JP2009543101A - 対象物の薄層の画像を生成するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

遠視野光学系（５）を用いて位置分解型検出器（６）上に対象物（４）の層画像を生成するための方法では、対象物（４）が少なくとも１つの対象面（３）内で、少なくとも２つのバイナリ照明パターン（２６、２７；３３、３４）によって合焦されて照明され、かつ照明パターン（２６、２７；３３、３４）のそれぞれに対し相応の画像が捕捉され、その際、照明パターン（２６、２７；３３、３４）はそれぞれ暗領域（２７；３４）および明領域（２６；３３）を有しており、これらの領域のうち明領域および暗領域のうちの少なくとも１つが、照明パターン（２６、２７；３３、３４）を重ねた場合に対象物（４）を完全に覆う。捕捉画像から層画像が算定され、この層画像は部分セグメントを含んでおり、この部分セグメントはそれぞれ対象物（４）の部分領域を再現しており、この部分領域は、使用された照明パターンのうちの１つの照明パターンの明領域内に、部分領域の縁が明領域の縁から少なくとも所定の最低間隔だけ離隔されるように位置し、かつ部分セグメントはそれぞれ、少なくとも２つの画像を使用して、少なくとも部分的に不適切な光を補正したうえで算定されており、この少なくとも２つの画像は、それぞれ幾つかの照明パターンで捕捉されており、これらの照明パターン内では、それぞれの部分セグメントに相応する部分領域が、全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第１の照明パターンの明領域内に位置するか、または全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第２の照明パターンの暗領域内に位置している。

Description

本発明は、特に遠視野光学系を用いて対象物の薄層の画像を生成するための方法および相応の装置に関する。

生物試料または材料は、しばしば顕微鏡によって検査される。特に、相応の対象物を、構造認識のため遠視野光学系によって検査することができ、この遠視野光学系は、対象物または対象物の薄層、理想的には面を、位置分解型検出器上に結像する。このような結像検査は、例えば通常の顕微鏡検査または蛍光顕微鏡検査によって行うことができる。この薄層は、スライド・ガラスまたはウェル・プレートの底のようなキャリア上の、例えば蛍光を発する層であることができ、この層は、好ましくは「マイクロアレイ」内に配置された固定化細胞、組織切片、またはＤＮＡ断片を含んでいる。

しかしながら、特に生物の対象物を検査するために、量的な蛍光顕微鏡検査もしばしば用いられる。一般的に量的な蛍光顕微鏡検査の目標は、試料を、特に所与の厚さの薄層を照射することで蛍光放射を励起することにあり、この蛍光放射の強度は、試料内の測定すべき蛍光物質の濃度に依存する。蛍光放射の強度を測定することにより、蛍光物質の濃度を逆推理することが可能である。したがって、この場合、極端な画像鮮鋭度よりも、薄層から出る放射だけを極めて確実に捕捉することが重要である。このため、しばしば、高解像顕微鏡の代わりに、いわゆる位置分解型蛍光リーダが使用され、この蛍光リーダは、量的な蛍光顕微鏡検査のために最適化された顕微鏡と見做すことができる。対象物または試料は特に、フォトリソグラフィー法またはスポッタによって製造されたバイオ・チップであり得る。

薄層内で生成された蛍光放射の強度に関してできるだけ正確な測定値を得るため、２つの条件に注意を払わなければならない。１つには、薄層からの蛍光放射ができるだけ網羅的に、かつ量的に正確に捕捉されるべきである。もう１つには、薄層からではない放射、特に蛍光放射ができるだけ良く抑えられるべきであり、つまり優れた深度選択が達成されるべきであり、この深度選択の場合、できるだけ焦点面の周りの層内の放射だけを捕捉する。この抑えられるべき光学的放射は、光学スペクトルの可視領域内にあることが絶対に必要というわけではないが、以下では不適切な光とも呼ぶ。

不適切な光の発生源としては、少なくとも下記の発生源が考慮される。不適切な光は例えば、表面での、空気混入などに基づくガラス内での、反射および散乱光によって、もしくは使用されたガラスの、フレームでの、自己蛍光によって、もしくは蛍光測定時に抑えられていない励起光によって、発生する。さらに不適切な光は、対象物または試料のうちの好ましくは薄層内にある焦点面の外にある領域からくる可能性もあり、例えばスライド・ガラスの裏面の蛍光を発する汚染によって、または薄層と境を接している蛍光液体を有する隣接層からくる。

しかし不適切な光は、検出された強度分布のコントラストを減少させる、または変えてしまうので、対象物の結像をも不都合に妨げる可能性がある。
不適切な光を回避するための可能性は、共焦点レーザ・スキャナの使用にある。共焦点レーザ・スキャナの場合、常に試料のうちの数μｍ^２の小さな平面だけが照明され、これに加え検出時にはこの小さな平面だけが観察される。これが、良く適合されたピンホールによって徹底して実施される場合、不適切な光は最初から抑えられる。ただしレーザ・スキャナは、遠視野光学系を備えた顕微鏡に対して一連の欠点を有している。例えば蛍光顕微鏡検査の場合、焦点内での高い放射強度により、励起飽和および蛍光体の強い退色を生じさせ得る。さらに、波長の選択に明らかな制限がある。多くの可動コンポーネント、高い調整労力、および検出器の低い量子効率、一般的には光電子増倍管が、更なる欠点である。

これらの欠点を回避するため、幾つかの照明パターンで画像を捕捉し、かつ捕捉したこれらの画像から薄層画像を計算する方法が提案されている。
欧州特許第９７２２２０号明細書（Ｂ１）に記載された方法の場合、薄層を有する対象物の３つの画像が捕捉され、この３つの画像は、空間的に正弦状で、それぞれ３分の１周期ずつ相互にずらされた強度プロフィルを備えた照明を薄層に合焦した場合に捕捉される。捕捉されたこれらの画像から、薄層画像が算出される。

独国特許出願公開第１９９３０８１６号明細書（Ａ１）では、顕微鏡画像の深度選択のための方法および装置が記載されており、この場合、１次元的に周期的な格子、例えば縞格子を照明のために使用する。これに関しては、少なくともｎ（ｎ＞２）回のＣＣＤカメラ記録が行われ、その際、照明構造が、それぞれ格子定数の１／ｎずつずらされる。次に少なくとも３回の記録から試料の共焦点断面を計算する。この方法は、格子が試料上に正弦状の照明強度を生成しない場合、アーチファクトに対処できない。

国際公開第９８／４５７４５号パンフレット（独国特許出願公表第６９８０２５１４号明細書（Ｔ２））は、顕微鏡用の結像システムおよび結像方法を記載しており、この場合、２つのコヒーレントな光線を重ねることで、構造化された照明を企図する。この方法は、独国特許出願公開第１９９３０８１６号明細書（Ａ１）に基づく上述の方法と同様に、主として、走査型レーザ顕微鏡に倣い幾つかの対象面における光学的断面を発生させるという目標を追求している。

両方の方法は、厚い試料の深さ分解能を得るという目標を追求している。これらの方法は、遠視野光学系によって、焦点深度より厚い試料または対象物の共焦点断面を得ることに用いられる。両方の場合には、三角方程式を解かなければならないので、計算労力が相対的に大きい。

未公開の独国特許出願第Ｐ１０３３０７１６．８号明細書には、不均質で、光を放つまたは照明された、平面的な対象物を結像する際に不適切な光を除去するための方法を実施するための装置が記載されている。この装置は放射源を含んでおり、放射源の後ろには照明光学系が備えられており、この照明光学系は、後ろに配列された視野絞り面を均質に照らし出すために放射を均質化しており、この視野絞り面内には、対象物または試料に重ねられる照明構造を生成するため、構造化された視野絞りが配置されている。この照明構造は、第１の光学的手段によって試料上に結像され、その際、この第１の光学的手段は、照明用鏡筒、場合によってはカラー・スプリッタ、および対物レンズを含み得る。さらに第２の光学的手段が、重ねられた照明構造と共に試料を、特に光学的放射のための位置分解型検出器上に結像するために企図されている。この構成はさらに調整手段を含んでおり、この調整手段によって、対象物または試料上の対象面内の照明構造が定義的に位置決めされ得る。検出器は、不適切な光を算定および除去するための評価機構と接続されている。暗い領域が交差しない少なくとも２つの異なる照明パターンを用いた構造化された明視野照明が使用される。この場合、相応の画像から暗画像および明画像を算定することができる。明画像から暗画像を差し引くことにより、最終的な画像を得ることができる。

この装置に企図された構造化された明視野照明の場合、この明視野照明で対象物を照明することおよび上に露光された視野絞り構造と共に対象物を結像することを１つの対物レンズで行う場合、対物レンズ内の励起光が、特に使用されるガラスの自己蛍光によって不適切な光の発生を呼び起こす可能性がある。さらに対象物、例えばバイオ・チップの裏面が、焦点面とほぼ同じ励起強度で照射される。このため裏面の汚染によって引き起こされる蛍光強度も相応に高い可能性があり、かつ測定誤差の原因となり得る。このため、これらの欠点を回避するための第２の方法では、明視野照明の代わりに構造化された暗視野照明を使用することが提案されている。

