JP2009544718A - タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を処置するための接着タンパク質からのペプチドをディスプレイするファージの使用 - Google Patents

Abstract

タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を処置するための接着タンパク質からのペプチドをディスプレイするファージの使用要約：哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する治療剤を使用し、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を阻害または処置し、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害し、事前に形成した細胞内タンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集できる。非繊維状バクテリオファージＲＧＤ細胞接着配列をその表面上にディスプレイするが、抗体または該ＲＧＤ細胞接着配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない繊維状バクテリオファージは、このような治療剤の好ましい実施態様である。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２００６年７月２１日に出願された米国特許第６０／８３２，２２９号からの優先権の恩典を主張し、それは参照により全体が組み入れられる。

発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、細胞内のタンパク質の繊維性封入または凝集を阻害すること、および、事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体を溶解すること、および、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を阻害または処置するための方法および医薬組成物に関するものである。

関連技術の説明
斑形成病は、脳中のアミロイド斑沈着、ならびに、神経変性の存在により特徴づけられる。アミロイド沈着は、不溶性塊に凝集されたペプチドにより形成される。ペプチドの性質は異なる疾患において変動するが、しかし、大半の場合において、凝集はβプリーツシート構造を有し、コンゴーレッド色素で染色される。早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、および前駆症状性のアルツハイマー病を含むアルツハイマー病（ＡＤ）に加えて、アミロイド沈着により特徴づけられる他の疾患は、例えば、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、およびプリオン病である。動物において最も多く見られるプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピー、ならびにウシの牛海綿状脳症（ＢＳＥ）である（Wilesmith and Wells, 1991）。４つのプリオン病がヒトにおいて同定されている：（ｉ）クールー、（ｉｉ）クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、（ｉｉｉ）ゲルスマン・ストロイスラー・シェンカー病（ＧＳＳ）、および（ｉｖ）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（Gajdusek, 1977;およびTritschler et al.,1992）。

プリオン病は、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）の対応するスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への変換を含む。分光測定によって、ＰｒＰＣのスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への変換は主要なコンフォメーション遷移を含み、プリオン病が、他のアミロイド生成性の疾患と同様に、タンパク質コンフォメーションの障害であることを意味することが実証される。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの遷移は、αヘリカル二次構造における低下（４２%から３０%）およびβシート含量における顕著な上昇（３%から４３%）を伴う（Caughey et al., 1991;およびPan et al., 1993）。この再構成は、非変性界面活性剤中での不溶性およびタンパク質分解に対する部分的な耐性を含む、異常な生理化学的特性に関連する。以前の研究では、ヒトＰｒＰ（ＰｒＰ １０６〜１２６）の１０６〜１２６番目の残基と相同な合成ペプチドが、ＰｒＰＳｃの病原性特性および物理化学的特性の一部を呈することが示された（Selvaggini et al., 1993; Tagliavini et al., 1993;およびForloni et al., 1993）。ペプチドは顕著なコンフォメーション多型を示し、様々な環境において異なる二次構造を獲得する（De Gioia et al., 1994）。それは緩衝溶液中でβシートコンフォメーションの形をとる傾向があり、プロテアーゼでの消化に対して部分的に耐性であるアミロイド原線維に凝集する。近年、抗体３Ｆ４とそのペプチドエピトープ（ＰｒＰ １０４〜１１３）の複合体のＸ線結晶学的研究によって、プリオン病の発生に必須のコンフォメーション的再構成の構成要素と考えられるこの可動性領域の構造的見解が示された（Kanyo et al., 1999）。フォールディング−アンフォールディングおよび／または溶解−凝集の過程に関与する配列のクラスの同定は、凝集の予防および／または脱凝集の誘発に基づく、斑形成病の処置のための新しい方向を開く（Silen and Agard, 1989; Frenkel et al., 1998; Horiuchi and Caughey, 1999）。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年認知症を招く進行性の疾患である。大まかに言うと、この疾患は２つのカテゴリー：老齢期（典型的に、６５歳超）において起こる遅発型、および、老年期よりもかなり前（例えば、３５〜６０歳）に発生する早期発症型に分類される。この疾患のいずれのタイプにおいても、病理は同様であるが、しかし、異常は、より低年齢で開始する症例においてより重度かつ広範となる傾向がある。この疾患は、脳中の２つのタイプの病変、老人斑および神経原線維変化により特徴づけられる。老人斑は幅１５０mmまでのまとまりのない好中球の部位であり、中央に細胞外アミロイド沈着を伴い、脳組織切片の顕微鏡分析により見ることができる。神経原線維変化は、二つ一組で互いにねじれた２つのフィラメントからなるタウタンパク質の細胞内沈着物である。

老人斑の主成分は、アミロイドβ（Ａβ）またはベータ−アミロイドペプチド（βＡＰまたはβＡ）と呼ばれるペプチドである。アミロイドベータペプチドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆タンパク質の３９〜４３個のアミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質のいくつかの突然変異は、アルツハイマー病の存在と相関する（Goate et al., (1991), バリン７１７からイソロイシン; Chartier Harlan et al., (1991), バリン７１７からグリシン; Murrell et al., (1991), バリン７１７からフェニルアラニン; Mullan et al., (1992), 二重突然変異, リジン５９５−メチオニン５９６からアスパラギン５９５−ロイシン５９６への変化）。

このような突然変異は、ＡＰＰからベータ−アミロイドへのプロセシングの上昇または変化、特にＡＰＰから長型ベータ−アミロイドの増量へのプロセシング（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）によりアルツハイマー病を起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２などの他の遺伝子における突然変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を与え、長型ベータ−アミロイドの増量を起こす（Hardy, TINS 20, 154, 1997を参照）。これらの知見は、ベータ−アミロイド、特にその長型が、アルツハイマー病の原因エレメントであることを示唆する。

自己凝集の証拠を伴う他のペプチドまたはタンパク質も公知であり、例えば、限定はされないが、アミリン（Young et al., 1994）；ボンベシン、セルレイン、コレシストキニン・オクタペプチド、エレドイシン、ガストリン関連ペンタペプチド、ガストリン・テトラペプチド、ソマトスタチン（還元型）、サブスタンスＰ；およびペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチンＮ−Ｔｙｒ（Banks and Kastin, 1992）などである。以下の表１は、神経変性に関連する一部のコンフォメーション病のリストを示す。

アミロイド線維に関する論文は、円筒状βシートがＸ線および電子顕微鏡のデータの一部と一致する唯一の構造であることを示し、アルツハイマーＡβフラグメントおよび変異体の繊維はおそらくは２または３のいずれかの同心円筒状βシートから作られる（Peretz et al., 2002）。完全なＡβペプチドは４２個の残基を含み、円筒シェルを核とするためにまさに適切な数である；この知見、およびプロリンの非存在下においてＡβペプチドから作製されたβシート中の多くの可能な強い静電相互作用は、Ａβペプチドがアルツハイマー患者において見出される細胞外アミロイド斑を形成する性質を説明する。この解釈が正しい場合、アミロイドは中央の水で満たされた空洞を伴う細管（ナノチューブ）からなる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアミロイド斑の成長の可逆性は、斑中βＡと溶液中βＡの間での定常状態の平衡を示唆する（Maggio and Mantyh, 1996）。βプリーツシート繊維を形成するためのβＡ重合のペプチド−ペプチド相互作用に対する依存性、および反応に対する他のタンパク質の刺激的影響は、アミロイド形成がモデュレーションを受けうることを示唆する。アミロイド形成に干渉できる物質を見出すための多くの試みがなされてきた。最も研究された化合物は、抗体、プロリンなどのベータ−ブレイカーアミノ酸から構成されるペプチド、認識モチーフに対する荷電基の付加、および構成要素としてのＮメチル化アミノ酸の使用である（Gazit, 2002による概説）。

代替Ｄ残基およびＬ残基から作製された環状ペプチドは、それら自体を膜中に挿入し、それらを脱分極することにより細菌を殺すこのようなナノチューブを形成する（Peretz et al., 2002）。一部のアミロイド線維がコンダクターとなり、同じ機構により細胞を殺しうるとの示唆がある。

それら自体をヘリカルターンの間のギャップ中に挿入できるコンゴーレッドなどの芳香族化合物は、円筒シェルを不安定化し、この過程を開始するが、しかし、予防はより有効であり、おそらくは達成がより容易でありうる（Peretz et al., 2002）。

細胞内凝集体―コンフォメーション病の特徴
タンパク質のミスフォールディングおよびコンフォメーション変化は、いくつかのタイプの疾患における出現および進行の主な原因であり（Raso et al., 2000）、コンフォメーション病のリストを、それらの関連するタンパク質成分および細胞封入体とともに、以下の表２において示す（Goedert et al., 1998）。一部の場合において、複数のタンパク質が障害に関与し、斑中に共存する、またはその形成を容易にする。

西洋の高齢化する人口における主要な問題を表すアルツハイマー病（ＡＤ）において、主なタンパク質成分はＡＰＰであって、約７００個のアミノ酸残基の膜貫通タンパク質である。その異常なプロセシングにおいて、Ａβ（１〜４０）ペプチドが細胞外に産生され、斑として沈着する。ＡＤの別の特徴は、細胞中に観察される別のタンパクの神経原線維変化τau（タウ）であり、τauは、ニューロンにおいて細胞内に位置する軸索微小管を安定化することに関与する微小管関連タンパク質である。

二番目に多く見られる神経変性病であるパーキンソン病においては、いくつかのタンパク質が関与する：αシヌクレイン、シンフィリン（αシヌクレイン結合タンパク質）、およびパーキン（Ciechanover, 2001）。パーキンソン病の特色は細胞内レビー小体の存在であり、それはパーキンソン病の散発例、レビー小体型認知症、およびアルツハイマー病のレビー小体変異体において見出される（Chung et al., 2001）。αシヌクレインはレビー小体の主成分である（Spillantini et al., 1997）。αシヌクレインおよびシンフィリンのいずれもレビー小体の形成のために必要とされ、そこでシンフィリンのユビキチン化がおそらく起こる（Ciechanover, 2001;およびChung et al., 2001）。

さらなるコンフォメーション病の例であるプリオン病、一連の伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールー、クロイツフェルト−ヤコブ病、および致死性家族性不眠症、ウシにおける牛海綿状脳症、ヒツジにおけるスクレイピー、ならびにシカにおける慢性消耗病）は、細胞内アミロイドーシスと共通の多くの特色を有し、最も起こりうるのは「コンフォメーション的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）」である（Soto, 2001）。今までに、約２０のヒトのタンパク質が、様々なコンフォメーション病におけるタンパク質沈着物中に見出された。これらは任意の配列相同性または構造的相同性を示さない。共通のイベントはコンフォメーション変化であると考えられ、生物学的機能の欠如または毒性活性の獲得、およびおそらくは、アミロイド原線維の形成をもたらす。

繊維性凝集体およびアミロイド斑が一部の他の病理の副産物であるのか否か、またはそれらが疾患の主な原因であるのか否かは、議論の対象である。タンパク質凝集体と変性組織との共局在およびそれらの存在と病徴との関連は、コンフォメーション病の病変形成におけるアミロイド沈着の関与の強い指標である（Soto, 2001）。一部の神経変性病の家族性症例において（表１および２）、突然変異タンパク質が原線維を形成する能力と病理の徴候出現との間の直接的な関連についての証拠が得られている（Goedert et al., 1998;およびConway et al., 1998）。トランスジェニック動物での研究によって、アミロイド生成性タンパク質および疾患の病変形成における突然変異の寄与も確認された（Soto, 2001; Scherzinger et al., 1997;およびTurmaine et al., 2000）。

異なるタンパク質におけるアミロイド形成の類似性
Dobsonおよび共著者は、アミロイド線維形成がタンパク質の一般的な特性であることを提唱した（Guijarro et al., 1998; Fandrich et al., 2001;およびDobson, 1999）。共通の知見は、繊維化が、中間状態、部分的にアンフォールドされている、または部分的にフォールドされている、モルテン・グロビュールまたは天然中間体のいずれかから始まることである（Rochet et al., 2000）。αヘリカル構造を伴う部分はαからβの遷移を受けなければならず、次にβストランドは規則的な繊維構造に会合する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ｐＨを変えること、または有機溶媒を添加することによる溶媒条件の変化（Buck, 1998）によって、部分的なアンフォールディングおよびそれに続くタンパク質繊維形成を導くことができる（Chiti et al., 1999a and 1999b）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、部分的なアンフォールディングが、突然変異、膜のｐＨにおける局所変化、酸化ストレス、および熱ストレスに起因するタンパク質の安定性の低下の結果として起こりうるのに対し、部分的なフォールディングは、農薬などの環境中の疎水性物質に対する暴露時に起こりうる（Uversky et al., 2001）。

