JP2009542191A - 診断のための生体分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】具体的には、本発明は、対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び/又は重篤度を検出する方法を提供する。また、本発明は、対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法を提供する。
【選択図】図1
Description
そのため、乳がんを検出及び処置するための改善された方法が歓迎される。
本発明は上記の問題を検討し、細胞増殖異常(例えば、がんなど)を検出及び/又は処置するための方法を提供する。一般に、当該異常はがんであり、具体的には乳がんである。
1つの局面において、本発明は、
[1]対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び/又は、重篤度を検出及び/又は定量化する方法であって、
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び/又は、重篤度が示されるものである方法を提供する。
(a)対象からの少なくとも2つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)少なくとも2つのサンプルにおけるPA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を比較することを含む方法もまた提供される。
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法もまた提供される。
(a)少なくとも1つの薬物を少なくとも1つの対象に投与すること;
(b)少なくとも1つのタンパク質を前記対象から得ること;
(c)前記タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸残基を少なくとも1つの試薬により標識すること;及び
(d)前記タンパク質を質量分析法によって分析し、それにより、前記少なくとも1つのタンパク質及び/又はそのフラグメントを特定し、発現の変動が生じているかどうかを明らかにすることを含む方法もまた提供される。
(a)少なくとも1つの対象からの少なくとも1つのサンプルを提供すること;
(b)PA2G4遺伝子及び/又はその変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法もまた提供される。
前記コントロールはまた、PA2G4遺伝子及び/又はPA2G4タンパク質の低いレベル又は低下したレベルの発現を有する少なくとも1つの対象である場合がある。前記コントロールはまた、選択された集団から得られる発現における平均値である場合がある。
前記分子は、前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異にハイブリダイゼーション可能な核酸配列であり得る。
前記キットはさらに、疾患状態又は処置条件の診断及び/又は予後評価などの目的ための化合物の使用に関連するパッケージング及び情報を含むことができる。
前記細胞増殖異常はがんである場合がある。具体的には、前記細胞増殖異常は乳がんである場合がある。前記対象は哺乳動物である場合があり、具体的にはヒトである場合がある。
生物学的材料−生物学的ソースに由来する任意の材料。当該材料は、生体分子、細胞、組織及び/又は体液を含むことができる。当該材料は、細胞培養、動物対象、哺乳動物対象又はヒト対象から得ることができる。
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び/又は、重篤度が示されるものである方法を提供する。
(a)対象からの少なくとも2つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)少なくとも2つのサンプルにおけるPA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を比較することを含む方法もまた提供される。
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法もまた提供される。
もまた提供される。
(a)少なくとも1つの対象からの少なくとも1つのサンプルを提供すること;
(b)前記PA2G4遺伝子及び/又はその変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法もまた提供される。
本発明の核酸は、当分野で知られている方法による好適な宿主細胞へのDNA移入によってインビトロで発現させることができる。例えば、核酸を組換え発現ベクターに挿入することができる。様々な宿主−発現ベクターシステムを、本発明の核酸を発現させるために利用することができる。これらには、微生物(例えば、組換えバクテリオファージDNA、組換えプラスミドDNA又は組換えコスミドDNAの発現ベクターにより形質転換された細菌;組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母など)、及び、組換えウイルス発現ベクター又は組換えプラスミド発現ベクターを感染させたヒトセルラインが含まれるが、これらに限定されない。組換えポリペプチド又はそのフラグメントの単離及び精製は従来の手段によって行うことができ、そのような方法には、調製用クロマトグラフィー、及び、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を伴う免疫学的分離が含まれる。
マーカーヌクレオチド配列(PA2G4、GRP78及びCK19)の発現をmRNAレベル又はタンパク質レベルのいずれかで明らかにすることができる。組織サンプル又は体液サンプルにおけるmRNAレベルを測定する様々な方法が当分野では知られている。mRNAレベルを測定するために、細胞を溶解することができ、ライセートにおけるmRNAのレベル、あるいは、ライセートから精製又は半精製されたRNAにおけるmRNAのレベルを、様々な方法のいかなるものによっても決定することができ、そのような方法には、限定されないが、検出可能に標識されたDNAプローブ又はRNAプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する定量的又は半定量的なRT−PCR方法論が含まれる。あるいは、定量的又は半定量的なインシチュウーハイブリダイゼーションアッセイを、例えば、組織切片又は非溶解の細胞懸濁物、及び、検出可能(例えば、蛍光又は酵素)標識されたDNAプローブ又はRNAプローブを使用して行うことができる。mRNAを定量するためのさらなる方法には、RNA保護アッセイ(RPA)及び遺伝子発現の連続分析(SAGE)が含まれる。