両方の方法の場合、完全な暗画像または完全な不適切な光の画像を得るため、照明されていない領域の間の内挿を実施する必要がある。
前述の全ての方法は、深度選択を達成することができ、かつ薄層と境を接する領域からの不適切な光を少なくとも部分的に抑え得るのではあるが、しかし薄層内の蛍光を発する材料の濃度測定の正確性にまだ改善の余地があるという量的な蛍光顕微鏡検査に関する欠点を示している。

したがって、本発明の課題は、対象物の層画像を生成し、特に薄層の画像も生成し、同時に優れた深度選択および蛍光測定の際の高い量的正確性を可能にする方法を提案すること、ならびにその方法を実施するための装置を提供することである。

この課題は、遠視野光学系を用いて位置分解型検出器上に対象物の層画像を生成するための方法によって解決され、この方法の場合、対象物が少なくとも１つの対象面内で、少なくとも２つのバイナリ照明パターンによって合焦されて照明され、かつこの照明パターンのそれぞれに対し相応の画像が捕捉され、その際、照明パターンはそれぞれ暗領域および明領域を有しており、これらの領域のうち明領域および暗領域のうちの少なくとも１つが、照明パターンを重ねた場合に対象物を完全に覆い、かつ捕捉画像から層画像が算定され、この層画層は部分セグメントを含んでおり、この部分セグメントはそれぞれ対象物の部分領域を再現しており、この部分領域は、使用された照明パターンのうちの少なくとも１つの照明パターンの明領域内に、部分領域の縁が明領域の縁から少なくとも所定の最低間隔だけ離隔しているように位置し、かつこの部分セグメントはそれぞれ、少なくとも２つの画像を使用して、少なくとも部分的に不適切な光を補正したうえで算定されており、この少なくとも２つの画像は、それぞれ幾つかの照明パターンで捕捉されており、これらの照明パターン内では、それぞれの部分セグメントに相応する部分領域が、全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第１の照明パターンの明領域内に位置するか、または全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第２の照明パターンの暗領域内に位置している。

更にこの課題は、対象物の層画像を生成するための装置によって解決され、この装置は、対象物の対象面内を、合焦して照明するための照明機構を備えるとともに、放射線経路内で照明機構の後ろに配置され、構造化された絞りとして作用する要素を備えた、対象物の対象面内を照明するための少なくとも２つの所定の照明パターンを生成するための機構を備えており、その際、照明パターンはそれぞれ暗領域および明領域を有しており、これらの領域のうち明領域および暗領域のうちの少なくとも１つが、照明パターンを重ねた場合に対象物を完全に覆っており、更に、画像面上に対象面を結像するための好ましくは遠視野光学系として形成された結像光学系、対象物から出る光学的放射を検出するため画像面内に配置された位置分解型検出器、及び検出器の検出信号を評価するための評価機構を備えており、この評価機構は、検出信号を基に画像を捕捉するため、かつ本発明による方法のうち画像捕捉に続く工程を実施するため、かつ特に、捕捉画像から層画像を算定するために設けられており、この層画像は部分セグメントを含んでおり、この部分セグメントはそれぞれ対象物の部分領域を再現しており、この部分領域は、使用された照明パターンのうちの少なくとも１つの照明パターンの明領域内に、部分領域の縁が明領域の縁から少なくとも所定の最低間隔だけ離隔しているように位置し、かつこの部分セグメントはそれぞれ、少なくとも２つの画像を使用して、少なくとも部分的に不適切な光を補正したうえで算定されており、この少なくとも２つの画像は、それぞれ幾つかの照明パターンで捕捉されており、これらの照明パターン内では、それぞれの部分セグメントに相応する部分領域が、全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第１の照明パターンの明領域内に位置するか、または全体的に、幾つかの照明パターンのうちの第２の照明パターンの暗領域内に位置している。

この装置によって実施可能な方法は、対象物の、好ましくは平面的な対象物の、特に不均質で、光を放つまたは照明された対象物の層画像を生成するために用いられる。特にこの方法は、顕微鏡検査方法、好ましくは量的な蛍光顕微鏡検査方法、または蛍光リーダを使用した方法であり得る。

この方法の場合、層が絶対に薄い必要はなく、もっと正確に言えば、この層は特に、全体的な層でもよく、照明用放射が合焦される面だけでなくてもよい。
この方法の場合、本発明の枠内では対象面内の結像可能な領域の大きさに応じて、試料全体または物体全体もしくは試料全体または物体全体の検査すべき、または結像可能な部分領域のみと理解される対象物の層が、少なくとも２つの構造化されたバイナリ照明パターンによって照明される。これに関し、バイナリ照明パターンとは、例えば正弦プロフィルの形の強度プロフィルを備えた照明パターンとは違い、暗領域内に、少なくとも幾何光学の枠内では基本的に照明放射が到達せず、かつ暗領域から明領域への移行部が、これら領域の広さに比べて非常に細い（可能であれば量的な限界を提示してください）ことによって、この方法の本質である構造化が達成される照明パターンと理解される。対象物の明領域または暗領域とは、それぞれの照明パターンによる照明の際に、照明パターンの明領域または暗領域内にある対象物の領域である。

構造化された照明を生成するため、装置では、本発明の枠内では可視の放射と共に赤外線または紫外線の放射とも理解される照明光を放出するための照明機構と、対象物を、少なくとも結像すべき対象物層内で、合焦させて特に構造化もさせて照明するための少なくとも２つの所定の照明パターンを生成するための機構とが企図される。このためバイナリ照明パターンを生成するための機構は、特に、絞りとして作用する要素を備えており、この要素は、好ましくは視野絞りとして作用する。この要素は、光透過性または透明な領域、および光不透過性または乳白色の領域を有しており、これらの領域には、照明パターン内のそれぞれ明領域および暗領域が相応しており、この明領域および暗領域は隣接している。これに基づき、対象物または検査領域の中または上では、照明光によって照明される領域および照明されない領域が生じる。

この方法の場合、対象物は、次々と照明パターンの別の１つによってそれぞれ照明される。その際、この方法の場合に使用される照明パターンは、想像または仮定として照明パターンを同時に重ねた場合に、照明パターンの暗領域および明領域のうちの少なくとも１つが対象物を完全に覆うように選択される。

それぞれの照明パターンによって照明された対象物は、その後、特に対物レンズを含み得る結像光学系によって、対象物の画像を補足するために用いられる位置分解型検出器上に結像される。位置分解型検出器としては、好ましくはＣＣＤマトリクスまたはＣＭＯＳマトリクスが使用され得る。

位置分解型検出器の信号は、評価機構によって、例えばビデオ・インターフェイスと、評価および特に対象物の照明後の方法工程を実施するための少なくとも１つのコンピュータ・プログラムが保存されたメモリと、コンピュータ・プログラムを実施するためのプロセッサとを備えたデータ処理機構によって、画像へと処理される。

本発明は、とりわけ以下の観察に由来する。つまり、例えば放射線方向を横切る正弦状の強度プロフィルを備えた照明放射のような構造化された照明放射を、対象物の１つの面内に合焦させる場合、放射線方向に沿って、合焦のために使用された光学系の特性により決定された１つ照明強度分布だけが生じ、この照明強度は、その最大値をこの面内に有することができるが、しかし最大値の点から放射線方向に平行に低下していく。この面を結像光学系によって検出器上に結像する場合に類似の現象が生じ、このため、検出器によって受信された強度を、放射線方向におけるこの面から発生源までの間隔の関数として示した、それぞれの照明パターンに対して定義された深度レスポンス関数も同様に、この面内で最大値を有する。しかし、また深度レスポンス関数も、この最大値の領域内で湾曲し、このため所与の照明強度に対して受信された強度は、焦点面からの間隔が増していくにつれ低下する。この低下は、焦点面付近での感度の低下を意味しており、したがって、照明された層から出る放射は完全には捕捉されない。

それだけでなく、任意の照明パターンの場合、対象物のうち、それぞれの照明パターンの明領域によって照明された領域からの、それぞれの捕捉画像内では、存在する場合には不適切な光に相応する光成分が、対象物の画像のうちの、対象物の上または中でのそれぞれの照明パターンの暗領域、つまり対象物の照明されていない領域に相応する領域内に向けられる。画像のうちのこれらの領域内では、この成分がその後、不適切な光として検出される。

層内の感度を上昇させ、かつ不適切な光の影響を減少させるため、本発明により提案されることは、１つにはバイナリ照明パターンを使用することであり、もう１つには、不適切な光を補正するため、捕捉画像内の或る領域を組み合わせることであり、その領域とは、画像を捕捉するために使用した照明パターンの明領域または暗領域内に位置し、かつまたその縁が、明領域と暗領域の間の移行部から所定の最低間隔離間されているような領域である。これにより、明領域と暗領域の間の移行部の影響が大幅に減少され、かつ意外にも、最大値の付近に水平域を備えた深度レスポンス関数が生じ、したがってこの水平域の幅に亘って、基本的に一定の感度が存在する。