原線維の共通の特色は、原線維の長軸に対して垂直に走るβストランド（４．７Åだけ隔てられる）、および、この軸に対して平行に伸展するβシートである（Serpell, 2000）。βストランドは、１１５Åまたは２５０Å毎に通常のリピートを伴うβヘリカルツイストを形成する（Serpell, 2000;およびDing et al., 1999）。

アミロイド−繊維形成を理解することは、今日の最も破壊的な疾患の一部を解決し、そして最低限、タンパク質構造、フォールディング、および安定性に関する一般的な知識を増やすことに寄与しうる。アミロイド原線維の多くの特性が現れている：フィラメントおよび原線維についての共通構造（Serpell, 2000）、核生成依存性キネティクス（Lomakin et al., 1996）、オリゴマー中間体の役割（Harper et al., 1999;およびWalsh et al., 1999）、および巨視的状態として挙動する高エネルギーバリヤーにより隔てられた少なくとも２つのタンパク質コンフォメーションの存在（Ferreira et al., 2001; およびSchlunegger et al., 2001）。

家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）
家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）は、運動ニューロンが損なわれ、喪失される先天的な神経変性病であり、ＡＬＳ症例の１０%を占める（Cudkowicz et al., 2004、およびGonzalez de Aguilar et al., 2007）。これらの症例の２０%において、病理は、アミロイド様フィラメントおよび凝集体の形成をもたらす突然変異型タンパク質スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の細胞内蓄積により特徴づけられる（Bruijn et al., 1998; Watanabe et al., 2001; Taylor et al., 2002; Elam et al., 2003; Wood et al., 2003; およびMatsumoto et al., 2005）。ｆＡＬＳは、ミスフォールディング型のＳＯＤ１タンパク質を導くＳＯＤ１遺伝子における数十の公知の突然変異に起因するが、ＳＯＤ１遺伝子における任意の公知の突然変異を欠くＡＬＳ患者の他の８０%が、ＳＯＤ１タンパク質のミスフォールディングを強制できる翻訳後修飾または他の環境条件の結果でありうるＳＯＤ１凝集体を被るか否かは証明されていない。

ＡＬＳ研究における進歩が、突然変異ヒトＳＯＤ１タンパク質のいくつかのトランスジェニックマウスモデルの開発後に得られた。これらのモデルの１つは、Ｇ９３Ａ突然変異ＳＯＤ１タンパク質を有し、これはＳＯＤ１蓄積および運動障害を招く（Watanabe et al., 2001; Wong et al., 2002; Julien and Kriz 2006;およびUrushitani et al., 2007）。これらのマウスは、最善かつ最も一般的なＡＬＳ研究モデル動物である。

細胞内凝集体を溶解および予防する方向での治療的アプローチ
新規治療的アプローチは以下の目的の１つを達成する方向に向けられている：コンフォメーション変化を阻害および／または逆転するため、または小さな凝集体を溶解し、アミロイド原線維を分解するためのいずれか。タンパク質の活性コンフォメーションに対して結合し、これによりコンフォメーション変化を阻害するモノクローナル抗体の使用を含む、いくつかの成功した試みが文献中に引用されている。アルツハイマー病において、ワクチン接種の実用化が見込まれており、この場合においては、より小さなオリゴマーおよび前繊維性凝集体を標的にする（Ingram et al., 2001）。Ｓｏｔｏおよび共同研究者は、いわゆる「ミニ−シャペロン（ｍｉｎｉ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）」、別名「βシート・ブレイカー（β ｓｈｅｅｔ ｂｒｅａｋｅｒｓ）」をデザインし（Soto et al., 2001）、これらは自己会合に関与するタンパク質領域の配列に対して結合するペプチドである。プリオン病において、アルツハイマーと同様に、コンフォメーション変化を予防するモノクローナル抗体を使用し、治験が進行中である（Jones, 2001）。他の目的のために既に使用中である一部の薬物がスクリーニングされており、いくつかは、Prusinerのグループが報告した通り、早期介入のために使用した場合に神経変性を遅延または逆転し、また、全く絶望的な症例において病状を改善することが見出された（Korth et al., 2001）。これらの薬物の１つであるキナクリンは抗マラリア剤であり、その他、クロルプロマジンは統合失調症を処置するために使用される。アミロイド繊維形成の他の遮断薬が見出されており、コンゴーレッド誘導体、抗癌薬および抗菌薬からニコチンおよびメラトニンにまで及ぶ（Findeis, 2000）。

細胞中へのファージ内在化のためのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド
アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）細胞接着配列は、２２年前にフィブロネクチンにおいて発見された（Pierschbacher et al., 1984a）。非常に大きなタンパク質においてわずか３個のアミノ酸が細胞のために必須の認識部位を形成しうるとの驚くべき知見は、初期にはいくらかの懐疑を伴って受け入れられた。知見は、しかし、フィブロネクチンに関してすぐに確認され、次に他のタンパク質に拡大された。原論文において予測された通り、ＲＧＤ配列は多くの他の接着タンパク質の細胞付着部位であることが判明した（Pierschbacher et al., 1984b; Yamada et al., 1984; Gartner et al., 1985; Plow et al., 1985; Suzuki et al., 1985;およびGardner et al., 1985）。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴａｔタンパク質は、他の内在化ペプチドでは、細胞付着活性を伴うＲＧＤ含有タンパク質である。Ｔａｔの細胞との相互作用は重要であり、それはＴａｔが細胞により内在化でき、このため１個の細胞により産生されたＴａｔが別の細胞に入り、潜在ＨＩＶの産生を活性化することができるためである（Ensoli et al., 1990）。

Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）付着部位を含むタンパク質は、それらのレセプターとしての役割を果たすインテグリンと共に、細胞接着のための主要な認識システムを構成する。ＲＧＤ配列は、数多くの接着性細胞外マトリクス、血液、および細胞表面タンパク質の細胞付着部位であり、２０を超える公知のインテグリンの半数近くが、その接着タンパク質リガンドにおいてこの配列を認識する。一部の他のインテグリンは、それらのリガンド中の関連配列に対して結合する。接着タンパク質のインテグリン結合活性は、ＲＧＤ配列を含む短い合成ペプチドにより再現できる。このようなペプチドは、表面上で不溶化された場合には細胞接着を促進し、溶液中で細胞に提示された場合にはそれを阻害する。１個のみ、または数個のＲＧＤに向けたインテグリンに対して選択的に結合する試薬は、ＲＧＤの周囲の選択された配列を伴うペプチドを環化することにより、およびＲＧＤ模倣体を合成することによりデザインできる。インテグリン媒介性の細胞付着が細胞の移動、増殖、分化、およびアポトーシスに影響を与え、それらをレギュレーションするため、ＲＧＤペプチドおよび模倣体を使用して様々な生物学的システムにおいてインテグリン機能を探索できる。

ＲＧＤ環状ペプチドを介したインテグリンレセプターを通じた、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介した哺乳動物細胞に対するファージ結合および内在化
ＲＧＤ配列を含む環状ペプチドは、高親和性でインテグリン分子に結合し、これによりＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのインベイシン媒介性内在化と同様の機構による内在化を可能にする。繊維状ファージ・ディスプレイ・システム中のインテグリン結合性ＲＧＤ含有環状ペプチドを、ｆｄファージの主要コートタンパク質遺伝子である遺伝子ＶＩＩＩを伴う外因性ＤＮＡ配列に対して融合した（Greenwood et al., 1991; およびHart et al., 1994）。このアプローチの目的は、ファージと細胞の間の相互作用のための機会を最大限にするために、複数コピーのインテグリン結合ペプチドをディスプレイすることであった。カプシドは、野生型ｐＶＩＩＩサブユニットと融合ｐＶＩＩＩサブユニットのハイブリッド混合物を含む（Greenwood et al., 1991; およびHart et al., 1994）。Hartは、環状ペプチド配列ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣ（配列番号１）をコード化するＤＮＡオリゴヌクレオチドをデザインし、複数コピーにおいてファージ上にディスプレイさせた。このペプチドは、元々は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩによりコード化される非主要コートタンパク質において単離および記載され、高いインテグリン結合親和性を有することが示された（O’ Neil et al., 1992）。その主要コートタンパク質サブユニットにおいてこの粒子をディスプレイするバクテリオファージｆｄ粒子は、インテグリンについても高い結合親和性を有する。

ファージＭ１３のｐＶＩＩＩ主要コートタンパク質上に提示される環状ペプチド配列ＥＦＧＡＣＲＧＤＣＬＧＡ（配列番号２）は、高効率的に哺乳動物細胞に結合することが示された（Ivanenkov et al., 1999; およびMasliash et al., 2000）。

本明細書における任意の文書の引用は、このような文書が関連する先行技術であるとの了解、または本出願の任意の請求項の特許性に対する考慮される題材としては意図されていない。内容に関する任意の記載または任意の文書の日付は、出願時に出願者が入手可能な情報に基づき、このような記載の正確性に関する承認を構成しない。

発明の概要
この方法は、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を阻害または処置するための方法を提供する。この方法は、それを必要とする哺乳動物の被験体に対する有効量の治療剤を投与することを含み、治療剤は、疾患を阻害または処置するために、該治療剤を細胞内に内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する。

本発明は、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害するため、または、事前に形成した細胞内タンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集（溶解）するための方法も提供する。

本発明は、本方法において活性成分として使用される有効量の治療剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

