WO2012132384A1 - 局在プラズモン増強蛍光粒子、局在プラズモン増強蛍光検出用担体、局在プラズモン増強蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents

局在プラズモン増強蛍光粒子、局在プラズモン増強蛍光検出用担体、局在プラズモン増強蛍光検出装置および蛍光検出方法 Download PDF

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enhanced
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fluorescent
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大塚　尚
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富士フイルム株式会社
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a localized plasmon-enhanced fluorescent particle used for fluorescence detection utilizing localized plasmon enhancement, a localized plasmon-enhanced fluorescence detection carrier equipped with the enhanced fluorescence particle, a localized plasmon-enhanced fluorescence detection device, and a fluorescence detection method It is about.
  • an immunochromatographic method disclosed in Patent Document 1 is known.
  • This immunochromatography method uses a carrier (support) in which a substance that reacts with and binds to a detection target is fixed at a predetermined position, and a sample in which labeled fine particles capable of binding to the detection target are mixed is developed on the carrier. If the detection target exists and binds to the substance, the presence or amount of the detection target is determined using the fact that the labeled fine particles that have been bound to the detection target are colored at the predetermined position. It is to detect.
  • this immunochromatographic method is rapidly expanding as a method for detecting pathogenic bacteria and viruses easily and rapidly against viral diseases such as influenza.
  • gold fine particles are used as the labeling fine particles, and in this case, coloring is performed by utilizing absorption of light of a specific wavelength by local plasmons (localized plasmons) generated in the particle portions. . Therefore, the color development can be changed to some extent by changing the particle diameter of the gold fine particles.
  • a fluorescence method has been widely used as a method capable of highly sensitive measurement in biomeasurement and the like.
  • This fluorescence method irradiates a sample considered to contain a detection object that emits fluorescence when excited by light of a specific wavelength, and then detects the presence of the detection object by detecting the fluorescence at that time. It is a method to confirm.
  • the detection target is not a fluorescent substance
  • this binding that is, by detecting the fluorescence in the same manner as described above, by contacting the sample with a substance that is labeled with the fluorescent substance and specifically binds to the detection target. The existence of a detection target is also widely confirmed.
  • excitation light that is totally reflected on the substrate surface is incident from the back surface of the substrate, and the fluorescence is excited by an evanescent wave that oozes out to the substrate surface (evanescent fluorescence). Law) is known.
  • Patent Document 2 a method using the effect of electric field enhancement by plasmon resonance is proposed in Patent Document 2 and the like.
  • the surface plasmon enhanced fluorescence method in order to generate plasmon resonance, a metal layer is provided on the substrate, and excitation light is incident on the interface between the substrate and the metal layer from the back surface of the substrate at an angle greater than the total reflection angle.
  • the surface plasmon is generated in the metal layer by the irradiation of the excitation light, and the S / N is improved by increasing the fluorescence signal by the electric field enhancing action.
  • Patent Document 3 discloses that a dye molecule is a silica particle. It has been proposed to use fluorescent labels contained within.
  • Patent Document 4 discloses a fluorescent substance comprising a plurality of fluorescent dye molecules and one or more fluorescent enhancement fine particles as a fluorescent label in a plasmon enhanced fluorescence method as a fluorescent label. It has been proposed to use Examples of the fluorescence enhancing fine particles include scattering fine particles, metal fine particles, and metal nanorods.
  • the immunochromatography method it is possible to change the color development to some extent by changing the particle diameter of the gold fine particles or the like as the labeled fine particles, but the wavelength of the absorption of the gold fine particles by the local plasmon is around 530 nm. For this reason, the color is magenta, which is not highly visible to the human eye. Therefore, it is difficult for this immunochromatography method to meet the demand for high sensitivity, for example, to detect a trace amount of substance of about several tens of pmol (picomol).
  • the surface plasmon-enhanced fluorescence sensor can detect a very small amount of substance of several fmol (femto mol) and can meet the demand for higher sensitivity. Since a system is required, the apparatus becomes complicated and expensive.
  • Patent Document 5 is a localized plasmon-enhanced fluorescence measurement that uses electric field enhancement by localized plasmons by using metal fine particles as a fluorescence sensor that can be highly sensitive and can be formed at low cost.
  • a device is proposed.
  • the fluorescent dye is too close to the metal, the energy excited in the fluorescent dye transitions to the metal film before generating the fluorescence, causing a phenomenon that no fluorescence is generated (so-called metal quenching).
  • metal quenching a dye-labeled antibody is bound to metal particles wrapped with an inflexible film in order to suppress metal quenching.
  • Patent Document 5 the label used in Patent Document 5 is obtained by binding an antibody 105 to which one dye 104 is attached to a metal particle 103 wrapped with an inflexible film 102 for suppressing metal quenching as shown in FIG. Since the number of dyes 104 is small, there is a problem that the signal is small and sufficient sensitivity cannot be achieved.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and uses localized plasmon-enhanced fluorescent particles that can be used in a localized plasmon-enhanced fluorescence detection device to produce a higher electric field enhancing effect and generate larger fluorescence.
  • the purpose is to provide.
  • an object of the present invention is to provide a localized plasmon-enhanced fluorescence detection carrier, a localized plasmon-enhanced fluorescence detection device, and a fluorescence detection method, each including a localized plasmon-enhanced fluorescent particle.
  • the localized plasmon-enhanced fluorescent particle of the present invention includes a plurality of fine metal particles and a plurality of fluorescent dyes dispersed and contained in a translucent dielectric material,
  • the metal fine particles have a particle size of more than 10 nm and 40 nm or less, and an occupied volume ratio is 5% ⁇ occupied volume ratio ⁇ 40%.
  • the particle size of the metal fine particles is defined by the maximum length of the particles, and here, the individual particles of the plurality of metal fine particles have a particle size in the above range.
  • the occupied volume ratio is a ratio of the volume of the metal fine particles per unit volume of the localized plasmon enhanced fluorescent particles calculated based on the occupied volume in the localized plasmon enhanced fluorescent particles of all the included metal fine particles.
  • the light-transmitting dielectric material is preferably SiO 2 or a light-transmitting resin.
  • translucency means that the transmittance is 85% or more with respect to fluorescence and the peak wavelength of excitation light for exciting the fluorescence.
  • the light transmissive resin is preferably a polymethyl methacrylate resin (PMMA) or a cycloallephine-based resin having excellent light transmittance.
  • the localized plasmon enhanced fluorescence detection carrier of the present invention comprises a sample holder having a flow path through which a sample solution flows, A detection unit in which a first binding substance that specifically binds to a substance to be detected in the sample solution is fixed in the flow path, Provided upstream of the detection unit in the flow path is a label binding substance imparting part to which a label binding substance is imparted, The label-binding substance specifically binds to the first binding substance by mixing with the second binding substance that specifically binds to the detection substance, and mixed with the sample to compete with the detection substance. It is characterized in that the enhanced fluorescent particle of the present invention is added to any one of the third binding substances.
  • the localized plasmon enhanced fluorescence measuring device of the present invention comprises a localized plasmon enhanced fluorescence detection carrier of the present invention, A light source that irradiates the detection unit with excitation light that excites the phosphor; And a light detection means for detecting fluorescence emitted from the phosphor excited by the excitation light.