それだけでなく、本発明による方法はその単純さを特色としており、というのも単純な総和および強度値の選択だけを実施すればよいのである。これらの工程は、コンピュータによって、しかしより単純なプロセッサによっても、またはそれどころかプログラミングされていない回路によって、三角演算よりかなり速く実施可能である。これに基づき、本発明による装置も非常に単純に構成され得る。

この方法の場合、原理的に、部分セグメントの間に細い領域が発生する可能性があり、この領域内での明るさの値は、隣接する部分セグメントの値の間の内挿によって算定可能である。しかしながら、この方法の場合、部分セグメントが隙間なく互いに接して繋がる、または部分的に重なり合うことが好ましい。このため装置は、部分セグメントが隙間なく互いに接して繋がる、または部分的に重なり合うように形成されるのが好ましい。これにより部分セグメントの間の内挿は必要なく、このことは方法の実施スピードを明らかに速め、かつ最終的な層画像の正確性を向上させる。特に、照明パターンを重ねた場合に照明パターンの暗領域が対象物を完全に覆うので、画像の暗領域から、内挿なしで、対象物全体の暗画像または全ての除去すべき不適切な光の成分を含む不適切な光の画像を得ることができる。部分セグメントまたはそれに相応する対象物の部分領域が、部分的に重なり合っている場合、幾つかの画像の余剰部分領域を介して平均値を求めてもよい。例えば、明領域の結像画像を総和する場合、部分的に重なった領域内では、これらの領域での二重捕捉の効果を補正するため繰り込みを実施してもよい。照明パターンの部分セグメントが部分的に重なり合う場合、幾つかの画像からの暗領域画像の余剰部分領域を介して、平均値を求め得ることが好ましい。

この方法では、部分セグメントが、最小の広さの１０％より少なく部分的に重なり合っている場合が特に好ましい。このため装置は、部分セグメントが最小の広さの１０％より少なく部分的に重なり合うように形成されることが好ましい。このやり方では、少ない数の照明パターンしか使用する必要がない。

原則的に、最低間隔は任意に選択可能である。しかしながらこの方法の場合、最低間隔は、明領域または暗領域の隣り合った境界線の最も小さい間隔の１／５より大きいことが好ましい。この場合の装置は、最低間隔が、明領域または暗領域の隣り合った境界線の最も小さい間隔の１／５より大きくなるように形成されることが好ましい。この変形形態は、焦点面の周りの層からくる放射の強度を、特に完全に捕捉可能であるという利点を有する。

部分セグメントは、違う手法で形づくることができる。この方法の一変形形態の場合、層画像を算定するため、まず捕捉画像から明画像および暗画像を形成することができ、その際、対象物の領域を再現する捕捉画像の部分セグメントをそれぞれ使用し、この部分セグメントは、それぞれの画像を捕捉する際に使用した照明パターンの明領域または暗領域内にある対象物の領域を再現しており、かつこの領域の縁は、照明パターンの明領域および暗領域の間の移行部から最低間隔離間されている。その後、明画像および暗画像からの差分形成によって、少なくとも部分的に補正された層画像を生成可能である。この場合の装置では評価機構を形成することが好ましく、この評価機構により、層画像を算定するためにまず、捕捉画像から明画像および暗画像を形づくり、その際、対象物の領域を再現する捕捉画像の部分セグメントがそれぞれ使用され、この部分セグメントは、それぞれの画像を捕捉する際に使用した照明パターンの明領域または暗領域内にある対象物の領域を再現しており、かつ、この領域の縁は、照明パターンの明領域および暗領域の間の移行部から最低間隔離間されており、ならびに明画像および暗画像からの差分形成によって、少なくとも部分的に補正された層画像を生成する。この変形形態は、明画像および暗画像のうちの少なくとも１つの平滑化が簡単に実施可能であるという利点を有する。

この方法の別の変形形態の場合、偶数個の照明パターンが使用され得る。この場合、まずそれぞれ使用した照明パターンが互いに対して相補的な捕捉画像から差分画像を形成することにより、少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像を算定可能であり、かつこの少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像から層画像を算定可能である。この場合の装置は好ましくは、偶数個の照明パターンを使用するように、ならびに評価機構を形成するように、形成され、この評価機構は、まずそれぞれ使用した照明パターンが互いに対して相補的な捕捉画像から差分画像を形成することにより、少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像を算定し、かつこの少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像から層画像を算定するために形成される。この変形形態は、部分セグメントの繋ぎ合せをより簡単に行えるという利点を有する。その際、セグメントが部分的に重なり合い得る場合も、繋ぎ合せと理解される。部分セグメントの繋ぎ合せは、画像組立とも解され得る。繋ぎ合せの際、部分セグメントは、対象物上での相応の領域の配置に相応して、相対的に互いに対して配置される。この繋ぎ合せは、例えば画像を足し合わせることによって行われ得る。

照明パターン自体は、暗領域および明領域ならびに部分セグメントが前に挙げた特性を有していれば、様々な構造を備え得る。例えば、径方向に走る明領域および暗領域を備えており、相応の基本パターンが中心点の周りを所定の角度だけ回転することによってそれぞれ生成された照明パターンを使用してもよい。

しかしながら、本発明の方法の場合、照明パターンは、対象物に対しそれぞれ異なって変位された基本パターンによって与えられることが好ましい。このため装置は、照明パターンが、対象物に対しそれぞれ異なって変位された基本パターンによって与えられるように形成されることが好ましい。つまり照明パターンは、同じ構造を備えており、ただし対象面内では互いに対して変位されている。このような照明パターンは簡単に生成可能である。それだけでなく、この照明パターンによってそれぞれ生成された画像の評価が、特に簡単に構成される。

この方法の場合、基本パターンとして周期的な基本パターンを使用することが特に好ましく、その際、変位された基本パターンは、対象物に対して基本パターンをずらすことよって得られる。このため装置は、基本パターンが周期的な基本パターンであり、その際、変位された基本パターンが、基本パターンをずらすことによって得られるように形成されることが好ましい。特に、それぞれの変位は基本パターンの周期に依存し得る。この種類の照明パターンは、特に簡単な生成が可能なだけでなく、捕捉画像の簡単な評価をも可能にする。

その際、１回または複数回のずらしの量、ずらしの回数、照明パターンの数は、深度レスポンス関数が照明パターンが合焦される焦点面の領域内で水平域を有するように、選択されることが特に好ましい。このため装置は、深度レスポンス関数が照明パターンが合焦される焦点面の領域内で水平域を有するように、１回または複数回のずらしの量、ずらしの回数、照明パターンの数を選択するように構成されることが特に好ましい。その際、深度レスポンス関数とは、既に前述した関数のことである。その際、水平域とは、この関数が、焦点面の点状だけではない領域内で一定の値を取ることと理解される。好ましくはこの関数は、水平域から急勾配を経てゼロ付近の値へと、好ましくはゼロの値へと低下する。

対象物に対する照明パターンの変位は、様々な手法で達成可能である。
本発明による方法の好ましい実施形態の場合、対象物を照明パターンに対してずらす。このため本発明の装置では、構造化された絞りとして作用する要素によって生成された基本パターンが、移動によって変位された対象物上で、照明パターンの１つを形成するように、かつ対象物のそれぞれの位置変化後に自動的に評価機構によって画像を捕捉可能であるように、対象物またはスライド・ガラスを移動させ得る駆動装置を評価機構により制御することができる。駆動装置として、非常に正確な位置決めを可能にする圧電アクチュエータまたは偏心駆動装置が使用可能であることが好ましい。この駆動装置は場合によっては、いずれにしても必要な、光学系に対する対象物の位置決めのためにも利用可能である。好ましくは、いずれにしても存在する、モータによって移動可能な顕微鏡ステージを使用可能である。その際、駆動装置による移動は、使用した照明パターンに応じて、対象面に沿った１つまたは２つの方向に可能であり得る。評価機構は特に、駆動装置の制御によって対象物の上または中で一連の照明パターンを生成するために形成可能であり、その際、照明パターンの調整後にそれぞれ画像を捕捉する。これにより装置のユーザのために、操作が著しく簡略化される。それだけでなく評価機構を相応にプログラミングすることにより、照明パターンの種類と必要なずれの間の、この方法によって必要な依存性が、自動的に考慮され得る。

検出器に対する対象物の移動を避けるため、上述の変形形態に対する代替案として、基本パターンを機械的な装置によってずらし得ることが好ましい。本発明による装置の場合、構造化された絞りとして作用する要素は視野絞りであることが好ましい。視野絞りまたは視野絞りの一部を移動させ得る駆動装置は、評価機構により、照明パターンが対象物上に放射されるように制御可能である。照明パターンのそれぞれの変化の後に、評価機構によって画像が自動的に捕捉される。これに関し、視野絞りとは、特に、構造化された照明を形成するために、剛性の、不透明要素または乳白色要素を備える絞りと理解される。