本発明はさらに、細胞増殖関連異常を防止及び処置するための方法を提供する。処置される対象は、例えば、対象から調製されたサンプルにおけるPA2G4のゲノムDNA、DNA転写物又はDNA産物のレベルを、上記で記載された方法によって明らかにすることによって特定することができる。PA2G4のゲノムDNAレベルが、対象由来のサンプルにおいて、正常な対象に由来するサンプル(コントロール)におけるPA2G4のゲノムDNAレベルよりも高いならば、その対象は、PA2G4のゲノムDNA、DNA転写物又はDNA産物のレベルを低下させる化合物の効果的な量による処置についての候補である。
実施例1−化学試薬及び材料
MCF−7乳がん細胞をAmerican Type Culture Collection(Manassas、VA、米国)から得た。タモキシフェン(TAM)、ニワトリオバルブミン、ストレプトマイシン、L−グルタミン、ペニシリン、4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)、3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸(HNBA)、2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHB)、プロテアーゼインヒビターカクテル、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、デオキシコール酸ナトリウム及びオルトバナジン酸ナトリウムをSigma(St Louis、MO、米国)から得た。スルフェニルハライド薬剤及び2−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBS、重形態及び軽形態)をShimazu Biotech(京都、日本)から得た。Tris(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)塩酸塩をPierce(Rockford、IL、米国)から得た。Deep Purple蛍光色素、ジチオスレイトール(DTT)及び西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体をGE HealthCare(Uppsala、スウェーデン)から得た。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA)及びポリビニリデンジフルオリドメンブレン(PVDF)をBio−Rad(Hercules、CA、米国)から得た。C18 Zip TipをMillipore(Bedford、MA、米国)から得た。配列決定規格の修飾トリプシンをPromega(Madison、WI、米国)から得た。ダルベッコ改変イーグル培地5(DMEM)をGibco(Grand Island、NY、米国)から得た。デキストラン活性炭処理のウシ胎児血清(FBS)をHyClone Laboratories(Pittsburg、PA、米国)から得た。抗ビンキュリン抗体及び抗PA2G4抗体をUpstate Biotechnology(VA、米国)から得た。抗サイトケラチン19抗体及び抗GRP78抗体をSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz Inc、CA、米国)から得た。Trizol及び逆転写酵素をInvitrogen(CA、米国)から得た。cDNA合成及びRT−PCRにおいて使用されたオリゴヌクレオチドプライマーはSigma Proligo(Sigma、シンガポール)から合成された。
MCF−7乳がん細胞を、10%のFBS、100U/mLのペニシリン、100U/mLのストレプトマイシン及び2mMのL−グルタミンが補充されたDMEMにおいて培養した。TAM処理の前に、細胞をPBSで洗浄し、5%のデキストラン活性炭処理FBSを含むフェノールレッド非含有DMEMにおいて24時間維持した。その後、細胞を40%〜50%のコンフルエンスで10μMのTAMにより処理し、24時間及び48時間で集めた。コントロールとして、姉妹培養物を等体積のビヒクル(0.1%エタノール)により処理した。
実施例3−タンパク質の抽出及びNBS標識化
TAM処理されたMCF−7細胞及びコントロールのMCF−7細胞を2DE溶解緩衝液(7Mの尿素、2Mのチオ尿素、4%のCHAPS、1mMのPMSF、50μg/mLのDnaseI、50μg/mLのRnaseI及びプロテアーゼインヒビターカクテル)において溶解し、抽出されたタンパク質を、2Dサンプルクリーンアップキット(Bio−Rad)を使用して8M尿素/5mM EDTAに緩衝液交換した。タンパク質をBradford法(Bradford、1976)によって定量し、100μgの各タンパク質ライセートを、振とうとともに、25μLの酢酸における20倍モル過剰の12C(軽)−又は13C(重)−2−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBS)により暗所で標識した。NBS標識化では、12C又は13CのNBS成分がトリプトファン残基に選択的に導入され、これにより、6Daの質量差が、軽いNBS標識トリプトファンペプチドと、重いNBS標識トリプトファンペプチドとの間でもたらされる。その後、質量分析法(MS)を使用して、ペプチドピーク対の強度比を求めることができ、これにより、それぞれの軽い集団及び重い集団の相対的な定量化がもたらされる(図1A)(Kuyama他、2003)。
一次元目の分離の前に、それぞれのIPGストリップ(18cm、pH4〜7、GE HealthCare)を340μLの再水和緩衝液(7Mの尿素、2Mのチオ尿素、4%のCHAPS、0.5%のIPG緩衝液(pH4〜7)及び20mMのDTT)により8時間再水和した。一次元目の分離をIPGphor IEFシステム(GE HealthCare)で行った。80μLの溶解緩衝液における100μgのタンパク質ライセート、20mMのDTT及び0.5%のIPG緩衝液(pH4〜7)を、カップローディングにより陽極側にアプライした。その後、ストリップを、20℃において、200Vで3時間、500Vで1時間、500Vから8000Vまで7時間、その後、67,000Vhに達するまで8000Vでフォーカスさせた。フォーカス後、IPGストリップを2段階で平衡化した:(1)50mM Tris−HCl(pH8.8)、6M尿素、30%グリセロール、2%SDS、1%DTT及び微量のブロモフェノールブルーにおいて15分;(2)2.5%のヨードアセトアミドをDTTの代わりに含有する類似する溶液において15分。