  • the detection unit of the sample cell partially including the detection unit to which the first binding substance that specifically binds to the detection substance is fixed has the detection part specific to the detection part.
  • the enhanced fluorescent particles of the present invention are used as the fluorescent label. And detecting enhanced fluorescence due to localized plasmon resonance.
  • the particle size of the metal fine particles is more than 10 nm and 40 nm or less, and the occupied volume ratio Is characterized in that 5% ⁇ occupied volume ratio ⁇ 40%. Therefore, when irradiated with light, localized plasmon resonance occurs in the metal microparticles, and localizes around the metal microparticles.
  • An enhanced electric field is generated by plasmon resonance, and the fluorescence from the fluorescent dye molecule is enhanced by the enhanced electric field.
  • the integrated amount of fluorescence becomes very large, and the enhanced fluorescent particles generate fluorescence with a very high sensitivity to light irradiation. Since both the metal fine particles and the fluorescent dye molecules are dispersed and arranged in the translucent dielectric material, the fluorescent dye molecules are arranged close to the metal fine particles so that metal quenching occurs. Although there are a plurality of fluorescent dye molecules that are not close to each other, it is possible to reliably obtain an electric field amplification effect by localized plasmons and generate enhanced fluorescence.
  • the localized plasmon enhanced fluorescence detection support according to the present invention includes the enhanced fluorescent particles of the present invention, it becomes possible to detect a substance to be detected with high sensitivity.
  • the localized plasmon enhanced fluorescence detection apparatus includes the enhanced fluorescent particles of the present invention, it is possible to detect a substance to be detected with high sensitivity. Further, the localized plasmon enhanced fluorescence detection device of the present invention does not require a total reflection optical system such as a prism unlike the surface plasmon enhanced fluorescence detection device, so that the device configuration is simple and can be formed at low cost. It becomes.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing enhanced fluorescent particles for localized plasmon enhanced fluorescence detection according to an embodiment of the present invention.
  • the enhanced fluorescent particle 1 is formed by dispersing and encapsulating a plurality of metal fine particles 3 and a plurality of fluorescent dye molecules 4 in a translucent dielectric material 2.
  • the enhanced fluorescent particles 1 are irradiated with light, generate localized plasmon resonance in the metal fine particles 3, generate an enhanced electric field due to the localized plasmon resonance in the periphery thereof, and enhance fluorescence from the fluorescent dye molecule by the electric field enhancing effect. It is what produces.
  • the translucent dielectric material 2 may be any material that transmits the fluorescence emitted from the fluorescent dye molecules contained therein and the excitation light for exciting the fluorescent dye molecules, and is particularly preferably SiO 2 or a light-transmitting resin.
  • the light transmissive resin material include polymethyl methacrylate resin (PMMA) and cycloolefin resin.
  • PMMA polymethyl methacrylate resin
  • cycloolefin resin polymethyl methacrylate resin
  • “transparent to excitation light and fluorescence” means that the transmittance is 85% or more with respect to the excitation light peak wavelength and the fluorescence peak wavelength.
  • the material constituting the metal fine particles 3 may be any material that generates localized plasmon resonance when irradiated with light, and is a group consisting of Au, Ag, Cu, Al, Pt, Ni, Ti, and alloys thereof. What has at least 1 sort (s) of selected metal as a main component is preferable.
  • Fluorescent dye molecule 4 is Cy3, Cy5 or the like.
  • the size of the fluorescent dye molecule 4 is about 1 nm.
  • the particle diameter of the enhanced fluorescent particles is preferably 5300 nm or less from the viewpoint of diffusion time.
  • the particle size is preferably about 100 to 500 nm.
  • the electric field enhancement effect by localized plasmon resonance by the metal fine particles is in the range of the particle size of the metal fine particles from the surface of the metal fine particles.
  • the size of the metal fine particles is set so as to obtain an electric field enhancement effect on the fluorescent dye existing at a distance of about 10 nm or more from the metal fine particles by making it larger than the distance at which metal quenching occurs. Therefore, it is desirable that the particle size of the metal fine particles is more than 10 nm.
  • the particle size of the metal fine particles is preferably 10 nm ⁇ particle size ⁇ 40 nm.
  • the metal fine particles be dense. This is because the electric field enhancement effect is about the particle size of the metal fine particles, so that the range in which the enhancement effect does not reach increases when the metal fine particles are sparse.
  • the fluorescent dye is present at a position 10 nm or more away from any metal fine particles. That is, if the fluorescent dye is present at a location where the distance between the metal fine particles is at least 20 nm or more, metal quenching does not occur.
  • the volume content of the metal fine particles In order to satisfy both of these conditions, it is necessary to precisely limit the volume content of the metal fine particles. In this case, in order to consider the volume content, it is easy to understand when packing the fine metal particles coated with a 20 nm quenching prevention film layer (for example, a transparent dielectric film) in the enhanced fluorescent particles. Specifically, when arranged in a lattice, packing can be performed with a particle number of at least 5%. Of course, in this state, the distance between the metal particles at the closest point is 20 nm, but the distance between the metal particles on the diagonal of the lattice is considerably larger than 20 nm. If the distance between the metal fine particles is too large, the electric field enhancement effect is reduced.
  • a 20 nm quenching prevention film layer for example, a transparent dielectric film
  • the distance between the metal fine particles is 20 nm or more, but it is preferable not to be too large.
  • the metal fine particles coated with the 10 nm quenching prevention film layer may be packed in the closest packing.
  • the volume occupancy of the metal fine particles is about 40%.
  • the distance between the metal fine particles is 20 nm or more in almost all directions, but the distance from 20 nm can be made uniform.
  • the first method is to form a dielectric film from a SiO 2 film, and roughly comprises the following steps (1) to (3).
  • the organic dye is naturally immobilized in the silica particles by mixing the dye-silane coupling agent complex in which the organic dye and the silane coupling agent are covalently bonded together with TES (TEOS) (Furukawa Electric) (Refer to the left column of Time Report No. 121 (March 2008) pp.17-22, pp.18).
  • TES TEOS
  • this production method cannot control the number of fine metal particles contained in silica. Therefore, it is necessary to carry out purification, separation and sorting by centrifugation, electrophoresis or liquid chromatography. In fact, this sorting is relatively easy when the initial metal particle diameters are uniform.
  • This method roughly comprises the following steps (1) to (3).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • 144 ⁇ L of EDOEA solution “2, 2 ′-(ethylenedioxy) bis (ethylamine) solution ”(0.1 wt% with respect to water: 96 nmol) is added all at once and stirred.
  • the reagent is removed by dialysis over 24 hours, and then centrifuged at 4000 G for 30 minutes, and the supernatant corresponding to 80% by volume is discarded. Next, add the same volume of water as the discarded supernatant and centrifuge in the same manner.
  • a film made of a crosslinked product of polystyrene-polyacrylic acid block copolymer is formed around gold nanoparticles (gold fine particles). As a result, a product in which a plurality of gold nanoparticles are encapsulated in polystyrene particles is obtained.
