JP2009537121A - 抗炎症作用を有する融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
特に血管の分岐部(アテローム性動脈硬化の病変が高頻度に発症する部位)においては、機械力も補足的な役割を果たす。剪断力の増加により、内皮由来の窒素(NO)の産生が減少する可能性がある。NOは、血管拡張剤として働き、抗炎症作用を有する。また、剪断力が増加すると、上記のような結果をもたらす接着分子の産生も増加する。
2つの別個のタンパク質またはサブユニットタンパク質の二量化の媒介に関与するタンパク質のセグメントが含まれるように、アミノ酸配列を考慮して、第2のポリペプチドを設計する。多くのタンパク質のペプチド二量体構造に関するアミノ酸配列などの微構造は、当技術分野において詳細な記載があるため、この設計も、当業者にとっては容易である。
配列や構造が知られている公知の二量体形成タンパク質としては、Gタンパク質、ヒストン、インターフェロン、インターロイキン2受容体、hsp90、チロシンキナーゼ、IgG分子などが挙げられる。上記のタンパク質内の二量化を媒介するドメインは、それぞれ本発明の融合タンパク質の製造に直接用いることができる。しかしながら、融合タンパク質の生成量を上げるために、標的遺伝子突然変異や、C末端および/またはN末端に特定のアミノ酸を付加することによって、これらのドメインを修飾するのが好ましい。その結果、例えば融合タンパク質の免疫作用は低減するが、大方、二量化の機能を維持することができる。
他の重要な利点は、融合タンパク質と変性LDLとの複合体が、完全にヒト由来であるため、免疫原性は低いということである。従って、「排除」に関わるいずれの炎症反応も、極めて軽度であるか、あるいはまったく起こらない。
本発明のさらなる発展形態において、アテローム発生の主要因としての酸化LDLは、機能が低下するか、あるいは選択的に除去される。
macrosialinまたはgp110とも呼ばれるCD68は、単球または組織マクロファージで高レベルに発現している膜貫通型糖タンパク質である。そのアミノ酸配列とこれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において開示されている。NCBI database accession No.AAB25811またはNP_001242(ヒト変異体のアミノ酸配列)、database accession No.NM_001251またはAAH15557(ヒト変異体mRNAのヌクレオチド配列)を参照のこと。すでに同定されているこのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列も、参照により本出願に援用する。
本発明の融合タンパク質は、変性LDLへの親和性を失うことなく、サイズが縮小されている。これにより、本発明の融合タンパク質の可溶性は、顕著に上昇する。本発明者らは、CD68の細胞外ドメインが変性LDLへの結合に関与し、該ドメインがその結合に十分であるという科学上の発見を利用した。
ヒト変異体のCD68(NCBI accession No. AAH15557;Strausbergら)の細胞外ドメインは、全長タンパク質のほぼ22〜319位に相当するアミノ酸残基を含む。mRNAレベルでは、66〜960位のヌクレオチドに相当する。当然のことながら、1つ1つのアミノ酸残基またはヌクレオチドに至るまで限定することは、本質的に不可能である。
タンパク質原性アミノ酸は、極性、無極性、酸性および塩基性アミノ酸の4つのグループに分類できることが知られている。極性アミノ酸を他の極性アミノ酸に置換(例えばセリンをグリシンに置換)しても、概して生物活性に変化がなく、あるいはあっても些細なものである。すなわち、このようなアミノ酸の置換は、本発明の融合タンパク質の機能にほとんど影響を及ぼさない。
このような背景から、本発明は、上記のカテゴリーの1つに属するアミノ酸のうちの1つまたは複数個のアミノ酸が同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換されているCD68またはその細胞外ドメインの変異体を第1のポリペプチドとして含む融合タンパク質も包含する。このような配列変異体は、CD68またはCD68の細胞外ドメインのアミノ酸配列と、それぞれ好ましくは約70%、より好ましくは約80%、非常に好ましくは約90〜95%の相同性を有している。
「Fc」は「結晶化可能なフラグメント」を意味する。このフラグメントや2つのFabフラグメントは、IgG分子のパパイン消化によって生じる。Fcドメインは、ヒンジ領域を含む一対のCH2およびCH3ドメインから成り、免疫グロブリンの二量化機能に関与する部分を含む。
さらに、当然のことながら、Fcドメインのフラグメントまたは変異体が、それぞれサイズは縮小されていても抗体の二量化機能を有する限り、この場合も、本発明の融合タンパク質の機能を失わずに、該フラグメントまたは変異体を用いることができる。上述の、CD68のフラグメントまたは変異体の説明(Fcのフラグメントまたは変異体の説明として準用可能)を参照のこと。
本発明者らの知見によれば、第2のポリペプチドは、免疫系を活性化するエフェクター機能がなくても、抗体のFcドメインが有する二量化機能さえ含んでいれば、本発明の融合タンパク質の機能としては十分である。したがって、例えば、免疫系の活性化を大幅に抑制するように、あるいは活性化が全く起こらないように、補体およびFc受容体の結合領域を変異させた合成Fcフラグメントも用いることができる。