蛍光標識されたタンパク質のゲルスポットを切り出し、ゲル内トリプシン消化を、Xciseロボットシステム(Shimazu Biotech、京都、日本)を使用して行った。自動操作では、消化前に、ゲル片を水により2回洗浄し、100%アセトニトリル(ACN)により収縮させ、乾燥することが行なわれた。30μLのトリプシン(50mM重炭酸アンモニウム(pH8.5)における3.33ng/μL)をそれぞれのゲルプラグに加え、消化を振とうとともに30℃で一晩行った。その後、サンプルを清浄化し、C18 Zip Tipにより濃縮した。
NBS/2DE/MSに関連する生物学的変動及び実験的変動を調べるために、また、タンパク質の量をNBS/2DE/MS分析及び従来の2DE分析の間で比較するために、本発明者らは一連のPearson相関検定を適用して、研究中のこれら2つのデータセットの類似性を評価した。何らかの認められた相関値の有意性を求めるために、ブートストラップ並び換え検定を、比較されているこれら2つのデータセットの指標を入れ換え、ランダム化されたデータセットについての相関係数を再計算することによって行った。相関検定については、何らかの認められた相関値の有意性を求めるために、ブートストラップ並び換え検定を、比較されているこれら2つのデータセットにおけるタンパク質の順序を入れ換え、ランダム化されたデータセットについての相関係数を再計算することによって行った。この手順を10,000回繰り返し、ランダム化された係数が、認められた値を超える頻度をコンピューター計算し、これを経験的p値として反映させた。
全細胞ライセートを、TAM処理された細胞及びコントロールの細胞を、1mMのPMSF及び1mMのオルトバナジン酸ナトリウムを含有するRIPA緩衝液(0.15MのNaCl、50mMのTris−HCl(pH7.4)、1mMのEDTA、1%のTriton X−100、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS)において溶解することによって調製した。ライセートを、BSAを標準物として使用してBradford試薬により定量した。等量の細胞ライセート(50μg)を12%SDS−ポリアクリルアミドゲルで泳動し、PVDFメンブレンに電気ブロットした。ブロットを、抗ビンキュリン抗体、抗サイトケラチン19抗体及び抗GRP78抗体によりそれぞれプローブした。メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体とインキュベーションした後、反応性を、化学発光検出キット(Bio−Rad)を使用してX線フィルム(Kodak)で可視化した。
cDNA合成及びRT−PCRのために、総RNAを、Trizol試薬を使用してTAM処理のMCF−7細胞から抽出した。RNAを定量し、等量のRNAサンプルを2%アガロースゲルで電気泳動して、正常化を確認した。等量のビヒクル処理及びTAM処理のRNAサンプルを、オリゴdTプライマーを製造者により提案される条件で使用してSuperscript II逆転写酵素によって逆転写した。RT−PCRを、PA2G4特異的プライマー及びβ−アクチン特異的プライマーを使用してcDNAから行った。この研究で使用されたオリゴの配列は、PA2G4−RTF:CACGTGCCTTCTTCAGTGAG(配列番号58);PA2G4−RTR:ACTCTGGAGGAGGGCCTTTA(配列番号59);β−アクチン−RTF:CGGGAAATCGTGCGTGACATT(配列番号60);β−アクチン−RTR:TGATCTCCTTCTGCATCCTGT(配列番号61)であった。
その後、我々は、NBS/2DE/MS法を、TAM又はビヒクルのいずれかにより処理されたMCF−7乳がん細胞のプロファイリングを行うことによって、複雑な生物学的サンプルに適用した。最初に、比較の基礎を提供するために、MCF−7サンプルを、従来の2DEプラットフォームを使用して分析した。この従来の2DE分析では、TAM処理のMCF−7細胞及びビヒクル処理のMCF−7細胞についての三連のゲルを作製し、Deep Purple蛍光標識化により可視化し、PDQuestを使用して、蛍光標識強度における違いを特定した。得られた2DEゲルは、TAM又はビヒクルのいずれかにより処理されたサンプルについて非常に類似したタンパク質パターンを示し、85%〜95%の一致率がそれぞれのゲルにおけるおよそ340個のタンパク質スポットにわたって存在した。定性的には、1つのタンパク質スポットがTAM処理の細胞において特徴的であり、一方、7個がビヒクル処理の細胞において特徴的であった。量的レベルでは、27個のタンパク質スポット及び47個のタンパク質スポットが、TAM処理したとき、2倍を超える強度の増大及び低下をそれぞれ示した(図11及び表3)。次に、TAM処理の細胞及びコントロールの細胞に由来する同じタンパク質ライセートをNBS/2DE/MS分析にもまた供した。
最後に、NBS/2DE/MSから得られた量的情報の有効性を確認するために、我々は2つの代表的なタンパク質についての免疫ブロッティング実験を行った。TAM又はビヒクルにより24時間又は48時間処理されたMCF−7細胞の独立したバッチに由来する総細胞ライセートを1Dゲルで分離し、タンパク質特異的抗体により免疫ブロッティングした(図10)。78kDaのグルコース調節タンパク質(GRP78)(多剤耐性タンパク質)は、NBS/2DEマップにおいて示される4つのイソ型を有した(図4におけるスポット15〜スポット18)。NBS(13C/12C)比率及び2DE定量化の結果に基づいて、4つすべてのイソ型の発現が、48時間のTAM処理を行ったとき、増大することが予想された(表1及び図5)。抗GRP78による免疫ブロッティングでは、TAM処理後の24時間でさえ、このタンパク質のアップレギュレーションが確認され、この増大した発現が48時間まで安定していた(図10)。同様に、5個のCK19イソ型が2DE分析によって特定された(図4におけるスポット19〜スポット23)。従来の2DE画像分析に基づいて、スポット19を除くすべてが、48時間のTAM処理を行ったとき、(2倍を超える)著しい増大を示した。しかしながら、NBS/2DE/MS定量化に基づいて、CK19イソ型のすべてが、TAM処理したとき、明確なダウンレギュレーションを示した(図5におけるスポット19〜スポット23)。抗CK−19抗体による免疫ブロッティングでは、TAM処理を48時間行ったとき、このタンパク質のダウンレギュレーションが疑いなく確認された(図10)。このデータは、NBS/2DEに基づくタンパク質定量化法が、2DEのみの定量技術と比較して、個々のタンパク質に関するより正確な量的情報を提供する可能性が高いことを示している。