  • Impregnation of fluorescent dye molecules Particles including the metal fine particles prepared in the above step are impregnated with fluorescent dye molecules. This process is as follows. 0.1% Solid in phosphate (polystyrene solution: pH 7.0) is prepared using particles including metal fine particles prepared in the above step. Next, a 0.3 mg ethyl acetate solution (1 mL) of fluorescent dye molecules (Hayashibara Biochemical Laboratories, NK-2014, excitation wavelength: 780 nm) is prepared.
  • the above polystyrene solution and fluorescent dye solution are mixed, impregnated while evaporating, and then centrifuged (15000 rpm, 4 ° C., 20 minutes twice) to remove the supernatant.
  • the enhanced fluorescent particles contain a plurality of metal fine particles, the effect of electric field enhancement by localized plasmons by individual metal fine particles can be superimposed over the entire area of the particles, so that single metal fine particles were used.
  • the electric field enhancement effect can be enhanced more than in the case, and since it includes a plurality of fluorescent dye molecules, the amount of emitted fluorescence is greatly increased compared to the case where a single fluorescent dye molecule is used as a fluorescent label. be able to. That is, the enhanced fluorescent particles of the present invention can obtain enhanced fluorescence that is synergistically increased by the electric field enhancing effect of the plurality of metal fine particles and the fluorescence amount increasing effect of the plurality of fluorescent dye molecules.
  • this enhanced fluorescent particle 1 is used as a fluorescent label for antigen detection in an antigen-antibody reaction using localized plasmon enhanced fluorescence
  • a secondary antibody that specifically binds to the antigen on the surface of the enhanced fluorescent particle 1 is used. Immobilized and used as a labeled secondary antibody (labeled binding substance).
  • FIG. 2A is a schematic plan view of a carrier for immunochromatography measurement
  • FIG. 2B is a sectional view taken along the line IIB-IIB in FIG. 2A showing a schematic configuration of the carrier.
  • the immunochromatographic measurement carrier 10 includes a sample holder (case) 16 including a chromatographic medium 12 as a flow path for a sample solution.
  • a part of the chromatographic medium 12 is provided with a detection region (detection unit) 13 to which a first binding substance B 1 that specifically binds to the target substance A is added.
  • a label binding substance applying unit 17 to which the label binding substance 20 is provided is provided.
  • the case 16 is provided with a window 15 made of a transparent member for visually inspecting the detection region 13 and an injection port 14 that is opened at least when the sample solution is injected, for injecting the sample solution S into the chromatographic medium 12. Yes.
  • the chromatographic medium 12 is constituted by a membrane made of nitrocellulose, and the membrane 12 is included in the case 16 so that the detection region 13 can be seen from the window 15 of the case 16.
  • the substance A to be detected is a predetermined antigen
  • the detection region 13 of the chromatographic medium 12 is primary as the first binding substance B 1 that specifically binds to the predetermined antigen A that is the substance to be detected. An antibody is added.
  • the label binding substance 20 is composed of the second binding substance B 2 labeled with the enhanced fluorescent particles 1.
  • the second binding substance B 2 is a secondary antibody B that specifically binds to the antigen A, and binds to another epitope ⁇ epitope; antigen determinant> with respect to the antigen A that is the substance to be detected. It is used.
  • an inspection end confirmation region 18 to which a reference antibody B 3 that binds to the secondary antibody B 1 is added is provided downstream of the detection region 13 of the membrane 12.
  • This confirmation region 18 is also provided in the case 16. It is comprised so that it can visually recognize from the window part 15.
  • FIG. 16 a water absorption pad 19 is provided at the most downstream end in the case 16 so as to absorb water so that the sample liquid S does not return backward.
  • the primary antibody B 1 , the secondary antibody B 2 and the reference antibody B 3 are each added to a predetermined region of the membrane 12, but the addition form may be simply given to each region. However, if the secondary antibody B 2 and the reference antibody B 3 are flowed by permeation and movement of the sample liquid in the membrane, the reaction result may not be visible. It is desirable to be fixed to the area.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the steps of the immunochromatographic measurement method.
  • FIG. 3 in order to make it easy to visually recognize the movement of the antigen A and the labeled binding substance 20 in the membrane 12, the binding state of the primary antibody, the reference antibody, etc., only one or several of them are schematically shown. Show.
  • the sample solution S is, for example, blood, urine, or runny nose that is a target for testing whether or not a substance to be detected is included.
  • step 1 The sample liquid S to be inspected is dropped from the inlet 14.
  • the sample liquid S contains the antigen A which is a substance to be detected.
  • step2 the sample liquid S is the membrane 12 penetrates moved by capillary action, the antigen A in the sample solution S is bound to the secondary antibody B 2 of label binding substance 20 added to the injection port 14 near the membrane 12 The membrane 12 permeates and moves to the detection region 13 side. At this time, the label-binding substance 20 that is not bound to the antigen A is also flowed to the detection region 13 side together.
  • step3 the sample liquid S is gradually moved into the detection region 13 side along the membrane 12, the primary antigen A bound to the secondary antibody B 2 of label binding substance 20, which are fixed on the detection region 13 bound to the antibody B 1, so-called sandwich is formed antigen a is sandwiched with primary antibody B 1 and the secondary antibody B 2.
  • step4 further binds to a second antibody B 2 is the reference antibody B 3 of label binding substance 20 that is not bound to the antigen A.
  • the secondary antibody B 2 binds to the reference antibody B 3 , the fluorescence from the enhanced fluorescent particles 1 can be visually recognized in the test completion confirmation region 18, and it is confirmed that the sample liquid has surely flowed to the detection region 13 and the confirmation region 18. Can be confirmed.
  • the result of the immune reaction is visually observed from the window 15.
  • other excitation light irradiation means for example, light of a xenon lamp or a halogen lamp generally used for illumination of a microscope
  • the enhanced fluorescence may be observed from the enhanced fluorescent particles.
  • the immunochromatographic measurement carrier 10 uses the enhanced fluorescent particles 1 as a fluorescent label, the enhanced fluorescence is synergistically increased by the electric field enhancing effect by the plurality of metal fine particles and the fluorescence amount increasing effect by the plurality of fluorescent dye molecules. Can be obtained, and highly sensitive measurement can be performed.
  • a fluorescence detection device that detects enhanced fluorescence may be configured using light irradiation means and fluorescence detection means that measures fluorescence from the enhanced fluorescence particles.
  • the immunochromatographic measurement carrier which is an embodiment of the localized plasmon resonance enhanced fluorescence detection carrier, has a label-binding substance (labeled secondary antibody) added to a part of the membrane 12 in advance.
  • the secondary antibody may not be added to the membrane.
  • a solution containing the labeled secondary antibody is injected from the injection port, and the labeled secondary antibody is bound to the antigen bound to the primary antibody.
  • the antibody may be bound, or a solution containing the labeled secondary antibody and the sample solution are mixed in advance, and the antigen in the sample solution and the labeled secondary antibody are combined and injected from the injection port. You may do it.
  • FIG. 4 is a schematic side view showing a localized plasmon enhanced fluorescence detection apparatus (hereinafter simply referred to as a fluorescence detection apparatus).
  • this fluorescence detection device 40 includes a bottom surface 41a provided with a detection unit 42 to which a first binding substance B1 that specifically binds to a substance A to be detected in a sample liquid is fixed, and a sample liquid.