いかなる組成のアミノ酸配列でも、接続エレメントを構成しうるが、1〜100個のアミノ酸を含んでいることが好ましい。2つのポリペプチドの連結による本発明の融合タンパク質の生成で生じたアミノ酸によっても、このような接続エレメントを実現できる。
配列番号2で示されるヌクレオチド配列は、ヒトCD68タンパク質変異体の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列由来である。配列番号3で示されるヌクレオチド配列は、ヒトCD68タンパク質の細胞外ドメインにおいて、cag塩基トリプレットがaag塩基トリプレットで置換されている個体群に存在する多型を提供する。この多型の機能的な効果は、これまで知られていない。
アミノ酸の数よりも、それに対応するコドンの数が多いことから、遺伝コードが縮重していることが知られている。ほとんどのアミノ酸には、1つより多くのコドンが存在し、例えばアルギニン、ロイシンおよびセリンは最大6つのコドンによってコードされている。概して、コドンの3番目のヌクレオチドは部分的に、または完全に置換することができる。
このような背景から、遺伝コードの縮重により、配列番号2または3で示されるヌクレオチド配列とは個々のヌクレオチドは異なるが、同等にCD68タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸分子によって、第1のポリペプチドがコードされている融合タンパク質も提供する。このような変異体は、配列番号2または3で示されるヌクレオチド配列と、好ましくは約70%の相同性、より好ましくは約80%の相同性、非常に好ましくは約90〜95%の相同性を有する。
標的遺伝子突然変異によって、331位のプロリンをセリンに置換した。また、アミノ酸234〜237位のテトラペプチドLeu−Leu−Gly−GlyをAla−Ala−Ala−Alaに置換した。上記のペプチドを、ヒトIgG1のFcフラグメントの天然配列と比較して、より容易に発現させるために、CHO細胞用に、コドンに関してポリペプチドを最適化した。
発現ベクターへコード配列を導入し、当技術分野で公知の方法によって適当な細胞(例えばCHO細胞)を形質転換する。次いで、この細胞から目的の第2のポリペプチドを生成する。
当然のことながら、配列番号5で示されるヌクレオチド配列だけでなくその変異体も、第2のポリペプチドの生成に適している。遺伝コードの縮重により、配列番号5で示されるヌクレオチド配列とは個々のヌクレオチドは異なるが、同等に目的の第2のポリペプチドをコードする核酸分子も用いることができる。このような変異体は、配列番号5で示されるヌクレオチド配列と、好ましくは約70%の相同性、より好ましくは約80%の相同性、非常に好ましくは約90〜95%の相同性を有する。
配列番号6で示されるアミノ酸配列は、N末端にCD68の細胞外ドメインのセグメント、およびC末端にFcフラグメントのセグメントを含むだけではなく、FcフラグメントとCD68の細胞外ドメインとを接続する3つのアミノ酸から成る中間エレメントも含む。
当然のことながら、配列番号6で示されるアミノ酸配列においては、上述の通り本発明の融合タンパク質の機能にほとんど影響を与えずに、1つのカテゴリーに属する個々のアミノ酸を、同じカテゴリーの別のアミノ酸で置換することができる。
当然のことながら、配列番号6で示されるアミノ酸配列は、N末端および/またはC末端にアミノ酸をさらに含んでもよい。このアミノ酸は、単に、発現細胞において、融合タンパク質の発現量を上げ、分泌させるという理由から、あるいは単に構造上の理由から存在する。このようなアミノ酸としては、例えばヒトIgGκ鎖、またはマルチクローニングサイト(MCS)由来のものが挙げられる。
配列番号7で示されるヌクレオチド配列は、CD68の細胞外ドメインと、Fcフラグメント由来の第2のポリペプチドとをコードするコード配列だけではなく、前述の接続エレメントをコードし、3つの塩基トリプレットから成る中間セグメントも含む。
配列番号7で示されるヌクレオチド配列のcag塩基トリプレットがaag塩基トリプレットで置換された配列番号8で示されるヌクレオチド配列は、CD68の細胞外ドメインにおける前述の多型を提供する。
当技術分野で周知の方法によって、本発明の核酸分子を、発現ベクターに導入することができる。次いで、それを用いて適当な生物細胞(例えばCHO細胞)を形質転換し、該細胞で目的の融合タンパク質を生成する。
当然のことながら、配列番号7または8で示されるヌクレオチド配列の代わりに、遺伝コードの縮重により、同じ融合タンパク質をコードするその変異体も用いることができる。
本発明の検出可能なマーカーとは、撮像法を利用して識別することができる任意の構成要素を意味する。これには、AMPPD、CSPDのような蛍光、燐光または化学発光の特性を持つ着色剤を含む変色指示薬、32P、35S、125I、131I、14C、3Hのような放射性指示薬、およびビオチンまたはジゴキシゲニン、アルカリフォスファターゼ、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼなどのような非放射性指示薬が挙げられる。撮像法としては、マーカーの性質に応じて、オートラジオグラフィー、ブロッティング、ハイブリダイゼーションまたは顕微鏡を用いた手法が使用される。