照明パターンの移動に対する代替案として、構造化された絞りとして作用する要素が視野絞りであり、かつ少なくとも２つの照明構造を生成するため視野絞りの後ろに、可動の光偏向要素を配置することが企図され得る。その際、視野絞りは固定的に位置決め可能である。光偏向要素として特に、使用した照明パターンに応じて１つの軸または２つの直交する軸の周りを傾動可能な、鏡面反射性の平面または透明な平行平面板を使用し得る。駆動装置として、圧電駆動装置または偏心駆動装置が使用可能であることが好ましい。照明パターンの調整および相応の画像の補足を簡略化するため、光偏向要素を移動させ得る駆動装置は、評価機構により、照明パターンが対象物上に放射されるように制御可能である。評価機構による照明パターンのそれぞれの変化の後に、画像が自動的に捕捉される。この変形形態は、前に自動的な制御に関連して挙げた利点を有している。

両方の実施形態では、視野絞りが透明領域および乳白色領域を有しており、これらの領域は、対象面内で所望の照明パターンが得られるように形成されている。
基本パターンをずらすために、機械的手段を使用することを避けるべき場合、電気的に制御可能な光変調ユニットを企図することができ、この変調ユニットは、照明パターンが生成されるように制御される。本発明の装置では、例えば絞りとして作用する要素を、このような電子的に制御可能な変調ユニットとして形成可能である。電気的に制御可能な光変調ユニットとしては、例えばいわゆるＤＭＤ（「ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｒｒｏｒ ｄｅｖｉｃｅｓ」）もしくは電子的に制御可能な光透過型または反射型の液晶パネルまたはＬＣＤも使用可能である。前述のように評価機構は、照明パターンが検査すべき領域上に放射され、かつ照明パターンのそれぞれの変化の後で評価機構により画像が自動的に捕捉可能であるように制御し得ることが好ましい。本発明のこの実施形態は、機械的な駆動装置をなくすことを可能にするだけでなく、幾つかの照明パターン・タイプの間の簡単な交換も可能にする。

この方法の好ましい変形形態では、基本パターンとして、周期ｐでの周期的な縞パターンが使用可能であり、この縞パターンの周期的に交互に配置された明帯状部および暗帯状部は同じ幅であり、かつこの縞パターンからは、帯状部の長手方向を横切って周期ｐのｍ／ｎ倍ずらすことで、別の照明パターンが生成可能であり、この場合、ｎは照明パターンの数であり、０＜ｍ＜ｎである。このため装置では、視野絞りが、交互に配置された同じ幅の透明領域および乳白色領域から成る縞状構造を有することが好ましい。その際、帯状部は、検査領域全体または対象物全体に亘って延びていることが好ましい。利用する照明パターンが多くなればなるほど、相応の画像を捕捉する際に使用される励起光はより少なくなる。これにより、最終的な画像の背景における強度ノイズを、ほぼ任意に低下させることができる。その際、透明領域および乳白色領域の次元は、照明パターンが、前述のパラメータで生成され得るように選択される。電気的に制御可能な変調ユニットを使用する場合、照明パターンの生成には、評価機構の相応の形成またはプログラミングで十分である。

代替案として、それぞれ２方向に周期的な明領域および暗領域の配置を有する照明パターンが使用可能であり、その配置は、該複数方向の少なくとも１方向に互いに対して変位される。機械的にずらし得る視野絞りを使用する場合、好ましくは視野絞りが、２方向に周期的な透明領域および乳白色領域の配置を有しており、その際、乳白色領域が互いに境を接している。電気的に制御可能な変調ユニットを使用する場合、これらの照明パターンの生成には、評価機構の相応の形成またはプログラミングで十分である。方向は互いに対し直交であることができ、ただし絶対にそうである必要はない。この実施形態の場合、縞の使用による１方向の際立ちが避けられ、これにより不適切な光の抑制の方向依存性がより少なくなる。それだけでなく、焦点面または対象面の外での、構造化された照明による変調がより速く消え、これにより、結像光学系の被写界深度の外の光がより良く抑えられる。

周期的な照明パターンを使用する場合、不適切な光を取り除いた画像内にまだ、照明パターンの周期性によって引き起こされた照明の不均質性が存在する可能性がある。このため本発明による方法の場合、不適切な光が補正された画像を、層画像の形成前に低周波フィルタにかけることが好ましい。このため装置では、不適切な光が補正された画像を層画像の形成前に低周波フィルタにかけるように、評価機構が形成されることが好ましい。

特に量的な蛍光顕微鏡検査の場合に好まれ得る、対象物の暗視野照明での検査の場合、照明光学系は、暗視野照明のために、絞りとして作用する要素を対象物上に結像するよう形成される。

この場合、本発明の装置では、照明光学系は開口度が小さい照明用対物レンズとして形成されるべきであり、その際、照明用対物レンズの光軸と、結像光学系によって定義された光軸とが、角度αを囲んでいる。この形成は、大きな被写界深度領域を生じさせる。角度αは、透明な対象物または試料の下面での放射強度を最小化するため、好ましくは５０°より大きくされるべきである。

この場合、照明光学系がシャインプルーフ光学系であることが好ましい。その際、照明の焦点面を試料の上面に適合し得るので、暗視野照明のために、より大きな開口数を企図することができる。

さらに、検出器上に対象物を結像するための結像光学系がシャインプルーフ光学系を含んでもよい。この場合、照明用対物レンズの光軸が試料表面に垂直に立っており、一方で結像用対物レンズの光軸は、照明用対物レンズの光軸に対して角度αのところに立っている。

方法も、この方法を実施させ得る装置も、バイオ・チップの読み取りのために、量的な蛍光顕微鏡検査において、およびフォトメトリック測定の場合に、適用可能であることが有利である。

以下に、本発明を図面に基づき例示的にさらに詳しく説明する。
図１に非常に簡略的および概略的に示した本発明の第１の好ましい実施形態に基づく対象物の層画像を生成するための装置は、照明機構１と、その後ろに配列されており、キャリアまたはステージ上に配置された対象物４の対象面３内に照明パターンを生成するための機構２と、画像面Ｂ上に対象物４を結像するための結像光学系５と、画像面内に配置された位置分解型検出器６とを含んでいる。評価機構７が、検出器接続部を介して検出器６と接続されており、かつ制御導線を介して機構２と接続されている。

照明機構１は、光源または放射源８を備えており、その後ろには、フィルタ９と、シャッタ１０と、随意的にのみ、例えば光導波バーまたは内側に鏡を備えたガラス中空バーのような、放射線経路を均質化する光学要素１１と、視野絞り面１４の領域を均質に照らし出すための第１の照明光学系１２および１３とが、配列されている。

機構２は、この例では構造化された視野絞り１５として、照明機構１の放射線経路内に配置され、照明機構によって均質に照らし出され得て、構造化された絞りとして作用し、視野絞り面１４内の２つの互いに直交する方向に定義的にずらし得るように放射線経路内に配置された要素と、図１では概略的にしか示されていない、視野絞り１５をずらし得る駆動装置１６とを備えている。

照明パターンを生成するための機構２の機械的構成は、図２にさらに正確に示されている。偏心駆動装置１７および１８は、視野絞り面１４内の要素を２つの互いに直交する方向で側方にずらし、かつこのやり方で定義的に位置決めできるように、視野絞り１５と連結されている。

視野絞り１５は、周期的に配置された帯状の乳白色領域を有しており、この乳白色領域は透明領域によって互いから離されており、これにより、以下により詳しく説明するように、対象面３内に相応の帯状の照明パターンを生成することができる。

さらに図１で示されているように、要素１５の後ろに配列されており、照明用鏡筒２０と、ビーム・スプリッタ２１と、対物レンズ２２とを含む第２の照明光学系１９によって、視野絞り１５が、検査または結像すべき対象物４または対象面３上に結像され、これにより視野絞り面１４内の視野絞り１５の位置およびその構造に相応する照明パターンが、対象物４上に放射される。

結像光学系５は遠視野光学系であり、この例では対物レンズ２２と、ビーム・スプリッタ２１と、結像用鏡筒２３とを含んでおり、かつそれぞれの照明構造で照明された対象物４を、画像面Ｂまたは光学的放射のための位置分解型検出器６上に、高いコントラストで結像する。

ビーム・スプリッタ２１は、この例ではカラー・スプリッタとして形成されており、かつ望ましくないまたは邪魔なスペクトルの放射成分を除去し得るフィルタ２４および２５を備えている。ビーム・スプリッタ２１ならびにフィルタ２４および２５は、落射蛍光のための装置の構成要素であり、その際、フィルタ２５および２６は、邪魔な反射を放射線経路から遠ざけるために、数度の角度だけ斜めに位置している場合が有利である。

検出器６は、ＣＣＤ要素またはＣＭＯＳ要素から成るマトリクスを含んでおり、かつこの例ではＣＣＤカメラの構成要素である。
検出器６は評価機構７と接続されており、この評価機構は、検出器６の信号を捕捉し、対象物４を結像する際に不適切な光の算定または除去を実施し、かつ最終的な層画像を生成する。このため評価機構７は、プロセッサ、メモリ、および相応のインターフェイスを備えている。最終的な画像を保存すること、および図１に示されていない表示装置またはプリンタを介して出力することのうち少なくとも１つが可能である。