  • the substance A to be detected which is detected by the fluorescence detection apparatus 40 is, for example, a CRP antigen (molecular weight 110,000 Da), and a primary antibody (monoclonal antibody) as the first binding substance B 1 that specifically binds to it. ) Is fixed on the bottom surface 41 a of the sample cell 41.
  • the primary antibody B 1 represents, for example, a terminal via the PEG carboxyl functionalized by amine coupling method, is fixed on the bottom surface 41a of the sample cell 41.
  • the above-mentioned amine coupling method includes the following steps (1) to (3) as an example. This is an example when a 30 ⁇ L (microliter) cuvette / cell is used.
  • a secondary antibody (monoclonal antibody) having a different epitope from secondary antibody B 1 is used as a second binding substance B 2 that specifically binds to CRP antigen A in sample solution S. ) Are mixed with a number of enhanced fluorescent particles 1 bonded to the surface.
  • the light source 43 is not limited to the semiconductor laser, and other known light sources can be appropriately selected and used.
  • LAS-1000 plus (trade name) manufactured by FUJIFILM Corporation can be suitably used as the photodetector 44, but is not limited thereto, and is not limited to CCD, PD (photodiode), photomultiplier tube, c- A known material such as MOS can be appropriately selected and used.
  • the excitation wavelength is determined according to the fluorescent dye molecules included in the enhanced fluorescent particles.
  • the sample liquid S is passed through the inside of the sample cell 41, then as a binding substance a fluorescent label has been applied in the same manner, enhanced secondary antibody B 2 is fixed to the surface fluorescent particles 1 is caused to flow.
  • the excitation light L 0 is irradiated from the light source 43 toward the detection unit 42 of the sample cell 41.
  • the secondary antibody B 2 of the labeled binding substance 20 is further bound to the antigen A.
  • the enhanced fluorescent particle 1 that is the label of the secondary antibody B 2 is excited by the excitation light L 0 .
  • the excitation light L 0 is irradiated as described above, the localized plasmon is excited by the plurality of metal fine particles 3 in the enhanced fluorescent particle 1 existing in the vicinity of the detection unit 42 of the sample cell 41, and the localized plasmon
  • the fluorescence Lf is amplified by the electric field amplification action.
  • fluorescence L f is amplified, it is possible to detect the CRP antigens A is a detected object with high sensitivity.
  • the fluorescence detection apparatus and detection method of this embodiment since the above-described enhanced fluorescent particles 1 are used, synergistically by the electric field enhancement effect by the plurality of metal fine particles and the fluorescence amount increase effect by the plurality of fluorescent dye molecules. Increased enhanced fluorescence can be obtained, and fluorescence can be detected with extremely high sensitivity.
  • the fluorescent sensor of this embodiment does not require a total reflection optical system such as a prism unlike the surface plasmon enhanced fluorescent sensor, the apparatus configuration is simple and can be formed at low cost.
  • the immunochromatographic measurement carrier and the fluorescence detection apparatus detect fluorescence by a so-called sandwich type detection method.
  • the second binding that specifically binds to the antigen is performed.
  • Sample solution S using a labeled binding substance obtained by modifying the third binding substance that specifically binds to the first binding substance (primary antibody) B 1 to the enhanced fluorescent particles 1 instead of the substance (secondary antibody) B 2 If mixed in, a fluorescence detection device that detects fluorescence by a so-called competitive method can be obtained.