ホモダイマーを生体へ全身適用した後、ホモダイマーが急速にかつ特異的に、傷害を受けた血管野またはアテローム性動脈硬化を呈した血管野に限定的に蓄積すること、ならびにあらゆる非特異的な全身性副作用や血液中におけるホモダイマーの急速な分解を、大幅に回避できることを裏付ける証拠を、本発明者らは有している。さらに、本発明のホモダイマーは、生体中の天然のCD68受容体を不活性化また阻害することによって、マクロファージのLDL取込および泡沫細胞化をさらに防ぐことができるという証拠も、本発明者らは有している。
当技術分野においては、既にSR−A1のような他の可溶性スカベンジャー受容体で、そのような機構に関する記載がある。Gough et al. (2001), The use of human CD68 transcriptional regulatory sequences to direct high−level expression of class A scavenger receptor in macrophages in vitro and in vivo, Immunology 103, pages 351 to 361. を参照のこと。本発明者らは、in vitro共存培養アッセイにおいて、本発明のホモダイマーの濃度を上げて添加すると、泡沫細胞の形成を有意に抑制し、例えばMMP−9の分泌といった泡沫細胞のいくつかの機能も抑制可能であることを実証することができた。
当然のことながら、本発明の核酸分子は、対応する形質転換細胞での発現または生成を可能にする、あるいは促進するヌクレオチドセグメントを、さらに含んでもよい。例えば、構造上の理由で、IgG分子のκ鎖のリーダーセグメント、およびそれに接続しているマルチクローニングサイト(MCS)由来アミノ酸を5’末端に配置してもよい。しかし、これらの配列は、翻訳産物では、全長のコンストラクトから切り離される可能性があるので、本発明の融合タンパク質に必ずしも存在するわけではない。
(a)本発明の融合タンパク質、本発明のホモダイマーおよび/または本発明の核酸分子の調製、および(b)薬学的および/または診断的に許容される担体による製剤化、および適用可能な場合(c)薬学的および/または診断的に有効であるさらなる添加物の添加。
(1)検出可能なマーカーを含む本発明の融合タンパク質および/または本発明のホモダイマーの調製、(2)融合タンパク質および/またはホモダイマーの生体内への導入、および(3)ポジトロン放出断層撮影(PET)のような撮像法を利用した、生体内に特異的に蓄積した融合タンパク質の視覚化。
(1)変性LDL、好ましくは酸化LDLに特異的に結合するポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列の調製、(2)二量化を媒介するポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列の調製、(3)融合タンパク質をコードする融合配列を得るための、第1および第2のヌクレオチド配列の連結、(4)発現ベクターへの融合配列のクローニング、(5)発現に適した細胞への発現ベクターの導入、(6)細胞における融合タンパク質の発現、および(7)融合タンパク質の細胞からの単離。
いずれの場合も、一般的な1文字コードを用いる。以下の表示において、アミノ酸配列は、左端にアミノ末端すなわち、N末端を有し、右端にカルボキシ末端すなわち、C末端を有する。ヌクレオチド配列は、左端に5’末端を有し、右端に3’末端を有する。
特異的プライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、新たに調製したマクロファージcDNAライブラリーからヒトCD68の細胞外ドメインを増幅した。上記フラグメントの両末端に、制限部位を新たに導入した。分泌量を上げるために、ヒトIgのκ鎖のリーダー配列を含むプラスミドに、このフラグメントをクローニングし、CD68のリーダー配列を置換した。
ヒトIgG1のFcドメイン由来の人工遺伝子を合成し、標的遺伝子突然変異によって、331位のプロリンをセリンに置換した。また、アミノ酸234〜237位のテトラペプチドLeu−Leu−Gly−GlyをAla−Ala−Ala−Alaに置換した。ペプチドの発現を促進するために、コドンに関してCHO細胞用に、このポリペプチドを最適化した。
この2つのフラグメントを、それぞれ制限酵素で切断して、連結することによって、Fc部分とCD68部分を融合した。その結果、融合タンパク質の、この2つの部分の間に、特異的な接続配列が生じた。この配列は、3つのアミノ酸から成る。以下に、得られた融合cDNAを示す(表9)。
次に、コドンに関してCHO用に最適化され、補体およびFc受容体の結合領域が変異しているヒトIgG1分子(hIgG1mut)のFcフラグメント由来のポリペプチドが続く。カルボキシ末端の「*」は、終止コドンを表す。
70%コンフルエントのFlp−In(登録商標)−CHO細胞(invitrogen)に、プラスミドpOG44:pcDNA5−FRT−CD68−Fc−opt(共にInvitrogen)を9:1の比率でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を洗浄し、新鮮な培地を加えた。トランスフェクションの48時間後に、細胞を500mg/mlハイグロマイシン含有の新鮮培地に移して、20倍希釈した。ハイグロマイシン耐性の細胞を単離し、増殖させた。