さらに評価機構７は、構造化された視野絞り１５によって生成された照明構造をずらし得る駆動装置１６のための制御部として用いられる。評価機構７は、駆動装置１６およびシャッタ１０を制御することで一連の照明パターンを生成し、かつ検出器６の信号を捕捉することで、検査領域または対象物４のそれぞれ照明パターンに相応する一連の画像を補足するように形成される。一連の画像の最後の１つを捕捉した後、これらの画像は評価機構７内で処理される。

本発明の第１の好ましい実施形態に基づく方法を実施する場合、視野絞り１５の構造に相応する４つの照明パターンが使用され、この照明パターンは図３にさらに正確に示されている。

第１の照明パターンは基本パターンである。その他の照明パターンは、この基本パターンから、距離ｖだけ基本パターンをずらすことで生じる。基本パターンは、幅ｄの帯状の暗領域２６と、それぞれ暗領域２６の間に配置されており、暗領域２６と同じ幅ｈを有する帯状の明領域２７とを備えた、周期ｐでの周期的な構造を有している。

基本パターンは、帯状の暗領域２６または明領域２７の長手方向に対して直交に向いた方向に、距離ｖずつ３回ずらされる。基本パターンがずれることで次々と生じる照明パターンが相対的に変位されている距離ｖは、この例では周期ｐの４分の１の長さを有している。この例での４つの照明パターンの代わりに、Ｎ個の照明パターンを使用する場合、ｖは、特にｐ／Ｎで選択され得る。

周期ｐは、試料の側で１μｍ〜１００μｍであることが好ましい。
対象面３内で、４つの照明パターンを重ねた場合、検査領域または対象物４が暗領域２６によって完全に覆われる。このため暗領域２６を繋ぎ合わせると、対象物４が暗領域によって完全に覆われ、したがって暗領域２６の間の内挿は必要ない。

同様のことが、明領域２７に当てはまる。
本発明の第１の好ましい実施形態に基づき、遠視野光学系または結像光学系５によって位置分解型検出器６上に対象物４の層画像を生成するための方法の場合、対象面３内の対象物４が、対象面３上に合焦された４つの照明パターンによって次々と照明され、このために評価機構７が、駆動装置１６およびシャッタ１０を相応に制御する。照明パターンのそれぞれに対し、検出器６および評価機構７によって相応の画像が自動的に捕捉される。この捕捉画像は、場合によっては、暗領域２６が結像される領域内に、対象物４のうち明領域２７によって照明された区間から放出された不適切な光による明るさが生じる。

その後、この捕捉画像から、評価機構７内で対象物４の層画像が生成される。
このために、まず明画像および暗画像を形成する。明画像または暗画像の生成には部分セグメントだけを使用し、この部分セグメントは、明領域２７または暗領域２６の部分領域３７または３８に相応し、この部分領域は、それぞれ明領域または暗領域の中央にある帯状部を形づくっている。この例示的実施形態では、部分セグメントがちょうど明領域または暗領域の画像の中央の５０％に相応している。

この場合、明画像または暗画像は、部分領域３７および３８に相応する部分セグメントを繋ぎ合わせることによって生じる。その際、捕捉画像の領域の相対的な配置または部分セグメントの配置は、捕捉画像の領域に相応する対象物４上の照明パターンの明領域または暗領域の配置に相応する。

その後、暗画像は、ノイズを抑えるため、相応のロー・パス・フィルタの使用の下、計算により評価機構７によって平滑化される。
最後に、評価機構７内で暗画像を明画像から差し引き、その際、対象物４の最終的な層画像が生じ、この層画像では、不適切な光は抑えられているが、層内の強度は非常に正確に捕捉されている。

この方法では、光軸上の点に関し、対象面から間隔ｚをあけた光軸上の位置から出る光学的放射の検出強度が、照射強度の関数として示す合計深度レスポンス関数が、対象面から遠く離れた面に関して共焦点の抑制を達成するような、かつその際、焦点面の周りの特定の深度領域内で発生する蛍光放射が完全な効率で検出されるような、形状を有することが達成される。これは合計深度レスポンス関数が、中央に値が１またはほぼ１の水平域を有することを意味している。

幾つかの構造化された照明に対する合計深度レスポンス関数は、以下のように計算でき、または見積もられ得る。その際、対象物上に結像される構造が、光学システムの、より正確には結像光学系５の解像限界より明らかに粗い場合に関しては、この計算は幾何光学モデルによって近似させ得る。

幾何光学モデルは、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）とも呼ばれる光学システムの伝達関数が、焦点内でデルタ関数により近似可能な場合に、全般的に適用可能である。第１の工程では、この条件を満たすことから始めるべきである。それだけでなく瞳面内の光波領域は、均質に照らし出された円に相応すると仮定する。瞳内の照明野の直径と結像光学系５の焦点距離との比率から、結像光学系５の開口数を計算することができる。その際、焦点面に対する間隔の関数としてのＰＳＦが円として生じ、この円の半径Ｒ_ＰＳＦは、下記のように、焦点面に対する間隔ｚ、結像光学系５の焦点距離ｆ、および瞳の半径Ｒ_瞳に依存しており、

この場合、対象面から間隔ｚをあけた面内で生じる強度分布は、デフォーカスされたＰＳＦによる照明構造Ｉ_構造照明の畳み込みとして生じる

蛍光用の検出器６は、焦点面または対象面に対して共役の面内にある。検出器面内での強度Ｉ_検出器は、下記の式によって生じる

これに関しＰＳＦ（ｚ）は深度レスポンス関数として理解することができる。この例では、結像光学系５が同時に照明のために利用されるので、ＰＳＦ（ｚ）を２回適用することにより、合計深度レスポンス関数が生じる。

こうして、デフォーカシングｚの関数としてこのように決定された検出器上の強度分布により、合計深度レスポンス関数が決定され得る。
現況技術において述べた方法の場合、正弦状の強度分布が表面上に投影され、かつ検出器上での変調が測定される。つまり下記の式が当てはまり、
Ｉ_構造照明＝１＋ｓｉｎ（ω_ｘｘ）
その際、ωｘ_は、結像光学系５の光軸方向または放射線方向もしくはｚ軸に対して直交する面内の位置周波数を表し、ｘは、その面内の位置を表す。

この強度分布は、深度ｚに依存する半径を備えた円で２回畳み込みがなされる。このためＰＳＦ（ｚ）のフーリエ変換は、変形ベッセル関数に相応する。この関数の２乗は、エアリー関数として知られている。照明関数は、ゼロ、＋ω_ｘ、および−ω_ｘのところで３つのピークを発生させる。この関数にエアリー関数を乗じても、この３つの位置でだけゼロとは異なる値が生じる。構造化された照明の方法により強度分布の変調だけを測定する。これにより＋ω_ｘおよび−ω_ｘでの２つのピークによって、２つの値だけがエアリー関数から切り取られる。ここで深度ｚを変化させると、様々な縮尺のエアリー関数が生じ、このエアリー関数から、照明関数のフーリエ変換はそれぞれ＋ω_ｘおよび−ω_ｘでの値だけを切り取る。したがって、まとめると、幾何光学モデルでは、正弦状の強度分布を備えた照明および上述の評価アルゴリズムの場合、合計深度レスポンス関数はエアリー関数に相応すると言うことができる。

典型的な共焦点のポイント・スキャナを幾何光学モデルによって考察する場合、下記の合計深度レスポンス関数が生じ（図４の破線の曲線を参照）、

正確な波動光学的描写は下記の式を生じさせ、
Ｔ_{レスポンス}（ｚ）＝ｓｉｎｃ^２（ａｚ）
その際、ａは比例係数である（図５の破線の曲線を参照）。

この場合も、合計深度レスポンス関数は焦点のすぐ近くで低下している。
これに対し、本発明による方法は、焦点のすぐ近くに、つまり対象面のすぐ近くに、値１での水平域を有する合計深度レスポンス関数を生じさせる。

この合計深度レスポンス関数の変化に関する基本原理は、以下のように理解できる。つまり、試料を長方形縞格子によって照明し、かつ４つの画像を処理するために示した方法を使用する場合、全ての対象点は、明るい帯状部と暗い帯状部の間の縁から、少なくとも帯状部の４分の１は離れていることが保証される。伝達関数ＰＳＦ（ｚ）が、デフォーカシングｚに依存する半径の円に相応すると仮定すると、隣接する帯状部の縁についての情報が対象点内に到達するのは、錯乱円の半径が、帯状部の縁に対する間隔に相応するほど、デフォーカシングが大きくなる場合になってからである。この間隔は、対象点に関し、その対象点の位置に応じて、帯状部の幅の４分の１から半分の間で変化する。このため簡略化された幾何光学モデルを使用する場合、合計深度レスポンス関数には、試料内での位置に依存する幅Ｚを有する値１での水平域が生じる。最小の幅Ｚは、下記の式によって計算される