  • the antigen A can be quantitatively analyzed based on the detected fluorescence amount.

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Abstract

【課題】ローカルプラズモン増強蛍光検出において、より高精度な検出を可能とする。 【解決手段】複数の金属微粒子（３）と複数の蛍光色素（４）とが透光性誘電体材料（２）に分散して内包してなる増強蛍光粒子（１）を用いる。ここで、増強標識粒子（１）内の金属微粒子（３）の粒径は１０ｎｍ超、４０ｎｍ以下であり、占有体積比率が、５％≦占有体積比率≦４０％である。

Description

局在プラズモン増強蛍光粒子、局在プラズモン増強蛍光検出用担体、局在プラズモン増強蛍光検出装置および蛍光検出方法
　本発明は、局在プラズモン増強を利用した蛍光検出に用いられる局在プラズモン増強蛍光粒子、その増強蛍光粒子を備えた局在プラズモン増強蛍光検出用担体、局在プラズモン増強蛍光検出装置および蛍光検出方法に関するものである。
　従来、病原性ウィルス抗原やその他の蛋白質を検出する方法の一つとして、例えば特許文献１に示されるイムノクロマトグラフ法が知られている。このイムノクロマトグラフ法は、検出対象物と反応、結合する物質を所定位置に固定した担体（支持体）を用いるものであり、検出対象物と結合可能な標識微粒子を混合した試料を上記担体
において展開させ、もし検出対象物が存在して上記物質と結合した場合は、検出対象物と結合していた標識微粒子が上記所定位置において呈色することを利用して、検出対象物の存否や量を検出するものである。
　例えばインフルエンザ等のウィルス性の病気に対して、このイムノクロマトグラフ法は簡易かつ迅速に病原菌やウィルスを検出できる方法として需要が急速に拡大している。
　なお、上記の標識微粒子としては一般に金微粒子が用いられ、その場合は、該粒子の部分で発生したローカルプラズモン（局在プラズモン）による特定波長の光の吸収を利用して、呈色させている。したがって、この金微粒子の粒子径を変えることで、ある程度発色を変化させることが可能となっている。
　またバイオ測定等において高感度の測定ができる方法として、従来、蛍光法も広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物の存在を確認する方法である。また、検出対象物が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物の存在を確認することも広くなされている。
　また、蛍光標識からの蛍光検出の方法としては、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に染み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出する方法（エバネッセント蛍光法）が知られている。
　さらに、エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献２などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
　表面プラズモン増強蛍光法においては、強いエネルギーを与えることによる色素の褪色が、感度および定量精度の低下を引き起こすという問題があり、それを解決する方法として、特許文献３には、色素分子をシリカ粒子内に包含させた蛍光標識を用いることが提案されている。
　また、特許文献４には、プラズモン増強蛍光法において、さらなる高感度化を図るために、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子および１以上の蛍光増強微粒子を透光材料により包含してなる蛍光物質を用いることが提案されている。なお、蛍光増強微粒子としては、散乱性微粒子、金属微粒子、金属ナノロッドなどが挙げられている。
　前述した通りイムノクロマトグラフ法においては、標識微粒子である金微粒子等の粒子径を変えることで、ある程度発色を変化させることが可能であるが、金微粒子のローカルプラズモンによる吸収の波長が５３０ｎｍ付近に有るために発色はマゼンタとなり、それは人間の目に対して視認性が良くないものとなっている。したがってこのイムノクロマトグラフ法は、例えば数十ｐmol（ピコ・モル）程度の微量な物質も検出できるようにという、高感度化の要求に応えるのは困難となっている。
　一方、表面プラズモン増強蛍光センサは数ｆmol（フェムト・モル）程度の微量な物質を検出可能であって、高感度化の要求にも応えられるものであるが、その半面、プリズム等の全反射光学系を必要とするので、装置が複雑化してコストが高くつくものとなっている。
　そこで、本出願人は、特許文献５において、高感度化が可能で、しかも安価に形成可能な蛍光センサとして、金属微粒子を用いることにより局在プラズモンによる電場増強を利用する局在プラズモン増強蛍光測定装置を提案している。
　また、蛍光色素が金属に接近し過ぎていると、蛍光色素内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得ることから、特許文献５では、金属消光抑制のため不撓性膜で包んだ金属粒子に色素標識抗体を結合させている。
特公平７－１３６４０号公報 特開平１０－３０７１４１号公報 特開２０１０－９１５５３号公報 特開２０１０－１９７６５号公報 特開２００８－２１６０４６号公報
　しかしながら、特許文献５に用いられる標識は、図４に示すよう金属消光抑制のため不撓性膜１０２で包んだ金属粒子１０３に１つの色素１０４が付与された抗体１０５を結合させたものであり、色素１０４の数が少ないために信号が小さく、十分な高感度化が図れないという問題がある。
　本発明は上記事情を鑑みてなされたものであって、局在プラズモン増強蛍光検出装置において用いられる、より高い電場増強効果を生じ、より大きな蛍光を発生させることができる局在プラズモン増強蛍光粒子を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は局在プラズモン増強蛍光粒子を備えた局在プラズモン増強蛍光検出用担体、局在プラズモン増強蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の局在プラズモン増強蛍光粒子は、複数の金属微粒子と複数の蛍光色素とが透光性誘電体材料に分散して内包されてなり、
　前記金属微粒子の粒径が１０ｎｍ超、４０ｎｍ以下であり、占有体積比率が、５％≦占有体積比率≦４０％であることを特徴とするものである。
　金属微粒子の粒径は、粒子の最大長で定義するものとし、ここでは、複数の金属微粒子の個々の粒子が上記範囲の粒径であるものとする。占有体積比率は、内包されている全金属微粒子の局在プラズモン増強蛍光粒子における占有体積に基づいて算出される、局在プラズモン増強蛍光粒子の単位体積あたりの金属微粒子の体積の比率である。
　前記透光性誘電体材料は、SiO2または光透過性樹脂であることが好ましい。
　ここで、透光性とは、蛍光および蛍光を励起するための励起光のピーク波長に対して、透過率が８５％以上をいうものとする。
　光透過性樹脂としては、光透過性に優れるポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、シクロアレフィン系樹脂であることが好ましい。
　本発明の局在プラズモン増強蛍光検出用担体は、試料液が流下される流路を有する試料保持具からなり、
　前記流路内に、前記試料液中の被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部が設けられ、
　前記流路内の前記検出部より上流側に、標識結合物質が付与された標識結合物質付与部が設けられ、
　前記標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記試料中に混合されて前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に、本発明の増強蛍光粒子が付与されてなるものであることを特徴とする。
　本発明の局在プラズモン増強蛍光測定装置は、本発明の局在プラズモン増強蛍光検出用担体と、
　前記検出部に対して、前記蛍光体を励起する励起光を照射する光源と、
　前記励起光によって励起された蛍光体が発する蛍光を検出する光検出手段とを備えてなることを特徴とするものである。
　本発明の蛍光検出方法は、被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部を一部に備えた試料セルの前記検出部に、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記試料液中に混合されて前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、前記蛍光標識が光の照射を受けて生じる蛍光を検出する蛍光検出方法において、前記蛍光標識として本発明の増強蛍光粒子を用い、局在プラズモン共鳴による増強された蛍光を検出することを特徴とする。
