WO2006032769A1 - Biopuce de diagnostic du caractere metastatique ou localise d'une tumeur mammmaire, procede et kit d'utilisation - Google Patents

Biopuce de diagnostic du caractere metastatique ou localise d'une tumeur mammmaire, procede et kit d'utilisation Download PDF

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WO2006032769A1
WO2006032769A1 PCT/FR2005/002308 FR2005002308W WO2006032769A1 WO 2006032769 A1 WO2006032769 A1 WO 2006032769A1 FR 2005002308 W FR2005002308 W FR 2005002308W WO 2006032769 A1 WO2006032769 A1 WO 2006032769A1
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seq
fragments
representative
genes
nucleic acid
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Application number
PCT/FR2005/002308
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Valérie CHABAUD
Chantal D'incan
Valérie SYLVAIN-VIDAL
Véronique VIDAL
Marie Agier
Yves-Jean Bignon
Christian Pradeyrol
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Diagnogene Sa
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a solid support coated with a set of representative fragments of genes whose expression profile for all of these genes in a subject with a mammary tumor allows the diagnosis or prognosis of the metastatic or localized character said tumor, and a kit comprising such a support;
  • the subject of the invention is also a method for diagnosing or prognosing in vitro the metastatic or localized nature of a mammary tumor, where appropriate also enabling the cells to be characterized whether the cells of said mammary tumor express the estrogen receptors or not, said method using the use of the solid support.
  • Cancer can be defined very broadly as a disease linked to the proliferation and uncontrolled spread of abnormal cells of the body: these abnormal cells, called “malignant”, proliferate anarchically from a primitive home, who can relapse locally after removal, extend to adjacent tissues and spread at a distance (metastases).
  • Cancer affects about 10 million people worldwide. More than 4.4 million cases come from Asia. Europe has 2.8 million cases, North America 1.4 million and Africa 627 000 cases. Cancer is one of the leading causes of death in developed countries; In Europe and the United States, it is estimated that one in five people will die Cancer. The incidence of cancer over the last 100 years seems to be increasing, but this observation must be balanced by the fact that the probability of developing cancer increases with age, and that overall the proportion of the elderly population is also increasing .
  • breast cancer In women, breast cancer and the most common: there are thus 43,000 new cases and 11,000 deaths per year in France. Breast cancer is the leading cause of cancer death in women. It should be noted that 99% of breast cancers occurring in women, and 1% in men.
  • axillary dissection consists of removing axillary lymph nodes (armpits) and making sections of these ganglia in hematoxylin and eosin staining.
  • axillary dissection is responsible for most of the post-surgical functional symptoms of breast cancer, ranging from 10% for lymphedema.
  • PET Positron Emission Tomography
  • FDG positron-emitting radioactive marker
  • axillary dissection is the study of the sentinel lymph node.
  • the latter is defined as the first ganglion that receives the lymphatic flow of the primary tumor.
  • the sentinel lymph node technique is therefore an effective method for assessing axillary lymph node status and avoiding axillary dissection in patients with small breast cancer without clinical lymph node involvement.
  • an unaffected sentinel node excludes in theory a metastatic invasion of the rest of the armpit and thus renders the axillary dissection useless.
  • investigations on a single ganglion may be at the origin of axillary staging, the sentinel lymph node technique is not yet standardized and false negative rates are evaluated in the literature from 0 to 15%.
  • the "probes" (or representative fragments) deposited on the biochip correspond to genes whose expression levels are modified in mammary tumors, thus allowing the study of parameters such as hormonal receptivity, ganglionic invasion, the status BRCA1 / BRCA2, overexpression of erbb2, cell proliferation, cell types present in the tumor.
  • the inventors were able to identify a a set of genes whose overexpression is characteristic of ganglionic invasion and therefore of a metastatic tumor (N + tumor), and another set of genes whose overexpression is characteristic of the absence of ganglionic invasion and therefore of a tumor localized (N- tumor). These genes are listed in Tables A1, A2 and A3.
  • the determination of the ganglionic invasion, and therefore of the metastatic or localized nature of a tumor firstly requires the characterization of the expression of the estrogen receptors by the mammary tumor cells.
  • a mammary tumor is thus classified ER + when it expresses the estrogen receptors, and ER- otherwise.
  • Table A1 collects the discriminating genes for lymph node invasion overexpressed in mammary tumors that express estrogen receptors (ER + tumors).
  • Table A2 gathers the ganglionic invasion discriminant genes overexpressed in both mammary tumors that express estrogen receptors (ER + tumors) and those that do not express it (ER- tumors).
  • Table A3 collects the discriminating genes for lymph node invasion overexpressed in mammary tumors that do not express estrogen receptors (ER- tumors).
  • the subject of the present invention is a solid support coated with a set of representative fragments of genes whose expression profile for all of these genes in a subject presenting a mammary tumor allows the diagnosis or the prognosis of the metastatic nature. or localized of said tumor, characterized in that said set comprises: at least 36 fragments, each of the 36 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1 and A2, or minus 88 fragments, each of the 88 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A2 and A3, or at least 119 fragments, each of the 119 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3, and is further constituted by a maximum of 393 fragments, each of the 393 fragments being representative of a gene selected from the genes of Table B.
  • This set which comprises at least the said 36 or 88 or 119 fragments, is further constituted by a maximum of 393 fragments, each of the 393 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Table B.
  • the expression "furthermore At most, the "set” means that the set, comprising at least the 36 fragments or at least the 88 fragments or at least the 119 fragments, may further contain from 1 to 393 other representative gene fragments as defined in Table B.
  • the clearance is further constituted by 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,
  • the set comprises: at least 36 fragments, each of the 36 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1 and A2, or at least 88 fragments, each of the 88 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A2 and A3, or at least 119 fragments, each of 119 fragments being representative a separate gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3, and is further constituted at most by 200 fragments, each of the 200 fragments being representative of a specific gene selected from the genes of Table B.
  • the support whose set includes at least the 36 fragments (each of which is representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1 and A2) makes it possible to detect ganglionic invasion in the case of ER + tumors.
  • the medium whose game includes at least 88 fragments
  • each of which is representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A2 and A3 makes it possible to detect ganglionic invasion in the case of ER- tumors.
  • the support whose set comprises at least the 119 fragments makes it possible to detect ganglionic invasion both in the case of ER tumors. - and in the case of ER + tumors.
  • the tumors express the estrogen receptor (respectively ER + or ER- tumors); then, if the tumors are ER +, we will focus only on the expression profile obtained for the genes listed in Tables A1 and A2, and if the tumors are ER-, we will be interested in the expression profile obtained for these genes. genes listed in Tables A2 and A3.
  • the expression profile which is obtained using the solid support according to the present invention, contains the information relating to the expression of all the genes of which a representative fragment has been deposited on said solid support.
  • representative fragment of a gene of Table A1, A2, A3, B or Table C is meant in the present application any coding fragment (mRNA, cDNA) of one of these genes which is sufficiently to hybridize specifically, under conditions suitable for hybridization, with a mRNA or cDNA fragment present in the test nucleic acid sample or with a fragment present in the nucleic acid sample of reference, and thus makes it possible to identify said fragment present in the test or reference nucleic acid sample as being a constitutive fragment of said given gene, said gene therefore being present in the test nucleic acid sample or in the reference nucleic acid sample; when such a representative fragment of a gene of Table A1, A2, A3, B or Table C is sequenced, the sequence identified makes it possible to conclude without ambiguity that said fragment belongs to said given gene of Table A1, A2, A3, B or Table C.
  • probe is also used in this application to refer to a representative fragment.
  • the representative fragment of a gene according to the invention comprises and / or consists of at least 15, preferably 20, 25, 30, 35, 40, 45, 47, 48, 49 and particularly preferably 50 nucleotides identical to those of the fragment of the test or reference nucleic acid constituting said given gene, said gene being therefore present in the test nucleic acid and in the reference nucleic acid.
  • appropriate conditions for hybridization refers to conditions of high stringency which allow hybridization when sequences complementary to at least 80, 82, 85, 87, 89, 90, 92, 95, 97 99% gold are able to hybridize specifically.
  • hybridization or washing buffers (Corning) or the following hybridization conditions will be used:
  • Hybridization proper for 20 hours at a temperature dependent on the size of the probe for example 55 ° C for a probe of about 50 nucleotides size
  • the final wash is performed at 0.. 1X SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C for a probe of about 50 nucleotides in size.
  • the solid support used for carrying out the present invention can generally be any miniaturized support of glass or silicon. or a polymer which can be coated with nucleotide sequences of known sequence, in particular the representative fragments of genes according to the present invention deposited in an ordered arrangement, and whose function is to recognize, in a mixture, their complementary nucleotide sequences.
  • a solid support there may be mentioned, but not limited to, membranes such as high density nylon membranes (eg Performa, Genetix, New Milton, UK); micro-arnino-silane microarrays are preferably used, especially from Corning (ultraGAP TM, NY).
  • the surface of the support is treated to form a dense and regular network of microsurfaces on which the representative fragments are fixed ; the location of each of them is precisely known.
  • Such solid supports are well known to those skilled in the art, who will be able to choose the type of support to be used and the appropriate conditions for a given hybridization test.
  • the subject having a mammary tumor is preferably a mammal, and particularly preferably a human.
  • the present invention is particularly suitable for screening for metastatic breast tumors in women, but it can also be used in cases of breast cancer in humans.
  • percent identity between two nucleic acid sequences, it is meant to designate a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after their better alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed. at random and over their entire length.
  • Optimal sequence alignment for comparison can be achieved using mathematical algorithms. In a preferred, non-limiting manner, mention may be made of the various algorithms mentioned in the document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics: A Trends
  • the programs may be used: -BLAST, in particular BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing proteins and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25 (17): 3389-3402), -FASTA (Altschul SF et al, 1990, J. Mol Biol., 403-410), -Clustal W ( Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res 22, 4673-80),
  • nucleic acid may be used indifferently in the present application to designate a precise sequence of nucleotides that can correspond to both DNA and its transcripts (RNA). These nucleic acids are isolated from their natural environment.