帯状部の中央の点に関して、水平域の最大幅はちょうど２Ｚである。５つ以上の記録を使用すれば、水平域の最小幅（図５の実線）をさらに増大させることができ、理論的には、無限に多くの測定に対しては、水平域の最大幅２Ｚに達する（図５の長破線）。

この非常に簡単な説明は、フレネル近似において波動光学的に検算することができる。その際に予想され得る結果は、３つの場合に区別することができる。
１．照明構造がシステムの光学解像度よりかなり大きい。この場合、幾何学的描写および波動光学的描写は、同じ結果を提供するだろう。

２．照明構造が解像限界に比べてさほど大きくはない。この場合、合計深度レスポンス関数のために、波動光学的な計算を適用しなければならない。構造の大きさに応じて、合計深度レスポンス関数の水平域は「角を丸くされる」。これにより、効果的に利用可能な水平域の幅は減少する。

３．照明構造の大きさが解像限界の付近にある。この場合にはもう照明格子の第１の周波数成分しか光学システムによって伝達されない。この場合、合計深度レスポンス関数内に水平域は発生しない。この場合、合計深度レスポンス関数は基本的に、正弦状の縞照明に対する幾何近似での合計深度レスポンス関数に相応する。

第２の場合は、近軸のフレネル近似モデルによって波動光学的にシミュレーションが可能である。この結果は図５に示されている。これにおいて正弦状の照明構造に関する結果は破線で示されており、かつ上述の同じ周期の縞構造に関する結果が示されている。この場合に対する伝達関数ＰＳＦは、焦点付近で波動光学的に計算され、かつＩ_検出器に関する等式に基づき、それ自体およびバイナリ縞パターンによる畳み込みがなされた。図５は得られた信号の推移を示している。この図には、正弦状およびバイナリの照明構造に関する合計深度レスポンス関数が、破線または実線で示されており、光軸またはｚ軸上の点の位置に依存して示されており、その際、ゼロ点は焦点面に相応する。図４と比較して、合計深度レスポンス関数の水平域の角が明らかに丸くなっていることが分かる。

特定の測定用途のために、照明格子の形での構造化された照明を最適化するためには、その他の点で評価方法に変更がない場合、照明格子の周波数を変えるだけでよい。この変化は２つの効果を結果として招く。１つ目に、照明格子の格子周期が大きくなればなるほど、非焦点面からの光の共焦点の抑制が悪くなっていく。その際、基本的に、合計深度レスポンス関数、したがって共焦点の抑制の程度は、格子周波数によってスケーリングされる。２つ目に、合計深度レスポンス関数における水平域の幅も、したがって強度効率１で検出器上に結像される試料の深度領域も、照明格子の周波数によってスケーリングされる。ただし共焦点の抑制／水平域幅の、照明格子の格子周波数によるこの単純な線形依存性は、光学システムの解像限界より明らかに大きな格子波長に関してのみ当てはまる。この条件が満たされない場合、合計深度レスポンス関数は、それぞれの格子周波数に対して個別に、波動光学的に計算されなければならない。その後、このデータに基づき様々な測定用途のために格子周波数の最適化を行うことができる。

第２の例示的実施形態は、層画像の生成が一部変更され、かつこのために評価機構が相応に一部変更されることによってのみ、第１の例示的実施形態と異なっている。このため第１例示的実施形態のうち変更のない部分に対する全ての説明はここでも当てはまり、かつ同じ符号が使用される。

ここでは、第１の画像が第３の画像から差し引かれ、かつ第２の画像が第４の画像から差し引かれることによって、少なくとも部分的に不適切な光の補正が行われた２つの暫定画像が生成される。

その後、第１の暫定画像から部分領域３７に相応する部分セグメントが、および第２の暫定画像から部分領域３８に相応する部分セグメントが、層画像へと繋ぎ合わされる。
第３および第４の例示的実施形態が、第１または第２の例示的実施形態と異なるところは、明領域または暗領域の画像から、部分セグメントに相応する部分領域３７または３８として、ここでは幅ｐ／２の中央の帯状部ではなく、幅３／４ｐの中央の帯状部を使用することであり、これにより部分セグメントは部分的に重なり合う。部分セグメントが部分的に重なり合うので、総和の際、部分的に重なった領域内で強度の過剰なつり上げが生じ、このつり上げは、参照または繰り込みによって取り除かれる。

その他の工程は、第１または第２の例示的実施形態でのように行われる。
本発明による方法または本発明による装置の第５の好ましい実施形態の場合、視野絞り１５を動かすのではなく、対象物４を動かす。このために、上に対象物を配置しており、かつ評価機構７により制御された駆動装置によって対象面３に平行な方向に移動可能なステージが使用され得る。捕捉画像の評価は、第１の例示的実施形態に倣って行われる。対象面３内で対象物４を位置決めするため、駆動装置として、圧電アクチュエータ、偏心駆動装置、または別の適切な変位メカニズムを使用可能であり、ただし好ましくはモータを取り付けた顕微鏡ステージを使用可能である。第２から第４の例示的実施形態が相応に一部変更され得る。

本発明の第６の好ましい実施形態に基づく装置は、図６に原理的に示された照明パターンを生成するための一部変更された機構２８および相応に一部変更された評価機構を使用することにより、第１の例示的実施形態の装置と異なっている。その他のコンポーネントには基本的に変更がないので、これらのコンポーネントには同じ符号が使用され、かつ第１の例示的実施形態に対する説明が相応に当てはまる。

図６に部分的に示された機構２８は、構造化された絞りとして作用する要素として、視野絞り面１４内に配置された市松模様構造を有する視野絞り２９を備えており、この市松模様構造は、２つの互いに直交する方向に周期的に、同じ周期で形成された透明および乳白色の正方形領域を有している（図７を参照）。幾つかの照明構造を生成するため、機構２８は、図６に概略的に示したように、構造化された視野絞り２９に対し光の方向において後ろに配列された平行平面のガラス板３０を備えており、このガラス板は、２つの互いに直交する軸の周りを傾動可能である。ガラス板３０を制御して定義的に傾動させるため、有利なやり方では、駆動装置３１として、図示されていない評価機構の制御によって相応に制御される圧電アクチュエータ３２が企図される。周知のように、ガラス板３０を傾動させると、放射線経路の光学的な放射線変位が、したがって対象物４上への視野絞り２９の変位された結像が起こる。図６に書き込まれた矢印は、ガラス板３０の傾動方向を示している。

放射線変位を生成するために、別の適切な要素の使用も可能である。ガラス板３０のための駆動装置として、別の実施形態では、偏心駆動装置または別の適切な駆動メカニズムも企図され得る。

対象面３内に視野絞り２９を結像すると、２つの互いに直交する方向に周期的に配置されて市松模様パターンを形づくる正方形の明領域３３および暗領域３４を有する図７に示した基本パターンが生じる。この基本パターンは、以下に数字１によって示される方向において第１の周期ｐ１を、および以下に数字２によって示される方向において第２の周期ｐ２を有しており、その際、この例示的実施形態では、これらの周期が同じ大きさで選択されている。

この例では、１６個の照明パターンを生成するために、それ自体が第１の照明パターンである基本パターンを、まず方向１に次々と距離ｖ１ずつ３回ずらし、つまり明領域３３の図７での水平な側に平行にずらし、その際、第２、第３、および第４の照明パターンが生じる。その後、第５の照明パターンを生成するために、第１のずらし方向に直交する方向２に距離ｖ２だけずらし、つまり図７での明領域の垂直な側に平行にずらす。その後、更に３つの照明パターンが、第１のずらし方向にそれぞれ距離ｖ１ずつずらすことによって生成される。その後、更にｖ２だけずらし、その後ｖ１を３回、再びｖ２、およびその後ｖ１を３回ずらす。

周期ｐ１およびｐ２は、対象面内では１μｍ〜１００μｍの範囲内にあることが好ましい。この周期は、別の例示的実施形態では異なる大きさを選択してもよい。
１６個の照明パターンを重ねると、照明パターンの明領域３３が、対象面３内の対象物４を完全に覆う。同様のことが、暗領域３４に当てはまる。

本発明の第６の好ましい実施形態に基づく対象物４の結像方法は、第１の例示的実施形態に倣って行われる。ここで部分セグメントはそれぞれ、市松模様パターンの正方形内の正方形の領域３７または３８に相応し、この領域３７、３８の縁は、明領域または暗領域のそれぞれの縁から、明領域または暗領域の横の長さの４分の１の間隔をあけている。

この方法は、第１の例示的実施形態の方法に対して、つまり縞による照明パターンの使用に対して、焦点面または対象面の外での、構造化された照明による変調がより速く消え、これにより結像光学系の被写界深度の外の光がより良く抑えられるという利点を有している。

図８には、例示的に、市松模様状の強度分布を備えたバイナリの照明パターンに関し（実線）、および２つの次元における正弦状の強度分布を備えた照明パターンに関し（破線）、幾何光学近似での合計深度レスポンス関数が示されている。図４および図５でのように、横座標は、スケーリングされた任意の単位での焦点面からの間隔を、および縦座標は、同様に任意にスケーリングされた単位での合計深度レスポンス関数のそれぞれの値を示している。これに基づき、ボックス状のプロフィルへのより良い近似が達成される。