　本発明による局在プラズモン増強蛍光検出用の増強蛍光粒子によれば、複数の金属微粒子と複数の蛍光色素分子を内包し、特に金属微粒子の粒径が１０ｎｍ超、４０ｎｍ以下であり、占有体積比率が、５％≦占有体積比率≦４０％であることを特徴とするものであるので、光の照射を受けたときに、金属微粒子において局在プラズモン共鳴が生じ、その金属微粒子の周囲に局在プラズモン共鳴による増強電場が生じ、その増強された電場により蛍光色素分子からの蛍光が増強される。複数の蛍光色素分子が増強蛍光粒子に内包されているため、積算される蛍光量は非常に大きくなり、増強蛍光粒子は光の照射に対し、非常に高い感度で蛍光を生じる。なお、金属微粒子と蛍光色素分子とは共に透光性誘電材料中に分散して配置されているので、蛍光色素分子が金属微粒子に対して、金属消光が起きる程度に近接して配置されているものも存在するが、そのように近接していない蛍光色素分子も複数存在するため、局在プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、増強された蛍光を発生させることができる。
　本発明による局在プラズモン増強蛍光検出用担体は、本発明の増強蛍光粒子を備えているので、被検出物質を高い感度で検出することが可能となる。
　本発明による局在プラズモン増強蛍光検出装置は、本発明の増強蛍光粒子を備えているので、被検出物質を高い感度で検出することができる。
　また、本発明の局在プラズモン増強蛍光検出装置は、表面プラズモン増強蛍光検出装置のようにプリズム等の全反射光学系を必要とするものではないので、装置構成が簡単で安価に形成可能なものとなる。
局在プラズモン増強蛍光検出用の増強蛍光粒子の断面模式図 イムノクロマト測定用担体の概略構成を示す平面図 図２ＡのIIA-IIA断面図 イムノクロマト測定の工程を示す図 局在プラズモン増強蛍光検出装置を示す概略側面図 従来の蛍光標識を示す断面模式図
　以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
　図１は、本発明の一実施形態による局在プラズモン増強蛍光検出用の増強蛍光粒子を示す概略断面図である。
　図１に示す通り、この増強蛍光粒子１は、透光性誘電体材料２中に複数の金属微粒子３および複数の蛍光色素分子４が分散して内包されてなるものである。増強蛍光粒子１は、光の照射を受け、金属微粒子３において局在プラズモン共鳴を生じ、その周囲に局在プラズモン共鳴による増強電場を生じると共に、その電場増強効果により蛍光色素分子から増強された蛍光を生じるものである。
　透光性誘電体材料２としては、内包される蛍光色素分子が発する蛍光および蛍光色素分子を励起するための励起光を透過する材料であればよく、SiO2や光透過性樹脂が特に好ましい。光透過性樹脂材料としてはポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィン系樹脂などが挙げられる。ここで、励起光、蛍光に対し透明とは、励起光ピーク波長、蛍光ピーク波長に対し、透過率が85％以上であることをいうものとする。
　金属微粒子３を構成する材料としては、光の照射を受けて、局在プラズモン共鳴を生じるものであればよく、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
　蛍光色素分子４はＣｙ３、Ｃｙ５等である。蛍光色素分子４の大きさは～１ｎｍ程度である。
　増強蛍光粒子の粒径は、拡散時間の点から5300ｎｍ以下のものが好ましい。粒径は100～500ｎｍ程度が好ましい。
　蛍光色素が金属微粒子に例えば10ｎｍ未満で近接すると金属消光が生じ、蛍光の発光が抑制されてしまうという問題がある。他方で、金属微粒子による局在プラズモン共鳴による電場増強効果は金属微粒子表面から該金属微粒子の粒径程度の範囲である。
　金属微粒子の大きさは、金属消光が生じる距離よりも大きくすることにより、金属微粒子から１０ｎｍ程度より離れて存在する蛍光色素に対する電場増強効果が得られるように設定することが望ましい。したがって、金属微粒子の粒径は１０ｎｍ超であることが望ましい。実用的な金属である金微粒子の場合、１０ｎｍ≦粒径≦４０ｎｍであれば、可視光領域の全ての波長に対して吸収・プラズモン共鳴を起こさせることができる（TECHNO-COSMOS 2008 Mar. Vol.21、pp.32-38のpp.35左欄参照）。これら２点の条件から、金属微粒子の粒径は、１０ｎｍ＜粒径≦４０ｎｍであることが望ましい。
　さて一方、局在プラズモン共鳴による電場増強効果をより大きく得るためには、金属微粒子が密で在ることが望ましい。なぜなら、電場増強の効果は金属微粒子の粒径程度であるため、金属微粒子が疎の場合、増強の効果が及ばない範囲が大きくなるためである。一方、金属微粒子と蛍光色素との距離が１０ｎｍ未満に近接すると前述のように金属消光が生じる。したがって、いずれの金属微粒子からも１０ｎｍ以上離れた位置に蛍光色素が存在していることを要する。すなわち、金属微粒間の距離が少なくとも２０ｎｍ以上離れている箇所に蛍光色素が存在すれば、金属消光を生じない。
　このような条件を両立させるためには、金属微粒子の体積含有率を精密に限定する必要がある。この場合、体積含有率を考えるには、２０ｎｍの消光防止膜層（例えば、透明な誘電体膜）を被覆した金属微粒子を増強蛍光粒子内にパッキングすることを考えると判りやすい。具体的には、格子状に並べた場合、最低５％以上の粒子数でパッキングすることができる。もちろんこの状態だと最も近接した箇所の金属微粒間の距離は２０ｎｍであるが、格子の対角線上の金属微粒間距離は２０ｎｍよりかなり大きくなる。金属微粒子間距離が大きくなりすぎると電場増強効果が低減することから、金属微粒子間距離は２０ｎｍ以上であるが、大きくなりすぎないことが好ましい。そのためには、１０ｎｍの消光防止膜層を被覆した金属微粒子を最密充填すればよい。この場合、金属微粒子の体積占有率は４０％程度であり、このときは、ほぼ全ての方向で金属微粒間の距離を２０ｎｍ以上であるが、２０ｎｍから大きくなりすぎない距離に揃えることができる。
　ここで、透光性誘電体材料に金属微粒子と蛍光色素を同時に内包してなる増強蛍光粒子の作製方法について２つの例を説明する。
　まず第１の方法は、誘電体膜をSiO2被膜から形成するものであり、大きく分けて次の（１）～（３）の工程からなる。
　（１）金属微粒子３となる金コロイドの合成
　（２）金コロイド表面分散剤の置換（クエン酸→シロキサン）
　5×10-4molの金コロイド水溶液500ｍL（ミリ・リットル）に、APS（（3-Aminopropyl)trimethoxysilane）水溶液（2.5ｍL、1ｍmol）を添加し、15分間強攪拌することにより、金コロイド表面のクエン酸を置換する。
　（３）金コロイド表面のSiO2修飾
　ｐH10～11に調整したsodium silicate 0.54重量％水溶液20ｍLを工程（２）の金コロイド水溶液に添加し、強攪拌する。24時間経過すると、厚さが約4ｎｍのSiO2被膜が形成される。この溶液を遠心分離により30ｍLまで濃縮した溶液に、170ｍLのエタノールを添加する。さらに0.6ｍLのNH4OH（28％）を滴下し、80μL（マイクロ・リットル）のTES（テトラエトキシシラン）を添加し、24時間ゆっくり攪拌すると、厚さ20ｎｍのSiO2被膜が形成される。このとき、TES(TEOS)と同時に有機色素とシランカップリング剤を共有結合で結合した色素-シランカップリング剤複合体を混ぜることによって自然にシリカ粒子中に有機色素が固定化される（古河電工時報第121 号（平成20 年3 月）pp.17-22の pp.18 左欄参照。）。なお、この製作法では、厳密にはシリカ中に含まれる金属微粒子の数を制御できない。したがって、遠心分離・電気泳動や液クロによって、精製・分離・選別を行なう必要がある。実際、最初の金属微粒子径が揃っている場合、この選別は比較的容易である。
　次に第２の方法として、透光性材料をポリマーからなるものとする場合について説明する。この方法は、大きく分けて次の（１）～（３）の工程からなる。
　（１）金属微粒子３となる金ナノ粒子のDMF（N,N-dimethylformamide）への再分散
　平均粒径が約30ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を最大約360ｐmol（＝7×10-11重量％）含む水分散液を１ｍL用意し、これを遠心分離にかけた後、上澄み0.95ｍLを捨てる。残った暗赤色、粘稠性の沈殿物を１ｍLのDMFに再分散させる。なお、過剰のクエン酸イオンは粒子のカプセル化を阻害する。また、小粒径の粒子を用いる場合は、DMFを加える前に水で洗浄した方が良い。
　（２）金ナノ粒子のカプセル化