図１Ａ〜１Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した内在化ファージキネティクスの定量的分析を示すグラフである。図１Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、いくつかの時間経過で培養した：１５および３０分、１、２、５、および２２時間。その後、細胞を溶解し、全細胞ライセートを、マウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４０５nmでのレファレンスで、分光光度計によりモニターし、４９２nmでの光学密度に比例した。図１Ｂは図１Ａの拡大であり、２時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図１ＣはファージＲＧＤ検量線である。 図１Ａ〜１Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した内在化ファージキネティクスの定量的分析を示すグラフである。図１Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、いくつかの時間経過で培養した：１５および３０分、１、２、５、および２２時間。その後、細胞を溶解し、全細胞ライセートを、マウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４０５nmでのレファレンスで、分光光度計によりモニターし、４９２nmでの光学密度に比例した。図１Ｂは図１Ａの拡大であり、２時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図１ＣはファージＲＧＤ検量線である。 図１Ａ〜１Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した内在化ファージキネティクスの定量的分析を示すグラフである。図１Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、いくつかの時間経過で培養した：１５および３０分、１、２、５、および２２時間。その後、細胞を溶解し、全細胞ライセートを、マウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４０５nmでのレファレンスで、分光光度計によりモニターし、４９２nmでの光学密度に比例した。図１Ｂは図１Ａの拡大であり、２時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図１ＣはファージＲＧＤ検量線である。 図２Ａ〜２Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定したＣＨＯ細胞からのファージクリアランスのキネティクスを示すグラフである。図２Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、２時間の初期内在化で培養した。その後、細胞を洗い、培地を交換した。細胞をいくつかの時間点の後に溶解した：２、５、４８、および７２時間。細胞ライセートをマウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４９２nmで測定した光学密度に対して比例し、４０５nmでのレファレンスを分光光度計によりモニターした。図２Ｂは図２Ａの拡大であり、１０時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図２Ｃは、ファージＲＧＤ、ＷＴ、ＰＢＳ、またはチメロサールと１週間インキュベートしたＣＨＯ細胞の追加プレートのＭＴＴ生存アッセイを示す。 図２Ａ〜２Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定したＣＨＯ細胞からのファージクリアランスのキネティクスを示すグラフである。図２Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、２時間の初期内在化で培養した。その後、細胞を洗い、培地を交換した。細胞をいくつかの時間点の後に溶解した：２、５、４８、および７２時間。細胞ライセートをマウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４９２nmで測定した光学密度に対して比例し、４０５nmでのレファレンスを分光光度計によりモニターした。図２Ｂは図２Ａの拡大であり、１０時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図２Ｃは、ファージＲＧＤ、ＷＴ、ＰＢＳ、またはチメロサールと１週間インキュベートしたＣＨＯ細胞の追加プレートのＭＴＴ生存アッセイを示す。 図２Ａ〜２Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定したＣＨＯ細胞からのファージクリアランスのキネティクスを示すグラフである。図２Ａにおいて、ＣＨＯ細胞を、最終濃度６．６×１０^１２ファージ／プレートのファージＲＧＤ（◆）、ＷＴ（■）、またはＰＢＳ（▲）と共に、２時間の初期内在化で培養した。その後、細胞を洗い、培地を交換した。細胞をいくつかの時間点の後に溶解した：２、５、４８、および７２時間。細胞ライセートをマウス抗Ｍ１３抗体でコートした９６マイクロタイタープレートに対して適用した。細胞内におけるファージレベルをポリクローナルウサギ抗ファージ抗体、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体で検出した。細胞内におけるファージ濃度は、４９２nmで測定した光学密度に対して比例し、４０５nmでのレファレンスを分光光度計によりモニターした。図２Ｂは図２Ａの拡大であり、１０時間までの短い時間経過での可視化を可能にする。図２Ｃは、ファージＲＧＤ、ＷＴ、ＰＢＳ、またはチメロサールと１週間インキュベートしたＣＨＯ細胞の追加プレートのＭＴＴ生存アッセイを示す。 図３Ａおよび３Ｂは、トランスジェニックマウスの海馬（図３Ａ）および皮質（図３Ｂ）におけるレビー小体の染色を示すグラフである。グループＡ／対照を水ビデ（ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ）で週１回８週間処置した（ｎ＝５）。グループＢ／ファージ慢性を繊維状ファージで週１回８週間処置した（ｎ＝５）。〜１５月齢の海馬および皮質（ｎ＝３／グループ）におけるαシヌクレイン免疫反応性の評価１日２回３日間処置した急性処置グループ（８月齢）において効果は認められない。 図３Ａおよび３Ｂは、トランスジェニックマウスの海馬（図３Ａ）および皮質（図３Ｂ）におけるレビー小体の染色を示すグラフである。グループＡ／対照を水ビデ（ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ）で週１回８週間処置した（ｎ＝５）。グループＢ／ファージ慢性を繊維状ファージで週１回８週間処置した（ｎ＝５）。〜１５月齢の海馬および皮質（ｎ＝３／グループ）におけるαシヌクレイン免疫反応性の評価１日２回３日間処置した急性処置グループ（８月齢）において効果は認められない。 図４は、ファージで処置したＳＯＤ１マウスのＲｏｔｏｒｏｄ運動能力を示すグラフである。ここに提示したＲｏｔｏｒｏｄ結果は、マウスの疾患発症の推定齢での運動能力を評価する。結果を３回／匹／週の平均時間として算出する。処置マウスは未処置マウスよりも良好な運動能力を有し、より長時間その能力を保持し、それは疾患発症の遅延に置き換えられることが分かる。完全な運動機能障害は、すべてのグループにおいてほぼ同齢でエンドポイントに達した。 図５は、ＲＧＤをディスプレイするファージで処置したＳＯＤ１ ＡＬＳモデルマウスの生存率を示すグラフである。暗い太線は未処置マウスの生存率を示す。明るい細線は、ＵＶ不活化ファージ処置マウスの生存率を示し、対照グループに対して２６日間の死亡発現の遅延および最高齢マウスの死亡における１４日間の遅延を示す。５０%生存の平均が、対照グループよりも１０日間長いと推定される。暗い細線は、生ファージ処置マウスの生存率を示し、対照グループに対して１５日間の死亡発現の遅延および最高齢マウスの死亡における１９日間の遅延を示す。５０%生存の平均が、対照グループよりも８日間長いと推定される。 図６Ａ〜６Ｅは、ＳＯＤ１およびファージ免疫組織学からの画像および共焦点顕微鏡の結果であり、ここで図６Ａは、モノクローナル抗体抗ヒトＳＯＤ１（Santa Cruz １：５００）ｃｙ２標識を使用した皮質におけるニューロンのＳＯＤ１染色を示す。多数のＳＯＤ１陽性ニューロンが皮質において見ることができる。図６Ｂは、ｃｙ３標識ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）を使用したファージ標識を示す。矢印は、ファージ陽性皮質ニューロンの一部およびニューロン細胞質内のファージの存在を指し示す。図６Ｃは、ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）のｃｙ３標識を使用した星状細胞のファージ標識（形態のみによる）を示す。図６ＤおよびＥは、ＳＯＤ１ニューロンの二重標識を示し、Ｍ１３ファージはＳＯＤ１陽性ニューロンへのファージ内在化および細胞質におけるその存在を実証する。 図６Ａ〜６Ｅは、ＳＯＤ１およびファージ免疫組織学からの画像および共焦点顕微鏡の結果であり、ここで図６Ａは、モノクローナル抗体抗ヒトＳＯＤ１（Santa Cruz １：５００）ｃｙ２標識を使用した皮質におけるニューロンのＳＯＤ１染色を示す。多数のＳＯＤ１陽性ニューロンが皮質において見ることができる。図６Ｂは、ｃｙ３標識ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）を使用したファージ標識を示す。矢印は、ファージ陽性皮質ニューロンの一部およびニューロン細胞質内のファージの存在を指し示す。図６Ｃは、ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）のｃｙ３標識を使用した星状細胞のファージ標識（形態のみによる）を示す。図６ＤおよびＥは、ＳＯＤ１ニューロンの二重標識を示し、Ｍ１３ファージはＳＯＤ１陽性ニューロンへのファージ内在化および細胞質におけるその存在を実証する。 図６Ａ〜６Ｅは、ＳＯＤ１およびファージ免疫組織学からの画像および共焦点顕微鏡の結果であり、ここで図６Ａは、モノクローナル抗体抗ヒトＳＯＤ１（Santa Cruz １：５００）ｃｙ２標識を使用した皮質におけるニューロンのＳＯＤ１染色を示す。多数のＳＯＤ１陽性ニューロンが皮質において見ることができる。図６Ｂは、ｃｙ３標識ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）を使用したファージ標識を示す。矢印は、ファージ陽性皮質ニューロンの一部およびニューロン細胞質内のファージの存在を指し示す。図６Ｃは、ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）のｃｙ３標識を使用した星状細胞のファージ標識（形態のみによる）を示す。図６ＤおよびＥは、ＳＯＤ１ニューロンの二重標識を示し、Ｍ１３ファージはＳＯＤ１陽性ニューロンへのファージ内在化および細胞質におけるその存在を実証する。 図６Ａ〜６Ｅは、ＳＯＤ１およびファージ免疫組織学からの画像および共焦点顕微鏡の結果であり、ここで図６Ａは、モノクローナル抗体抗ヒトＳＯＤ１（Santa Cruz １：５００）ｃｙ２標識を使用した皮質におけるニューロンのＳＯＤ１染色を示す。多数のＳＯＤ１陽性ニューロンが皮質において見ることができる。図６Ｂは、ｃｙ３標識ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）を使用したファージ標識を示す。矢印は、ファージ陽性皮質ニューロンの一部およびニューロン細胞質内のファージの存在を指し示す。図６Ｃは、ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）のｃｙ３標識を使用した星状細胞のファージ標識（形態のみによる）を示す。図６ＤおよびＥは、ＳＯＤ１ニューロンの二重標識を示し、Ｍ１３ファージはＳＯＤ１陽性ニューロンへのファージ内在化および細胞質におけるその存在を実証する。 図６Ａ〜６Ｅは、ＳＯＤ１およびファージ免疫組織学からの画像および共焦点顕微鏡の結果であり、ここで図６Ａは、モノクローナル抗体抗ヒトＳＯＤ１（Santa Cruz １：５００）ｃｙ２標識を使用した皮質におけるニューロンのＳＯＤ１染色を示す。多数のＳＯＤ１陽性ニューロンが皮質において見ることができる。図６Ｂは、ｃｙ３標識ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）を使用したファージ標識を示す。矢印は、ファージ陽性皮質ニューロンの一部およびニューロン細胞質内のファージの存在を指し示す。図６Ｃは、ウサギポリクローナル抗Ｍ１３ファージ（１：５００）のｃｙ３標識を使用した星状細胞のファージ標識（形態のみによる）を示す。図６ＤおよびＥは、ＳＯＤ１ニューロンの二重標識を示し、Ｍ１３ファージはＳＯＤ１陽性ニューロンへのファージ内在化および細胞質におけるその存在を実証する。 図７は、ファージがテトラサイクリン培地上で増殖するＴＧ１細菌に感染する能力を示すペトリ皿の画像であり、ここで対照皿において、ＰＢＳを与えたＴＧ１は増殖しないが、しかし、ＴＧ１にＭ１３ファージを与えた場合、次に、それらは、細菌にテトラサイクリン耐性を与える感染ファージの結果として、テトラサイクリン培地上で増殖できる。 図８は、ファージのＵＶ照射によってファージがＴＧ１細菌に感染する能力が予防されることを示すペトリ皿の画像であり、ここでペトリ皿Ａは陽性対照であり―Ｍ１３が感染したＴＧ１細菌は、それにより、テトラサイクリン上で増殖できる；ペトリ皿Ｂ―１サイクルの２００，０００μjのＵＶ不活化を経たＭ１３ファージが感染したＴＧ１細菌は、それにより、細菌に感染する能力を失う；ペトリ皿Ｃ―２サイクルの２００，０００μjのＵＶ不活化を経たＭ１３ファージが感染したＴＧ１細菌；ペトリ皿Ｄ―３サイクルの２００，０００μjのＵＶ不活化を経たＭ１３ファージが感染したＴＧ１細菌；ペトリ皿Ｅ―４サイクルの２００，０００μjのＵＶ不活化を経たＭ１３ファージが感染したＴＧ１細菌；ペトリ皿Ｆ―５サイクルの２００，０００μjのＵＶ不活化を経たＭ１３ファージが感染したＴＧ１細菌。 図９Ａおよび９Ｂは、ＵＶ照射したファージの電子顕微鏡写真である（バー１００nm）図９Ａは、天然の繊維状構造における野生型ファージを示し、図９ＢはＵＶ照射したファージを示す。ＵＶ照射したファージにおけるファージの繊維状構造は損傷を受けていない。 図９Ａおよび９Ｂは、ＵＶ照射したファージの電子顕微鏡写真である（バー１００nm）図９Ａは、天然の繊維状構造における野生型ファージを示し、図９ＢはＵＶ照射したファージを示す。ＵＶ照射したファージにおけるファージの繊維状構造は損傷を受けていない。 図１０は、Ａβ１−４０凝集とのファージ干渉を評価するＴｈＴアッセイの結果を示すグラフである。アミロイド含量を、４８５nmの波長で、続いて４３５nmの励起で蛍光分光分析により測定した。

発明の詳細な説明
βアミロイドペプチド（ＳＡ）は、アルツハイマー病の２つの特徴の１つである。このペプチドは、脳組織において強変性剤によってのみ溶解できる繊維性の毒性凝集体を形成する。これらの神経毒性特性はペプチド凝集型に関連するため、脳内におけるアミロイド線維性沈着の範囲を減少または除去する方向の治療的アプローチを開発することにおいて多大な努力が注ぎ込まれてきた。

生理的条件下で、合成βＡは凝集型の形をとり、神経突起からの変化も示し、海馬ニューロンにおける神経毒性効果を促進する。βＡの凝集は、ｐＨ、ペプチド濃度、温度、およびインキュベーション時間に依存することが示されている。

本発明者の実験室において、構造レベルおよび遺伝子レベルのいずれでもよく理解されている繊維状ファージＭ１３、ｆ１、およびｆｄ（Greenwood et al., 1991）を使用した。この実験室は、繊維状バクテリオファージが、ベクターの不活性特性および外来分子を運ぶ能力のいずれも保存しつつ、中枢神経系への侵入特性を呈することを最初に示した（Frenkel and Solomon, 2002）。

本発明者の実験室は、驚くべきことに、繊維状ファージ自体がβＡ凝集をｉｎ ｖｉｔｒｏで予防し、ならびに、既に形成した凝集体を溶解する能力を有することも発見した。

繊維状バクテリオファージは、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む構造的に関連するウイルスのグループである。それらは増殖性感染の間にはそれらの宿主を殺さない。Ｆプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに感染するファージは、まとめてＦｆバクテリオファージと呼ばれる。それらは哺乳動物細胞には感染しない。