本発明の第７の好ましい実施形態に基づく対象物の画像を捕捉するための装置は、視野絞り１５のための別の駆動装置によって、第１の例示的実施形態の装置と異なっている。全ての他のコンポーネントに変更はなく、そのためこれらのコンポーネントに対し同じ符号が使用され、かつ図１に基づく第１の例示的実施形態に関する説明が相応に当てはまる。

図９は、変更された、照明パターンを生成するための機構の概略的な部分図を示している。評価機構内の制御部によって制御される駆動装置は、圧電アクチュエータ３５および３６を含んでおり、この圧電アクチュエータは視野絞り１５と連結されており、このため視野絞り１５は、圧電アクチュエータ３５および３６により、視野絞り面１４内で２つの互いに直交する方向に沿って側方にずらされることによって定義的に変位され得る。幾つかの位置で調整された視野絞り１５を対象物４上に結像することにより、前述のように幾つかの照明構造が対象面３内に生成され、この照明構造は、その後、対象物３と共に検出器６上に結像される。

本発明の第８の好ましい実施形態は、これまで述べた例示的実施形態と異なり、照明パターンを生成するための機構が、ここでは視野絞りも駆動装置も備えておらず、その代わりに構造化された絞りとして作用する要素として、視野絞り面１４内に配置された電気的に制御可能な変調ユニット４５を、光透過型ＬＣＤの形で備えている。図１０に概略的に示したように、変調ユニット４５は、制御導線を介して評価機構４６と接続されており、この評価機構は、評価機構内に保存された明暗パターンを光透過型ＬＣＤ上に表示し、これにより対象面３上に相応の照明パターンを放射するというように、第１の例示的実施形態の評価機構７に対して変更されている。

本発明の第９の好ましい実施形態に基づく装置は、図１１に光学的構成全体が概略的に簡略的に示されており、第１の例示的実施形態の装置とは、絞りとして作用する要素が、暗視野照明のために対象物上に鮮鋭に結像可能であることによって異なっている。このために第２の照明光学系１９が、一部変更された第２の照明光学系４０に取り替えられ、ビーム・スプリッタ２１は必要なくなる。第１の例示的実施形態に対して基本的に変更のないコンポーネントに関しては、第１の例示的実施形態の実施が相応に当てはまり、かつ同じ符号が使用される。

この装置は、照明機構１を含んでおり、この照明機構は、光源または放射源８を備えており、その後ろには、随意的にシャッタ１０と、有利には、例えば光導波バーまたは内側に鏡を備えたガラス中空バーのような、放射線経路を均質化する光学要素１１と、視野絞り面１４内で放射線経路内に配置され、照明パターンを生成するための、この例では構造化された視野絞り１５を含む機構２を均質に照らし出すための照明光学系１２および１３とが、配列されている。この視野絞り１５は、放射線経路内で視野絞り面１４の２つの互いに直交する方向に定義的に位置決め可能に配置されている。つまり視野絞り１５は、視野絞り１５と連結された駆動装置１６によって、この面１４内でずらすことができる。

視野絞り１５の後ろに配列されており、この例では照明用鏡筒４１と、偏向ミラー４２と、励起フィルタ４３と、対物レンズ４４とを含む、一部変更された第２の照明光学系４０によって、構造化された絞りとして作用する要素、つまりここでは構造化された視野絞り１５が、暗視野照明において、検査または測定すべき対象物４または対象面３上に結像される。第２の照明光学系４０は、いわゆるシャインプルーフ光学系を形づくっており、この光学系の光軸は、対象物４の表面または対象面３に対し垂直に走る結像光学系５の光軸に対して角度αのところに配置されている。有利には角度α＞５０°である。例えば対物レンズ２２と、フィルタ２５と、結像用鏡筒２３とを含むこの結像光学系５によって、対象物４が、重ねられた照明構造と共に、光学的放射のための位置分解型検出器６上に高いコントラストで結像される。

しかしながら類似のやり方では、一部変更された実施形態の場合に、結像光学系をシャインプルーフ光学系として形成することもできる。この場合、第２の照明光学系４０の光軸は、対象物４の表面または対象面３上に垂直に立っている。その際、この光軸と結像光学系の光軸とが角度αを形づくる。

本発明の第１の好ましい実施形態に基づく、対象物の画像を捕捉するための装置の光学的構成の概略図。 図１に基づく装置内の、偏心駆動装置を備えた視野絞りにより照明パターンを生成するための機構の概略的な部分図。 図１に基づく装置の視野絞りによって得られる４つの照明パターンを示す図。 １つの次元において正弦関数に基づき変化する強度を備えた照明パターンおよびその正弦関数の周期で繰り返す明帯状部および暗帯状部を備えたバイナリ照明パターンに関し、幾何光学近似での合計深度レスポンス関数を示す図。 図４における照明パターンに関し、フレネル近似での合計深度レスポンス関数を示す図。 本発明の第６の好ましい実施形態に基づく、対象物の画像を捕捉するための装置の場合の、照明パターンを生成するための機構の概略的な部分図。 本発明の第６の好ましい実施形態に基づく装置または方法の場合の、２方向に周期的な市松模様の照明パターンを示す図。 ２つの次元において正弦関数に基づき変化する強度を備えた照明パターンおよびその正弦関数の周期で繰り返す市松模様状に配置された正方形の明帯状部および暗帯状部を備えたバイナリ照明パターンに関し、幾何光学近似での合計深度レスポンス関数を示す図。 本発明の第７の好ましい実施形態に基づく、対象物の画像を捕捉するための装置の場合の、照明パターンを生成するための機構の概略的な部分図。 本発明の第８の好ましい実施形態に基づく、対象物の画像を捕捉するための装置の光学的構成の概略図。 本発明の第９の好ましい実施形態に基づく、対象物の画像を捕捉するための装置の光学的構成の概略図。

符号の説明

１ 照明機構
２ 照明パターン生成機構
３ 対象面
４ 対象物
５ 結像光学系
６ 検出器
７ 評価機構
８ 放射源
９ フィルタ
１０ シャッタ
１１ 均質化する光学要素
１２、１３ 第１の照明光学系
１４ 視野絞り面
１５ 視野絞り
１６ 駆動装置
１７、１８ 偏心駆動装置
１９ 第２の照明光学系
２０ 照明用鏡筒
２１ ビーム・スプリッタ
２２ 対物レンズ
２３ 結像用鏡筒
２４、２５ フィルタ
２６ 暗領域
２７ 明領域
２８ 照明パターン生成機構
２９ 視野絞り
３０ ガラス板
３１ 駆動装置
３２ 圧電アクチュエータ
３３ 明領域
３４ 暗領域
３５ 圧電アクチュエータ
３６ 圧電アクチュエータ
３７ 部分領域
３８ 部分領域
３９ 細胞
４０ 第２の照明光学系
４１ 照明用鏡筒
４２ 偏向ミラー
４３ 励起フィルタ
４４ 対物レンズ
４５ 変調ユニット
４６ 評価機構

Claims (32)