  • At least one representative fragment of a gene selected from the genes of Tables A1, A2, A3 and B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ ID N 0 2 S 0 SEQ ID 8, SEQ ID N 0
  • SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95 to 97, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO : 133, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 149-152, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO : 133, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 149-152, SEQ
  • SEQ ID No. 422 SEQ ID NO 0434, SEQ ID NO 437, SEQ ID NO 470 and SEQ ID NO: 490-502 in Table A3, and the fragments of sequence SEQ ID NO: I5 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12-14, SEQ ID NO: 16-19, SEQ ID NO. No. 21 to 29, SEQ ID N 0 31, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 287, SEQ ED NA 0 289-310 SEQ ID NO 312 to 315, SEQ ID NO 317-319, SEQ ID NO: 322-324, SEQ ID NO: 326-336, SEQ ID No. 338 to 349, SEQ ID No. 0 351, SEQ ID No. 353 to 365, SEQ ID No. 367 to 371, SEQ ID No. 373 to 384, SEQ ID No. 386 to 397, SEQ ID No. 399 to 401, SEQ ED NA 0 403-410, SEQ ID NO 412-421, SEQ NA 0 423-433, SEQ ID NO
  • At least one representative gene fragment for the set of genes of Tables A1, A2, A3 and B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ ED No. 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38-41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 206,
  • SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO : 207 to 211, SEQ ID NO: 213 to 218, SEQ ID NO: 220 to 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 to 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 263-280, SEQ ID NO: 282-285, SEQ ID NO: 0 287, SEQ ID NO: 289-310, SEQ ID NO: 312-3. 315, SEQ ID NO: 317-319, SEQ ID NO: 322-324, SEQ ID NO: 326-336, SEQ ID NO:
  • One (SEQ ID NO: 71) or the other (SEQ ID NO : 72) of the two representative fragments of the TUBB gene (Table A3) can be used indifferently in the present invention, as can the two fragments. be used simultaneously (SEQ ID No. 71 and SEQ ID No. 72).
  • one (SEQ ID NO: 193) or the other (SEQ ID NO: 194) of the two representative fragments of the BCAR1 gene can be used indifferently in the present invention, just as the two fragments can be used simultaneously (SEQ ID No. 0 193 and SEQ ID No.
  • the set consists of 36 fragments, each of the 36 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1 and A2, or by 88 fragments, each of the 88 fragments being representative of a separate gene selected from the genes of Tables A2 and A3, or by 119 fragments, each 119 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3.
  • the set consists of 510 fragments, each of the 510 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3, and B.
  • 3 genes (TUBB, BCAR1). and CCNEl) are each represented by 2 fragments (see above).
  • the set consists of 511 fragments, each of the 511 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Tables A1, A2 and A3, and B.
  • the set consists of 512 fragments, each of the 512 fragments being representative of a gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3, and B.
  • the set is. consisting of 513 fragments, each of the 513 fragments being representative of a gene selected from the genes of Tables A1, A2 and A3, and B.
  • Such a solid support coated with a set consisting of a set of fragments each of which is representative of the genes of Tables A1, A2, A3 and B makes it possible to characterize ganglionic invasion, and therefore the metastatic or localized nature of a mammary tumor. , and also allows to determine other elements such as evaluation of patient survival, BRCA1 / BRCA2 status, cell proliferation and estrogen receptor expression by cells of a mammary tumor.
  • a second aspect of the present invention relates to a method of in vitro diagnosis or prognosis of metastatic or localized character of a mammary tumor from a sample of said tumor in a subject, characterized in that said method comprises a step in which a sample of a nucleic acid extract is deposited, where appropriate after retro-transcription, from said tumor sample, on a solid support according to the present invention, and in that the amount of nucleic acid having hybridized with the set of representative fragments deposited on said support is analyzed. . . ..
  • the method for diagnosing or prognosing in vitro the metastatic or localized nature of a mammary tumor comprises the following steps: a) the extraction of a test nucleic acid sample from tumor sample, b) labeling the nucleic acid test sample obtained in step a) using a first marker. .
  • step c) in parallel, labeling a reference nucleic acid sample with a second marker different from the first marker of step b), d) contacting the acid sample labeled nucleic acid obtained in step b) and the labeled reference nucleic acid sample obtained in step c) with the support according to the present invention under appropriate conditions for hybridization, each representative fragment of a solid support gene being capable of hybridizing with a fragment of the gene present in the labeled test nucleic acid sample and a fragment of the gene present in the reference nucleic acid sample, e) normalization, for each representative fragment of gene deposited on the support, the hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample and that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, f) the comparison, for each frag representative of a gene deposited on the support, of the standardized hybridization intensity obtained for the test nucleic acid sample labeled with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, so as to obtain an expression profile of the genes whose representative fragments
  • test nucleic acid sample is either an mRNA sample or a cDNA sample obtained after retrotranscription of this mRNA; the nucleic acid (ARKm or cDNA) contained in such a sample is in sufficient quantity to characterize the expression profile of all the genes of which a representative fragment has been deposited on the solid support.
  • the labeling of the test nucleic acid sample in step b) and that of the reference nucleic acid sample in step c) allows the emission of a detectable and quantifiable signal characteristic of the hybridization intensity obtained when a representative fragment of a given gene hybridizes with a fragment present in the test nucleic acid sample, on the other hand with a fragment present in the sample nucleic acid reference.
  • the intensity of hybridization obtained is proportional to the level of expression of the gene represented by the fragment deposited on the solid support.
  • the labeling may consist of a radio-labeling (such as 32 P, 33 P, 35 S, which can be detected using for example a gamma counter or a scintillator, autoradiography, ...), an erizmatic labeling (biotin, digoxigenin , ...), chemiluminescent labeling (luminol, dioxetane, luciferase, luciferin) or fluorescent labeling.
  • a radio-labeling such as 32 P, 33 P, 35 S, which can be detected using for example a gamma counter or a scintillator, autoradiography, Among other suitable labeling, the solid support must not be glass.
  • fluorescent marking is particularly preferred for carrying out the present invention.
  • fluorescent markers include, but are not limited to, fluorescein and its derivatives, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), coumarins, cyanines 2, 3 and
  • the two markers for the test nucleic acid sample and the reference nucleic acid sample will be selected so as to obtain two comparable signals of hybridization intensity between them.
  • reference nucleic acid sample in this application is intended to denote a pool of nucleic acid obtained from different normal and tumor cell lines. These cell lines are generally cultured on an industrial scale to produce large batches that undergo stringent quality control procedures. Such a reference nucleic acid sample serves as a control to obtain the information relating to the expression of the genes present in the test nucleic acid sample after hybridization with the representative fragments deposited on the solid support.
  • references nucleic acid sample mention may be made of, but not limited to, the "Universal human reference RNA” RNA pool, marketed by Stratagene.
  • step g) as a function of the expression profile obtained in step f) is carried out using the Principal Component Analysis method developed by the. Evry Genome and Computing Laboratory (software
  • the method according to the present invention is characterized in that the classification in step g) is determined by comparing the expression profile obtained in step f) by means of the solid support according to the invention with the profile expression as defined in Tables A1, A2 and A3.
  • the method according to the present invention also makes it possible to characterize whether the cells of the tumor mammary express or not the estrogen receptors, said method being characterized in that after step f), the expression profile of all the genes of Table C obtained by means of the solid support according to the present invention is compared. invention with the expression profile as defined in said Table C.
  • the genes of Table C constitute a group of genes selected from the genes of Tables A1, A2, A3 and B.
  • a solid support according to the present invention for detecting ganglionic invasion in both ER tumors and in ER + tumors, including this group of genes, it will also be possible to characterize whether the mammary tumor cells express (ER +) or not (ER-) the estrogen receptors: using this support, we will characterize in a first step if the tumor from which the sample was taken is an ER + tumor or ER- tumor, and in a second step, if the tumor is ER +, we will only look at the expression profile obtained for any or part of the genes listed in Tables A1 and A2, and if the tumor is ER-, we will look at the expression profile obtained for all or part of the genes listed in Tables A2 and A3.
  • the method according to the present invention is characterized in that the comparison in step f) of the normalized hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample comprises the following steps: a) calculating, for each representative fragment of a gene deposited on the support, the ratio of the normalized hybridization intensity obtained for the nucleic acid sample labeled test and that obtained for the sample of labeled reference nucleic acid, b) calculating, for each representative fragment of a gene deposited on the support, the log 2 of each ratio obtained in step a).
  • Each representative fragment of the set is generally deposited once, preferably twice, more preferably three times or even four times on the solid support.
  • the method according to the present invention is characterized in that, when each fragment of the game is deposited three times on the support, the average of 1Og 2 of the three replicates is calculated for each of these fragments.
  • the method according to the present invention is characterized in that the test and reference nucleic acid samples are RNA, preferably mRNA.
  • the method according to the present invention is characterized in that the step b) of marking the test RNA, preferably the test mRNA, of the sample with the aid of the first marker comprises the following steps i) retrotranscription of the test RNA from the sample obtained in step a), ii) incorporation of the first marker during the in vitro transcription of the test DNA obtained in step i).
  • step c) of marking the reference RNA sample, preferably reference mRNA, with the aid of the second marker comprises the following steps: i) the retrotranscription of the reference RNA from step c), ii) the incorporation of the second marker during the in vitro transcription of the test DNA obtained in step i).
  • kits comprising the solid support of the present invention are sufficiently described in the literature, and generally comprise, in addition to the solid support, reagents necessary for hybridization such as in particular markers or hybridization buffers, and. washing.
  • Figure IA Classification obtained by Multiple Component Analysis for ER + tumors (PCR, GeneAnova software, Evry genome and computer laboratory).
  • Figure IB Classification obtained by Multiple Component Analysis for ER- tumors.
  • Figure 2 Classification obtained by Multiple Component Analysis for the study of estrogen receptor (ER + / ER-) expression by mammary tumor cells.
  • RNA pool of cell lines is used as reference RNA
  • This reference pool of reference RNA is commercially available and includes a collection of RNAs obtained from a number of cell lines to cover an optimal range of genes.
  • Molecular probes are oligonucleotides of 50 bases synthesized by MWG. The sequence of some oligonucleotides is available in the MWG banks, others have been sought at the request of the inventors. These oligonucleotides are diluted to a concentration of 25 ⁇ M in a 50% DMSO solution (dimethylsulfoxide) and then deposited on Ultragaps slides (Corning, New York, US) using a robot (Microgrid II, Biorobotics, Genomic Solutions, Cambridge, UK). ). Each molecular probe is deposited in triplicate on the slide. After deposition, the DNA molecules are fixed by incubation on slides at 80 ° C. for 2 hours. A chemical treatment as defined by the company Corning is carried out. The slides are then stored at room temperature in the dark.
  • RNA are retrotranscribed in the presence of amino-allyl dUTP (Fairplay Microarray labeling kit, Stratagene, La Jolla, US).
  • the cDNAs obtained from the tumor RNAs and reference RNAs are respectively incubated with cyanine and cyanine 3 (Amersham Biosciences, Quebec, CA) which will bind to the amino-allyl group.