実施例11−乳がん細胞におけるPA2G4のプロテオミクス。a)2つの乳がんセルライン(MCF−7及びHCC−38)及びCRLセルラインの2DE分析では、PA2G4が、ER−のセルラインではなく、ER+のセルラインにおいて過剰発現したことが示された。
b)MCF−7細胞におけるPA2G4の過剰発現はタモキシフェン処置によって抑制することができる。NBS分析を使用したとき、5倍の低下が見出され、2DE分析を使用したとき、3倍の低下が見出された。
PA2G4タンパク質に対する好適な抗体を商業的供給元から入手することができ、当分野で知られている任意の免疫学的結合/ハイブリダイゼーション反応においてPA2G4を検出及び/又は定量するために使用することができる。例えば、PA2G4のポリクローナル抗体をAbnova Corporation(台湾)から入手することができる(製品番号H00005036−A01)。これは、部分的組換えPA2G4免疫原に対して惹起されたマウスポリクローナル抗体である。あるいは、別の一例が、Upstate(米国)から入手可能な、ウサギから惹起された抗Ebp−1ポリクローナル抗体である(製品番号07−397)。
当業者は、好適なベクターを選択し、PA2G4遺伝子配列をその遺伝子のその後の発現のためにベクターに挿入することができる。PA2G4について、PA2G4が挿入されたベクターが市販されている。例えば、Origene(米国)は、製品番号SC103017として、PA2G4配列をそのpCMV6−XL6ベクターに有する。
本発明は、ER+乳がん細胞及びER+乳がん疾患患者におけるPA2G4遺伝子及びPA2G4タンパク質の示差的発現、並びに、その発現におけるタモキシフェン(TAM)の抑制作用を開示する。この知見に基づいて、本発明は、対象におけるER+乳がん疾患を診断又は予後判定するための方法、及び、対象が、乳がん疾患を発症する増大した危険性にあるかどうかを明らかにするための方法を提供する。さらに、本発明は、PA2G4遺伝子及びその対応する遺伝子産物を使用して乳がん疾患を処置又は防止するための治療的方法及び予防的方法を提供する。
PA2G4の遺伝子/タンパク質発現と、前記分子発現に対するTAMの阻害的効果との関係性の我々の観察結果、並びに、2つの乳がん患者コホートにおける生存データ研究に基づいて、我々は、PA2G4遺伝子/タンパク質が、乳がんの治療をモニターするための潜在的用途を有すると考えている。さらなる研究のために、我々は、siRNAを、siRNAのトランスフェクションの後でのER+細胞(例えば、MCF−7)の生理学的変化を観測するための遺伝子サイレンシングのために使用する。その場合、我々は、ER+細胞の生存におけるPA2G4遺伝子の役割を評価することができ、また、我々が、PA2G4遺伝子を特異的に阻害することによってER+のがん細胞を抑制することができるかどうかを明らかにすることができる。そのようなアッセイは用量依存的な経時的応答研究が可能であり、血清及び他の体液サンプルへの具体的な適用を有する。結果は、乳がん患者において治療をモニターするためにPA2G4を使用するという実現可能性を示すことができる。
細胞増殖異常(例えば、乳がんなど)を処置するための分子を、PA2G4遺伝子配列(配列番号1)又はPA2G4タンパク質配列(配列番号2)を使用して調製することができる。当業者は、PA2G4の遺伝子又はmRNAに対して相補的な核酸(例えば、siRNAなど)を、mRNAの翻訳を阻害するか、又は低下させるために、当分野で知られているいかなる方法によっても作製することができる。同様に、PA2G4タンパク質に基づく抗体(例えば、実施例10において示される抗体など)を、PA2G4タンパク質に結合し、従って、PA2G4タンパク質の作用を不活性化する抗体を作製するために、当分野で知られているいかなる方法によっても惹起させることができる。そのような治療用分子は、好適な賦形剤、ビヒクル又はキャリアと混合し、所望される治療効果を得るために疾患組織又は疾患細胞に投与することができる。具体的には、所望される治療効果は、PA2G4の遺伝子及び/又はタンパク質の発現を低下又は減少させることである。
実施例17−キット
本発明はまた、PA2G4遺伝子、その遺伝子転写物、遺伝子産物、バリエーション又はフラグメントに対して相補的又はハイブリダイゼーション可能である少なくとも1つのバイオマーカーを含むキットを提供する。そのような相補的又はハイブリダイゼーション可能なバイオマーカーには、PA2G4遺伝子あるいはその遺伝子産物又はフラグメント又はバリエーションを認識し、これに結合する核酸プローブ、並びに、PA2G4遺伝子産物又はそのフラグメントを認識し、これに結合する抗体が含まれる。十分な相同性が、相補的なバイオマーカーによる遺伝子又はタンパク質の認識を可能にするために存在する限り、遺伝子は野生型又はその変異型が可能であり、タンパク質は野生型又はその変異型が可能である。相補的又はハイブリダイゼーション可能な生体分子は標識することができ、従って、細胞増殖性疾患の予後評価(細胞増殖性疾患に対する感受性を予測すること)のために、又は、細胞増殖性疾患の診断のために、又は、疾患状態の重篤度を示すために、又は、一連の処置の効力をモニターするために使用することができる。
本研究において、本発明者らは、敗血症患者におけるアポトーシス上皮の有用な血清マーカー(de Graauw他、2005)であることが示されている別のTAM調節タンパク質(CK18ネオエピトープM30)を見出した。アポトーシス時において、DNAの断片化、核の凝縮及びCK18の切断は既知の事象であり、また、M30ネオ抗原と呼ばれるCK18におけるネオエピトープが、初期のカスパーゼ切断事象のとき、利用可能になる。CK18のTAM媒介によるダウンレギュレーションが認められることにより、CK18のダウンレギュレーションの測定が薬物応答性の尺度としてTAM処置患者において有用であることが示される。注目すべきことに、TAMが乳がんについての最初のホルモン治療であるとしても、TAM治療の大きな有害な副作用は、望ましくない子宮内膜増殖である。そういうものとして、CK18のダウンレギュレーションは、乳がんに対する素因を示し、CK18は乳がんについてのバイオマーカーとして有用である。
方法
IHC(免疫組織化学的)染色の最適化を、PA2G4抗体(Ab)についてのIHC染色条件を最適化する目的で乳房組織マイクロアレイに対して行った。4つの異なる抗原回復法を、一次抗体の異なる濃度を用いて陽性コントロールの細胞ブロックに対して適用した。1:50、1:100、1:200及び1:400(体積に基づく比率)の希釈度を試験した。