繊維状バクテリオファージは長さ約１〜２ミクロンおよび直径６nmの柔軟なロッドであり、タンパク質サブユニットのヘリカルシェルがＤＮＡコアを取り囲む。２つの主なコートタンパク質であるタンパク質ｐＩＩＩおよび主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩは、提示されるタンパク質のコピー数において異なる。ｐＩＩＩは４〜５コピーにおいて提示され、ｐＶＩＩＩは〜３，０００コピーにおいて見出される。約５０残基の主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩサブユニットは大部分がアルファ−ヘリカルであり、アルファ−ヘリックスの軸はビリオンの軸と小角度を作る。タンパク質殻（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｅｌｌ）は３つのセクションにおいて考えることができる：サブユニットのＮ末端領域により占められ、周囲の溶媒と相互作用する酸性残基に富み、ビリオンに低等電点を与える外表面；無極性側鎖の１９残基ストレッチを含み、そこでタンパク質サブユニットは主に互いに相互作用する殻の内側；および、サブユニットのＣ末端領域により占められ、ＤＮＡコアと相互作用する塩基性残基に富む内表面。実質的にすべてのタンパク質側鎖の相互作用は、サブユニット内よりはむしろ、コートタンパク質アレイ中の異なるサブユニットの間であるとの事実によって、これは、巨大分子集合体におけるアルファ−ヘリカルサブユニットの間の相互作用の試験のための有用なモデルシステムになる。繊維状バクテリオファージの独自構造によってその脳内への侵入が可能になるが、それは約１６．３MDの質量を有し、ファージ構造がアミロイド線維自体と似ているため、βＡ繊維化と干渉するその能力に寄与する。

上記を考えると、本発明者の実験室は、繊維状ファージがβアミロイドペプチドの凝集過程に干渉する能力を検証し、異なる時間間隔で、異なる比率での野生型繊維状ファージとβアミロイドペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーションが、βアミロイドの予防および／または脱凝集を導く。さらに、繊維ファージは細胞の生存能に対する保護効果を示す。

本発明者の実験室は、このように、繊維状ファージＭ１３のアミロイドβペプチド（ＡβＰ）凝集に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのモデュレーション効果、ならびに、凝集したＡβ媒介性の毒性に対するファージの神経保護活性を実証した。繊維状ファージの線形構造は、Ａβに対する抗凝集特性を与えることが示され、アミロイド形成を阻害し、既に形成した凝集体をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで溶解する。ファージの線形構造を修飾すること、および、それを球状にすることによって、その脱凝集能ならびに侵入能が消失する。

本発明者の実験室は、最近、それらの線形の形状に起因し、繊維状バクテリオファージが異なる種類の膜に高い透過性を有することを示した。この独自構造によって、それらの高分子量にもかかわらず、ＣＮＳへのそれらの侵入が可能になる。抗Ａβ抗体をディスプレイするようにこれらのファージを操作し、経鼻投与を介してトランスジェニックマウスの脳内にデリバリーし、Ａβ斑と共局在化させた。最近、その表面上にコカイン捕捉抗体をディスプレイする操作された繊維状バクテリオファージの経鼻投与を使用した、コカイン乱用に対する同様の処置戦略が提案された。これらのファージ粒子はＣＮＳ侵入のために有効なベクターであり、コカインを結合でき、それによりげっ歯類モデルにおいてその行動的効果を遮断する（Carrera et al., 2004）。

データは、繊維状ファージβアミロイド原線維とスライド上で増殖させたミクログリア細胞のインキュベーション後に得られた。βアミロイドがミクログリアを活性化すれば、ファージは、ミクログリアを活性化することなくそれを溶解する。ファージ技術がβアミロイドの抗凝集剤の新しく実質的に無制限の供給源を提供し、Ｆｃレセプターを介してマイクログリアを過剰活性化しうる抗体の有害効果を予防する。

バクテリオファージは、遺伝子および／またはデリバリー媒体として、動物ウイルスを上回る独特な利点を有する。それらは、大規模な産生および精製が非常に効率的であり、動物ウイルスベクターのそれよりもずっと安価である単純なシステムである。加えて、ＤＮＡの大セグメントをファージミドベクター中に効率的にパッケージングできる。原核生物の感染、集合、および複製のために進化したため、バクテリオファージは、哺乳動物細胞において複製し、哺乳動物細胞について自然向性（ｎａｔｕｒａｌ ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すことはできない。これによって非特異的遺伝子デリバリーの可能性が最小限になる。ファージベクターは、それらが動物細胞において複製可能実体を作成する可能性が低いため、潜在的にウイルスよりもずっと安全である（Monaci et al., 2001）。

本発明は、疾患を阻害または処置するために哺乳動物の被験体の細胞中に治療剤を内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する有効量の治療剤を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を阻害または処置するための方法を提供する。

本発明の方法により阻害または処置される疾患は、表１において開示する、タウ、Ａβ１−４２ペプチド、ヒートショックタンパク質、αシヌクレイン、シスタリン（ｃｙｓｔａｌｌｉｎ）、ハンチントンまたはアタキシンのＧｌｕリピート伸長、プリオンタンパク質、カテプシンＢ、アミリン、アミロイドＡ、およびβ２ミクログロブリンなどのタンパク質成分から作製された神経原線維変化などの、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を指す。好ましくは、疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。疾患の好ましい実施態様は脳に関連し、この方法は、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する身体の他の部分の疾患も処置できる。

本明細書において使用する通り、治療剤は、治療剤が、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の形成を脱凝集または阻害するために、前記の治療剤を細胞内に内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する限り、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害する、または事前に形成した細胞内のタンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝縮（溶解）する任意の薬剤でよい。ペプチド配列を有する治療剤の好ましい実施態様は、好ましくは、繊維状バクテリオファージがペプチド配列以外の抗体または非繊維性バクテリオファージもディスプレイしないという条件で、その表面上にペプチド配列をディスプレイする繊維状バクテリオファージである。治療剤の他の非限定的な例として、他のタイプのファージおよびウイルス、ならびに、哺乳動物細胞の接着配列に融合される、ペプチド、タンパク質および他の治療化合物が挙げられる。このようなペプチドの非限定的な例として、米国特許第６，４６２，１７１号およびSoto et al., (2001)において開示される抑制性ペプチドが挙げられる。

哺乳動物細胞の接着配列は、細胞接着の結果としての内在化を促す任意の配列でよい。好ましくは、哺乳動物細胞の接着配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である。最も好ましくは、ＲＧＤ細胞接着配列は、配列番号１または配列番号２を含み、環状である。細胞接着配列の別の非限定的な例は、ＨＩＶからのＴａｔペプチドである。

繊維状バクテリオファージは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、またはこれらの混合物などの任意の繊維状バクテリオファージである。Ｍ１３が以下の実施例において使用されたが、任意の他の繊維状バクテリオファージが同様に挙動および機能すると予測され、それはこれらが同様の構造を有し、および、それらのゲノムが９５%を超えるゲノム同一性を有するためである。繊維状バクテリオファージは、好ましくはＵＶ照射および不活化し、ＵＶ照射および不活化は、バクテリオファージの繊維状構造を、損傷を受けないままにし、それは細胞内のタンパク質の繊維性封入体または凝集体の形成を阻害するその能力、または事前に形成した細胞内のタンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集するその能力を保持する。

方法を使用して脳において生じる疾患を阻害または処置する場合、繊維状バクテリオファージは好ましくは経鼻投与し、レシピエントの嗅覚系を通じてレシピエントの体内に活性成分を導入する。

治療剤の好ましい実施態様としての繊維状バクテリオファージＭ１３は、多くの利点を有する。それは、ペプチドまたはタンパク質の発現のための無毒性の十分に確立されたシステムである。それはそのコートタンパク質上で発現されたペプチドまたはタンパク質を安定化し、大規模産生にスケールアップすることが容易であり、哺乳動物細胞への向性を有さず、脳内への侵入を促す。

本発明は、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内での形成を阻害するための方法も提供する。この方法は治療剤をもたらすことを含み、治療剤は、この治療剤を哺乳動物細胞内に内在化でき、タンパク質の繊維性封入体または凝集体を形成できる細胞内ペプチドまたはポリペプチドと接触し、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害するようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する。

本発明は、さらに、事前に形成した細胞内のタンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集するための方法を提供する。本発明の実施態様は、治療剤をもたらすことを含み、治療剤は、この治療剤を哺乳動物細胞内に内在化でき、事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体と接触し、事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体を脱凝集するようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する。

βＡ繊維形成または脱凝集に関する繊維状バクテリオファージの抗凝集または脱凝集特性は、周知のＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔ（ＴｈＴ）結合アッセイにより測定できる。βＡ繊維構造形成の破壊および事前に形成されたβＡ原線維の脱凝集は、ＴｈＴ蛍光における実質的な低下により指示される。

この明細書および添付請求項の目的のために、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」「レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）」という用語は互換的に使用される。それらは最も好ましくはヒトであるが、しかし、マウス、ラット、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなどを含む任意の哺乳動物でよく、これらは予防的、実験的、または治療的な処置のいずれかの対象である。

「ベータアミロイドペプチド」という用語は、「βアミロイドペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」、および「Ａβ」と同義語である。これらの用語のすべてが、アミロイド前駆体タンパク質に由来する斑形成ペプチドを指す。

本明細書において使用される通り、「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」、「プリオン」は、適当な条件下で、斑形成病に関与する凝集体の形成を誘発できるポリペプチドを指す。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、このような条件下で、限定はされないが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、または狂牛病、ネコのネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）などの斑形成病に関与する対応するスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に返還される。

本明細書において使用される通り、「脱凝集（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ）」という用語は、典型的に非共有結合によりまとめられた凝集タンパク質の可溶化（溶解）を指す。

「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患の進行を実質的に阻害、遅延、または逆転させること、疾患の臨床症状を実質的に改善すること、または疾患の臨床症状の出現を実質的に予防することを意味することを意図する。

本明細書においても使用されている通り、「斑形成病（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、限定はされないが、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病、前駆症状性のアルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性骨髄腫、およびヒトに罹患することが知られているプリオン病、例えば、クールー、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルスマン・ストロイスラー・シェンカー病（ＧＳＳ）、および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、および動物では、例えば、スクレイピーおよび牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの疾患において、ベータ−アミロイド、血清アミロイドＡ、シスタチンＣ、ＩｇＧカッパ軽鎖、またはプリオンタンパク質などの凝集するタンパク質（斑形成ペプチド）による斑の形成により特徴づけられる疾患を指す。

上に記載した疾患に関連するアミロイド斑（アミロイド沈着としても知られる）の大部分が脳内に局在化するため、細胞外斑のための任意の提案した処置モダリティ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｙ）によって血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力ならびにアミロイド斑を溶解する能力が実証されなければならない。通常、ＢＢＢに侵入できる分子の平均サイズは約２kDaである。

増加する証拠によって、嗅覚欠損および中枢嗅覚経路における神経変性変化が、ＡＤの臨床経過において早期に影響を受けることが示される。さらに、ＡＤに関与する解剖学的パターンは、嗅覚経路がＡＤの発生における初期段階でありうることを示唆する。

嗅覚レセプターニューロンは、鼻腔の上皮層に存在する双極細胞である。それらの軸索はくし状板を横断し、脳の嗅球において嗅覚経路の最初のシナプスに突き出る。この配置によってそれらがハイウェイになり、ウイルスまたは他の輸送された物質がＢＢＢを越えてＣＮＳに接近できる。

先に示した通り、経鼻投与（Mathison et al., 1998; Chou et al., 1997; Draghia et al., 1995）によって、ウイルスおよび巨大分子の脳脊髄液（ＣＳＦ）またはＣＮＳ中への直接的な移行が可能になる。

脳へのアデノウイルスベクターのためのデリバリーのポイントとしての嗅覚レセプターニューロンの使用が、文献において報告されている。この方法は、報告によると、一見の毒性はなく、１２日間、脳においてレポーター遺伝子の発現を起こす（Draghia et al., 1995）。

本発明の医薬的調製物は、活性成分として、治療剤を細胞内に内在化できるようにディスプレイされるペプチド配列を有する有効量の治療剤を含む。

本発明の調製物は、それ自体で、または適当な担体または賦形剤と混合した医薬組成物中で生物に投与できる。

本明細書において使用される通り、「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、生理学的に適した担体または賦形剤などの他の化学成分を伴う、本明細書に記載の１または複数の活性成分の調製物を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を促すことである。

本明細書において、「活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、生物学的効果を説明可能な調製物を指す。

以下、「生理学的に許容可能な担体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」および「医薬的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という語句は、互換的に使用でき、生物に有意な刺激を起こさず、投与した化合物の生物学的な活性および特性を抑止しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは以下の表現下に含まれる。