　上記（１）の工程で得られた、平均粒径が約30ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子を約648ｐmol（＝7×10-11重量％）含むDMF分散液１ｍLに、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体(ポリスチレンが約100量体、ポリアクリル酸が約13量体)のDMF溶液(約10-2ｇ/ｍL)10μLを加え、シリンジポンプにより8.3μL／minの流量で水200μLを加えて激しく撹拌する。10分撹拌すると溶液の色が徐々に紫色に変化するので、そこで１重量％のドデカンチオールDMF溶液5μLを加え、24時間撹拌する。その後、さらにシリンジポンプにより、2ｍL／ｈの流量で水3ｍLを加える。
　次に透析により24時間かけてDMFを除去する。次いで撹拌しながら72μLのEDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）溶液（水に対して0.1重量％：24ｎmol）を一気に添加し、30分撹拌したところで144μLのEDODEA溶液「2,2’-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) solution」（水に対して0.1重量％：96ｎmol）を一気に添加し、撹拌する。
　その後、透析により24時間かけて試薬を除去し、次いで4000Ｇで30分間遠心分離を行い、体積で80％に相当する上澄みを捨てる。次に捨てた上澄みと同体積の水を加えて同様に遠心分離を行う。この遠心分離から遠心分離までの操作を３回以上繰り返すことにより、ポリスチレン-ポリアクリル酸ブロック共重合体の架橋物からなる被膜が金ナノ粒子（金微粒子）の周りに形成される。これによって、複数の金ナノ粒子がポリスチレン粒子内に内包されてなるものが得られる。
（３）蛍光色素分子の含浸
　上記工程で作製した金属微粒子を包含する粒子に蛍光色素分子を含浸させる。この工程は以下の通りである。
　上記工程で作製した金属微粒子を包含する粒子を用いて、0.1％Solid in phosphate(ポリスチレン溶液：pH7.0）を調製する。
　次に、蛍光色素分子（林原生物化学研究所、NK-2014、励起波長：780ｎｍ)0.3ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍL）を作製する。
　上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（15000rpm、４℃、20分を２回）を行い、上澄みを除去する。
　以上の工程により、複数の蛍光色素分子および複数の金属粒子を、蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する機能を有するポリスチレンにより内包してなる増強蛍光粒子を得ることができる。このような手順でポリスチレン粒子に蛍光色素分子を含浸させて作製され増強蛍光粒子の粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ150ｎｍ）となる。
　増強蛍光粒子は、複数の金属微粒子を内包するものであるため、粒子内全域に亘り個々の金属微粒子による局在プラズモンによる電場増強の効果を重畳させることができるので、単体の金属微粒子を用いた場合よりも電場増強効果を高めることができ、また、複数の蛍光色素分子を内包するものであるため、蛍光色素分子単体を蛍光標識として用いる場合と比較すると、発光する蛍光量を大幅に増加することができる。すなわち、本発明の増強蛍光粒子は、複数の金属微粒子による電場増強効果と複数の蛍光色素分子による蛍光量増加効果とにより相乗的に増加された増強蛍光を得ることができる。
　この増強蛍光粒子１は、局在プラズモン増強蛍光を用いた抗原抗体反応において抗原検出のための蛍光標識として用いる場合には、増強蛍光粒子１の表面に抗原と特異的に結合する２次抗体を固定化し、これを標識２次抗体（標識結合物質）として用いる。
　次に本発明の増強蛍光粒子を備えた局在プラズモン増強蛍光検出用担体として、イムノクロマト測定用担体について説明する。図２Ａはイムノクロマト測定用担体の平面模式図、図２Ｂは担体の概略構成を示す図２ＡのIIB-IIB断面図である。
　イムノクロマト測定用担体１０は、試料液の流路としてのクロマトグラフ媒体１２を内包してなる試料保持具（ケース）１６を備えている。クロマトグラフ媒体１２の一部には被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ1が付加された検出領域（検出部）１３が設けられ、クロマトグラフ媒体１２の検出領域１３の上流側に、標識結合物質２０が付与された標識結合物質付与部１７が設けられている。ケース１６には、クロマトグラフ媒体１２に試料液Ｓを注入するための、少なくとも試料液注入時には開口する注入口１４、および検出領域１３を視認するための透明部材からなる窓部１５が設けられている。
　クロマトグラフ媒体１２はここでは、ニトロセルロースからなるメンブレンにより構成されており、メンブレン１２はケース１６内にその検出領域１３がケース１６の窓部１５から視認できるようにして内包されている。本実施形態において被検出物質Ａは所定の抗原であり、クロマトグラフ媒体１２の検出領域１３には被検出物質である所定の抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１として１次抗体が付加されている。
　標識結合物質２０は、増強蛍光粒子１により標識された第２の結合物質Ｂ２からなる。第２の結合物質Ｂ２は、抗原Ａと特異的に結合する２次抗体Ｂであり、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別のエピトープ＜epitope;抗原決定基＞に結合するものが用いられている。
　さらに、メンブレン１２の検出領域１３よりも下流側には２次抗体Ｂ１と結合する参照用抗体Ｂ３が付加された検査終了確認領域１８が設けられており、この確認領域１８もケース１６の窓部１５から視認できるよう構成されている。また、ケース１６内の最も下流側端部には試料液Ｓが逆戻りすることないように吸水する吸水パッド１９が備えられている。
　１次抗体Ｂ１、２次抗体Ｂ２および参照用抗体Ｂ３は、それぞれメンブレン１２の所定領域に付加されているが、その付加形態は単にそれぞれの領域に付与しただけでもよい。しかし、２次抗体Ｂ２および参照用抗体Ｂ３は試料液のメンブレン内の浸透移動により流されてしまうと反応結果を視認できなくなる恐れがあるため、アミノ結合などの手法によりメンブレン１２のそれぞれの領域に固定されていることが望ましい。
　本発明に係る実施形態のイムノクロマト測定用担体１０を用いた、試料液中に所定の抗原Ａが存在するか否かについてのイムノクロマト測定工程について説明する。
　図３はイムノクロマト測定方法の工程を模式的に示す図である。図３においては、メンブレン１２内における、抗原Ａと標識結合物質２０の移動、１次抗体、参照用抗体との結合状態等を視認しやすくするため、それぞれ１つもしくは数個だけを模式的に示している。
　試料液Ｓは、例えば、被検出物質が含まれているか否かを検査する対象となる血液、尿、鼻水などである。
ｓｔｅｐ１：注入口１４から検査対象である試料液Ｓを滴下する。ここでは、この試料液Ｓ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。
ｓｔｅｐ２：試料液Ｓがメンブレン１２内を毛細管現象により浸透移動し、試料液Ｓ中の抗原Ａはメンブレン１２の注入口１４近傍に付加されている標識結合物質２０の２次抗体Ｂ２と結合し、メンブレン１２内を検出領域１３側へと浸透移動する。この際、抗原Ａと結合していない標識結合物質２０も一緒に検出領域１３側へと流される。
ｓｔｅｐ３：試料液Ｓはメンブレン１２に沿って検出領域１３側へと徐々に移動し、標識結合物質２０の２次抗体Ｂ２と結合した抗原Ａが、検出領域１３上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ４：さらに抗原Ａと結合していない標識結合物質２０の２次抗体Ｂ２が参照用抗体Ｂ３と結合する。２次抗体Ｂ２が参照用抗体Ｂ３と結合すると検査終了確認領域１８において増強蛍光粒子１からの蛍光が視認でき、試料液が確かに検出領域１３および確認領域１８まで流れてきていることを確認することができる。
　このような状態で窓部１５から免疫反応の結果を目視する。なお、太陽光、室内光の光では十分に蛍光が発光されない場合には、他の励起光照射手段（例えば、顕微鏡の照明に一般的に用いられている、キセノンランプや、ハロゲンランプの光）を入射させて、増強蛍光粒子からは増強された蛍光を観察してもよい。
　本イムノクロマト測定用担体１０は、蛍光標識として増強蛍光粒子１を用いているので、複数の金属微粒子による電場増強効果と複数の蛍光色素分子による蛍光量増加効果とにより相乗的に増加された増強蛍光を得ることができ、高感度な測定を行うことができる。
　なお、被検体の量が非常に微量であるために、増強されていてもなお蛍光が微弱である場合や測定を常に一定以上の精度で行うために、増強蛍光粒子に励起光を照射する励起光照射手段と、増強蛍光粒子からの蛍光を測定する蛍光検出手段を用いて、増強蛍光を検出する蛍光検出装置を構成してもよい。