染色された陽性コントロール組織のスライドが最適化の後で病理学者によって検査された。最適な条件(具体的な抗原回復法及び具体的な一次抗体希釈を含む)を、病理学者の助言を聞いた後で決定し、乳房組織マイクロアレイに適用した。
I.溶液:
クエン酸(pH6.0)緩衝液
10.5gのクエン酸
2MのNaOHによりpH6.0に調節する(約65mL)
脱イオン水により5Lにする
(pHが高ければ、クエン酸を加え、pHが低ければ、NaOHを加える。)
Tris−EDTA(pH9.0)緩衝液
12gのTris塩基
1gのEDTA
脱イオン水により500mLにする
0.2MのHClによりpH9に調節する
DAKO(pH6.0)緩衝液
60mlのDako(10x)(Cat.S2369)標的回復、脱イオン水により600mLにする。
DAKO(pH9.0)緩衝液
60mlのDako(10x)(Cat.S2367)標的回復、脱イオン水により600mLにする。
TBS洗浄緩衝液(pH7.6)10x
0.5M Tris 60.6g
9(wt/v)%NaCl 90g
脱イオン水により1Lにし、HClを加えて、pH7.6に調製する。
脱パラフィン化の前に、アレイのスライドは室温で60分間保たなければならないか、又は、オーブンにおいて、水平位置で20分間、60℃で加熱されなければならない。スライドを金属トレイにおいて整列させる。
1.スライドをキシレンに5分間浸漬し、新しいキシレンで1回、5分間繰り返す(キシレンは毒性である)。
2.スライドを100%エタノールに5分間浸漬する。
3.スライドを95(v/v)%エタノール/H2Oに5分間浸漬する。
4.スライドを70(v/v)%エタノール/H2Oに5分間浸漬する。
5.スライドを洗浄のために流水に入れる。
方法A.クエン酸塩緩衝液(高圧ポットにおいて加熱される)
1.2Lのクエン酸塩緩衝液をステンレス製圧力鍋において10分間〜15分間沸騰させる。
2.緩衝液が沸騰したら、スライドを垂直にポットに入れ、ふたをしっかり閉める。ふたの上の2つのボタンが持ち上がった後、時間を3分計り始める(スライドを鍋の底に直接に触れさせない)。
3.3分後、ポットを取り出し、流しにおいて流水下で冷却する。圧力は、ノブを回すことによって解放することができる。圧力を解放した後、ふたを開け、スライドを流水下に置いて冷却する。
1.600mlの緩衝液をプラスチックジャーに注ぐ。
2.スライドをプラスチックトレーにおいて整列させ、緩衝液に移す。
3.ジャーをプラスチックフィルムで包み、数個の穴を上部に開ける。
4.ジャーを電子レンジに入れる。出力を5に設定し(10段階の5の出力、中レベルで)、時間を25分に設定する(緩衝液が、透明ではなく、乳白色になる)。
5.ジャーを取り出し、ジャーを流しにおいて流水下に置く。溶液が再び透明になり得る。
6.冷却後、スライドを、水の入った容器の中に取り出す。
方法C.DAKO(pH6.0)緩衝液(B.のような方法)
方法D.DAKO(pH9.0)緩衝液(B.のような方法)
1.スライドを軽く振って乾燥させ、ペン(DAKO、S2002)を使用して、組織の領域の周りを描く。組織の周りにペンによって描かれた円により、液体(例えば、抗体溶液、洗浄緩衝液など)に対するバリアが提供される。
2.スライドを軽く振って乾燥させ、ブロッキング溶液(DAKO、S2023)を組織に滴下する。10分間インキュベーションする。
インキュベーション期間中に溶液に泡がないことを確認する。
3.スライドから液を除き、脱イオン水によりすすぎ洗浄する。スライドをラックに入れ、流水下で5分間洗浄する。
4.スライドをプラスチックトレーに水平に置き、TBSを5分間注ぐ。
5.一次Abを抗体希釈液(DAKO、S0809)で希釈する。
6.スライドから液を除き、スライドを軽くたたく。200uLの希釈されたAbを組織の上に加え、30分間インキュベーションする(泡を立てさせない)。
7.スライドを引き上げ、TBSで満たす。液を除き、軽く振る。
8.TBSをスライドに注ぎ、5分間待つ。この期間中、さらにTBSを時々加えて、スライドが乾燥することを避ける。
9.スライドから液を除き、スライドをハンドタオルで軽くたたく。エンビジョンキット(DAKO、S5007)から白色ボトル(Dako REAL(商標)EnVision(商標)HRPウサギ/マウス)を取り出し、数滴を滴下し、組織を30分間覆う。
10.スライドから液を除き、スライドをTBSにより洗浄する。TBSをスライドに注ぎ、5分間待つ。
11.1mlの基質緩衝液を20μLのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン:毒性)と混合する。それらを使用前に混合する。基質緩衝液及びDABの両方がエンビジョンキット(DAKO、S5007)に含まれる。
12.スライドから液をTBSとともに除き、軽くたたいて乾燥させ、DAB混合物をスライドに滴下し、10分間インキュベーションする。
13.スライドを脱イオン水により洗浄する。
14.スライドをH/Eラックに整列させ、流水下に5分間置く。
15.組織が青く染色されるまで、スライドをヘマトキシリンの中に2分間入れ、スライドをPBS(リン酸塩緩衝化生理的食塩水)に10秒間入れる。スライドを流水下で10分間洗浄する。
16.スライドを一連の溶液において脱水する:70%エタノール、95%エタノール、100%エタノール(4回)、キシレン(2回)。それぞれ1分間。
17.スライドを取り付け用装置に載せる。
腫瘍組織マイクロアレイでのPA2G4のIHC染色は96.5%(すなわち、86個中83個の腫瘍組織)の陽性染色(褐色に着色された)を示した。そのような陽性染色された腫瘍組織の中で、40.7%(すなわち、86個中35個)の腫瘍組織が悪性度3の陽性染色であった;36%(すなわち、86個中31個)の腫瘍組織が悪性度2の陽性染色であった;20%(すなわち、86個中17個)の腫瘍組織が悪性度1の陽性染色であった。具体的には、正常な組織に対するPA2G4についてのIHC染色の観測結果が図13(A)に示され、挿入図は正常な組織の拡大部を示す。
このタンパク質は、良好なバイオマーカーであると見なすことができる。
方法
I.ウエスタンブロッティング
A.タンパク質調製
1.目的とする組織をメスにより薄く切って、適切なサイズのフラグメントを得る。
2.組織の表面における血液及び他の混入物を除くために、薄く切った組織をPBSで1回〜2回、30秒間洗浄する(混入の程度に依存する、より多くの洗浄が、ひどく汚れた組織については必要となる)。
3.組織を、乳棒及び乳鉢を使用して液体窒素中でより小さいフラグメントに粉砕する。
4.組織フラグメントを、250mMスクロースを含有するエッペンドルフチューブに集め、30秒間、2回〜3回洗浄する(血液汚染の程度に依存する)。