1. 遠視野光学系（５）を用いて位置分解型検出器（６）上に対象物（４）の層画像を生成するための方法であって、この場合
   該対象物（４）が少なくとも１つの対象面（３）内で、少なくとも２つのバイナリ照明パターン（２６、２７；３３、３４）によって合焦されて照明され、かつ該照明パターン（２６、２７；３３、３４）のそれぞれに対して相応の画像が捕捉され、その際、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）はそれぞれ暗領域（２７；３４）および明領域（２６；３３）を有しており、これらの該領域のうち該明領域および該暗領域のうちの少なくとも１つが、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）を重ねた場合に該対象物（４）を完全に覆い、かつ
   該捕捉画像から層画像が算定され、該層画像は部分セグメントを含んでおり、該部分セグメントはそれぞれ該対象物（４）の部分領域を再現しており、該部分領域は、使用された該照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの少なくとも１つの照明パターンの明領域内に、該部分領域の縁が該明領域の縁から少なくとも所定の最低間隔だけ離隔しているように位置し、かつ該部分セグメントはそれぞれ、少なくとも２つの画像を使用して、少なくとも部分的に不適切な光を補正したうえで算定されており、該少なくとも２つの画像は、それぞれ幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）で捕捉されており、これらの該照明パターン内では、それぞれの該部分セグメントに相応する該部分領域が、全体的に、該幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの第１の照明パターンの明領域内に位置するか、または全体的に、該幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの第２の照明パターンの暗領域内に位置している、方法。
2. 前記部分セグメントが、隙間なく互いに接して繋がる、または部分的に重なり合う、請求項１に記載の方法。
3. 前記部分セグメントが、最小の広さの１０％より少なく部分的に重なり合う、請求項２に記載の方法。
4. 前記最低間隔が、隣り合った境界線の最も小さい間隔の１／５より大きい、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記層画像を算定するため、まず前記捕捉画像から明画像および暗画像を形成し、その際、前記対象物（４）の領域を再現する前記捕捉画像の部分セグメントをそれぞれ使用し、該部分セグメントは、それぞれの前記画像を捕捉する際に使用した照明パターン（２６、２７；３３、３４）の明領域または暗領域内にある前記対象物（４）の領域（３７、３８）を再現しており、かつ該領域（３７、３８）の縁は、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）の該明領域および該暗領域の間の移行部から前記最低間隔離間されており、
   該明画像および該暗画像からの差分形成によって、少なくとも部分的に補正された層画像が生成される、
   請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 偶数個の照明パターン（２６、２７；３３、３４）が使用され、かつそれぞれ使用した該照明パターン（２６、２７；３３、３４）の互いに対して相補的な捕捉画像から差分画像を形成することにより、少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像を算定し、かつ該少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像から前記層画像を算定する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）が、前記対象物（４）に対しそれぞれ異なって変位された基本パターンによって与えられる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 基本パターンとして周期的な基本パターンを使用し、その際、前記変位された基本パターンが、前記対象物（４）に対して該基本パターンをずらすことによって得られる、請求項７に記載の方法。
9. 前記１回または複数回のずらしの量、および前記ずらしの回数、前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）の数は、前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）が合焦される焦点面の領域内で深度レスポンス関数が水平域を有するように、選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記対象物（４）が、前記基本パターン（２６、２７）に対してずらされる、請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記基本パターン（２６、２７；３３、３４）が、機械的な装置（１５、９；１５、１６；１５、３１）によってずらされる、請求項７乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 電気的に制御可能な光変調ユニット（４５）が、前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）を生成するように制御される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 基本パターンとして、周期ｐでの周期的な縞パターンが使用され、該縞パターンの周期的に交互配置されている明帯状部および暗帯状部は同じ幅であり、かつ該縞パターンからは、該帯状部の長手方向を横切って該周期ｐのｍ／ｎ倍ずらすことで、別の照明パターン（２６、２７；３３、３４）が生成可能であり、その際、０＜ｍ＜ｎである、請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の、または請求項７乃至１１のいずれか１項および請求項１２に記載の方法。
14. それぞれ２方向に周期的な明領域および暗領域（３３、３４）の配置を有する照明パターン（３３、３４）が使用され、その際、該配置が、該方向の少なくとも１方向に互いに対して変位される、請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の、または請求項７乃至１１のいずれか１項および請求項１２に記載の方法。
15. 明画像および暗画像のうちの少なくとも１つが低周波フィルタにかけられる、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 対象物（４）の層画像を生成するための装置であって、
    該対象物（４）の対象面（３）内を、合焦して照明するための照明機構（１）と、
    放射線経路内で該照明機構（１）の後ろに配置され、構造化された絞りとして作用する要素を備えた、該対象物（４）の該対象面（３）内を照明するための少なくとも２つの所定の照明パターン（２６、２７；３３、３４）を生成するための機構（２；２８；４５）であって、その際、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）はそれぞれ暗領域（２７；３４）および明領域（２６；３３）を有しており、これらの該領域のうち該明領域および該暗領域のうちの少なくとも１つが、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）を重ねた場合に該対象物（４）を完全に覆う、
    画像面（Ｂ）上に該対象面（３）を結像するための好ましくは遠視野光学系として形成された結像光学系（５）、機構（２；２８；４５）と、
    該対象物（４）から出る光学的放射を検出するため該画像面（Ｂ）内に配置された位置分解型検出器（６）と、
    該検出器（６）の検出信号を評価するための評価機構（７、４６）であって、該評価機構は、該検出信号を基に画像を捕捉するため、かつ請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法のうち画像捕捉に続く工程を実施するため、特に、該捕捉画像から層画像を算定するために設けられており、該層画像は部分セグメントを含んでおり、該部分セグメントはそれぞれ該対象物（４）の部分領域を再現しており、該部分領域は、使用された該照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの１つの照明パターンの明領域内に、該部分領域の縁が該明領域の縁から少なくとも所定の最低間隔だけ離隔しているように位置し、かつ該部分セグメントはそれぞれ、少なくとも２つの画像を使用して、少なくとも部分的に不適切な光を補正したうえで算定されており、該少なくとも２つの画像は、それぞれ幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）で捕捉されており、これらの該照明パターン内では、それぞれの該部分セグメントに相応する該部分領域が、全体的に、該幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの第１の照明パターンの明領域内に位置するか、または全体的に、該幾つかの照明パターン（２６、２７；３３、３４）のうちの第２の照明パターンの暗領域内に位置している、評価機構（７、４６）と
    を備える装置。
17. 前記部分セグメントが、隙間なく互いに接して繋がる、または部分的に重なり合うように形成される、請求項１６に記載の装置。
18. 前記部分セグメントが、最小の広さの１０％より少なく部分的に重なり合うように形成される、請求項１７に記載の装置。
19. 前記最低間隔が、明領域または暗領域の隣り合った境界線の最も小さい間隔の１／５より大きい、請求項１６または１７に記載の装置。
20. 前記評価機構が、前記層画像を算定するために形成され、このために前記捕捉画像から明画像および暗画像を形成し、その際、前記対象物（４）の領域を再現する前記捕捉画像の部分セグメントをそれぞれ使用し、該部分セグメントは、それぞれの前記画像を捕捉する際に使用した照明パターン（２６、２７；３３、３４）の明領域または暗領域内にある前記対象物（４）の領域を再現しており、かつ該領域の縁は、該照明パターン（２６、２７；３３、３４）の該明領域および該暗領域の間の移行部から前記最低間隔離間されており、かつ該明画像および該暗画像からの差分形成によって、少なくとも部分的に補正された層画像を生成する、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の装置。
21. 偶数個の照明パターン（２６、２７；３３、３４）が使用されるように形成されており、かつこの場合、前記評価機構が、それぞれ使用した該照明パターン（２６、２７；３３、３４）の互いに対して相補的な捕捉画像から差分画像を形成することにより、少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像を算定し、かつ該少なくとも部分的に不適切な光が補正された画像から前記層画像を算定するために設けられている、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の装置。
22. 前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）が、前記対象物（４）に対しそれぞれ異なって変位された基本パターンによって与えられるように形成される、請求項１６乃至２１のいずれか１項に記載の装置。
23. 前記基本パターンが周期的な基本パターンであり、その際、前記変位された基本パターンが、該基本パターンをずらすことによって得られるように形成される、請求項２２に記載の装置。
24. 前記１回または複数回のずらしの量、前記ずらしの回数、前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）の数が、深度レスポンス関数が、前記照明パターン（２６、２７；３３、３４）が合焦される焦点面の領域内で水平域を有するように選択される、請求項２３に記載の装置。
25. 前記対象物（４）または前記対象物（４）用のキャリアを移動させ得る駆動装置（１６；３１）が、該キャリアによって移動された前記対象物（４）上で、前記構造化された絞りとして作用する要素によって生成された基本パターン（２６、２７；３３、３４）が照明パターン（２６、２７；３３、３４）を結像するように、前記評価機構（７）により制御され得、かつ
    前記評価機構（７、４６）によって、前記対象物（４）のそれぞれの位置変化後に、前記検出器（６）の画像を自動的に捕捉可能である、請求項１６乃至２４のいずれか１項に記載の装置。
26. 前記対象物（４）または前記対象物（４）用のキャリアを移動させ得る駆動装置（１６；３１）が、該キャリアによって移動された前記対象物（４）上で、前記構造化された絞りとして作用する要素によって生成された基本パターン（２６、２７；３３、３４）が照明パターン（２６、２７；３３、３４）を結像するように、前記評価機構（７）により制御され得、かつ
    前記評価機構（７、４６）によって、前記対象物（４）のそれぞれの位置変化後に、前記検出器（６）の画像を自動的に捕捉可能である、
    請求項１６乃至２５のいずれか１項に記載の装置。
27. 前記構造化された絞りとして作用する要素が視野絞り（１５）であり、かつ少なくとも２つの照明構造を生成するため該視野絞り（１５）の後ろに、可動の光偏向要素（３０）が配置される、請求項１６乃至２６のいずれか１項に記載の装置。
28. 前記視野絞り（１５）が、交互に配置された透明領域および乳白色領域から成る縞状構造を有する、請求項２７に記載の装置。
29. 前記視野絞り（１５）が、２方向に周期的な透明領域および乳白色領域の配置を有しており、その際、該乳白色領域が互いに境にて接する、請求項２７に記載の装置。
30. 前記絞りとして作用する要素が、電子的に制御可能な変調ユニット（４５）、特にＬＣＤまたはＤＭＤである、請求項２７に記載の装置。
31. 前記絞りとして作用する要素を前記対象物（４）上に結像するための照明光学系（４０）が、暗視野照明用の照明光学系として形成される、請求項１６乃至３０のいずれか１項に記載の装置。
32. 前記評価機構が、明画像および暗画像のうちの少なくとも１つを低周波フィルタにかけるように形成される、請求項１６乃至３１のいずれか１項に記載の装置。

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