CD68−Fc融合タンパク質を安定発現するCHO細胞を培養した。感染の3日後に、培養上清を、3800×gで4℃、30分間遠心分離し、孔径0.2μmのフィルターで濾過した。1.2倍量の硫酸アンモニウム(761g/l)を加えて、4℃で一晩撹拌することにより、CD68融合タンパク質を沈殿させた。
ヒト血小板を分離するために、健常被検者の静脈から採血し、酸性のクエン酸デキストロース(ACD)緩衝液に回収した。回収した血液を430×gで、20分間遠心分離した後、多血小板血漿(PRP)を採取し、HEPES緩衝タイロード液(2.5mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM HCl, 2.5mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM glucose, 1mg/ml BSA, pH6.5)に加えた。次いで、900×gで、10分間遠心分離した。上清を除去し、HEPES緩衝タイロード液(pH7.4)で血小板を含むペレットを懸濁した。
次いで、この細胞を、0.2%ゼラチンでコーティングした96穴プレートで培養した。細胞培養用に、glutamax、ならびに5%の熱失活させたウシ胎仔血清、100mg/mlペニシリン−ストレプトマイシン、1%MEMビタミンおよび1%非必須アミノ酸を添加したIMDMを使用した。すべて、Gibco(Invitrogen、Karlsruhe, Germany)から購入した。CD34+始原細胞(50,000個の細胞)と、血小板(2×108/ml)とを、0.2%ゼラチンでプレコーティングした96穴プレートで、37℃、5%CO2の条件下培養した。位相差顕微鏡によって、6つの枠の泡沫細胞の形成を計数した。
スカベンジャー受容体CD68陽性の免疫蛍光染色像(図2B)と泡沫細胞の透過型電子顕微鏡像(図2C)より、CD34+細胞と血小板との共存培養で生じた「巨大細胞」は、実際、泡沫細胞であることが、実証された。
in vitroで生成された泡沫細胞の機能的な特徴を調べるために、泡沫細胞がアセチル化LDL(acLDL)を取り込めるかどうか実験を行った。得られた泡沫細胞と、蛍光標識したacLDL(Dil−AcLDL)とを培養し、次いでメパクリンで密顆粒を染色することにより、これを実施した。次いで、共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像判定したところ、得られた泡沫細胞のacLDLの取り込み、およびそれをもって泡沫細胞の機能性が、明らかに実証された。図3Aを参照のこと、スケールバー25μm。
in vitroで10日間、血小板とCD34+幹細胞とを共存培養することにより、泡沫細胞が得られた。培養した一部を、CD68−Fcホモダイマーで処理し、別の一部を、コントロールとしてFc単体で処理した。次いで、CD68−Fcホモダイマーとの培養により、泡沫細胞の形成が抑制されるかどうかを顕微鏡を用いて解析した。結果を図3Bに示す。
Fcで処理(左図)しても、泡沫細胞の形成に何ら効果はないが、CD68−Fcホモダイマーで処理(右図)した場合、泡沫細胞の形成が抑制されることが示された。
1. コントロールCD34、
2. コントロールCD34、
3. コントロールタンパク質100g/ml、
4. コントロールタンパク質400μg/ml、
5. CD68−Fcホモダイマー100g/ml、
6. CD68−Fcホモダイマー200g/ml、
7. CD68−Fcホモダイマー400g/ml、
8. フルバスタチン1μM。
非常に特徴的なスタチンであるフルバスタチン(レーン8)と同様に、CD68−Fcホモダイマー(レーン5、6および7)の存在下では、泡沫細胞によるMMP−9の形成が、明らかに抑制されることが示された。
手術で患者の頸動脈から摘出したアテローム斑を、分解して、懸濁した後、培養プレートに移して、表面を乾燥した。次いで、CD68もしくはGPVIのFc部、またはFc単体のそれぞれに対する特異的なELISAを行なった。結果を図5Aに示す。並行して、頸動脈の血栓内膜切除術の組織標本を用いて、ヒト組織の免疫組織学的な解析を行った。結果を図5Bに示す。
Claims (23)
- (a) 変性LDLに特異的に結合する第1のポリペプチド、および(b)二量化を媒介する第2のポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 変性LDLが、酸化LDL(oxLDL)であることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質。
- 第1のポリペプチドが、CD68、好ましくはCD68の細胞外ドメイン、またはCD68のLDL結合機能を有するそれらのフラグメントもしくは変異体を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の融合タンパク質。
- 第2のポリペプチドが、免疫グロブリンのFcドメイン、またはFcドメインの二量化機能を有する該Fcドメインのフラグメントもしくは変異体を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質。
