JP2009531388A - 免疫原性組成物 - Google Patents

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Abstract

本出願は、ブドウ球菌ＰＮＡＧを含む免疫原性組成物であって、該ＰＮＡＧは、４０％未満がＮ−アセチル化されており、かつＰＮＡＧのアミン基に結合したリンカーによってキャリアタンパク質と結合してＰＮＡＧ複合体を生成している、上記免疫原性組成物に関する。ＰＮＡＧと５型及び／又は８型莢膜多糖とを含む免疫原性組成物を用いたワクチン、治療方法、並びにその製造方法もまた記載する。

Description

本発明は、ブドウ球菌免疫原性組成物及びワクチン、その製造、並びにかかる組成物の医療における用途の分野に関する。より具体的には、本発明は、場合により黄色ブドウ球菌由来の５型及び／又は８型多糖又はオリゴ糖と組み合わせてもよい、特定の結合方法によって調製されたＰＮＡＧ多糖又はオリゴ糖複合体を含むワクチン組成物に関する。かかるワクチンを用いたブドウ球菌感染の治療又は予防方法もまた提供する。
静脈内デバイスの使用の増加に伴い、地域感染及び病院獲得感染の数はいずれも近年増加の一途をたどっている。病院獲得（院内）感染は、特に、毎年２百万人以上の患者が罹患する米国では、罹病及び死亡の主な原因となっている。様々な研究から、米国人患者の約６％が入院中に感染するとされる。米国における経済的負担は、１９９２年に４５億ドルを超えると推定された（Emori及びGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428）。最も頻度が高い感染は、尿管感染（ＵＴＩ：感染の３３％）、次いで肺炎（１５．５％）、外科手術部位感染（１４．８％）及び主要血流感染（１３％）が続く（Emori及びGaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428）。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、血液凝固酵素陰性ブドウ球菌（ほとんどが表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腸球菌、大腸菌（Escherichia coli）及び緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa）は、主な院内病原体である。これらの病原体はほぼ同数の感染を引き起こすが、これらが生み出しうる障害の重症度と、抗生物質耐性分離菌の頻度を考え合わせると、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を最も重要な院内病原体とする順位になる。
黄色ブドウ球菌は、有意な罹病率及び死亡率を有する院内感染の最も一般的な病原体である（Romero-Vivasら、1995, Infect, Dis. 21; 1417）。これは、場合によっては、骨髄炎、心内膜炎、敗血性関節炎、肺炎、膿瘍及びトキシックショック症候群の原因となることがある。
表皮ブドウ球菌は、通常の皮膚共生生物であり、これは、移植した医療デバイスの感染及び手術部位での感染を引き起こす重要な日和見性病原体でもある。表皮ブドウ球菌が感染する医療デバイスとして、心臓ペースメーカー、髄液シャント、持続携帯式腹膜透析カテーテル、整形外科デバイス及び人工弁が挙げられる。
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌感染は抗生物質で治療され、ペニシリンが選択薬であるが、メチシリン耐性分離株にはバンコマイシンが使用される。抗生物質に対する広スペクトル耐性を示すブドウ球菌の割合は、１９８０年代以来ますます優勢となっており（Panliloら、1992, Infect. Control Hosp. Epidemiol, 13; 582）、有効な抗菌剤療法にとって脅威となっている。加えて、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌株が最近出現したため、いかなる有効な治療も利用可能でないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現して蔓延するであろうという恐怖感が広まった。
受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる別の手法が研究されている。ポリクローナル抗血清の投与を含む治療法（ＷＯ００／１５２３８号、ＷＯ００／１２１３２号）、並びにリポテイコ酸に対するモノクローナル抗体による治療（ＷＯ９８／５７９９４号）も開発中である。
別の手法は、活性ワクチン接種を用いて、ブドウ球菌に対する免疫応答を生じさせることである。ワクチン成分として含有させるいくつかの候補が確認されている。このような成分として、フィブロネクチン結合タンパク質（米国特許第５８４０８４６号）、ＭＨＣ ＩＩ類似体（米国特許第５６４８２４０号）、フィブリノーゲン結合タンパク質（米国特許第６００８３４１号）、ＧｅｈＤ（ＵＳ２００２／０１６９２８８号）、コラーゲン結合タンパク質（米国特許第６２８８２１４号）、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ及びＳｄｒＨ（ＷＯ００／１２６８９号）、変異型ＳＥＡ及びＳＥＢ外毒素（ＷＯ００／０２５２３号）、並びに５２ｋＤａビトロネクチン結合タンパク質（ＷＯ０１／６０８５２号）が挙げられる。
黄色ブドウ球菌のゲノムは配列決定されており、そのコード配列の多くが同定されている（ＥＰ７８６５１９号、ＷＯ０２／０９４８６８号）。表皮ブドウ球菌についても同様である（ＷＯ０１／３４８０９号）。この手法を改善することによって、ブドウ球菌感染に罹患した患者からの過免疫血清によって認識されるタンパク質が同定されている（ＷＯ０１／９８４９９号、ＷＯ０２／０５９１４８号）。
黄色ブドウ球菌に対して又はそれが産生するエキソプロテイン（exoprotein）に対して標的化されたワクチンの第一世代の成功は限定されたものであった（Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162）。そこで、ブドウ球菌感染に対する有効なワクチンを開発する必要性が残されている。
本発明は、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満がＮ−アセチル化されているブドウ球菌ＰＮＡＧを含む免疫原性組成物であって、該ＰＮＡＧがＰＮＡＧのアミン基に結合したリンカーによりキャリアタンパク質と結合してＰＮＡＧ複合体を形成している、上記免疫原性組成物を開示する。かかる免疫原性組成物は、場合により黄色ブドウ球菌由来の５型及び／又は８型莢膜多糖又はオリゴ糖を含んでもよい。
上記の抗原の組合せは、ある範囲のブドウ球菌感染に対する免疫応答を誘発することができる。ＰＮＡＧは、グラム陽性細菌において高度に保存されており、広範な細菌に対する防御をもたらす一方、５型及び８型多糖は、院内感染の最も一般的な原因である黄色ブドウ球菌の大部分の菌株に対する免疫応答を誘発する強力な免疫原である。
多糖
ポリＮ−アセチル化グルコサミン（ＰＮＡＧ）
ＰＮＡＧは、多糖細胞間接着因子であり、場合によりＮ−アセチル基で置換されていてもよいβ（１→６）結合グルコサミンのポリマーから構成される。この多糖は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方に存在し、いずれの供与源からも単離することができる（Joyceら 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litranら 2002, Infect. Imun. 70; 4433）。例えば、ＰＮＡＧは、黄色ブドウ球菌ＭＮ８ｍ株から単離することができる（ＷＯ０４／４３４０７号）。
以前にポリ−Ｎ−スクシニル−β−（１→６）−グルコサミン（ＰＮＳＧ）として知られる多糖は、最近になって、Ｎ−スクシニル化が正しくないことが同定されたため、予想された構造を有するものではないことが示された（Maira-Litranら 2002, Infect. Imun. 70; 4433）。従って、以前にＰＮＳＧとして知られる多糖は現在ＰＮＡＧであることが判明し、これもまたＰＮＡＧという用語に含まれる。
ＰＮＡＧは、４００ｋＤａを超えるものから、７５〜４００ｋＤａまで、１０〜７５ｋＤａまで、そして多くても３０の反復単位（Ｎ−アセチル及びＯ−スクシニル成分で置換されたβ−（１→６）結合グルコサミン）からなるオリゴ糖まで、さまざまなサイズをとるものである。任意のサイズのＰＮＡＧ多糖又はオリゴ糖、例えば４０ｋＤａを超えるサイズのものを本発明の免疫原性組成物に使用することができる。サイジングは、当技術分野で公知の任意の方法、例えばマイクロ流動化、超音波照射又は化学的切断により行うことができる（ＷＯ０３／５３４６２号、ＥＰ４９７５２４号、ＥＰ４９７５２５号）。
ＰＮＡＧのサイズ範囲の例は、４０〜４００ｋＤａ、５０〜３５０ｋＤａ、４０〜３００ｋＤａ、６０〜３００ｋＤａ、５０〜２５０ｋＤａ及び６０〜２００ｋＤａである。
用語「ＰＮＡＧ」には、ｄＰＮＡＧ及びＰＮＡＧの両方が含まれる。ＰＮＡＧは、大部分が脱アセチル化形態となるように、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満又は１％未満がＮ−アセチル化されている。ＰＮＡＧの脱アセチル化エピトープは、オプソニンによるグラム陽性菌、例えば黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌の死滅を媒介可能な抗体を誘導することができる。一実施形態において、ＰＮＡＧは、その２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．１％未満の残基でＯ−スクシニル化されていないか又はＯ−スクシニル化されている。
一実施形態において、ＰＮＡＧは、４０ｋＤａ〜３００ｋＤａ（又は７５ＫＤａ〜１５０ＫＤａ）のサイズを有し、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満又は１０％未満のアミノ基がアセチル化されるように脱アセチル化されている。
一実施形態において、ＰＮＡＧは、その２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．１％未満の残基でＯ−スクシニル化されていないか又はＯ−スクシニル化されている。
脱アセチル化ＰＮＡＧ（ｄＰＮＡＧ）という用語は、そのアミノ基の６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満又は５％未満がアセチル化されているＰＮＡＧ多糖又はオリゴ糖を指す。
本明細書で用いる「ＰＮＡＧ」という用語は、その糖のアセチル化形態及び脱アセチル化形態の両方を含む。
一実施形態では、天然の多糖を化学的に処理することにより、ＰＮＡＧを脱アセチル化して、ｄＰＮＡＧを形成する。例えば、天然ＰＮＡＧを塩基性溶液で処理し、ｐＨが１０を超えるようにする。例えば、０．１〜５Ｍ、０．２〜４Ｍ、０．３〜３Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．７５〜１．５Ｍ、又は１ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＮＨ４ＯＨでＰＮＡＧを処理する。処理は、２０〜１００℃、２５〜８０℃、３０〜６０℃若しくは３０〜５０℃又は３５〜４５℃の温度で、少なくとも１０若しくは３０分、又は１、２、３、４、５、１０、１５若しくは２０時間かけて実施する。ｄＰＮＡＧは、ＷＯ０４／４３４０５号に記載されているように調製することもできる。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に含まれる多糖（複数でもよい）は、以下に記載するようにキャリアタンパク質と結合させる。
黄色ブドウ球菌由来の５型及び８型多糖
ヒトへの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌のほとんどの菌株が、５型又は８型多糖のいずれかを含む。約６０％のヒト菌株が８型であり、約３０％が５型である。５型及び８型莢膜多糖抗原の構造は、Moreauら、Carbohydrate Res. 201; 285 (1990)及び Fournierら、Infect. Immun. 45; 87 (1984) に記載されている。両者とも、その反復単位にＦｕｃＮＡｃｐと、スルフヒドリル基を導入するのに用いることができるＭａｎＮＡｃＡを有する。
近年（Jones, Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)）、ＮＭＲ分光学的方法により、これらの莢膜多糖の構造は以下に示す構造に訂正された：
５型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
８型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
多糖は、当業者に周知の方法（例えば、米国特許第６２９４１７７号に記載の方法）を用いて、黄色ブドウ球菌の適当な菌株から抽出することができる。例えば、ＡＴＣＣ１２９０２は５型黄色ブドウ球菌株であり、ＡＴＣＣ１２６０５は８型黄色ブドウ球菌株である。５型及び８型多糖は、Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367に記載されているように黄色ブドウ球菌から抽出することができる。
多糖は天然のサイズでもよいし、あるいは、例えば、マイクロ流動化、超音波照射又は化学処理によりサイジングしてもよい。本発明は、黄色ブドウ球菌由来の５型及び８型多糖から誘導されたオリゴ糖をも包含する。
本発明の免疫原性組成物に含まれる５型及び８型莢膜多糖又はオリゴ糖は、Ｏ−アセチル化されている。一実施形態において、５型莢膜多糖又はオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％又は８０〜９０％である。一実施形態において、８型莢膜多糖又はオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％又は８０〜９０％である。一実施形態において、５型及び８型莢膜多糖又はオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％又は８０〜９０％である。
本発明の免疫原性組成物に含まれる５型及び８型多糖は、場合により、後述するようにキャリアタンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。
本発明の免疫原性組成物は、場合により、５型若しくは８型多糖のいずれか、又はこれらの両者を含んでもよい。
黄色ブドウ球菌３３６抗原
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第６２９４１７７号に記載の黄色ブドウ球菌３３６抗原を含む。
３３６抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、Ｏ−アセチル基を含まず、黄色ブドウ球菌３３６型（ＡＴＣＣ ５５８０４として寄託）に対する抗体と特異的に結合する。
一実施形態において、３３６抗原は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動化、超音波照射又は化学処理によりサイジングされたものであってもよい。本発明はまた、３３６抗原から誘導されたオリゴ糖をも包含する。
３３６抗原は、本発明の免疫原性組成物に含有させる場合、場合により、後述するようにキャリアタンパク質と結合させるか、あるいは、結合させない。
表皮ブドウ球菌由来のＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型多糖
表皮ブドウ球菌のＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株及びＳＥ−１０株は、３つの異なる型の莢膜、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型を特徴とする（Ichiman及びYoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229）。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出される莢膜多糖は、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型多糖を形成する。多糖は、いくつかの方法（例えば、米国特許第４１９７２９０に記載の方法、又はIchimanら、1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176に記載の方法など）により抽出することができる。
本発明の一実施形態では、免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌由来のＩ型及び／又はＩＩ型及び／又はＩＩＩ型多糖又はオリゴ糖を含む。
多糖は、天然のサイズの多糖であるか、あるいは、例えば、マイクロ流動化、超音波照射又は化学的切断によりサイジングされたものである。本発明はまた、表皮ブドウ球菌株から抽出されたオリゴ糖も包含する。
これらの多糖は、結合させないか、あるいは、場合により、後述するように結合させる。
多糖の結合（コンジュゲート）
ワクチン接種に多糖を使用することに付随する問題の中で、多糖それ自体は不十分な免疫原であるという事実がある。この免疫原性の欠如を克服するために設計されている戦略には、バイスタンダーＴ細胞の助けをもたらす大きなタンパク質キャリアに多糖を結合することがある。本発明に使用する多糖をバイスタンダーＴ細胞の助けをもたらすタンパク質キャリアに結合することが好ましい。多糖又はオリゴ糖免疫原にカップリングするために現在使用されているこのようなキャリアの例としては、ジフテリア及び破傷風トキソイド（それぞれＤＴ、ＤＴ ＣＲＭ１９７及びＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、並びに、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）由来のプロテインＤ、ニューモリシン、又はこれらのうちいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片として、Ｔヘルパーエピトープを含む断片が挙げられる。特に、プロテインＤ断片は、そのタンパク質のＮ末端側の３分の１を含んでいるのが好ましい。プロテインＤは、インフルエンザ菌由来のＩｇＤ結合タンパク質である（ＥＰ０ ５９４ ６１０Ｂ１）。
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が脱Ｎ−アセチル化されているブドウ球菌ＰＮＡＧ（すなわち、残基の４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がＮ−アセチル化されている）であって、ＰＮＡＧのアミン基に結合したリンカーによりＰＮＡＧがキャリアタンパク質と結合（コンジュゲート）してＰＮＡＧ複合体を形成しているＰＮＡＧを含む。
「リンカー」という用語は、完全な複合体（コンジュゲート）においてＰＮＡＧとキャリアタンパク質とを共有結合により連結する分子を意味する。リンカーは、結合反応に使用した２つの分子の共有結合から生じるものでありうる。あるいは、リンカーは、結合反応に用いた１つの分子に由来するものであってもよいし、又は結合反応に用いた３つの分子に由来するものであってもよい。一実施形態において、リンカーは、ＰＮＡＧのアミンに由来するＮＨと、キャリアタンパク質のカルボン酸基に由来するＣＯとの単一ペプチド結合でありうる。
ＰＮＡＧのアミン基は、グルコサミン環の一級アミンであり、リンカーとの結合後に二級アミンとなる。
一実施形態において、リンカーはキャリアタンパク質のアミン基に結合している。例えば、キャリアタンパク質のアミン基は、キャリアタンパク質のリジン残基又はアミノ末端である。
あるいは、リンカーは、キャリアタンパク質のカルボン酸基、例えばキャリアタンパク質のグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基、又はカルボキシル末端に結合している。
一実施形態において、リンカーは、リンカーがＰＮＡＧ及びキャリアタンパク質のいずれか又は両方と共有結合している位置にペプチド結合を含む。一実施形態において、リンカーは、第１にリンカーがＰＮＡＧと共有結合している位置に、第２にリンカーがキャリアタンパク質と共有結合している位置に、２つのペプチド結合を含む。
一実施形態において、リンカーは、１〜４０、５〜３０、５〜２０、１０〜２０、１２〜１８、１４〜１６又は１〜５オングストロームの長さである。
一実施形態において、リンカーはマレイミド基を含む。場合により、マレイミド基は、硫黄原子に結合（すなわち共有結合）している。
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（Ｉ）である：
Figure 2009531388
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。例えば、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。例えば、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（ＩＩ）の構造を有する：
Figure 2009531388
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（ＩＩＩ）の構造を有する：
Figure 2009531388
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（ＩＶ）の構造を有する：
Figure 2009531388
〔式中、Ｒは、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合である〕。例えば、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アルキル、Ｃ４−Ｃ８アルキル、又はＣ６アルキルである。
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（Ｖ）の構造を有する：
Figure 2009531388
〔式中、Ｒは、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合である〕。例えば、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ３−Ｃ１０アルキル、Ｃ４−Ｃ８アルキル、又はＣ６アルキルである。
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（ＶＩ）である：
Figure 2009531388
〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される〕。例えば、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。例えば、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルキル、Ｃ３−Ｃ４アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、又はＣ５アルキルである。例えば、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、Ｃ２及びＣ２；Ｃ２及びＣ３；Ｃ２及びＣ４；Ｃ２及びＣ５；Ｃ３及びＣ２；Ｃ３及びＣ３；Ｃ３及びＣ４；Ｃ３及びＣ５；Ｃ４及びＣ２；Ｃ４及びＣ３；Ｃ４及びＣ５；Ｃ５及びＣ２；Ｃ５及びＣ４；Ｃ５及びＣ３；Ｃ５及びＣ４；又はＣ５及びＣ５である。
一実施形態において、ＰＮＡＧ複合体は、式（ＶＩＩ）である：
Figure 2009531388
一実施形態において、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、インフルエンザ菌プロテインＤ、緑膿菌エキソプロテインＡ、肺炎球菌ニューモリシン及びαトキソイドからなる群より選択される。
一実施形態において、キャリアタンパク質は、以下からなる群より選択されるブドウ球菌タンパク質又はその断片を含む。すなわち、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン（自己溶菌酵素）、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、及びＮｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ突然変異体、並びにＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）。
本発明の免疫原性組成物において使用するための別のキャリアタンパク質は、単一のブドウ球菌タンパク質又はその断片、あるいは少なくとも１、２、３若しくは４の又は正確に１、２、３若しくは４の又はそれ以上の後述する項目で例示するブドウ球菌タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質である。
ブドウ球菌ワクチンに関して使用するのに特に有利と考えられる新規なキャリアタンパク質は、ブドウ球菌αトキソイドである。これは結合の過程で毒性が低減することから、この天然形態を多糖と結合させてもよい。好ましくは、残留毒性がより低減するため、Ｈｉｓ３５Ｌｅｕ又はＨｉｓ３５Ａｒｇ変異体のような遺伝的に解毒したαトキシンをキャリアとして使用する。あるいは、架橋試薬、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドでの処理により、αトキシンを化学的に解毒する。場合により、遺伝的に解毒したαトキシンを、好ましくは、架橋試薬、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドでの処理により化学的に解毒し、毒性をさらに低減してもよい。他のブドウ球菌タンパク質又はその断片、特に上記で例示したものを、上記で例示した多糖のためのキャリアタンパク質として使用しうる。キャリアタンパク質は、少なくとも１、２、３、４若しくは５の又は正確に１、２、３、４若しくは５の上記で例示したブドウ球菌タンパク質を含む融合タンパク質であってもよい。
ＰＮＡＧ又は多糖は、公知の方法（例えば、Marburgによる米国特許第４８３０８５２号、Likhiteによる米国特許第４，３７２，９４５号、Armorらによる米国特許第４，４７４，７５７号、Jenningsらによる米国特許第４，３５６，１７０号、又はKossaczka及びSzu Glycoconjugates Journal 17, 425-433. 2000）によりキャリアタンパク質（複数でもよい）と結合させることができる。あるいは、ＣＤＡＰ結合化学を実施する（ＷＯ９５／０８３４８号参照）。