　なお、上記局在プラズモン共鳴増強蛍光検出用担体の実施形態であるイムノクロマト測定用担体は、メンブレン１２の一部に予め標識結合物質（標識２次抗体）を付加してあるものとしたが、標識２次抗体はメンブレンに付加されていなくてもよい。その場合には、試料液を注入し、抗原と１次抗体とを結合させた後に、標識２次抗体を含む溶液を注入口から注入し、１次抗体と結合している抗原に標識２次抗体を結合させるようにしてもよいし、予め標識２次抗体を含む溶液と検体液とを混合し、検体液中の抗原と標識２次抗体とを結合させた状態で、注入口から注入するようにしてもよい。
　図４は、局在プラズモン増強蛍光検出装置（以下、単に蛍光検出装置という）を示す概略側面図である。
　図示されている通りこの蛍光検出装置４０は、試料液中の被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定された検出部４２が設けられた底面４１ａと、試料液Ｓを検出部上に保持する透明部材製の試料保持部４１ｂからなる試料セル４１と、この試料セル４１の検出部４２に向けて励起光Ｌ0を照射する半導体レーザ等の光源４３と後述のようにして検出部４２から発せられる蛍光Ｌｆを検出する光検出器４４とを有している。
　この蛍光検出装置４０が検出対象としている被検出物質Ａは、一例としてCRP抗原（分子量11万 Da）であり、それと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１として１次抗体（モノクロナール抗体）が試料セル４１の底面４１ａの上に固定されている。この１次抗体Ｂ１は、例えば末端をカルボキシル基化したPEGを介して、アミンカップリング法により、試料セル４１の底面４１ａの上に固定される。
　上記アミンカップリング法は一例として下記（１）～（３）のステップからなるものである。なおこれは、30μL（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。
　（１）リンカー先端（末端）の-COOH基を活性化
0.1mol（モル）のNHSと0.4molのEDCとを等体積混合した溶液を30μL加え、30分間室温静置。なお、
　　NHS：N-hydroxysuccinimide
　　EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
である。
　（２）1次抗体Ｂ１の固定化
PBSバッファ（pH7.4）で5回洗浄後、1次抗体溶液（500μg/ｍL）を30μL加え、30～60分間室温静置。
　（３）未反応の -COOH基をブロッキング
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、１molのエタノールアミン（pH8.5）を30μL加え、20分間室温静置。さらにPBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄。
　CRP抗原Ａの検出に際しては、試料液Ｓの中に、CRP抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２として、２次抗体Ｂ１とはエピトープが異なる２次抗体（モノクロナール抗体）が表面に結合された多数の増強蛍光粒子１が混合される。
　光源４３としては上記半導体レーザに限らず、その他の公知の光源を適宜選択使用可能である。また光検出器４４としては、例えば富士フイルム株式会社製　LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、それに限らず、CCD、PD（フォトダイオード）、光電子増倍管、c-MOS等の公知のものを適宜選択使用可能である。また励起波長は増強蛍光粒子に内包されている蛍光色素分子に応じて決定される。
　この蛍光検出装置を用いて、試料液Ｓに含まれるCRP抗原Ａを定量分析する場合について説明する。
　まず試料セル４１の中において試料液Ｓが流され、次いで同様に蛍光標識が付与された結合物質として、２次抗体Ｂ２が表面に固定された増強蛍光粒子１が流される。
　この操作の後、光源４３から試料セル４１の検出部４２上に向けて励起光Ｌ0が照射される。このとき、もし試料液Ｓの中にCRP抗原Ａが存在してそれらが検出部４２の１次抗体Ｂ１に結合していれば、さらに該抗原Ａに標識結合物質２０の２次抗体Ｂ２が結合し、その２次抗体Ｂ２の標識である増強蛍光粒子１が励起光Ｌ0によって励起されることとなる。こうして励起された増強蛍光粒子１は蛍光Ｌｆを発し、その蛍光Ｌｆが光検出器４４によって検出される。こうして検出される蛍光Ｌｆの光量は、励起される増強蛍光粒子１の量が多いほど、つまりCRP抗原Ａの量が多いほど大となるので、この検出光量に基づいてCRP抗原Ａを定量分析することができる。
　また上述のように励起光Ｌ0が照射されたとき、試料セル４１の検出部４２近辺に存在する増強蛍光粒子１内の複数の金属微粒子３によって局在プラズモンが励起され、この局在プラズモンの電界増幅作用によって蛍光Ｌｆが増幅されることとなる。こうして蛍光Ｌｆが増幅されることにより、被検出物であるCRP抗原Ａを高感度で検出可能となる。
　また本実施形態の蛍光検出装置および検出方法においては、上述の増強蛍光粒子１を用いているので、複数の金属微粒子による電場増強効果と複数の蛍光色素分子による蛍光量増加効果とにより相乗的に増加された増強蛍光を得ることができ、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。
　そして本実施形態の蛍光センサは、表面プラズモン増強蛍光センサのようにプリズム等の全反射光学系を必要とするものではないので、装置構成が簡単で安価に形成可能なものとなる。
　以上説明した実施形態のイムノクロマト測定用担体および蛍光検出装置は、いわゆるサンドイッチ形式と呼ばれる検出方式で蛍光検出するものであるが、例えば図４の構成において、抗原と特異的に結合する第２の結合物質（２次抗体）Ｂ２に替えて第１の結合物質（１次抗体）Ｂ１と特異的に結合する第３の結合物質を増強蛍光粒子１に修飾した標識結合物質を用い試料液Ｓ中に混合させれば、いわゆる競合方式で蛍光検出する蛍光検出装置が得られる。すなわちその場合は、第３の結合物質と抗原Ａとが１次抗体Ｂ１への結合において競合するので、抗原Ａの量が多いほど検出部に結合される増強蛍光粒子が少なくなり、検出される蛍光Ｌfの光量が少なくなる。そこでこの場合も、この検出蛍光量に基づいて抗原Ａを定量分析することができる。

Claims (5)

  1. 　局在プラズモン増強蛍光検出において用いられる増強蛍光粒子であって、
    　複数の金属微粒子と複数の蛍光色素とが透光性誘電材料に分散して内包されてなり、
    　前記金属微粒子の粒径が１０ｎｍ超、４０ｎｍ以下であり、占有体積比率が、５％≦占有体積比率≦４０％であることを特徴とする増強蛍光粒子。
  2. 　前記透光性誘電材料がSiO2または透明樹脂であることを特徴とする請求項１記載の増強蛍光粒子。
  3. 　試料液が流下される流路を有する試料保持具からなり、
    　前記流路内に、前記試料液中の被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部が設けられ、
    　前記流路内の前記検出部より上流側に、標識結合物質が付与された標識結合物質付与部が設けられ、
    　前記標識結合物質が、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記試料中に混合されて前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に、請求項１または２記載の増強蛍光粒子が付与されてなるものであることを特徴とする局在プラズモン増強蛍光検出用担体。
  4. 　請求項３記載の局在プラズモン増強蛍光検出用担体と、
    　前記検出部に対して、前記蛍光体を励起する励起光を照射する光源と、
    　前記励起光によって励起された蛍光体が発する蛍光を検出する光検出手段とを備えてなることを特徴とする局在プラズモン増強蛍光測定装置。
  5. 　被検出物質と特異的に結合する第１の結合物質が固定された検出部を一部に備えた試料セルの前記検出部に、前記被検出物質と特異的に結合する第２の結合物質、および前記試料液中に混合されて前記被検出物質と競合して前記第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質のいずれか一方の結合物質に蛍光標識が付与されてなる標識結合物質を含む試料液を接触させ、
    　前記蛍光標識が光の照射を受けて生じる蛍光を検出する蛍光検出方法において、
    前記蛍光標識として請求項１記載の増強蛍光粒子を用い、局在プラズモン共鳴による増強された蛍光を検出することを特徴とする蛍光検出方法。
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