本明細書において、「賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」という用語は、活性成分の投与をさらに促すために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例として、限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。

薬物の製剤化および投与のための技術は、"Remington’s Pharmaceutical Sciences"（Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版）において見出せ、それは参照により本明細書に組み入れられる。

適した投与経路として、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸内デリバリー、または、筋内、皮下および髄内注入、ならびに髄腔内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼球内注入を含む非経口デリバリーが挙げられる。

あるいは、調製物を全身性ではなく局所、例えば、患者の脳内へのこの調製物の直接的な注入により投与できる。

本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知の過程、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、ゲル化、乳化、カプセル化、封入化、または凍結乾燥過程を利用して製造できる。

本発明の使用のための医薬組成物は、このように、医薬的に使用できる調製物中への活性成分のプロセシングを促す賦形剤および助剤を含む、１または複数の生理学的に許容可能な担体を使用し、従来の方法で製剤化できる。適切な製剤は、選んだ投与経路に依存する。

注入のために、本発明の活性成分を、水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩バッファーなどの生理学的に適合するバッファー中に製剤化できる。経粘膜投与のために、浸透される関門に適当な浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は当技術分野において一般的に公知である。

経口投与のために、治療剤を、活性成分と当技術分野において周知の医薬的に許容可能な担体を併用することにより容易に製剤化できる。このような担体によって、治療剤を、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化できる。経口使用のための薬理学的調製物は、固形賦形剤を使用し、任意に得られた混合物を粉砕し、および、適した助剤を適宜添加した後に、顆粒の混合物をプロセシングし、錠剤コアまたは糖衣錠コアを得ることにより作製できる。適した賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの増量剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容可能なポリマーである。適宜、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、もしくはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加できる。

糖衣錠コアは適したコーティングを伴い提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を使用でき、それは任意にガム・アラブル（ｇｕｍ ａｒａｂｌｅ）、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合物を含む。染料または色素を、異なる組み合わせの活性成分用量の同定またはその特性付けのために、錠剤または糖衣コーティングに添加できる。

経口で使用できる医薬組成物として、ゼラチンで作製されたプッシュフィットカプセルならびにゼラチンで作製されたソフト密封カプセルおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤が挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および、任意に、安定剤との混合剤中で活性成分を含みうる。ソフトカプセル中で、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適した液体中に溶解または懸濁できる。加えて、安定剤を添加できる。経口投与のためのすべての製剤は、選んだ投与経路に適した投与量にする必要がある。

口腔投与のために、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の状態を取りうる。

経吸入のために、本発明の使用のための活性成分を、便宜上、適した噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素の使用を伴う、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレイ提示の状態においてデリバリーされる。加圧エアロゾルの場合において、投与量の単位は、測定した量をデリバリーするためのバルブを提供することにより決定できる。例えば、ディスペンサーにおける使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末ベースの粉末混合物を含んで製剤化できる。

本明細書において記載する調製物は、例えば、ボーラス注入または継続注入による非経口投与用に製剤化できる。注入用の製剤は、単位投与量の形態において、例えば、アンプル中で、または多回投与容器中で、任意に保存剤を添加して、提示できる。組成物は油性または水性の賦形剤中の懸濁剤、溶液、または乳剤でよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤用薬剤を含んでよい。

非経口投与のための医薬組成物は、水溶性型の活性調製物の水溶液を含む。加えて、活性成分の懸濁剤は、適当な油性または水性の注入懸濁剤として調製できる。適した親油性の溶媒または賦形剤は、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを含む。水性注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁剤の粘性を増大させる物質を含んでよい。任意に、懸濁剤は、適した安定剤、または活性成分の可溶性を増大し、高濃縮溶液の調製を可能にする薬剤を含んでもよい。

あるいは、活性成分は、適した賦形剤、例えば、滅菌パイロジェン・フリー水溶液との構成のために、使用前に、粉末型でよい。

本発明の調製物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を使用し、坐剤または保持浣腸剤などの直腸用組成物中で製剤化してもよい。

本発明と関連する使用に適した医薬組成物として、活性成分が使用目的を達成するための有効量含まれる組成物が挙げられる。より具体的には、治療的有効量は、疾患の症状を予防、軽減、または改善するため、または処置されている被験体の生存を延長するために有効な活性成分の量を意味する。それは、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害または減少する、または事前に形成された細胞内タンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集／溶解する有効量も意味する。

治療的有効量の決定は、特に、本明細書において提供する詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法において使用する任意の調製物について、治療的有効量または用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイから初期に推定できる。例えば、用量は、所望の効果を達成するために、動物モデルにおいて製剤化できる。このような情報を使用して、ヒトにおけるより有用な用量をより正確に決定できる。

本明細書において記載される活性成分の毒性および治療効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの標準的な医薬的手順により、細胞培養または実験動物において決定できる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投与量の製剤化において使用できる。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路に依存して変動しうる。厳密な製剤、投与経路、および投与量は、患者の状態の観点から、個々の医師が選んでよい。（例えば、Fingl et al., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1 (1975)を参照）

投与量および投与間隔を個別に調整し、凝集を予防する、または存在する凝集体を脱凝集するために十分である血漿レベルまたは脳レベルの繊維状バクテリオファージを提供できる（最小有効濃度、ＭＥＣ）。ＭＥＣは各々の調製物について変動しうるが、しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから推定できる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特性および投与経路に依存する。結合アッセイを使用して、血漿濃度を決定できる。

投与間隔もＭＥＣ値を使用して決定できる。調製物は投与計画を使用して投与すべきであり、それによって時間の１０〜９０%、好ましくは３０〜９０%、最も好ましくは５０〜９０%の間、ＭＥＣを上回る血漿レベルが維持される。

処置される状態の重症度および反応性に応じて、投与は単回投与または複数回投与でよく、処置経過は数日から数週まで、または根治がもたらされるまで、もしくは病状の減退が達成されるまで続く。

投与する組成物の量は、無論、処置される被験体、苦痛の重症度、投与の方法、処方する医師の判断などに依存する。

本発明の組成物は、適宜、ＦＤＡ承認済みキットなど、パックまたはディスペンサー・デバイス中に提示されてよく、それには活性成分を含む１または複数の単位剤形を含んでよい。パックは、例えば、ブリスター・パックなど、金属箔またはプラスチック箔を含みうる。パックまたはディスペンサー・デバイスは、投与のための指示が添付されうる。パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する行政機関により処方される状態の容器に関連する通知によっても適応でき、この通知は、組成物またはヒトまたは獣医用投与の状態の機関による承認を反映する。このような通知は、例えば、処方薬のための米国食品医薬品局による承認済みラベルまたは承認済み産物インサートでよい。適合する医薬担体中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物を、上でさらに詳述するように、調製し、適当な容器中に入れ、指示した条件の処置のために標識することもできる。

ここでは本発明を一般的に記載しているが、同じことは、例示のために提供され、本発明を限定することを意図しない以下の実施例の参照を通じて容易に理解されうる。

実施例１
アルツハイマー病実験
材料および方法
電子顕微鏡法（ＥＭ）
繊維状ファージのアミロイドβペプチド（ＡβＰ）との相互作用
ファージおよびＡβサンプルを２００＃グリッド上で蒸発させたＦｏｒｍｖａｒ被膜カーボンに接着し、ブロットした。繊維状ファージ粒子とＡβ繊維を識別するために、ＡβＰ（本発明者の実験室において産生）のＥＦＲＨアミノ酸残基（配列番号３）に対して産生させたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１９６での免疫標識を実施し、Ａβおよびウサギポリクローナル抗Ｍ１３（当研究室において産生）を検出し、ファージを標識した。免疫標識を、１２nm金抱合ヤギ抗マウス抗体および６nm金抗ウサギ抗体によりそれぞれ可視化した（Electron Microscopy Sciences, Washington）。サンプルを一次抗体と共に１０分間インキュベーションし、０．１% ＢＳＡ／ＴＢＳで５回洗い、次に二次抗体と共に３０分間インキュベーションし、洗い、含水酢酸ウラニル（２%wt／vol）（Sigma）でネガティブ染色し、JEOL 1200 EX電子顕微鏡下で観察した（Ingram, 2001）。

野生型Ｍ１３ファージがＡβＰ凝集を予防する能力は、ＡβＰ１−４０（９７μＭ）を異なる量のファージ（２×１０^１２ファージ＝１１０nM、２×１０^１０ファージ＝１．１nM、および２×１０^８ファージ＝０．０１nM）と９日間３７℃でインキュベーションすることにより実証した。ＰＢＳの添加が対照としての役割を果たした。ファージを伴う、または伴わないＡβＰ溶液からの１０μlのサンプルを、上に記載の通りにプロセシングした。

凝集実験のために、ＰＢＳ中に溶解したＡβＰ１−４０を３７℃で９日間インキュベーションし、凝集体を形成した。ファージ（１×１０^１２ファージ＝５５nM、１×１０^１０ファージ＝０．５５nM）をサンプルに添加し（Ａβ１−４０ ９７μM）、３７℃で１６時間コインキュベーションし、ＥＭ分析のためにプロセシングした。

ファージＲＧＤの構築
コンピテント大腸菌の調製
異なる大腸菌株（Ｋ９１Ｋａｎ、ＤＨ５α、およびＸＬ−１ ｂｌｕｅ）を２mlの２ＹＴ培地（１００μg／mlカナマイシン、２０μg／mlテトラサイクリンをそれぞれ含む、または抗生物質を含まない）中で、３７℃で一晩振盪しながら（２５０rpm）増殖した。次に、６００μlの一晩培養物を６０mlのＳＯＢ培地に移し、早期対数状態まで増殖した（Ｏ．Ｄ．（６００nm）〜０．３）。増殖した細菌を氷上で１０分間インキュベーションし、次に４℃で５，０００rpm、１０分間遠心分離した。細菌ペレットを２０mlのＣＣＭＢ中に再懸濁し、２０分間氷上でインキュベーションし、続いて４℃で５，０００rpm、１０分間遠心分離した。沈殿した細菌を５mlのＣＣＭＢ中に再懸濁させ、分注し、使用まで−７０℃で保存した。

ファージＲＧＤのクローニング
Ｆ８８−４ベクター精製および切断
ｆ８８−４ベクターを「タイプ８８」ｆｄライブラリークローン（George Smithにより提供）から、DNA midi purification kitを使用して単離した。Ｆ８８−４ベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ制限酵素により消化した。１５μgのｄｓＤＮＡ、１μlのＰｓｔＩおよび１μlのＨｉｎｄＩＩＩ、４μlのＮｏ．３制限酵素バッファー×１０を含む４０μlの全反応量を３７℃で２時間インキュベーションし、その後に７０℃５分間不活化した。その後、１μlのアンタークティックホスファターゼを、消化したベクターに添加し、３７℃で３０分間、ＤＮＡから５’リン酸基を除去した。この産物を０．７%アガロースゲル中で電気泳動した。線形のプロセシング済みベクターを、ＤＮＡ抽出キットを使用してゲルから精製した。

インサートの調製：インサートプライマーのリン酸化およびアニーリング
２つの相補的プライマーそれぞれ５０pmolを２．５μlのＴ４キナーゼバッファー×１０、１μlのＴ４キナーゼ、および１６．５μlのＤＤＷと混合し、３７℃で２時間インキュベーションし、その後に７０℃１０分間キナーゼを不活化した。次に、２０pmolの各々のプライマーを全量１００μlに混合し、９５℃で５分間インキュベーションした。次に、漸減温度を適用し、プライマーのアニーリングを可能にした。この段階でアニーリングしたプライマー（インサート）は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの突出末端からなるｄｓＤＮＡである。

ライゲーションおよびトランスフォーメーション
プロセシングしたベクターおよびアニーリングしたプライマー（インサート）を、以下の通りに、モル比１：３でそれぞれライゲーションした：１００ngのベクター、１．４２３ngのインサート、１．５μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼバッファー×１０、および１μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼを全容積１５μlに添加し、室温で２時間インキュベーションし、その後に４℃で一晩インキュベーションした。ベクター自己ライゲーション率を評価するために、ベクターのみからなる追加混合物を調製した。ライゲーション産物を、以下の通りに、ヒートショック手順を使用してコンピテントＫ９１Ｋａｎ細菌に形質転換した：１０μlのライゲーション混合物を１００μlの解凍した細菌に添加し、氷上で３０分間インキュベーションし、その後に４２℃で２分間のインキュベーションおよび氷上で５分間の迅速な追加インキュベーションした。次に、１mlの２ＹＴを細菌に添加し、培養物を１５０rpmで１時間振盪しながら３７℃で増殖し、抗生物質耐性遺伝子を発現させた。細菌を１００μg／mlカナマイシンおよび２０μg／mlテトラサイクリンを含む２ＹＴプレート上で２つの希釈物中に播種し、３７℃で一晩増殖した。

