗体Ｃ０が固定されている。互いに異なる１次抗体が設けられている点以外は、第１のセンサ部５８’と第２のセンサ部５９’は同一の構成である。抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとは、第１のセンサ部５８’に固定されている１次抗体Ｃ１に競合的に結合するものである。第２のセンサ部５９’に固定されている１次抗体Ｃ０は抗原Ａとは結合せず、標識２次抗体ＣＦと直接結合するものである。これにより、流路を流れた標識２次抗体ＣＦの量、活性など反応に関する変動要因と励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど光電場増強度に関する変動要因を検出し、較正に利用することができる。なお、第２のセンサ部には１次抗体Ｃ０ではなく、既知量の標識物質が予め固定されていてもよい。標識物質は２次抗体により表面修飾された蛍光物質と同種のものであってもよいし、波長、サイズの異なる蛍光物質であってもよい。この場合、励起光照射光学系２０、金（Ａｕ）膜５８ａおよび５９ａ、液体試料Ｓなど表面プラズモン増強度に関する変動要因のみを検出し、較正に利用することができる。第２のセンサ部５９’に標識２次抗体ＣＦ、既知量の標識物質のどちらを固定するかは較正目的および方法によって適宜、選択することができる。
検出用試料セル５０Ｂは、既述の検出用試料セル５０Ａと同様に、上述した第１〜第３のいずれの実施形態の検出装置および方法においても、センサチップとして使用することができる。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用試料セル５０Ｂを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１４を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと流路５２内に配置された標識２次抗体ＣＦとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとが競合して、第１のセンサ部５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１のセンサ部５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体ＣＦの一部は、第２のセンサ部５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体ＣＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＣＦを洗い流す。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ３：メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ４：流路５２に染み出した血漿Ｓと流路５２内に配置された標識２次抗体ＣＦとが混ぜ合わされる。
ｓｔｅｐ５：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、抗原Ａと標識２次抗体ＣＦとが競合して、第１のセンサ部５８’上に固定されている１次抗体Ｃ１と結合する。
ｓｔｅｐ６：第１のセンサ部５８’上の１次抗体Ｃ１と結合しなかった標識２次抗体ＣＦの一部は、第２のセンサ部５９’上に固定されている１次抗体Ｃ０と結合する。さらに１次抗体Ｃ１またはＣ０と結合していない標識２次抗体ＣＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＣＦを洗い流す。
このように、血液を注入口から注入し、センサ部５８’上の１次抗体Ｃ１に抗原Ａおよび標識２次抗体ＣＦが競合的に結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、第１のセンサ部５８’および第２のセンサ部５９’からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２のセンサ部５９’からの検出信号を検出できるように検出用試料セルをＸ方向に移動させ、第２のセンサ部５９’からの検出信号を検出し、この検出信号をリファレンスとして、第１のセンサ部５８’からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。
競合法においては上記のように、被検出物質Ａの濃度が高ければ、１次抗体Ｃ１と結合する２標識２次抗体ＣＦの量が少なくなり、金属層上の蛍光物質Ｆの数が少なくなるため蛍光強度が小さくなる。一方、被検出物質Ａの濃度が低ければ、１次抗体Ｃ１と結合する標識２次抗体ＣＦの量が多くなり、金属膜上の蛍光物質Ｆの数が多くなるため蛍光強度が大きくなる。競合法は被検出物質にエピトープが一つあれば測定が可能であることから、低分子量の物質の検出に適している。
本実施形態に係る検出用試料セルでも、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として予め備えている。したがって、本実施形態においても、第１実施形態の検出用試料セルと同様の効果を得ることができる。
（検出用試料セルの設計変更例）
図１５は、光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる検出用試料セルの断面図である。この検出用試料セルは、図１０に示した第１の実施形態の検出用試料セルの構成と略同一であるが、それぞれのセンサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備えている点で異なる。この検出用試料セルは、光導波層５８ｂ、５９ｂ上に上記のような抗体を適宜固定することにより、検出装置および方法の第４・第５の実施形態でのセンサチップとして使用することができる。
図１５は、光導波モードによる光電場増強を利用する検出方法および装置に用いる検出用試料セルの断面図である。この検出用試料セルは、図１０に示した第１の実施形態の検出用試料セルの構成と略同一であるが、それぞれのセンサ部の金属層５８ａ、５９ａ上にさらに光導波層５８ｂ、５９ｂを備えている点で異なる。この検出用試料セルは、光導波層５８ｂ、５９ｂ上に上記のような抗体を適宜固定することにより、検出装置および方法の第４・第５の実施形態でのセンサチップとして使用することができる。
「検出用キット」
本発明の検出方法に使用される検出用キットについて説明する。図１６は検出用キット６０の構成を示す模式図である。
本発明の検出方法に使用される検出用キットについて説明する。図１６は検出用キット６０の構成を示す模式図である。
本発明に係る検出用キット６０は、検出用試料セル６１と、液体試料と同時もしくは液体試料の流下後に流路内に流下される標識用溶液６３とを備えている。ここで、標識用溶液６３は、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂ２（第２の結合物質）と、この２次抗体Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆとからなる標識２次抗体ＢＦ（蛍光標識結合物質）を含むものである。
検出用試料セル６１は、検出用試料セル内に、蛍光増強微粒子Ｍが含まれる標識２次抗体ＢＦが物理吸着した標識２次抗体吸着エリアを備えていない点でのみ上述の第２の実施形態の検出用試料セル５０Ａと異なり、その他は検出用試料セル５０Ａと略同一の構成である。
本発明の検出方法において、本実施形態の検出用キット６０を用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図１７を参照して説明する。