ＣＤＡＰでは、シアニル化試薬である１−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＡＤＰ）を多糖−タンパク質複合体の合成のために使用することが好ましい。シアニル化反応は、アルカリ感受性多糖の加水分解を回避するような比較的穏やかな条件下で実施する。この合成により、キャリアタンパク質への直接カップリングが可能である。
多糖は、水又は生理食塩水溶液に溶解する。ＣＤＡＰは、アセトニトリルに溶解して、すぐに多糖溶液に添加する。ＣＤＡＰは多糖のヒドロキシル基と反応して、シアン酸エステルを生成する。活性化ステップの後、キャリアタンパク質を添加する。リジンのアミノ基は活性化多糖と反応して、イソ尿素共有結合を形成する。カップリング反応後、大過剰のグリシンを添加して、残りの活性化官能基をクエンチする。続いて生成物をゲル浸透カラムに通して未反応のキャリアタンパク質と残りの試薬を除去する。
一実施形態において、ＰＮＡＧは、例えば、カルボジイミド化学を利用して、例としてＥＤＡＣ（Kossaczka及びSzu Glycoconjugates Jouranl 17; 425-433, 2000）を用いて、ＰＮＡＧのアミン基とキャリアタンパク質のカルボキシル基との結合を行う方法によって結合させる。一実施形態において、ＰＮＡＧは、スペーサー、例えば二官能性スペーサーを介してキャリアタンパク質に結合させる。スペーサーは、場合によりヘテロ二官能性であってもよいし、又はホモ二官能性であってもよく、例えば、１つの反応性アミノ基と１つの反応性カルボン酸基、２つの反応性アミノ基、又は２つの反応性カルボン酸基を有する。スペーサーは、例えば４〜２０、４〜１２、５〜１０個の炭素原子を有する。可能なスペーサーはＡＤＨである。他のスペーサーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（ＷＯ００／１０５９９号）、ニトロフェニル−エチルアミン（Geverら (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288）、ハロゲン化ハロアルキル（米国特許第４０５７６８５号）、グリコシド結合（米国特許第４６７３５７４号、米国特許第４８０８７００号）、及び６−アミノカプロン酸（米国特許第４４５９２８６号）が挙げられる。
ＣＤＡＰを用いた黄色ブドウ球菌莢膜多糖又はオリゴ糖の結合
本発明のさらなる実施形態において、細菌の糖（例えば黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖）とキャリアタンパク質とを含む複合体の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）細菌糖（例えば黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖）をシアニル化試薬で活性化して、活性化細菌（例えば黄色ブドウ球菌５型又は８型）多糖又はオリゴ糖を生成するステップ；及び
（ｂ）前記活性化細菌（例えば黄色ブドウ球菌５型又は８型）多糖又はオリゴ糖とキャリアタンパク質とを共有結合して、細菌（例えば黄色ブドウ球菌５型又は８型）多糖又はオリゴ糖複合体を生成するステップ
を含む方法を提供する。
本発明のシアニル化試薬の結合方法は、糖含有部分をタンパク質に結合（コンジュゲート）させるために使用することができる。例えば、細菌莢膜糖は、場合により血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ若しくはＹに由来するナイセリア（Neisseria）莢膜糖、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆ由来の肺炎球菌糖、５型若しくは８型株、表皮ブドウ球菌、ＧＢＳ、ＧＡＳ由来のブドウ球菌莢膜糖、又はインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）ＰＲＰから選択されるものである。
黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌の糖は、上述した特性のいずれをも有する。
例えば、黄色ブドウ球菌５型又は８型糖は、天然のサイズのものであってもよいし、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射又は化学処理によりサイジングされたものであってもよい。５型又は８型糖は、場合により、ＭＡＬＬＳで測定した場合に１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、３００〜１０００ｋＤａ、３０〜３００ｋＤａ、１０〜１００ｋＤａ又は５〜５０ｋＤａの分子量を有しうる。また５型又は８型糖は、場合により、粘度が１〜３、２．０〜３．０、２．５〜２．９又は２．６〜２．８ｃｐとなるようにサイジングしてもよい。
５型又は８型多糖又はオリゴ糖は、場合により、Ｏ−アセチル化の程度が１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００又は８０〜１００％である。
本発明の方法において使用されるキャリアタンパク質は上述したとおりである。一実施形態において、キャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、緑膿菌エキソプロテインＡ、インフルエンザ菌プロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン及びブドウ球菌タンパク質又はその断片からなる群より選択される。ブドウ球菌タンパク質又はその断片は、場合により、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、プロテインＡ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、ＭＲＰＩＩ、Ｍｇ２＋輸送体、プロテインＡ、Ａａａ、Ａｎｔ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択される。
一実施形態において、シアニル化試薬は、１−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラボレート（ＣＤＡＰ）である。
一実施形態において、５型又は８型多糖又はオリゴ糖は、例えばイソ尿素共有結合を介して、キャリアタンパク質と直接結合している。
一実施形態において、５型又は８型多糖又はオリゴ糖はスペーサーを介してキャリアタンパク質と結合している。黄色ブドウ球菌多糖とキャリアタンパク質とをスペーサーを介して結合（コンジュゲート）させるために、以下の方法を使用した。制御条件下にてシアニル化剤である１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により多糖を活性化するカップリング化学によって多糖とスペーサー（例えばＡＤＨ）との共有結合を実施する。スペーサーはシアニル化多糖（ＰＳ）とそのヒドラジノ基を介して反応し、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
一実施形態において、スペーサーは、二官能性である、及び／又はＣ４−１２アルキル基を含む、及び／又は２つのアミノ基を含む、及び／又は２つのカルボン酸基を含む。一実施形態において、スペーサーはＡＤＨである。
一実施形態において、ステップ（ａ）におけるシアニル化試薬と多糖又はオリゴ糖との比は、０．２５／１〜１／１（ｗ／ｗ）又は０．３／１〜０．７／１（ｗ／ｗ）、０．５〜０．７５、又は約０．５／１又は約０．７５／１である。
一実施形態において、ステップ（ａ）は、ｐＨ５．０〜７．０、ｐＨ５．５〜６．５、又はｐＨ６．０付近で行われる。
一実施形態において、ステップ（ａ）は、３０秒〜１０分、１分〜５分、又は２〜５分かけて行われる。
一実施形態において、ステップ（ａ）は、ｐＨ８．０〜１０．０又はｐＨ９．０付近にｐＨを上昇させることにより終了する。
一実施形態において、ステップ（ｂ）におけるキャリアタンパク質と５型又は８型多糖又はオリゴ糖との比は、１／１〜１０／１、１．１／１〜５／１又は１．２／１〜２．５／１（ｗ／ｗ）である。
一実施形態において、ステップ（ｂ）は、ｐＨ８．０〜１０．０又はｐＨ９．０付近で行われる。
一実施形態において、ステップ（ｂ）は、１０分〜１２時間、２５分〜４時間、３０分〜２時間、又は約１時間かけて行われる。
一実施形態において、本方法は、５型又は８型多糖又はオリゴ糖複合体と、少なくとも１つのさらなるブドウ球菌抗原、例えば上述したブドウ球菌抗原（糖及びタンパク質など）のいずれか、とを混合するさらなるステップを含む。
一実施形態において、本発明の方法は、５型又は８型多糖又はオリゴ糖複合体と、薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤とを混合して、ワクチンを生成するさらなるステップを含む。一実施形態において、複合体をアジュバントと混合する。以下に記載する任意の賦形剤又はアジュバントを複合体と混合することができる。
本発明のさらなる態様は、黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖と、イソ尿素共有結合を含むリンカーによって結合したキャリアタンパク質とを含む複合体である。
一実施形態において、黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖は上述した特性のいずれをも有する。これは、例えば、上述したように場合により天然のサイズでもよいし又はサイジングされていてもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明の方法により得られる複合体である。
本発明のさらなる態様は、本発明の複合体及び薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、場合によりアジュバントを含むワクチンである。賦形剤及びアジュバントは場合により以下に記載するものである。
本発明のさらなる態様は、本発明の複合体を混合するステップ、及び薬学的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、ワクチンの製造方法である。
本発明のさらなる態様は、本発明のワクチンをそれを必要とする患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌感染の予防又は治療方法である。一実施形態において、この方法は以下に記載のものである。
本発明のさらなる態様は、ブドウ球菌感染の治療又は予防のためのワクチンの製造における、本発明の複合体の使用である。
タンパク質
本発明の免疫原性組成物は、場合により、さらにブドウ球菌タンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌由来のタンパク質）を含んでもよい。本発明のいくつかの実施形態は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方に由来するタンパク質を含む。本発明の免疫原性組成物は、図１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性、場合により少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７〜９９％又は厳密な同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を含む。
タンパク質を本明細書で具体的に言及する場合、天然又は組換えの全長タンパク質、あるいは場合により任意のシグナル配列が除去された成熟タンパク質を指すことがある。タンパク質は、ブドウ球菌株から直接単離してもよいし、又は、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。タンパク質の免疫原性断片は、本発明の免疫原性組成物に含めることができる。これらの断片は、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、又は少なくとも１００アミノ酸を含み、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取り出される。さらに、かかる免疫原性断片は、通常、ブドウ球菌タンパク質に対して作製された抗体、又はブドウ球菌による哺乳動物宿主の感染により作り出される抗体と、免疫学的に反応するか、あるいはＴ細胞エピトープを含む。一実施形態において、免疫原性断片はまた、有効量で（単独で又はキャリアと結合したハプテンとしてのいずれかで）投与した際に、ブドウ球菌感染に対する防御免疫応答を誘発する断片も包含する。この防御免疫応答は、場合により黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌感染を防御するものである。かかる免疫原性断片としては、例えば、Ｎ末端リーダー配列、及び／又は膜貫通ドメイン、及び／又はＣ末端アンカードメインを欠損するタンパク質が挙げられる。一実施形態において、本発明の免疫原性断片は、図１から選択される配列に対して断片配列の全長にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性を有する、タンパク質の実質的に全ての細胞外ドメインを含む。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ブドウ球菌タンパク質又はブドウ球菌タンパク質の断片の融合タンパク質を含んでいてもよい。このような融合タンパク質は、組換え技術によって作製することができ、少なくとも２、３、４、５又は６のブドウ球菌タンパク質の一部（例えば、以下に列挙するブドウ球菌タンパク質の組み合わせ）を含むことができる。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも２、３、４又は５のブドウ球菌タンパク質の複数部分を含んでいてもよい。これらは、異なるブドウ球菌タンパク質又は同一タンパク質におけるその断片の組み合わせであってもよい。あるいは、本発明は、Ｔ細胞エピトープを提供する配列又は精製タグ（例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、ポリヒスチジン）、ウイルス表面タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスの血球凝集素）、又は細菌タンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７））のような異種配列との融合タンパク質などの、ブドウ球菌タンパク質又はその断片の単一の融合タンパク質も包含する。融合タンパク質は、本発明の免疫原性組成物中に遊離タンパク質として存在することができ、あるいは、糖に結合したキャリアタンパク質であってもよい。
タンパク質
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに以下で述べる１以上のタンパク質又はその免疫原性断片を含む。タンパク質の多くは、細胞外成分結合タンパク質、輸送体タンパク質、又はトキシン及び病原性調節因子のカテゴリーに含まれる。本発明の免疫原性組成物は、場合により、さらに、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質、ブドウ球菌輸送体タンパク質、又はブドウ球菌トキシン若しくは病原性調節因子を含む。本発明の免疫原性組成物は、場合により、少なくとも１、２、３、４、５若しくは６の又は正確に１、２、３、４、５若しくは６のブドウ球菌タンパク質を含む。
以下の表１は、図１及び図２においてそれぞれ示された好ましいタンパク質配列及びＤＮＡ配列の配列番号を示している。ＳＡは、黄色ブドウ球菌由来の配列を示し、またＳＥは表皮ブドウ球菌由来の配列を示す。
Figure 2009531388
Figure 2009531388
細胞外成分結合タンパク質
細胞外成分結合タンパク質は、宿主細胞外成分に結合するタンパク質である。この用語は、限定されるものではないが、接着因子を包含する。
細胞外成分結合タンパク質の例としては、ラミニン受容体（Naiduら J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177）、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質（米国特許第５８０１２３４号, Wiltshire及びFoster Infec. Immun. 2001, 69; 5198）、ＥｂｈＡ（Williamsら Infect. Immun. 2002, 70; 6805）、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）(Parkら 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）（Wastfelt及びFlock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347）、ＳＢＩ（Zhangら FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211）、オートリシン（自己溶菌酵素）（Ruppら 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038）、ＣｌｆＡ（米国特許第６００８３４１号, McDevittら Mol. Microbiol. 1994, 11; 237）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ（McCreaら Microbiology 2000, 146; 1535）、ＳｄｒＨ（McCreaら Microbiology 2000, 146; 1535）、リパーゼＧｅｈＤ（ＵＳ２００２／０１６９２８８）、ＳａｓＡ（Rocheら Microbiology 2003, 149; 643）、ＳａｓＣ（Rocheら Microbiology 2003, 149; 643）、ＳａｓＫ（Rocheら Microbiology 2003, 149; 643）、ＦｎｂＡ（Flockら Mol Microbiol. 1994, 12; 599, 米国特許第６０５４５７２号）、ＦｎｂＢ（ＷＯ９７／１４７９９号, Boothら 2001 Infec. Immun. 69; 345）、コラーゲン結合タンパク質Ｃｎａ（Visaiら 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837）、ＣｌｆＢ（ＷＯ９９／２７１０９号）、ＳｄｒＤ（ＷＯ９９／２７１０９号）、ＳｄｒＥ（ＷＯ９９／２７１０９号）、ＦｂｐＡ（Phonimdaengら 1988 J. Gen Microbiol.134; 75）、Ｎｐａｓｅ（Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999）、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ（Lonenzら FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145）、ＳｓａＡ（Langら FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213）、ＥＰＢ（Hussain及びHermann symposium on Staph Denmark 14-17th 2000）、ＳＳＰ−１（Veenstraら 1996, J. Bacteriol. 178; 537）、ＳＳＰ−２（Veenstraら 1996, J. Bacteriol. 178; 537）、１７ｋＤａヘパリン結合タンパク質ＨＢＰ（Fallgrenら 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547）、ビトロネクチン結合タンパク質（Liら 2001, Curr. Microbiol. 42; 361）、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ（ＷＯ９７／４８７２７号）、及びＭＡＰ（米国特許第５６４８２４０号）がある。
ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質
このタンパク質は、ＡＢＣ輸送体タンパク質であり、肺炎双球菌（S. pneumoniae）の接着因子ＰｓａＡのホモログ（相同体）である。このタンパク質は、高い免疫原性を有する３２ｋＤａのリポタンパク質であり、細菌細胞壁全体に分布している（Cockayneら Infect. Immun. 1998 66; 3767）。このタンパク質は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌において３２ｋＤａのリポタンパク質として発現され、スタフィロコッカス・ホミニス（S. hominis）においては４０ｋＤａのホモログが存在する。表皮ブドウ球菌において、このタンパク質は、鉄制御オペロンの成分である。これは、ストレプトコッカス・パラサンギス（Streptococcus parasanguis）のＦｉｍＡを含む接着因子、及び鉄輸送機能が立証された又は推測されているＡＢＣ輸送体ファミリーのリポタンパク質の両方に対して顕著な相同性が見られる。
米国特許第５，８０１，２３４号に開示された唾液結合タンパク質も、ＳｉｔＣの形態であり、本発明の免疫原性組成物に包含することができる。
ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢ
これらのタンパク質は、いずれもフィブリノーゲン結合活性を有し、血漿存在下で黄色ブドウ球菌が凝集形成する引き金となる。これらは、細胞壁関連タンパク質に共通するＬＰＸＴＧモチーフを含む。
ＣｌｆＡは米国特許第６００８３４１号に記載され、またＣｌｆＢはＷＯ９９／２７１０９号に記載されている。
血液凝固因子（ＦｂｐＡ）
このタンパク質は、黄色ブドウ球菌を血漿存在下で凝集形成させる引き金となるフィブリノーゲン結合タンパク質である。血液凝固因子に関しては、Phonimdaengら（J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83）、Phonimdaengら（Mol Microbiol 1990; 4:393-404）、Cheungら（Infect Immun 1995; 63:1914-1920）、及びShopsinら（J. CLin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456）に概説されている。
本発明の免疫原性組成物に包含される好ましい断片は、シグナルペプチド（Ｃ末端方向に２７アミノ酸）が除去された成熟タンパク質を含む。
血液凝固因子は、３つの異なるドメインを有する。コイルドコイル領域であるアミノ酸５９〜２９７、プロリン−グリシンリッチ領域であるアミノ酸３２６〜５０５、そしてβシート構造を有するアミノ酸５０６〜６４５に由来するＣ末端ドメインである。これらのドメインのそれぞれは、本発明の免疫原性組成物中に包含することのできる断片である。
ＳｄｒＧ
このタンパク質は、ＷＯ００／１２６８９号に開示されている。ＳｄｒＧは、血液凝固因子陰性のブドウ球菌において見いだされ、ＬＰＸＴＧ配列を含む細胞壁関連タンパク質である。
ＳｄｒＧは、シグナルペプチド（アミノ酸１〜５１）、フィブリノーゲン結合部位及びコラーゲン結合部位を含む領域（アミノ酸５１〜８２５）、２つのＣｎａＢドメイン（アミノ酸６２７〜６９８と７３８〜８０９）、ＳＤ反復領域（アミノ酸８２５〜１０００）、並びにアンカードメイン（アミノ酸１００９〜１０５６）を含む。
ＳｄｒＧの好ましい断片は、シグナルペプチド、及び／又はＳＤ反復領域、及びアンカードメインが除去されているポリペプチドを包含する。これらは、配列番号７０又は２０又は２１の、アミノ酸５０〜８２５、アミノ酸５０〜６３３、アミノ酸５０〜５９７（ＷＯ０３／７６４７０号の配列番号２）、アミノ酸２７３〜５９７（ＷＯ０３／７６４７０号の配列番号４）、アミノ酸２７３〜５７７（ＷＯ０３／７６４７０号の配列番号６）、アミノ酸１〜５４９、アミノ酸２１９〜５４９、アミノ酸２２５〜５４９、アミノ酸２１９〜５２８、アミノ酸２２５〜５２８を含む又はそれよりなるポリペプチドを包含する。
好ましくは、配列番号７０、２０又は２１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する配列を有するＳｄｒＧポリペプチドは、本発明の免疫原性組成物中に包含される。
本発明の組成物は、場合により上記ＳｄｒＧポリペプチドの断片を含んでもよい。
一実施形態において、断片は、シグナルペプチド及び／又はＳＤ反復ドメイン及び／又はアンカードメインが除去されている。例えば、配列番号７０のアミノ酸１〜７１３、１〜５４９、２２５〜５４９、２２５〜５２９、２４〜７１７、１〜７０７、１〜６９０、１〜６８０、１〜６７０、１〜６６０、１〜６５０、１〜６４０、１〜６３０、１〜６２０、１〜６１０、１〜６００、３４〜７０７、４４〜６９７、３６〜６８９に相当する配列、又は配列番号７０若しくは２０若しくは２１に対して８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
一実施形態において、シグナルペプチドが除去されている断片は、その断片のＮ末端にメチオニン残基を有し、正確な翻訳が確保されている。
一実施形態において、前記断片は、以下の配列を有する：
MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE
LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGST
IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY
VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE
ＥｂｈＡ及びＥｂｈＢ
ＥｂｈＡ及びＥｂｈＢは、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の双方で発現されるタンパク質であり（Clarke及びFoster Infect. Immun. 2002, 70; 6680, Williamsら Infect. Immun. 2002, 20; 6805）、フィブロネクチンと結合する。フィブロネクチンは細胞外マトリックスの重要な成分であるため、ＥｂｈＡ及びＥｂｈＢは、ブドウ球菌を宿主細胞外マトリックスに接着する上で重要な機能を有する。
Ｅｂｈタンパク質は大型で、１．１メガダルトンの分子量を有する。Ｅｂｈタンパク質の断片の使用は、製造や製剤化が容易なため完全な配列よりもむしろ利点がある。このタンパク質の中心領域は、フィブロネクチン結合部位を含む不完全な反復を包含する。以下に記載する一以上の反復ドメインを含む断片は、本発明の免疫原性組成物に包含するのに適した断片である。
Ｅｂｈタンパク質は、以下のコンセンサス配列を含むことを特徴とする１２７アミノ酸長の不完全な反復ユニットを含む：
L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A
又は
.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}
又は
.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......
〔ここで、「.」は、任意のアミノ酸を意味し、「. {10}」は、任意の１０個のアミノ酸を意味し、またI/Vはアミノ酸の二者択一的選択を意味する〕。
Kurodaら(2001) Lancet 357; 1225-1240、及び表２に開示された配列を参照することにより、Ｅｂｈタンパク質内の反復配列は容易に推定される。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に包含される断片は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は１０個以上の上記１２７アミノ酸の反復単位を含むタンパク質を包含する。かかる断片は、１２７アミノ酸反復領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の反復から構成されていてもよく、あるいは断片の一方の又は両方の末端に付加的なアミノ酸残基を有する１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の反復から構成されていてもよい。場合により、断片は、Clarkeら, Infection and Immunity 70, 6680-6687, 2002に記載されたような、３つの反復にまたがる約４４ｋＤａのＨ２ポリペプチド（アミノ酸３２０２〜３５９５）であってもよい。このような断片は、フィブロネクチンと結合することができ、及び／又は全Ｅｂｈタンパク質に応答する抗体を誘発することができるものであることが好ましい。
Ｅｂｈタンパク質は、フィブロネクチンと結合可能である。これらのポリペプチド配列の好ましい断片は、フィブロネクチンに結合する能力を保持している。フィブロネクチンへの結合は、Clarkeら（Infection and Immunity 70; 6680-6687 2002）によって説明されているように、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。
一実施形態において、前記断片は、Ｂ細胞又はヘルパーＴエピトープ（例えば、表３及び４に記載した断片／ペプチド）を含む断片である。
Ｅｂｈの全長配列における反復配列
Ｅｂｈの全長配列は、Kurodaら (2001) Lancet 357; 1225-1240に開示されている。以下の表は、１２７アミノ酸の反復の全長配列内での始まり及び終わりのアミノ酸残基を示す。
Figure 2009531388
１２７アミノ酸の反復に関するＢ細胞エピトープ予測
全長配列は、Kurodaら (2001) Lancet 357; 1225-1240に開示されている。全長配列のアミノ酸３２０４〜３３３１にコードされているこれらの反復の一つを選択して、エピトープ予測を行った。すなわち、以下の配列である：
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI
Figure 2009531388
ＥｂｈにおけるヘルパーＴ細胞エピトープ予測
全長配列は、ＴｒＥＭＢＬデータベースに、配列参照番号Ｑ８ＮＷＱ６で開示されている。全長配列のアミノ酸番号３２０４〜３３３１にコードされている、これらの反復の一つを選択し、エピトープ予測を行った。すなわち、以下の配列である：
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI
Figure 2009531388
本発明のタンパク質の断片は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプチドを生成するために使用することができる。したがって、これらの断片は、本発明の全長タンパク質を生成するための中間体として使用してもよい。
一実施形態において、いくつかの、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３個の、１若しくは２個の、又は１個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失、又は付加されている変異体が使用される。
エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）
ＥｂｐＳは分子量８３ｋＤａを有する、４８６アミノ酸を含むタンパク質である。このタンパク質は、黄色ブドウ球菌の細胞膜と関連し、膜内にこのタンパク質を留める３つの疎水性領域を有する（Downerら 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Parkら 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803）。
アミノ酸１〜２０５及び３４３〜４８６の２つの領域は、細胞膜の外側に露出した表面部となる。ＥｂｐＳのリガンド結合ドメインは、Ｎ末端の残基１４〜３４に位置する（Parkら 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845)。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に包含される断片は、エラスチン結合領域（アミノ酸１〜２０５）を含む表面露出断片である。場合により、前記断片は、露出ループ部の全てを含まないまでも、エラスチン結合領域（アミノ酸１４〜３４）を含む必要がある。使用可能な他の断片は、第二表面露出ループ部（アミノ酸３４３〜４８６）を形成するアミノ酸からなる。また、一方の又は両方の末端において最大１個、２個、５個、１０個、２０個、又は５０個のアミノ酸が少ない他の断片も使用できる。
ラミニン受容体
黄色ブドウ球菌のラミニン受容体は、病原性に重要な役割を果たす。感染の特性は、血流への侵入であり、それが広範囲に及ぶ転移性膿症の形成を可能にする。血流侵入には、血管基底膜を通過して浸出する能力が必要である。これは、ラミニン受容体を介したラミニンとの結合を介することで達成される（Lopesら Science 1985, 229; 275）。
ラミニン受容体は、表面露出しており、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌を含む多くのブドウ球菌株に存在する。
ＳＢＩ
Ｓｂｉは、プロテインＡに加えて、第２のＩｇＧ結合タンパク質であり、大部分の黄色ブドウ球菌株で発現している（Zhangら 1998, Microbiology 144; 985）。
Ｓｂｉの配列のＮ末端は、２９番アミノ酸の後に切断部位をもつ典型的なシグナル配列を有する。それゆえ、本発明の免疫原性組成物に使用することのできるＳｂｉの断片は、アミノ酸残基３０、３１、３２、又は３３番から始まり、Ｓｂｉ（例えば、配列番号２６）のＣ末端にまで続く。
ＳｂｉのＩｇＧ結合ドメインは、４１番〜９２番アミノ酸からこのタンパク質のＮ末端領域に向う領域として同定されている。このドメインは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインと相同性を有する。
Ｓｂｉの最小のＩｇＧ結合ドメインは、以下の配列を含む：
QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK
** *** * *** * * * * *
「＊」は、ＩｇＧ結合ドメイン間で類似のアミノ酸を示す。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に包含されるＳｂｉの断片は、ＩｇＧ結合ドメインを含む。この断片は、上記配列で「＊」によって示したようなＩｇＧ結合ドメインのコンセンサス配列を含む。場合により、断片は、上記で示す完全配列を含む又はそれからなるものである。場合により、断片は、Ｓｂｉ（例えば配列番号２６）の３０〜９２番、３３〜９２番、３０〜９４番、３３〜９４番、３０〜１４６番、３３〜１４６番、３０〜１５０番、３３〜１５０番、３０〜１６０番、３３〜１６０番、３３〜１７０番、３３〜１８０番、３３〜１９０番、３３〜２００番、３３〜２０５番、又は３３〜２１０番アミノ酸を含む又はそれからなる。
断片は、表示した配列に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。
断片は、ＩｇＧ結合ドメインの複数の反復（２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個）を含んでいてもよい。
ＥＦＢ−ＦＩＢ
Ｆｉｂは、黄色ブドウ球菌により細胞外培地中に分泌される１９ｋＤａのフィブリノーゲン結合タンパク質である。このタンパク質は、検証された黄色ブドウ球菌分離株の全てで産生される（Wastfelt及びFlock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347）。
黄色ブドウ球菌は、フィブリノーゲンの存在下で凝集し、フィブリノーゲン被覆表面に結合する。この能力は、カテーテル及び内皮細胞におけるブドウ球菌のコロニー形成（定着）を促進する。
Ｆｉｂは、該タンパク質のＮ末端にシグナル配列を含み、およそ３０番アミノ酸に推定切断部位を有する。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、成熟タンパク質（このタンパク質の約３０番アミノ酸からＣ末端）の配列を含む又はそれからなる。
Ｆｂｅ−ＥｆＢ／ＦＩＧ
Ｆｂｅは、表皮ブドウ球菌の多くの分離株に見られ、１１９ｋＤａの推定分子量を有するフィブリノーゲン結合タンパク質である（Nilssonら 1998. Infect. Immun. 66; 2666）。この配列は、黄色ブドウ球菌由来の凝集因子（ＣｌｆＡ）の配列と関連する。Ｆｂｅに対する抗体は、表皮ブドウ球菌のフィブリノーゲン被覆プレート及びカテーテルへの結合を阻害することができる（Pei及びFlock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52）。
Ｆｂｅは、５１番と５２番アミノ酸の間に切断部位がある推定シグナル配列を有する。それ故、Ｆｂｅの好ましい断片は、５２番アミノ酸からＣ末端（１，０９２番アミノ酸）に及ぶＦｂｅの成熟形態を含む。
Ｆｂｅの５２番アミノ酸から８２５番アミノ酸のドメインは、フィブリノーゲン結合に関与する。一実施形態において、Ｆｂｅの断片は、５２〜８２５番アミノ酸からなるか、又はそれを含む。
Ｆｂｅの３７３番〜５１６番のアミノ酸領域は、ＦｂｅとＣｌｆＡの間で最大の保存性を示す。一実施形態において、断片は、Ｆｂｅの３７３番〜５１６番アミノ酸を含む。
Ｆｂｅの８２５〜１０４１番アミノ酸は、縦列反復したアスパラギン酸とセリン残基からなる高度な反復領域を含む。
ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ
ＩｓａＡは、ＰｉｓＡとしても知られる２９ｋＤａのタンパク質であり、入院患者の敗血症の間の、免疫優性ブドウ球菌タンパク質であることが判明している（Lorenzら 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145）。
ＩｓａＡ配列の最初の２９アミノ酸は、シグナル配列であると考えられている。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に包含されるＩｓａＡの断片は、コード配列の３０番アミノ酸残基以降末端までを含む。
フィブロネクチン結合タンパク質
フィブロネクチン結合タンパク質Ａは、フィブロネクチンとの結合に関与するいくつかのドメインを含む（ＷＯ９４／１８３２７号）。それらは、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４と呼ばれる。一実施形態において、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ又はＢの断片は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ１〜Ｄ２、Ｄ２〜Ｄ３、Ｄ３〜Ｄ４、Ｄ１〜Ｄ３、Ｄ２〜Ｄ４又はＤ１〜Ｄ４を含む又はそれからなる。
フィブロネクチン結合タンパク質は、３６個のアミノ酸シグナル配列を含む。例えば、
VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA
である。
場合により、このシグナル配列が除かれた成熟タンパク質が、本発明の免疫原性組成物に包含される。
輸送体タンパク質
グラム陽性菌の細胞壁は、細菌内への代謝産物の自由拡散を防ぐ障壁として働く。タンパク質ファミリーは、細菌内への必須栄養素の通過を調整することから細菌の生存に必須である。輸送体タンパク質という用語は、鉄のような代謝産物と結合する最初のステップに関与するタンパク質、及び実際にその代謝産物を細菌内に輸送するのに関与するタンパク質を包含する。
鉄分子は、細菌の成育に必須の補因子である。シデロフォアは、分泌された後、遊離鉄と結合し、その後、細胞膜を通過する輸送のために鉄を送達する細菌表面受容体によって捕捉される。このクラスのタンパク質に対する免疫応答の誘発によってブドウ球菌が生存不能となるので、鉄の獲得はヒトへの感染の樹立に重要である。
輸送体タンパク質の例としては、免疫優性ＡＢＣ輸送体（Burnieら 2000 Infect. Imun. 68; 3200）、ＩｓｄＡ（Mazmanianら 2002 PNAS 99; 2293）、ＩｓｄＢ（Mazmanianら 2002 PNAS 99; 2293）、ＩｓｄＣ（ＷＯ０６／５９２４７号）、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ（Wiltshire及びFoster 2001 Infect. Immun. 69; 5198）、及びＮｉ ＡＢＣ輸送体が挙げられる。
免疫優性ＡＢＣ輸送体
免疫優性ＡＢＣ輸送体は、十分に保存されたタンパク質であり、異なるブドウ球菌株に対しても交差防御性の免疫応答を誘発することができる（Meiら 1997, Mol. Microbiol. 26; 399）。このタンパク質に対する抗体は、敗血症に罹患した患者で発見されている（Burnieら 2000, Infect. Immun. 68; 3200）。
免疫優性ＡＢＣ輸送体の任意の断片は、ペプチドＤＲＨＦＬＮ、ＧＮＹＤ、ＲＲＹＰＦ、ＫＴＴＬＬＫ、ＧＶＴＴＳＬＳ、ＶＤＷＬＲ、ＲＧＦＬ、より好ましくはＫＩＫＶＹＶＧＮＹＤＦＷＹＱＳ、ＴＶＩＶＶＳＨＤＲＨＦＬＹＮＮＶ及び／又はＴＥＴＦＬＲＧＦＬＧＲＭＬＦＳを包含し得る。これらの配列は、ヒト免疫系により認識されるエピトープを含むためである。
ＩｓｄＡ−ＩｓｄＢ
黄色ブドウ球菌のｉｓｄ（iron-regulated surface determinant：鉄制御型表面決定因子）遺伝子は、ヘモグロビン結合及びヘム鉄の細胞質移行に関与するタンパク質をコードする。ヘム鉄は、必須栄養素として作用する。ＩｓｄＡ及びＩｓｄＢは、ブドウ球菌の細胞壁に局在してる。ＩｓｄＡは、プロテイナーゼＫ消化感受性であることから細菌表面に露出していると考えられている。ＩｓｄＢは、部分的に消化されたことから、細菌表面上に部分的に露出していることが示唆されている（Mazmanianら 2003 Science 299; 906）。
ＩｓｄＡ及びＩｓｄＢは、いずれも２９ｋＤａのタンパク質で、ヘムと結合する。それらの発現は、Ｆｕｒリプレッサーを介して鉄利用可能性によって制御されている。それらは、鉄濃度が低い場合には、宿主に感染する間、高発現する。
前記タンパク質はＦｒｐＡ及びＦｒｐＢとしても知られている（Morrisseyら 2002, Infect. Immun. 70; 2399）。ＦｒｐＡ及びＦｒｐＢは、高い電荷をもつ主要な表面タンパク質である。それらは、プラスチックへの接着に大きく寄与することが判明している。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＷＯ０１／９８４９９号又はＷＯ０３／１１８９９号で開示されているＩｓｄＡ及び／又はＩｓｄＢの断片を含む。
トキシン及び病原性調節因子
このタンパク質ファミリーのメンバーは、αトキシン、溶血素、エンテロトキシンＢ及びＴＳＳＴ−１のようなトキシン、並びにＲＡＰのようなトキシンの生成を調節するタンパク質を含む。
αトキシン（Ｈｌａ）
αトキシンは、黄色ブドウ球菌の大部分の菌株によって産生される重要な病原性決定因子である。このタンパク質は、溶血作用をもった孔形成トキシンである。αトキシンに対する抗体は、動物モデルでαトキシンの有害な及び致死性の作用を中和することが示されている（Adlamら 1977 Infect. Immun. 17; 250）。ヒト血小板、内皮細胞、及び単核細胞は、αトキシンの作用に影響を受けやすい。
αトキシンの高い毒性は、免疫原として使用する前に解毒しておく必要性が求められる。これは、化学的処理によって、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、若しくは他の架橋剤を用いた処理によって、又はそれを下記で述べる細菌多糖と化学的に結合させることによって達成することができる。
毒性を除くさらなる方法は、毒性を除く一方でトキシンの抗原性は保持させる点突然変異を導入することである。αトキシンの３５番アミノ酸においてヒスチジン残基をロイシン残基で置換する点突然変異の導入は、毒性を除去する一方で抗原性の保持をもたらす（Menzies及びKernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839）。３５番のヒスチジンは、孔形成に必要な適切なオリゴマー化に重要であるらしく、この残基の変異は毒性の喪失をもたらす。
本発明の免疫原性組成物に取り入れる場合、αトキシンは、場合によりＨｉｓ３５の変異によって（例えば、Ｈｉｓ３５をＬｅｕ又はＡｒｇで置換することによって）解毒される。別の実施形態において、αトキシンは、免疫原性組成物の他の成分、例えば莢膜多糖又はＰＮＡＧと、最も好ましくは黄色ブドウ球菌５型及び／又は黄色ブドウ球菌８型多糖及び／又はＰＮＡＧと結合（複合体形成）することにより解毒される。
ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）
ＲＡＰは、それ自身はトキシンではないが、病原性因子の発現の調節因子である。ＲＡＰは、ブドウ球菌により産生され、分泌される。このタンパク質は、他のブドウ球菌のａｇｒ調節系を活性化し、かつ溶血素（ヘモリシン）、エンテロトキシンＢ及びＴＳＳＴ−１のような病原性因子の発現と、それに続く放出を活性化する。
他の免疫優性タンパク質
蓄積関連タンパク質（Ａａｐ）
Ａａｐは、１４０ｋＤａのタンパク質であり、表面上での表皮ブドウ球菌株の蓄積に必須である（Hussainら Infect. Immun. 1997, 65; 519）。このタンパク質を発現している菌株は著しく多量の生物膜を産生したことから、Ａａｐは生物膜形成に関与していると考えられている。Ａａｐに対する抗体は、生物膜形成を抑制し、また表皮ブドウ球菌の蓄積を抑制することができる。
ブドウ球菌分泌抗原（ＳｓａＡ）
ＳｓａＡは、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の双方で見出された３０ｋＤａの強力な免疫原性タンパク質である（Langら 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213）。心内膜炎罹患過程のその発現により、感染性疾患の発症に特異的な病原性の役割が示唆された。
ＳａａＡは、Ｎ末端リーダー配列及びシグナルペプチダーゼ切断部位を含む。リーダーペプチドの後に約１００アミノ酸の疎水性領域が３０番残基から１３０番残基まで続く。
本発明の免疫原性組成物中に包含されるＳｓａＡの任意の断片は、成熟タンパク質（２７番アミノ酸からＣ末端まで、又は３０番アミノ酸からＣ末端まで）から構成される。
さらなる任意の断片は、３０番アミノ酸から１３０番アミノ酸までのＳｓａＡの疎水性領域を含む。
組み合わせ
ブドウ球菌感染は、いくつかの異なる段階を経て進行する。例えば、ブドウ球菌の生活環は、片利共生定着、隣接する組織若しくは血流に接近することによる感染の開始、血液中での嫌気的増殖、黄色ブドウ球菌病原性決定因子と宿主防御機構との間の相互作用、並びに心内膜炎、転移性膿瘍形成及び敗血症候群などの合併症の誘発を含む。細菌表面上の異なる分子が感染サイクルの異なるステップに関与する。ブドウ球菌感染の異なるプロセスに関与する特定の抗原の組み合わせに対する免疫応答を標的とすることにより、ブドウ球菌機能は多面的局面で影響を受ける。またこれは優れたワクチン効率をもたらし得る。
特に、異なるクラスに由来するいくつかの抗原の組み合わせ（それらのいくつかは宿主細胞への接着に関与し、それらのいくつかは鉄獲得又は他の輸送体機能に関与し、それらのいくつかはトキシン又は病原性調節因子及び免疫優性抗原である）は、多段階の感染に対して防御する免疫応答を誘導することができる。
抗原のいくつかの組み合わせは、免疫応答を誘発する点で特に有効である。これは、実施例に記載したような動物モデルアッセイで、及び／又は実施例で記載したようなオプソニン食細胞アッセイを用いることで測定することができる。理論に縛られることなく、抗原の有効な組み合わせは、抗原の組み合わせに対する多くの免疫応答の特性によって可能となると考えられる。抗原自体は、通常ブドウ球菌細胞の表面上に露出しており、それらは保存されている傾向にあるが、単一抗原に対して誘発される抗体を用いて行われる最適な殺菌反応のために十分な量が表面細胞上に存在する傾向にはない。本発明の抗原を組み合わせることは、臨界閾値を越えてブドウ球菌細胞と相互作用する抗体の有利な組み合わせを誘発する製剤をもたらし得る。この臨界値において、十分な特性をもつ十分な抗体は、細菌表面に結合し、補体による効果的な殺傷、又は細菌の中和のいずれかを可能にする。これは、実施例で記載したような動物チャレンジモデル、又はオプソニン作用アッセイのいずれかで測定することができる。
本発明の好ましい免疫原性組成物は、ブドウ球菌内で異なる機能を有する少なくとも２つの異なるタンパク質カテゴリーから選択される複数のタンパク質を含む。そのようなタンパク質カテゴリーの例として、細胞外結合タンパク質、鉄獲得タンパク質のような輸送体タンパク質、トキシン若しくは病原性調節因子、及び他の免疫優性タンパク質が挙げられる。
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、以下の２、３又は４の異なる群から選択される２、３、４、５又は６以上のいくつかのタンパク質を含む：
・ａ群）細胞外成分結合タンパク質
・ｂ群）輸送体タンパク質
・ｃ群）トキシン又は病原性調節因子
・ｄ群）構造タンパク質。
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに以下の２、３又は４の群から選択される２、３、４、５又は６以上のいくつかのタンパク質を含む：
・ａ群）ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質又はその断片
・ｂ群）免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、Ｍｇ２＋輸送体、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌輸送体タンパク質又はその断片
・ｃ群）αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌病原性調節因子、トキシン又はそれらの断片
・ｄ群）ＭＲＰＩＩ及びオートリシンからなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌の構造タンパク質又はその免疫原性断片。
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、以下の２又は３の群から選択される２、３、４、５又は６以上のいくつかのタンパク質を含む：
・ａ群）ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質又はその免疫原性断片
・ｂ群）免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌輸送体タンパク質又はその免疫原性断片
・ｃ群）αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌病原性調節因子、トキシン又はそれらの免疫原性断片
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ａ群）から選択される少なくとも１のタンパク質と、ｂ群）及び／又はｃ群）から選択されるさらなるタンパク質とを含む。
さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ｂ群）から選択される少なくとも１の抗原と、ｃ群）及び／又はａ群）から選択されるさらなるタンパク質とを含む。
さらなる実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ｃ群）から選択される少なくとも１の抗原と、ａ群）及び／又はｂ群）から選択されるさらなるタンパク質とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質の任意の組み合わせは、ラミニン受容体と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｉｔＣと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＥｂｈＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＥｂｈＢと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＥｂｐＳと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＡ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＥＦＢ（ＦＩＢ）と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳＢＩと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、オートリシンと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＣｌｆＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｄｒＣと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｄｒＤと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｄｒＥと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｄｒＧと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、及びＲＡＰからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｄｒＨと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳａｓＦと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、リパーゼＧｅｈＤと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳａｓＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＦｎｂＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＦｎｂＢと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、Ｃｎａと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＣｌｆＢと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＦｂｐＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、Ｎｐａｓｅと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｓａＡと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＥＰＢと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳＳＰ−１と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳＳＰ−２と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＨＰＢと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ビトロネクチン結合タンパク質と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、フィブリノーゲン結合タンパク質と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、血液凝固酵素（コアグラーゼ）と、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、Ｆｉｇと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＭＡＰと、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、免疫優性ＡＢＣ輸送体と、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＩｓｄＡと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＩｓｄＢと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＳｉｔＣと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、αトキシン、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体、ＲＡＰ、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、αトキシンと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、αトキシンＨ３５Ｌ若しくはＨ３５Ｒ変異体と、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＲＡＰと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳａｓＦ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ、Ｎｉ ＡＢＣ輸送体、Ａａｐ及びＳｓａＡからなる群より選択される１、２、３、４又は５のさらなる抗原とを含む。
本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質のさらなる組み合わせは、ＩｓｄＡ及びＩｓｄＢ、ＩｓｄＡ及びＣｌｆＡ、ＩｓｄＡ及びＣｌｆＢ、ＩｓｄＡ及びＳｄｒＣ、ＩｓｄＡ及びＳｄｒＤ、ＩｓｄＡ及びＳｄｒＥ、ＩｓｄＡ及びＳｄｒＧ、ＩｓｄＡ及びＳａｓＦ、ＩｓｄＢ及びＣｌｆＡ、ＩｓｄＢ及びＣｌｆＢ、ＩｓｄＢ及びＳｄｒＣ、ＩｓｄＢ及びＳｄｒＤ、ＩｓｄＢ及びＳｄｒＥ、ＩｓｄＢ及びＳｄｒＧ、ＩｓｄＢ及びＳａｓＦ、ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢ、ＣｌｆＡ及びＳｄｒＣ、ＣｌｆＡ及びＳｄｒＤ、ＣｌｆＡ及びＳｄｒＥ、ＣｌｆＡ及びＳａｓＦ、ＣｌｆＢ及びＳｄｒＣ、ＣｌｆＢ及びＳｄｒＤ、ＣｌｆＢ及びＳｄｒＥ、ＣｌｆＢ及びＳａｓＦ、ＳｄｒＣ及びＳｄｒＤ、ＳｄｒＣ及びＳｄｒＥ、ＳｄｒＣ及びＳａｓＦ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ、ＳｄｒＤ及びＳａｓＦ、ＳｄｒＥ及びＳａｓＦを含む。
上記及び以下の組み合わせにおいて、特定されたタンパク質は、場合により、本発明の免疫原性組成物中に上記のような断片又は融合タンパク質として存在していてもよい。
３つのタンパク質の組み合わせ
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらに、αトキシン、細胞外成分結合タンパク質（例えば、接着因子）、及び、輸送体タンパク質（例えば、鉄結合タンパク質）を組み合わせた３つのタンパク質成分を含む。
前記組み合わせで、αトキシンは、化学的に解毒するか、又は点突然変異（複数でもよい）の導入（例えば、Ｈｉｓ３５Ｌｅｕ点突然変異）により遺伝学的に解毒することができる。αトキシンは、遊離タンパク質として存在するか、あるいは免疫原性組成物の多糖又はＰＮＡＧ成分と結合している。
組み合わせの例として、以下が含まれる：
αトキシンと、ＩｓｄＡと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される細胞外成分結合タンパク質とを含む免疫原性組成物；
αトキシンと、ＩｓｄＢと、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される細胞外成分結合タンパク質とを含む免疫原性組成物；
αトキシンと、ＩｓｄＡと、ラミニン受容体、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、オートリシン、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される接着因子とを含む免疫原性組成物；
αトキシンと、ＩｓｄＢと、ラミニン受容体、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、Ｆｉｇ、及びＭＡＰからなる群より選択される接着因子とを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びラミニン受容体を含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＥｂｈＡを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＥｂｈＢを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＥｂｐＳを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＥＦＢ（ＦＩＢ）を含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＳｄｒＧを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＣｌｆＡを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＣｌｆＢを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＦｎｂＡを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及び血液凝固酵素（コアグラーゼ）を含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＦｉｇを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＳｄｒＨを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＳｄｒＣを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＳｄｒＤを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＳｄｒＥを含む免疫原性組成物；
αトキシン、ＩｓｄＡ、及びＭＡＰを含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ及びＳｂｉを含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ及びＩｓｄＢを含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ及びＩｓｄＡを含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ及びＳｄｒＣを含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ及びＥｂｈ又は上記のその断片を含む免疫原性組成物；
Ｓｂｉ及びＳｄｒＣを含む免疫原性組成物；
Ｓｂｉ及びＥｂｈ又は上記のその断片を含む免疫原性組成物；
ＩｓａＡ、Ｓｂｉ又はＳｄｒＣを含む本発明の免疫原性組成物。
異なるクローン系列で発現される抗原の選択
黄色ブドウ球菌の集団構造と関連する病原性因子の発生の解析により、黄色ブドウ球菌の自然集団における可変的な病原性遺伝子の存在が明らかとなった。
黄色ブドウ球菌の臨床分離体のうち、少なくとも５つのクローン系列が高度に蔓延していることが明らかになった（Boothら, 2001 Infect Immun. 69(1):345-52）。α−ヘモリシン（ｈｌａ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）及び凝集因子Ａ（ｃｌｆＡ）は、系列の同一性の有無にかかわらず、大部分の分離体に存在することが判明した。これは、黄色ブドウ球菌の生存においてこれらのタンパク質が重要であることを示唆している（Boothら, 2001 Infect Immun. 69(1):345-52）。さらに、Peacockら 2002によれば、ｆｎｂＡ、ｃｌｆＡ、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、ｓｐａ、ｍａｐ、ｐｖｌ（Panton-Valentine ロイコシジン）、ｈｌｇ（γトキシン）、αトキシン、及びｉｃａの分布は、基礎となったクローン構造に無関連と思われる。これは、これらの遺伝子が少なからず水平伝播していることを示唆している。
一方、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、β−ヘモリシン（ｈｌｂ）、コラーゲン結合タンパク質（ｃｎａ）、ＴＳＳＴ−１（ｔｓｔ）、及びメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ）のような他の病原性遺伝子は、特定の系列と強く関連する（Boothら, 2001 Infect Immun. 69(1):345-52）。同様に、Peacockら（2002 (Infect Immun. 70(9):4987-96)）は、集団内のエンテロトキシン、ｔｓｔ、エクスフォリアチン（表皮剥脱毒素：ｅｔａ及びｅｔｂ）、β及びδトキシン、ｓｄｒ遺伝子群（ｓｄｒＤ、ｓｄｒＥ及びｂｂｐ）、ｃｎａ、ｅｂｐＳ及びｅｆｂの分布が、全てＭＬＳＴ由来のクローン複合体に著しく強く関連することを示した。
ＭＬＳＴデータによれば、院内感染症の原因である菌株が地域感染症を誘発する菌株又は無症状保菌者から回収された菌株と明らかに異なる亜集団であるという証拠はなかった（Feilら, 2003 J Bacteriol. 185(11):3307-16）。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、異なるクローン系列由来のブドウ球菌に対して有効である。
一実施形態において、免疫原性組成物は、ブドウ球菌の大部分の分離体で発現している１、２、３、４又は少なくとも１のタンパク質を含む。このようなタンパク質の例として、α−ヘモリシン（ｈｌａ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）及び凝集因子Ａ（ｃｌｆＡ）、血液凝固酵素（コアグラーゼ）、ｓｐａ、ｍａｐ、ｐｖｌ（Panton-Valentineロイコシジン）、ｈｌｇ（γトキシン)、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＲＡＰ、オートリシン（Ruppら 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038）、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳＰＯＩＩＩＥ（）、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、ＳａｓＦ（Rocheら 2003, Microbiology 149; 643）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＦｎｂＢ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ（Lorenzら Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145）、ＳａｓＨ（Rocheら 2003, Microbiology 149; 643）、ＭＲＰＩ、ＳａｓＤ（Rocheら Microbiology 149; 643）、ＳａｓＨ（Rocheら 2003, Microbiology 149; 643）、オーレオリシン前駆体（aureolysin precursor：ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１及び新規オートリシンが挙げられる。
他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、クローン株の異なる集団で発現する２以上のタンパク質を含む。場合により、抗原の組み合わせによって、複数のクローン株に対して、又は全てのクローン株に対して有効な免疫応答が生じることがある。例えば、組み合わせには、ＦｎｂＢ及びβ−ヘモリシン、ＦｎｂＢ及びＣｎａ、ＦｎｂＢ及びＴＳＳＴ−１、ＦｎｂＢ及びｍｅｃＡ、ＦｎｂＢ及びＳｄｒＤ、ＦｎｂＢ及びＳｄｒＦ、ＦｎｂＢ及びＥｂｐＳ、ＦｎｂＢ及びＥｆｂ、β−ヘモリシン及びＣｎａ、β−ヘモリシン及びＴＳＳＴ−１、β−ヘモリシン及びｍｅｃＡ、β−ヘモリシン及びＳｄｒＤ、β−ヘモリシン及びＳｄｒＦ、β−ヘモリシン及びＥｂｐＳ、β−ヘモリシン及びＥｆｂ、Ｃｎａ及びＴＳＳＴ−１、Ｃｎａ及びｍｅｃＡ、Ｃｎａ及びＳｄｒＤ、Ｃｎａ及びＳｄｒＦ、Ｃｎａ及びＥｂｐＳ、Ｃｎａ及びＥｆｂ、ＴＳＳＴ−１及びｍｅｃＡ、ＴＳＳＴ−１及びＳｄｒＤ、ＴＳＳＴ−１及びＳｄｒＦ、ＴＳＳＴ−１及びＥｂｐＳ、ＴｓｓＴ−１及びＥｆｂ、ＭｅｃＡ及びＳｄｒＤ、ＭｅｃＡ及びＳｄｒＦ、ＭｅｃＡ及びＥｂｐＳ、ＭｅｃＡ及びＥｆｂ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＦ、ＳｄｒＤ及びＥｂｐＳ、ＳｄｅＤ及びＥｆｂ、ＳｄｒＦ及びＥｂｐＳ、ＳｄｒＦ及びＥｆｂ、並びに、ＥｂｐＳ及びＥｆｂがある。
上記組み合わせは、上述したさらなる成分と組み合わせることもできる。
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌に対する防御
本発明の一実施形態において、免疫原性組成物は、ブドウ球菌の２以上の菌株に対して（例えば、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の双方に由来する菌株に対して）有効な免疫応答を提供する。例えば、防御免疫応答は、黄色ブドウ球菌の５型及び８型血清型に対して発生する。
本発明の免疫原性組成物の使用の一つは、院内感染を（例えば、選択的外科手術患者において）入院治療前に接種することにより予防することである。この段階では、患者がどのブドウ球菌株に晒されるのかを正確に予測することは困難である。それ故、種々のブドウ球菌株に対して有効な免疫応答を生じさせることができるワクチンを接種することが都合良い。
有効な免疫応答は、実施例で説明したようなマウスのチャレンジモデル又はオプソニン食作用アッセイにおいて有意な防御を付与する免疫応答として定義される。マウスチャレンジモデルにおける有意な防御とは、例えば、実施例５で示すように、キャリア接種マウスと比較してＬＤ５０の少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％又は２００％の増加として定義される。コットンラットチャレンジにおける有意な防御とは、例えば、実施例８で示すように、ＬｏｇＣＦＵ／鼻腔の平均測定値の少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％又は９０％の減少として定義される。オプソニン化抗体の存在は、防御と関連することが知られている。それ故、有意な防御は、例えば、実施例７のようにオプソニン食作用アッセイにおいて、細菌数の少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％又は９０％の減少によって示される。
免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥｂｈＡ／ＥｂｈＢ、ＥｂｐＳ及びＡａｐなどのいくつかのタンパク質は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌間でよく保存されており、また実施例８で、ＩｓａＡ、ＣｌｆＡ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＧ、ＨａｒＡ、ＦｎｂｐＡ及びＳｂｉが交差反応性免疫応答（例えば、黄色ブドウ球菌の少なくとも１株と表皮ブドウ球菌の少なくとも１株間での交差反応性）を生じ得ることが明らかとなった。ＰＩＡも黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌間でよく保存されている。
従って、一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＰＮＡＧ、並びに５型及び８型多糖、並びに１、２、３又は４の上記タンパク質を含むことができる。
ワクチン
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に、また任意でアジュバントと共に混合されて、ワクチンを形成する。
適当なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩があるが、カルシウム、マグネシウム、鉄、又は亜鉛の塩であってもよく、あるいはアシル化チロシン若しくはアシル化糖の不溶性懸濁液、陽イオン置換した若しくは陰イオン置換した糖、又はポリホスファゼンであってもよい。
一実施形態において、アジュバントはＴＨ１又はＴＨ２型応答のいずれかの優先的誘発物質となる。高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫応答の誘発を助ける傾向があるのに対し、高レベルのＴｈ２型サイトカインは、該抗原に対する体液性免疫応答の誘発を助ける傾向がある。
Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的ではないことに留意する必要がある。実際には、個体は、主にＴｈ１又は主にＴｈ２として表示される免疫応答を支持する。しかし、多くの場合、Ｍｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａｎによりマウスＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンについて記載されている（Mosmann, T.R.及びCoffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173）ような表現でサイトカインのファミリーを考えるのが好都合である。伝統的には、Ｔｈ１−型応答は、Ｔ−リンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生と関連している。Ｔｈ１−型免疫応答の誘発に直接関連することが多いその他のサイトカインは、Ｔ細胞（例えば、ＩＬ−１２）により産生されない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌に関連する。主にＴｈ１型応答を促進する好適なアジュバント系を以下に挙げる：モノホスホリルリピドＡ又はその誘導体、具体的には３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製については、ＧＢ２２２０２１１ Ａを参照）；並びに、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム若しくは水酸化アルミニウム）又は水中油型エマルションのいずれかと、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとの組合せ。このような組合せの場合、同じ粒状構造に抗原と３Ｄ−ＭＰＬを含有させることにより、抗原及び免疫刺激シグナルのさらに効率的な送達が可能になる。様々な研究から、３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強できることが明らかにされた［Thoelenら、Vaccine (1998) 16:708-14；ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］。
増強された系には、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ９４／００１５３号に開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又は、ＷＯ９６／３３７３９号に開示されているように、ＱＳ２１をコレステロールでクエンチングする低反応原性（less reactogenic）組成物が含まれる。水中油型エマルションにＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを含む、可能性あるアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０号に記載されている。場合により、前記に加え、ワクチンはサポニン、例えばＱＳ２１を含む。製剤は、さらに水中油型エマルションとトコフェロール（ＷＯ９５／１７２１０号）を含んでもよい。本発明は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、３Ｄ−ＭＰＬと一緒に本発明の免疫原性組成物を混合することを含む、ワクチン製剤の製造方法も提供する。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５号）もまたＴＨ１応答の好ましい誘導物質であり、本発明における使用に適している。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、リポソーム又はＩＳＣＯＭ構造を形成するものである。
ＱＳ２１：ステロールの比は、典型的におよそ１：１００〜１：１重量／重量である。好ましくは、過剰ステロールが存在し、ＱＳ２１：ステロールの比は、少なくとも１：２ｗ／ｗである。ヒトへの投与のために、典型的には、ＱＳ２１とステロールは、１用量当たり約１μｇ〜約１００μｇ、好ましくは約１０μｇ〜約５０μｇの範囲でワクチンに存在する。
リポソームは、典型的には、中性脂質、例えば、ホスファチジルコリンを含み、これは、室温で非晶質であるのが好ましく、例えば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン又はジラウリルホスファチジルコリンである。リポロームはまた、飽和脂質からなるリポソームのリポソーム−ＱＳ２１構造の安定性を高める荷電脂質を含んでもよい。これらのケースでは、荷電脂質の量は好ましくは１〜２０％ｗ／ｗ、最も好ましくは５〜１０％である。ステロールとリン脂質の比は１〜５０％（モル／モル）、典型的には２０〜２５％である。
場合により、本発明の組成物は、ＭＰＬ（３−脱アシル化モノ−ホスホリルリピドＡ、３Ｄ−ＭＰＬとしても知られる）を含む。３Ｄ−ＭＰＬは、３種類の脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５若しくは６のアシル化鎖との混合物としてＧＢ２ ２２０ ２１１（Ｒｉｂｉ）から知られ、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ（モンタナ州）により製造される。可能な形態は、国際特許出願９２／１１６５５６に開示されている。
本発明の好適な組成物は、初めに、ＭＰＬなしでリポソームを調製し、次に、好ましくは１００ｎｍ粒子としてＭＰＬを添加する。従って、ＭＰＬは小胞膜内に含まれない（ＭＰＬアウトとして知られる）。ＭＰＬが小胞膜内に含まれる（ＭＰＬインとして知られる）組成物も本発明の一形態をなす。抗原は、小胞膜内又は小胞膜外のいずれに含有させてもよい。場合により可溶性抗原は膜外にあり、また、疎水性若しくは脂質化抗原は膜内又は外のいずれに含有させてもよい。
本発明のワクチン製剤を用いて、全身又は粘膜経路を介した該ワクチンの投与により、感染しやすい哺乳動物を防御又は治療することができる。このような投与としては、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路による注射；又は、口内／消化管、気道、尿生殖管への粘膜投与が挙げられる。肺炎又は中耳炎の治療のためにはワクチンの鼻内投与が好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭保菌はより効率的に予防され、それゆえ初期段階で感染が減弱する）。本発明のワクチンは単一用量として投与することもできるが、その成分を同時に、又は時間を変えて共投与してもよい（例えば、免疫応答相互の最適な協調を達成するために、肺炎球菌多糖は、ワクチンの細菌タンパク質成分の投与と同時に、又はその１〜２週間後、別々に投与することができる）。共投与のために、任意のＴｈ１アジュバントを様々な投与の一部又は全部に存在させてもよい。例えば、これは、ワクチンの細菌タンパク質成分と組み合わせて含有させることができる。単一の投与経路以外にも、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、多糖をＩＭ（又はＩＤ）投与し、細菌タンパク質をＩＮ（又はＩＤ）投与することができる。さらには、本発明のワクチンを初回免疫ではＩＭ投与し、追加免疫ではＩＮ投与することも可能である。
各ワクチン用量における複合（コンジュゲート）抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な有害副作用を起こさずに、免疫防御応答を誘導する量として選択する。このような量は、使用する具体的な免疫原、及びその提示方法に応じて変動する。一般に、各用量は、０．１〜１００μｇの糖、多糖複合体の場合には０．１〜５０μｇ、０．１〜１０μｇ、１〜１０μｇ、又は１〜５μｇを含む。
ワクチンにおけるタンパク質抗原の含量は、典型的には１〜１００μｇ、５〜５０μｇ、又は５〜２５μｇの範囲である。最初のワクチン接種後、適切な間隔をおいて、１又は複数回の追加免疫を被験者に実施してもよい。
ワクチン製剤は、Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach”（Powell M.F.及びNewman M.J.編）（1995 Plenum Press New York））に概要が記載されている。リポソームへの封入はFullertonによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
本発明のワクチンは溶液として、又は凍結乾燥させて保存することができる。場合により、スクロース、トレハロース若しくはラクトースのような糖の存在下で溶液を凍結乾燥する。典型的には、凍結乾燥し、使用前に即時に再構成するものである。凍結乾燥によって、さらに安定した組成物（ワクチン）が得られる。
方法
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物及びワクチンの製造方法を包含する。
一実施形態において、本発明の方法は、抗原を混合して本発明の免疫原性組成物を生成するステップ、及び薬学的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、ワクチンの製造方法である。
治療方法
本発明はまた、ブドウ球菌感染、特に、病院で獲得する院内感染の治療方法も包含する。
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、選択的外科手術の場合に用いるのが特に有利である。このような患者は、手術日が事前にわかっているため、前もって接種することができる。黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌感染に患者が暴露されるかどうかはわからないため、前述したように、両方を防御する本発明のワクチンを接種するのが好ましい。典型的には、選択的外科手術を待機中の１６歳を超える成人を本発明の免疫原性組成物及びワクチンで処置する。あるいは、選択的外科手術を待機中の３〜１６歳の小児を本発明の免疫原性組成物及びワクチンで処置する。
本発明のワクチンで保健機関職員を接種することも可能である。
本発明のワクチン製剤を用いて、全身又は粘膜経路から上記ワクチンを投与することにより、感染しやすい哺乳動物を防御又は治療することができる。このような投与として、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下経路による注射；又は、口内／消化管、気道、尿生殖管への粘膜投与が挙げられる。
各ワクチン用量における抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意な有害副作用を起こすことなく、免疫防御応答を誘導する量として選択する。このような量は、使用する具体的な免疫原、及びその提示方法に応じて変動する。ワクチンのタンパク質含量は、典型的には１〜１００μｇ、５〜５０μｇ、典型的には１０〜２５μｇの範囲にある。具体的ワクチンについての最適量は、被験者における適切な免疫応答の観察を含む標準的試験により確認することができる。最初のワクチン接種後、適切な間隔をおいて、１又は数回の追加免疫を被験者に実施することができる。
本発明のワクチンはあらゆる経路により投与することができるが、皮膚内（ＩＤ）への前記ワクチンの投与は、本発明の一実施形態を形成する。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる外側の「角質」表皮を含み、これは表皮を覆っている。この表皮の下に、真皮と呼ばれる層があり、この層は皮下組織を覆っている。研究者らは、皮膚、特に真皮にワクチンを注射すると、免疫応答を刺激することを明らかにしたが、これも多くのさらなる利点を伴うと考えられる。本明細書に記載するワクチンの皮内接種は、本発明の好ましい形態である。
皮内注射の慣用の方法、すなわち、「マントウー法」は、皮膚を清浄した後、一方の手で引き伸ばし、狭いゲージ針（２６〜３１ゲージ）の斜端を上方に向け、１０〜１５°の角度で針を挿入する。針の斜端を挿入したら、針の軸を下げ、わずかに圧力を加えながらさらに進め、皮膚の下で持ち上げる。次に、極めてゆっくりと液体を挿入することにより、皮膚表面に水泡又は隆起を形成した後、針をゆっくりと引き抜く。
さらに近年になり、皮膚内又は皮膚を介した液体薬剤投与のために専用に設計されたデバイスが記載されており、例えば、ＷＯ９９／３４８５０号及び欧州特許第１０９２４４４号に記載されているデバイス、また、例えば、以下の文献に記載のジェット式注射デバイスが挙げられる：ＷＯ０１／１３９７７号；米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５号及びＷＯ９７／１３５３７号。ワクチン製剤の皮内投与の別の方法として、従来の注射器と針、固形ワクチンの弾道送達（ballistic delivery）のために設計されたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１号）、又は経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０号；ＷＯ９８／２８０３７号）；あるいは、皮膚の表面に適用するもの（経皮送達（transdermal, transcutaneous）：ＷＯ９８／２０７３４号；ＷＯ９８／２８０３７号）がある。
本発明のワクチンを皮膚、あるいはさらに具体的には真皮に投与する場合には、ワクチンは低液量、具体的には、約０．０５ｍｌ〜０．２ｍｌの量である。
本発明の皮膚又は皮内ワクチンにおける抗原の含量は、筋内ワクチンに存在する通常の用量（前記参照）と同様でよい。しかし、製剤が「低用量」であることが皮膚又は皮内ワクチンの特徴である。従って、「低用量」ワクチンにおけるタンパク質抗原は、用量当たり０．１〜１０μｇ、好ましくは０．１〜５μｇほどの少量存在するのが好ましく、多糖（好ましくは結合した）抗原は、用量当たりの多糖が０．０１〜１μｇ、好ましくは０．０１〜０．５μｇの範囲で存在しうる。
本明細書で用いる用語「皮内送達」とは、皮膚における真皮の領域にワクチンを送達することを意味する。しかし、ワクチンは、必ずしも真皮だけに位置させるわけではない。真皮は、ヒトの皮膚表面から約１．０〜約２．０ｍｍの間に位置する皮膚であるが、個体間や、身体の各部でいくらか差がある。一般に、皮膚の表面から１．５ｍｍ下に進めば真皮に到達すると考えられる。真皮は、表面の角質層及び表皮と、下方の皮下層との間に位置する。送達方法に応じて、ワクチンは最終的に真皮内だけ、又は主に真皮内に位置させることもあり、あるいは、最終的に表皮及び真皮内に分布させることもある。
本発明の実施形態は、ブドウ球菌感染又は疾患の予防又は治療方法であって、本発明の免疫原性組成物又はワクチンを、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法である。
本発明のさらなる実施形態は、ブドウ球菌感染又は疾患、場合により術後ブドウ球菌感染、の予防又は治療のためのワクチンの製造における、本発明の免疫原性組成物の使用である。
用語「ブドウ球菌感染」は、哺乳動物、好ましくはヒト宿主に感染を引き起こすことができる黄色ブドウ球菌（S.aureus）及び／又は表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）並びにその他のブドウ球菌株により引き起こされる感染を包含する。
本明細書の用語「含んでなる」、「含む」は、本発明者らによれば、すべての場合に、それぞれ「〜から構成された」、「〜からなる」で随意に言い換えることができるものとする。
本特許明細書に引用した参照文献又は特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れるものとする。
本発明がさらによく理解されるように、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、説明を目的にするにすぎず、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
組換えタンパク質を発現するためのプラスミドの構築
Ａ．クローニング
タンパク質がＮ末端又はＣ末端に（Ｈｉｓ）６アフィニティークロマトグラフィータグを含んだ融合タンパク質として発現されるように、ブドウ球菌遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド内に遺伝子操作で導入された適当な制限部位を利用して、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２４ｄ又はｐＱＥ−３０の中にＰＣＲ産物を部位指定的にクローニングした。
使用したプライマーは、以下の通りである：
αトキシン ：5’-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3’、及び
5’-CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3’
EbpS： 5’-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3’、及び
5’-CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3’
ClfA: 5’-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3’、及び
5’-CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC-3’
FnbpA： 5’-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3’、及び
5’-CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3’
Sbi： 5’-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3’、及び
5’-GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3’
SdrC： 5’-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3’、及び
5’CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3’
SdrG： 5’-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3’、及び
5’-CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3’
Ebh： 5’-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3’、及び
5’-AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3’
Aaa： 5’-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3’、及び
5’-GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3’
IsaA： 5’-GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCAAGC-3’、及び
5’-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3’
HarA： 5’-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3’、及び
5’-TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3’
オートリシングルコサミニダーゼ：5’-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3’、及び
5’-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3’
オートリシンアミダーゼ： 5’-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3’、及び
5’-GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3’
IsdA： 5’-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3’、及び
5’-ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3’
IsdB： 5’-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3’、及び
5’-GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3’
MRPII： 5’-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3’、及び
5’-AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3’
まず、ＰＣＲ産物をＴｏｐ１０細菌細胞を用いて使用説明書に従いｐＧＥＭ−Ｔクローニングベクター（Novagen社）に導入した。この中間構築物は、発現ベクター内へのさらなるクローニングをより容易にするために作製した。ＤＮＡ挿入物を含む形質転換体を制限酵素解析によって選択した。消化後、約２０μｌの反応液アリコートをアガロースゲル電気泳動によって（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファ内で０．８％アガロースを用いて）解析した。ＤＮＡ断片をゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色の後、ＵＶ照射により視認した。ＤＮＡの分子サイズ標準（１Ｋｂラダー, Life Technologies社）を被検サンプルと同時並行で電気泳動し、それを用いてＤＮＡ断片のサイズを推定した。各クローニングの選択された形質転換体から精製されたプラスミドを、続いて適当な制限酵素を用いて、製造業者（Life Technologies社）推奨の方法に従って完全に連続的に消化した。その後、消化したＤＮＡ断片をシリカゲルベースのスピンカラムを用いて精製した後、ｐＥＴ２４ｄ又はｐＱＥ−３０プラスミドにライゲーションした。Ｅｂｈ（Ｈ２断片）、ＡａＡ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＨａｒＡ、Ａｔｌ−アミダーゼ、Ａｔｌ−グルコサミン、ＭＲＰＩＩ、ＩｓａＡのクローニングをｐＥＴ２４ｄプラスミドを用いて行い、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＥ、ＦｎｂｐＡ、ＳｄｒＧ／Ｆｂｅ、αトキシン及びＳｂｉのクローニングをｐＱＥ−３０プラスミドを用いて行った。
Ｂ：発現ベクターの作製
ライゲーション用の発現プラスミドｐＥＴ２４ｄ又はｐＱＥ−３０を調製するため、同様に適当な制限酵素で完全に消化した。調製したベクターに対してモル濃度で約５倍過剰の消化断片を用いてライゲーション反応を行った。標準的な約２０μｌのライゲーション反応（約１６℃、約１６時間）を、当該分野で周知の方法によりＴ４ ＤＮＡリガーゼ（約２．０ユニット／反応、Life Technologies社）を用いて行った。ライゲーション液のアリコート（約５μｌ）を用いて、Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）又はＢＴ２１：：ＤＥ３エレクトロコンピテント細胞を当該分野で周知の方法により形質転換した。約１．０ｍｌのＬＢ培地で３７℃にて約２〜３時間増殖させた後、形質転換処理した細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び／又はカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガープレートに塗布した。抗生物質は、選択に包含される。プレートを３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。ＡｐＲ／ＫａｎＲの単一コロニーを滅菌した爪楊枝で拾い、新たに調製したＬＢ ＡｐＲ／ＫａｎＲプレートに「パッチ」植菌し、同時に約１．０ｍｌのＬＢ Ａｐ／Ｋａｎブロス培地に植菌するのに使用した。パッチプレート及びブロス培養の双方を標準インキュベータ（プレート）又は振とう式水浴のいずれかで３７℃で一晩インキュベートした。全細胞に基づくＰＣＲ解析を用いて、ＤＮＡ挿入物を含む形質転換体を確認した。ここで、約１．０ｍｌの一晩培養したＬＢ Ａｐ／Ｋａｎブロス培養を１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに移し、細胞をＢｅｃｋｍａｎｎ社の微量遠心機で遠心（室温にて約３分、約１２，０００×ｇ）して回収した。細胞ペレットを約２００μｌの滅菌水に懸濁し、約１０μｌのアリコートを用いて、フォワード／リバース増幅プライマーの両方を含む最終容量約５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。最初に９５℃の変性ステップを約３分間行い、細菌細胞の熱破砕及びプラスミドＤＮＡの遊離を確実に行った。ＡＢＩ社モデル９７００サーマルサイクラーにより３２サイクル、３ステップの熱増幅プロフィール（すなわち、９５℃−４５秒；５５〜５８℃−４５秒；７２℃−１分）を用いて、溶解した形質転換体のサンプルからＢＡＳＢ２０３断片を増幅した。熱増幅後、約２０μｌの反応液アリコートをアガロースゲル電気泳動で解析した（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファ内で０．８％アガロースを用いて）。ＤＮＡ断片をゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色の後、ＵＶ照射により視認した。ＤＮＡの分子サイズ標準（１Ｋｂラダー, Life Technologies社）を被検サンプルと同時並行で電気泳動し、それを用いてＰＣＲ産物のサイズを推定した。予想サイズのＰＣＲ産物を生成した形質転換体をタンパク質発現構築物を含む菌株として同定した。発現プラスミド含有株を、その後組換えタンパク質の発現誘導性について解析した。
Ｃ．ＰＣＲ陽性形質転換体の発現解析
一晩培養した前培養液のアリコート（約１．０ｍｌ）を約２５ｍｌのＬＢ Ａｐ／Ｋａｎ培地を入れた１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに植菌し、３７℃で振とう（約２５０ｒｐｍ）しながら、培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００で約０．５、すなわち対数増殖期（通常約１．５〜２．０時間）に達するまで培養した。このとき、約半分の培養液（約１．２５ｍｌ）を第二の１２５ｍｌフラスコに移し、組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧ（滅菌水で調製した１．０Ｍストック、Sigma社）を１．０ｍＭの終濃度で添加することにより誘導した。ＩＰＴＧ誘導及び非誘導の両培地をさらに約４時間、３７℃で振とうしながらインキュベーションし続けた。誘導及び非誘導両培地のサンプル（約１０ｍｌ）をインキュベーション後に取り出し、細胞を微量遠心機で室温にて約３分間遠心することによって回収した。個々の細胞ペレットを約５０μｌの滅菌水に懸濁し、２−メルカプトエタノールを含む等量の２×Ｌａｅｍｅｌｌｉ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファと混合した。沸騰水浴に約３分間置き、タンパク質を変性させた。等量（約１５μｌ）の粗製ＩＰＴＧ誘導及び非誘導細胞溶解物の両方を２つの１２％Ｔｒｉｓ／グリシンポリアクリルアミドゲル（１ｍｍ厚Ｍｉｎｉ−ｇｅｌｓ, Novex社)上に加えた。誘導及び非誘導溶解サンプルを予め染色した分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ, Novex社）と共に慣用条件下で標準的なＳＤＳ／Ｔｒｉｓ／グリシンランニングバッファ（BioRad社）を用いて電気泳動した。電気泳動後、一方のゲルをクマシーブリリアントブルーＲ２５０（BioRad社）で染色し、その後脱色して新規のＩＰＴＧ誘導タンパク質を視覚化した。第二のゲルには、ＰＶＤＦメンブレン（孔サイズ０．４５ミクロン、Novex社）上にBioRad社Ｍｉｎｉ−ＰｒｏｔｅａｎＩＩブロッティング装置とＴｏｗｂｉｎ（トービン）メタノール（２０％）転写バッファを用いて、４℃にて約２時間かけてエレクトロブロッティングを行った。メンブレンのブロッキング及び抗体インキュベーションを当該分野で周知の方法に従って行った。抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）３モノクローナル抗体、続いてＨＲＰ結合ウサギ抗マウス二次抗体（QiaGen社）を用いて、組換えタンパク質の発現の確認及び同定を行った。抗Ｈｉｓ抗体反応パターンの視覚化は、ＡＢＴ不溶性基質を使用して又はAmersham社のECL化学発光システムを用いたHyperfilmを使用して行った。
組換えタンパク質の作製
細菌株
大腸菌の組換え発現用菌株であり、プラスミド（ｐＱＥ３０）を含んだＭ１５（ｐＲＥＰ４）株、又はブドウ球菌タンパク質をコードするプラスミドｐＥＴ２４ｄを含んだＢＬ２１：：ＤＥ３株を用いて、組換えタンパク質の精製用細胞集団を調製した。
培地
組換えタンパク質の調製に用いた発酵培地は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／又は３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ培地（Difco）からなる。消泡剤を培養槽の培地に０．２５ｍｌ／Ｌ（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、Sigma社）で添加した。組換えタンパク質の発現を誘導するために、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を発酵槽に加えた（終濃度；１ｍＭ）。
組換えタンパク質の作製
非変性条件下
ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで加えて、培養液をさらに４時間培養した。その後、培養液を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレットをプロテアーゼインヒビターカクテルを含むリン酸バッファ（５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４：ｐＨ７）に懸濁した。このサンプルを１５００バールの圧力でフレンチプレスにより（２回のランで）溶解した。１５，０００ｒｐｍで３０分間の遠心の後、上清をさらなる精製のために回収し、ＮａＣｌを０．５Ｍになるまで加えた。その後、サンプルを５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）で調整したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＸＫ１６カラムPharmacia社、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂Qiagen社）に加えた。サンプルを加えた後、カラムをバッファＡ（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）／０．３Ｍ ＮａＣｌ／１０％グリセロール）で洗浄した。結合したタンパク質を溶出するため段階勾配を用いた。この勾配では、バッファＢ（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）／０．３Ｍ ＮａＣｌ／１０％グリセロール／２００ｍＭイミダゾール）が異なる割合でバッファＡに加えられている。バッファＢの割合は、１０％から１００％へと徐々に増加している。精製後、タンパク質を含む溶出分画をプールし、濃縮し、０．００２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）／１５Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
この方法を利用して、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＧ、ＩｓｄＡ、ＩｓａＢ、ＨａｒＡ、Ａｔｌ−グルコサミン及びαトキシンを精製した。
変性条件下
ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで添加し、培養液をさらに４時間培養した。その後、培養液を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ペレットをプロテアーゼインヒビターカクテルを含むリン酸バッファ（５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４：ｐＨ７）に懸濁した。このサンプルを１５００バールの圧力を用いてフレンチプレスにより（２回のランで）溶解した。１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、ペレットを１Ｍ尿素を含むリン酸バッファで洗浄した。このサンプルを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ペレットを８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８）に再懸濁し、室温に一晩置いた。サンプルを１５，０００ｒｐｍで２０分遠心して、上清をさらなる精製のために回収した。それからサンプルを８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８）で調整したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＸＫ１６カラムPharmacia社、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂Qiagen社）に加えた。フロースルーの通過後、カラムをバッファＡ（８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０））、バッファＣ（８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．３））、バッファＤ（８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．９））及びバッファＥ（８Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ４．５））で連続的に洗浄した。組換えタンパク質はバッファＤとＥでの洗浄の間にカラムから溶出した。変性組換えタンパク質は、尿素を欠く溶液に溶解することができる。このため、８Ｍ尿素に含まれる変性タンパク質を４Ｍ尿素／０．１ＭＮａ２ＰＯ４／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）、２Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４／０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）／０．５Ｍアルギニン、及び０．００２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．１）／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍアルギニンに対して連続的に透析した。
この方法を用いて、Ｅｂｈ（Ｈ２断片）、ＡａＡ、ＳｄｒＣ、ＦｎｂｐＡ、Ｓｂｉ、Ａｔｌ−アミダーゼ及びＩｓａＡを精製した。
精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。非変性条件下で精製したタンパク質の一つ（αトキシン）及び変性条件下で精製したタンパク質の一つ（ＳｄｒＣ）の結果を図３及び４に示す。
ＣＤＡＰを用いた黄色ブドウ球菌莢膜多糖複合体の調製
ＣＤＡＰを用いた天然ＰＳ８の活性化及びカップリング化学
ＳＡ０８−ＴＴ００４
活性化及びカップリングを室温で連続的な攪拌下において行った。１０ｍｇの天然多糖を０．２Ｍ ＮａＣｌに溶解し、最終ＰＳ濃度で２．５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。その溶液を活性化ステップ前にｐＨ６．０＋／−０．２に調製した。
開始時（０時）に、５０μｌのＣＤＡＰ溶液（新たに調製したアセトニトリル／ＷＦＩ：５０／５０の１００ｍｇ／ｍｌ溶液）をＣＤＡＰ／ＰＳ比が約０．５／１になるよう手動で添加した。１．５分後に、ｐＨを０．５Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ９．００＋／−０．０５に上昇させた。ＮａＯＨ添加を約１分間行い、キャリアを添加するまでｐＨをｐＨ９．００＋／−０．０５に安定させた。
４．５分後に、１．５ｍｌのＴＴ（０．２Ｍ ＮａＣｌに溶解した１０ｍｇ／ｍｌ溶液）を適当なタンパク質／ＰＳ比（１．５／１）に達するまで添加した。ｐＨを直ちにカップリングｐＨ９．００＋／−０．０５に調整した。溶液を手動のｐＨ調節下で１時間放置した。
カップリングステップ後、０．５ｍｌの２Ｍグリシン（ｇｌｙ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）：７．５／１）を添加し、ｐＨをただちに９．００＋／−０．０５に調整した。溶液を３０分間手動のｐＨ調節下に放置した。その後、複合体を５μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて流速は３０ｍｌ／時に固定した。
溶出分画をレゾルシノール、及びμＢＣＡで解析した。目的の分画をプールし、０．２２μｍのＳｔｅｒｉｖｅｘでろ過した。
得られた複合体は、レゾルシノール及びＬｏｗｒｙ（ローリー）アッセイによる評価で最終ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）が１．０５だった。
サイジングした多糖におけるＣＤＡＰを用いた黄色ブドウ球菌莢膜多糖複合体の調製
ＣＤＡＰを用いたサイジングＰＳ８の活性化及びカップリング化学
ＰＳは、理論上１０％の含水率で加重されている。２ｇの天然の含湿ＰＳを初期濃度１０ｍｇ／ｍｌでＷＦＩに一晩溶解した。サイジング前に、天然ＰＳ溶液を５μｍのカットオフフィルターで浄化した。
ホモジナイズセルをマイクロフルイディクスＦ２０Ｙ−０．７５μｍ相互作用チャンバで置き換えたＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０ホモジナイザー装置を用いて、活性化ステップ前の多糖の分子量及び粘度を減少させた。サイズ縮小化は、最初の１０サイクルを１００００ｐｓｉで、次の６０サイクルを１５０００ｐｓｉで行った。続いて、サイズ縮小化の進行度はその過程で粘度を測定することによって判断した。７０サイクル後で目標物が２．７４±０．２ｃｐに達したときにサイジングを停止した
活性化及びカップリングは、室温にて連続的な攪拌下において行った。
５０ｍｇのサイジングした多糖８を０．２Ｍ ＮａＣｌで希釈して、最終ＰＳ濃度５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。
開始時（０時）に、３７５μｌのＣＤＡＰ溶液（新たに調製したアセトニトリル／ＷＦＩ：５０／５０の１００ｍｇ／ｍｌ溶液）をＣＤＡＰ／ＰＳ比が約０．７５／１になるよう手動で添加した。
１分後に、ｐＨを０．５Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ９．００＋／−０．０５に上昇させた。
２．５分後に、１０ｍｌのＴＴ（０．２Ｍ ＮａＣｌに溶解した１０ｍｇ／ｍｌ溶液）を適当なタンパク質／ＰＳ比（２／１）に達するまで添加し、ｐＨを直ちにカップリングｐＨ９．００＋／−０．０５に調整した。溶液を手動のｐＨ調節下で５５分間放置した。
カップリングステップ後、２．５ｍｌの２Ｍグリシン（ｇｌｙ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）：７．５／１）を添加し、ｐＨを調整器でただちに９．００＋／−０．０５に調整した。溶液を３０分間手動のｐＨ調節下に放置した。
その後、複合体を５μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００ＨＲ（ＸＫ２６／１００）に注入した。流速は６０ｍｌ／時に固定した。
溶出分画をレゾルシノールで、及びタンパク質用量で解析した。目的の分画をプールして、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐａｃｋ２０でろ過した。
得られた複合体は、最終ＴＴ／ＰＳ比が１．９４だった。
ＥＤＡＣを用いた黄色ブドウ球菌莢膜多糖複合体の調製
ＥＤＡＣを用いた活性化及びカップリング化学：
黄色ブドウ球菌８型莢膜多糖−ＴＴ複合体
ＰＳの誘導体化
活性化及びカップリングを室温で連続的な攪拌下において行った。
３０ｍｇの天然多糖を水で希釈して、最終多糖濃度で５ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。その溶液を０．５ＮのＨＣｌでｐＨ４．５〜５．０に調整し、６６μｌのＡＤＨを加えた（２．２ｍｇ／ｍｌ ＰＳ）。完全に溶解した後、６０ｍｇのＥＤＡＣを加えた（２ｍｇ／ｍｌ ＰＳ）。７０分後、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に上昇させ、反応を停止させた。遊離のＡＤＨをＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００ＨＲ（ＸＫ１６／４０）を用いた精製により除去した。０．２ＭのＮａＣｌを溶出バッファとして用い、流速は６０ｍｌ／時に固定した。サイズ縮小化は、１５分間の超音波処理で行い、Ｍｉｌｌｅｘフィルター（０．２２μｍ）でのろ過滅菌が可能となった。
カップリング
破傷風トキソイドを０．２Ｍ ＮａＣｌに溶解した５〜１０ｍｇの誘導体化多糖に加え、０．５Ｎ ＨＣｌの添加によりｐＨをｐＨ５．０又はｐＨ６．０に調整した。ＥＤＡＣを０．１Ｍ Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．５）に溶解し、その後ＥＤＡＣを１０分間にわたって（１／５容量を２分毎）添加した。
使用した条件（表６参照）に応じて、反応は、３０〜１８０分後に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加により停止させた。ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００ＨＲで精製する前に、複合体を５μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化した。あるいは、複合体を５分間の超音波ステップで清澄化した。その後、複合体をＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。流速を３０ｍｌ／時で固定し、溶出バッファとして１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いた。溶出プールをレゾルシノール及びμＢＣＡプロフィール（それぞれ多糖及びタンパク質用量を測定する）に基づいて選択した。複合体を０．２２μｍの滅菌メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ２０）により１０ｍｌ／分でろ過した。
Figure 2009531388
得られた複合体は表６に示す以下の性質を有している。
Figure 2009531388
黄色ブドウ球菌８型多糖もＡＤＨで誘導体化する前にマイクロ流動化によって処理をした。
ＰＳの誘導体化
活性化及びカップリングを室温で連続的撹拌下において行った。
２００ｍｇのサイジングした多糖を水で希釈して、最終ＰＳ濃度で１０ｍｇ／ｍｌの水溶液を得た。その後、４４０ｍｇのＡＤＨを添加した（２．２ｍｇ／ｍｌ ＰＳ）。４００ｍｇのＥＤＡＣ（２ｍｇ／ｍｌ ＰＳ）の添加前に溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．７に調製した。６０分後、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨをｐＨ７．５に上昇させ、反応を停止させた。混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（カットオフ値１０．０００ＭＷＣＯ）で濃縮した。ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）で精製する前に、複合体を５μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化した。０．１５０Ｍ ＮａＣｌを溶出バッファとして用いて、流速は３０ｍｌ／時に固定した。
カップリング
１００ｍｇのＴＴを０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液中の５０ｍｇの誘導体化多糖に添加した。ｐＨを０．３Ｎ ＨＣｌの添加によりｐＨ５．０±０．０２に調整した。ＥＤＡＣを０．１Ｍ Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．５）に溶解し、それから１０分間にわたって（毎分１／１０量）添加した。使用した条件（表８参照）に応じて、３０〜１８０分後に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加によって反応を停止した。ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００ＨＲで精製する前に、複合体を５μｍのＭｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化した。その後、複合体をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ（ＸＫ５０／１００）に注入した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを溶出バッファとして用いて、流速は６０ｍｌ／時に固定した。溶出プールをレゾルシノール及びμＢＣＡプロフィール（それぞれ多糖及びタンパク質用量を測定する）に基づいて選択した。その後、複合体を０．２２μｍの滅菌メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ２０）により１０ｍｌ／分でろ過した。
Figure 2009531388
Figure 2009531388
脱−Ｏ−アセチル化黄色ブドウ球菌８型多糖におけるＥＤＡＣを用いた黄色ブドウ球菌莢膜多糖複合体の調製
脱−Ｏ−アセチル化
０．１Ｎ ＮａＯＨを１６ｍｌのサイジングしたＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、最終ＰＳ濃度９ｍｇ／ｍｌ及び最終ＮａＯＨ濃度０．１Ｎとなるようにした。３７℃で１又は２時間の処理後、ＰＳは非処理ＰＳと比較してそれぞれ３５％及び１２％（Ｈｅｓｔｒｉｎ用量）のＯ−アセチル化レベルを有していた。
０．１Ｎ ＮａＯＨを１９ｍｌのサイジングしたＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）に添加し、最終ＰＳ濃度９．５ｍｇ／ｍｌ及び最終ＮａＯＨ濃度０．０５Ｎとなるようにした。３７℃で１又は２時間の処理後、ＰＳは非処理ＰＳと比較してそれぞれ７８％及び５８％（Ｈｅｓｔｒｉｎ用量）のＯ−アセチル化レベルを有していた。
誘導体化ステップは、未処理ＰＳに関して予め上記で示したように行った。
Figure 2009531388
Ｏ−アセチル基の除去により反応性カルボン酸基の利用度が増大した。実際、わずか１２％のＯ−アセチル基を有するＰＳの誘導体化レベルが７８％のＯ−アセチルを有するＰＳよりも±２．５倍上回った。
カップリングは、未処理ＰＳに関して予め上記で示したように行った。
Figure 2009531388
Figure 2009531388
ｄＰＮＡＧの結合
ｄＰＮＡＧの活性化及びカップリング
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体
本明細書の以下に記載する手法を用いて、下記の複合体を生成した：
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１０：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１１：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１２：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１４：ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１７：ＤＴＴ処理ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１９：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０２０：ｄＰＮＡＧ−Ｓ−ＧＭＢＳ＋ＤＴＴ処理ＴＴ−ＳＰＤＰ
ｄＰＮＡＧ
１ｇのＰＮＡＧを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で５Ｎ ＨＣｌに溶解し、１時間インキュベートした。続いて５Ｎ ＮａＯＨを用いて中和した。この溶液を５μｍ膜メンブレンを用いて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲにおいて精製した。目的の画分、すなわち「中間の分子サイズ」（Infection and Immunity, 70: 4433-4440 (2002)を参照）に相当するものをプールし、濃縮したあと、脱Ｎ−アセチル化処理を行った。
溶液を１Ｍ ＮａＯＨで調整し、３７℃で２４時間放置した。中和後、生成物に対して透析及び濃縮を行った。
ｄＰＮＡＧの活性化
Ｓ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド、Ｐｉｅｒｃｅ）を０．２Ｍ ＮａＣｌ中のｄＰＮＡＧに添加し（Ｓ−ＧＭＢＳ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）：１／１）、ｐＨ７．０（１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ調節）にて室温で２時間にわたりインキュベートした。ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ−４０ＦにおいてＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を溶出バッファーとして６０ｍｌ／時の一定の流速で用いて精製することにより過剰のＧＭＢＳと副産物を除去した。溶出プールを光学密度（ＵＶ＝２０６ｎｍ）の関数で選択し、続いてＶｉｖａｓｐｉｎ管３，０００ＭＷＣＯ又はＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯにおいて濃縮した。
カップリング
ＧＭＢＳ活性化ｄＰＮＡＧ及びＤＴＴ還元（reduced）ＴＴ−ＳＰＤＰを混合し、室温で攪拌した。使用した条件に応じて、２０〜１２０分後にシステイン（リン酸ナトリウムバッファーｐＨ８．０中４ｍｇ／ｍｌ）を３０分かけて添加することにより反応を停止させた。複合体を５μｍフィルターを用いて清澄化し、精製のためにＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ＨＲ樹脂（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。最終的な複合体は、多糖（ヘキソサミン用量）及びタンパク質組成（ローリー用量）について試験した。
Figure 2009531388
Figure 2009531388
ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ：
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，Ｍｅｒｃｋ）に溶解した５倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート，ＭＷ：３１２．４，Ｐｉｅｒｃｅ）を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍｌのｄＰＮＡＧ１００ｍｇに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで２８分間の遠心）で±６ｍｌにまで濃縮した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００ＨＲ（ＸＫ１６／４０）で精製を行った。リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて６０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。目的の画分（２０６ｎｍで読み取り）をプールし、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで３０分間の遠心）において１．１ｍｌになるまで濃縮した。
ＴＴ−ＳＰＤＰ：
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，Ｍｅｒｃｋ）に溶解した１５倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）中のＴＴ（５０／ｍｌ）１ｇに添加し、室温で８０分間インキュベートした。続いて、生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００ＨＲ（ＸＫ１６／４０）に注入し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６），１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡを６０ｍｌ／時の一定の流速で用いて溶出した。溶出プールを光学密度（ＵＶ＝２８０ｎｍ）の関数で選択し、続いてＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯ（３０００ｒｐｍで７５分間の遠心）において１９．６ｍｌになるまで濃縮した。
ＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰは、ＴＴ−ＳＰＤＰとしてＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、インキュベーション時間を６０分として生成された。
ＴＴ−ＳＨ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＨ
ＤＴＴをＴＴ−ＳＰＤＰ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＰＤＰにＤＴＴ／ＴＴ比（ｍｇ／ｍｇ）が０．７／１となるよう添加した。室温で２時間後、ピリジン−２−チオンが放出されて、その特徴的な吸収が３４３ｎｍとなった。ゲルろ過（ＰＤ−１０，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりチオール化タンパク質を過剰のＤＴＴから精製した。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯにおいて濃縮した後、タンパク質含量をローリー用量により評価した。
ｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰ＋ＴＴ−ＳＨ又はＴＴ−ＬＣ−ＳＨ（ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１４及び０１６）
カップリングは、連続的に攪拌しながら、初期ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）２／１で、室温にて実施した。
ｄＰＮＡＧ及びＴＴ−ＳＨを混合して、最終ＰＳ濃度２０ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度４０ｍｇ／ｍｌを得た。３０分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
ｄＰＮＡＧ及びＴＴ−ＬＣ−ＳＨを混合して、最終ＰＳ濃度１０ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度２０ｍｇ／ｍｌを得た。７５分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
続いて、複合体を５μｍ Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。
溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。
得られた複合体は、最終ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）が２．１８（ＴＴ−ＳＨ）及び２．２４（ＴＴ−ＬＣ−ＳＨ）だった。
ｄＰＮＡＧのチオール化
１１．６ｍｇのＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＭＷ：１５４．２４）を１６．５ｍｇのｄＰＮＡＧ−ＳＰＤＰに添加した。室温で２時間後、ピリジン−２−チオンが放出されて、その特徴的な吸収が３４３ｎｍとなった。ゲルろ過（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ４０Ｆ）によりチオール化ＰＳを過剰のＤＴＴから精製し、続いてＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０，０００ＭＷＣＯにおいて８６０μｌになるまで濃縮した。
ｄＰＮＡＧ−ＳＨ＋ＴＴ−ＳＰＤＰ（ｄＰＮＡＧ−ＴＴ０１７）
カップリングは、連続的に攪拌しながら、初期ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）１．７／１で、室温にて実施した。
ｄＰＮＡＧ−ＳＨ及びＴＴ−ＳＰＤＰを混合して、最終ＰＳ濃度７．７３ｍｇ／ｍｌ及び最終タンパク質濃度１３．３ｍｇ／ｍｌを得た。９０分後、未反応のスルフヒドリル基を２−ヨードアセトアミド（Ｍｅｒｃｋ）の添加によりクエンチした。
続いて、複合体を５μｍ Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルターを用いて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ＨＲ（ＸＫ１６／１００）に注入した。２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて３０ｍｌ／時の一定の流速で溶出を行った。
溶出画分をヘキソサミンにより及びタンパク質用量により分析した。目的の画分をプールし、０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｖｅｘにおいてろ過した。
得られた複合体は、最終ＴＴ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）が２．７４だった。
製剤化
アジュバント組成物
アジュバントＡをアジュバントとして添加した又はアジュバントを添加していない、以下の組成を有する複合体を接種した。
アジュバントＡの組成
質量（０．５ｍＬ用量あたり）
リポソーム：
−ＤＯＰＣ １ｍｇ
−コレステロール ０．２５ｍｇ
３ＤＭＰＬ ５０μｇ
ＱＳ２１ ５０μｇ
ＫＨ２ＰＯ４１ ３．１２４ｍｇ バッファ
Ｎａ２ＨＰＯ４１ ０．２９０ｍｇ バッファ
ＮａＣｌ ２．９２２ｍｇ
（１００ｍＭ）
ＷＦＩ 適量 ａｄ ０．５ｍｌ溶媒
ｐＨ６．１
１．ＰＯ４総濃度＝５０ｍＭ
動物実験
雌ＣＤ−１マウス（８〜１０週齢）は、Charles River Laboratories社（Kingston, Mass）から購入した。致死率検証のために、９〜１１匹のＣＤ−１マウスからなる５つの群の腹腔内（ｉ．ｐ．）にＣＳＡプレート上で増殖させた黄色ブドウ球菌を段階希釈して投与した。接種量は、約１０１０から１０８ＣＦＵ／マウスの範囲とした。死亡率は、３日間毎日評価した。５０％致死用量（ＬＤ５０Ｓ）は、用量応答関係のプロビットモデルを用いて評価した。通常のＬＤ５０の帰無仮説は、尤度比検定で検証した。亜致死性菌血症は、８〜２０匹のマウスからなる群に約２×１０６ＣＦＵ／マウスを静脈内（ｉ．ｖ．）経路で、又は約２×１０７ＣＦＵ／マウスをｉ．ｐ．経路で投与することによって生じさせた。接種後、個々の動物群について、特定の時間に尾から血液を採取し、菌血症レベルを５％ヒツジ血液を含んだトリプシン大豆アガープレート（Becton Dickinson Microbiology Systems社）で二重試験にて行った量的平板計数により評価した。統計的有意性は、ウエルチの改変型対応のないスチューデントｔ検定で判定した。
黄色ブドウ球菌ＰＳ８−ＴＴ及びｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体の免疫原性
３０匹のマウスの群をアジュバント添加していない又はアジュバントＡと組み合わせた糖用量３μｇの黄色ブドウ球菌ＰＳ８−ＴＴ複合体を用いて、０日目、１４日目、２８日目、及び４２日目に皮下接種した。０日目に、０．００１〜０．０１３μｇを含む最初の糖用量をマウスに接種した。さらに食塩水に溶解した０．３μｇの用量で免疫付与を３回行った。５５日目に、血清をそのマウスから回収し、各血清サンプルをＥＬＩＳＡによって検証し、ＰＳ８に対する免疫応答を評価した。１０匹のマウスの群をコントロール群に用いて、それらには食塩水又はアジュバントＡを含む食塩水のいずれかを接種した。
精製したＰＳ８を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した２μｇ／ｍｌ溶液として高結合性マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp社）上に４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで室温にて３０分間撹拌しながらブロッキングした。マウス抗血清を１／１００に前希釈し、その後、さらにマイクロプレート内で２倍希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体をＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎで１：５０００に希釈したJackson ImmunoLaboratories Inc.社のペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１５−０３５−００３）を用いて検出した。検出抗体を３０分間室温で撹拌しながらインキュベートした。発色は、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ４．５）あたり４ｍｇのＯＰＤ（Sigma社）＋５μｌのＨ２Ｏ２を用いて１５分間室温で暗所にて行った。反応は、５０μｌのＨＣｌで停止させ、６５０ｎｍに対して４９０ｎｍで光学密度を読み取った。
結果を中間点力価で表し、ＧＭＴは３０サンプル（コントロール用は１０サンプル）について算出した。結果を以下の表１４に示す。
Figure 2009531388
３０匹のマウスの群に、アジュバント添加していないか又はアジュバントＡと組み合わせて２００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶解した０．３μｇの糖用量で、黄色ブドウ球菌ｄＰＮＡＧ−ＴＴ複合体（１０％〜３０％がＮ−アセチル化されたｄＰＮＡＧ含有）を皮下接種した。マウスには、０日目、１４日目、及び２８日目に３回接種した。４１日目又は４２日目に、血清をマウスから回収し、各血清サンプルをＥＬＩＳＡによって検証し、ＰＮＡＧに対する免疫応答を評価した。１０匹のマウスの群をコントロール群に用いて、それらには食塩水又はアジュバントのみのいずれかを接種した。
抗−ＰＮＡＧ ＥＬＩＳＡ：
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したメチル化ＨＳＡ（２．５μｇ／ｍｌ）と混合した精製ＰＮＡＧ（２．５μｇ／ｍｌ）を高結合性マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp社）上に４℃で一晩かけて被覆した。
プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで室温にて３０分間撹拌しながらブロッキングした。マウス抗血清を１／１００に前希釈し、その後、さらにマイクロプレート内で２倍希釈し、室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体をＰＢＳ−０．２％ＢＳＡ−０．０５％ｔｗｅｅｎで１：５０００に希釈したJackson ImmunoLaboratories Inc.社のペルオキシダーゼ結合ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１５−０３５−００３）を用いて検出した。検出抗体を３０分間室温で撹拌しながらインキュベートした。発色は、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ４．５）あたり４ｍｇのＯＰＤ（Sigma社）＋５μｌのＨ２Ｏ２を用いて１５分間室温にて暗所で行った。反応は、５０μｌのＨＣｌで停止させ、６５０ｎｍに対して４９０ｎｍで光学密度を読み取った。
ＧＭＴは、３０サンプル（コントロール用は１０サンプル）の中間点力価で算出した。
Figure 2009531388
ＣＤＡＰ法で作製されたＰＳ ＊ −ＴＴ複合体の免疫原性
結果
Figure 2009531388
オプソニン食作用アッセイ
ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）による黄色ブドウ球菌のｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニン貪食性殺傷をXuら 1992 Infect. Immun. 60; 1358に記載のように行った。ヒトＰＮＭは、ヘパリン添加した血液から３％デキストランＴ−２５０における沈降により調製した。オプソニン反応混合物（１ｍｌ）は、熱不活化ウシ胎児血清を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に約１０６のＰＭＮ、約１０８ＣＦＵの黄色ブドウ球菌、及び０．１ｍｌの検査血清又はＩｇＧ調製物を含んでいる。過免疫付与したウサギ血清をポジティブコントロールとして用い、また０．１ｍｌの免疫付与していないウサギ血清をＩｇＧサンプルの完全な供与源として用いた。反応混合物を３７℃でインキュベートし、細菌サンプルを０分、６０分、及び１２０分の時点で水に移し、続いて希釈し、トリプシン大豆アガープレート上に広げ、一晩インキュベート後の細菌数をカウントするため３７℃でインキュベートした。
マウス及びウサギにおけるブドウ球菌タンパク質の免疫原性
動物に精製したブドウ球菌タンパク質を免疫し、過免疫血清を発生させた。マウスに３回（０日、１４日、及び２８日目）、スペコール（Ｓｐｅｃｏｌ）をアジュバントとして添加した１０μｇの各タンパク質を免疫した。ウサギに３回（０日、２１日、及び４２日目）、スペコールをアジュバントとして添加した２０μｇの各タンパク質を免疫した。免疫血清を回収し、抗タンパク質及び抗全死菌ＥＬＩＳＡで評価した。
抗タンパク質ＥＬＩＳＡ：
精製したタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した１μｇ／ｍｌ溶液として高結合性マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp社）上に４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで室温にて３０分間撹拌しながらブロッキングした。試験サンプルを１／１０００に希釈し、室温で撹拌しながら１時間インキュベートした。洗浄後、結合したマウス及びウサギ抗体をＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎで１：５０００に希釈したJackson ImmunoLaboratories Inc.社のペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１５−０３５−００３）又はＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１−０３５−００３）を用いて検出した。検出抗体を３０分間室温で撹拌しながらインキュベートした。発色は、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ４．５）あたり４ｍｇのＯＰＤ（Sigma社）＋５μｌのＨ２Ｏ２の溶液を用いて１５分間室温で暗所にて行った。反応は、５０μｌのＨＣｌで停止させ、６５０ｎｍに対して４９０ｎｍで光学密度を読み取った。
３回目の後の１／１０００希釈のＯ．Ｄ．を、同希釈の免疫前血清で得られたＯ．Ｄ．と比較した。
マウス及びウサギ血清で得られた結果を図５に示す。各抗原に対する良好なセロコンバージョンが観察された。ＳＢＩに対して生起された血清の評価は、このタンパク質のＩｇ結合活性によって弱められた。
抗全死菌ＥＬＩＳＡ
５型及び８型黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌Ｈａｙ株に由来する全死菌（熱又はホルムアルデヒドで不活化したもの）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した２０μｇ／ｍｌ溶液として、高結合性マイクロタイタープレート（Nunc Maxisorp社）上に４℃で蒸発させながら一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで室温にて３０分間撹拌しながらブロッキングした。プロテインＡを、ＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎで希釈した１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ニワトリ抗プロテインＡ（ＩＣＬカタログ番号ＣＰＡ−６５Ａ−２）の添加によって中和した。続いて、室温で１時間インキュベートした。その後、試験サンプルをＰＢＳ−０．０５％の入ったマイクロプレート上で１／１０の開始希釈から２倍に希釈し、１時間室温で撹拌しながらインキュベートした。洗浄後、結合したマウス又はウサギ抗体を、ＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎで１：５０００に希釈したJackson ImmunoLaboratories Inc.社のペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１５−０３５−００３）又はＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（カタログ番号１１−０３５−００３）を用いて検出した。検出抗体を３０分間室温で撹拌しながらインキュベートした。発色は、１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ４．５）あたり４ｍｇのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ社）＋５μｌのＨ２Ｏ２を用いて１５分間室温で暗所にて行った。反応は５０μｌのＨＣｌで停止させ、６５０ｎｍに対して４９０ｎｍで光学密度を読み取った。
ブドウ球菌においてタンパク質の発現レベルが培養条件により変わることに留意する必要がある。したがって、否定的な結果は、免疫原性がないというよりも、むしろ誤った培養条件を選択したことを反映しているのかもしれない。
マウス血清を用いた結果を表１７に示し、またグラフのいくつかを図６に示す。黄色ブドウ球菌５型株の弱い認識が抗ＳｄｒＣ、ＦｎｂｐＡ、Ｅｂｈ、Ｓｂｉ及びＩｓａＡに対する血清で観察された。黄色ブドウ球菌８型株の組換体は、Ｓｂｉに対する血清でのみ観察された。表皮ブドウ球菌Ｈａｙ株の弱い認識がＡｔｌアミダーゼ、ＭＲＰＩＩ、ＩｓｄＡ、ＩｓａＡ、Ｅｂｈ、Ａａａ及びＳｂｉに対する血清で観察された。
ウサギ血清を用いて得られた結果から選択したものを図７に示し、表１８にまとめた。非常に良好な３株の認識がＩｓａＡ及びＩｓｄＢで観察された
動物は、他のタンパク質で使用された３回の注射ではなく、むしろ１回の注射を受けたのみであるが、３株の弱い認識がＨａｒＡで観察された。
Figure 2009531388
Figure 2009531388
鼻腔保菌モデルにおけるブドウ球菌タンパク質の組み合わせの効力
３匹のコットンラットからなる１５の群に８種のブドウ球菌抗原の組み合わせを接種し、またコントロールとして機能する５匹のコットンラットを抗原なしで処置した。これら１６の群については以下の通りである：
群１：Ａｔｌ−グルコサミン、Ａｔｌ−アミダーゼ、ＡＡＡ、αトキシン、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、Ｅｂｈ、Ｓｂｉ
群２：Ａｔｌ−グルコサミン、Ａｔｌ−アミダーゼ 、ＩｓｄＡ、 ＩｓｄＢ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、Ｅｂｈ、ＦｎｂｐＡ
群３：Ａｔｌ−グルコサミン、Ａｔｌ−アミダーゼ、ＨａｒＡ、ＩｓｄＡ、ＭＲＰＩＩ、ＩｓｄＢ、ＡＡＡ、αトキシン
群４：Ａｔｌ−グルコサミン、ＨａｒＡ、ＩｓｄＡ、ＡＡＡ、ＣｌｆＡ、ＩｓａＡ、Ｅｂｈ、Ｓｂｉ
群５：ＨａｒＡ、ＭＲＰＩＩ、ＡＡＡ、αトキシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、Ｅｂｈ、ＦｎｂｐＡ
群６：ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＡＡＡ、αトキシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＧ、Ｓｂｉ、ＦｎｂｐＡ
群７：Ａｔｌ−アミニダーゼ、ＩｓｄＡ、ＭＲＰＩＩ、ＡＡＡ、ＩｓａＡ、ＳｄｒＧ、Ｅｂｈ、ＦｎｂｐＡ
群８：コントロール
群９：Ａｔｌ−グルコサミン、ＩｓｄＡ、ＭＲＰＩＩ、αトキシン、ＩｓａＡ、ＳｄｒＣ、Ｓｂｉ、ＦｎｂｐＡ
群１０：Ａｔｌ−グルコサミン、ＭＲＰＩＩ、ＩｓｄＢ、ＡＡＡ、ＣｌｆＡ、ＩｓａＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ
群１１：Ａｔｌ−アミニダーゼ、ＭＲＰＩＩ、ＩｓｄＢ、αトキシン、ＣｌｆＡ、ＩｓａＡ、Ｅｂｈ、Ｓｂｉ
群１２：Ａｔｌ−グルコサミン、ＨａｒＡ、ＩｓｄＢ、αトキシン、ＩｓａＡ、ＳｄｒＧ、Ｅｂｈ、ＦｎｂｐＡ
群１３：Ａｔｌ−アミダーゼ、ＨａｒＡ、ＩｓｄＢ、ＡＡＡ、ＩｓａＡ、ＳｄｒＣ、Ｓｂｉ、ＦｎｂｐＡ
群１４：Ａｔｌ−グルコサミン、Ａｔｌ−アミダーゼ、ＨａｒＡ、ＭＲＰＩＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＧ、Ｓｂｉ、ＦｎｂｐＡ
群１５：Ａｔｌ−アミダーゼ、ＨａｒＡ、ＩｓｄＡ、αトキシン、ＣｌｆＡ、ＩｓａＡ、ＳｄｆＣ、ＳｄｒＧ
群１６：ＨａｒＡ、ＩｓｄＡ、ＭＲＰＩＩ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、Ｅｂｈ、Ｓｂｉ
各抗原混合物は、ＭＰＬ及びＱＳ２１を含むリポソームからなるアジュバントと混合したそれぞれの抗原を３μｇ含んでいる。コットンラットに実験第１日目、１４日目及び２８日目の３回接種した。接種後２週間で、免疫の効力をKokai-Kunら (2003) Antimicrob.Agents.Chemother. 47; 1589-1597に記載の鼻腔内保菌アッセイで評価した。
データを古典的な重回帰分析により「Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ６」ソフトウェアを用いて解析した。抗原の存在を＋１で、また抗原の非存在を−１として符号化した。モデルの方程式を用いて、どの抗原が鼻腔あたりのコロニー数を大きく減少させる重要な抗原であるかを決定することができた。
結果
鼻腔内保菌アッセイの結果を表１９に示す。コントロール群は、平均３．５１３３５のｌｏｇＣＦＵ／鼻腔を有しており、鼻腔内保菌の減少は、ブドウ球菌タンパク質を接種したコットンラットの全群で見ることができた。群４、９、及び１３は、ＣＦＵ／鼻腔において２ログを超える減少を示しており、鼻腔内保菌での最大減少を示した。群１２及び１６もまた、ＣＦＵ／鼻腔で約２ログの減少を示した。
Figure 2009531388
抗原混合物中における特定の抗原の寄与については、鼻腔保菌データの重回帰分析を用いて算出した。最終モデルには７種の最良抗原が含まれていた。これらの抗原の結果を表２０に示す。タンパク質混合物の中で、ＨａｒＡの含有が鼻腔保菌数の最大の低減をもたらし、続いてＩｓａＡ、Ｓｂｉ、ＳｄｒＣ、オートリシン−グルコサミン、ＭＲＰＩＩ及びＥｂｈの順であった。
Figure 2009531388
好ましいタンパク質のポリペプチド配列である。表１は、各配列番号によって示されるタンパク質の情報を示す。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 図１−１の続き。 好ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。表１は、各配列番号によってコードされるタンパク質の情報を示す。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 図２−１の続き。 非変性条件下でのαトキシンの精製を示す。パネルＡは、αトキシンの精製中に調製したサンプルのクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーン１：分子量マーカー、レーン２：過剰発現させたαトキシンを含有する可溶性分画、レーン３：Ｎｉ−ＮＴＡカラムからのフロースルー、レーン４：１０％のバッファＢでの溶出分画、レーン５：２０％のバッファＢでの溶出分画、レーン６：３０％のバッファＢでの溶出分画、レーン７：５０％のバッファＢでの溶出分画、レーン８：７５％のバッファＢでの溶出分画、レーン９及び１０：１００％のバッファＢでの溶出分画、レーン１１：誘導前Ｔ＝０における細菌、レーン１２：誘導後Ｔ＝４時間における細菌、レーン１３：細胞溶解物、レーン１４：可溶性分画、レーン１５：不溶性分画。パネルＢは、精製したαトキシンの１０、５、２及び１μｌのクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 変性条件下におけるＳｄｒＣの精製を示す。パネルＡはαトキシンの精製中に調製したサンプルのクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。レーンＭ：分子量マーカー、レーン開始：過剰発現させたＳｄｒＣを含む不溶性分画からの上清、レーンＦＴ１：Ｎｉ−ＮＴＡカラムからのフロースルー、レーンＣ：バッファＣで溶出した分画、レーンＤ：バッファＤで溶出した分画、レーンＥ：バッファＥで溶出した分画。パネルＢは、精製したＳｄｒＣの１、２、５及び１０μｌのクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 精製タンパク質で被覆されたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対する抗血清のＥＬＩＳＡ結果である。接種前プールマウス：接種前のマウスから抽出されたプールされた血清を用いた結果。３回接種後プールマウス：接種後に抽出されたプールされたマウス血清を用いた結果。接種前プールウサギ：接種前のウサギから抽出されたプールされた血清を用いた結果。３回接種後プールウサギ：接種後に抽出されたプールされたウサギ血清を用いた結果。Ｂｌｃ：ネガティブコントロール。 図５−１の続き。 図５−１の続き。 図５−１の続き。 図５−１の続き。 ブドウ球菌の死菌で被覆されたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するマウス抗血清のＥＬＩＳＡ結果である。パネルＡは、黄色ブドウ球菌５型血清型の全死菌で被覆されたプレートを用いている。パネルＢは、黄色ブドウ球菌８型血清型の全死菌で被覆されたプレートを用いている。パネルＣは、表皮ブドウ球菌の全死菌で被覆されたプレートを用いている。四角で示される点を結ぶ線は、表示のブドウ球菌タンパク質で３回免疫したマウス由来の抗血清を用いたＥＬＩＳＡ結果を示している。菱形で示される点を結ぶ線は、接種前のマウス血清のＥＬＩＳＡ結果を示している。 図６−１の続き。 図６−１の続き。 図６−１の続き。 図６−１の続き。 ブドウ球菌の死菌で被覆されたプレートにおけるブドウ球菌タンパク質に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ結果である。パネルＡは、黄色ブドウ球菌５型血清型の全死菌で被覆されたプレートを用いている。パネルＢは、黄色ブドウ球菌８型血清型の全死菌で被覆されたプレートを用いている。パネルＣは、表皮ブドウ球菌の全死菌で被覆されたプレートを用いている。四角で示される点を結ぶ線は、表示のブドウ球菌タンパク質で３回免疫した（１回しか免疫していないＨａｒＡを除く）ウサギ由来の抗血清を用いたＥＬＩＳＡ結果を示している。菱形で示される点を結ぶ線は、接種前のウサギ血清のＥＬＩＳＡ結果を示している。 図７−１の続き。 図７−１の続き。 図７−１の続き。 図７−１の続き。 図７−１の続き。 図７−１の続き。 図７−１の続き。

Claims (57)

  1. ４０％未満がＮ−アセチル化されているブドウ球菌ＰＮＡＧを含む免疫原性組成物であって、該ＰＮＡＧがＰＮＡＧのアミン基に結合したリンカーによってキャリアタンパク質と結合してＰＮＡＧ複合体を形成している、上記免疫原性組成物。
  2. 黄色ブドウ球菌由来の８型莢膜多糖又はオリゴ糖を含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
  3. 黄色ブドウ球菌由来の５型莢膜多糖又はオリゴ糖を含む、請求項１又は２記載の免疫原性組成物。
  4. リンカーがキャリアタンパク質のアミン基に結合している、請求項１、２又は３記載の免疫原性組成物。
  5. リンカーが１〜２０オングストロームの長さである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  6. リンカーが硫黄原子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  7. リンカーがマレイミド基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  8. リンカーがジスルフィド結合を含む、請求項６記載の免疫原性組成物。
  9. マレイミド基が硫黄原子に結合している、請求項７記載の免疫原性組成物。
  10. リンカーがペプチド結合を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  11. ＰＮＡＧ複合体が、以下の構造：
    Figure 2009531388
     〔式中、Ｒ１及びＲ２は独立して、場合により置換されていてもよい芳香族若しくは脂肪族鎖、又は結合から選択される。〕
    を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  12. Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項１１記載の免疫原性組成物。
  13. Ｒ２がＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項１１又は１２記載の免疫原性組成物。
  14. ＰＮＡＧ複合体が、以下の構造：
    Figure 2009531388
     を有する、請求項１１記載の免疫原性組成物。
  15. ３３６抗原をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  16. ブドウ球菌タンパク質又はその断片をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  17. ブドウ球菌タンパク質又はその断片が、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ及びＭＡＰからなる群より選択される細胞外成分結合タンパク質である、請求項１６記載の免疫原性組成物。
  18. ブドウ球菌タンパク質又はその断片が、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体からなる群より選択される輸送体タンパク質である、請求項１６又は１７記載の免疫原性組成物。
  19. ブドウ球菌タンパク質又はその断片が、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択されるトキシン又は病原性調節因子である、請求項１６、１７又は１８記載の免疫原性組成物。
  20. 以下：
    ａ群）ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ及びＭＡＰからなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質又はその断片；
    ｂ群）免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、Ｍｇ２＋輸送体、ＨａｒＡ、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌輸送体タンパク質又はその断片；
    ｃ群）αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌病原性調節因子、トキシン又はその断片；
    ｄ群）ＭＲＰＩＩ及びオートリシンからなる群より選択される少なくとも１つのブドウ球菌構造タンパク質又はその免疫原性断片
    から選択される少なくとも２つの異なる群より選択される２又はそれ以上のブドウ球菌タンパク質を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  21. キャリアタンパク質が、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、プロテインＡ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択されるブドウ球菌タンパク質又はその断片を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  22. キャリアタンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、インフルエンザ菌プロテインＤ、緑膿菌エキソプロテインＡ、肺炎球菌ニューモリシン及びαトキソイドからなる群より選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  23. 有効な免疫応答が、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方に対して生起される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
  24. 請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
  25. 抗原を混合して請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を調製するステップ、及び薬学的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、ワクチンの製造方法。
  26. 請求項２４記載のワクチンをそれを必要とする患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌感染の予防又は治療方法。
  27. ブドウ球菌感染の治療又は予防のためのワクチンの製造における、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
  28. 黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖とキャリアタンパク質とを含む複合体の製造方法であって、
    （ａ）黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖をシアニル化試薬で活性化して、活性化黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖を生成するステップ；及び
    （ｂ）前記活性化黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖とキャリアタンパク質とを共有結合して、５型又は８型多糖又はオリゴ糖複合体を生成するステップ
    を含む方法。
  29. ５型又は８型多糖が天然のサイズである、請求項２８記載の方法。
  30. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖がサイジングされている、請求項２８記載の方法。
  31. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖が、マイクロ流動化、超音波照射又は化学処理によりサイジングされている、請求項３０記載の方法。
  32. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖のＯ−アセチル化の程度が５０〜１００％である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. キャリアタンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、緑膿菌エキソプロテインＡ、インフルエンザ菌プロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン及びブドウ球菌タンパク質からなる群より選択される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. キャリアタンパク質が、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、プロテインＡ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＨａｒＡ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択されるブドウ球菌タンパク質又はその断片である、請求項３３記載の方法。
  35. シアニル化試薬が１−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラボレート（ＣＤＡＰ）である、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖がキャリアタンパク質と直接結合している、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖がスペーサーを介してキャリアタンパク質と結合している、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. スペーサーがＡＤＨである、請求項３７記載の方法。
  39. ステップ（ａ）におけるシアニル化試薬と多糖又はオリゴ糖との比が０．２５／１〜１／１（ｗ／ｗ）又は０．３／１〜０．７／１（ｗ／ｗ）である、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ステップ（ａ）がｐＨ５．０〜７．０で行われる、請求項２８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. ステップ（ａ）が１分〜５分かけて行われる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. ステップ（ａ）がｐＨ８．０〜１０．０にｐＨを上昇させることにより終了する、請求項２８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. ステップ（ｂ）におけるキャリアタンパク質と５型又は８型多糖又はオリゴ糖との比が、１．１／１〜４／１又は１．２／１〜２／１（ｗ／ｗ）である、請求項２８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. ステップ（ｂ）がｐＨ８．０〜１０．０で行われる、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. ステップ（ｂ）が２５分〜４時間かけて行われる、請求項２８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖複合体と、少なくとも１つのさらなるブドウ球菌抗原とを混合するさらなるステップを含む、請求項２８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. ５型又は８型多糖又はオリゴ糖複合体と、薬学的に許容される希釈剤とを混合して、ワクチンを生成するさらなるステップを含む、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖又はオリゴ糖と、イソ尿素共有結合を含むリンカーによって結合したキャリアタンパク質とを含む複合体。
  49. 黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖が天然のサイズである、請求項４８記載の複合体。
  50. 黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖がサイジングされている、請求項４８記載の複合体。
  51. 黄色ブドウ球菌５型又は８型多糖のＯ−アセチル化の程度が５０〜１００％である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の複合体。
  52. キャリアタンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、緑膿菌エキソプロテインＡ、インフルエンザ菌プロテインＤ、肺炎球菌ニューモリシン及びブドウ球菌タンパク質からなる群より選択される、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の複合体。
  53. キャリアタンパク質が、ラミニン受容体、ＳｉｔＣ／ＭｎｔＣ／唾液結合タンパク質、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、エラスチン結合タンパク質（ＥｂｐＳ）、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、プロテインＡ、オートリシン、ＣｌｆＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、リパーゼＧｅｈＤ、ＳａｓＡ、ＳａｓＢ、ＳａｓＣ、ＳａｓＤ、ＳａｓＦ、ＳａｓＫ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、Ｃｎａ、ＣｌｆＢ、ＦｂｐＡ、Ｎｐａｓｅ、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＳｓａＡ、ＥＰＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合タンパク質、血液凝固酵素、Ｆｉｇ、ＭＡＰ、免疫優性ＡＢＣ輸送体、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、Ｍｇ２＋輸送体、ＳｉｔＣ及びＮｉ ＡＢＣ輸送体、αトキシン（Ｈｌａ）、αトキシンＨ３５Ｒ変異体及びＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）からなる群より選択されるブドウ球菌タンパク質又はその断片である、請求項５２記載の複合体。
  54. 請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
  55. 請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の複合体を混合するステップ、及び薬学的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、ワクチンの製造方法。
  56. 請求項５４記載のワクチンをそれを必要とする患者に投与するステップを含む、ブドウ球菌感染の予防又は治療方法。
  57. ブドウ球菌感染の治療又は予防のためのワクチンの製造における、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の複合体の使用。
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