陽性クローンの同定
Ｋａｎ／Ｔｅｔ上で増殖した形質転換したコロニーをコロニーＰＣＲにかけた。各々のコロニーを７μlのレディミックス、１μl（１０pmol）の各々のプライマー（インサートプライマーがフォワード・プライマーとしての役割を果たし、ｆ８８−４ベクターのｐＶＩＩＩに相補的なプライマーがリバース・プライマーとしての役割を果たした）および５μlの滅菌ｄｄＨ_２Ｏと混合し、その後に以下の通りのＰＣＲ反応を行った：９５℃６分、次に：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分の２９サイクル。最終鎖伸長は、７２℃での追加５分のインキュベーションにより実施した。次に、ＰＣＲ産物を２%アガロースゲルに適用し、３５bpのバンドを検出し、ＲＧＤインサートが実際にベクターにライゲーションされていることを示した。次に、陽性コロニーを、ＰＣＲにおいて使用したリバース・プライマーを使用して配列決定した。

ファージ産生
ＰＥＰインサートを含むｆ８８−４ベクターならびに野生型クローン（「ネイキッド」ｆ８８−４ベクターである）をトランスフェクションしたＫ９１Ｋａｎ大腸菌を、１００μg／mlカナマイシンおよび２０μg／mlテトラサイクリンを含む２mlの２ＹＴ培地中で３７℃、２５０rpmで増殖した。一晩増殖中のスターターの１mlを、１００μg／mlカナマイシン、２０μg／mlテトラサイクリン、および１mM ＩＰＴＧを含む１lの２ＹＴ培地中に添加し、３７℃、２５０rpmで一晩インキュベーションした。翌日、細菌を除去するために、接種菌液を６，５００rpm、４℃で２０分間遠心分離した。上精を回収し、ＰＥＧ／ＮａＣｌと５：１（ｖ／ｖ）比率で、４℃で一晩インキュベーションし、ファージの沈殿を可能にした。次に、ファージを、４℃で、９，０００rpm、１時間の遠心分離により沈殿させた。上精を捨てた後、沈殿物を２０mlの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、もう１度、４℃で、５：１比率のＰＥＧ／ＮａＣｌでの一晩インキュベーションにより沈殿させた。ファージ粒子を、４℃で、９，０００rpm、１時間の遠心分離により沈殿させ、１mlの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、次に０．４５μフィルターチップを使用してろ過し、微量の細菌を除去した。回収したファージ粒子の濃度を、以下の式に従って、分光光度計により測定した、２６９nmおよびレファレンスとして３２０nmでの吸光度に従って決定した：

酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用したファージ産生の検出
ＥＬＩＳＡ９６マイクロタイタープレートを、１ウェルあたり全容積５０μl中のコーティングバッファー中に希釈した、いくつかの濃度のファージＲＧＤまたはファージＷＴでコーティングした。３７℃での２時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで２回洗った。次に、プレートを３７℃のＰＢＳ中３%ミルク（２００μl／ウェル）で３時間ブロッキングし、その後、上記の通りに、洗った。１%ミルク中で１：１，０００希釈したウサギ抗Ｍ１３ポリクローナル抗体５０μlを洗い、３７℃で１．５時間インキュベーションし、その後に記載の通りの洗った。ヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体（５０μl）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションし、その後に記載の通りの洗った。プレートを、各々のウェルに５０μlの基質Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（７．５mlクエン酸バッファー中の１５mgＯＰＤおよび３μlの３０%Ｈ_２Ｏ_２を添加）を使用して展開した。反応を２５μlの４N ＨＣｌを使用して停止した。色濃度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４９２nmにおける吸光度により、４０５nmのレファレンスでモニターした。

サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した内在化ファージキネティクスの定量的分析
ファージ内在化の厳密な時間を決定するため、および、内在化ファージの量をいくつかの短い時間点で定量するために、ファージを、このアッセイにおいては時間点が１５分および３０分、１、２、５、および２２時間であることを除いて、記載のものと同様に、ＣＨＯ細胞と共にインキュベーションした。細胞を溶解し、タンパク質濃度についてアッセイした。９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングバッファー中で１：２５０に希釈したマウス抗Ｍ１３モノクローナル抗体でコーティングし、１ウェル当たり５０μlで、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回洗い、その後にＰＢＳでの２回の洗い、ＰＢＳ中の５０μlの１%ミルクの全容積における同等のタンパク質濃度について標準化後、三通りに添加した。ファージ検量線を、この手順において細胞に投与したファージＲＧＤの同じ産生を使用し、ＰＢＳ中の５０μlの１%ミルクの全容積中におけるいくつかの連続希釈により実施した。サンプルを３７℃で２時間インキュベーションし、その後にＰＢＳＴでの２回の洗い、次にＰＢＳでの２回洗った。プレートを、１ウェル当たり１００μlのＰＢＳ中の３%ミルクで、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＰＢＳでの１回の洗い後、１%ミルク中で１：１，５００希釈したウサギ抗Ｍ１３ポリクローナル抗体を１ウェル当たり５０μl、３７℃で１．５時間添加した。プレートをＰＢＳＴで２回およびＰＢＳで２回洗った後、１%ミルク中で１：２，５００希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ抱合二次抗体を１ウェル当たり５０μl添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。非結合の二次抗体を、ウェルをＰＢＳＴで２回およびＰＢＳで２回洗うことにより除去した。プレートを、各々のウェルに５０μlの基質Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（７．５mlクエン酸バッファー中１５mgのＯＰＤおよび３μlの３０%Ｈ_２Ｏ_２を添加）を使用して展開した。反応を２５μlの４N ＨＣｌを使用して停止した。色濃度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用し、４０５nmのレファレンスで、４９２nmにおける吸光度によりモニターした。

サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した内在化ファージキネティクスの定量的分析
ＣＨＯ細胞への初期内在化後のファージ・クリアランス・キネティクスを決定するために、クリアランス・アッセイを実施した。このアッセイは、ファージＰＥＰ粒子の大部分が最長でも約２時間後には細胞に内在化するとの事実に基づいた。５×１０^５個の細胞を、３７℃、９０%相対湿度、および５%ＣＯ_２で１０cmプレート中のＣＨＯ増殖培地（１０%血清を含む）中に播種した。９０%コンフルエントで、細胞を滅菌ＰＢＳで洗い、増殖血清不含培地を細胞に添加した。２時間のインキュベーション後、細胞に、６×１０^１２ファージＲＧＤもしくはＷＴ、または対照としてＰＢＳ（未処置）を投与した。ファージ粒子を細胞と共に２時間インキュベーションし、その後に細胞をＰＢＳで３回十分に洗った。血清不含培地を細胞に添加し、細胞を、いくつかの時間間隔後に溶解した：２時間、５時間、４８時間、および７２時間。細胞抽出物をタンパク質濃度についてアッセイした。細胞からのファージクリアランスについての定量的ＥＬＩＳＡを同様に実施した。ファージクリアランスが細胞死の結果ではないことを確認するために、ＭＴＴアッセイを、ファージＲＧＤもしくはＷＴまたはＰＢＳと共に１週間インキュベーションしたＣＨＯ細胞の追加の１０cmプレートにおいて実施した。

細胞内における内在化ファージＲＧＤ局在化の免疫蛍光法
内在化ファージの細胞内における特異的な局在化のために、ファージ粒子を伴う細胞オルガネラの共局在化を、特異的抗体および細胞内マーカーからなるプラスミドを使用して実施した。ＣＨＯ細胞をプレート底から剥離し、トリパンブルー法により計数し、直径１３mmのガラスカバースリップを伴う滅菌２４ウェルプレート上で、ＣＨＯ培養液中で１ウェル当たり５×１０^４細胞個（１０%血清を含む）（１ウェル当たり７００μl）を３７℃、９０%相対湿度、および５%ＣＯ_２で培養した。約６０%コンフルエントで、細胞を、ＣＭＶプロモーター下で、１μgのＥＥＡ１−ＧＦＰ（早期エンドソームマーカー）、Ｌｇｐ−１２０−ＹＦＰ（リソソームマーカー）、ＧａｌＴ−ＧＦＰ（ゴルジマーカー）、またはＳｅｃ６１−ＧＦＰ（Ｅ．Ｒ．マーカー）のいずれかでトランスフェクションした。トランスフェクションは、ＦｕＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬で、またはＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬で、製造業者の使用説明書に従って実施し、プレートを銀紙中に保持した。２４時間後、細胞を十分に洗い、１ウェル当たり１０^１１ファージＲＧＤ、ＷＴ、またはＰＢＳと共に２４時間、血清不含培地中でインキュベーションした。翌日、細胞を滅菌ＰＢＳで３回洗い、１ウェル当たり５００μlの４%パラホルムアルデヒドで、３０分間４０℃で固定し、その後に７００μlの１%ＮＨ_４Ｃｌで各々５分の３回の洗いが続いた。細胞を２００μlの１%サポニン（非透過処理細胞はＰＢＳで洗った）を使用して室温で１５分間透過処理し、その後にＰＢＳでの３回の十分な洗いが続いた。ブロッキングは、ブロッキング・バッファーを使用して（非透過処理ウェルはサポニンなしのブロッキング・バッファーで洗った）、１５分間室温で実施した。ブロッキング・バッファーで１：５００希釈した第一抗体マウス抗Ｍ１３の２００μlを各々のウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。次に、細胞を１%サポニンで３回洗い（非透過処理ウェルはＰＢＳで洗った）、ヤギ抗マウスｃｙ３抱合二次抗体をブロッキング・バッファー中１：５００で、室温で１時間添加した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗った。ＰｒｏＬｏｎｇアンチフェーディング溶液（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（封入剤）を添加し、キャリーガラス（ｃａｒｒｙｉｎｇ ｇｌａｓｓ）およびカバースリップ（細胞を含む）をその上に適用した。４０℃で２日間後、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して可視化した。

内在化ファージＲＧＤの細胞内経路の免疫蛍光法
特異的なエンドサイトーシスのオルガネラに相関し、いくつかの時間点での、細胞内のファージ経路を明らかにするために、細胞を、ＣＭＶプロモーター下にＥＥＡ１−ＧＦＰ（早期エンドソームマーカー）またはＬｇｐ−１２０−ＹＦＰ（リソソームマーカー）を含むプラスミドでトランスフェクションした。ファージ粒子を、記載の通りに、トランスフェクションした細胞に適用した；しかし、この手順において、インキュベーション時間は１５分、３０分、１時間、２時間、および５時間であった。インキュベーション後、細胞を滅菌ＰＢＳで十分に洗い、細胞を、記載の通り、固定、染色、および可視化した。

結果
繊維状ファージの抗凝集特性
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
ＴｈＴ実験は、ファージの脱凝集活性が、細胞外繊維形成を予防するその能力よりも効率的であることを指示する。ＡβＰ凝集における２６%の低下が、ペプチドＡβＰを繊維状ファージの存在下においてインキュベーションした際に観察され、事前に凝集したＡＳにファージを添加することによってアミロイド線維における４５%減少をもたらした。

ｉｎ ｖｉｖｏ実験
ファージの脱凝集特性が、ヒトアミロイド前駆タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスへのファージの脳内注入によりｉｎ ｖｉｖｏで示された。繊維状ファージがトランスジェニックマウスのＡＥ斑に結合する能力は、ＡＤモデル脳切片の免疫組織化学染色により実証された。Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄからなる繊維状ファージファミリー（Ｆｆ）は、構造的および遺伝的に十分に試験されている。原核生物の感染、集合、および複製のために進化したため、バクテリオファージは、哺乳動物細胞について向性を欠く。それらの繊維状構造（長さ９００nm、直径７nm）によって、それらのＣＮＳへの侵入が可能になる。Ｆｆビリオンは、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩを含むチューブ中にパッケージされ、４または５コピーの４種の各々の非主要コートタンパク質により末端で閉じられた一本鎖ＤＮＡゲノムからなる。本発明者の実験室は、繊維状ファージの線形構造がＡβＰに対する抗凝集特性を付与することを見出した。ファージの線形構造を修飾し、それを球状にすることによって、その脱凝集能が消失された。繊維状ファージは、ＡβＰ凝集過程に干渉し、既存のＡβ繊維を溶解し、これらの知見のＡＤ処置ならびに他のアミロイド生成性の疾患との治療的関連性を示唆する。