ｓｔｅｐ１：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１７において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１のセンサ部５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：標識２次抗体ＢＦを含む標識用溶液６３を注入口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：標識２次抗体ＢＦが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：標識２次抗体ＢＦが徐々に下流側に流れ、標識２次抗体ＢＦが抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と結合することにより、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は、第２のセンサ部５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに、抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルター５５で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１７において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、血漿Ｓ中の抗原Ａが、第１のセンサ部５８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合する。
ｓｔｅｐ４：標識２次抗体ＢＦを含む標識用溶液６３を注入口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ５：標識２次抗体ＢＦが毛細管現象により流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、標識用溶液６３をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６：標識２次抗体ＢＦが徐々に下流側に流れ、標識２次抗体ＢＦが抗原Ａと結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と結合することにより、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。抗原Ａと結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は、第２のセンサ部５９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに、抗原Ａまたは１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦがセンサ部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ６の後、検出装置において、蛍光物質Ｆ内に蛍光増強微粒子Ｍが存在することによる蛍光量の増大効果を利用し、第１のセンサ部５８からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を高感度に検出することができる。その後、第２のセンサ部５９からの検出信号を検出できるように検出用試料セル６１をＸ方向に移動させ、同様に、センサ部上に蛍光標識結合物質を引き寄せ、第２のセンサ部５９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定している第２のセンサ部５９からの検出信号は標識２次抗体の流下した量、活性などの反応条件を反映した検出信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１のセンサ部からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２のセンサ部５９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子）をあらかじめ固定しておき、第２のセンサ部５９からの蛍光信号をリファレンスとして第１のセンサ部からの検出信号を補正してもよい。
蛍光物質への２次抗体修飾方法および標識用溶液の作製方法の一例を説明する。
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径φ１５０ｎｍ、励起波長７８０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
前述の手順で作製した蛍光物質溶液（蛍光物質の直径φ１５０ｎｍ、励起波長７８０ｎｍ)に５０ｍＭ ＭＥＳバッファおよび、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）溶液を加えて撹拌する。これにより蛍光物質への抗体の修飾がなされる。
次に、４００ｍｇ／ｍＬのＷＳＣ（品番０１−６２−００１１、和光純薬）水溶液を加え室温で攪拌する。
さらに、２ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ水溶液を添加し撹拌した後、遠心分離にて、粒子を沈降させる。
最後に、上清を取り除き、ＰＢＳ(ｐＨ７．４)を加え、超音波洗浄機により、表面修飾された蛍光物質を再分散させる。さらに遠心分離を行い、上清を除いた後、１％ＢＳＡのＰＢＳ(ｐＨ７．４)溶液５００μＬ加え、表面修飾された蛍光物質を再分散させて標識用溶液とする。
本実施形態に係る検出用キットでは、蛍光色素分子ｆと１の蛍光増強微粒子Ｍとを内包する蛍光物質Ｆを蛍光標識として予め備えているため、本発明に係る検出装置および方法における効果と同様に、蛍光標識の励起に起因して生じる光を増強することができる。この結果、本実施形態に係る検出用試料キットを用いて被検出物質の検出を行うことによって、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することが可能となる。
（検出用キットの設計変更例）
本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１３に示す検出用試料セルを用いることにより、競合法によるアッセイを行う検出装置および方法に好適なものとなる。
本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１３に示す検出用試料セルを用いることにより、競合法によるアッセイを行う検出装置および方法に好適なものとなる。
また、本発明に係る検出用キットは、付属の検出用試料セルとして、光導波層を有する図１５に示す検出用試料セルを用いることにより、光導波モードによる電場増強を利用する検出装置および方法に好適なものとなる。
１、２、３、４、５ 検出装置
１０、１０’、１０” センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属層（金属膜）
１２’ 金属層（金属微細構造体）
１３ 試料保持部
１４ センサ部
１６ 透光材料
１９ センサチップ収容部
２０、２０’ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５４ａ 注入口
５４ｂ 空気孔
５５ メンブレンフィルター
５７ 標識２次抗体吸着エリア
５８、５９ センサ部
６０ 検出用キット
６３ 検出用キットの標識用溶液
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１、Ｃ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ、ＣＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｃ３ ２次抗体（第３の結合物質）