- Fcドメインの変異体が、補体およびFc受容体の結合領域に、融合タンパク質の免疫原性を減弱するような突然変異を含むことを特徴とする請求項4に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとを接続するエレメントをさらに含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 第1のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 第1のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号2もしくは3で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 第2のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 第2のポリペプチドが、添付の配列表の配列番号5で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 添付の配列表の配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 添付の配列表の配列番号7もしくは8で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じ融合タンパク質をコードする変異体を含む核酸分子によって、コードされることを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、検出可能なマーカーをさらに含むことを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質を含むホモダイマー。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
- (a)変性LDL、好ましくは酸化LDLに特異的に結合するポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、および(b)二量化を媒介するポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列を含む請求項15に記載の核酸分子。
- 添付の配列表の配列番号2もしくは3で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項15または16に記載の核酸分子。
- 添付の配列表の配列番号5で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項15〜17のいずれかに記載の核酸分子。
- 添付の配列表の配列番号7もしくは8で示されるヌクレオチド配列、またはその変異体であって、遺伝コードの縮重により、同じポリペプチドをコードする変異体を含むことを特徴とする請求項15〜18のいずれかに記載の核酸分子。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質、および/または請求項14に記載のホモダイマーおよび/または請求項15〜19のいずれかに記載の核酸分子、ならびに、適用可能な場合、薬学的および/または診断的に許容される担体、および、適用可能な場合、薬学的および/または診断的に有効であるさらなる添加物を含む医薬用および/または診断用の組成物。
- アテローム性動脈硬化とアテローム斑を含む急性または慢性血管障害の治療および/または診断に用いる医薬用および/または診断用の組成物を製造するための、請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質、および/または請求項14に記載のホモダイマーおよび/または請求項15〜19のいずれかに記載の核酸分子の使用。
- (1)請求項13に記載の融合タンパク質、および/または請求項14に記載のホモダイマーの調製、
(2)融合タンパク質および/またはホモダイマーの生体内への導入、および
(3)撮像法を利用した、生体内に特異的に蓄積した融合タンパク質の視覚化
の工程を含む、生体における、アテローム性動脈硬化およびアテローム斑を含む急性または慢性血管障害の診断方法。 - (1)変性LDL、好ましくは酸化LDLに特異的に結合するポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列の調製、
(2)二量化を媒介するポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列の調製、
(3)融合タンパク質をコードする融合配列を得るための、第1および第2のヌクレオチド配列の連結、
(4)発現ベクターへの融合配列のクローニング、
(5)発現に適した細胞への発現ベクターの導入、
(6)細胞における融合タンパク質の発現、および
(7)融合タンパク質の細胞からの単離
の工程を含む、請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法。
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