  • the fluorescent cDNAs are then purified and dried under vacuum. The pellet is taken up in 16 .mu.l of hybridization buffer (Corning, New York, US), followed by denaturation at 100.degree.
  • the hybridization is done with a "coverslip" which makes it possible to maintain contact between the target and the surface of the blade, at 37 ° C. and 50% humidity, during the night.
  • the slides are then washed in solutions of SDS (sodium dodecyl sulphate) and SSC (saline sodium citrate) at different concentrations. Fluorescence is detected by passing the chip through a scanner (GMS 418, Affymetrix).
  • SDS sodium dodecyl sulphate
  • SSC saline sodium citrate
  • the resulting images are analyzed with image analysis software
  • the normalization of the data is done according to the global lowess method because there is a systematic dependence between the value of the Iog 2 (ratio) and the intensity, which generally appears by high values of the Iog 2 (ratio) for values of low intensity. This method makes it possible to remove such effects. Then, the ratio of tumor / reference intensities is calculated, then the Iog 2 ratio. For each gene, the average of the Iog 2 (ratio) of the three replicates is calculated, each molecular probe being deposited three times on the chip.
  • the Student test is then used. This is a significance test that can be used when comparing two averages.
  • the t-test is calculated by performing the ratio of the difference of the averages over the standard error. A value p ⁇ 0.05 is considered significant.
  • This test is involved to evaluate the level of significance between the means of expression of the different genes between the group of samples "Sensitive” and the group of “resistant” samples.
  • the expression profiles of the discriminant genes (p ⁇ 0.05) are then studied by a principal component analysis (PCA).
  • PCA principal component analysis
  • the PCA allows to visualize the geometry of the cloud of the observations when the space with more than 3 dimensions. It proceeds in 2 steps, the determination of the axes of inertia of the cloud then its projection on the planes determined by the axes of inertia taken 2 to 2.
  • the analysis of the sphere of the correlations makes it possible to visualize the similarities between different profiles of 'expression.
  • the linear correlation between 2 profiles is equal to the cosine of the angle between the vectors corresponding to these experimental conditions (an angle of 90 ° shows a total absence of correlation).
  • the biochip used in this study can therefore be used to determine the lymph node status of a tumor, thus avoiding axillary dissection to patients.
  • Group 1 corresponds to patients whose tumors express the estrogen receptor (ER +).
  • Group 2 corresponds to patients whose tumors do not express the estrogen receptor (ER-).
  • ND Ganglionic status not determined.
  • N N + status, ganglionic invasion; N-, no ganglionic invasion.
  • ER + tumors have a better prognosis than ER tumors.
  • the data used are those of the patients studied for the characterization of ganglionic invasion.
  • Patient # 68 initially characterized ER + is classified in the group ER-.

Abstract

La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet présentant une tumeur mammaire permet le diagnostic ou le pronostic du caractère métastatique ou localisé de ladite tumeur, ainsi qu'un kit comprenant un tel support; l'invention a également pour objet un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire, le cas échéant permettant également de caractériser si les cellules de ladite tumeur mammaire expriment ou non les récepteurs aux oestrogènes, ledit procédé mettant en œuvre l'utilisation du support solide.

Description

BIOPUCE DE DIAGNOSTIC DU CARACTERE METASTATIQUE OU LOCALISE D'UNE TUMEUR MAMMAIRE, PROCEDE ET KIT D'UTILISATION
La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet présentant une tumeur mammaire permet le diagnostic ou le pronostic du caractère métastatique ou localisé de ladite tumeur, ainsi qu'un kit comprenant un tel support ; l'invention a également pour objet un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire, le cas échéant permettant également de caractériser si les cellules de ladite tumeur mammaire expriment ou non les récepteurs aux oestrogènes, ledit procédé mettant en oeuvre l'utilisation du support solide.
Le cancer peut être défini de façon très large comme une maladie liée à la prolifération et la diffusion incontrôlée de cellules de l'organisme devenues anormales : ces cellules anormales, dites « malignes », prolifèrent de manière anarchique à partir d'un foyer primitif, qui peut récidiver localement après son ablation, s'étendre aux tissus voisins et essaimer à distance (métastases).
Le cancer touche environ 10 millions de personnes dans le monde. Plus de 4,4 millions des cas proviennent d'Asie. L'Europe compte 2,8 millions de cas, l'Amérique du Nord 1,4 millions et l'Afrique 627 000 cas. Le cancer est l'une des premières causes de mortalité dans les pays développés ; en Europe et aux Etats-Unis, on estime qu'une personne sur cinq décédera d'un cancer. L'incidence des cancers sur les 100 dernières années paraît être en progression, mais cette observation doit être pondérée par le fait que la probabilité de développer un cancer augmente avec l'âge, et que globalement la proportion de la population âgée est aussi en augmentation.
Chez la femme, le cancer du sein et le plus fréquent : on note ainsi 43 000 nouveaux cas et 11 000 décès par an en France. Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer chez la femme. Il est à noter que 99% des cancers du sein apparaissant chez la femme, et 1% chez l'homme.
En Europe, la mise en place de moyens de dépistage et de prévention permet un diagnostic des tumeurs mammaires à un stade précoce, qui permet de définir ensuite une orientation thérapeutique. Un facteur pronostic important consiste à déterminer si des métastases sont présentes dans les ganglions lymphatiques ; on parle alors d'envahissement ganglionnaire ; en l'absence d'envahissement ganglionnaire, on parle de tumeur mammaire localisée.
L'une des méthodes jusqu'ici couramment employées pour caractériser l'envahissement ganglionnaire consiste à effectuer un curage axillaire, qui consiste à prélever des ganglions axillaires (aisselles) et réaliser des coupes de ces ganglions en coloration hématoxyline et éosine. Toutefois, cette technique du curage est actuellement remise en question : le curage axillaire est responsable de la plupart des symptômes fonctionnels post-chirurgicaux du cancer du sein, allant de 10 % pour ce qui est du lymphoedème
(syndrome du gros bras) à plus de 80 % de gêne et de douleurs à la mobilisation du membre supérieur. En outre, dans les pays occidentaux, la proportion des tumeurs, dépourvues d'envahissement ganglionnaire (N-) approche les 80 %, ce qui veut dire que près de 4 femmes sur 5 subissent un curage axillaire inutile. La classification des tumeurs mammaires en stade N- ( sans envahissement ganglionnaire) ou N+ ( avec envahissement ganglionnaire) est d'autant plus exacte que le nombre de ganglions prélevés est plus élevé, conduisant ainsi à des résultats présentant un certain risque d'erreur. L'examen anatomopathologique standard pour les ganglions d'un curage axillaire
(coloration des coupes) pourrait être complété par des techniques d'immunohistochimie basées sur une réaction immunologique spécifique et un contrôle morphologique des cellules immunoréactives. Cependant, l'identification de micrométastases en réalisant des coupes sériées et une immunohistochimie n'est pas envisageable en pratique courante, pour des raisons de temps et de coût sur l'ensemble des ganglions prélevés dans un curage axillaire.
Une alternative à la réalisation du curage ganglionnaire axillaire est la tomographie d'émission de positron (PET pour « Positron Emission Tomography »), une technique d'imagerie médicale de médecine nucléaire dans laquelle un marqueur radioactif émetteur de positrons est injecté in vivo (FDG-PET pour (18F)FluoroDeoxyGlucose-PET). Cette technique, très sensible, est pour l'instant trop coûteuse et peu accessible.
Une autre alternative au curage axillaire est l'étude du ganglion sentinelle. Ce dernier est défini comme le premier ganglion qui reçoit le flux lymphatique de la tumeur primaire. La technique du ganglion sentinelle est donc une méthode efficace pour évaluer le statut ganglionnaire axillaire et éviter le curage axillaire chez les patientes ayant un cancer du sein de petite taille sans envahissement ganglionnaire clinique. En effet, un ganglion sentinelle non atteint exclut en théorie un envahissement métastatique du reste de l'aisselle et rend donc le curage axillaire inutile. Bien que les investigations sur un seul ganglion puissent être à l'origine de la stadification axillaire, la technique du ganglion sentinelle n'est pas encore standardisée et les taux de faux négatifs sont évalués dans la littérature de 0 à 15 %. Ce taux peut être diminué par l'utilisation de techniques de biologie moléculaire telles que la RT-PCR (amplification en chaîne par polymérase — Transcription inverse ; RT-PCR pour « Reverse Transription Polymérase Chain Reaction »). Mais l'étude en biologie moléculaire s'effectue à partir . de tissu congelé, ce qui implique que Panatomopathologiste doit soustraire une partie du ganglion à l'étude histologique standard.
Ainsi, il est indispensable de pouvoir disposer d'un autre outil de diagnostic simple à mettre en œuvre, peu coûteux et fiable pour évaluer le statut ganglionnaire dans le cancer du sein.
Cet objectif a été atteint par les inventeurs désignés dans la présente demande. Ces derniers ont pu mettre au point une biopuce à ADN qui permet de définir le statut ganglionnaire de patientes ayant développé une tumeur mammaire. Les tumeurs mammaires sont hétérogènes car elles résultent de l'accumulation et de combinaisons de multiples altérations moléculaires. Les indications thérapeutiques et diagnostiques sont fondées sur des facteurs pronostics classiques (histologiques et cliniques) qui ne révèlent pas cette hétérogénéité. En effet, cela correspond le plus souvent à l'étude d'un seul gène ou produit de gène à la fois. Une caractérisation moléculaire globale et détaillée, obtenue à l'aide de la biopuce sleon l'invention, permet donc d'affiner le diagnostic, les indications thérapeutiques et donc la survie des patients.
Les « sondes » (ou fragments représentatifs) déposées sur la biopuce correspondent à des gènes dont les niveaux d'expression sont modifiés dans les tumeurs mammaires, permettant ainsi l'étude de paramètres tels que la réceptivité hormonale, l'envahissement ganglionnaire, le statut BRCA1/BRCA2, la surexpression de erbb2, la prolifération cellulaire, les types cellulaires présents dans la tumeur. Les inventeurs ont pu identifier un ensemble de gènes dont la surexpression est caractéristique d'un envahissement ganglionnaire et donc d'une tumeur métastatique (tumeur N+), et un autre ensemble de gènes dont la surexpression est caractéristique de l'absence d'envahissement ganglionnaire et donc d'une tumeur localisée (tumeur N-). Ces gènes sont listés dans les Tableaux Al, A2 et A3.
Dans la présente demande, la détermination de l' envahissement ganglionnaire, et donc du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur, passe d'abord par la caractérisation de l'expression des récepteurs aux oestrogènes par les cellules de la tumeur mammaire. Une tumeur mammaire est ainsi classée ER+ lorsqu'elle exprime les récepteurs aux oestrogènes, et ER- dans le cas contraire.
Le Tableau Al rassemble les gènes discriminants pour l' envahissement ganglionnaire surexprimés dans les tumeurs mammaires qui expriment les récepteurs aux oestrogènes (tumeurs ER+).
Le Tableau A2 rassemble les gènes discriminants pour l'envahissement ganglionnaire surexprimés à la fois dans les tumeurs mammaires qui expriment les récepteurs aux oestrogènes (tumeurs ER+) et celles qui ne l'expriment pas (tumeurs ER-).
Le Tableau A3 rassemble les gènes discriminants pour l'envahissement ganglionnaire surexprimés dans les tumeurs mammaires qui n'expriment pas les récepteurs aux oestrogènes (tumeurs ER-).
Ainsi, la présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet présentant une tumeur mammaire permet le diagnostic ou le pronostic du caractère métastatique ou localisé de ladite tumeur, caractérisé en ce que ledit jeu comprend : - au moins 36 fragments, chacun des 36 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou au moins 88 fragments, chacun des 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou au moins 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et est en outre constitué au maximum par 393 fragments, chacun des 393 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.
Ce jeu, qui comprend au moins lesdits 36 ou 88 ou 119 fragments, est en outre constitué au maximum par 393 fragments, chacun des 393 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau B. L'expression « en outre constitué au maximum par » signifie que le jeu, comprenant au moins les 36 fragments ou au moins les 88 fragments ou au moins les 119 fragments, peut en outre contenir de 1 à 393 autres fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B. De préférence, le jeu est en outre constitué par 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,
170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 391 ou 392 fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B.
De préférence, le jeu comprend : au moins 36 fragments, chacun des 36 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou au moins 88 fragments, chacun des 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou au moins 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et est en outre constitué au maximum par 200 fragments, chacun des 200 fragments étant représentatif d'un gène disctinct choisi parmi les gènes du Tableau B.
Le support dont le jeu comprend au moins les 36 fragments (dont chacun est représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2), permet de dépister l'envahissement ganglionnaire dans le cas de tumeurs ER+. Le support dont le jeu comprend au moins les 88 fragments
(dont chacun est représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3), permet de dépister l'envahissement ganglionnaire dans le cas de tumeurs ER-. Le support dont le jeu comprend au moins les 119 fragments (dont chacun est représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3), permet de dépister l'envahissement ganglionnaire à la fois dans le cas de tumeurs ER- et dans le cas de tumeurs ER+. Bien entendu, dans ce dernier cas, il convient de déterminer avant le dépistage si les tumeurs expriment ou non le récepteur aux oestrogènes (respectivement tumeurs ER+ ou ER-) ; ensuite, si les tumeurs sont ER+, on s'intéressera uniquement au profil d'expression obtenu pour les gènes listés dans les Tableaux Al et A2, et si les tumeurs sont ER-, on s'intéressera au profil d'expression obtenu pour les gènes listés dans les Tableaux A2 et A3.
Le profil d'expression, qui est obtenu en utilisant le support solide selon la présente invention, contient les informations relatives à l'expression de l'ensemble des gènes dont un fragment représentatif a été déposé sur ledit support solide.
Par l'expression « fragment représentatif » d'un gène du Tableau Al, A2, A3, B ou du Tableau C on entend désigner dans la présente demande tout fragment codant (ARNm, ADNc) d'un de ces gènes qui est suffisamment long pour s'hybrider spécifiquement, dans des conditions appropriées pour l'hybridation, avec un fragment d'ARNm ou d'ADNc présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, et permet ainsi d'identifier ledit fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou de référence comme étant un fragment constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l' échantillon d'acide nucléique test ou dans l'échantillon d'acide nucléique de référence ; lorsqu'un tel fragment représentatif d'un gène du Tableau Al, A2, A3, B ou du Tableau C est séquence, la séquence identifiée permet de conclure sans ambiguïté que ledit fragment appartient audit gène donné du Tableau Al, A2, A3, B ou du Tableau C. Le terme « sonde » est également utilisé dans la présente demande pour désigner un fragment représentatif.
Dé préférence, le fragment représentatif d'un gène selon l'invention comprend et/ou est constitué par au moins 15, de préférence 20, 25, 30, 35, 40, 45, 47, 48, 49 et de manière particulièrement préférée 50 nucléotides identiques à ceux du fragment de l'acide nucléique test ou de référence constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l'acide nucléique test et dans l'acide nucléique de référence.
L'expression "conditions appropriées pour l'hybridation" dans là présente invention désigne des conditions de forte stringence qui permettent l'hybridation lorsque des séquences complémentaires à au moins 80, 82, 85, 87, 89, 90, 92, 95, 97 or 99 % sont capables de s'hybrider spécifiquement.
Les conditions de forte stringence sont largement décrites dans la littérature, par exemple dans Sambrook et al., (1989, « Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (« Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor Lab.CSH, N. Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) "Current
Protocols in Molecular Biology, Chapter 2" (Greene Publishing and Wiley- Interscience, N. Y.), et ces conditions peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction de la taille des fragments nucléotidiques, selon les enseignements appropriés connus.
On utilisera par exemple des tampons d'hybridation ou de lavage appropriés (Corning), ou encore les conditions d'hybridation suivantes :
(1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (2OmM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl
+ 0.015 M de citrate de sodium), 50% de formamide, 7% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5% de dextran sulfate et 1% d'ADN de sperme de saumon ;
(2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 55°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2X SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0..1X SSC + 0.1% SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides.
Le support solide utilisé pour la réalisation de la présente invention, également appelé de manière indifférente dans la présente demande « (bio)puce » ou « (bio)ρuce à ADN », peut être de manière générale tout support miniaturisé de verre, de silicium ou de polymère qui peut être revêtu de séquences nucléotidiques de séquence connue, en particulier les fragments représentatifs de gènes selon la présente invention déposés en arrangement ordonné, et dont la fonction est de reconnaître, dans un mélange, leurs séquences nucléotidiques complémentaires. Comme exemple de support solide on peut citer, mais sans s'y limiter, des membranes telles que les membranes de nylon à densité élevée (par exemple Performa, Genetix, New Milton, UK) ; on utilisera de préférence des lames microréseau en arnino-silane, disponibles notamment chez Corning (ultraGAP™, NY). La surface du support est traitée pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces sur lesquelles les fragments représentatifs sont fixés ; l'emplacement de chacun d'entre eux est précisément connu. De tels supports solides sont bien connus de l'homme de l'art, qui saura choisir le type de support à utiliser et les conditions appropriées pour un test d'hybridation donné.
Le sujet présentant une tumeur mammaire est de préférence un mammifère, et de manière particulièrement préférée l'homme. La présente invention est tout particulièrement appropriée pour le dépistage de tumeurs mammaires métastatiques chez la femme, mais elle peut également être utilisée dans les cas de cancers du sein chez l'homme.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends
Guide, 1998 :5 :7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Karlin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. On pourra utiliser en particulier les programmes : -BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402), -FASTA (Altschul S. F. ét al, 1990, J. Mol. Biol., 403-410), -Clustal W (Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-80),
-BESTFIT. L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI (http :ww.ncbi.nih.gov).
Les expressions « acide nucléique », « séquence nucléique » ou « d'acide nucléique », « polynucléotide », « oligonucléotide », « séquence de polynucléotide », « séquence nucléotidique », pourront être employés de manière indifférente dans la présente demande pour désigner un enchaînement précis de nucléotides pouvant correspondre aussi bien à de l'ADN qu'à ses produits de transcription (ARN). Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, au moins un fragment représentatif d'un gène choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N0 2S SEQ ID N0 8, SEQ ID N0
11, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 38 à 41, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 114, SEQ ID N° 206, SEQ ID N° 219, SEQ ID N0 231, SEQ ID N° 233, SEQ ID N° 259, SEQ ID N° 286, SEQ ID N° 288, SEQ ID N° 311, SEQ ID N° 350, SEQ ID N° 441, SEQ ID N° 467 et SEQ ID N° 484 à 489 pour le Tableau Al , les fragments de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 43, SEQ ID N0 58 et SEQ ID N0 118 pour le Tableau A2, les fragments de séquence SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 48, SEQ ID
N° 59, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N0 71 ou 72, SEQ ID N°73, SEQ ID N° 76, SEQ ID N0 80 à 83, SEQ ID N0 85,
SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 95 à 97, SEQ ID N° 100, SEQ
ID N° 101, SEQ ID N° 103, SEQ ID N° 106, SEQ ID N° 110, SEQ ID N°
111, SEQ ID N° 113, SEQ ID N° 119, SEQ ED N° 120, SEQ ID N° 123,
SEQ ID N° 126, SEQ ID N° 129, SEQ ID N° 132, SEQ ID N0 133, SEQ ID N° 141, SEQ ID N° 142, SEQ ID N° 144, SEQ ID N° 149 à 152, SEQ
ID N° 154, SEQ ID N° 156, SEQ ID N° 157, SEQ ID N° 164, SEQ ID N° .
12
171, SEQ ID N° 175, SEQ ID N° 181, SEQ ID N° 187, SEQ DD N° 192, SEQ ID N° 195, SEQ ID N° 212, SEQ ID N0 235, SEQ ID N° 262, SEQ ID N° 281, SEQ ID N° 316, SEQ ID N° 320, SEQ ID N° 321, SEQ ID N° 325, SEQ ID N° 337, SEQ ID N° 352, SEQ ID N° 366, SEQ ID N0 372, SEQ ID N° 385, SEQ ID N° 398, SEQ ID N0 402, SEQ ID N0 411, SEQ
ID N° 422, SEQ ID N0 434, SEQ ID N° 437, SEQ ID N° 470 et SEQ ID N° 490 à 502 pour le Tableau A3, et les fragments de séquence SEQ ID N° I5 SEQ ID N° 3, SEQ ED N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 à 14, SEQ ID N° 16 à 19, SEQ ID N° 21 à 29, SEQ ID N0 31, SEQ ID
N° 33 à 37, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 49, SEQ ID N0 50, SEQ ID N° 52 à 57, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 64 à 67, SEQ ID N° 70, SEQ ED N° 74, SEQ ED N° 75, SEQ ID N° 77 à 79, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 87 à 90, SEQ ID N° 92 à 94, SEQ ID N° 98, SEQ ID N0 99, SEQ ID N0 102, SEQ ID N° 104, SEQ ID N° 105,
SEQ ID N° 107 à 109, SEQ ID N° 112, SEQ ED N° 115 à 117, SEQ ID N° 121, SEQ ID N0 122, SEQ ED N0 124, SEQ ID N° 125, SEQ ED N° 127, SEQ ED N° 128, SEQ ID N° 130, SEQ ED N° 131, SEQ ED N° 134 à 140, SEQ ED N0 143, SEQ ID N° 145 à 148, SEQ ED N0 153, SEQ ID N° 155, SEQ ED N° 158 à 163, SEQ ED N° 165 à 170, SEQ ED N° 172 à 174, SEQ
ID N° 176 à 180, SEQ ID N° 182 à 186, SEQ ID N° 188 à 191, SEQ ID N° 193 ou 194, SEQ ID N° 196 à 201, SEQ ED N° 202 ou 203, SEQ ED N° 204, SEQ ID N° 205, SEQ ED N0 207 à 211, SEQ ID N° 213 à 218, SEQ ID N0 220 à 230, SEQ ID N° 232, SEQ ID N° 234, SEQ ED N° 236 à 258, SEQ ED N0 260, SEQ ID N0 261, SEQ ED N° 263 à 280, SEQ ID N° 282 à
285, SEQ ID N° 287, SEQ ED N0 289 à 310, SEQ ID N° 312 à 315, SEQ ED N° 317 à 319, SEQ ID N° 322 à 324, SEQ ID N° 326 à 336, SEQ ID N° 338 à 349, SEQ ED N0 351, SEQ ED N° 353 à 365, SEQ ED N° 367 à 371, SEQ ID N° 373 à 384, SEQ ID N° 386 à 397, SEQ ID N° 399 à 401, SEQ ED N0 403 à 410, SEQ ED N° 412 à 421, SEQ ED N0 423 à 433, SEQ
ID N° 435, SEQ ED N° 436, SEQ ED N° 438 à 440, SEQ ED N° 442 à 466, SEQ ID N° 468, SEQ ID N0 469, SEQ ID N0 471 à 483 et SEQ ID N° 503 " à 513 pour le Tableau B5 ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).
Selon un mode de réalisation encore plus préféré, au moins un fragment représentatif de gène pour l'ensemble des gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ED N° 2, SEQ ID N° 8, SEQ ID N0 11, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 38 à 41, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 114, SEQ ID N° 206,
SEQ ID N° 219, SEQ ID N° 231, SEQ ID N0 233, SEQ ID N° 259, SEQ ID N0 286, SEQ ID N° 288, SEQ ID N0 311, SEQ ID N° 350, SEQ ID N° 441, SEQ ID N° 467 et SEQ ID N° 484 à 489 pour le Tableau Al, les fragments de séquence SEQ ID N0 5, SEQ ID N° 30, SEQ ID N0 43, SEQ ID N° 58 et SEQ ED N° 118 pour le Tableau A2, les fragments de séquence SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 48, SEQ ID N0 59, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 71 ou 72, SEQ ID N°73, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 80 à 83, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 95 à 97, SEQ ID N° 100, SEQ ID N0 101, SEQ ID N° 103, SEQ ID N° 106, SEQ ID N° 110, SEQ ID N°
111, SEQ ID N° 113, SEQ ID N° 119, SEQ ID N° 120, SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 126, SEQ ID N° 129, SEQ ID N° 132, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 141, SEQ ID N° 142, SEQ ID N° 144, SEQ ID N° 149 à 152, SEQ ID N° 154, SEQ ED N° 156, SEQ ID N0 157, SEQ ED N0 164, SEQ LD N° 171, SEQ LD N0 175, SEQ ID N0 181, SEQ ED N0 187, SEQ ED N0 192,
SEQ ED N0 195, SEQ ID N0 212, SEQ ID N° 235, SEQ ED N° 262, SEQ ID N0 281, SEQ ID N0 316, SEQ ID N° 320, SEQ ED N0 321, SEQ ID N° 325, SEQ ID N° 337, SEQ ID N° 352, SEQ ID N° 366, SEQ ID N° 372, SEQ ID N° 385, SEQ ID N° 398, SEQ ID N° 402, SEQ ID N° 411, SEQ ID N° 422, SEQ ID N° 434, SEQ ID N0 437, SEQ ID N° 470 et SEQ ID N° 490 à 502 pour le Tableau A3, et les fragments de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N°
- 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N°
12 à 14, SEQ ID N° 16 à 19, SEQ ID N° 21 à 29, SEQ ID N° 31, SEQ ID
N° 33 à 37, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 52 à 57, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ
ID N° 64 à 67, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N0 77 à 79, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 87 à 90, SEQ ID N° 92 à 94, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99, SEQ ID N° 102, SEQ ID N° 104, SEQ ID N0 105, SEQ IDN0 107 à 109, SEQ ID N° 112, SEQ ID N0 115 à 117, SEQ ID N° 121, SEQ ID N° 122, SEQ ID N° 124, SEQ ID N° 125, SEQ ID N0 127,
SEQ ID N° 128, SEQ ID N° 130, SEQ ID N° 131, SEQ ID N° 134 à 140, SEQ ID N° 143, SEQ ID N° 145 à 148, SEQ ID N° 153, SEQ JD N0 155, SEQ ID N° 158 à 163, SEQ ID N0 165 à 170, SEQ DD N° 172 à 174, SEQ ID N° 176 à 180, SEQ ID N° 182 à 186, SEQ ID N° 188 à 191, SEQ ID N° 193 ou 194, SEQ ID N° 196 à 201, SEQ ID N° 202 ou 203, SEQ ID N°
204, SEQ ID N0 205, SEQ ID N0 207 à 211, SEQ ID N° 213 à 218, SEQ ID N° 220 à 230, SEQ ID N° 232, SEQ ID N° 234, SEQ ID N° 236 à 258, SEQ ID N° 260, SEQ ID N° 261, SEQ ID N° 263 à 280, SEQ ID N° 282 à 285, SEQ ID N0 287, SEQ ID N° 289 à 310, SEQ ID N° 312 à 315, SEQ ID N° 317 à 319, SEQ ID N° 322 à 324, SEQ ID N° 326 à 336, SEQ ID
N° 338 à 349, SEQ ID N0 351, SEQ ID N° 353 à 365, SEQ ID N0 367 à 371, SEQ ID N° 373 à 384, SEQ ED N° 386 à 397, SEQ ID N° 399 à 401, SEQ ID N0 403 à 410, SEQ ID N0 412 à 421, SEQ ED N° 423 à 433, SEQ ID N° 435, SEQ ID N° 436, SEQ ID N° 438 à 440, SEQ ID N° 442 à 466, SEQ ID N0 468, SEQ ED N0 469, SEQ ID N° 471 à 483 et SEQ ID N° 503 à 513 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).
L'un (SEQ ID N° 71) ou l'autre (SEQ ID N0 72) des deux fragments représentatifs du gène TUBB (Tableau A3) peut être utilisé de manière indifférente dans la présente invention, de même que les deux fragments peuvent être utilisés de manière simultanée (SEQ ID N° 71 et SEQ ID N° 72). De même, l'un (SEQ ID N° 193) ou l'autre (SEQ ID N° 194) des deux fragments représentatifs du gène BCARl peut être utilisé de manière indifférente dans la présente invention, de même que les deux fragments peuvent être utilisés de manière simultanée (SEQ ID N0 193 et SEQ ID N°
94). Enfin, l'un (SEQ ID N° 202) ou l'autre (SEQ ID N° 203) des deux fragments représentatifs du gène CCNEl peut être utilisé de manière indifférente dans la présente invention, de même que les deux fragments peuvent être utilisés de manière simultanée (SEQ ID N0 202 et SEQ ID N° 203).
Les fragments tels que définis au point b) des modes de réalisation ci-dessus qui restent représentatifs des gènes donnés, résultent par exemple d'un polymorphisme nucléotidique ou d'une mutation (délétion, insertion, substitution...).
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le jeu est constitué par 36 fragments, chacun des 36 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou par 88 fragments, chacun des 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou par 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, À2 et A3.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le jeu est constitué par 510 fragments, chacun des 510 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et B. 3 gènes (TUBB ,. BCARl et CCNEl) sont chacun représentés par 2 fragments (cf. supra). Ainsi, selon une alternative, le jeu est constitué par 511 fragments, chacun des 511 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et B. Selon une autre alternative,, le jeu est constitué par 512 fragments, chacun des 512 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et B. Selon une dernière alternative préférée entre toutes, le jeu est. constitué par 513 fragments, chacun des 513 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et B.
Un tel support solide revêtu d'un jeu constitué par un ensemble de fragments dont chacun est représentatif des gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B permet de caractériser l' envahissement ganglionnaire, et donc le caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire, et permet également de déterminer d'autres éléments tels que l'évaluation de la survie des patientes, le statut BRCA1/BRCA2, la prolifération cellulaire et l'expression des récepteurs aux oestrogènes par les cellules d'une tumeur mamaire.
La caractérisation de l'expression des récepteurs aux oestrogènes par les cellules d'une rumeur mammaire (ER+ ou ER-) précède la détermination l'envahissement ganglionnaire pour une tumeur mammaire donnée (cf. supra).
Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire à partir d'un prélèvement de ladite tumeur chez un sujet, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape dans laquelle on dépose un échantillon d'un extrait d'acide nucléique, le cas échéant après rétro-transcription, issu dudit prélèvement tumoral, sur un support solide selon la présente invention, et en ce qu'on analyse la quantité d'acide nucléique ayant hybride avec le jeu de fragments représentatifs déposé sur ledit support. . . ..
De préférence, le procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral, b) le marquage de l'acide nucléique test de l'échantillon obtenu à l'étape a) à l'aide d'un premier marqueur, . . c) en parallèle, le marquage d'un échantillon d'acide nucléique de référence à l'aide d'un deuxième marqueur différent du premier marqueur de l'étape b), d) la mise en contact de l'échantillon d'acide nucléique test marqué obtenu à l'étape b) et de l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué obtenu à l'étape c) avec le support selon la présente invention dans des conditions appropriées pour l'hybridation, chaque fragment représentatif d'un gène du support solide étant capable de s'hybrider avec un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique test marqué et un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, e) la normalisation, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, f) la comparaison, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, de sorte à obtenir un profil d'expression des gènes dont les fragments représentatifs ont été déposés sur le support solide, g) le classement de la tumeur mammaire comme étant métastatique ou localisée après analyse du profil d'expression obtenu à l'étape f).
L'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral telle que définie à l'étape a) du procédé de prédiction selon la présente invention est une technique couramment employée en biologie moléculaire. De manière générale, pour la réalisation de la présente invention, l'échantillon d'acide nucléique test est soit un échantillon d'ARNm, soit un échantillon d'ADNc obtenu après rétrotranscription de cet ARNm ; l'acide nucléique (ARKm ou ADNc) contenu dans un tel échantillon est en quantité suffisante pour caractériser le profil d'expression de l'ensemble des gènes dont un fragment représentatif a été déposé sur le support solide. Les techniques de biologie moléculaire employées pour la réalisation de la présente invention sont bien connues de l'homme de l'art, et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple Sambrook, Russell et al, "Molecular cloning: A laboratory manual", Vol.3, January 15,
2001, CoId Spring Harbor Laboratory ; « Nucleic acid hybridization », BD Haines, SJ Higgins (Eds), 1985, IRL Press). Ainsi, l'homme du métier saura appliquer la procédure nécessaire pour l'extraction d'un échantillon de l'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral.
Le marquage de l'échantillon d'acide nucléique test à l'étape b) et celui de l'échantillon d'acide nucléique de référence à l'étape c) permet l'émission d'un signal détectable et quantifiable, caractéristique de l'intensité d'hybridation obtenue lorsqu'un fragment représentatif d'un gène donné s'hybride d'une part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test, d'autre part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence. L'intensité d'hybridation obtenue est proportionnelle au niveau d'expression du gène représenté par le fragment déposé sur le support solide.
Le marquage peut consister en un radio-marquage (tel que 32P, 33P ,35S, qui peut être détecté en utilisant par exemple un compteur gamma ou un scintillateur, autoradiographie,...), un marquage erizymatique (biotine, digoxigénine,...), un marquage chimioluminescent (luminol, dioxétane, luciférase, luciférine) ou un marquage fluorescent. Lorsqu'on utilise le marquage radioactif, le support solide ne doit pas être en verre.
Le marquage fluorescent est particulièrement préféré pour la réalisation de la présente invention. Comme exemple de marqueurs fluorescents on peut citer, mais sans s'y limiter, la fluorescéine et ses dérivés, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les coumarines, les cyanines 2, 3 et
5, les dérivés de la phycocyanine, l'allophycocyanine (APC), la phycoérythrine-cyanine 5 (PC5) et la phycoérythrine (PE), la calcéine (AM), la tetraméthyl-rhodamine de fluorescence rouge ou la rhodamine et ses dérivés, la protéine de fluorescence verte ou GFP (« Green Fluorescent Protein »), le chlorure de dansyl, Pumbelliferone etc.. (voir également W. T.
Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition).
On choisira les deux marqueurs pour l'échantillon d'acide nucléique test et ipour l'échantillon d'acide nucléique de référence de sorte à obtenir deux signaux caractéristiques de l'intensité d'hybridation comparables entre eux.
Les méthodes de marquage sont bien connues de l'homme de l'art et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple "Pratique de l'utilisation des sondes nucléiques et de l'hybridation moléculaire", Gérard Lacotte, May 1992, Ed. Lavoisier, Paris, et W. T. Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition) ; les kits et les marqueurs sont disponibles dans le commerce (voir par exemple le kit « Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit », disponible chez Agilent Technologies, ou d'autres kits/marqueurs disponibles par exemple chez Molecular Probes, Leiden, NL,
Clontech, PaIo Alto, CA, Stratagene, La JoIIa5 CA, etc...).
On entend désigner par « échantillon d'acide nucléique de référence » dans la présente demande un pool d'acide nucléique obtenu à partir de différentes lignées cellulaires normales et tumorales. Ces lignées cellulaires sont de manière générale mises en culture à l'échelle industrielle afin de produire des lots de taille importante, qui subissent des procédures de contrôle qualité stringentes. Un tel échantillon d'acide nucléique de référence sert de contrôle pour obtenir les informations relatives à l'expression des gènes présents dans l'échantillon d'acide nucléique test après hybridation avec les fragments représentatifs déposés sur le support solide.
Comme exemple d'échantillon d'acide nucléique de référence on peut citer, mais sans s'y limiter, le pool d'ARN « Universal human référence RNA », commercialisé par Stratagene.
La normalisation à l'étape e) permet de s'affranchir des différences causées par le bruit de fond, la durée de l'hybridation, le marquage plus ou moins important des échantillons d'acides nucléiques test et de référence, les quantités variables des échantillons d'acides nucléiques test et de référence déposés sur le support solide, etc.. La normalisation des résultats est couramment utilisée dans les expériences de biologie moléculaire et est bien connue de l'homme de l'art. Tous types de méthodes peuvent être utilisés pour la réalisation de la présente invention, tels que notamment la méthode « Lowess Global » (Yang IV et al. Within the fold: assessing differential expression measures and reproducibility in microarray assays. Génome Biol. 3, research 0062.1-0062.12, 2002). "
L'analyse à l'étape g) en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f) est réalisée à l'aide de la méthode d'Analyse en Composantes Principales développée par le. laboratoire Génome et Informatique d'Evry (logiciel
GeneAnova, voir point 5 « analyse des données » de l'exemple). D'autres méthodes d'analyse à plusieurs variables appropriées pourront être utilisées pour classer la tumeur mammaire comme étant métastatique ou localisée. On peut citer à titre d'exemple les logiciels suivants, disponibles sur Internet :
- TIGR Multi-experiment Viewer: www.tigr.org/software,
- J-Express:www.ii.uib.no/%7Ebjarted/jexρress, et
- Genesis, genome.tugraz.at/Software/Genesis/ (sans www).
De préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que le classement à l'étape g) est déterminé par comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape f) au moyen du support solide selon l'invention avec le profil d'expression tel que défini dans les Tableaux Al, A2 etA3.
Comme cela a été dit précédemment, avant de déterminer l'envahissement ganglionnaire pour une tumeur mammaire donnée, il est indispensable de caractériser l'expression des récepteurs aux oestrogènes par les cellules de ladite tumeur. Cette caractérisation de l'expression des récepteurs aux oestrogènes peut être effectuée selon toute méthode appropriée connue de l'homme de l'art telle que par exemple l'immunobistochimie, mais également en utilisant le procédé selon la présente invention.
Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon la présente invention permet également de caractériser si les cellules de la tumeur mammaire expriment ou non les récepteurs aux oestrogènes, ce dit procédé étant caractérisé en ce qu'après l'étape f), on compare le profil d'expression de l'ensemble des gènes du Tableau C obtenu au moyen du support solide selon la présente invention avec le profil d'expression tel que défini dans ledit Tableau C.
Les gènes du Tableau C constituent un groupe de gènes sélectionnés parmi les gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B. Ainsi, un support solide selon la présente invention, permettant de dépister l'envahissement ganglionnaire à la fois dans les tumeurs ER- et dans les tumeurs ER+, et comprenant notamment ce groupe de gènes, pemettra également de caractériser si les cellules de la tumeur mammaire expriment (ER+) ou non (ER-) les récepteurs aux oestrogènes : à l'aide de ce support, on caractérisera dans un premier temps si la tumeur à partir de laquelle le prélèvement a été effectué est une tumeur ER+ ou une tumeur ER-, et dans un deuxième temps, si la tumeur est ER+, on s'intéressera uniquement au profil d'expression obtenu pour tout ou partie des gènes listés dans les Tableaux Al et A2, et si la tumeur est ER-, on s'intéressera au profil d'expression obtenu pour tout ou partie des gènes listés dans les Tableaux A2 et A3.
Selon encore une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que la comparaison à l'étape f) de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué comprend les étapes suivantes : a) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du rapport entre l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour 1 ' échantillon d' acide nucléique de référence marqué, b) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du log2 de chaque rapport obtenu à l'étape a). Chaque fragment représentatif du jeu est déposé de manière générale une fois, de préférence deux fois, manière encore préférée trois fois, voire quatre fois sur le support solide. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que, lorsque chaque fragment du jeu est déposé trois fois sur le support, la moyenne des 1Og2 des trois réplicats est calculée pour chacun de ces fragments.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les échantillons d'acides nucléiques test et de référence sont de l'ARN, de préférence de PARNm.
De préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape b) de marquage de l'ARN test, de préférence de l'ARNm test, de l'échantillon à l'aide du premier marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN test de l'échantillon obtenu à l'étape a), ii) l'incorporation du premier marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).
Selon une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape c) de marquage de l'échantillon d'ARN de référence, de préférence de l'ARNm de référence, à l'aide du deuxième marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN de référence de l'étape c), ii) l'incorporation du deuxième marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).
De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les premier et deuxième marqueurs sont choisis parmi la cyanine 3 et la cyanine 5. Un dernier aspect de la présente invention concerne un kit comprenant le support solide selon la présente invention. Les kits comprenant un support solide d'hybridation sont suffisamment décrits dans la littérature, et comprennent de manière générale, outre le support solide, des réactifs nécessaires pour l'hybridation tels que notamment des marqueurs ou des tampons d'hybridation, et de. lavage.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
FIGURES
Figure IA : Classification obtenue par Analyse en Composantes Multiples pour les tumeurs ER+ (ACP, logiciel GeneAnova, laboratoire génome et informatique d'Evry).
Figure IB : Classification obtenue par Analyse en Composantes Multiples pour les tumeurs ER-. Figure 2 : Classification obtenue par Analyse en Composantes Multiples pour l'étude de l'expression des récepteurs aux oestrogènes(ER+/ER-) par les cellules de tumeurs mammaires.
EXEMPLES
Exemple 1 : Etude de l'envahissement ganglionnaire
1. Patientes
Des fragments chirurgicaux de tumeurs mammaires chez des patientes opérées au centre Jean Perrin (Clermont-Ferrand) ont été prélevés. Les critères de sélection des tumeurs ont été le type histologique (il s'agit de carcinomes canalaires infiltrants) et la survenue de ces tumeurs dans un contexte sporadique. Au total, 69 tumeurs sont étudiées.
2. Echantillons biologiques L'extraction d'ARN est réalisée à partir des rumeurs congelées dans l'azote liquide avec le protocole Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Après vérification de la qualité des. ARN obtenus par. microélectrophorèse sur le bioanalyseur (Agilent technologies, Massy, France), 10 μg d'ARN totaux sont utilisés pour l'étude sur puce. Un pool d'ARN de lignées cellulaires est utilisé comme ARN référence
(Universal human référence RNA, Stratagene, La Jolla, CA). Ce pool d'ARN de référence, disponible dans le commerce, comprend une collection d'ARN obtenus à partir d'un certain nombre de lignées cellulaires pour couvrir une gamme optimale de gènes.
3. Préparation des biopuces (ou « supports solides »)
Les sondes moléculaires (ou « fragments représentatifs ») sont des oligonucléotides de 50 bases synthétisés par la société MWG. La séquence de certains oligonucléotides est disponible dans les banques de MWG, d'autres ont été recherchées la demande des inventeurs. Ces oligonucléotides sont dilués à une concentration de 25 μM dans une solution de DMSO 50% (diméthylsulfoxide) puis déposés sur des lames Ultragaps (Corning, New York, US) grâce à un robot ( Microgrid II, Biorobotics, Genomic Solutions, Cambridge, UK). Chaque sonde moléculaire est déposées en triplicat sur la lame. Après dépôt, les molécules d'ADN sont fixées par incubation sur des lames à 8O0C, pendant 2 heures. Un traitement chimique tel que défini par la société Corning est réalisé. Les lames sont alors conservées à température ambiante, à l'obscurité.
4. Marquage et hybridation Pour chaque échantillon, 10 μg d'ARN sont rétrotranscrits en présence d'amino-allyl dUTP (Fairplay Microarray labelling kit, Stratagene, La Jolla, US). Les ADNc obtenus à partir des ARN de la tumeur et de TARN référence sont respectivement incubés avec de la cyanine 5 et cyanine 3 (Amersham Biosciences, Québec, CA) qui vont se fixer sur le groupement amino-allyl. Les ADNc fluorescents sont alors purifiés et séchés sous vide. Le culot est repris dans 16 μl de tampon d'hybridation (Corning, New York, US) puis l'on procède ensuite à la dénaturation à 100°C. L'hybridation se fait avec un « coverslip » qui permet de maintenir le contact entre la cible et la surface de la lame, à 370C et 50% d'humidité, pendant la nuit.
Les lames sont ensuite lavées dans des solutions de SDS (dodécylsulfate de sodium) et SSC (citrate de sodium salin) à différentes concentrations. La fluorescence est détectée par passage de la puce dans un scanner (GMS 418, Affymetrix).
5. Analyses des données
Les images obtenues sont analysées avec un logiciel d'analyse d'image
, (Jaguar, Affymetrix, UK). La normalisation des données est effectuée selon la méthode lowess global car il y a une dépendance systématique entre la valeur du Iog2(ratio) et l'intensité, qui apparaît généralement par des valeurs du Iog2(ratio) élevées pour des valeurs d'intensité faibles. Cette méthode permet d'enlever de tels effets. Ensuite, le ratio des intensités tumeur/référence est calculé, puis le Iog2 des ratios. Pour chaque gène, la moyenne des Iog2(ratio) des trois réplicats est calculée, chaque sonde moléculaire étant déposée trois fois sur la puce.
Le test de Student est alors utilisé. H s'agit d'un test de significativité qui peut être employé lors de la comparaison de deux moyennes. Le test t est calculé en effectuant le rapport de la différence des moyennes sur l'erreur standard. Une valeur p < 0,05 est considérée comme significative. Ce test est impliqué pour évaluer le niveau de significativité entre les moyennes d'expression des différents gènes entre le groupe des échantillons « sensibles » et le groupe des échantillons « résistantes ». Les profils d'expression des gènes discriminants (p<0,05) sont alors étudiés par une analyse en composantes principales (ACP).
L'Analyse en Composantes Principales (logiciel GeneAnova, Laboratoire Génome et Informatique d'Evry, FR) est une méthode dite descriptive, elle vise à structurer et simplifier des données issues de plusieurs variables, sans
-privilégier- l'une d'entre elles.. L'ACP permet de visualiser la géométrie du nuage des observations quand l'espace à plus de 3 dimensions. Elle procède en 2 étapes, le détermination des axes d'inertie du nuage puis sa projection sur les plans déterminés par les axes d'inertie pris 2 à 2. L'analyse de la sphère des corrélations permet de visualiser les similitudes entre différents profils d'expression. La corrélation linéaire entre 2 profils est égale au cosinus de l'angle entre les vecteurs correspondants à ces conditions expérimentales (un angle de 90° montre une absence totale de corrélation).
6. Résultats et discussion
Deux groupes de patientes sont étudiés (cf. Tableau « Données cliniques des patientes »). Le premier correspond aux patientes dont les tumeurs expriment le récepteur aux oestrogènes (« estrogen receptor positive », ER+), le second à celles qui ne l'expriment pas (« estrogen receptor négative », ER -).
111 gènes (cf. Tableaux A2 et A3) ont un profil d'expression qui permet de discriminer les tumeurs ER-/N- des tumeurs ER-/N+ contre 72 gènes (cf. Tableaux Al et A2) pour les tumeurs ER+. Les classifications (Figures IA pour les tumeurs ER+ et IB pour les tumeurs ER-) obtenues par analyse en composantes multiples révèlent deux groupes, l'un correspond au tumeurs N-, l'autre correspond aux tumeurs N+.
La biopuce utilisée dans le cadre de cette étude peut donc être utilisée pour déterminer le statut ganglionnaire d'une tumeur en évitant ainsi un curage axillaire aux patientes.
Tableau « Données cliniques des patientes »
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Le groupe 1 correspond aux patientes dont les tumeurs expriment le récepteur aux oestrogènes ( ER+).
Le groupe 2 correspond aux patientes dont les tumeurs n'expriment pas le récepteur aux oestrogènes ( ER-).
ND : Statut ganglionnaire non déterminé.
Statut N : N+, envahissement ganglionnaire ; N-, pas d'envahissement ganglionnaire.
Exemple 2 : Etude de l'expression des récepteurs aux oestrogènes
Le cancer du sein est hormonodépendant. Les cellules tumorales expriment les récepteurs- aux oestrogènes- ( ER, estrogen receptor). Les tumeurs ER+ sont de meilleur pronostic que les tumeurs ER-.
Les données utilisées sont celles des patientes étudiées pour la caractérisation de l'envahissement ganglionnaire.
La démarche technique est identique (cf. Exemple 1). Seuls les gènes discriminant les tumeurs ER+ des tumeurs ER- changent et sont indiqués dans le Tableau C.
La classification obtenue est celle de la Figure 2. La patiente n°68 initialement caractérisée ER+ se classe dans le groupe ER-.
TABLEAUAl
U)
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
TABLEAU A2
Figure imgf000033_0002
TABLEAU A3
Figure imgf000033_0003
(J-)
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
OJ
Figure imgf000036_0001
TABLEAUB
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
U) OO
Figure imgf000039_0001
U)
«o
Figure imgf000040_0001
ë
Figure imgf000041_0001
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è
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6
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£
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LU
Figure imgf000046_0001
4->
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
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OO
TABLEAU C
Figure imgf000050_0001
O
Figure imgf000051_0001

Claims

Revendications
1. Support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet présentant une tumeur mammaire permet le diagnostic ou le pronostic du caractère métastatique ou localisé de ladite tumeur, caractérisé en ce que ledit jeu comprend : - au moins 36 fragments, chacun des 36 fragments étant, représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou au moins 88 fragments, chacun dès 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct
• choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou au moins 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et
- est en outre constitué au maximum par 393 fragments, chacun des 393 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.
2. Support solide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le jeu comprend :
- au moins 36 fragments, chacun des 36 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou au moins 88 fragments, chacun des 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou au moins 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3, et - est en outre constitué au maximum par 200 fragments, chacun des 200 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.
3. Support solide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins un fragment représentatif d'un gène choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 11,
SEQ ID N° 20, SEQ ED N° 32, SEQ ID N° 38 à 41, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 51, SEQ ID N0 62, SEQ ID N0 114, SEQ ID N0 206, SEQ ID N° 219, SEQ ID N° 231, SEQ ID N0 233, SEQ ID N° 259, SEQ ID N0 286, SEQ ID N0 288, SEQ ID N° 311, SEQ ID N° 350, SEQ ID N° 441, SEQ ID N° 467 et SEQ ID N° 484 à 489 pour le Tableau Al, les fragments de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N0 30, SEQ ID N0 43,
SEQ ID N° 58 et SEQ ID N° 118 pour le Tableau A2, les fragments de séquence SEQ ID N° 15, SEQ ID N0 48, SEQ ID N° 59, . SEQ ID N° 63, SEQ ID N0 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 71 ou 72, SEQ ID
N°73, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 80 à 83, SEQ ID N° 85, SEQ ID N0 86", SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 95 à 97, SEQ ID N° 100, SEQ ID N° 101, SEQ ID N°
103, SEQ ID N° 106, SEQ ID N0 110, SEQ ID N° 111, SEQ ID N0 113, SEQ ID
N° 119, SEQ ID N0 120, SEQ ID N° 123, SEQ ID N0 126, SEQ ID N0 129,
SEQ ID N0 132, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 141, SEQ ID N0 142, SEQ ID N°
144, SEQ ID N0 149 à 152, SEQ ID N° 154, SEQ ID N° 156, SEQ ID N° 157, SEQ ID N° 164, SEQ ID N° 171, SEQ ID N° 175, SEQ ID N° 181, SEQ ID N°
187, SEQ ID N° 192, SEQ ID N° 195, SEQ ID N° 212, SEQ ID N° 235, SEQ ID
N° 262, SEQ ID N° 281, SEQ ID N° 316, SEQ ID N° 320, SEQ ID N° 321,
SEQ ID N° 325, SEQ ID N° 337, SEQ ID N° 352, SEQ ID N° 366, SEQ ID N°
372, SEQ ID N0 385, SEQ ID N° 398, SEQ ID N° 402, SEQ ID N° 411, SEQ ID N0 422, SEQ ID N° 434, SEQ ID N° 437, SEQ ID N° 470 et SEQ ID N0 490 à
502 pour le Tableau A3 , et les fragments de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N0 12 à 14, SEQ ID N° 16 à 19, SEQ ID N° 21 à 29, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 33 à 37, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50,
SEQ ID N° 52 à 57, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 64 à 67, SEQ ID N0 70, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ED N° 77 à 79, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 87 à 90, SEQ ID N° 92 à 94, SEQ ID N0 98, SEQ ID N° 99, SEQ ID N° 102, SEQ ID N° 104, SEQ ID N° 105, SEQ ID N° 107 à 109, SEQ ID N° 112, SEQ ID N0 115 à 117, SEQ ID N° 121, SEQ ID N0 122, SEQ ID N° 124, SEQ
ID N° 125, SEQ ID N° 127, SEQ ID N° 128, SEQ ID N° 130, SEQ ID N° 131, SEQ ID N0 134 à 140, SEQ ID N° 143, SEQ ID N° 145 à 148, SEQ ID N0 153, SEQ ID N° 155, SEQ TD N0 158 à 163, SEQ ID N° 165 à 170, SEQ ID N0 172 à
174, SEQ ID N0 176 à 180, SEQ ID N° 182 à 186, SEQ ID N° 188 à 191, SEQ
ID N° 193 ou 194, SEQ ID N0 196 à 201, SEQ ID N° 202 ou 203, SEQ ID N°
204, SEQ ID N0 205, SEQ ID N° 207 à 211, SEQ ID N° 213 à 218, SEQ ID N° 220 à 230, SEQ ID N0 232, SEQ ID N° 234, SEQ ID N° 236 à 258, SEQ ID N°
260, SEQ ID N0 261, SEQ ID N° 263 à 280, SEQ ID N° 282 à 285, SEQ ID N0
287, SEQ ID N0 289 à 310, SEQ ID N° 312 à 315, SEQ ID N° 317 à 319, SEQ ID N0 322 à 324, SEQ ID N0 326 à 336, SEQ ID N0 338 à 349, SEQ ID N0 351,
SEQ ID N° 353 à 365, SEQ ID N° 367 à 371, SEQ ID N° 373 à 384, SEQ ED N° 386 à 397, SEQ ID N0 399 à 401, SEQ ID N° 403 à 410, SEQ ID N° 412 à 421,
SEQ ID N° 423 à 433, SEQ ID N° 435, SEQ ID N° 436, SEQ ID N° 438 à 440,
SEQ ID N0 442 à 466, SEQ ID N° 468, SEQ ID N° 469, SEQ ID N° 471 à 483 et SEQ ID N° 503 à 513 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).
4. Support solide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'au moins un fragment représentatif de gène pour l'ensemble des gènes des Tableaux Al, A2, A3 et B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 8, SEQ ID N0 11, SEQ ED N° 20, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 38 à 41, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 47, SEQ ED N° 51, SEQ ID N° 62, SEQ ID N0 114, SEQ ID N° 206, SEQ ID N°
219, SEQ ID N° 231, SEQ ID N0 233, SEQ ID N° 259, SEQ ED N° 286, SEQ ID N° 288, SEQ DD N0 3 il, SEQ ID N° 350, SEQ ID N° 441, SEQ DD N° 467 et SEQ DD N° 484 à 489 pour le Tableau Al, les fragments de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 43, SEQ DD N0 58 et SEQ ID N° 118 pour le Tableau A2, les fragments de séquence SEQ DD N° 15, SEQ ID N° 48, SEQ DD N0 59, SEQ DD N° 63, SEQ ID N0 68, SEQ ID N0 69, SEQ DD N° 71 ou 72, SEQ DD N°73, SEQ ID N0 76, SEQ ID N0 80 à 83, SEQ ID N0 85, SEQ ID N° 86, SEQ
ID N° 91, SEQ ID N0 95 à 97, SEQ ID N° 100, SEQ ID N0 . 101, SEQ ID N°
103, SEQ ID N0 106, SEQ ID N0 110, SEQ ID N0 111, SEQ ID N0 113, SEQ ID
N0 119, SEQ ID N° 120, SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 126, SEQ ID N0 129, SEQ ED N0 132, SEQ ID N° 133, SEQ ID N0 141, SEQ ID N° 142, SEQ ID N°
144, SEQ ID N0 149 à 152, SEQ ID N0 154, SEQ ID N° 156, SEQ ID N° 157,
SEQ ID N0 164, SEQ ID N0 171, SEQ ID N0 175, SEQ ID N0 181, SEQ ID N0 187, SEQ ID N0 192, SEQ ID N° 195, SEQ ID N0 212, SEQ ID N0 235, SEQ ID
N0 262, SEQ ID N° 281, SEQ ID N° 316, SEQ ID N0 320, SEQ ID N0 321, SEQ ID N° 325, SEQ ID N° 337, SEQ ID N0 352, SEQ ID N° 366, SEQ ID N°
372, SEQ ID N° 385, SEQ ID N0 398, SEQ ID N° 402, SEQ ID N0 411, SEQ ID N° 422, SEQ ID N° 434, SEQ ID N0 437, SEQ ID N° 470 et SEQ ID N0 490 à 502 pour le Tableau A3, et les fragments de séquence SEQ ID ÎSf° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N0 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N0 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 à 14,
SEQ ID N° 16 à 19, SEQ ID N0 21 à 29, SEQ ID N° 31, SEQ ID N0 33 à 37, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 52 à 57, SEQ ID N0 60, SEQ ID N0 61, SEQ ID N° 64 à 67, SEQ ID N° 70,. SEQ ID N° 74, SEQ ID N0 75, SEQ ID N° 77 à 79, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 87 à 90, SEQ ID N° 92 à 94, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99, SEQ ID N°
102, SEQ ID N° 104, SEQ ID N0 105, SEQ ID N0 107 à 109, SEQ ID N° 112, SEQ ID N0 115 à 117, SEQ ID N° 121, SEQ ID N° 122, SEQ ID N0 124, SEQ ID N° 125, SEQ ID N0 127, SEQ ID N0 128, SEQ ID N° 130, SEQ ID N° 131, SEQ ID N° 134 à 140, SEQ ID N° 143, SEQ ID N0 145 à 148, SEQ ID N0 153, SEQ DD N° 155, SEQ ID N° 158 à 163, SEQ ID N° 165 à 170, SEQ ID N0 172 à
174, SEQ ID N° 176 à 180, SEQ ID N0 182 à 186, SEQ ID N0 188 à 191, SEQ ID N° 193 ou 194, SEQ ID N0 196 à 201, SEQ ID N0 202 ou 203, SEQ ID N° 204, SEQ ID N° 205, SEQ ID N0 207 à 211, SEQ ID N0 213 à 218, SEQ ID N° 220 à 230, SEQ ID N° 232, SEQ ID N° 234, SEQ ID N° 236 à 258, SEQ ID N0 260, SEQ ID N0 261, SEQ ID N0 263 à 280, SEQ ID N0 282 à 285, SEQ ID N
287, SEQ ED N° 289 à 310, SEQ ID N° 312 à 315, SEQ ID N° 317 à 319, SEQ ID N° 322 à 324, SEQ ID N° 326 à 336, SEQ ID N° 338 à 349, SEQ ID N° 351, SEQ ID N0 353 à 365, SEQ ID N0 367 à 371, SEQ ID N0 373 à 384, SEQ ID N0 386 à 397, SEQ ID N0 399 à 401, SEQ ID N° 403 à 410, SEQ ID N° 412 à 421, SEQ ID N° 423 à 433, SEQ ID N° 435, SEQ ID N° 436, SEQ ID N° 438 à 440, SEQ ID N° 442 à 466, SEQ ID N° 468, SEQ ID N° 469, SEQ ID N° 471 à 483 et SEQ ID N° 503 à 513 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).
5. Support solide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le jeu est constitué par 36 fragments, chacun des 36 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al et A2, ou par 88 fragments, chacun des 88 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux A2 et A3, ou par 119 fragments, chacun des 119 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes des Tableaux Al, A2 et A3.
6. Procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro du caractère métastatique ou localisé d'une tumeur mammaire à partir d'un prélèvement de ladite tumeur chez un sujet, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape dans laquelle on dépose un échantillon d'un extrait d'acide nucléique, le cas échéant après rétro-transcription, issu dudit prélèvement tumoral, sur un support solide • selon l'une des revendications 1 à 5, et en ce qu'on analyse la quantité d'acide nucléique ayant hybride avec le jeu de fragments représentatifs déposé sur ledit support.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral, „
56
b) le marquage de l'acide nucléique test de l'échantillon obtenu à l'étape a) à 1 ' aide d 'un premier marqueur, c) ' en parallèle, le marquage d'un échantillon d'acide nucléique de référence à l'aide d'un deuxième marqueur différent du premier marqueur de l'étape b), d) la mise en contact de l'échantillon d'acide nucléique test marqué obtenu à l'étape b) et de l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué obtenu à l'étape c) avec le support selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions appropriées pour l'hybridation, chaque fragment représentatif d'un gène du support solide étant capable de s'hybrider avec un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique test marqué et un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, e) la normalisation, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, f) la comparaison, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, de sorte à obtenir un profil d'expression des gènes dont les fragments représentatifs ont été déposés sur le support solide, g) le classement de la tumeur mammaire comme étant métastatique ou localisée après analyse du profil d'expression obtenu à l'étape f).
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le classement à l'étape g) est déterminé par comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape f) au moyen du support solide selon l'une des revendications 1 à 5 avec le profil d'expression tel que défini dans les Tableaux Al, A2 et A3.
9. Procédé selon la revendication 7 permettant également de caractériser si les cellules de la tumeur mammaire expriment ou non les récepteurs aux oestrogènes, caractérisé en ce qu'après l'étape f), on compare le profil d'expression de l'ensemble des gènes du Tableau C obtenu au moyen du support solide selon l'une des revendications 1 à 4, avec le profil d'expression tel que défini dans ledit Tableau C.
10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la comparaison à l'étape f) de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué comprend les étapes suivantes : a) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du rapport entre l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, b) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du log2 de chaque rapport obtenu à l'étape a).
11. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10 caractérisé en ce que, lorsque chaque fragment du jeu est déposé trois fois sur le support, la moyenne des log2 des trois réplicats est calculée pour chacun de ces fragments.
12. Procédé selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé. en ce que les échantillons d'acides nucléiques test et de référence sont de l' ARN.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape b) de marquage de l'ARN test de l'échantillon à l'aide du premier marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN test de l'échantillon obtenu à l'étape a), ii) l'incorporation du premier marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape c) de marquage de l'échantillon d'ARN de référence à l'aide du deuxième marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de PARN de référence de l'étape c), ii) l'incorporation du deuxième marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).
15. Procédé selon l'une des revendications 7 à 14, caractérisé en ce que les premier et deuxième marqueurs sont choisis parmi la cyanine 3 et la cyanine 5.
16. Kit comprenant le support solide selon l'une des revendications 1 à 5.
PCT/FR2005/002308 2004-09-17 2005-09-19 Biopuce de diagnostic du caractere metastatique ou localise d'une tumeur mammmaire, procede et kit d'utilisation WO2006032769A1 (fr)

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