Ｄ 光電場
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｐ 放射光
ＬＳ 散乱光
Ｍ 蛍光増強微粒子
Ｍｃ 金属被膜
１０、１０’、１０” センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属層（金属膜）
１２’ 金属層（金属微細構造体）
１３ 試料保持部
１４ センサ部
１６ 透光材料
１９ センサチップ収容部
２０、２０’ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
３０ 光検出器
５０、５０Ａ、５０Ｂ、６１ 試料セル
５１ 誘電体プレート
５２ 流路
５３ スペーサ
５４ 上板
５４ａ 注入口
５４ｂ 空気孔
５５ メンブレンフィルター
５７ 標識２次抗体吸着エリア
５８、５９ センサ部
６０ 検出用キット
６３ 検出用キットの標識用溶液
Ａ 抗原（被検出物質）
Ｂ１、Ｃ１ １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２ ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ、ＣＦ 標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｃ３ ２次抗体（第３の結合物質）
Ｄ 光電場
Ｆ 蛍光物質
ｆ 蛍光色素分子
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｐ 放射光
ＬＳ 散乱光
Ｍ 蛍光増強微粒子
Ｍｃ 金属被膜
Claims (15)
- 誘電体プレートの一面に、該誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用い、
前記センサ部に試料を接触させることにより、該試料に含有される被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を、前記センサ部上に結合させ、
前記センサ部に励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、
該増強した光電場により、前記蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、該励起に起因して生じる光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子および１以上の蛍光増強微粒子を、該複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることを特徴とする検出方法。 - 前記蛍光増強微粒子が、散乱性微粒子であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
- 前記蛍光増強微粒子が、金属微粒子であることを特徴とする請求項２に記載の検出方法。
- 前記蛍光増強微粒子が、金属ナノロッドであることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
- 前記蛍光増強微粒子の粒径が、１０〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の検出方法。
- 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の検出方法。 - 前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の検出方法。 - 前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備えるものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の検出方法。 - 前記センサチップとして、前記積層構造が光導波層を備えるものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードによって前記増強した光電場を発生せしめ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートに対し前記一面と対向する他面側へ放射される、前記新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出することを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の検出方法。 - 請求項１から９いずれかに記載の検出方法において前記センサチップとして使用される検出用試料セルであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、
前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、
前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、
前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部とを備え、
前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなることを特徴とする検出用試料セル。 - 前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための第１の結合物質であって、前記センサ部上に固定されているものを備えることを特徴とする請求項１０に記載の検出用試料セル。
- 前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちいずれか一方の結合物質と、該一方の結合物質が修飾された前記蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質であって、前記センサ部より上流側の前記流路内に配置されている前記蛍光標識結合物質を備えることを特徴とする請求項１１に記載の検出用試料セル。
- 前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１０から１２いずれかに記載の検出用試料セル。
- 請求項１から９いずれかに記載の検出方法において使用される検出用キットであって、
液体試料が流下される流路を有する基台と、前記流路の上流側に設けられた該流路に前記液体試料を注入するための注入口と、前記流路の下流側に設けられた、前記注入口から注入された前記液体試料を該下流側に流すための空気孔と、前記注入口と前記空気孔との間の前記流路に設けられたセンサチップ部であって、前記流路の内壁面の一部として設けられた誘電体プレート、および該誘電体プレートの試料接触面の所定領域に設けられたセンサ部を備えるセンサチップ部と、前記蛍光標識結合物質を前記センサ部上に固定するための、該センサ部上に固定された第１の結合物質とを備え、前記センサ部が、前記誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなる、前記センサチップとして使用される検出用試料セル、および
前記液体試料と同時もしくは前記液体試料の流下後に前記流路内に流下される標識用溶液であって、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のうちのいずれか一方の結合物質と、該一方の結合物質が修飾された前記蛍光物質とからなる蛍光標識結合物質を含む前記標識用溶液を備えてなることを特徴とする検出用キット。 - 前記積層構造が、光導波層を備えることを特徴とする請求項１４に記載の検出用キット。
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