ファージＲＧＤ内在化
ファージＲＧＤは、投与後１５分という早期にＣＨＯ細胞中に内在化された（図１Ｂ、◆）。高レベルのファージＲＧＤが、細胞との２時間のインキュベーションの内に検出され、２２時間の時間経過、検証した最後の時間点まで、内在化が続いた（図１Ａ、◆）。対照的に、ファージＷＴは、２２時間の長いインキュベーション後に中程度の内在化のみ示し（図１Ａ、◆）、その時間点まで、測定したすべての時間点で未処置の細胞と同じ測定値を与える。それでも、この時間でのその内在化は、わずか１５分以内のＲＧＤ内在化と同程度である。検量線の評価後（図１Ｃ）、Ｏ．Ｄ．４９２＝０．５は２×１０^９のファージ粒子と同様である。細胞との１５分のインキュベーション後での内在化ファージの量は２×１０^９であると推測されうる。エラーバーは、各々３回繰り返した３つの独立した実験から算出された標準偏差値を表す。

ファージＲＧＤと、ＧＦＰに融合した早期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１−ＧＦＰまたはＬｇｐ１２０−ＹＦＰリソソームマーカーをトランスフェクションした細胞との有意な共局在が観察された。しかし、他の細胞オルガネラであるＥＲタンパク質ｓｅｃ６１−ＧＦＰおよびゴルジタンパク質ＧａｌＴ−ＧＦＰを検証した場合、ファージの共局在は検出されなかった。これらの結果は、ＲＧＤが実際に内在化のエンドサイトーシス経路機構を通じて内在化することを示す。

ＡＤのトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける実験
Ｔｇマウス、野生型ヒトαシヌクレインを、血小板由来増殖因子β（ＰＤＧＦ−β）の調節管理下で発現した。このプロモーターが選ばれたが、それが他のヒトタンパク質の発現を神経変性病のトランスジェニックモデルにおけるニューロンを標的とするように成功裏に使用されているためである（Masliah et al., 2000）。

ヒトＰＤＧＦ−βの５’隣接領域の１，４８０塩基対（ｂｐ）フラグメントをｐｓｉｓＣＡＴプラスミド（T. Collins, Harvard Medical Schoolから供与）から単離し、ＳＶ４０スプライスの５’から３’、全長の野生型κシヌクレインをコード化する４２３ｂｐのヒトｃＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルを提供するｐＣＥＤ４ベクター（Invitrogen） からのＳＶ４０配列からなるＮｏｔＩ−ＳａｌＩフラグメントの上流に置いた。得られた融合遺伝子をベクター配列から取り除き、精製し、標準的な手順に従って１細胞胚（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２ Ｆ２）にマイクロインジェクションした。１３のトランスジェニック樹立系統を、尾部ＤＮＡのスロットブロット分析により同定し、野生型Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２ Ｆ１マウスと交配し、トランスジェニック系統を樹立した。トランスジェニック子孫を尾部ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により同定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、７２℃５分の最終伸長を伴う３０サイクル（９３℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１．５分）において増幅した。プライマーは以下の通りであった：

５’−ＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧ（センス；配列番号４）および

５’−ＣＣＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣ（アンチセンス；配列番号５）

レビー小体の染色
ヒトαシヌクレインに対する抗体は、レビー小体病において見出される特徴的な細胞質内封入体も認識した。ヒトαシヌクレイン免疫反応性封入体は、最高発現系統からのトランスジェニックマウスにおいて最も多量であり、非トランスジェニック対照においては検出されなかった。トランスジェニックマウスにおいて、封入体は、新皮質のより深い層、海馬のＣＡ３領域、および嗅球、ならびに時には黒質中のニューロンにおいて最も高頻度に見出された。これらの領域は、典型的に、レビー小体病を伴う患者においても影響を受ける（Masliah et al., 2000）。

考察
繊維状ファージＭ１３は使用のための多くの利点を有する。それは、ペプチドまたはタンパク質の発現のための無毒性の十分に確立されたシステムであり、そのコートタンパク質上に発現されたタンパク質またはペプチドを安定化し、簡単な大規模産生からなり、哺乳動物細胞への向性を有さない。繊維状ファージによって脳侵入が可能になることも我々の実験室により示された。

繊維状ファージＭ１３に基づく、哺乳動物細胞中に内在化するデリバリーシステムを、この実施例中の実験において使用した。αｖインテグリンファミリーを結合するために必要とされる最小アミノ酸配列であるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸を含むコンセンサスコア（Ｒ−Ｇ−Ｄコア）からなるＥＦＧＡＣＲＧＤＣＬＧＡ配列（配列番号２）（Ivanenkov et al., 1999a and 1999b）。ＲＧＤコアは、２つのシステインに囲まれたファージコートタンパク質上にディスプレイされ、これによりＲＧＤコアペプチドの環状提示が促進される。環状ペプチドの作成は、非環状ペプチドと比較して、より高い親和性をもたらし、標的特異性を可能にする。さらに、環状ペプチドの提示は、ｉｎ ｖｉｖｏでのより高い安定性を与える（Stefanidakis and Koivunen, 2004）。

このように、ファージ表面上での〜１５０コピーの多価ペプチド提示を可能にし、このような提示によって、αインテグリンレセプターの結合により媒介される能動細胞インポートレセプター媒介性エンドサイトーシス（ＲＭＥ）システムが生じた。

免疫蛍光標識を使用し、ＷＴファージと比較し、ファージＲＧＤの哺乳動物ＣＨＯ細胞への結合および内在化が観察された。哺乳動物細胞によりファージを特性付けするために、ＣＨＯ細胞を細胞モデルとして選択した。これらの細胞は、一般的で十分に確立された細胞モデルであり、接着性であるという利点を有する。インテグリンは、非接着モデルとは対照的に、この細胞表面上に多量に現れ、結合および内在化のためにそれらと細胞内αアクチンとの相互作用を可能にする。細胞に投与されたファージＲＧＤの用量依存的な内在化が実証され、より多量のファージが細胞に投与された場合、より高い内在化が観察された。

いくつかの細胞内標的システムは、特に高用量で投与された場合、細胞に対して細胞傷害性を有する（Mountain, 2000; Lee and Jameson, 2005）。したがって、２つの異なる比色実験によるファージ投与のＣＨＯ細胞に対する影響を検証した。細胞死を、ファージＲＧＤまたはＷＴを細胞に投与後、トリパンブルーカウントにより調べ、細胞生存をＭＴＴアッセイにより評価した。このアッセイは、細胞内におけるファージの存在が、２日間のインキュベーション後に有害効果を有さないことを確認するために実施した。これらのいずれの実験においても、ファージＲＧＤまたはファージＷＴを投与された細胞は、未処置細胞と同様の生存を示し、これらの２つの相互アッセイが同様の結果を与えたことが分かる。

細胞内おけるファージＲＧＤの運命を明らかにし、その特異的な局在化を見出し、その細胞内での経路を明確に示すために、細胞内ファージおよび細胞オルガネラのいずれも二重標識した。異なるインキュベーション時間において、エンドサイトーシス経路に従ってファージＲＧＤの細胞内経路を明らかにできた：ファージは最初の１５分に早期エンドソーム中に位置した。２時間のインキュベーション後、より多くのファージ粒子が２〜５時間以内にエンドソーム内に位置し、ファージ粒子の大部分がリソソームに位置し、それは内在化のエンドサイトーシス経路を指摘する。

結論として、本発明者は本発明において哺乳動物細胞への細胞内標的のためのシステムを確立した。高い結合力および親和性を伴う細胞内内在化を可能にするＲＧＤコアペプチドからなる内在化ファージを構築した。システムは、内在化および細胞内におけるクリアランスキネティクスのいずれについても特性付けされ、このようにして、ファージは投与後１５分以内に内在化され、細胞内において見出されるファージの量は経時的に上昇する。ファージ粒子は約１日後に細胞からクリアランスされた。内在化システムは、培地中に適用された場合、またはひとたび細胞内に入った場合、細胞に対する毒性効果は有さないことも見出された。ファージ細胞内経路は、インテグリン媒介性エンドサイトーシスのエンドソーム経路を介することが示されており、１５分後、ファージは早期エンドソーム中に位置し、その後に次の２時間以内でのリソソームへの再配置が続く。

実施例２
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）実験
材料および方法
タンパク質の蓄積、疾患発症、および死亡を加速する、高コピー数の突然変異型ＳＯＤ１タンパク質を運ぶ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ−Ｊマウスを使用した。これらのマウスの平均寿命は１３０〜１３５日と推定され、疾患発症は８０〜９０日での運動能力の３０%喪失で定義された（Urushitani et al., 2007）。

８匹のマウスを２グループに分けた。４匹のマウスに、マイクロピペットを使用し、１０μlの生ファージＲＧＤを経鼻投与し、４匹のマウスを、同様の方法で、１２μlのＵＶ不活化ＲＧＤファージで処置した。各々の投与において各々のマウスに与えたファージの数は、２．５×１０^１２であった。マウスは、５０日齢から４０日間は２回／週（推定される運動低下の発症）、９０日からそれらを屠殺するまでは３回／週処置した。３４匹の未処置マウスを対照として使用し、生存時間を評価した。

１週間に１回、マウスは、Ｒｏｔｏｒｏｄ ｄｒｕｍ（ＳＤＩ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、運動力についてテストされた。Ｒｏｔｏｒｏｄにおける活動時間をモニターした。２５rpmまでの加速モード（速度４）にセットした。マウスが食物および水に到達できなくなるまで、および／または、それらが横たえられた直後に起き上がることができなかった場合に生存率を評価した。マウスを、ＣＯ_２を使用して屠殺し、それらの脳および脊髄を、さらなる分析および組織学的検査のために、ＰＦＡ ４%中での固定のために除去した。

ファージのＵＶ不活化をDelmastro et al.(1997)に従って実施した。ファージ溶液をいくつかの２５μl液滴に分注し、各々を２４ウェルプレート中のウェル中に置いた。液滴に、２００，０００μjのU. V. Stratalinkerでの３サイクル（サイクルの間に１分の休止）の照射において照射した。

凝集アッセイ
ＴｈＴ結合アッセイを活用し、ＵＶ不活化ファージがアミロイド凝集体を溶解する能力（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を、生ファージがこれらの凝集体を溶解する能力との比較で評価した。アミロイドβ繊維形成をチオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイにより定量化し、それはアミロイド線維の同定に特異的である。ＴｈＴは凝集繊維と迅速に会合し、新しい４３５〜４５０nmで最高となる励起（吸収）および４８５nmでの増強発光を生じ、遊離染料での３８５nm（励起）および４４５nm発光と対照的である。この変化は凝集状態に依存しており、単量体または二量体のペプチドが反応せず、凝集体のグアニジン解離がシグナルを破壊するためである（LeVine H. 1993）。試料発光をPerkin-Elmer model LS-50蛍光分光光度計を使用して測定し、任意の単位により指示した。

このテストは相対的であるため（ペプチドのファージとの凝集と比較したアミロイドβの凝集）、絶対値は相対的凝集パーセンテージほど重要ではない。

凝集パーセンテージを以下の方法で算出した：

アミロイドβ凝集を１００%と考えた。ファージ溶液およびバッファー溶液のバックグラウンド値を常に測定し、それらの値をすべての結果のスコアから省略した。すべての実施したテストにおいて、ファージ溶液についての値はバッファーのそれとほぼ同様であり、したがって、ファージがＴｈＴ陽性βシート構造を形成しないと結論付けた。

脱凝集アッセイ
ＡＳＰ−４０を２０日間３７℃でインキュベーションし、凝集を促進した。ファージまたはＰＢＳを添加し、事前に凝集したＡＳとさらに７２時間インキュベーションした。蛍光を上記の通りに測定した。

結果
疾患の発症の遅延、ならびに、生存率の上昇が、対照未処理群と比較し、ＵＶ不活化ＲＧＤファージおよび生ＲＧＤファージの両群において観察された。観察可能な有害効果は、いずれの群においても見られなかった。

運動能力
処置群および未処置群のいずれも同齢で同じ運動不全エンドポイントに達したが、図４に示したＲｏｔｏｒｏｄ結果は、処置マウスが未処置マウスよりも長時間より良好な運動能力を有することを指示し、これにより疾患発症の遅延を証明した。

