JP2009527507A - Ｃｄ６３の表面発現を示す細胞に対する細胞傷害性介入 - Google Patents

Ｃｄ６３の表面発現を示す細胞に対する細胞傷害性介入 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌様疾患の診断および治療に関し、特に、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の仲介に関し、もっとも特異的には、細胞傷害性反応を起動するための手段として、任意に一つ以上の化学療法剤と組み合わせられる、癌様疾患修飾性抗体（ＣＤＩＶＩＢ）の使用に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する、結合アッセイに関する。
【選択図】図４

Description

本発明は、癌様疾患の診断および治療に関し、特に、腫瘍細胞に対する細胞傷害性の介入に関し、もっとも特異的には、細胞傷害性反応を起動するための手段として、任意に一つ以上の化学療法剤と組み合わせられる、癌様疾患修飾性抗体（ＣＤＡＭＢ）の使用に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する、結合アッセイに関する。
癌におけるＣＤ６３： ＣＤ６３は、テトラスパニンファミリーのＩＩＩ型膜タンパクであり、このファミリーの、２０種の現今メンバーは、四つの膜貫通セグメントの存在によって特徴づけられる。活性化血小板、顆粒球、およびメラノーマ細胞の全体細胞標本に対して惹起した抗体を用いて、いくつかのグループが独立にＣＤ６３を特定した。それぞれの、認識糖タンパク抗原のＣＤＮＡをクローニングしたところ、これらの様々な抗原は同一分子であるという見解が得られた。その後、白血球タイピングに関する、第６回国際ワークショップ（１９９６）は、これらの抗体を、ＣＤ６３抗体と分類命名した。１９９６年のワークショップ以前、ＣＤ６３は、複数の名前で知られており（メラノーマ１抗原、眼球メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連膜糖タンパク３、グラニュロフィシン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１）、これらは、時には、その部分的特徴解明および特定をもたらした抗体と関連させられた。したがって、ＣＤ６３はまた、抗原ＭＥ４９１（ＭＡＢ ＭＥ４９１）、神経腺抗原（ＭＡＢ ＬＳ５９、 ＬＳ６２、 ＬＳ７６、 ＬＳ１１３、 ＬＳ１４０、およびＬＳ１５２）、ＰＬＴＧＰ４０ （ＭＡＢ Ｈ５Ｃ６、 Ｈ４Ｆ８、 およびＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄支質細胞抗原（ＭＡＢ １２Ｆ１２）、骨前駆細胞特異的マーカー（ＭＡＢ ＨＯＰー２６）、およびインテグリン関連タンパク（ＭＡＢ ６Ｈ１）とも表示される。ヒトのＣＤ６３と交差反応することが判明している、他の抗体として、８ー１Ｈ、８ー２Ａ（ＭＥ４９１と交差反応を持つ）、ＮＫＩ/Ｃ３、およびＮＫＩ/黒ー１３（非特許文献１、２、３）がある。
ＣＤ６３は、最初、ヒトのメラノーマ細胞標本に対して惹起した、いくつかの抗体の内の一つであるＭＡＢ ＭＥ４９１を用いて、メラノーマＣＤＮＡライブラリーからクローンされた。ヒトのメラノーマ生検標本の実験において、ＭＡＢ ＭＥ４９１の反応性は、メラノーマの進行と逆相関を持つらしいことが示された。正常のメラノサイトでは、ＭＥ４９１抗体の反応性は低く、メラノーマ進行の初期段階（形成異常母斑および放射状増殖相（ＲＧＰ）腫瘍）ではより高くなるが、より発達したメラノーマ腫瘍、例えば、垂直増殖相（ＶＧＰ）および転移性腫瘍では減少するか、場合によっては欠落する。
ＣＤ６３はさらに、活性化依存性血小板膜５３ ＫＤＡ糖タンパクを検出する、ＭＡＢ ２.２８（活性化血小板に対して惹起されたもの）を用いて、ヒトの血小板において見出され、部分的にその特徴が明らかにされた。この分子はさらに、未刺激血小板の内部顆粒の膜と関連づけられた。同じ実験において、ＭＡＢ ２.２８はさらに、リソソーム区画の既知のマーカーである、酵素カテプシンＤに対する抗体と共時局在させたところ、巨核球および内皮細胞の内部顆粒を標識した。抗体集合および発現クローニングによる追跡実験から、この抗体によって認識される抗原がＣＤ６３であることが特定され、さらに、リソソーム区画において、該区画の特異的マーカーＬＡＭＰー１およびＬＡＭＰー２と共時局在させたところ、その存在が確認された。この分子のクローニングから、該分子がＣＤ６３であることが特定され、該分子をテトラスパニンファミリーに含めることが可能となった。
ＣＤ６３の発現は、多くの、異なる組織および細胞タイプで検出されている。細胞レベルでは、ＣＤ６３は、原形質膜と、さらには、細胞内の、後期エンドソーム小胞構造と関連することが見出された。ある場合には、細胞の活性化によって、ＣＤ６３の細胞内備蓄の移動による表面発現の上昇がもたらされた。ＣＤ６３はさらに、Ｂリンパ球においてＭＨＣクラスＩＩと共に、特に、エンドソームにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の表面輸送に与るエキソソームにおいて、かつ、分泌顆粒において、共時局在し、かつ、物理的に関連することが見出された。ＣＤ６３は、様々の細胞タイプ、例えば、Ｂー、およびＴーリンパ球、好中球、乳癌およびメラノーマ細胞において、テトラスパニンファミリーの他のメンバー、例えば、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ、Ｌ、Ｘ）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９Ｃ（ＶＬＡー３、またはインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９Ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９Ｆ（ＶＬＡー６、またはインテグリン鎖α６）、およびＣＤ２９（インテグリン鎖β１）、と相互作用を持つことが見出された。
癌におけるＣＤ６３の役割はこれまでずっと不明なままであった。ＣＤ６３は、最初、いくつかの独立グループによって、異なる様々な事象、例えば、血小板および顆粒球の活性化、ＭＨＣクラスＩＩ依存性抗原提示、インテグリン依存性細胞接着および移動、および、ある種の癌における腫瘍進行に関与することが見出されているが、その機能は依然として完全には解明されていない。現今の証拠は、ＣＤ６３が、様々な細胞内の生理的事象に関与していることを支持するが、それらの機能が相互に独立しているのかどうか、または、ＣＤ６３が関与する、基礎となる、共通の細胞機構が存在するのかどうかに関しては不明である。
これまでいくつかのグループが、ＣＤ６３と、ある種の腫瘍、特にメラノーマの進行との関連を調べてきている。ＭＡＢ ＭＥ４９１の外にも、他の、いくつかの抗ＣＤ６３モノクロナール抗体が、様々な進行段階の腫瘍を持つ患者から入手した癌サンプルの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色のために開発された。確かにＣＤ６３発現の低下を反映するものと、著者らによって解釈される染色度低下が、癌の高度の進行、および、その転移性と相関することが、観察された。比較的最近の、ある研究も、ＣＤ６３を含むテトラスパニンファミリーのいくつかのメンバーについて、その外見上の発現レベルの低下（ＭＲＮＡの定量化後の）と、いくつかの哺乳類癌由来細胞系統のインビトロ侵襲性との間に有意の相関があることを記載している。別の実験は、差動提示によって、エストロゲン無添加環境に暴露した乳癌培養細胞においてＣＤ６３を特定した。これは、ＣＤ６３発現は、ステロイドホルモンによって調整が可能であること、および、ＣＤ６３量および/または機能の変化もまた、乳房腫瘍の進行と関連する可能性のあることを示した。
一方、抗ＣＤ６３モノクロナール抗体ＭＡＢ ＦＣー５.０１による研究によって、その反応性エピトープは、異なる正常組織において様々に発現されることが明らかになった。この抗体は、ＣＤ６３を認識することが判明しているが、該抗体は、初期のメラノーマと、転移性メラノーマを含む、より進行した段階のメラノーマとを区別しなかった（ＭＡＢ ＭＥ４９１と違って）。これは、ＣＤ６３抗原は、これら比較的進行した腫瘍には存在するが、そのエピトープのあるものは、細胞において様々の段階で腫瘍からマスクされる可能性のあることを示唆する。これは、ＣＤ６３の中核ポリペプチドの翻訳後修飾の変化によるものかもしれないし、あるいは、ＣＤ６３が、他の分子と相互作用を持ち、それが、抗体認識および結合のための、特異的エピトープの利用可能性に影響を及ぼすためかもしれない。これらの結果は、非特許文献４によって記載される所見、すなわち、抗ＣＤ６３ ＭＡＢ ＮＫＩーＣ３による染色は、種々の進行段階におけるメラノーマ、例えば、原発性、放射増殖相、垂直増殖相、および転移性メラノーマから得られた組織切片を区別しないという観察を支持した。別の研究（非特許文献５、６）で、乳癌および非小細胞型肺癌から得られたＭＲＮＡの定量的ＰＣＲ分析によって、テトラスパニンファミリーの二つのメンバー（ＣＤ９およびＣＤ８２）では、その発現レベルと、腫瘍の進行および患者の予後との間に有意の相関があったが、同様の相関は、ＣＤ６３では認められないことが明らかにされた。なぜなら、ＣＤ６３の発現は全てのサンプルにおいて類似していた。これらの一見互いに矛盾する結果のため、ＣＤ６３と癌の関連をはっきりと証明する、強力で確実なデータは不足している。
ＣＤ６３と、この分子の、最終的腫瘍抑制機能との結びつきを確立するためのインビボ実験は、これまでほとんど試みられたことが無かった。上記研究の一つにおいて、ヒトのＣＤ６３過剰発現、ＨーＲＡＳ転換ＮＩＨー３Ｔ３細胞を、無胸腺マウスの皮下および腹腔内に注入し、親の、ＣＤ６３非過剰発現細胞の行動と比べたところ、腫瘍サイズおよび転移能の低下の外、生存時間の延長によって示される、悪性/腫瘍発現表現型の低下が明らかになった。これは、形質転換細胞におけるヒトのＣＤ６３の存在は、該細胞の悪性行動を抑える可能性のあることを示唆した。比較的最近、ヒトのＣＤ６３を発現するように、かつ、ＣＤ６３に対する耐性を誘発するように開発されたトランスジェニックマウスモデルの実験において、ヒトのＣＤ６３ーＭＨＣクラスＩ（Ｈー２ＫＢ）を共時トランスフェクトさせた、マウスのメラノーマ細胞系統を注入したところ、ワクシニアウィルスに融合させたヒトのＣＤ６３による免疫化によって、腫瘍増殖を抑制し、生存時間を延長することが可能であることが示された。この著者らによって、この治療作用は、Ｔーリンパ球依存性であること、および、この保護作用には、内因性の抗ＣＤ６３抗体は関与していないらしいことが示唆された。なぜなら、腫瘍増殖抑制は、動物に、ＣＤ６３ーＭＨＣクラスＩを共時トランスフェクトさせた細胞を注入したときにのみ起こり、ＣＤ６３のみをトランスフェクトさせた細胞系統では起こらなかったからである。この解釈は、次の事実によって支持された。すなわち、精製ヒトＣＤ６３によってあらかじめ免疫化され、抗ヒトＣＤ６３抗体を発達させた野生型動物では、腫瘍細胞増殖に対する保護作用は見られなかった。最初ヒト起源と考えられていたが、後にラット系統のものであることが解明されたＫＭ３細胞系統を用いた、非特許文献７に記載される実験から、このタンパクの発現は、無胸腺マウスの皮内に注入した場合、親の、トランスフェクトされないＫＭ３細胞を用いて観察したものと比べて、該細胞の増殖および転移能を下げることが明らかにされた。ただし、種々の、トランスフェクト細胞系統、および非トランスフェクト細胞系統の、インビトロの増殖速度の間には有意差は無かった。これらの所見は、腫瘍細胞のインビボおよびインビトロ両方の増殖速度に影響を及ぼすことが知られる、他の腫瘍抑制遺伝子の作用と、ＣＤ６３の可能な作用とを区別するものであった。さらに、抗ＣＤ６３モノクロナール抗体ＭＥ４９１は、インビトロアッセイ（非特許文献７）において、腫瘍細胞の、ランダムな運動性を下げることによって機能的作用を及ぼすことが見出されているのに、該細胞の増殖速度には影響を及ぼさなかった。
この実験はさらに、ＣＤ６３が、細胞外基質（ＥＣＭ）由来化学誘引物質、例えば、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびビトロネクチンに反応して移動を促進する可能性のあること、および、この作用は、β１型インテグリンの機能的関与によって仲介される可能性のあること、ただし、このインテグリンに対する抗体はこれらの作用を阻止することができなかったという所見を記載した。しかしながら、ＣＤ６３トランスフェクト細胞における、ビトロネクチン介在性シグナル伝達（インテグリンαＶβ５に対する既知のリガンド）の役割と、他のＥＣＭ成分、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンによって仲介されるシグナル伝達の役割との間には拮抗作用があるようであった。これは、特異的条件下で、ＥＣＭ成分の存在下では、ＣＤ６３の発現は移動の低下をもたらす可能性のあること、かつ、これは、接着と運動性との間の微妙なバランスに依存する可能性のあることを示唆した。別の実験では、抗ＣＤ６３モノクロナール抗体（ＭＡＢ ７１０Ｆ）は、ＰＭＡー処理ＨＬー６０細胞の接着および拡散を強調するが、一方、別の抗ＣＤ６３モノクロナール抗体（ＭＡＢ ２.２８）は、同じ作用を強調するものの、その作用は、はるかに小さい割合の細胞集団に対し、はるかに大量を加えたときにのみ見られた。これらの結果は、ＣＤ６３に対し多くの抗体が開発されてきたけれども、その機能的作用は大きく異なることを示した。
テトラスパニン類は、細胞増殖にも関与している可能性がある。非特許文献８は、ＣＤ８１（ＴＡＰＡー１）を認識するマウスＭＡＢ ５Ａ６の、リンパ球細胞系統に対する抗増殖作用について記載する。別の実験では、ヒトのＴリンパ球のＣＤ３７に抗体を連結したところ、ＣＤ３７誘発性増殖が阻止された。それよりも近いところでは、ＣＤ３７発現を欠損させた動物モデル（ＣＤ３７ノックアウト）による実験において、この動物から得られたＴリンパ球は、コンカナバリンＡ活性化およびＣＤ３/Ｔ細胞受容体結合に対し、野生動物のものと比べ、過度の増殖性を持つことを明らかにした。したがって、細胞成長および増殖における機能的役割が、テトラスパニンファミリーの共通の特性である可能性があるとする仮設が提出された。胚芽細胞腫および肝細胞癌細胞に関する最近の研究から、これらの細胞と、抗ＣＤ８１モノクロナール抗体との結合により、ＥＲＫ/ＭＡＰキナーゼ経路の活性がもたらされることが明らかにされた。このシグナル伝達経路は、細胞の成長および増殖事象に関与することがこれまで示されている。平行的研究において、ヒトのＣＤ８１を過剰に発現するトランスフェクト細胞系統において、擬似トランスフェクトされたコントロール細胞に比べて、増殖が増していることが示された。したがって、これまで得られた証拠は、一般にテトラスパニンが、特に、ＣＤ６３が、細胞成長増殖および細胞の接着/運動性の関連事象に関与することを示している。これらの二種類の細胞事象は、共に腫瘍の進行および転移において中心的役割を果たしているので、最近、熱心な研究標的となっている。
これまで、ＣＤ６３発現細胞を特異的に標的とする、抗ＣＤ６３抗体、またはその他の試薬は、報告されたことはなかったし、かつ、腫瘍細胞の、インビトロおよびインビボの増殖特性に同時的に影響を及ぼすのみならず、腫瘍細胞成長の動物モデルの生存時間にも影響を及ぼすことが示されたこともなかった。
アミノ酸配列決定および分析からは、テトラスパニンと他のタンパクファミリーとの間にも、または、以前に解明された機能的モジュールのいずれとも相同性は明らかにされず、さらに、従来既知のいずれの酵素活性も示唆されなかった。このため、シグナル伝達経路の変調における、このタンパクファミリーの役割を調べることは従来きわめて困難であった。しかしながら、細胞生理学における変化をもたらし、シグナル伝達経路の変調に深く依存するテトラスパニン特異的試薬を用いて得られた証拠は、テトラスパニン類は、シグナル伝達特性を有することを示唆する。ＣＤ６３は、それ自体が、二次的メッセンジャーシグナルの発生に関与する酵素であるいくつかの分子と、物理的にも機能的にも関連するか、または、そのような酵素と物理的におよび/または機能的に関連する。
炎症反応の初期ステップの一つである、ヒトの好中球と内皮細胞の相互作用を調節する機構の細部を明らかにするように設計された実験から、好中球をあらかじめ、いくつかの抗ＣＤ６３モノクロナール抗体（ＡＨＮー１６、 ＡＨＮー１６.１、 ＡＨＮー１６.２、 ＡＨＮー１６.３およびＡＨＮー１６ー５）で処理すると、これらの抗体の、培養内皮細胞層に対する接着が増進されることが明らかになった。さらに、この作用は、多くの細胞内シグナル経路の、周知の変調因子であるカルシウムイオン（ＣＡ２+）の存在に大きく依存しており、かつ、細胞が、刺激性抗体に暴露される、ある特異的期間に限って見られた。抗体に対する暴露をさらに長くした後では、好中球の、内皮細胞に対する接着は、より遅いＣＡ２+の添加に対して感受性を失った。これは、この事象が、動的で、時間的に調節される（一過性の）ものであることを意味する。さらに、ＣＤ６３は、ＣＤ１１/ＣＤ１８タンパク複合体と物理的に相互作用を持つことが認められ、かつ、この複合体を特異的に標的とする試薬は、変調シグナルを仲介した。この研究では、ＣＤ６３はさらに、酵素チロシンキナーゼＬＣＫおよびＨＣＫを含む複合体と物理的に関連するか、またはその一部であることが判明した。これらの酵素は、特異的表面受容体の活性化に応じて発せられる細胞内調節シグナルの仲介において中心的役割を果たし、細胞特異的生理的変化をもたらす、シグナル伝達縦列経路の一部である、タンパククラスのメンバーである。もう一つの研究から、テトラスパニン（ＣＤ６３を含む）とモノクロナール抗体の共時連結は、ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌細胞の、コラーゲン基質に対する接着によって誘発される酵素フォーカル接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化または活性を強化する可能性のあることが示唆された。これは、インテグリン介在性チロシンキナーゼシグナル伝達経路の変調に、ＣＤ６３（および、他のテトラスパニンファミリーのメンバー）が直接関与することを示す。表面のＣＤ６３の存在、および抗ＣＤ６３モノクロナール抗体ＭＡＢ ７１０Ｆによる表面ＣＤ６３に対する連結と機能的に交差する可能性のある、その他のシグナル伝達経路は、細胞内シグナル伝達経路の、もう一つの周知の変調因子である、酵素プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）によるリン酸化の変調に依存するもののようである。この所見を裏づけるものとして、ＭＡＢ ７１０Ｆによる、骨髄腫細胞系統ＨＬー６０の接着および形態変化の強化は、それらの細胞に対するフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による前処理に依存していた。ただし、ＰＫＣの時間的関与は、決定的には証明されなかった。一方、独立グループによるその後の研究によって、ＰＭＡー誘発によるＨＬー６０の分化がＰＫＣ活性依存性であることが証明された。なぜなら、この酵素の特異的抑制因子であるＲＯ３１ー８２２０が、ＰＭＡの作用を阻止したからである。
ＣＤ６３、およびテトラスパニンファミリーの他のメンバーと、シグナル伝達経路との関連を支持する、さらに別の証拠が、ＣＤ６３（およびＣＤ５３も）分子と、チロシンフォスファターゼ活性の間の、直接的か、または、超分子複合体の一部として現れる物理的関連を記載する研究から得られた。この研究では、抗ＣＤ６３抗体によって分離された免疫沈澱複合体が、チロシンフォスファターゼ活性と関連することが示された。ただし、チロシンフォスファターゼＣＤ４５と関連することが示されたＣＤ５３と違って、ＣＤ６３関連フォスファターゼを特定することはできなかった。さらに近年、テトラスパニンファミリーのいくつかのメンバーが、ＩＩ型フォスファチジルイノシトール４ーキナーゼ（ＩＩ型ＰＩ ４ーＫ）と関連することが見出された（非特許文献９）。この相互作用は、きわめて特異的であるようであった。なぜなら、その相互作用は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、およびＡ１５/ＴＡＬＬＡにおいてのみ特定されたが、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２、またはＮＡＧー２に起こることは観察されなかったからである。さらに、テトラスパニンファミリーのメンバーと、ＰＩー４Ｋの間の関連は相互に排他的であった。なぜなら、各ＰＩー４キナーゼ含有複合体は、テトラスパニンファミリーの単一メンバーに限定されていたからである。特に、ＣＤ６３ーＰＩー４キナーゼ複合体は、他のテトラスパニンメンバーによって形成されるものと違って、脂質ラフト様ドメインの細胞内区画にほぼ全部が認められた。この所見は、この、ＰＩー４キナーゼと相互作用を持つことが認められた、ＣＤ６３分画は、二次的メッセンジャー分子としての機能の外に（非特許文献１１）、膜輸送（エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス）および細胞骨格の再編成の調節への関与が周知な、フォスフォイノシチド生合成経路に関連する、あるいは、該合成経路に依存する、特異的細胞内事象（非特許文献１０）への関与が考えられること示唆した。
ＣＤ６３が、これまで直接関与することが見出された酵素が全て、シグナル伝達経路の調節に、直接かつ重要に関与していたことは、これらの酵素活性の下流側にある、調節またはエフェクター分子として、シグナル伝達経路の変調におけるＣＤ６３の関連を支持するさらに別の証拠を提供した。
腫瘍の進行をもたらす機構の解明は、しばしば一見矛盾する観察事実によって彩られる、きわめて困難で、複雑な試みであり、そのため、それらの観察事実が、有効に翻訳されて効果的治療にまとめられることは稀である。ＣＤ６３の、腫瘍の進行および転移との関連、および、シグナル伝達経路との関連に関する現在知られる知見に鑑みると、その機能が、腫瘍細胞において変更されることも可能である。
腫瘍細胞に対し細胞傷害性作用を持つ抗原特異的試薬であって、認識抗原（単数または複数）を発現する細胞に結合し、それ単独で、または他の分子と連結して、正常細胞集団に対しては著明な有害作用を及ぼすことなく、腫瘍細胞の増殖、進行、および転移を抑制するような、細胞性、およびインビボ生理活性を持つ試薬を開発したならば、それは、可能な治療および診断ツールとしてきわめて有益であろう。
癌治療薬としてのモノクロナール抗体： 癌を抱える各個人は独特であり、その個人のアイデンティテイと同様、他の癌と異なる癌を有する。にも拘わらず、現今の治療は、同じ段階の、同じタイプの癌を有する全ての患者を、同じように治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、第一線治療には奏功せず、したがって、次の治療ラウンドに進むが、治療不振、転移、および最終的に死亡の確率は増す。もしも特定の個人に合わせた治療の特注が可能となるならば、それは、より優れた治療法となると考えられる。特注を可能とする、現今唯一の治療は、手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合わせて調整することはできないが、手術だけでは、多くの場合、治癒をもたらすには不十分である。
モノクロナール抗体の登場とともに、特注治療のための方法を開発する可能性がより現実的となった。なぜなら、各抗体は、単一のエピトープを指向させることが可能だからである。さらに、ある特定の個人の腫瘍を一意に定める、エピトープの関連集合体に向けられる、抗体の組み合わせを生産することが可能である。
癌様細胞と正常細胞との間には有意な差があること、癌様細胞は、形質転換細胞に特異的な抗原を含むことを認識した科学界は、モノクロナール抗体を、これらの癌抗原に対し特異的に結合させることによって、形質転換細胞を特異的に標的とするように設計することが可能であると長い間思い続けてきた。このことから、モノクロナール抗体は、癌細胞を排除するための「魔法の弾丸」として役立ち得るとする信念が生まれた。しかしながら、現在では、いかなるものでも、単一のモノクロナール抗体では、癌の全ての事例には役立たないこと、複数のモノクロナール抗体を、一つのクラスとして、指向性癌治療として展開することが可能であることが広く認識されている。本開示の発明の教示にしたがって単離されるモノクロナール抗体は、患者にとって有利なやり方で、例えば、腫瘍負荷を下げることによって、癌様疾患の進行を修飾することが示されているが、本明細書では、癌様疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）、または「抗癌」抗体のように、様々な名前で呼ばれることになる。
現在、癌患者は、通常、少数の治療選択肢しか持たない。癌治療における区分法は、全体的な生存率および罹患率に改善をもたらした。しかしながら、特定の個人に対しては、このような統計学上の改善は、彼らの個人的状況の改善とは必ずしも相関しない。
したがって、開業医が、同じ対象群の中の他の患者とは独立に各腫瘍を独立に治療することを可能とする方法原理が提出されたならば、それは、まさにその個人だけに合わせた独自の方法を可能とすると考えられる。このような治療コースは、もし実現するならば、治癒率を上げ、さらによい結果を産み、長く求められてきた要求を満たすものとなろう。
歴史的には、ポリクロナール抗体が使用されてきたが、ヒト癌の治療ではごく限られた成功しか得られなかった。リンパ腫および白血病が、ヒトの血漿で治療されたが、長期の寛解または反応はほとんど見られなかった。さらに、再現性が欠如しており、化学療法に比べ、一段と勝る長所が見られなかった。乳癌、メラノーマ、および腎細胞癌のような固体腫瘍も、ヒト血漿、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清によって治療されたが、同様にその結果は予測不明で、無効であった。
固体腫瘍に対するモノクロナール抗体について、これまで多くの臨床治験が行われている。１９８０年代、ヒトの乳癌について少なくとも四つの臨床治験が行われたが、特異的抗原に対する抗体、または組織選択性に基づいて選ばれた抗体を用いたが、少なくとも４７名の患者の内、反応者は僅かに１名であった。１９９８年になって始めて、シスプラチンと組み合わせて、抗ＨＥＲ２/ＮＥＵヒト化抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））を用いた臨床治験が成功した。この治験では、３７名の患者の反応が評価されたが、約４分の１は、部分的反応率しか示さず、別の４分の１では、軽度の、または安定的な病気の進行が見られた。反応者の内、進行までの時間の中央値は８.４ヶ月であり、反応持続時間の中央値は５.３ヶ月であった。
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）と組み合わせた第一線使用が１９９８年に承認された。臨床治験結果から、ＴＡＸＯＬのみを服用したグループに比べ（３.０ヶ月）、抗体治療プラスＴＡＸＯＬを服用した人々（６.９ヶ月）では、病気進行までの時間の中央値に増加が見られた。生存率中央値にも僅かな増加が見られた。すなわち、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮプラスＴＡＸＯＬ治療群・対・ＴＡＸＯＬ治療単独群において、２２ヶ月・対・１８ヶ月であった。さらに、抗体プラスＴＡＸＯＬ併用群では、ＴＡＸＯＬ単独群に比べ、完全反応者の数（８パーセント対２パーセント）、および部分的反応者の数（３４パーセント対１５パーセント）の両方において増加が見られた。しかしながら、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮおよびＴＡＸＯＬによる治療では、ＴＡＸＯＬ治療単独に比べ、より高頻度の心臓毒性が誘発された（それぞれ、１３パーセント対１パーセント）。さらに、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療は、現在、その機能も、生物学的に重要なリガンドも未知な受容体である、ヒトの表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２/ＮＥＵ）を過剰発現する（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって定量した）患者、転移性乳癌をもつ患者の約２５％に対してのみ有効であった。したがって、乳癌患者にとっては、依然として満たされない大きな要求がある。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療で利益を受けることが可能な人々でもやはり化学療法は必要であろうし、したがって、少なくともある程度は、この種の治療の副作用に対処する必要はあろう。
結腸直腸癌を調べる臨床治験は、糖タンパクおよび糖脂質の両方を標的とする抗体を含む。腺癌に対して若干の特異性を持つ、１７ー１Ａなどの抗体は、６０名を超える患者において第２相臨床治験を経過したが、１名の患者しか部分的反応を示さなかった。別の臨床治験において、１７ー１Ａは、さらにシクロフォスファミドを使用するプロトコールで使用されたが、５２名の患者の内、完全な反応が得られたのは１名、僅かな反応が得られたのは２名のみであった。これまでのところ、１７ー１Ａの第ＩＩＩ相臨床治験は、第ＩＩＩ段階結腸癌に対する補助治療として効力の改善を実証していない。最初、画像用として承認された、マウスのヒト化モノクロナール抗体の使用は、腫瘍の寛解をもたらさなかった。
やっと最近になって、モノクロナール抗体の使用による結腸直腸癌の臨床治験においていくつかの陽性結果が得られている。２００４年、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）は、ＥＧＦＲを発現する転移性結腸直腸癌を有するが、イリノテカン中心の化学療法に対してほとんど反応しない患者の第２線治療用として承認された。２群によるＩＩ相臨床治験および単一群による治験の両方から得られた結果から、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸは、それぞれ、２３および１５パーセントの反応率、および、病気進行までの時間の中央値４.１および６.５ヶ月をもたらすことが示された。同じ２群ＩＩ相臨床治験およびもう一つの単一群治験から得られた結果から、ＥＲＢＩＴＸ単独による治療は、それぞれ、１１および９パーセントの反応率、および、病気進行までの時間の中央値１.５および４.２ヶ月をもたらすことが示された。
したがって、スイスおよびアメリカ合衆国の両国で、イリノテカンと組み合わせたＥＲＢＩＴＵＸが、アメリカ合衆国でＥＲＢＩＴＵＸ治療単独が、第１線のイリノテカン治療が不成功であった結腸癌患者に対する第２線治療薬として承認された。以上、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ同様、スイスにおける治療は、モノクロナール抗体と化学療法の併用としてのみ承認された。さらに、スイスおよび合衆国における治療は、第２線治療としてのみ患者用に承認された。さらに、２００４年、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）が、転移性結腸直腸癌の第１線治療薬として、５ーフルオロウラシル静注投与中心の化学療法と組み合わせた使用について承認された。ＩＩＩ相臨床治験の結果から、５ーフルオロウラシル単独で治療した患者と比べ、ＡＶＡＳＴＩＮプラス５ーフルオロウラシルで治療した患者では、生存時間の延長が証明された（それぞれ、２０ヶ月・対・１６ヶ月）。しかしながら、再び、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮおよびＥＲＢＩＴＵＸと同様、治療は、モノクロナール抗体と化学療法の併用としてのみ承認された。
肺癌、脳癌、卵巣癌、すい臓癌、前立腺癌、および胃癌についても不振な結果が続いている。最近、非小細胞型肺癌について有望な結果が、あるＩＩ相臨床治験から得られた。この治験では、細胞殺戮剤ドキソルビシンに接合させたモノクロナール抗体（ＳＧＮー１５； ＤＯＸーＢＲ９６、およびＳＩＡＬＹＬーＬＥＸ）が、化学療法剤タキソテールと組み合わせて使用された。タキソテールは、肺癌の第２線治療用として唯一ＦＤＡ承認を受けた化学療法剤である。初期のデータは、タキソテール単独と比べ、全体的生存率の改善を示した。治験のために招集された６２名の患者の内、３分の２が、タキソテールと組み合わせてＳＧＮー１５を服用し、一方、残りの３分の１は、タキソテールだけを服用した。タキソテールと組み合わせてＳＧＮー１５を服用した患者では、全体生存時間の中央値は、タキソテールだけを服用した患者における５.９ヶ月と比べ、７.３ヶ月であった。１年と１８ヶ月における全体生存率は、ＳＮＧー１５・プラス・タキソテールを服用する患者では、タキソテールだけを服用する患者に比べ、それぞれ、２４および８パーセントであった。さらに新たな臨床治験が計画されている。
臨床前の段階ではあるが、メラノーマに対するモノクロナール抗体の使用には、限られたものではあるが、ある程度の成功が見られる。これらの抗体の内で、臨床治験に達したものはほとんどなく、これまで承認されたものもなく、ＩＩＩ相治験において有望な結果を示したものもない。
病気治療のための新薬の発見は、３０、０００種の既知の遺伝子の内で、病気の発生原因に明らかに寄与する関連標的が特定できないために妨げられる。腫瘍学研究では、単にそれらが腫瘍細胞において過剰に発現されるという事実に基づいて、薬剤の仮想標的がしばしば選択される。このようにして特定された標的は次に、多数の化合物との相互作用についてスクリーニングされる。仮想抗体治療の場合、これらの候補化合物は、通常、ＫＯＨＬＥＲおよびＭＩＬＳＴＥＩＮ（非特許文献１２）によって敷かれた基本原理に基づく、従来の、モノクロナール抗体生産法によって得られる。抗原（例えば、全体細胞、細胞分画、精製抗原）によって免疫化したマウスから脾臓細胞を収集し、固定されたハイブリドーマパートナーと融合させる。得られたーハイブリドーマを、標的にもっとも積極的に結合する抗体の分泌についてスクリーニングし、選択する。癌細胞に向けられた、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮおよびＲＩＴＵＸＩＭＡＢを含む、多くの、治療および診断用抗体は、これらの方法を用いて生産され、その親和性に基づいて選択されてきた。この戦略における欠陥は二重である。先ず、治療または診断用抗体結合のための適切な標的の選択が、組織特異的発癌過程を取り巻く知識の欠乏、およびその結果生じる単純化法、例えば、標的の特定を、過剰発現によって行う選択によって限定される。第二に、受容体にもっとも大きい親和度をもって結合する薬剤分子が、常に、もっとも高率に、シグナルを起動または抑制するとする仮設は必ずしも常に該当しない。
乳癌および結腸癌の治療においては若干の進歩が見られたとは言うものの、単一剤であれ、併用治療であれ、効果的な抗体治療の特定および開発は、全ての種類の癌について不十分なままである。
先行特許：
特許文献１は、細胞代謝に対し抗翻訳および/または抗複製作用を有するモノクロナール抗体を内部に取り込む、癌細胞表面抗原に対して特異的なモノクロナール抗体を選択し、かつ、該モノクロナール抗体を特定するための方法を教示する。例として述べると、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３メラノーマ細胞、およびＳＷ９４８結腸直腸癌細胞中に取り込まれることが示された。さらに、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞において転写および細胞増殖を下げることが示された。特許文献２（およびその関連特許文献３、４、および５）は、ＣＤ６３抗原を含むグループから選ばれた卵巣腫瘍マーカー遺伝子によってコードされる卵巣腫瘍マーカーポリペプチドに結合する抗体による、卵巣腫瘍の増殖または転移の抑制法を明示する。卵巣腫瘍マーカー遺伝子を特定するために、卵巣腫瘍を用いて遺伝子発現の連続分析を行ったところ、候補としてＣＤ６３が特定された。特許文献６（および、その関連特許文献７）は、新規ポリペプチド、ヒトのＣＤ６３抗原５６.８７を明示する。特許文献８は、新規ポリペプチド、ヒトのＣＤ６３抗原１４.６３を明示する。特許文献９は、新規ポリペプチド、ヒトのＣＤ６３抗原１５.０７を明示する。特許文献１０は、新規ポリペプチド、ヒトのＣＤ６３抗原１１.１１を明示する。これらの特許文献は、ＣＤ６３抗原および抗体を特定するが、本発明の単離モノクロナール抗体、または、本発明の単離モノクロナール抗体の有用性を開示していない。
ＭＥ４９１ポリペプチドをコードする遺伝子はクローンされ、その配列は、１９８８年２月２４日公刊のために受理された（非特許文献１３）。ＣＤ６３をコードする遺伝子はクローンされ、その配列は、１９９１年２月公刊のために受理され（非特許文献１４）、かつ、公刊物は、ＭＥ４９１の、ＣＤ６３との同一性を明瞭に示した。
特許文献１１（配列番号８９、優先権出願日：２００４年６月２９日）、特許文献１２（配列番号１、優先権出願日：２００３年２月１３日（特許文献１３））；他の優先権日付：２００２年２月１４日（特許文献１４））、特許文献１５（配列番号４０、優先権出願日：２００２年１２月３０日（特許文献１６）；他の優先権日付：２００２年１月２日（特許文献１７））。全て、ＣＤ６３に対し１００％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献１８（配列番号９７８７および１２１０１、優先権出願日：２００２年８月１４日（特許文献１９）；他の優先権日付：２００１年８月１４日（特許文献２０）は、ＣＤ６３を含む、２３８個のアミノ酸の内２３７個のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献２１（配列番号２７、優先権出願日：２００３年２月１８日（特許文献２２）；他の優先権日付：２００２年２月２０日（特許文献２３））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内２２４個のアミノ酸と９４％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献２４（配列番号４１６８および４９１３、優先権出願日：２０００年２月２１日（特許文献２５）；他の優先権日付：１９９９年２月２６日（特許文献２６））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内、それぞれ、２０５個のアミノ酸および９４個のアミノ酸と１００％配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献２７（赤痢菌属ＯＳＰＧ#２６に対するヒトの侵食タンパク、優先権出願日：２００２年１月１１日（特許文献２８）；他の優先権日付：２００１年１月１２日（特許文献２９）は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内１３０個のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献３０（配列番号７５６、優先権出願日：２０００年３月０８日（特許文献３１）；他の優先権日付：１９９９年３月１２日（特許文献３２））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内１２７個のアミノ酸と９９％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献３３（配列番号３２０３、優先権出願日：２００１年１月０７日（特許文献３４）；他の優先権日付：２０００年１月０７日（特許文献３５））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内１３２個のアミノ酸と９７％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献３６（ヒトのＣＤ６３タンパク由来の、大きな細胞外ループ配列、優先権出願日：１９９９年１月１５日（特許文献３７）；他の優先権日付：１９９８年１月１５日（特許文献３８））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内９９個のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献３９（配列番号１２０７、優先権出願日付：２００２年３月０５日（特許文献４０）；他の優先権日付：２００１年３月０５日（特許文献４１））は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内１０２個のアミノ酸と８６％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
特許文献４２（配列番号４１６９、２０００年２月２１日（特許文献４３）；他の優先権日付：１９９９年２月２６日（特許文献４４）は、ＣＤ６３を含む２３８個のアミノ酸の内７４個のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを明示する。
これらの特許出願は、ＣＤ６３抗原に対し様々の配列相同性を有するポリペプチドを特定する。多くの場合、これらの出願はさらに、対応するポリペプチドおよびその相同体に対する抗体および抗体誘導体を明示するが、本発明の単離モノクロナール抗体を開示しないし、または、本発明の単離モノクロナール抗体の有用性を開示しない。重要なことは、上記出願は全て、ＣＤ６３をコードするポリヌクレオチド配列の公刊後に出願されたものである。
ＵＳ０５２９６３４８ ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１ ＷＯ０１７５１７７Ａ３ ＷＯ０１７５１７７Ａ２ ＡＵ０１５３１４０Ａ５ ＷＯ０２０５５５５１Ａ１ ＣＮ１３６４８０３Ａ ＣＮ１３２６９６２Ａ ＣＮ１３２６９５１Ａ ＣＮ１３５１０５４Ａ ＷＯ２００４０４１１７０.８９ ＷＯ２００３０６８２６８ーＡ２ ２００３ＷＯーＥＰ００１４６１ ２００２ＧＢー００００３４８０ ＷＯ２００３０５７１６０ーＡ２９ ２００２ＷＯーＵＳ０４１７９８ ２００２ＵＳー０３４５４４４Ｐ ＷＯ２００３０１６４７５ーＡ２ ２００２ＷＯーＵＳ０２５７６５ ２００１ＵＳー０３１２１４７Ｐ ＷＯ２００３０７０９０２ーＡ２ ２００３ＷＯーＵＳ００４９０２ ２００２ＵＳー０３５８２７９Ｐ ＥＰ１０３３４０１ーＡ２ ２０００ＥＰー００２００６１０ ９９ＵＳー０１２２４８７Ｐ ＷＯ２００２５７３０３ーＡ２ ２００２ＷＯーＥＰ０００７７７ ２００１ＵＳー０２６１１３０Ｐ ＷＯ２０００５５１８０ーＡ２ ２０００ＷＯーＵＳ００５９１８ ９９ＵＳー０１２４２７０Ｐ ＷＯ２００２００６７７ーＡ１ ２００１ＷＯーＵＳ０１８５６９ ２０００ＵＳー０２０９４６７Ｐ ＷＯ９９６６０２７ーＡ１ ９９ＷＯーＵＳ０１３４８０ ９８ＵＳー００８９２２６Ｐ ＷＯ２００２７０５３９ーＡ２ ２００２ＷＯーＵＳ００５０９５ ２００１ＵＳー００７９９４５１ ＥＰ１０３３４０１ーＡ２ ２０００ＥＰー００２００６１０ ９９ＵＳー０１２２４８ＵＰ ＶＡＮＮＥＧＯＯＲ ＡＮＤ ＲＵＭＫＥ、 １９８６ ＤＥＭＥＴＲＩＣＫ ＥＴ ＡＬ.、 １９９２ ＷＡＮＧ ＥＴ ＡＬ.、 １９９２ ＳＩ ＡＮＤ ＨＥＲＳＥＹ（１９９３） ＡＤＡＣＨＩ ＥＴ ＡＬ.、 １９９８ ＨＵＡＮＧ ＥＴ ＡＬ.、 １９９８ ＲＥＤＦＯＲＤ ＥＴ ＡＬ. （１９９５） ＯＲＥＮ ＥＴ ＡＬ. （１９９０） ＢＥＲＤＩＴＣＨＥＶＳＫＩ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７ ＣＬＡＡＳ、 Ｃ、 ＥＴ ＡＬ.、 ２００１ ＭＡＲＴＩＮ、 Ｔ.、 １９９８ ＫＯＨＬＥＲ ＡＮＤ ＭＩＬＳＴＥＩＮ （１９７５、 ＮＡＴＵＲＥ、 ２５６、 ４９５ー４９７） ＣＡＮ ＲＥＳ ４８：２９５５、 １９８８、 ＪＵＮＥ １ ＪＢＣ ２６６（５）：３２３９ー３２４５、 １９９１
本発明人らには、以前に、癌様疾患の治療に有用な、個別の要求に合致させた抗癌抗体を選択するためのプロセスを主題とした、名称「個別化された、患者特異的抗癌抗体（“ＩＮＤＩＶＩＤＵＡＬＩＺＥＤ ＰＡＴＩＥＮＴ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＡＮＴＩーＣＡＮＣＥＲ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ”）」なる米国特許第６、１８０、３５７が付与された。タンパクの構造および機能に重大な作用を及ぼすことなく、そのポリペプチドにおいて、いくつかのアミノ酸配列を変更することが可能であることは、従来技術において周知である。抗体の分子再編成において、バックボーン領域の核酸またはアミノ酸配列の修飾は、一般に、耐容される。そのような修飾として、ただしこれらに限定されないが、置換（保存的置換が好ましい）、欠失、または付加が挙げられる。さらに、標準的化学療法型薬剤、例えば、核種を、本発明のＣＤＭＡＢに接合し、前記化学療法剤の使用域を収束することは、本発明の範囲内にある。このＣＤＭＡＢは、毒素、細胞傷害性成分、酵素、例えば、ビオチン接合酵素、または血液系細胞に接合させて、抗体接合体を形成することも可能である。
本出願は、癌様疾患修飾性モノクロナール抗体をコードする、ーハイブリドーマ細胞系統を単離するための上記３５７特許に教示される、患者特異的抗癌抗体の生産法を利用する。これらの抗体は、一腫瘍のために特異的に生産することが可能であり、したがって、癌治療の特注化を可能とする。本出願の通用範囲において、細胞殺戮性（細胞傷害性）、または細胞増殖抑制性（細胞静止性）を有する抗癌抗体を、以後、細胞傷害性を持つと呼ぶ。これらの抗体は、癌の段階判定および診断の補助に使用すること、腫瘍の転移の治療に使用することが可能である。従来の薬剤発見パラダイムにしたがって生成される抗体と違って、このようにして生成される抗体は、従来から悪性組織の増殖および/または生存と一体的であることが示されたことがない分子および経路をも標的とする可能性がある。さらに、これらの抗体の結合親和性は、比較的強い親和度の相互作用には反応しない細胞傷害性事象の起動に求められる要求に合致する。
個別化された抗癌治療の展望は、患者の管理法にも変化をもたらす。考えられる臨床シナリオは、発見の時点で腫瘍サンプルが得られ、預託される。このサンプルについて、既存の、癌様疾患修飾抗体系列に基づいて、腫瘍のタイプ分けを行うことが可能である。患者の段階判定を行うと好都合であるが、患者をさらに段階判定するのに、手持ちの抗体を使用することが可能である。直ちに既存の抗体で患者を治療することが可能であり、その腫瘍に対して特異的な、一系列の抗体を、本明細書に略述される方法を用いて、または、本明細書に開示されるスクリーニング法と組み合わせてファージディスプレイライブラリーを用いて、生産することが可能である。生成される全ての抗体が、抗癌抗体のライブラリーに加えられる。なぜなら、他の腫瘍が、治療されるものと同じエピトープのいくつかを担持する可能性があるからである。本法にしたがって生産される抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する、任意の数の患者において癌様疾患を治療するのに有用である可能性がある。
抗癌抗体の外に、患者は、多数方式統合治療の一部として、現今推奨の治療を受容するように選択することも可能である。本法によって単離される抗体は、非癌様細胞に対しては比較的毒性を持たないという事実から、複数抗体の高用量の併用を、単独で、または通例治療と組み合わせて使用することが可能である。高い治療指数はさらに、治療耐性細胞出現の可能性を下げることになる、短い時間スケールでの再治療を可能とする。
患者が、初回の治療コースに反応しにくかったり、または転移が起こった場合には、腫瘍に対する特異的抗体の生成過程を、再治療のために繰り返すことが可能である。さらに、抗癌抗体を、その患者から得た赤血球に接合させて、転移治療のために再輸液することが可能である。転移癌に対しては効果的な治療がほとんどなく、転移は通常、死に至る暗い結果の予兆である。しかしながら、転移癌には、通常、よく血管が発達しており、赤血球による抗癌剤の送達は、腫瘍部位に抗体を濃縮する作用を及ぼすことが可能である。転移以前においても、大抵の癌細胞は、その生存を、宿主の血液補給に依存するので、赤血球に接合させた抗癌抗体は、体内の腫瘍に対しても有効である可能性がある。それとは別に、抗体は、他の血液系細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などに接合させてもよい。
５クラスの抗体があり、それぞれが、その重鎖によって与えられる機能と関連する。一般に、裸の抗体による癌細胞の殺作用は、抗体依存性細胞傷害性、または補体依存性細胞傷害性のどちらかによって仲介されると考えられている。例えば、マウスのＩＧＭおよびＩＧＧ２Ａ抗体は、補体系のＣ１成分に結合することによってヒトの補体を活性化し、それによって補体活性化の古典経路を活性化し、これが、腫瘍の分解を可能とする。ヒトの抗体では、もっとも効果的な補体活性化抗体は、一般に、ＩＧＭおよびＩＧＧ１である。ＩＧＧ２ＡおよびＩＧＧ３異性形から成るマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、およびある種のリンパ球を介して細胞死をもたらすＦＣ受容体を有する、細胞傷害性細胞を招集するのに有効である。ＩＧＧ１およびＩＧＧ３異性形から成るヒト抗体はＡＤＣＣを仲介する。
抗体介在性癌撲滅の、もう一つの可能な機序は、細胞膜、およびその関連糖タンパクまたは糖脂質における各種化学的結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒性抗体の使用を通じて行われる可能性がある。
抗体介在性癌細胞殺戮に関してはさらに三つの機序がある。第１は、癌細胞の上に存在する候補抗原に対して免疫反応を生成するよう生体を喚起するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖受容体を標的とし、それらの機能に干渉するか、または、受容体を下方調整して、該受容体の機能を効果的に欠落させる抗体の使用である。第３は、直接的細胞死を招く可能性のある、細胞表面成分同士の直接連結、例えば、ＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＴＲＡＩＬ Ｒ２などの死亡受容体、またはアルファＶベータ３などのインテグリン分子同士の連結に対する抗体の作用である。
癌薬剤の臨床的有用性は、患者にとって受容可能なリスクプロフィール下における該薬剤の利益によって量られる。癌治療では、一般に、生存率が、もっとも強く求められる利益であるが、生命の延長の外に、いくつかの広く認識される利益がある。治療が生存率に悪影響を及ぼすことない限り（望ましい）他の利益として、症状の緩和、不快事象に対する保護、再発までの時間、すなわち無病の生存時間の延長、および進行までの時間の延長が挙げられる。これらの基準は一般的に受け容れられており、米国食品薬品局などの規制当局も、これらの利益を生み出す薬品を承認する（ＨＩＲＳＣＨＦＥＬＤ ＥＴ ＡＬ.、 ＣＲＩＴＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷＳ ＩＮ ＯＮＣＯＬＯＧＹ/ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ４２：１３７ー１４３ ２００２）。これらの基準の外に、この種の利益を予告する他の終末点があることも十分認識されている。米国食品薬品局によって与えられる承認過程が加速されることは、患者利益を予測することがほぼ確かな代用物の存在を一部認めることになる。２００３年末現在、この過程の下に１６種の薬剤が承認され、この内四つは完全承認を受けた。すなわち、追跡実験でも、代用終末点によって予測された通りの直接的患者利益が実証された。固体腫瘍における薬剤作用を判定するための、一つの重要な終末点は、治療に対する反応を測定することによって腫瘍負荷を評価することである（ＴＨＥＲＡＳＳＥ ＥＴ ＡＬ. ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＨＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ９２（３）： ２０５ー２１６ ２０００）。このような評価のための臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）が、癌における国際的エキスパートグループである、固体腫瘍における反応評価基準作業グループによって制定されている。ＲＥＣＩＳＴ基準による客観的反応によって示され、適切なコントロールグループと比べて腫瘍負荷に対する作用が実証された薬剤は、最終的に、直接的患者利益をもたらす傾向を持つ。前臨床背景では、一般に、腫瘍負荷の評価および記録は、比較的直接的である。前臨床実験が、臨床背景に翻訳可能である限りにおいて、前臨床モデルにおいて生存の延長を実現した薬剤は、臨床的有用性がもっとも期待される。臨床治療に対し陽性反応をもたらす場合と似て、前臨床背景において腫瘍負荷を緩和する薬剤は、その病気に対し著明な直接的影響をもたらす可能性がある。生存時間の延長は、癌薬剤の治療においてもっとも求められる臨床結果ではあるが、臨床的有用性を持つ他の利益もあり、かつ、病気進行の遅延と相関する可能性がある腫瘍負荷の緩和、生存時間の延長、またはその両方が、直接的利益をもたらし、かつ、臨床作用を持つことは明瞭である（ＥＣＫＨＡＲＤＴ ＥＴ ＡＬ. 「開発治療法：標的化合物の臨床治験設計の成功と失敗（“ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＳＵＣＣＥＳＳＥＳ ＡＮＤ ＦＡＩＬＵＲＥＳ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＴＲＩＡＬ ＤＥＳＩＧＮＳ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴＥＤ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ”）」、ＡＳＣＯ ＥＤＵＣＡＴＩＯＮＡＬ ＢＯＯＫ、 ３９ＴＨ ＡＮＮＵＡＬ ＭＥＥＴＩＮＧ、 ２００３、 ＰＡＧＥＳ ２０９ー２１９）。
ＵＳ６、１８０、３５７のプロセス、および、Ｕ.Ｓ.特許６、６５７、０４８およびＳ.Ｎ. １０/３４８、２３１およびＳ.Ｎ. ６０/６４２、０５７、なお上記特許のそれぞれの内容を引用により本明細書に含める、に開示されるプロセスを事実上用いて、マウスモノクロナール抗体７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、患者の肺（Ｈ４６０ー２２ー１）または乳房（７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、および１Ａ２４５.６）の腫瘍生検から得た細胞でマウスを免疫化した後に、得た。Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原は、様々な組織起源の、広範なヒト細胞系統の細胞表面に発現された。７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０抗原は、乳癌細胞の細胞表面に発現された。乳癌細胞系統ＭＤＡーＭＢー２３１（ＭＢー２３１）、およびメラノーマ細胞系統Ａ２０５８は、インビトロにおいて、Ｈ４６０ー２２ー１の細胞傷害性作用に対し感受性を有していた。乳癌細胞系統ＭＣＦー７、および前立腺癌細胞系統ＰＣー３は、インビトロにおいて、１Ａ２４５.６および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの細胞傷害性作用に対し感受性を有していた。乳癌細胞系統ＨＳ５７４.Ｔは、インビトロにおいて、７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０の細胞傷害性作用に対し感受性を有していた。
培養乳癌細胞に対する、Ｈ４６０ー２２ー１の細胞傷害性の結果は、インビボにおける、この癌症状に対する、その抗腫瘍活性によってさらに拡張された（Ｓ.Ｎ.１１/３２１、６２４の開示による）。ヒト乳癌の、予防的インビボモデルにおいて、Ｈ４６０ー２２ー１を、腫瘍細胞移植の１日前に、マウスに投与し、その後、毎週７週間に亘って注入した。Ｈ４６０ー２２ー１治療は、治療時の腫瘍増殖の抑制において、異性形コントロール抗体よりも有意に（Ｐ<０.０００１）効果的であった。治療相の終了時、Ｈ４６０ー２２ー１を投与されたマウスでは、腫瘍は、コントロール群の僅か１７.７パーセントまでしか増殖しなかった。治療後の追跡期間中もＨ４６０ー２２ー１の治療効果は持続し、治療群における腫瘍の平均体積は、測定相の終了までずっとコントロールよりも有意に小さかった。
生存率を抗体効力の尺度として用いると、コントロール群では、移植後７４ー８１日目に死亡率が５０％に達した。一方、Ｈ４６０ー２２ー１治療群では、実験の終了時にも死亡率は５０％に達しなかった。この差は、Ｈ４６０ー２２ー１治療群と、異性形コントロール治療群の間で有意であった（Ｐ<０.００１５）。これらのデータは、Ｈ４６０ー２２ー１治療が、コントロール治療群に比べて、生存利益を付与することを証明した。Ｈ４６０ー２２ー１は、体重減少および臨床的不調を含めた毒性の兆候を全く誘発しないので、安全と思われた。以上、Ｈ４６０ー２２ー１治療は、十分に確立されたヒトの乳癌モデルにおいて、コントロール治療群と比べ、腫瘍増殖が遅延され、生存率が強化された点で、効果的であった。これらの結果は、同様の所見が、この種の、別の実験でも観察されたことから再現が可能であり、癌を患う人々の治療への関与および利益を示唆する。
乳癌の予防的インビボモデルの外にも、Ｈ４６０ー２２ー１は、確立されたインビボの腫瘍モデルにおいて、ＭＢー２３１細胞に対し抗腫瘍活性を示した（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４に開示される）。この異種移植腫瘍モデルでは、ＭＢー２３１乳癌細胞が、抗体治療の前に腫瘍が臨界サイズに達するように免疫欠損マウスの皮下に移植された。Ｈ４６０ー２２ー１による治療を、標準的化学療法剤シスプラチンと比較した。シスプラチンおよびＨ４６０ー２２ー１治療では、異性形コントロール抗体で治療された群と比べ、平均腫瘍体積が有意に（Ｐ<０.００１）小さいことが示された。Ｈ４６０ー２２ー１治療は、シスプラチン化学療法のものの約３分の２の腫瘍抑制を仲介したが、シスプラチンに観察される著明な体重減少（Ｐ<０.００３）、および臨床的不調は無かった。Ｈ４６０ー２２ー１の抗腫瘍活性、およびその毒性がきわめて低いことは、Ｈ４６０ー２２ー１を、魅力ある抗癌治療剤とする。
治療後期間においても、Ｈ４６０ー２２ー１は、異性形コントロール抗体群に比べて腫瘍増殖を遅らせることによって腫瘍抑制を持続した。治療後３１日において、Ｈ４６０ー２２ー１は、異性形コントロール抗体群と比べて、４２パーセント腫瘍増殖を下げることによって腫瘍サイズを制限した。この値は、治療の終了時に観察された４８パーセントの低下にほぼ等しい。この確立された、乳癌腫瘍モデルにおいて、これらの結果は、腫瘍抑制を維持するＨ４６０ー２２ー１の能力は治療相を超えることを示し、かつ、哺乳動物において腫瘍負荷を減らし、生存を強化する抗体の能力を実証した。
乳癌および前立腺癌培養細胞に対する、１Ａ２４５.６および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの細胞傷害性の結果は、インビボにおけるこれらの癌兆候に対するその抗腫瘍活性によって（Ｓ.Ｎ. １０/３４８、２３１、Ｓ.Ｎ. １０/８９、８６６、Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６、およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示される）さらに拡張された。
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６は、ヒトの乳癌の、ＭＢー２３１予防的インビボモデルにおいて腫瘍増殖および腫瘍負荷を阻止した。監視は、治療後３００日続行した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、腫瘍を決して発達させることなく、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群の８７.５％は、移植後９ヶ月を超えてもなお生存していた（マウスの内の１匹は、非腫瘍関連の原因によって死亡した）。逆に、異性形コントロール群では、７２日目（治療後２３日）に死亡率が１００パーセントに達した。１Ａ２４５.６治療マウスでは、治療後１５１日までに死亡率が１００パーセントに達した。この日数は、異性形コントロール治療群のものより６倍以上長い。したがって、１Ａ２４５.６も、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａも、後者はより高度に、乳癌モデルにおいて生存率を上げ、かつ腫瘍増殖を阻止した（したがって、病気の進行を遅らせた）。
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６も、ヒト乳癌の、インビボ確立モデルにおいて、有意に腫瘍増殖を抑制し腫瘍負荷を下げた。８０日（治療後２３日）までに、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療マウスでは、異性形コントロール群に比べ、腫瘍の平均体積が８３％低くなった（Ｐ=０.００１）。１Ａ２４５.６は、この日に、腫瘍の平均体積を３５パーセント下げたが、この低下は、この実験では有意に届かなかった（Ｐ=０.１３５）。
抗体効力の尺度として生存率を用いると、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群における死亡リスクは、治療後約６０日において、異性形コントロール群の約１６パーセントであると評価された（Ｐ=０.０００６）。異性形コントロール群は、その１００％が、治療後５０日までに死んだ。それに対し、１Ａ２４５.６治療マウスは、治療後１００日まで生存し、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群の６０パーセントが、治療後１３０日においてもなお生存していた。このデータは、１Ａ２４５.６および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの両治療群とも、コントロール治療群と比べ、生存率利益を与えること、および腫瘍負荷を下げることを明らかにした。
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療は、体重減少および臨床的不調を含めた毒性の兆候を全く誘発しないので、安全と思われた。以上、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療は、十分に確立されたヒトの乳癌モデルにおいて、コントロール治療群と比べ、腫瘍増殖が遅延され、生存率が強化された点で、効果的であった。
Ｓ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示される実験において、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める、化学療法剤（シスプラチン）単独、または併用と比較した場合の７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの作用を、二つの異なる、乳癌異種移植確立モデルにおいて定量した。
ＭＢー２３１モデルでは、８３日（治療後２０日）において、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、バッファーコントロール治療動物に比べ、腫瘍増殖の８３％の低下をもたらした（Ｐ=０.００２）。シスプラチン治療単独は、コントロールに比べ、腫瘍サイズの７７パーセントの低下をもたらしたが、一方、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと組み合わせたシスプラチンは、コントロールと比べ、腫瘍サイズの８８パーセントの低下をもたらした（Ｐ=０.００６）。
ＭＤＡーＭＢー４６８（ＭＢー４６８）モデルでは、６２日（治療後１２日）において、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと組み合わせたシスプラチンにおいて、腫瘍増殖の最大低下（９７パーセント、Ｐ=０.００１）が観察された。シスプラチン治療単独は、バッファーコントロールに比べ、腫瘍サイズの９５パーセントの低下をもたらし、一方、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの単独治療は、３７パーセント（Ｐ=０.０４６）の低下をもたらした。
ＭＢー２３１およびＭＢー４６８両モデルでは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによる治療は、体重で測定した場合、シスプラチンによる治療に比べ、より大きな動物の安寧をもたらした。これらの結果から、ＭＢー３２１モデルでは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、シスプラチン単独治療に比べ、より大きな効力を有すること、および、両乳癌モデルでは、シスプラチンよりも、体重減少などの副作用がより少なく、よりよく耐容されることが示された。
各種用量における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療の作用を定量するために、用量反応実験を、予防的乳癌異種移植モデルにおいて行った（Ｓ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるやり方で）。５５日目（治療後５日）、０.２ ＭＧ/ＫＧ治療群では、異性形コントロール治療群に比べ、腫瘍増殖が８５パーセント低下した。さらに５５日目、２および２０ ＭＧ/ＫＧ治療の両群とも腫瘍はまだ発達していなかった。同様の結果が、１２５日目にも得られた（治療後７５日）。その時点で、２０ ＭＧ/ＫＧ治療群では腫瘍が発達せず、２ ＭＧ/ＫＧ治療群では、若干の、初期の腫瘍増殖が見られた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療はさらに、生存率利益も示した。異性形コントロール群のマウスは全て１０４日（治療後５４日）までに死亡したが、一方、０.２ ＭＧ/ＫＧ ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群は、１９７日目（治療後１４７日）まで生存した。さらに大きな生存率利益が、２.０および２０ ＭＧ/ＫＧ ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群において観察された。２９０日目（治療後２４０日）までに死亡したのは、２.０ ＭＧ/ＫＧ治療群では僅かに５０パーセントであり、２０ ＭＧ/ＫＧ治療群では、２９０日目までに死亡したものは全く無かった。したがって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、三つの全ての用量において、有意な腫瘍増殖低下をもたらし、生存率を増大させた。最大度の効力は、最高用量が示した。
乳癌の、インビボ確立腫瘍モデルにおける有効作用の外に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療はさらに、予防的インビボ前立腺癌モデル（Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める）において、ＰＣー３細胞に対し抗腫瘍活性を及ぼした。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療は、治療期間後短い時間ではあるが、腫瘍抑制において、異性形コントロール抗体よりも有意に効果的であった。治療相の終了時、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたは１Ａ２４５.６を投与されたマウスでは、増殖腫瘍は、それぞれ、異性形コントロール群の３１および５０パーセントであった。
ＰＣー３ ＳＣＩＤ異種移植モデルでは、病気進行の代用インディケータとして体重を使用することが可能である。５２日目、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療は、異性形コントロールに比べ、体重の損失を、それぞれ、５４および２５パーセントだけ有意に（それぞれ、Ｐ=０.００２および０.００４）阻止した。マウスは、治療後の生存率について監視した。治療後１１日で、異性形およびバッファーコントロールマウスは１００パーセント死亡率に達した。逆に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６では、治療後３８日で１００パーセント死亡率に達した。これは、コントロール群よりも３倍長い。以上、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび１Ａ２４５.６治療は、ヒト前立腺癌の確立モデルにおいて、異性形コントロール治療群に比べ、腫瘍増殖を遅らせ、体重損失を阻止し、かつ、生存を延長したという点で共に有効であった。
前立腺癌の予防的インビボ腫瘍モデルの外に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、インビボ確立腫瘍モデル（Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める）において、ＰＣー３細胞に対し抗腫瘍活性を示した。再び、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによる治療を、異性形コントロールと比較した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群では、治療直後において、異性形コントロール群に比べ、腫瘍の平均体積が有意に（Ｐ<０.０２４）に小さいことが示された。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、異性形コントロール群に比べ、３６パーセント大きな腫瘍抑制を仲介した。
乳癌および前立腺癌のインビボ腫瘍モデルにおける効果的作用の外に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療はさらに、予防的インビボすい臓癌モデル（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４に開示）において、ＢＸＰＣー３細胞に対し抗腫瘍活性を示した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、治療期間後短時間では、バッファーコントロールよりも、腫瘍の抑制において有意に有効であった（７１パーセント、Ｐ=０.０００９）。さらに、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、バッファーコントロール群と比べ、生存率利益を付与した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療群では、バッファーコントロール群のマウスの全員死亡後２週間以上経った時点で、マウスの４０パーセントが依存として生存していた。
乳癌、前立腺癌、およびすい臓癌のインビボ腫瘍モデルにおける効果的作用の外に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療はさらに、二つの、別々の、予防的インビボメラノーマ癌モデル（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４に開示）において、Ａ２０５８およびＡ３７５細胞に対し抗腫瘍活性を及ぼした。Ａ２０５８およびＡ３７５両モデルにおいて、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、腫瘍増殖の抑制において、バッファーコントロールよりも有意に効果的であった（それぞれ、７２パーセント、Ｐ=０.０１１、および６３パーセント、Ｐ=０.０００６）。乳癌、前立腺癌、およびすい臓癌モデルにおけるのみならず、メラノーマにおいても７ＢＤＩ−３３ー１１Ａに抗腫瘍活性が見られることは、該抗体を、抗癌治療剤として魅力的なものとする。
ヒトメラノーマの、予防的インビボ腫瘍モデルにおいて明らかにされた効果的作用の外に、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療はさらに、二つの、別々の、確立された、インビボメラノーマ癌モデル（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４に開示）において、Ａ２０５８およびＡ３７５細胞に対し抗腫瘍活性を及ぼした。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａプラスダカルバジン治療群では、ぞれぞれ、Ａ２０５８およびＡ３７５細胞に対し、腫瘍増殖が有意に抑制された。Ａ２０５８モデルでは、腫瘍の平均体積は、コントロール群測定値の３０.８７％（Ｐ<０４４３）であった。Ａ３７５モデルでは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ/ダカルバジン併用治療群におけるＴＴＥ（終末点までの時間）中央値は３９.１日であり、これは、腫瘍増殖における１４７％の有意な遅延に相当した（Ｐ<０.０１）。どちらのモデルにも有毒死は観察されなかった。したがって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療は、ヒト癌のインビボ確立モデルにおける乳癌および、ここでは、メラノーマの治療において、安全と思われ、かつ、効力を示した。
インビボで７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによって示された効力が、全てＡＤＣＣ活性によるものか、または一部が該活性によるものかを決定するために、ＮＯＤ ＳＣＩＤおよびＳＣＩＤの両マウスにおいて確立腫瘍モデルを用いＭＢー２３１細胞に対し、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの抗腫瘍活性を測定した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が機能的に欠損し、循環補体を欠き、機能的に未熟なマクロファージ集団しか持たない。一方、ＳＣＩＤマウスは、補体および強靭なＮＫ細胞活性を有する。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、マウスのＩＧＧ２モノクロナール抗体であり、したがって、インビボでＡＤＣＣ活性を発揮することが可能である。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの抗腫瘍活性を、バッファーコントロール、およびＨ４６０ー２２ー１、すなわち、その異性形に基づけばＡＤＣＣを介して活性を発揮する筈のない、マウスＩＧＧ１モノクロナール抗体と比較した。５４日目（最終治療後４日）、ＳＣＩＤ治療群では、７ＢＤＩ−３３ー１１ＡおよびＨ４６０ー２２ー１治療マウスにおいて腫瘍が発達したが、それらは、バッファーコントロール治療マウスの腫瘍の平均体積の、それぞれ、僅かに１.９および３.６パーセントであった。逆に、ＮＯＤ ＳＣＩＤ治療群では、再び５４日目（最終治療後４日）、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療マウスにおいて、腫瘍が増殖したが、それは、バッファーコントロール治療マウスの腫瘍平均体積の６７パーセントであった。Ｈ４６０ー２２ー１治療マウスは、ＳＣＩＤマウスの場合と同様の作用を示した。腫瘍は、バッファーコントロール治療マウスの腫瘍の平均体積の１.４パーセントであった。したがって、インビボにおける７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ活性は、一部は、ＡＤＣＣ活性によるもののようであるが、一方、Ｈ４６０ー２２ー１の抗腫瘍活性は、ＡＤＣＣとは独立するもののようである。
Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａエピトープが薬剤標的として有効であることを確かめるために、正常なヒトの組織における、それらの標的抗原の発現を定量した。Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に部分的に開示されるように、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める、正常なヒト組織に対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６の結合を定量した。ＩＨＣ染色によれば、腎臓、心臓、および肺を含む、基本的器官を含む組織の大部分において、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの抗原は発現されなかった。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、唾液腺、肝臓、すい臓、胃、前立腺、および十二指腸を染色したが、扁桃腺を強力に染めた。組織染色の結果から、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、各種細胞タイプに対して限られた結合を示したが、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に対し結合することが明らかにされた。Ｈ４６０ー２２ー１および１Ａ２４５.６では、より広範囲の組織が陽性に染色された。大部分の場合において、染色は、上皮、または浸潤性マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に限局していた。しかしながら、心筋および肝細胞の両方に陽性染色が見られた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６は、膜および細胞原形質の両染色パターンを示した。
Ｓ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるように、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、市販の、抗ＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６）と比較した。正常なヒト組織の染色の結果から、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、この場合も、各種細胞タイプに対しては限られた結合しか示さなかったが、浸潤性マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に対して結合することが明らかにされた。ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６抗体は、互いに比較すると、同様の染色パターンを示した。しかしながら、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６の染色パターンは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａに観察されるものと全く異なっていた。具体的には、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６は共に、より広範囲の正常組織に結合し、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａも陽性である組織においてより高い染色強度を示し、浸潤性マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞だけでなく、組織の大部分において上皮にも結合した。
Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の局在、および、母集団、例えば、乳癌患者におけるその出現頻度の決定は、これらの抗体の治療的使用を評価し、効果的臨床治験を設計するに当たって重要である。癌患者の乳房腫瘍におけるＨ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現を調べるために、９８名の、個別の、乳癌患者から得た腫瘍組織サンプルを、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングし（５０名の患者から得た結果は、以前に、Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に記載された、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める）、かつ、５０名の患者から得た腫瘍組織サンプルを、１Ａ２４５.６抗原について（Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６に開示、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める）、および、Ｈ４６０ー２２ー１抗原について（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４に開示、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める）スクリーニングした。
これらの実験の結果から、組織サンプルの３７パーセントは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原について陽性に染色することが示された。患者サンプルにおける７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限局するので、癌細胞特異的であるようであった。さらに、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、乳癌患者から得た、２０サンプルの正常組織のどれも染色しなかった。一方、Ｈ４６０ー２２ー１および１Ａ２４５.６は、乳癌組織サンプルの、それぞれ、９２パーセントおよび９８パーセントを染色した。Ｈ４６０ー２２ー１および１Ａ２４５.６はさらに、乳癌患者から得た、１０サンプルの正常組織の内９サンプルを染めた。しかしながら、この染色は、全体に、乳癌組織サンプルにおいて観察されたものよりもはるかに弱く、一般に、浸潤性線維芽細胞に限局していた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６抗原の乳房腫瘍発現は、悪性細胞の細胞膜および細胞原形質に限局するようであり、これは、ＣＤ６３が、治療において魅力的標的となることを示唆する。
Ｓ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるように、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、ＲＦＡＣ４およびＨ５Ｃ６、および抗ＨＥＲ２抗体（ＣーＥＲＢＢー２）と比較した。この実験の結果は、以前の結果と同様であり、腫瘍組織サンプルの３６パーセントが、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａについて陽性に染色し、一方、乳房腫瘍組織の９４および８５パーセントが、それぞれ、Ｈ５Ｃ６およびＲＦＡＣ４エピトープについて陽性であった。患者サンプルにおける７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限局するので、癌細胞に対し特異的であるようであった。さらに、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、乳癌患者から得た、１０サンプルの正常組織のどれも染色しなかった。一方、Ｈ５Ｃ６およびＲＦＡＣ４はともに、８サンプルの正常な乳房組織の内７サンプルを染めた。ＣーＥＲＢＢー２と比べると、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、完全に異なる染色プロフィールを示した。すなわち、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａについて陽性であった乳房腫瘍組織サンプルの半分は、ＨＥＲ２発現について陰性であり、これは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａが、既存の抗体療法によって支援されない患者集団を標的とすることを示す。さらに、７ＢＤＩ−３３ー１１ＡおよびＨＥＲ２に対し陽性である、乳房腫瘍組織切片の染色強度の間には差があった。ＣーＥＲＢＢー２抗体はまた、正常乳房組織切片の一つを陽性に染色した。
Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるように、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６発現をさらに、乳房腫瘍の発達、治療、および予後に重要な役割を果たす、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモンに対する受容体の、乳房腫瘍発現に基づいて評価した。１Ａ２４５.６抗原の発現と、エストロゲンまたはプロゲステロンいずれかの受容体の発現との間に相関は明らかではなかった。エストゲン受容体の欠如と、プロゲステロン受容体の存在および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの発現との間、および、エステロゲンおよびプロゲステロン両受容体の存在、およびＨ４６０ー２２ー１抗原発現の間には僅かな相関があった。腫瘍の段階、または癌進行の程度に基づいて腫瘍を分析すると、結果から、７ＢＤＩ−３３ー１１ＡおよびＨ４６０ー２２ー１の両方において、腫瘍の段階が高くなればなるほど、陽性発現がより大きくなる傾向が示唆された。同様の結果が、ＲＦＡＣ４についても得られた。Ｈ５Ｃ６もまた、エステロゲンまたはプロゲステロンとごく僅かな相関を示したが、腫瘍段階との相関は明らかではなかった。ただし、サンプルサイズの小さいために結論は限定された。
前立腺癌患者における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の局在、およびその出現頻度は、前立腺癌患者に対する７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ免疫治療の利益を評価し、効果的臨床治験を設計するに当たって重要である。癌患者の前立腺腫瘍における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現を調べるために、５１名の、個別の、前立腺癌患者から得た腫瘍組織サンプルを、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングした（Ｓ.Ｎ. １０/８１０、７５１の開示による、なおこの特許の内容を引用により本明細書に含める）。実験の結果から、組織サンプルの８８パーセントは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原について陽性に染色することが示された。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、正常組織切片も高い強度で染色したが、正常サンプルに比べ、より高度の染色が、腫瘍組織サンプルの膜において見られた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原について染色されない、一つの胎児性横紋筋肉腫サンプルがあった。試験した小サンプルサイズでは、腫瘍段階と、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の存在との間には直接の相関は無いようであった。
メラノーマ癌患者における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の局在、およびその出現頻度は、メラノーマ患者に対する７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ免疫治療の利益を評価し、効果的臨床治験を設計するに当たって重要である。癌患者のメラノーマ腫瘍における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現を調べるために、３９名の、個別の、メラノーマ患者から得た腫瘍組織サンプルを、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の発現についてスクリーニングした（Ｓ.Ｎ. １１/３２１、６２４の開示による）。実験の結果から、組織サンプルの９０パーセントは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原について陽性に染色することが示された。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、正常組織切片も高い強度で染色したが、この小さなサンプルでは、腫瘍段階と、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の存在との間には直接の相関は無いようであった。
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６の、可能な治療的利益をさらに拡大するために、ヒトの、各種癌組織における、その抗原の頻度および局在を求めた（Ｓ.Ｎ. １０/６０３、００６およびＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示による、なおこれらの特許それぞれの内容を引用により本明細書に含める）。陽性の、ヒト癌のタイプとしては、皮膚（１/２）、肺（３/４）、肝臓（２/３）、胃（４/５）、甲状腺（２/２）、子宮（４/４）、および腎臓（３/３）が挙げられる。ある癌は、その抗原を発現しなかった。そのようなものとして、卵巣（０/３）、睾丸（０/１）、脳（０/２）、およびリンパ節（０/２）が挙げられる。Ｈ４６０ー２２ー１および１Ａ２４５.６では、正常なヒトの組織系列同様、様々なヒト組織タイプ由来の、複数の癌が陽性に染色した。比較的大きな染色が、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓、胃、および膀胱の悪性細胞に見られた。ヒトの、乳房、前立腺、およびメラノーマ癌組織同様、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６の局在は、これらの腫瘍細胞の膜の上、および細胞原形質の内部に見られた。したがって、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体は、インビトロにおいて癌細胞系統に対して結合することの外に、その抗原が、ヒトにおいて、複数種類の癌において発現されるという証拠がある。
７ＢＤＩ−３３ー１１ＡについてはＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるように、１Ａ２４５.６およびＨ４６０ー２２ー１についてはＳ.Ｎ. １０/８１０、７５１に開示されるように、なおこれらの特許の内容を引用により本明細書に含める、生化学的データはさらに、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによって認識される抗原はＣＤ６３であることを示す。これは、ＣＤ６３に対して反応性を持つモノクロナール抗体ＲＦＡＣ４が、免疫沈降によって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、または１Ａ２４５.６に結合するタンパクを特定することを示す実験によって支持される。さらに、細菌発現実験から、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、ＣＤ６３の細胞外ループ２に結合することが明らかになった。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６エピトープはさらに、立体配座依存性であることによって区別された。これらのＩＨＣおよび生化学結果は、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、ＣＤ６３抗原に結合することを実証する。以上、証拠の主力は、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、ＣＤ６３上に存在する特異な立体配座エピトープ（単数または複数）との連結を通じて抗癌作用を仲介することを示す。本発明の目的のために、前記エピトープは、「ＣＤ６３抗原成分」と定義され、ーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、Ｈ４６０ー２２ー１によってコードされるモノクロナール抗体、その抗原結合性断片、またはその抗体接合体と結合する能力によって特徴づけられる。
以上まとめると、このデータは、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原が、癌関連抗原であり、ヒトにおいて発現され、病理的に関連する癌標的であることを示す。さらに、このデータは、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の、ヒトの癌組織に対する結合を示し、かつ、これらが、診断的、治療予測的、または予後判定的となる可能性のあるアッセイのために好適に使用が可能であることを示す。さらに、この抗原の細胞膜に対する局在は、多くの非悪性細胞における抗原発現の相対的低頻度による細胞の癌状態を示すことになり、この所見は、この抗原、その遺伝子または誘導体、そのタンパクまたはその変異種が、診断的、治療予測的、または予後判定的となる可能性のあるアッセイのために使用されることを可能とする。
本発明は、米国特許第６、１８０、３５７号に記載されるプロセスによって開発され、その作用では、動物モデルにおける非確立および確立腫瘍増殖による細胞傷害性アッセイにおいて、癌疾患に苦しむ動物モデルにおける生存の延長において特定される、Ｈ４６０ー２２ー１、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、および１Ａ２４５.６の開発と使用を記載する。さらに、本発明は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのヒト化型の開発を開示する。この内の一つは、予防的動物モデルにおいて同様の細胞傷害性を示す。本発明はさらに、マウスモノクロナール抗体ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、および７ＢＤＩー６０の使用を開示する。
本発明は、標的分子ＣＤ６３の上に存在する一エピトープまたは複数のエピトープに対して特異的に結合し、さらに、悪性腫瘍細胞に対しては、ただし正常細胞に対してはそのようなことはなく、インビトロの細胞傷害性を有し、かつ、ヒト癌のインビボモデルにおいて腫瘍増殖の抑制および生存の延長を直接仲介する試薬を記載する点において、癌治療の分野における進歩を表す。これは、以前に記載された、他の、いずれの抗ＣＤ６３抗体に対しても進歩である。なぜなら、同様の特性を持っていると示されたものはこれまでまったく無いのであるから。これは、ある種の腫瘍の増殖および発達と関連する事象にＣＤ６３が直接に関与するということをはっきりと示した点でも、この分野において進歩をもたらす。本発明はさらに、ヒト患者においても同様の抗癌性を示す可能性を有するという点でも癌治療における進歩を表す。さらに別の進歩として、これらの抗体を、抗癌抗体ライブラリーに含めることは、異なる抗癌抗体同士の適切な組み合わせを決定することによって、腫瘍を標的し、腫瘍の増殖および発達を抑制するのにもっとも効果的な抗体を発見することによって、異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的する可能性を強化することがある。
まとめると、本発明は、投与されると、哺乳動物において７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原を発現する癌の腫瘍負荷を下げ、さらに、治療される動物の生存の延長をもたらすことが可能な治療剤に対する標的としての、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原の使用を教示する。
したがって、ーハイブリドーマ細胞、および、それに対して前記ーハイブリドーマ細胞系統がコードされる、対応単離モノクロナール抗体、およびその抗原結合断片を分離するために、ある特定の個人、または一つ以上の特定の癌細胞系統から得られた癌様細胞に対して惹起される癌様疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）の生産法であって、ＣＤＭＡＢが、癌細胞に対しては細胞毒性を持つが、同時に、非癌様細胞に対しては比較的毒性を持たない方法を利用することが本発明の目的である。
癌様疾患修飾抗体、リガンド、および、その抗原結合性断片を教示することが、本発明のもう一つの目的である。
その細胞傷害性が、抗体依存性細胞毒性によって仲介される、癌様疾患修飾抗体を生産することが、本発明のさらに別の目的である。
その細胞傷害性が、補体依存性細胞毒性によって仲介される、癌様疾患修飾抗体を生産することが、本発明のさらに別の目的である。
その細胞傷害性が、細胞の化学的結合の加水分解を触媒する、その能力の関数である癌様疾患修飾抗体を生産することが、本発明のさらに別の目的である。
癌の診断、予後判定、および監視のための結合アッセイにおいて有用な、癌様疾患修飾抗体およびリガンドを生産することが、本発明のさらに別の目的である。
本発明の、他の目的および利点は、本発明のいくつかの実施態様が、具体的説明と例示のために記載される、下記の説明から明らかとなろう。
（図面の簡単な説明）
図１は、細胞系統ＯＣＣー１、ＯＶＡＲー３、およびＣＣＤー２７ＳＫに対するーハイブリドーマ上清のパーセント細胞傷害性および結合レベルを比較する。
図２は、細胞傷害性アッセイにおける、ＡＲ５１Ａ９９４.１・対・陽性および陰性コントロールの比較である。
図３は、癌および正常細胞系統に対する、ＡＲ５１Ａ９９４.１および抗ＥＧＦＲコントロールの結合を示す。データは、平均蛍光強度を、異性形コントロールに対する倍数増加として示して表に掲げる。
図４は、いくつかの癌および非癌細胞系統に向けられる、ＡＲ５１Ａ９９４.１および抗ＥＧＦＲ抗体の、代表的ＦＡＣＳヒストグラムを含む。
図５は、細胞傷害性アッセイにおける、７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０・対・陽性および陰性コントロールの比較である。
図６は、癌および正常細胞系統に対する、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６８、および抗ＨＥＲ２コントロールの結合を示す。データは、平均蛍光強度を、異性形コントロールに対する倍数増加として示して表に掲げる。
図７は、いくつかの癌および非癌細胞系統に向けられる、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、および抗ーＨＥＲ２抗体の、代表的ＦＡＣＳヒストグラムを含む。
図８は、予防的ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に及ぼす７ＢＤＩー５８の作用を示す。垂直破線は、抗体投与期間を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す。
図９は、予防的ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌モデルの体重に及ぼす７ＢＤＩー５８の作用を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す。
図１０は、ＭＤＡーＭＢー２３１細胞の全体膜分画（レーン１）、ＰＣー３の全体細胞分解物（レーン２）、およびＣＣＤー２７ＳＫ細胞系統の全体細胞分解物（レーン３）から得られたサンプルのウェスタンブロット。ブロットは、前述のように、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、ＡＲ５５Ａ９９４.１、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、およびＨ４６０ー２２ー１をプローブとして行った。
図１１は、ＭＤＡーＭＢー２３１細胞系統の全体膜分画から得られた７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによる免疫沈降によって調製される免疫複合体である。ブロットの個別レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、ＡＲ５１Ａ９９４.１（レーン２）、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（レーン３）、および異性形コントロール抗体（レーン４および５）をプローブとして得た。
図１２は、ＡＳＰＣー１ヒトすい臓癌細胞系統の全体膜分画から得られた１Ａ２４５.６による免疫沈降によって調製される免疫複合体である。ブロットの複製レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、１Ａ２４５.６（レーン２）、抗ＣＤ６３クローンＨ５Ｃ６（レーン３）、および異性形コントロール抗体（レーン４）をプローブとして得た。
図１３は、ヒトの組み換え融合構築体ＧＳＴーＥＣ２（ＣＤ６３）のウェスタンブロット。ブロットの個別レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、７ＢＤＩー６０（レーン２）、ＡＲ５１Ａ９９４.１（レーン３）、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（レーン４）、Ｈ４６０ー２２ー１（レーン５）、１Ａ２４５.６（レーン６）、および、陰性コントロールＨ４６０ー１６ー２（抗ＣＤ４４、レーン７）、および、異性形コントロール抗体（レーン８および９）をプローブとして得た。
図１４は、ヒトすい臓の、腫瘍および正常組織マイクロアレイに対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ結合のまとめである。
図１５は、すい臓組織において得られた結合パターンを示す代表的顕微鏡写真であって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（Ａ）、または異性形コントロール抗体（Ｂ）によってすい臓腫瘍組織において得られたもの、および、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（Ｃ）、または異性形コントロール抗体（Ｄ）によって非新生物性すい臓組織において得られたものである。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、腫瘍細胞に対しては強い、陽性の染色度を示すが、正常組織に対しては弱ー中等の染色度を示した。倍率は２００Ｘである。
図１６は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによって惹起された、ヒトの乳癌細胞に対するマウスエフェクター細胞のインビトロ細胞傷害活性。５１ＣＲ標識ＭＤＡーＭＢー２３１細胞を、各種濃度の７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたは異性形コントロールの存在下に、非接着性（Ａ）および接着性（Ｂ）マウスの脾臓エフェクター細胞とインキュベートした。
図１７は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたはバッファーコントロールによる各種投与スケジュール実行後に見られる、ＭＤＡーＭＢー２３１異種移植片由来マクロファージ数の要約である。
図１８は、７ＢＤＩ−３３ー１１ＡのＮ末端アミノ酸の配列である。
図１９は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の軽鎖可変域のＣＤＮＡ配列（配列番号１）である。演繹されたアミノ酸配列（配列番号２）を、ヌクレオチド配列の下に示す。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟軽鎖は、アサパラギン残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。
図２０は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の重鎖可変域のＣＤＮＡ配列（配列番号３）である。演繹されたアミノ酸配列（配列番号４）を、ヌクレオチド配列の下に示す。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟重鎖は、グルタミン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。
図２１は、ＶＬ領域アミノ酸配列同士の整列である。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＭＵ３３ー１１Ａ）および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＨＵ３３ー１１Ａ）のＶＬ領域、およびヒトのアクセプター１ＬＶＥおよびＪＫ２のアミノ酸配列が、単一文字コードとして示される。ヒトのＶＬセグメントのＣＤＲ配列は図から除かれている。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ中の１本下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触すると予想されており、したがって、対応するマウスの残基によって置換された。上から読むと、開示の配列は、配列番号２のアミノ酸残基２１ー５０；配列番号６のアミノ酸残基２２ー５２；配列番号６２；配列番号２のアミノ酸残基５１ー８０；配列番号６のアミノ酸残基５３ー８２；配列番号６のアミノ酸残基６３ー７７；配列番号２のアミノ酸残基８１ー１１０；配列番号６のアミノ酸残基８３ー１１２；配列番号６のアミノ酸残基８５ー１１２；配列番号２のアミノ酸残基１１１ー１３２；配列番号６のアミノ酸残基１１３ー１３４；配列番号６のアミノ酸残基１１３ー１１６；および配列番号６のアミノ酸残基１２５ー１３４である。
図２２は、ＶＨ領域アミノ酸配列同士の整列である。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＭＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＨＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）のＶＨ領域、およびヒトのアクセプターＡＡＲ３２４０９およびＪＨ６のアミノ酸配列が、単一文字コードとして示される。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ配列においてＣＤＲ配列（ＫＡＢＡＴ命名法）に下線を施す。ヒトのＶＨセグメントのＣＤＲ配列は図から除かれている。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩ） ＶＨ中の１本下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触すると予想されており、したがって、対応するマウスの残基によって置換された。二重下線を施したアミノ酸は、可能な免疫原性を下げるために、ヒトの共通残基で置換した。上から読むと、開示の配列は、配列番号４のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号８のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号１２のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号６３；配列番号４のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号８のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号１２のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号６４；配列番号４のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号８のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号１２のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号６５；配列番号４のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号８のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号１２のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号６６、；および配列番号８および１２のアミノ酸残基１２８ー１３８である。
図２３は、ミニエキソンにおける（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの軽鎖可変域のヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）である。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟軽鎖は、アスパラギン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。配列は、一意のＭＬＵＬ（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸＢＡＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位によって側接される。
図２４は、ミニエキソンにおける（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）の重鎖可変域のヌクレオチド配列（配列番号７）および演繹アミノ酸配列（配列番号８）である。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟重鎖は、グルタミン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。配列は、一意のＭＬＵＬ（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸＢＡＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位によって側接される。
図２５は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ遺伝子の構築のために使用されるプライマー。開示の配列は、上から、配列番号２１ー３９である。
図２６は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ遺伝子の構築のために使用されるプライマー。開示の配列は、上から、配列番号４０ー６１である。
図２７は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ またはＶＨミニエキソンの合成スキームである。一連の２０個（ＶＬの場合）または２２個（ＶＨの場合；図示される）が、アニールされ、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼによって伸長される。得られた集合２本鎖Ｖ遺伝子は、５’ および３’ 側接オリゴヌクレオチドによって増幅され、ＶＬ およびＶＨ遺伝子断片を生成する。この断片を、ゲル精製し、ＭＬＵＬおよびＸＢＡＩによって消化し、次に、それぞれ、ＰＶＫ、およびＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴまたはＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.Ｔベクターにサブクローンした。
図２８は、ＦＡＣＳ競合実験の要約である。
図２９は、部位指向性突然変異発生法によって、単一アミノ酸置換ＶＨ突然変異を生成するためのスキーム。別々の２ラウンドのＰＣＲを実行した。第１ラウンドのＰＣＲでは、二つの部分的ＶＨ遺伝子断片が増幅された。これらの二つの断片は、第２ラウンドのＰＣＲでさらに増幅されて、単一アミノ酸置換を有する、完全長ＶＨ遺伝子断片を生成する。所望の突然変異を有するＶＨ遺伝子を、側接ＭＬＵＬおよびＸＢＡＩ部位を用いて、ＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴおよびＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.Ｔにサブクローンした。
図３０は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）抗体発現のためのプラスミド構築体である。ＶＬ およびＶＨ遺伝子は、ＭＬＵＬＩおよびＸＢＡＩ部位によって側接されるミニエキソンとして構築された。Ｖ領域は、対応する発現ベクターの中に組み込まれた。
図３１は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａカッパ軽鎖のＣＤＮＡ（配列番号９）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１０）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。
図３２は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）γ１重鎖ＣＤＮＡ（配列番号１１）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１１）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。
図３３は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）γ２Ｍ３重鎖ＣＤＮＡ（配列番号１３）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１４）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。
図３４は、本文中に記述されるように、非還元および還元条件下における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＭＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）のＳＤＳーＰＡＧＥ分析。
図３５は、サイズ排除クロマトグラフィーによる（Ａ） （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（Ｂ） （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）のＨＰＬＣ分析。
図３６は、ＦＡＣＳ競合実験の要約である。
図３７は、ヒトのＣＤ６３に対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の相対的結合親和度を比較するためのＦＡＣＳ競合である。本文中に記載するように、ヒトのＣＤ６３＋細胞に対する、ＦＩＴＣ標識７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの結合を、様々な量の競合抗体７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の存在下に分析した。
図３８は、ヒトメラノーマのマウスモデルにおける、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３による治療の、腫瘍増殖に及ぼす作用を示す。腫瘍体積は、群の平均±ＳＥＭとして表す。垂直破線は、投与の初日および最終日を示す。
図３９は、実験期間中の体重に対する、モノクロナール抗体治療の作用を示す。体重は群の平均±ＳＥＭとして表す。
図４０は、抗ＣＤ６３ ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５.６、およびヒト化抗体（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１ および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３の結合親和性である。精製組み換えＧＳＴ融合構築体タンパクＧＳＴーＥＣ２（ＣＤ６３）に対する抗体結合の解離定数を、表面プラズモン共鳴によって評価した。
一般に、下記の単語または語句は、概要、説明、および特許請求項において使用される場合、表示の定義を有する。
「抗体」という用語は、もっとも広い意味で使用され、特異的に、例えば、単一モノクロナール抗体（作用性、拮抗性、および中和性抗体、脱免疫化、マウス、キメラ、またはヒト化抗体を含む）、複数エピトープ特異性を有する抗体組成物、単一鎖抗体、免疫接合体、および抗体断片（下記参照）を含む。
本明細書で用いる「モノクロナール抗体」という用語は、事実上均一な抗体の集団、すなわち、該集団を含む個々の抗体が、少量は存在してもよい、可能な天然の突然変異を除いては同一である集団から得られた抗体を指す。モノクロナール抗体は、特異性が高く、単一抗原部位を指向する。さらに、異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含む、ポリクロナール抗体調製品とは違って、各モノクロナール抗体は、抗原上の単一決定基を指向する。その特異性の外に、モノクロナール抗体は、他の抗体によって汚染されることなく合成が可能である点で有利である。「モノクロナール」という形容詞は、事実上均一な抗体集団から得られたものであるという抗体の特徴を示すものであって、何らかの特定の方法による抗体の生産を要求するものと考えてはならない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクロナール抗体は、最初にＫＯＨＬＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 ＮＡＴＵＲＥ、 ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたーハイブリドーマ（マウス、またはヒト）法によって製造されてもよいし、または、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４、８１６、５６７号参照）によって製造されてもよい。「モノクロナール抗体」はまた、例えば、ＣＬＡＣＫＳＯＮ ＥＴ ＡＬ.、 ＮＡＴＵＲＥ、 ３５２：６２４ー６２８（１９９１） およびＭＡＲＫＳ ＥＴ ＡＬ.、 Ｊ. ＭＯＬ. ＢＩＯＬ.、 ２２２：５８１ー５９７（１９９１）に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合部位、またはその可変域を含む、生の、未加工抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、完全長未満の抗体、ＦＡＢ、ＦＡＢ′、Ｆ（ＡＢ′）２、およびＦＶ断片；ダイアボディ；直線状抗体；抗体断片（単複）から形成される、単一鎖抗体分子；単一鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク、組み換えタンパク、および多重特異性抗体が挙げられる。
「未加工」抗体とは、抗原結合可変域の外、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、生得配列定常ドメイン（例えば、ヒトの生得配列定常ドメイン）、または、そのアミノ酸配列変異体であってもよい。未加工抗体は、一つ以上のエフェクター機能を有することが好ましい。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、未加工抗体を、様々の「クラス」に割り当てることが可能である。未加工抗体には、五つの大きなクラス：ＩＧＡ、ＩＧＤ、ＩＧＥ、ＩＧＧ、およびＩＧＭがあり、それらの内のいくつかはさらに、「サブクラス」（異性形）、例えば、ＩＧＧ１、ＩＧＧ２、ＩＧＧ３、ＩＧＧ４、ＩＧＡ、およびＩＧＡ２に分割される。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。これらサブユニットの構造、および、様々のクラスの免疫グロブリンの三次元形態は周知である。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦＣ領域（未加工配列ＦＣ領域、またはアミノ酸配列変動ＦＣ領域）の関与する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１Ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；ＦＣ受容体結合；抗体依存性細胞仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体のもの、ＢＣＲ）の下方調整が挙げられる。
「抗体依存性細胞仲介細胞傷害性」および”ＡＤＣＣ”とは、ＦＣ受容体（ＦＣＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞における結合抗体を認識し、次いで、該標的細胞の分解を誘発する、細胞仲介反応を指す。ＡＤＣＣを仲介する主要細胞、ＮＫ細胞は、ＦＣγＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球は、ＦＣγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、およびＦＣγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦＣＲ発現が、ＲＡＶＥＴＣＨ ＡＮＤ ＫＩＮＥＴ、 ＡＮＮＵ. ＲＥＶ. ＩＭＭＵＮＯＬ. ９：４５７ー９２ （１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば、米国特許第５、５００、３６２号または５、８２１、３３７号に記載されるもののような、インビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、抹消血単核球（ＰＢＭＣ）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。それとは別に、またはそれに加えてさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデルにおいて、例えば、ＣＬＹＮＥＳ ＥＴ ＡＬ. ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） ９５：６５２ー６５６（１９９８）に開示されるように評価してもよい。
「エフェクター細胞」とは、一つ以上のＦＣＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。この細胞は、少なくともＦＣγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが好ましい。ＡＤＣＣを仲介する、ヒトの白血球の例としては、抹消血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が挙げられるが、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然供給源から、例えば、本明細書に記載するように血液またはＰＢＭＣから単離されてもよい。
抗体のＦＣ領域に結合する受容体を記述するのに、「ＦＣ受容体」または”ＦＣＲ”という用語を用いる。好ましいＦＣＲは、ヒトの、生得配列ＦＣＲである。さらに、好ましいＦＣＲは、ＩＧＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦＣγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、およびＦＣγＲＩＩＩサブクラスの受容体、および、対立遺伝子変異種、およびこれらの受容体の別様のスプライス形を含む受容体が挙げられる。ＦＣγＲＩＩ受容体は、ＦＣγＲＩＩＡ（「活性受容体」）、およびＦＣγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）を含む。これらは、同様のアミノ酸配列を有するが、主に、その細胞原形質ドメインにおいて異なる。活性受容体ＦＣγＲＩＩＡは、その細胞原形質膜ドメインに免疫受容体チロシン系活性モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦＣγＲＩＩＢは、その細胞原形質膜ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Ｍ. ＩＮ ＤＡＥＲＯＮ、 ＡＮＮＵ. ＲＥＶ. ＩＭＭＵＮＯＬ. １５：２０３ー２３４ （１９９７）の総覧を参照されたい）。ＦＣＲは、ＲＡＶＥＴＣＨ ＡＮＤ ＫＩＮＥＴ、 ＡＮＮＵ. ＲＥＶ. ＩＭＭＵＮＯＬ. ９：４５７ー９２（１９９１）； ＣＡＰＥＬ ＥＴ ＡＬ.、 ＩＭＭＵＮＯＭＥＴＨＯＤＳ ４：２５ー３４ （１９９４）；および ＤＥ ＨＡＡＳ ＥＴ ＡＬ.、 Ｊ. ＬＡＢ. ＣＬＩＮ. ＭＥＤ. １２６：３３０ー４１ （１９９５）において総覧される。将来特定されるべきものも含めた、他のＦＣＲも、本明細書の”ＦＣＲ”という用語の中に包含される。この用語はさらに、母親のＩＧＧの胎児への転送に与る（ＧＵＹＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 Ｊ. ＩＭＭＵＮＯＬ. １１７：５８７（１９７６）、およびＫＩＭ ＥＴ ＡＬ.、 ＥＵＲ. Ｊ. ＩＭＭＵＮＯＬ. ２４：２４２９（１９９４））新生児受容体ＦＣＲＮを含む。
「補体依存性細胞傷害性」または”ＣＤＣ”とは、ある分子が、補体の存在下に標的を分解する能力を指す。補体活性経路は、補体系の第１成分（Ｃ１Ｑ）の、認識抗原と複合体を形成する分子（例えば、抗体）に対する結合によって起動される。補体活性化を評価するには、例えば、ＧＡＺＺＡＮＯーＳＡＮＴＯＲＯ ＥＴ ＡＬ.、 Ｊ. ＩＭＭＵＮＯＬ. ＭＥＴＨＯＤＳ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるものと同様のＣＤＣアッセイを行ってもよい。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、配列において抗体間で大きく異なるという事実を指し、各特定の抗体について、その特定の抗原に対する結合および特異性に関して使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインの全体に亘って均一には分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメインの超可変域と呼ばれる三つのセグメントに集中する。可変ドメインの、比較的高度に保存される部分は、枠組み構造領域（ＦＲ）と呼ばれる。生得の、重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主にβシート形態を取る四つのＦＲを含み、これらは、該シート構造を接続し、ある場合には、その一部を形成するループを形成する三つの超過変域によって接続される。各鎖における超可変域は、ＦＲによってごく接近して共に保持され、他方鎖の超過変域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に与る（ＫＡＢＡＴ ＥＴ ＡＬ.、 「免疫学的に興味深いタンパクの配列（“ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、”）」、５ＴＨ ＥＤ. ＰＵＢＬＩＣ ＨＥＡＬＴＨ ＳＥＲＶＩＣＥ、 ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ、 ＢＥＳＴＨＥＤＡ、 ＭＤ. （１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原に対する結合に直接には関与しないが、様々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の参加などを示す。
本明細書で用いる場合、「超可変域」という用語は、抗原結合に与る、抗体のアミノ酸残基を指す。超過変域は、一般に、「相補性決定域」または”ＣＤＲ”のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４ー３４（Ｌ１）、５０ー５６（Ｌ２）、および８９ー９７（Ｌ３）、および、重鎖可変ドメインにおける残基３１ー３５（Ｈ１）、５０ー６５（Ｈ２）、および９５ー１０２（Ｈ３）；ＫＡＢＡＴ ＥＴ ＡＬ.、 「免疫学的に興味深いタンパクの配列（“ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、”）」、５ＴＨ ＥＤ. ＰＵＢＬＩＣ ＨＥＡＬＴＨ ＳＥＲＶＩＣＥ、 ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＨＥＡＬＴＨ、 ＢＥＳＴＨＥＤＡ、 ＭＤ. （１９９１）、および/または、「超可変ループ」の残基（軽鎖可変域ドメインにおける残基２６３２（Ｌ１）、５０ー５２（Ｌ２）、および９１ー９６（Ｌ３）、および、重鎖可変ドメインにおける残基２６ー３２（Ｈ１）、５３ー５５（Ｈ２）、および９６ー１０１（Ｈ３）；ＣＨＯＴＨＩＡ ＡＮＤ ＬＥＳＫ Ｊ. ＭＯＬ. ＢＩＯＬ. １９６：９０１ー９１７（１９８７））を含む。「枠組み構造領域」または”ＦＲ”の残基は、本明細書に定義する超可変域残基以外の、可変ドメイン残基である。抗体をパパイン消化することによって、それぞれが、単一の抗原結合部位を有する、”ＦＡＢ”断片と呼ばれる、二つの、同一抗原結合断片、および、残余の”ＦＣ”断片が生産される。後者の命名は、それが容易に結晶化（ＣＲＹＳＴＡＬＬＩＺＥ）する能力を持つことを反映する。ペプシン処理によって、二つの抗原結合部位を有し、依然として抗原に交差連結することが可能なＦ（ＡＢ’ ）２断片が生成される。
“ＦＶ”は、一つの、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む、最小の抗体断片である。この領域は、緊密に、非共有的に連結された、１本の重鎖可変ドメインおよび１本の軽鎖可変ドメインのダイマーから成る。この形態においてこそ、各可変ドメインの三つの超可変域は相互作用を持ち、該ＶＨーＶＬダイマーの表面上に抗原結合部位を定める。全体として、この六つの超可変域が、抗体に対し抗原結合の特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（すなわち、抗原に対して特異的な超可変域を三つしか含まない、ＦＶの半分）ですらも、全体結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を持つ。ＦＡＢ断片はさらに、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。ＦＡＢ’ は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、抗体ヒンジ領域の一つ以上のシステインを含む数個の残基を付加する点で、ＦＡＢ断片とは異なる。ＦＡＢ′ーＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単複）が、少なくとも一つの遊離チオール基を担持する、ＦＡＢ′に対する本明細書の表示である。Ｆ（ＡＢ′）２抗体断片は、もともと、その間にヒンジシステインを有する、ＦＡＢ′断片ペアとして生産された。抗体断片同士の、他の化学的結合も既知である。
任意の脊椎動物種から得られた抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、二つのはっきりと異なるタイプの内の一つに割り当てることが可能である。
「単一鎖ＦＶ」または”ＳＣＦＶ”抗体断片は、単一のポリペプチド鎖として現れる、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。このＦＶポリペプチドはさらに、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、このＳＣＦＶが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能とするように、ポリペプチドリンカーを含むことが好ましい。ＳＣＦＶに関する総覧については、ＰＬＵＥＣＫＴＨＵＮ ＩＮ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、 ＶＯＬ. １１３、 ＲＯＳＥＮＢＵＲＧ ＡＮＤ ＭＯＯＲＥ ＥＤＳ.、 ＳＰＲＩＮＧＥＲーＶＥＲＬＡＧ、 ＮＥＷ ＹＯＲＫ、 ＰＰ. ２６９ー３１５（１９９４）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を有する、小型の抗体断片であって、同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）含む断片を指す。同じ鎖の二つのドメイン間にペア形成を許さないほど短いリンカーを用いることで、これらのドメインは、もう一つの鎖の相補ドメインとペア形成し、二つの抗原結合部位を形成することを強制される。ダイアボディは、さらに徹底的に、例えば、欧州特許第４０４、０９７号；国際特許第９３/１１１６１号、およびＨＯＬＬＩＮＧＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 ＰＲＯＣ. ＮＡＴＬ. ＡＣＡＤ. ＳＣＩ. ＵＳＡ、 ９０：６４４４ー６４４８（１９９３）に記載される。
「単離」抗体とは、その天然環境において特定され、その天然環境の成分から分離および/または回収された抗体である。その天然環境の汚染成分とは、該抗体の診断的または治療的使用に干渉することが予想される物質であって、酵素、ホルモン、およびその他の、タンパク様、または非タンパク様溶質を含んでもよい。単離抗体は、組み換え細胞中に滞在する抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも一成分は存在しないのであるから。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも一つの精製工程によって調製される。
対象抗原、例えば、ＣＤ６３抗原性成分に「結合する」抗体とは、十分な親和性をもって該抗原に結合することが可能であり、そのため、該抗原を発現する細胞に対する標的行動において治療剤または診断剤として有用である抗体である。抗体が、ＣＤ６３抗原成分に結合するものである場合、該抗体は、通常、他の受容体とは対照的に、ＣＤ６３抗原性成分に対し優先的に結合し、かつ、非特異的ＦＣ接触などの偶発的結合、または、他の抗原に共通の、翻訳後修飾による結合を含まないが、他のタンパクと著明な交差反応をしないものであってもよい。対象抗原に結合する抗体を検出するための方法は、従来技術で周知であり、例えば、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロットなどのアッセイ、ただしこれらに限定されないが、を含むことが可能である。
本明細書で用いる「細胞」、「細胞系統」、および「細胞培養体」という表現は、相互交換的に使用されるが、これらの表示は全て子孫を含む。全ての子孫は、ＤＮＡ内容において、故意の、または不慮の突然変異によって正確に同じであるとは必ずしも限らないことが理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニング選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する、突然変異子孫は含まれる。区別的表示が意図される場合は、文脈から明白である。
「治療」とは、その目的が、標的とする病的状態または障害を阻止すること、または遅延（低減）することである、治療処置および予防的または防止的策の両方を指す。治療を要する人々としては、すでにその障害を抱える人々の外、その障害を持ちやすい人々、またはその障害を予防しなければならない人々が挙げられる。したがって、本発明において治療しなければならない哺乳動物は、障害を持つと診断されていてもよいし、または、その障害にかかり易いか、または感受性を持っていてもよい。
「癌」または「癌様」という用語は、通常、無秩序な細胞増殖または死によって特徴づけられる、哺乳類における生理状態を指すか、または記述する。癌の例としては、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および、白血病およびリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。このような癌のさらに具体的な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃小腸癌を含む胃癌、すい臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、および頭部および頸部癌が挙げられる。
「化学療法剤」とは、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロフォスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））など；スルフォン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなど；エチレンイミンおよびメチラメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンフォスフォラミド、トリエチレンチオフォスファラミド、およびトリメチロロメラミンを含む；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロールナファジン、クロロフォスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６ージアゾー５ーオキソーＬーノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；抗代謝剤、例えば、メトトレキセート、および５ーフルオロウラシル（５ーＦＵ）；葉酸類縁体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリン類縁体、例えば、フルダラビン、６ーメルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類縁体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６ーアザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５ーＦＵなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎ホルモン、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸など；アセグラトン；アルドフォスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２ーエチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２、２’ 、２’ ’ ートリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“ＡＲＡーＣ”）；シクロフォスファミド；チオプテア；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＢＲＩＳＴＯＬーＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＯＮＣＯＬＯＧＹ、 ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ、 Ｎ.Ｊ.）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ＡＶＥＮＴＩＳ、 ＲＨＯＮＥーＰＯＵＬＥＮＣ ＲＯＲＥＲ、 ＡＮＴＯＮＹ、 ＦＲＡＮＣＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６ーチオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えば、シスプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰー１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴー１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；および、上記の内の、任意の化学療法剤の製薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義の中にさらに含まれるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調整または抑制するように活動する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ抑制性４（５）ーイミダゾール、４ーヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）；および、抗アントロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、レウプロリド、およびゴセレリン；および、上記の内の、任意の抗ホルモン剤の製薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。
治療のための「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物、例えば、ヒト、マウス、ＳＣＩＤまたはヌードマウス、またはマウスの純系、家庭内飼養および農場動物、および動物園、スポーツ、または、ペット動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む動物を指す。本発明では、哺乳動物はヒトであることが好ましい。
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法（例えば、１９８８年５月４日公刊の欧州特許第２６６、０３２号に記載されるような固相技術を用いた、フォスフォトリエステル、亜リン酸塩、またはフォスフォールアミダイト化学、または、ＦＲＯＥＨＬＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 ＮＵＣＬ. ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ.、 １４：５３９９ー５４０７、 １９８６によって記載されるデオキシヌクレオシドＨーフォスフォネート中間体を介して）によって化学的に合成される、短鎖長の、１本鎖または２本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。これらは次にポリアクリルアミドゲルにて精製される。
別様に指示しない限り、本明細書で用いる「ＣＤ６３抗原成分」という用語は、別にメラノーマＩ抗原とも呼ばれる、テトラスパニンファミリーのＩＩＩ型膜タンパク、眼球メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連膜糖タンパク３、グラニュロフィシン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１を指す。
「キメラ抗体」とは、免疫グロブリンであって、重鎖および/または軽鎖の一部が、ある特定の動物種から得られた抗体、または、ある特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、の対応配列と同一または相同であり、一方、該鎖（単複）の残余部分は、別の動物種から得られた抗体、または、別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、およびそのような抗体の断片、の対応配列と同一または相同であり、かつ、それらの鎖が所望の生物学的活性を示す免疫グロブリンである（米国特許第４、８１６、５６７号、およびＭＯＲＲＩＳＯＮ ＥＴ ＡＬ.、 ＰＲＯＣ. ＮＡＴＬ. ＡＣＡＤ. ＳＣＩ. ＵＳＡ、 ８１：６８５１ー６８５５ （１９８４））。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、抗体の、ＦＶ、ＦＡＢ、ＦＡＢ′、Ｆ（ＡＢ）２、またはその他の抗原結合配列）である。ヒト化抗体は、その大部分は、ヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）であるが、該レシピエント抗体の相補性決定域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および容量を有する、非ヒト動物種、例えば、マウス、ラット、またはウサギ（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリンである。ある例では、ヒトの免疫グロブリンのＦＶ枠組み構造領域（ＦＲ）残基は、対応する、非ヒトＦＲ残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入ＣＤＲまたはＦＲ配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つの、通常は二つの可変ドメインの事実上全てを含むが、該可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て、または事実上全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ、ＦＲ残基の全て、または事実上全てが、ヒト免疫グロブリンの共通配列のものに対応する。ヒト化抗体はさらに、免疫グロブリンの定常域（ＦＣ）、通常、ヒトの免疫グロブリンの定常域の少なくとも一部を含む。
「脱免疫化」抗体とは、ある任意の動物種に対して非免疫原性、または比較的低い免疫原性を有する、免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体に対し構造的変化を加えることによって実現される。当業者に既知の、いずれの脱免疫化技術であっても採用が可能である。抗体を脱免疫化するための、一つの好適な技術が、例えば、２０００年６月１５日公刊の国際特許第００/３４３１７号に記載される。
「相同性」とは、アミノ酸配列変異種であって、最大パーセント相同性を実現するように、配列同士を整列させ、必要ならギャップを導入した後同一となる、該アミノ酸配列変異種における残基のパーセントと特定される。整列のための方法およびコンピュータプログラムは従来技術において周知である。
本明細書を通じて、本発明において生産される、ーハイブリドーマ細胞系統および単離モノクロナール抗体は、別に、内部表示７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、Ｈ４６０ー２２ー１、またはＡＲ５１Ａ９９４.１とも呼ばれ、または、寄託表示ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、 ＩＤＡＣ １４１２０５ー０６とも呼ばれる。
本明細書で用いる「リガンド」とは、標的抗原に対し結合特異性を示し、未加工抗体分子であってもよく、少なくとも一つの抗原結合領域、またはその一部（すなわち、抗体分子の可変部分）を有する任意の分子であってもよい成分であって、例えば、ＦＶ分子、ＦＡＢ分子、ＦＡＢ′分子、Ｆ（ＡＢ）２、Ｆ（ＡＢ′）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク、または、任意の遺伝学的に加工された分子であって、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、 またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６（ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、 またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗原）のように表示されるーハイブリドーマ細胞系統によって生産される単離モノクロナール抗体によって結合される抗体に結合する抗原を特異的に認識し、結合する、遺伝学的に加工された分子を含む。
本明細書で用いる「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する、前記分子の一部を意味する。
本明細書で用いる「競合的に抑制する」とは、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０１（ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２抗体、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１）として表示される、ーハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクロナール抗体が指向する決定部位に対し、通例の相反性抗体競合アッセイ（ＢＥＲＬＡＮＧＥＲ、 Ｌ.、 ＳＹＬＶＥＳＴＲＥ Ｃ. ＡＮＤ ＤＵＦＯＵＲ Ｄ. （１９７３）、「競合およびサンドイッチ法によるアルファ胎児タンパクの酵素連結免疫アッセイ（“ＥＮＺＹＭＥ ＬＩＮＫＥＤ ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＦＯＲ ＡＬＰＨＡ ＦＥＴＯＰＲＯＴＥＩＮ ＢＹ ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＶＥ ＡＮＤ ＳＡＮＤＷＩＣＨ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ”）」、ＣＬＩＮＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ ４８、 １５）を用いて認識および結合することが可能であることを意味する。
本明細書の用いる「標的抗原」とは、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗原か、または、その部分である。
本明細書で用いる「免疫接合体」とは、細胞毒素、放射能剤、酵素、毒素、抗腫瘍剤、または治療剤に化学的または生物学的に連結される、任意の分子、またはリガンド、例えば、抗体である。抗体は、細胞毒素、放射能剤、抗腫瘍剤、または、治療剤に対し、その標的に結合可能である限り、任意の位置において連結されてよい。免疫接合体の例としては、抗体毒素化学的接合体および抗体・毒素融合タンパクが挙げられる。
本明細書で用いられる「融合タンパク」とは、抗原結合領域が、生物学的活性分子、例えば、毒素、酵素、またはタンパク剤に接続される、任意のキメラタンパクを意味する。
本明細書に記載される本発明がさらに十分に理解されるように、下記の説明が記述される。
本発明は、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗原を特異的に認識し、結合するリガンド（すなわち、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６リガンド）を提供する。
本発明のリガンドは、ーハイブリドーマＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６によって生産されるモノクロナール抗体の、その標的抗原に対する、免疫特異的結合を競合的に抑制する抗原結合領域を持っている限り、任意の形態を取ってもよい。したがって、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗体と同じ結合特異性を有するものであれば、いずれの組み換えタンパク（例えば、該抗体が、リンフォカイン、または腫瘍抑制増殖因子などの第２タンパクと組み合わされた融合タンパク）も、本発明の範囲内に入る。
本発明の一実施態様では、リガンドは、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗体である。
別の実施態様では、リガンドは、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗体の抗原結合領域を有する、ＦＶ分子（例えば、単一鎖ＦＶ分子）、ＦＡＢ分子、ＦＡＢ′分子、Ｆ（ＡＢ′）２分子、融合タンパク、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、または、任意の遺伝学的に加工された分子であってもよい抗原結合断片である。本発明のリガンドは、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６モノクロナール抗体の指向するエピトープを指向する。
本発明のリガンドは、誘導分子を生産するために、分子内のアミノ酸修飾によって修飾してもよい。化学的修飾も可能としてよい。
誘導体分子は、ポリペプチドの機能性を保持することが考えられる、すなわち、このような置換を有する分子であっても依然として、ポリペプチドが、ＩＤＡＣ １４１２０５ー０１、ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２３、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８９０、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４８８９、 ＡＴＣＣ ＰＴＡー４６２２、またはＩＤＡＣ １４１２０５ー０６抗原またはその部分に対して結合することを可能とする。
これらのアミノ酸置換としては、ただしこれらに必ずしも限定されないが、従来技術において「保存的」として知られるアミノ酸置換が挙げられる。
例えば、「保存的アミノ酸置換」と称されるある種のアミノ酸置換は、しばしばタンパクにおいて、該タンパクの立体配座または機能を変えることなく実行することが可能であるということは、タンパク化学の十分に確立された原理である。
このような変化として、他の任意の疎水性アミノ酸に対する、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の内の任意のものによる置換、およびその逆；アルパラギン（Ｎ）のグルタミン（Ｑ）による置換、およびその逆；および、トレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換、およびその逆が挙げられる。その他の置換も、特定のアミノ酸の環境、およびタンパクの三次元構造におけるその役割に応じて、保存的と見なすことも可能である。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、アラニンおよびバリン（Ｖ）と同様、しばしば相互交換が可能である。比較的疎水性の高いメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシンと、ときにバリンと相互交換することが可能である。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、そこでのアミノ酸残基の重要特性は、その電荷であり、その二つのアミノ酸残基のＰＨは重要ではない、位置においてしばしば相互交換可能である。特定の環境において「保存的」と考えることが可能な変化はさらに外にもある。
一抗体が得られれば、当業者であれば、競合的抑制性リガンド、例えば、同じエピトープを認識する競合抗体を生成することは可能である（ＢＥＬＡＮＧＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 １９７３）。一法は、該抗体によって認識される抗原を発現する免疫原による免疫化を要することが考えられる。サンプルとしては、ただしこれらに限定されないが、組織、単離タンパク（単複）、または細胞系統（単複）が挙げられる。試験抗体の結合を抑制する抗体を特定する競合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、または免疫沈降法を用いて、得られたーハイブリドーマをスクリーニングすることが考えられる。別の方法は、ファージディスプレイライブラリー、および、前記抗原を認識する抗体を選択するためのパンニングの利用が考えられる（ＲＵＢＩＮＳＴＥＩＮ ＥＴ ＡＬ.、 ２００３）。いずれにしろ、ーハイブリドーマを、標的抗原に対する元の抗体の結合を上回る能力に基づいて選択することが考えられる。したがって、このようなーハイブリドーマは、元の抗体と同じ抗原を認識し、かつ、同じエピトープをより特異的に認識する特徴を所有すると考えられる。
ーハイブリドーマ生産ーハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１および７ＢＤＩー５８
ーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩー５８およびＡＲ５１Ａ９９４.１は、ブダペスト協定にしたがって、２００５年１２月１４日に、それぞれ、アクセス番号１４１２０５ー０１および１４１２０５ー０６の下に、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＰＯＳＩＴＯＲＹ ＡＵＴＨＯＲＩＴＹ ＯＦ ＣＡＮＡＤＡ （ＩＤＡＣ）、 ＢＵＲＥＡＵ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、 ＨＥＡＬＴＨ ＣＡＮＡＤＡ、 １０１５ ＡＲＬＩＮＧＴＯＮ ＳＴＲＥＥＴ、 ＷＩＮＮＩＰＥＧ、 ＭＡＮＩＴＯＢＡ、 ＣＡＮＡＤＡ、 Ｒ３Ｅ ３Ｒ２に寄託された。３７ ＣＦＲ １.８０８にしたがって、寄託者は、寄託資料の一般公衆に対する利用可能性に対して課せられた制限は全て、特許承認と同時に問題なく解除されるであろうことを確信する。
抗癌抗体７ＢＤＩー５８を生産するーハイブリドーマは、Ｓ.Ｎ. １０/７１３、６４２の開示にならって生産された。抗癌抗体ＡＲ５１Ａ９９４.１を生産するーハイブリドーマを生産するために、ヒトの卵巣内膜腺癌腫瘍凍結組織（ＧＥＮＯＭＩＣＳ ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ、 ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ、 ＭＡ）の単一細胞縣濁液を、ＰＢＳ溶解として調製した。ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ、 ＶＥＮＬＯ、 ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ）アジュバントを、穏やかに混和して使用のために調製した。４から６週齢のＢＡＬＢ/Ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原アジュバントに２百万個の細胞を縣濁させた液を皮下に注入することによって免疫化した。初回の免疫化の２および５週後、調製したばかりの抗原アジュバントを用い、５０ー６０マイクロリットルに２百万個の細胞を縣濁させた液を腹腔内に注入することによってこの免疫化マウスをブーストした。最後の免疫化の３日後、脾臓を融合のために使用した。ーハイブリドーマは、単離脾臓細胞を、ＮＳＯー１骨髄腫瘍パートナーと融合することによって調製した。融合物から上清を、ーハイブリドーマのサブクローンについて試験した。
ーハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体が、ＩＧＧまたはＩＧＭ異性形であるかどうかを決めるために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。コーティングバッファー（０.１Ｍ炭酸塩/重炭酸塩バッファー、ＰＨ９.２ー９.６）に２.４マイクログラム/ＭＬの濃度で溶解したヤギ抗マウスＩＧＧ+ＩＧＭ（Ｈ+Ｌ）を、ウェル当たり１００マイクロリットルとしてＥＬＩＳＡプレートに加え一晩置いた。洗浄バッファー（ＰＢＳ+０.０５％ ＴＷＥＥＮ）にてプレートを３回洗浄した。ウェル当たり、１００マイクロリットルのブロッキングバッファー（洗浄バッファーに溶解した５％ミルク）をプレートに加え、室温で１時間放置し、次いで洗浄バッファーにて３回洗浄した。ウェル当たり、１００マイクロリットルのーハイブリドーマ上清を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩＧＧまたはＩＧＭ・西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体の１/１００、０００希釈液（５％ミルクを含むＰＢＳにて希釈）を、ウェル当たり１００マイクロリットル加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ウェル当たり１００マイクロリットルのＴＭＢ液を室温で１ー３分インキュベートした。発色反応を、ウェル当たり５０マイクロリットルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させ、プレートを、ＰＥＲＫＩＮーＥＬＭＥＲ ＨＴＳ７０００プレートリーダーによって４５０ ＮＭにおいて読み取った。図１に示すように、ＡＲ５１Ａ９９４.１ーハイブリドーマは、ＩＧＧ異性形の抗体を主に分泌した。
このーハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体のサブクラスを決めるために、異性形タイピング実験を、マウスモノクロナール抗体異性形タイピングキット（ＨＹＣＵＬＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、 ＦＲＯＮＴＳＴＲＡＡＴ、 ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ）を用いて行った。５００マイクロリットルのバッファー液を、ラット抗マウスサブクラス特異的抗体を含む試験ストリップに加えた。５００マイクロリットルのーハイブリドーマ上清を、この試験管に加え、穏やかに攪拌することによって沈めた。捕捉されたマウス免疫グロブリンは、コロイド粒子に結合させた、ラットの第２モノクロナール抗体によって直接検出した。これら二つのタンパクの結合は、異性形を分析するのに使用される視覚信号を創出する。抗癌抗体ＡＲ５１Ａ９９４.１は、ＩＧＧ１、カッパ異性形であった。
１ラウンドの限界希釈後、細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ーハイブリドーマ上清を、標的細胞に結合する抗体について試験した。二つのヒト卵巣癌細胞系統、および一つのヒトの正常皮膚細胞系統を試験した。それぞれ、ＯＣＣー１、ＯＶＣＡＲー３、およびＣＣＤー２７ＳＫであった。使用前、プレートに撒いた細胞を固定した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＰＢＳにて、プレートを室温で３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラフォルムアルデヒド１００マイクロリットルを、各ウェルに加え、室温で１０分置き、次いで捨てた。再び、ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＰＢＳにてプレートを室温で３回洗浄した。ブロッキングは、ウェル当たり、洗浄バッファー（ＰＢＳ+０.０５％ ＴＷＥＥＮ）に溶解した５％ミルク１００マイクロリットルを加え、室温で１時間置いて行った。洗浄バッファーにてプレートを３回洗浄し、ウェル当たり、７５マイクロリットルとしてーハイブリドーマ上清をプレートに加え、室温で１時間放置した。プレートを洗浄バッファーにて３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに接合させた、ヤギ抗マウスＩＧＧ抗体の１/２５、０００希釈液（５％ミルクを含むＰＢＳにて希釈）を、ウェル当たり１００マイクロリットル加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ウェル当たり１００マイクロリットルのＴＭＢ基質を室温で１ー３分インキュベートした。反応を、ウェル当たり５０マイクロリットルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて停止させ、プレートを、ＰＥＲＫＩＮーＥＬＭＥＲ ＨＴＳ７０００プレートリーダーによって４５０ ＮＭにおいて読み取った。結果は、図１の表示と同様、試験した細胞系統に対して結合しないことが以前に示されている、所有のＩＧＧ異性形コントロールに比べた場合の、背景を上回る倍数として表した。ーハイブリドーマＡＲ５１Ａ９９４.１由来の抗体は、卵巣癌細胞系統ＯＶＣＡＲー３に対しては結合を示したが、正常皮膚細胞系統ＣＣＤー２７ＳＫにたしては結合を示さなかった。
抗体結合の試験と合わせて、細胞系統：ＯＣＣー１、ＯＶＣＡＲー３、およびＣＣＤー２７ＳＫにおいて、ーハイブリドーマ上清の細胞傷害作用を試験した。ＣＡＬＣＥＩＮ ＡＭを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ （ＥＵＧＥＮＥ、 ＯＲ）から購入した。アッセイは、下記に略述する変更を除き、メーカーの指示にしたがって行った。細胞は、アッセイの前に、あらかじめ指定された適切な密度でプレートした。２日後、７５マイクロリットルの上清を、ハイブリドーマ・マイクロタイタープレートから細胞プレートに転送し、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて５日間インキュベートした。陽性コントロールとして使用されるウェルは、空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮＡＮ３）またはシクロヘキシミドを加えた。５日間の処理後、プレートを反転して空とし、ブロットして乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含む室温ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸バッファー生食液）を、多数チャンネル押し込みボトルから各ウェルに滴下し、３回叩き、反転して空とし、ブロット乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＤＰＢＳに希釈した蛍光カルセイン染料５０マイクロリットルを各ウェルに加え、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で３０分インキュベートした。プレートを、ＰＥＲＫＩＮーＥＬＭＥＲ ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーによって読み取り、データをＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＥＸＣＥＬで分析した。結果は、図１に表として掲げられる。ＡＲ５１Ａ９９４.１ーハイブリドーマの上清は、ＯＣＣー１およびＯＶＣＡＲー３細胞の、それぞれ、１４パーセントおよび１０パーセントについて特異的細胞傷害性をもたらした。ＯＣＣー１において、これは、陽性コントロールのアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにおいて得られる細胞傷害性の、それぞれ、１６および１５パーセントであった。図１の結果は、ＡＲ５１Ａ９９４.１の細胞傷害性結果は、、癌細胞タイプに対する結合レベルに比例しないことを示した。ＯＶＣＡＲー３細胞における結合レベルの方が高いにも拘わらず、ＯＶＣＡＲー３細胞に比べ、ＯＣＣー１細胞においてもたらされた細胞傷害性レベルの方が大きかった。図１に表示されるように、ＡＲ５１Ａ９９４.１は、ＣＣＤー２７ＳＫ正常細胞系統には細胞傷害性をもたらさなかった。既知の非特異的細胞傷害剤、シクロヘキシミドおよびＮＡＮ３は、一般に、予想通りの細胞傷害性をもたらした。
抗体生産：
ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、および７ＢＤＩー６０モノクロナール抗体は、ＣＬー１０００フラスコ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）においてーハイブリドーマを培養し、収集および再撒布を週に２回繰り返して生産した。抗体は、タンパクＧセファロース４高速フロー（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＢＡＩＥ Ｄ’ ＵＲＦＥ、 ＱＣ）による標準的抗体精製過程にしたがって精製した。脱免疫化、ヒト化、キメラ化、またはマウスの、モノクロナール抗体を利用することは本発明の範囲内にある。
細胞傷害性アッセイにおいて、ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体を、いくつかの陽性（抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、 ＩＧＧ１、 カッパ、５マイクログラム/ＭＬ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、 ＨＯＲＮＢＹ、 ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、ＳＩＧＭＡ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）、 ＮＡＮ３ （０.１％、 ＳＩＧＭＡ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ））、および陰性（１０７.３（抗ーＴＮＰ、 ＩＧＧ１、 カッパ、２０マイクログラム/ＭＬ、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）、および１Ｂ７.１１（抗ーＴＮＰ）、ＩＧＧ１、カッパ、２０マイクログラム/ＭＬ私的に精製したもの）、および、バッファー希釈液コントロールと比較した（図２）。すい臓癌（ＢＸＰＣー３）、卵巣癌（ＯＣＣー１およびＯＶＣＡＲー３）、および非癌（ＣＣＤー２７ＳＫ、ＨＳ８８８.ＬＵ）細胞系統を試験した（全て、ＡＴＣＣ、 ＭＡＮＡＳＳＡＳ、 ＶＡから入手した）。ＣＡＬＣＥＩＮ ＡＭはＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ （ＥＵＧＥＮＥ、 ＯＲ）から購入した。アッセイは、下記に略述する変更を除き、メーカーの指示にしたがって行った。細胞は、アッセイの前に、あらかじめ指定された適切な密度でプレートした。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体またなコントロールを培養液に希釈し、細胞プレートに転送し、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて５日間インキュベートした。次に、ウェルは、反転して空とし、ブロット乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含む室温ＤＰＢＳを、多数チャンネル押し込みボトルから各ウェルに滴下し、３回叩き、反転して空とし、ブロット乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＤＰＢＳに希釈した蛍光カルセイン染料５０マイクロリットルを各ウェルに加え、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で３０分インキュベートした。プレートを、ＰＥＲＫＩＮーＥＬＭＥＲ ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーによって読み取り、データをＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＥＸＣＥＬで分析した。結果は、図２に表として掲げられる。各抗体には、３重に行った４回の実験で観察された平均細胞傷害性に基づいて５から５０まで、アッセイ間に観察された変動に基づいて２５から１００までのスコアを与えた。これら二つのスコアの合計（細胞傷害性スコア）を図２に示す。５５以上の細胞傷害性スコアは、試験細胞系統に対して陽性であると見なした。ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体は、異性形およびバッファーの陰性コントロールに比べ、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌細胞系統およびＢＸＰＣー３すい臓癌細胞系統において特異的細胞傷害性をもたらした。これは、ＡＲ５１Ａ９９４.１クローンのーハイブリドーマ上清から得られたデータと一致する。すなわち、該クローンも、ＯＶＣＡＲー３細胞系統に対して特異的細胞傷害性を示した（実施例１を参照）。ＡＲ５１Ａ９９４.１は、ＯＣＣー１卵巣癌細胞系統では陽性の細胞傷害性スコアをもたらさなかった。重要なことは、ＡＲ５１Ａ９９４.１は、陰性コントロールと比べ、ＣＣＤー２７ＳＫまたはＨＳ８８８.ＬＵなどの非癌細胞系統に対し著明な細胞傷害性をもたらさなかったことである。化学的細胞傷害剤は、複数の細胞系統に対し予想通りの細胞傷害性を誘発した。
すい臓癌（ＢＸＰＣー３）、卵巣癌（ＯＣＣー１およびＯＶＣＡＲー３）、および非癌（ＣＣＤー２７ＳＫ、ＨＳ８８８.ＬＵ）細胞系統に対する、ＡＲ５１Ａ９９４.１の結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。ＦＡＣＳのために、先ず細胞単層をＤＰＢＳ（ＣＡ++およびＭＧ++無添加）によって洗浄して調製した。次に、細胞解離バッファー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＢＵＲＬＩＮＧＴＯＮ、 ＯＮ）を用いて、３７℃で細胞を細胞培養プレートから剥がした。遠心および収集後、細胞を、ＭＧＣＬ２、ＣＡＣＬ２、２パーセントのウシ胎児血清を含むＤＰＢＳ（染色媒体）に再縣濁し、カウントし、適切な細胞密度となるように分液し、回転沈殿させて細胞ペレットを形成し、２０ μＧ/ＭＬの試験抗体（ＡＲ５１Ａ９９４.１）の存在下に染色媒体に４℃で再縣濁するか、またはコントロール抗体（異性形コントロール、抗ＥＧＦＲ）の存在下に氷上で３０分再縣濁した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６ー接合二次抗体を添加する前に、細胞を染色媒体で一度洗浄した。次に、染色媒体に溶解したＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ５４６ー接合抗体を添加し４℃で３０分置いた。次に、細胞に最後の洗浄を行い、固定媒体（１.５％パラフォルムアルデヒドを含む染色媒体）に再縣濁した。ＦＡＣＳＡＲＲＡＹ（登録商標）システムソフトウェア（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）を用い、ＦＡＣＳＡＲＲＡＹにサンプルを走らせることによって細胞のフローサイトメトリー捕捉を評価した。細胞の前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）散乱を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器に対する電圧および振幅ゲインを調節することによって設定した。蛍光（ＡＬＥＸＡー５４６）チャンネルの検出器は、染色されない細胞が、約１ー５単位の蛍光強度中央値の均一ピークを持つように調整した。各サンプルについて、分析のために約１０、０００ゲート通過事象（染色固定細胞）が得られ、その結果を図３に示す。
図３は、異性形コントロールを上回る、平均蛍光強度の増加倍数を示す。ＡＲ５１Ａ９９４.１の代表的ヒストグラムを図４にまとめた。ＡＲ５１Ａ９９４.１は、卵巣癌細胞系統ＯＣＣー１およびＯＶＣＡＲー３（それぞれ１６および１４.８倍）、および非癌肺細胞系統ＨＳ８８８.ＬＵ（２４.６倍）に対し強力な結合を示したが、すい臓癌細胞系統ＢＸＰＣー３（８.６倍）、および非癌皮膚細胞系統ＣＣＤー２７ＳＫ（５.１倍）に対する結合はそれよりも弱かった。これらのデータは、ＡＲ５１Ａ９９４.１は、試験したいくつかの細胞系統に対しては明らかに結合するにも拘わらず、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌およびＢＸＰＣー３すい臓癌に対しては、インビトロにおいて僅かな関連細胞傷害性しか無いことを示すという点で、機能的特異性を示すことを明らかにした。
前記のインビトロ結合および細胞傷害性結果をさらに進めるために、細胞傷害性アッセイにおいて、ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体を、前述の陽性および陰性コントロールとともに、肺癌（Ａ５４９）、新たなすい臓癌（ＡＳＰＣー１およびＰＬ４５）、および卵巣癌（Ｃー１３、ＥＳー２、ＨＥＹ、ＯＶ２００８、ＯＶＣＡー４２９、およびＯＶＣＡー３）細胞系統について試験した（Ａ５４９、ＡＳＰＣー１、ＰＬ４５、およびＯＶＣＡＲー３は、ＡＴＣＣ、 ＭＡＮＡＳＳＡＳ、 ＶＡより、Ｃー１３、ＥＳー２、ＨＥＹ、ＯＶ２００８、およびＯＶＣＡー４２９は、ＯＴＴＡＷＡ ＲＥＧＩＯＮＡＬ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ （ＯＴＴＡＷＡ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）より入手した）。生存/死亡細胞傷害性アッセイは、前述のように行った。ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体は、異性形およびバッファーの陰性コントロールに比べ、ＥＳー２、ＯＶ２００８、およびＯＶＣＡー４２９卵巣癌細胞系統、およびＡ５４９肺癌細胞系統において特異的細胞傷害性をもたらした（図２）。さらに、ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体は、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌細胞系統においても特異的細胞傷害性をもたらした。これは、前述のＯＶＣＡＲー３細胞傷害性データと一致する。ＡＲ５１Ａ９９４.１は、Ｃー１３およびＨＥＹ卵巣癌細胞系統、またはＡＳＰＣー１およびＰＬ４５すい臓癌細胞系統では陽性の細胞傷害性スコアをもたらさなかった。化学的細胞傷害剤は、複数の細胞系統に対し予想通りの細胞傷害性を誘発した。
前述のものと同様のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体の、新たなすい臓癌（ＡＳＰＣー１およびＰＬ４５）、および卵巣癌（Ｃー１３、ＥＳー２、ＨＥＹ、ＯＶ２００８、ＯＶＣＡー４２９、およびＯＶＣＡー３）細胞系統に対する結合を評価した。図３は、異性形コントロールを上回る、平均蛍光強度の増加倍数を示す。ＡＲ５１Ａ９９４.１抗体の代表的ヒストグラムを図４にまとめた。ＡＲ５１Ａ９９４.１は、卵巣癌細胞系統ＥＳー２およびＯＶ２００８に対し比較的大きい結合を示し（それぞれ、２２.２および１９.８倍）たが、卵巣癌細胞系統Ｃー１３、ＨＥＹ、ＯＶＣＡー４２９、およびＯＶＣＡＲー３（それぞれ、９.８、４.４、３.９、および４.３倍）、すい臓細胞系統ＡＳＰＣー１およびＰＬ４５（それぞれ、４.１および２.４倍）、および肺癌細胞系統Ａ５４９（４.６倍）に対しては比較的弱い結合を示した。これらのデータは、ＡＲ５１Ａ９９４.１は、試験したいくつかの細胞系統に対しては明らかに結合するにも拘わらず、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌およびＢＸＰＣー３すい臓癌では、インビトロにおいて僅かな関連細胞傷害性しか無いことを示すという点で、機能的特異性を示すことを明らかにした。
細胞傷害性アッセイにおいて、７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０抗体を、いくつかの陽性（抗ＨＥＲ２（Ｃ２２５、 ＩＧＧ１、 カッパ、１０マイクログラム/ＭＬ、ＩＮＴＥＲ ＭＥＤＩＣＯ、 ＭＡＲＫＨＡＭ、 ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、ＳＩＧＭＡ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ））、および陰性（１０７.３（抗ーＴＮＰ、 ＩＧＧ１、 カッパ、２０マイクログラム/ＭＬ、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）、および、バッファー希釈液コントロールと比較した（図５）。卵巣癌（ＯＶＣＡＲー３）および乳癌（ＭＤＡーＭＢー４６８ （ＭＢー４６８））、および非癌（ＢＳＴ５４９、 ＣＣＤー２７ＳＫ、ＨＳ８８８.ＬＵ）細胞系統を試験した（全て、ＡＴＣＣ、 ＭＡＮＡＳＳＡＳ、 ＶＡから入手した）。生存/死亡細胞傷害性アッセイは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ （ＥＵＧＥＮＥ、 ＯＲ）から入手した。アッセイは、下記に略述する変更を除き、メーカーの指示にしたがって行った。細胞は、アッセイの前に、あらかじめ指定された適切な密度でプレートした。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体またなコントロールを培養液に希釈し、細胞プレートに転送し、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて５日間インキュベートした。次に、ウェルは、反転して空とし、ブロット乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含む室温ＤＰＢＳを、多数チャンネル押し込みボトルから各ウェルに滴下し、３回叩き、反転して空とし、ブロット乾燥した。ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＤＰＢＳに希釈した蛍光カルセイン染料５０マイクロリットルを各ウェルに加え、５パーセントＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で３０分インキュベートした。プレートを、ＰＥＲＫＩＮーＥＬＭＥＲ ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーによって読み取り、データをＭＩＣＲＯＳＯＦＴ ＥＸＣＥＬで分析した。結果は、図５に表として掲げられる。各抗体には、３重に行った４回の実験で観察された平均細胞傷害性に基づいて５から５０まで、アッセイ間に観察された変動に基づいて２５から１００までのスコアを与えた。これら二つのスコアの合計（細胞傷害性スコア）を図５に示す。５５以上の細胞傷害性スコアは、試験細胞系統に対して陽性であると見なした。７ＢＤＩー５８抗体は、異性形およびバッファーの陰性コントロールに比べ、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌細胞系統において特異的細胞傷害性をもたらした。７ＢＤＩー５８は、ＭＢー４６８乳癌細胞系統において陽性の細胞傷害性スコアをもたらさなかった。重要なことは、７ＢＤＩー５８は、陰性コントロールと比べ、ＢＳＴ５４９、ＣＣＤー２７ＳＫ、またはＨＳ８８８.ＬＵなどの非癌細胞系統に対し著明な細胞傷害性をもたらさなかったことである。これは、この抗体が、癌細胞に対して特異的な細胞傷害性を有することを示唆する。７ＢＤＩー６０抗体は、異性形およびバッファー陰性コントロールと比べ、ＭＢー４６８乳癌細胞系統において特異的細胞傷害性をもたらした。７ＢＤＩー６０は、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌細胞系統において陽性の細胞傷害性スコアをもたらさなかった。重要なことは、７ＢＤＩー６０が、陰性コントロールと比べ、ＢＳＴ５４９、ＣＣＤー２７ＳＫ、またはＨＳ８８８.ＬＵなどの非癌細胞系統に対し著明な細胞傷害性をもたらさなかったことである。これは、この抗体が、癌細胞に対して特異的な細胞傷害性を有することを示唆する。化学的細胞傷害剤は、複数の細胞系統に対し予想通りの細胞傷害性を誘発した。
乳癌（ＭＢー４６８）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲー３）、および非癌（ＢＳＴ５４９、ＣＣＤー２７ＳＫ、ＨＳ８８８.ＬＵ）細胞系統に対する、７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０の結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。ＦＡＣＳのために、先ず細胞単層をＤＰＢＳ（ＣＡ++およびＭＧ++無添加）によって洗浄して調製した。次に、細胞解離バッファー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＢＵＲＬＩＮＧＴＯＮ、 ＯＮ）を用いて、３７℃で細胞を細胞培養プレートから剥がした。遠心および収集後、細胞を、ＭＧＣＬ２、ＣＡＣＬ２、および２５％ウシ胎児血清を含むダルベッコのリン酸バッファー生食液（洗浄媒体）に再縣濁し、カウントし、適切な細胞密度となるように分液し、回転沈殿させて細胞ペレットを形成し、２０ マイクログラム/ＭＬの試験抗体（７ＢＤＩー５８または７ＢＤＩー６０）またはコントロール抗体（異性形コントロール、抗ＥＧＦＲ）を含む染色媒体（ＭＧＣＬ２およびＣＡＣＬ２を含むＤＰＢＳ）に再縣濁し、氷上に３０分再置いた。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６ー接合二次抗体を添加する前に、細胞を洗浄媒体で一度洗浄した。次に、染色媒体に溶解したＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ４８８ー接合抗体を添加し２０分置いた。次に、細胞に最後の洗浄を行い、１マイクログラム/ＭＬのヨウ化プロピジウムを含む染色媒体に再縣濁した。ＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェア（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）を用い、ＦＡＣＳＣＡＮ上にサンプルを走らせることによって細胞のフローサイトメトリー捕捉を評価した。細胞の前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）散乱を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器に対する電圧および振幅ゲインを調節することによって設定した。三つの蛍光チャンネル（ＦＬ１、 ＦＬ２、 およびＦＬ３）の検出器の設定は、精製異性形コントロール抗体で染色した細胞、次いで、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８ー接合二次抗体を、細胞が、約１ー５単位の蛍光強度中央値の均一ピークを持つように走らせることによって行った。生存細胞は、ＦＳＣに対してはゲート開放、ヨウ化プロピジウム排除によって獲得した。各サンプルについて、分析のために約１０、０００生細胞が得られ、その結果を図６に示す。
図６は、異性形コントロールを上回る、平均蛍光強度の増加倍数を示す。７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０抗体の代表的ヒストグラムを図７にまとめた。７ＢＤＩー５８は、卵巣癌細胞系統ＯＶＣＡＲー３（１３.８倍）、非癌肺細胞系統ＨＳ８８８.ＬＵ（１８.３倍）、非癌乳房細胞系統ＢＳＴ５４９（１０.８倍）、および非癌皮膚細胞系統ＣＣＤー２７ＳＫ（２２.５）に対し比較的大きい結合を示したが、乳癌細胞系統ＭＢ４６８（３.８倍）に対する結合は比較的弱かった。これらのデータは、７ＢＤＩー５８は、試験したいくつかの細胞系統に対しては明らかに結合するにも拘わらず、ＯＶＣＡＲー３卵巣癌では僅かな関連細胞傷害性しか無いという点で、機能的特異性を示すことを明らかにした。７ＢＤＩー６０は、卵巣癌細胞系統ＯＶＣＡＲー３（５.７倍）、乳癌細胞系統ＭＢー４６８（５.１倍）、非癌肺細胞系統ＨＳ８８８.ＬＵ（９.１倍）、非癌乳房細胞系統ＢＳＴ５４９（３.７倍）、および非癌皮膚細胞系統ＣＣＤー２７ＳＫ（８.１倍）に対し結合を示した。これらのデータは、７ＢＤＩー６０は、試験したいくつかの細胞系統に対しては明らかに結合するにも拘わらず、ＭＢー４６８乳癌では僅かな関連細胞傷害性しか無いという点で、機能的特異性を示すことを明らかにした。
ＭＤＡーＭＢー２３１細胞によるインビボ腫瘍実験
図８および９を参照すると、４から６週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの後頸部皮下に、１００マイクロリットルの生理的食塩水に縣濁した５百万個のヒト乳癌細胞（ＭＤＡーＭＢー２３１）を注入して移植した。これらのマウスを、５匹から成る二つの治療群にランダムに分けた。移植後１日目に、２０ ＭＧ/ＫＧの７ＢＤＩー５８試験抗体またはバッファーコントロールを、２.７ ＭＭ ＫＣＬ、 １ ＭＭ ＫＨ２ＰＯ４、 １３７ ＭＭ ＮＡＣＬ、および２０ ＭＭ ＮＡ２ＰＯ４を含む希釈液による保存濃度希釈後３００マイクロリットルとして、各群に腹腔内投与した。次に、同様にして、この抗体およびコントロールサンプルを、実験期間の間、週に１度合計８回投与した。腫瘍増殖を、約週に１度キャリパーで測定した。実験期間の間、週に１度動物の体重を測定した。実験の終了時、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインにしたがって安楽死させた。
７ＢＤＩー５８は、ヒト乳癌の、インビボ予防モデルにおいてＭＤＡーＭＢー２３１に見られる腫瘍増殖を著明に抑えた。移植後５５日目、最終治療投与の５日後、７ＢＤＩー５８治療群における腫瘍の平均体積は、バッファーコントロール治療群の腫瘍体積よりも９１.２パーセント低かった（図８）。実験終了時の腫瘍体積は、コントロールのものよりも有意に異なっていた（Ｐ=０.０１０５、Ｔー検定）。
実験を通じて毒性の臨床的兆候は無かった。週間隔で測定された体重は、健康状態および節約繁栄失敗の代用物とされた。図９において見て取れるように、実験期間中、コントロール群、または７ＢＤＩー５８治療群の体重には有意差は無かった。さらに、実験の終了時にも、この２群の間に体重の有意差は無かった。
結論として、７ＢＤＩー５８はよく耐容され、このヒトに乳癌異種移植モデルにおいて腫瘍負荷を抑えた。
モノクロナール抗体７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、ＡＲ５５Ａ９９４.１、および抗ＣＤ６３抗体の間の交差反応性の定量
モノクロナール抗体７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、およびＡＲ５５Ａ９９４.１をプローブとして、全体膜分画および全体細胞分解物をウェスタンブロットした結果は、ＡＲＩＵＳの抗ＣＤ６３モノクロナール抗体７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、およびＨ４６０ー２２ー１によって得られた結果と強い近似性を示した（図１０）。前記抗体が、ＣＤ６３と交差反応するかどうかを決めるために、培養細胞の全体膜分画から７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたは１Ａ２４５.６によって得られた免疫沈降複合体のウェスタンブロットのプローブとして、それらの抗体を用いた。
簡単に言うと、ＭＤＡーＭＢー２３１の全体膜分画（１ ＭＧ/ＭＬの最終タンパク濃度）３００マイクログラムを、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ接合タンパクＧセファロースビーズと４℃で２時間インキュベートした。洗浄後、ビーズを、ＩＸ非還元性ＳＤＳーＰＡＧＥサンプルバッファーにて沸騰し、このサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動によって分析した。ＰＶＤＦ膜に電気移送後、標準的ウェスタンブロット法にしたがって、抗体７ＢＤＩー５８、ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、および、ＩＧＧ１およびＩＧＧ２Ａ異性形コントロールをプローブとして分析した。一次抗体は全て、５マイクログラム/ＭＬの濃度で用いた。得られたブロット画像（図１１）は、７ＢＤＩー５８およびＡＲ５１Ａ９９４.１は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の場合と同じ抗原と交差反応すること、したがって、これらはＣＤ６３に特異的に結合することを示す。
抗体７ＢＤＩー６０が、ＣＤ６３と交差反応をするかどうかを決めるために、ＡＳＰＣー１細胞系統から単離された全体膜分画から、ヒトのＣＤ６３および抗体１Ａ２４５.５の免疫複合体を調製した。非還元条件下、１０％ ＳＤＳーポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によってこの免疫複合体を分析し、該タンパクをＰＶＤＦ膜に電気移送後、ブロットを、抗体７ＢＤＩー６０、１Ａ２４５.６、抗ＣＤ６３クローンＨ５Ｃ６、およびＩＧＧ１異性形コントロールをプローブとして分析した。一次抗体は全て、５マイクログラム/ＭＬの濃度で用いた。図１２は、異性形コントロールを例外として、全ての抗体が、同じ抗原ＣＤ６３と交差反応することを示す。
ヒトのＣＤ６３に対する、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、およびＡＲ５１Ａ９９４.１の交差反応をさらに確かめるために、ヒトＣＤ６３の最大細胞外ループの、大腸菌発現組み換えＧＳＴー融合構築体のウェスタンブロットにおけるプローブとしてこれらの抗体を用いた。簡単に言うと、精製組み換えＧＳＴー融合タンパク５マイクログラムを、１０％予備的ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動によって分析した。移送後、標準的ウェスタンブロット法にしたがって、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、およびＡＲ５１Ａ９９４.１、抗ＣＤ６３抗体、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、およびＨ４６０ー２２ー１、および、ＩＧＧ１およびＩＧＧ２Ａ異性形コントロール抗体をプローブとして分析した。一次抗体は全て、５マイクログラム/ＭＬの濃度で用いた。この実験の結果（図１３）は、全ての抗体が、異性形コントロールを除き、ヒトＣＤ６３の最大細胞外ループの、組み換えＧＳＴー融合構築体と特異的に交差反応することを明らかにし、したがって、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、およびＡＲ５１Ａ９９４.１は、ヒトＣＤ６３に特異的に結合することを示す。
ヒトすい臓腫瘍組織の染色
ヒトのすい臓腫瘍組織に対する７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの結合をさらに評価する（Ｓ.Ｎ.１０/６０３、００６に開示されるすい臓線癌の初回染色）ために、ＩＨＣ実験を行った。追加実験の条件を決めるために以前にＩＨＣ最適化実験を行った。
組織切片を、オーブンにおいて５８℃で１時間乾燥させることによって脱パラフィンし、ＣＯＰＬＩＮジャーにおいて、５回それぞれ４分間、キシレンに浸してワックス除去した。一連の濃度等級エタノール洗浄（１００％ー７５％）による処理後、切片を再び水で水和した。このスライドを、１０ ＭＭクエン酸バッファーにＰＨ６（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）において浸し、高、中、および低出力設定において、それぞれ５分間マイクロウェーブに暴露し、最後に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを、３％過酸化水素水に６分浸し、ＰＢＳで、３回それぞれ５分洗浄し、乾燥し、室温で５分間ＵＮＩＶＥＲＳＡＬブロック液（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）とインキュベートした。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、マウスの抗アクチンモノクロナール抗体（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）、または異性形コントロール抗体（ＡＳＰＥＲＧＩＬＬＵＳ ＮＩＧＥＲのグルコースオキシダーゼ、すなわち、哺乳類組織には存在せず、誘発可能でもない酵素を指向する抗体；ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）を、その作業濃度となるまで、抗体希釈バッファー（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）において希釈し（各抗体について５マイクログラム/ＭＬ、ただし、抗アクチンは、２マイクログラム/ＭＬとなるように希釈）、室温で１時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで３回それぞれ５分間洗浄した。ＨＲＰ接合二次抗体を支給されたまま（ＤＡＫＯ ＥＮＶＩＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）で室温で３０分用いて、一次抗体の免疫反応性を検出/可視化した。この工程後、スライドを、ＰＢＳで３回それぞれ５分洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためにＤＡＢ（３、３′ージアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、ＤＡＫＯ、 ＴＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）クロモゲン基質液を室温で１０分加えることによって発色反応を発達させた。水道水でスライドを洗浄することによって、クロモゲン反応を停止させた。ＭＥＹＥＲのヘマトキシリン（ＳＩＧＭＡ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）によってカウンターステインした後、スライドを、等級別エタノール（７５ー１００％）で脱水し、キシレンで透徹した。登載媒体（ＤＡＫＯ ＰＡＲＡＭＯＵＮＴ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）を用いてスライドをカバースリップで被った。スライドを、ＡＸＩＯＶＥＲＴ２００ （ＺＥＩＳＳ ＣＡＮＡＤＡ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮ）を用いて鏡検し、ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＥＣＬＩＰＳＥ ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＯＦＴＷＡＲＥ （ＭＩＳＳＩＳＳＡＵＧＡ、 ＯＮ）を用いてディジタル画像を獲得し、保存した。結果は、組織病理学者が読み取り、評点し、解釈した。
ヒトのすい臓の、正常および腫瘍組織アレイ（ＰＥＮＴＡＧＯＮ、 ＳＥＯＵＬ、 ＫＯＲＥＡ）を用い、３２個の、ヒトすい臓腫瘍組織、および４個の、ヒト正常すい臓組織に対する抗体の結合試験を行った。図１４は、一連のヒトの正常および腫瘍すい臓組織の、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ染色の結果のまとめを示す。各腫瘍サンプルは、組織の不均一性をカバーするために２スポットで表す。２スポットの平均スコアを、腫瘍切片の最終スコアと見なした。４個の、非新生物組織それぞれについてはただ１個のスポットしか利用しなかった。
図１４に示すように、マイクロアレイにおいて試験された、すい臓癌に対する７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの合計結合は、２７/３２（８４％）であった。抗体は、３/３２において強度（+++）の染色を、７/３２において中等度（++）の染色を、９/３２において低度（+）の染色を示し、８/３２においては不確実（±）であった。結合は腫瘍細胞に限局していた。細胞では、細胞原形質および膜に局在し、顆粒状の染色パターンを呈した。染色細胞のパーセンテージは、腫瘍細胞に対し不均一な結合を示し、その範囲は<１０％から>５０％であった。組織マイクロアレイに並べられたすい臓腫瘍の組織学的タイプにしたがって、２６/３０（８７％）に腺管腺癌に対する結合があり、１/２（５０％）に内分泌腺癌に対する結合があった。非新生物性すい臓組織について４/４（１００％）の結合があり、結合は、腺房上皮およびランゲルハンスの島に対するものであった（図１５）。
すい臓腫瘍の組織学的等級によれば、Ｇ１、Ｇ１ーＧ２、Ｇ２、Ｇ２ーＧ３、Ｇ３、Ｇ４に等級分けされた切片において、抗体は、それぞれ、１/１（１００％）、２/３（６７％）、９/１２（７５％）、２/２（１００％）、６/６（１００％）、および１/１（１００％）に対し結合した。等級不明の切片において５/５（１００％）に対する結合があった。すい臓腺癌の腫瘍ＴＮＭ段階に関連していうと、段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの切片において、抗体は、それぞれ、１/１（１００％）、１４/１７（８２％）、１/１（１００％）、および１０/１１（９１％）に対し結合した。したがって、抗体結合と、各種癌パラメータ（組織学的腫瘍タイプ、等級、およびＴＮＭ段階）との間に関連は見られなかったと考えられる。この相関の欠如は恐らく、癌段階のいくつかを表すサンプルサイズの小さいことに起因すると考えられる。
７ＢＤＩ−３３ー１１ＡＬ抗原は、すい臓腫瘍組織において発現されるようである。したがって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、すい臓癌の治療において治療剤としても可能性を有する。
抗体７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの、インビトロにおける抗体依存性細胞仲介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性の証明
予防的ヒトの乳癌モデルにおける７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの治療的インビボ使用は、以前に、ＳＣＩＤ・対・ＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスにおいてその効力を比較することによって証拠づけられたが（Ｓ.Ｎ. ６０/６４２、０５７に開示されるように）、その証拠は、ＡＤＣＣが、該動物モデルにおけるこの抗体のインビボ活性の、可能な機構であることを示した。さらに、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌細胞系統に対し、抗体依存性、細胞性、細胞傷害性を仲介することが可能であることが、インビトロ細胞毒性アッセイによって証明された。マウスのエフェクター細胞は、ＢＡＬＢ/ＣＡＪＣＬーＮＵーマウスの脾臓から得られ、４日間マウスＩＬー２（２０ ＮＭ）で刺激された。接着性および非接着性エフェクター細胞を分離し、インビトロ細胞傷害アッセイに用いた。ＭＤＡーＭＢー２３１標的細胞を、細胞培養プレートから剥がし、１千万個の細胞を６０分４０ μＣＩ ＮＡ２ ５１ＣＲＯ４ （ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）で標識し、１０４細胞/ウェルを、９６ーウェルプレートに加えた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、またはＩＧＧ２Ａ異性形適合コントロールを、この５１ＣＲ標識標的細胞に、様々な最終濃度で加え、その直後に、マウスエフェクター細胞を、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比が２５：１となるように加えた。３７℃で４時間インキュベーションした後、分解細胞から放出された５１ＣＲを測定した。各アッセイは３重に行い、結果は、（実験的ＣＰＭ ー 自発的ＣＰＭ）Ｘ １００/（最大ＣＰＭー自発的ＣＰＭ）と定義される、特異的分解パーセントとして表した。
この実験の結果（図１６）は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、接着性および非接着性エフェクター細胞の両方において、特異的で、容量依存性のＭＤＡーＭＢー２３１標的細胞の分解を誘発することをはっきりと示す。この細胞分解は、標的細胞が異性形適合コントロールの存在下にインキュベートされた場合は、同一濃度でも観察されない。したがって、このデータは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａが、エフェクター細胞活性を招集することによってＡＤＣＣを仲介することが可能であることを示す。
ＭＤＡーＭＢー２３１異種移植片におけるマクロファージの蓄積
ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌細胞系統に対する抗体依存性細胞性細胞傷害性を仲介する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの能力を証明するさらに別の証拠が、免疫組織化学によるインビボ実験から得られた。
６から８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの生食液に縣濁した、５００万個のヒトの乳癌細胞（ＭＤＡーＭＢー２３１）細胞を後頸部の皮下に移植した。毎週、腫瘍増殖をキャリパーで測定した。群の大部分において腫瘍の平均体積が１００ ＭＭ３ （８０ー１２０ ＭＭ３の範囲）を超えた時点で、３匹のマウスを屠殺し、腫瘍を収集し、一部をフォルマリンおよびＯＣＴに保存した。残余のマウスは、群当たり３匹ずつ、治療またはコントロール群に割り当てた。割り当て後１日目に、１５ ＭＧ/ＫＧの抗体またはバッファーコントロールを、２.７ ＭＭ ＫＣＬ、 １ ＭＭ ＫＨ２ＰＯ４、 １３７ ＭＭ ＮＡＣＬ、および２０ ＭＭ ＮＡ２ＰＯ４を含む希釈液による保存濃度希釈後３００マイクロリットルとして、各群に腹腔内投与した。週３回投与される、試験抗体またはコントロールが３、６、または１０回投与された後、マウスを屠殺し、腫瘍を収集し、フォルマリンおよびＯＣＴに保存した。腫瘍サンプルは、処理のために、ＴＯＲＯＮＴＯ ＧＥＮＥＲＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬ （ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮ）のＰＡＴＨＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＡＢに移送した。
組織切片を、オーブンにおいて５８℃で１時間乾燥させることによって脱パラフィンし、ＣＯＰＬＩＮジャーにおいて、５回それぞれ４分間、キシレンに浸してワックス除去した。一連の濃度等級エタノール洗浄（１００％ー７５％）による処理後、切片を再び水で水和した。このスライドを、１０ ＭＭクエン酸バッファーにＰＨ６（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）において浸し、高、中、および低出力設定において、それぞれ５分間マイクロウェーブに暴露し、最後に冷ＰＢＳに浸した。次に、スライドを、３％過酸化水素水に６分浸し、ＰＢＳで、３回それぞれ５分洗浄し、乾燥し、室温で５分間ＵＮＩＶＥＲＳＡＬブロック液（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）、室温で１５分ＡＶＩＤＩＮ Ｄブロック液（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＢＵＲＬＩＮＧＡＭＥ、 ＣＡ）、および室温で１５分ＢＩＯＴＩＮブロック液（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＢＵＲＬＩＮＧＡＭＥ、 ＣＡ）とインキュベートした。抗ＭＡＣー３ （ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）は、その作業濃度（０.７５ マイクロリットル/ＭＬ）となるまで、抗体希釈バッファー（ＤＡＫＯ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）において希釈し、室温で１時間インキュベートした。抗体希釈バッファー単独とインキュベートしたスライドを陰性コントロールとして用いた。スライドを、ＰＢＳで３回それぞれ５分間洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、ビオチニル化抗ラット（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）によって検出/可視化した。発色反応を、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＥＬＩＴＥＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＢＵＲＬＩＮＧＡＭＥ、 ＣＡ）によって検出した。水道水でスライドを洗浄することによって、クロモゲン反応を停止させた。ＭＥＹＥＲのヘマトキシリン（ＳＩＧＭＡ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、 ＯＡＫＶＩＬＬＥ、 ＯＮ）によってカウンターステインした後、スライドを、等級別エタノール（７５ー１００％）で脱水し、キシレンで透徹した。登載媒体（ＤＡＫＯ ＰＡＲＡＭＯＵＮＴ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮＴＡＲＩＯ）を用いてスライドをカバースリップで被った。スライドを、ＡＸＩＯＶＥＲＴ２００ （ＺＥＩＳＳ ＣＡＮＡＤＡ、 ＴＯＲＯＮＴＯ、 ＯＮ）を用いて鏡検し、ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＥＣＬＩＰＳＥ ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＯＦＴＷＡＲＥ （ＭＩＳＳＩＳＳＡＵＧＡ、 ＯＮ）を用いてディジタル画像を獲得し、保存した。結果は、組織病理学者が読み取り、評点し、解釈した。スライドの走査は、１００Ｘ倍率（ＺＩＥＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ ２００Ｍ）で行った。マクロファージ（ＭＡＣー３陽性）は、５個の異なるホットスポットをランダムに選択してカウントした。カウントのために腫瘍内領域を選んだが、辺縁の濃密区域は避けた。カウントする領域を選択した後、倍率を４００Ｘに移動させ、ＱＩＭＡＧＩＮＧ ＲＥＴＩＧＡカメラおよびＮＯＲＴＨＥＲＮ ＥＣＬＩＰＳＥソフトウェア（バージョン７.０）を用いて画像を獲得した。ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＥＣＬＩＰＳＥ手動カウント機能を用いて、陽性細胞の手動カウントを行った。カウント時、壊死領域および血管スペースは避けた。
腫瘍切片の調査から、腫瘍関連マクロファージの三つの分布パターンが示された。腫瘍の辺縁と周辺結合組織の間に、帯状パターンの抹消浸潤があった。このパターンは、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ処理腫瘍の全てにおいて明白であったが、バッファー処理腫瘍ではいくつかのものにのみ認められた。さらに、腫瘍細胞の間にグループ状の凝集があり、最後に、腫瘍細胞の中に、またはそれらを囲んで、散在的な単一細胞があった。
図１７に示されるように、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ処置は、３用量全てにおいて、バッファー処置よりも高度の、マクロファージの集積をもたらした。最高集積は、６回投与サンプルにおいて見られ、統計的に有意であった（Ｐ=０.０４７）。これは、最大パーセントの腫瘍増殖抑制は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの６回投与後に見られることを示すデータと相関した。さらに、３回投与のデータに注意を払うと、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ治療腫瘍におけるマクロファージの集積も有意に高かった（Ｐ=０.０３７）。抗体希釈バッファーだけとインキュベートしたサンプルは全て陰性であった。
したがって、ＭＤＡーＭＢー２３１異種移植片において、バッファー処置異種移植片に比べ、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ処置移植片では、腫瘍関連マクロファージの有意な集積が見られた。このデータは、ＡＤＣＣが、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの作用機構であるとする以前の証拠を支持する。
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのヒト化
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのヒト化は、ほぼ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＥＳＩＧＮ ＬＡＢＳ の（ＰＤＬ、 ＦＲＥＭＯＮＴ、 ＣＡ） ＱＵＥＥＮ ＥＴ ＡＬ. （１９８９）の方法にしたがって実行された。先ず、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの重鎖および軽鎖可変域（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）のアミノ酸配列に対し高い相同性を持つ、ヒトの可変（Ｖ）域を特定した。次に、ＣＤＲ配列を、該ＣＤＲの構造を維持するのに重要な枠組み構造アミノ酸と共に、選ばれたヒトの枠組み構造配列の中に移植した。さらに、可能な免疫原性を下げるために、対応するヒトのＶ領域サブグループにおいて非典型的と認められた、ヒトの枠組み構造アミノ酸を、共通アミノ酸によって置換した。得られたヒト化可変域を、マウス骨髄腫細胞系統ＳＰ２/０において、ＩＧＧ１およびＩＧＧ２Ｍ３形として発現させた（それぞれ（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ））。
マウス抗ヒトＣＤ６３モノクロナール抗体を生産するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、１０％ ＦＢＳ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）、 １％ ＭＥＭー非必須アミノ酸（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、 ＷＡＬＫＥＲＳＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）、 ０.１％ ２ーメルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、 ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）、１％ピルビン酸ナトリウム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）、１％ Ｌーグルタミン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）を含むＤＭＥＭ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）において培養した。マウス骨髄腫細胞ＳＰ２/０ーＡＧ１４ （ＡＴＣＣ、 ＭＡＮＡＳＳＵＳ、 ＶＡ；以後ＳＰ２/０と呼ぶ）は、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて維持した。マウスモノクロナール抗体７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、ＰＲＯＴＥＩＮ Ｇ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム使用のアフィニティクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。ＦＩＴＣー接合７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、ＦＬＵＯＲＥＰＯＲＴＥＲ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮーＥＸタンパク標識キット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ、 ＥＵＧＥＮＥ、 ＯＲ）を用いて調製した。もとＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥから入手した、ヒトの前立腺癌細胞系統ＰＣー３は、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩー１６４０ （ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、 ＷＡＬＫＥＲＳＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）において維持した。細胞系統は全て、７.５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
７ＢＤＩ−３３ー１１ＡＮー末端のアミノ酸の配列決定は、ＡＲＧＯ ＢＩＯＡＮＡＬＹＴＩＣＡ、 ＩＮＣ. （ＫＥＮＩＬＷＯＲＴＨ、 ＮＪ）で行った。図１８に示す、観察されたアミノ酸配列は、マウスの軽鎖および重鎖可変域遺伝子から予測された配列と一致した。
約１０７個の７ＢＤＩ−３３ー１１Ａーハイブリドーマ細胞から、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ、 ＢＵＲＬＩＮＧＴＯＮ、 ＯＮ）を用いて全体ＲＮＡを抽出し、供給業者のプロトコールにしたがってＰＯＬＹＡ ＴＲＡＣＴ ＭＲＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ （ＰＲＯＭＥＧＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、 ＭＡＤＩＳＯＮ、 ＷＩ）を用いてポリ（Ａ）+ＲＮＡを単離した。２本鎖ＣＤＮＡを、供給業者のプロトコールにしたがってＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＣＤＮＡ増幅キット（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＬＯＮＴＥＣＨ、 ＰＡＬＯ ＡＬＴＯ、 ＣＡ）を用いて合成した。重鎖および軽鎖の可変域ＣＤＮＡは、それぞれ、マウスのガンマ鎖およびカッパ鎖Ｃ領域にアニールする３′プライマー、および、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＣＤＮＡ増幅キットに提供される５’ ユニバーサルプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＨ ＰＣＲでは、３′プライマーは、配列５’ ーＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧー３’ （配列番号１５）を有していた。ＶＬ ＰＣＲでは、３′プライマーは、配列５’ ーＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ ー３’ （配列番号１６）を有していた。配列決定のために、ＶＨ およびＶＬ ＣＤＮＡを、ＰＣＲ４ＢＬＵＮＴーＴＯＰＯ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）においてサブクローンした。ＤＮＡ配列決定は、メーカーの指示にしたがって、蛍光性ジデオキシ鎖ターミネータ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、 ＦＯＳＴＥＲ ＣＩＴＹ、 ＣＡ）によるＰＣＲサイクル配列決定反応によって行った。この配列決定反応は、ＭＯＤＥＬ ３１００遺伝子分析器（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、 ＦＯＳＴＥＲ ＣＩＴＹ、 ＣＡ）において分析した。典型的なマウスの軽鎖および重鎖可変域に対して相同な特異的配列を特定した。このＶＬ およびＶＨ は、それぞれ、サブグループＩおよびＩＩＡに属することが認められた。この軽鎖および重鎖可変域をコードするＣＤＮＡ配列を図１９および２０に示す。ＣＤＮＡ配列分析から演繹された、Ｎー末端の２０個のアミノ酸配列は、軽鎖および重鎖両方のアミノ酸配列決定によって定められる対応配列と一致した。
ヒト化抗体Ｖ領域の設計は、ＱＵＥＥＮ ＥＴ ＡＬ. （１９８９）によって開示されるように行った。７ＢＤＩ−３３ー１１ＡＣＤＲのためのアクセプターとして使用される、ヒトのＶ領域枠組み構造は、配列相同性に基づいて選んだ。コンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ （ＬＥＶＩＴＴ、 １９８３）を用いて、可変域の分子モデルを構築した。ＣＤＲと接触を持つと予測される、ヒト化Ｖ領域のアミノ酸を、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの対応残基によって置換した。同じＶ領域サブグループにおいて非典型的であることが判明した、ヒト化Ｖ領域におけるアミノ酸は、可能な免疫原性を排除するために、共通アミノ酸に変えた。ヒトＶおよびＪ領域配列に対する相同性検索に基づいて、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの重鎖可変域の枠組み構造を得るために、ヒトのＶ領域ＡＡＲ３２４０９ （ＨＵＡＮＧ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）およびＪセグメントＪＨ６ （ＲＡＶＥＴＣＨ ＥＴ ＡＬ.、 １９８１）を選んだ。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの軽鎖可変域については、ヒトのＶ領域１ＬＶＥ （ＭＩＵＲＡ ＥＴ ＡＬ. ２００３）およびＪセグメントＪＫ２ （ＨＩＥＴＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 １９８２）を用いた。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨと、ヒトのアクセプターＡＡＲ３２４０９/ＪＨ６との間の同一性は７７％であり、一方、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬと、ヒトのアクセプター１Ｌ ＶＥ/ＪＫ２との間の同一性は、８８％であった。
コンピュータモデルが、ＣＤＲとの著明な接触を示唆した枠組み構造位置においては、Ｖ領域からのアミノ酸を、もとのヒトの枠組み構造アミノ酸に置換した。この置換は、重鎖の残基３０、４８、６７、６８、７０、７２、７４、９７、および９８において行った。軽鎖については、置換は残基２２において行った。対応するヒトＶ領域サブグループのそれぞれの位置においてめったに見られない枠組み構造残基は、それらの位置における、ヒトの共通アミノ酸によって置換した。この置換は、重鎖の残基３８、４０、および８４で行った。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、設計された（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと、ＶＬ およびＶＨ の、アクセプターヒトＶ領域アミノ酸配列との整列を、それぞれ、図２１および２２に示す。
重鎖および軽鎖可変域遺伝子を構築し、長さが約４０塩基対の、２０（軽鎖用）、または２２（重鎖用）の重複合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した（ＳＴＥＭＭＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 １９９５）。このオリゴヌクレオチドを、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、 ＬＡ ＪＯＬＬＡ、 ＣＡ）によってアニールし、伸長させたところ、完全長の２本鎖Ｖ遺伝子が集合された。この集合重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子断片を、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼ使用のＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ＭＬＵＩおよびＸＢＡＩにて消化し、ゲル精製し、かつ、それぞれ、ＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴまたはＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.ＴＴ （ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）、およびＰＶＫ （ＣＯ ＥＴ ