CN113652486B - 结直肠癌治疗预后生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结直肠癌治疗预后生物标志物及其应用，所述的生物标志物为DYNLT3和/或ACTR3B。本发明采用基因芯片检测实验证明了DYNLT3、ACTR3B在白头翁汤治疗后的结直肠癌患者中表达下调。进一步在数据集中验证发现，与正常人相比，DYNLT3、ACTR3B在结直肠癌患者中表达上调，且具有很好的诊断效能。本发明为诊治结直肠癌、预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后提供了新的方法和策略。

Description

结直肠癌治疗预后生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及结直肠癌治疗预后生物标志物及其应用。
背景技术
癌症是世界范围的健康问题，也是很多国家人口死亡的主要原因。全球每年都有约140万例恶性肿瘤病例，死亡人数达到70万人。其中，结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是位居全球恶性肿瘤的第三位，其死亡率位居第四位。最近的一项估计表明，到2030年，预计将增加60％的结直肠癌病例，也就是即将有超过220万例新病例，死亡人数也将达110万[Sierra,Monica,S,et al.Global patterns and trends in colorectal cancerincidence and mortality[J].Gut Journal ofthe British SocietyofGastroenterology,2017.]。
目前，临床治疗结直肠癌的方法以肿瘤的完全切除为主。然而，晚期结直肠癌患者在术后易发生复发和转移，这导致晚期结直肠癌患者的5年生存率小于10％。因此，放射治疗和化疗依然是晚期结直肠癌的主要治疗方法，但是这些治疗方法会导致严重的副作用。将传统的中药治疗作为一种安全的替代疗法已受到越来越多的关注。大多数中药含有多种生物活性成分，有成为新兴抗癌药物的潜力，例如多靶点抗癌药物。在临床研究中，已发现一些中草药对晚期结直肠癌有治疗效果，如白头翁汤。白头翁汤出自《伤寒论》，功用为清热燥湿，解毒凉血止痢。《医方集解·泻火之剂》：“此足阳明、少阴、厥阴药也。白头翁苦寒能人阳明血分，而凉血止痢；秦皮苦寒性涩，能凉肝益肾而固下焦；黄连凉心清肝，黄柏泻火补水，并能燥湿止痢而厚肠，取寒能胜热，苦能坚肾，涩能断下也。”目前关于白头翁汤治疗结直肠癌的相关作用模式和治疗靶点鲜有报道。通过研究结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后相关生物标志物，为预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后提供新方法，有利于针对患者之间的差异选择个体化治疗方案，提高中药治疗结直肠癌的效果。
发明内容
为了有效的诊断、预测结直肠癌，或预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后，本发明提供了一种生物标志物。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明一方面提供了一种试剂，所述的试剂能够特异性检测样本中生物标志物的表达水平。
术语“生物标志物”是指以可用于预测个体的癌症状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的DNA。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的DNA和RNA。在本发明的具体实施方式中，所述的生物标志物包括DYNLT3和/或ACTR3B。
如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。
本发明中，生物标志物例如DYNLT3(Gene ID:6990)、ACTR3B(Gene ID:57180)包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
本文所述的生物标志物可用于诊断测试中以评估受试者的结直肠癌状态。结直肠癌状态包括结直肠癌存在或不存在。结直肠癌状态还可以包括监测结直肠癌的病程，例如，监测疾病进展。基于受试者的结直肠癌状态，可以指示另外的程序，包括例如另外的诊断测试或治疗程序。
通常根据测定的准确度、测定的灵敏度、测定的特异性或“曲线下面积”(AUC，例如，接受者操作特征(ROC)曲线下面积)来测量诊断测试正确预测疾病状态的能力。如本文所用，准确度是错误分类的样品的分数的量度。可以将准确度度计算为例如在测试群体中正确分类的样本的总数除以样本的总数。灵敏度是通过测试预测为阳性的“真阳性”的量度，并且可以计算为正确鉴定的结直肠癌样品的数目除以结直肠癌样品的总数。特异性是通过测试预测为阴性的“真阴性”的量度，并且可以计算为正确鉴定的正常样品的数目除以正常样品的总数。AUC是接受者操作特征曲线下面积的量度，其为灵敏度对假阳性率(1-特异性)的曲线。AUC越大，测试的预测值越强大。测试效用的其他有用量度包括“阳性预测值”和“阴性预测值”两者，“阳性预测值”是测试为阳性的实际阳性的百分比，“阴性预测值”是测试为阴性的实际阴性的百分比。在一个优选的实施方案中，相对于正常受试者，来源于具有不同结直肠癌状态的受试者的样品中一种或多种生物标志物的水平显示出至少p＝0.05，例如p＝0.05，p＝0.01，p＝0.005，p＝0.001等的统计学显著差异，如相对于合适的对照所确定的。在其他优选的实施方案中，单独或组合使用本文所述的生物标志物的诊断测试显示至少约75％的准确度，例如，至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约97％，约99％或约100％的准确度。在其他实施方案中，单独或组合使用本文所述的生物标志物的诊断测试显示出至少约75％的特异性，例如至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约97％，约99％或约100％的特异性。在其他实施方案中，单独或组合使用本文所述的生物标志物的诊断测试显示出至少约75％的灵敏度，例如至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约97％，约99％或约100％的灵敏度。在其他实施方案中，单独或组合地使用本文所述的生物标志物的诊断测试显示出各自至少约75％的特异性和灵敏度，例如，至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约97％，约99％或约100％的特异性和灵敏度(例如，至少约80％的特异性和至少约80％的灵敏度，或例如，至少约80％的特异性和至少约95％的灵敏度)。
在本发明中检测生物标志物的试剂包括检测基因转录水平的试剂、检测基因翻译水平的试剂。检测基因转录水平的试剂包括但不限于引物、探针，检测基因翻译水平的试剂包括蛋白的结合剂。
“引物”是指寡核苷酸，它与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
蛋白的结合剂是例如蛋白质的受体、结合蛋白质的凝集素、针对蛋白质的抗体、针对蛋白质的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。
进一步，所述的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测所述生物标志物的表达水平的试剂。
本发明的核酸测序方法的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明的核酸测序方法的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
本发明中的核酸杂交方法包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNAISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明中的核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。
本发明的蛋白免疫方法包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
本发明另一方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括前面所述的试剂。
进一步，所述的试剂盒还包括下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明还提供了一种芯片，所述芯片包括前面所述的试剂。
在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
本发明还提供了一种组合物，所述的组合物包括抑制生物标志物表达的试剂，所述的生物标志物包括DYNLT3和/或ACTR3B。
本发明的组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语“载体”包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括，但不限于，糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及根据配制人员的判断，组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明还提供了如下任一项所述的应用：
(1)前面所述的试剂在制备预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后的产品中的应用；
(2)前面所述的试剂盒在制备预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后的产品中的应用；
(3)前面所述的芯片在制备预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后的产品中的应用；
(4)前面所述的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用；
(5)前面所述的试剂盒在制备诊断结直肠癌的产品中的应用；
(6)前面所述的芯片在制备诊断结直肠癌的产品中的应用；
(7)前面所述的组合物在制备预防或治疗结直肠癌的药物中的应用。
本发明中所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述能实现消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟相关疾病状态的任何症状的发生或复发的行为。换句话说，“治疗”疾病状态包括对该疾病状态的治疗性干预和预防性干预。
本发明还提供了一种诊断对象是否患有结直肠癌或预测对象是否存在患结直肠癌的风险或预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后的系统或装置，其特征在于，所述的系统/装置包括：
分析单元，所述单元适于测量对象样本中生物标志物的量；和
评估单元，其包含存储的参考和数据处理器，所述数据处理器已经实现了用于比较分析单元测量的生物标志物的量与存储的参考的算法，由此诊断对象是否患有结直肠癌或预测对象是否存在患结直肠癌的风险或预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后；
所述的生物标志物包括DYNLT3和/或ACTR3B。
本发明最后提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现前面所述的系统/装置。
附图说明
图1为DYNLT3在结直肠癌样本中的表达情况图；
图2为ACTR3B在结直肠癌样本中的表达情况图；
图3为DYNLT3诊断结直肠癌的ROC曲线图；
图4为ACTR3B诊断结直肠癌的ROC曲线图；
图5为基因组合DYNLT3+ACTR3B诊断结直肠癌的ROC曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1检测晚期结直肠癌患者服用白头翁汤前后基因表达水平
一、病例情况
2010年1月至2013年12月从新疆医科大学附属中医院招募患者3例，经组织学证实为晚期结直肠癌(III-IV级)。所有患者都是新疆维吾尔自治区地理区域内的中国汉族居民。每位患者的卡氏评分(Karnofsky Performance Status，KPS)均大于60。排除了严重肝肾疾病患者、孕妇和精神病患者。患者均未接受放疗或化疗。所有患者都签署了知情同意书。该研究经新疆医科大学附属中医医院伦理委员会批准，并遵循赫尔辛基宣言。
参照《中医诊断学》的诊断标准，三名患者均被诊断为湿热内蕴证。
二、实验方法
1、白头翁汤治疗晚期结直肠癌患者
上述3名患者服用白头翁汤颗粒(江阴天江药业有限公司生产)，剂量为每天两次、每次一袋。治疗21天后，收集患者的外周血样本进行RNA提取和微阵列分析。治疗前收集的外周血样本作为对照组。
2、RNA提取和微阵列分析
使用Trizol提取外周血样本的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度计2000(购自NanoDrop)确定RNA浓度。制备合格的RNA用于微阵列分析。将总RNA逆转录为cDNA，用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记，并与Agilent Human Gene Expression芯片(8*60K，Design ID：039494)杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(购自安捷伦科技公司)扫描得到原始数据。利用Genenspring 12.5软件(美国安捷伦科技有限公司)对原始数据进行标准化。对比用药前后，通过t检验获得差异显著性P值。P值＜0.05的基因被认为是差异表达的基因。
三、实验结果
对3名结直肠癌晚期患者进行白头翁汤治疗后，评价每个案例的KPS分数，均不低于90，该结果证明了白头翁汤用于治疗晚期结直肠癌的有效性。本研究在白头翁汤干预后患者中，共鉴定出217个p值小于0.05的差异表达mRNA(表达上调的mRNA有77个，表达下调的mRNA有140个)。其中，如表1所示，本发明所述的基因DYNLT3、ACTR3B均表达下调。
表1结直肠癌晚期患者使用白头翁汤治疗前后的生物标志物的表达情况
GeneID 基因 mean.after mean.before p.value Up_Down
6990 DYNLT3 8.403065 8.551689 0.041881 Down
57180 ACTR3B 8.023448 8.213394 0.008693 Down
实施例2 GEO数据检索分析
一、方法
1、数据来源
检索关键词：(Colorectal cancer)AND"Homo sapiens"[porgn:__txid9606]；筛选获得3套mRNA数据集。
表2 GEO数据库中检索到的mRNA数据集
Figure BDA0003260347020000101
2、数据预处理
对3套mRNA数据集共有的17323个基因进行scale标准化。
3、差异表达基因meta分析
采用metaMA包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method。采用标准是FDR<0.05&|Combined.ES|≥1.5，将数据集上下调不一致的基因舍去。
4、实验结果
分析得到1958个差异表达基因(1025个基因表达上调，933个基因表达下调)。其中，如图1、图2、表3所示，本发明所述的基因DYNLT3、ACTR3B均表达上调。
表3 DYNLT3、ACTR3B在结直肠癌样本中的表达情况
GeneID 基因 Combined.ES P.Value FDR UpDown
6990 DYNLT3 1.604685 0 0 Up
57180 ACTR3B 1.808093 0 0 Up
实施例3诊断效能验证
1、实验方法
使用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。在判断指标联合的诊断效能时，对各基因的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合检测方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
2、实验结果
如表4、5和图3、4、5所示，通过实验结果可知，DYNLT3、ACTR3B对于结直肠癌具有很好的诊断效果，且DYNLT3+ACTR3B组合对于结直肠癌的诊断效果好于单个标志物，具有更好的诊断效能。
表4单个基因的诊断效能数据
基因 AUC
DYNLT3 0.842
ACTR3B 0.840
表5基因组合的诊断效能数据
基因 AUC 敏感性 特异性
DYNLT3+ACTR3B 0.935 0.814 0.944
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.特异性检测样本中生物标志物DYNLT3和ACTR3B的表达水平的试剂在制备预测结直肠癌患者使用白头翁汤治疗预后的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测所述生物标志物的表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述的试剂包括引物、探针。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
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