生存率
より長い寿命が、未処置群と比較し、両方の処置群において観察された（図５）。

組織学的検査の結果
組織学的検査の結果（図６Ａ〜６Ｅ）は、ニューロンおよび星状細胞へのファージの侵入を実証する。ＵＶ不活化はファージ構造に損傷を与えない。

ファージが、ＵＶ不活化の結果として、その感染能を失うが、それにもかかわらず構造的改変を受けないことを確認するために、いくつかの実験を実施した：
―照射による細菌のファージ感染性の喪失
―ファージの繊維状構造の可視化を可能にした電子顕微鏡写真
―アミロイド−ベータ・ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ脱凝集アッセイ

照射による細菌のファージ感染性の喪失
テトラサイクリン耐性遺伝子を運ぶＭ１３繊維状ファージを、テトラサイクリンを添加した２ＹＴペトリ皿上に置いた。プレートにＴＧ１細菌を播種した。ＴＧ１培養物は、ファージがそれらに感染し、細菌にテトラサイクリン耐性遺伝子を与えることなくして、これらのプレート上で増殖できない。

図７において、対照皿は、ＰＢＳを播種したＴＧ１細菌上に置いた場合、細菌増殖を示さなかった。Ｍ１３ファージをＴＧ１培養物上に置いた場合、細菌は、感染ファージにより付与されるテトラサイクリン耐性に起因して増殖できた。異なる濃度のファージ（培養皿上での数により例証した）は、増殖可能であったＴＧ１培養物の数および密度と相関した。ＵＶにより照射された場合、ファージはＴＧ１細菌に感染するその能力を失い、これにより細菌が増殖するのを予防する。１サイクルのＵＶ照射がファージ不活化のために十分であることが見出された。

ＵＶ不活化ファージのＥＭ可視化
ＵＶ不活化ＲＧＤファージの電子顕微鏡象（図９Ａおよび９Ｂ）を撮り、照射過程がファージの繊維状構造に損傷を与えないことを確認した。

チオフラビンＴ結合アッセイを使用したＵＶ不活化ファージのアミロイド凝集体との相互作用の分析
この実験は、ＲＧＤペプチドをディスプレイするＵＶ不活化ファージで実施し、ＵＶ不活化ファージがそれらの構造を維持するだけでなく、アミロイド凝集体を脱凝集するそれらの機能および能力を保持することを実証した。本発明者の実験室において実施した先のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によって、生ファージがＡβ凝集体を脱凝集する能力を有することが確認された。

脱凝集テスト−５８μMのＡβｐ１−４０を２０日間インキュベーションした。繊維状ファージを添加し、７２時間コインキュベーションした。アミロイド含量をＴｈＴを使用して測定した。

ＡβＰ凝集における４５%の低下が、ＲＧＤファージを事前に凝集したＡβに添加した場合に観察された。同じ結果が、ＵＶ照射を受けていないＲＧＤファージで観察された。

この実験は、ＵＶ照射がアミロイド凝集体を脱凝集するＲＧＤファージの能力に損傷を与えないことを実証する。さらに、この実験は、それらのニューロン中への内在化を可能にするためにファージ上にディスプレイされたＲＧＤペプチドが、ファージの脱凝集能に損傷を与えないことを示す（パーキンソン、ハンチントン、およびＡＬＳにおいて見出されるような細胞内凝集体に関連する）。

結論
上に示した証拠は、繊維状ファージが既に形成した細胞内アミロイド斑を溶解および脱凝集する能力を有することを実証する。ＡＬＳ病の突然変異ＳＯＤ１−Ｔｇマウスにおける実験は、これらのマウスの細胞の細胞質中に形成されたＳＯＤ１凝集体を溶解でき、マウスの健康における改善をもたらすことを示す。これらのマウスのファージ処置は、それらの寿命を改善するだけでなく、それらの運動能力および体力を対照マウスと比較してより高いレベルにまで延ばした。

ファージにおけるＵＶ不活化実験は、ヒトへの使用のための安全な産物を開発する方向での別のステップである。ＵＶ不活化ファージは、それらの繊維状構造を無傷に保ち、これによりアミロイド斑を溶解するそれらの脱凝集能力を保持する。

ここでは本発明を十分に記載しているため、同じことを、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、および、必要以上の実験なく、広範な同等のパラメータ−、濃度、および条件内において実施できることを同業者は理解しうる。

本発明はその特定の実施態様に関連して記載され、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般的に、本発明の原理に従った、および、本発明に関連する当技術分野内の公知のまたは慣習的な実践内で生じる、および、添付請求項の範囲において従う、本明細書において先に記載した必須の特徴に対して適用できる、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適用を対象とすることを意図する。

学術論文または要旨、発表された、または対応する米国または外国の特許出願、公表された米国または外国の特許、または任意の他の参考文献を含む、本明細書において引用するすべての参考文献は、引用した参考文献において提示されるすべてのデータ、表、図、およびテキストを含め、本明細書における参照により全体が組み入れられる。加えて、本明細書において引用した参考文献内において引用される参考文献の全内容も参照により全体が組み入れられる。

公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法、または従来の方法への参照は、本発明の任意の局面、記載、または実施態様が、関連する技術分野において開示、教示、または示唆されるという許可では決してない。

特定の実施態様の先の記載は、他が、当技術分野の技能内の知識（本明細書において引用した参考文献の内容を含む）を適用することにより、必要以上の実験なしに、本明細書の一般的概念から逸脱することなく、様々な適用のために、このような特定の実施態様を容易に改変および／または適用できるとの本発明の一般的性質を十分に明らかにする。したがって、このような適用および改変は、開示した実施態様の同等物の意味および範囲内にあることが意図され、本明細書において提示した教示およびガイダンスに基づく。本明細書の表現または用語は、記載の目的のためであり、限定の目的ではなく、本明細書の用語または表現は、本明細書において提示する教示およびガイダンスに照らして、当業者の知識との組み合わせにおいて、当業者により解釈されることが理解されるはずである。

Claims (60)

1. タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を抑制または処置するための方法であって、哺乳動物の被験体の細胞中に治療剤を内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する有効量の治療剤を、それを必要とする哺乳動物に投与し、疾患を阻害または処置することを含む方法。
2. 治療剤が、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列をその表面上にディスプレイする繊維状バクテリオファージであって、該繊維状バクテリオファージが、抗体または該ペプチド配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない、請求項１記載の方法。
3. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄバクテリオファージ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
4. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３である、請求項２記載の方法。
5. 約１５０コピーの該ペプチド配列が、繊維状バクテリオファージの表面上にディスプレイされる、請求項２記載の方法。
6. 繊維状バクテリオファージが、その繊維状構造を維持するＵＶ不活化繊維状バクテリオファージである、請求項２記載の方法。
7. 有効量の該繊維状バクテリオファージが、経鼻的に投与される、請求項２記載の方法。
8. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項２記載の方法。
9. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項１記載の方法。
10. 該ＲＧＤ細胞接着配列を含む該ペプチド配列が、環状である、請求項９記載の方法。
11. 該ペプチド配列が、配列番号１のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項１０記載の方法。
12. 該ペプチド配列が、配列番号２のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項１０記載の方法。
13. 疾患が、アルツハイマー病である、請求項１記載の方法。
14. 疾患が、レビー小体型認知症である、請求項１記載の方法。
15. 疾患が、パーキンソン病である、請求項１記載の方法。
16. 疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項１記載の方法。
17. 哺乳動物の被験体が、ヒトである、請求項１記載の方法。
18. タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害するための方法であって、治療剤をもたらすことを含み、治療剤は、該治療剤を哺乳動物細胞内に内在化でき、タンパク質の繊維性封入体または凝集体を形成できる細胞内ペプチドまたはポリペプチドと接触するようにディスプレイされ、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成を阻害する、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する方法。
19. 該治療剤が、その表面上に哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列をディスプレイする繊維状バクテリオファージであって、該繊維状バクテリオファージが、抗体または該ペプチド配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない、請求項１８記載の方法。
20. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄバクテリオファージ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
21. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３である、請求項１９記載の方法。
22. 約１５０コピーの非繊維状バクテリオファージのペプチド配列が、繊維状バクテリオファージの表面上にディスプレイされる、請求項１９記載の方法。
23. 繊維状バクテリオファージが、その繊維状構造を維持するＵＶ不活化繊維状バクテリオファージである、請求項１９記載の方法。
24. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項１８記載の方法。
25. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項１８記載の方法。
26. ＲＧＤ細胞接着配列を含むペプチドσ配列が、環状である、請求項２５記載の方法。
27. ペプチド配列が、配列番号１のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項６３記載の方法。
28. ペプチド配列が、配列番号２のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項２６記載の方法。
29. 事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体を脱凝集するための方法であって、治療剤をもたらすことを含み、治療剤は、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有し、該治療剤を哺乳動物細胞内に内在化でき、事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体と接触するようにディスプレイされ、事前に形成した細胞内の繊維性封入体または凝集体を脱凝集する、方法。
30. 該治療剤が、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列をその表面上にディスプレイする繊維状バクテリオファージであって、該繊維状バクテリオファージが、抗体または該ペプチド配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない、請求項２９記載の方法。
31. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄバクテリオファージ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
32. 繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３である、請求項３０記載の方法。
33. 約１５０コピーの非繊維状バクテリオファージのペプチド配列が、繊維状バクテリオファージの表面上にディスプレイされる、請求項３０記載の方法。
34. 繊維状バクテリオファージが、その繊維状構造および事前に形成した細胞内のタンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集するその能力を維持するＵＶ不活化繊維状バクテリオファージである、請求項３０記載の方法。
35. 哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項３０記載の方法。
36. 哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項２９記載の方法。
37. ＲＧＤ細胞接着配列を含むペプチド配列が、環状である、請求項３６記載の方法。
38. ペプチド配列が、配列番号１のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項３７記載の方法。
39. ペプチド配列が、配列番号２のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項３７記載の方法。
40. 医薬的に許容可能な担体または賦形剤、および、活性成分として、細胞中に治療剤を内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する有効量の治療剤を含む、医薬組成物。
41. 該治療剤が、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列をその表面上にディスプレイする繊維状バクテリオファージであって、該繊維状バクテリオファージが、抗体または該ペプチド配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない、請求項４０記載の医薬組成物。
42. 該繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３、ｆ１、およびｆｄバクテリオファージ、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４１記載の医薬組成物。
43. 該繊維状バクテリオファージが、Ｍ１３である、請求項４１記載の医薬組成物。
44. 約１５０コピーの非繊維状バクテリオファージのペプチド配列が、繊維状バクテリオファージの表面上にディスプレイされる、請求項４１記載の医薬組成物。
45. 繊維状バクテリオファージが、その繊維状構造を維持するＵＶ不活化繊維状バクテリオファージである、請求項４１記載の医薬組成物。
46. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項４１記載の医薬組成物。
47. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項４０記載の医薬組成物。
48. 該ＲＧＤ細胞接着配列を含む該ペプチド配列が、環状である、請求項４７記載の方法。
49. 該ペプチド配列が、配列番号１のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項４８記載の医薬組成物。
50. 該ペプチド配列が、配列番号２のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項４８記載の医薬組成物。
51. 細胞中に治療剤を内在化できるようにディスプレイされる哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列を有する治療剤の薬物調製のための使用。
52. 該治療剤が、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の細胞内形成に関連する疾患を阻害または処置する、請求項５１記載の使用。
53. 疾患が、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、パーキンソン病、または筋萎縮性側索硬化症である、請求項５２記載の使用。
54. 治療剤が、タンパク質の繊維性封入体または凝集体の形成を阻害する、請求項５１記載の使用。
55. 治療剤が、事前に形成した細胞内タンパク質の繊維性封入体または凝集体を脱凝集する、請求項５１記載の使用。
56. 治療剤が、哺乳動物細胞の接着配列を含むペプチド配列をその表面上にディスプレイする繊維状バクテリオファージであって、該繊維状バクテリオファージが、抗体または該ペプチド配列以外の非繊維状バクテリオファージ抗原をディスプレイしない、請求項５１〜５５のいずれか１項記載の使用。
57. 該哺乳動物細胞の接着配列が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）細胞接着配列である、請求項５１〜５６のいずれか１項記載の使用。
58. 該ＲＧＤ細胞接着配列を含む該ペプチド配列が、環状である、請求項５７記載の使用。
59. 該ペプチド配列が、配列番号１のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項５８記載の使用。
60. 該ペプチド配列が、配列番号２のＲＧＤ細胞接着配列を含む、請求項５８記載の使用。

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