5.それぞれの洗浄工程の後で8000rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てる。
6.スクロース洗浄の後、ペレットを取り出し、微粉末に完全に粉砕する。
7.粉末をエッペンドルフチューブに集め、タンパク質を、Calbiochem Subcellular Proteome Extraction Kit(Calbiochem)を使用して抽出する。
8.多く存在する血漿タンパク質を、アルブミン・IgG除去キット(GE HealthCare)、その後で、Multiple Affinity Removal Column(Agilent Technology)を使用することによってタンパク質ライセートから除く。
9.除去処理後のタンパク質ライセートの緩衝液をSDSサンプル緩衝液(2(wt/v)%SDS、20(wt/v)%グリセロール、120mM Tris(pH6.8)、及び、160mM DTT)に交換し、タンパク質濃度を測定する。
Bradfordのクーマシーブルー法に従う。ウシ血清アルブミン(BSA、2mg/ml)を標準物として使用する。
1.BSAストック液を1mg/mlに希釈し、500μlの脱イオン水(d−H2O)におけるBSA標準物の濃度系列(0μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg)を調製する。
2.1μlのストック溶解緩衝液を標準物の系列溶液に加える。
3.サンプルを、1μlの細胞ライセートを500μlのd−H2Oに加えることによって調製する。
4.500μlのクーマシーブルー試薬を加え、混合する。
溶液を過度に長く室温で混合したままにしない。沈殿が生じる。
5.吸光度を595nmで読み取る。
細胞ライセートを−20℃で保存する。総体積が大きいならば、細胞溶解物を0.5mlのエッペンドルフチューブに小分けする。
1.15分間絶えず撹拌しながら15mlの分離用ゲルをフラスコにおいて調製する。
10%SDS分離用ゲル:
30(wt/v)%アクリルアミド/Bis 4.95ml
1.5M Tris−HCl(pH8.8) 3.75ml
10(wt/v)%SDS 0.15ml
d−H2O 6ml
注入前に、
TEMED(N,N,N,N−テトラメチルエチレンジアミン) 7.5μl
10(wt/v)%APS(過硫酸アンモニウム) 75μl
2.手袋を着用して、プレートを95%エタノールにより清浄化する。Kimwipesにより乾燥する。プレートを組み立て、プレートをプレートホルダーに据える。短い方のプレートが外に向いている。
3.TEMED及び10%APSを分離用ゲル溶液に加え、しばらく撹拌する。ピペットを使用して、溶液を短い方のプレートの上端の約0.5cm上までプレート間のすき間に加える。直ちに少量のH2O飽和ブタノールを加えて、分離用ゲルの上端を覆う。
4.実験台で1時間放置する。プレートの底部からの漏れがないことを確認する。
5.ブタノールを除き、ゲルの表面のd−H2Oにより清浄化する。プレートをKimwipeにより乾燥する。
6. 5mlの濃縮用ゲルを作製する:
4%SDS濃縮用ゲル:
30(wt/v)%アクリルアミド/Bis 0.66ml
1M Tris−HCl(pH6.8) 1.28ml
10(wt/v)%SDS 50μl
d−H2O 3ml
注入前に、
TEMED 5μl
10(wt/v)%APS 25μl
7.濃縮用ゲルを短いプレートの上端まで分離用ゲルに載せる。10ウエルのコームをプレートのすき間に直ちに挿入する。
8.重合させるために少なくとも5時間放置する。
9.コームを慎重に取り出し、ゲルの表面をd−H2Oにより洗浄する。ゲルを乾燥する。
10.500mlの泳動用緩衝液(25mM Tris−HCl、0.2Mグリシン、0.35(wt/v)%SDS)を調製する。
11.ゲルを電気泳動ホルダーに固定し、タンク内に入れる。泳動用緩衝液を長い方のプレートの上端まで2つのプレートの間に注ぐ。上部チャンバーから下部チャンバーへの緩衝液の漏れがないことを確認する。緩衝液のレベルは低下し続けない。
12.タンパク質ライセートを等体積の2x負荷用緩衝液(62.5mM TrisHCL(pH6.8)、25(wt/v)%グリセロール、2(wt/v)%SDS、5(wt/v)%メルカプトエタノール及び0.01(wt/v)%ブロモフェノールブルー)と混合する。
13.溶解物(5μg/ウエル)を二連で負荷する。
14.電気泳動を、色素がゲルの底に到達するまで150Vで1時間行う。
転写緩衝液:60mM Tris、40mMグリシン及び15(v/v)%メタノール(pH9.2)
1.ゲルを200mlの転写緩衝液に30分間浸漬する。
2.PDVFメンブレンをメタノールで15秒間湿らせ、脱イオン水ですすいだ後、転写緩衝液に少なくとも15分間浸漬する。2枚のろ紙を転写緩衝液に15分間浸漬する。
3.転写スタックをプレートの上に下記の順で組み立てる:
+ろ紙、メンブレン、ゲル、ろ紙−
注意:a.メンブレン及びろ紙をゲルと同じサイズで切る。
b.メンブレンと、ゲルとの間における気泡を避ける。
4.電源:15〜20V;時間:30〜45分(電力及び時間をゲルのサイズに従って調節する)。
1.カセットを開ける。
2.転写メンブレンをブロッキング緩衝液(20mM Tris塩基(pH7.6)、150mM NaCl、0.1(v/v)%Tween−20、5(v/v)%脱脂乳)に入れ、ブロットを4℃で一晩インキュベーションする。
3.ブロッキング緩衝液を除き、メンブレンを、洗浄緩衝液を10分毎に交換しながら、洗浄緩衝液(20mM Tris塩基(pH7.6)、150mM NaCl、0.1(v/v)%Tween−20)で撹拌しながら30分間すすぎ洗浄する。
4.ブロッキング処理後、メンブレンを一次抗体とインキュベーションする。
5.すすぎ洗浄の後、一次抗体緩衝液をメンブレンからデカンテーションし、メンブレンを、洗浄緩衝液を10分毎に交換しながら、洗浄緩衝液で撹拌しながら30分間すすぎ洗浄する。
6.二次抗体を、通常の場合には1:50,000で、ブロック緩衝液で希釈する(西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体)。室温で1時間〜2時間インキュベーションする。
7.二次抗体緩衝液を除き、メンブレンを、洗浄緩衝液を10分毎に交換しながら、洗浄緩衝液で撹拌しながら30分間すすぎ洗浄する。
1.ECL(Enhanced Chemiluminescence)試薬(溶液A及び溶液B(これらはGE HealthCare(英国)から得られる)の等体積混合物)を調製する。
2.試薬をメンブレンの上に加え、5分間反応する。
3.ブロットをVersaDoc5000にさらし、バンドのパターンを、Quantity Oneソフトウエアを使用して分析する。
この分析のために使用された組織を、Singapore National Cancer Center Tissue Repositoryから、独立した組織病理学者による2回の検査の後で得た。正常な乳房組織を美容外科患者から得た。
タンパク質抽出物の調製を、本質的には、Ou,K.、Kesuma,D.、Ganesan,K.、Yu,K.他、J.Proteome Res.、2006、5、2194〜2206に記載されるように行った。簡単に記載すると、薄く切った組織をPBSで洗浄して、血液及び他の混入物を除いた。粉砕した組織を、7Mの尿素(Bio−Rad)、2Mのチオ尿素(Fluka Chemie)、4%(w/v)のCHAPS(GE HealthCare)、1mMのPMSF(Sigma)、50μg/mLのDnase(Boehringer Mannheim)、50μg/mLのRnase(Boehringer Mannheim)、及び、プロテインインヒビターカクテル(Sigma、1mL/108細胞)からなるカクテルにより破砕した。得られた細胞ライセートをプローブ超音波処理器(Misonix Inc.、NY、米国)により超音波処理し、40,000rpmで20分間遠心分離して、細胞破片を除いた。その後、抽出されたタンパク質を、2Dサンプルクリーンアップキット(Bio−Rad)を使用して、8M尿素及び5mM EDTAに緩衝液交換した。
ウエスタンブロティングのとき、我々は、ER+(エストロゲン受容体)陽性である3名の乳がん患者に由来する抽出物の混合物、及び、正常者に由来する5つの抽出物をそれぞれ使用した。
PA2G4のバリデーションが図15に示される。図15(A)は、抗アクチンを参照として使用する、がんサンプル及び正常なサンプルにおけるPA2G4に対するウエスタンブロティングの結果を示す。図15(A)における各バンドが吸光度ユニットでの積分値として測定され、PDQuestソフトウエアによって計算される。図15(B)は、がんサンプル及び正常なサンプルにおけるそれぞれ、PA2G4のバンドの吸光度ユニットでの得られた積分値を示す。図15(A)及び図15(B)の両方において、ER+はがんサンプルを表し、TNTは正常なサンプルを表す。図15(B)における垂直軸はバンドの吸光度ユニットでの積分値を表す。これらの図から、乳がんサンプルは、正常なサンプルとの比較において過剰発現を明確に示す。乳がん組織における類似するアップレギュレーションが個々のサンプル及びセルラインにおいてもまた観測される(データは示されず)。
配列番号59は、逆転写リバースプライマーである。
配列番号60は、ベータ−アクチン逆転写フォワードプライマーである。
配列番号61は、ベータ−アクチン逆転写リバースプライマーである。
Claims (42)
- 対象における細胞増殖異常の存在、素因、及び/又は、重篤度を検出及び/又は定量化する方法であって、
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の存在、又は、素因、及び/又は、重篤度が示されるものである方法。 - 対象における細胞増殖異常のための処置の効力をモニターする方法であって、
(a)対象からの少なくとも2つのサンプルであって、それぞれのサンプルが異なる時点で得られるサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)少なくとも2つのサンプルにおけるPA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を比較することを含む方法。 - 対象における細胞増殖異常の結果を予後判定する方法であって、
(a)対象からの少なくとも1つのサンプルを用意すること;
(b)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;
(c)PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象における細胞増殖異常の予後が示されるものである方法。 - 前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも1つの対象である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子、そのRNA及び/又は変異は、ヒトPA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異であり、前記PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントは、ヒトPA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記検出は、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントを少なくとも1つのスルフェニルハライド試薬により標識し、その後、2次元ゲル電気泳動及び質量分析法によって行う、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記スルフェニルハライド試薬は2−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBS)である、請求項6に記載の方法。
- 対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異の発現を変化させることを含む方法。
- 前記PA2G4遺伝子は、配列番号1に示される配列を有する、請求項1〜3及び8のいずれかに記載の方法。
- 前記変化させることは、前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な核酸を投与することによって得る、請求項8に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はDNA又はRNAである、請求項10に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション可能な核酸はsiRNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記変化させることは、前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得る、請求項8に記載の方法。
- 対象における細胞増殖異常を処置する方法であって、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を変化させることを含む方法。
- 前記方法は、配列番号2のアミノ酸配列を有するPA2G4タンパク質の発現を変化させることを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記変化させることは、前記PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントのアミノ酸配列の全体又は一部に結合するポリペプチドを投与することによって得る、請求項14に記載の方法。
- 前記結合するポリペプチドは抗体である、請求項16に記載の方法。
- 前記変化させることは、前記PA2G4タンパク質のアミノ酸配列の全体又は一部にハイブリダイゼーション可能な化合物を投与することによって得る、請求項14に記載の方法。
- 前記発現を変化させることは、前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を低下させることを含む、請求項8及び14のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つのタンパク質及び/又はそのフラグメントの発現における変動を引き起こす少なくとも1つの薬物についてスクリーニングする方法であって、
(a)少なくとも1つの薬物を少なくとも1つの対象に投与すること;
(b)少なくとも1つのタンパク質を前記対象から得ること;
(c)前記タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸残基を少なくとも1つの試薬により標識すること;及び
(d)前記タンパク質を質量分析法によって分析し、それにより、前記少なくとも1つのタンパク質及び/又はそのフラグメントを特定し、発現の変動が生じているかどうかを明らかにすることを含む方法。 - 前記分析する工程(d)は、前記タンパク質を第1の特徴に基づいて分離し、場合により前記タンパク質を第2の特徴に基づいて分離し、前記タンパク質をイオン化し、前記分離されたタンパク質を検出及び特定することを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記タンパク質及び/又はそのフラグメントはPA2G4タンパク質及び/又はそのフラグメントである、請求項20のいずれかに記載の方法。
- 前記PA2G4タンパク質は配列番号2の配列を有する、請求項22に記載の方法。
- 前記試薬はスルフェニルハライドである、請求項20のいずれかに記載の方法。
- 前記試薬は2−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBS)である、請求項20のいずれかに記載の方法。
- 前記アミノ酸残基はトリプトファンである、請求項20のいずれかに記載の方法。
- 前記分離する工程は、質量、電荷、官能基及び等電点からなる群から選択される少なくとも1つの特徴に基づく、請求項21のいずれかに記載の方法。
- 前記分離する工程は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、二次元ゲル電気泳動(2DE)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び/又はフリーフロー電気泳動(FFE)のための工程である、請求項21のいずれかに記載の方法。
- 前記イオン化は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)、表面増強レーザー脱離/イオン化(SELDI)、ナノスプレーイオン化、大気圧化学的イオン化(APCI)、化学的イオン化(CI)、電子衝撃(EI)、高速原子衝撃(FAB)、電界脱離/電界イオン化(FD/FI)及びサーモスプレーイオン化(TSP)からなる群から選択される、請求項21のいずれかに記載の方法。
- 前記分析する工程(d)はタンデム質量分析法によって行う、請求項20のいずれかに記載の方法。
- 前記タンデム質量分析法では、四重極飛行時間型配置が使用される、請求項30に記載の方法。
- 少なくとも1つの候補を、臨床試験、実験及び/又は診断検査のために選択する方法であって、
(a)少なくとも1つの対象からの少なくとも1つのサンプルを提供すること;
(b)PA2G4遺伝子及び/又はその変異、あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を測定すること;及び
(c)前記PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントの発現を、少なくとも1つのコントロールのものと比較することを含み、発現における違いにより、前記対象が候補として好適であることが示されるものである方法。 - 前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない少なくとも1つの対象である、請求項32に記載の方法。
- 前記コントロールは、細胞増殖異常と診断されていない1つの対象である、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞増殖異常はがんである、請求項1〜3、8、14、20及び32のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞増殖異常は乳がんである、請求項1〜3、8、14、20及び32のいずれかに記載の方法。
- 前記対象は哺乳動物である、請求項1〜3、8、14、20及び32のいずれかに記載の方法。
- 前記対象はヒトである、請求項1〜3、8、14、20及び32のいずれかに記載の方法。
- 対象における細胞増殖異常の診断及び/又は予後評価のための診断及び/又は予後キットであって、PA2G4遺伝子、そのRNA及び/又は変異にハイブリダイゼーション可能な少なくとも1つの分子、並びに/あるいは、PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントに結合する少なくとも1つの分子を含むキット。
- 前記分子は、PA2G4遺伝子の転写物にハイブリダイゼーション可能なsiRNAである、請求項39に記載の診断及び/又は予後キット。
- 前記分子は、前記PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントに結合するタンパク質である、請求項39に記載の診断及び/又は予後キット。
- 前記分子は、前記PA2G4タンパク質、その誘導体、変異体及び/又はフラグメントに結合する抗体である、請求項39のいずれかに記載の診断及び/又は予後キット。
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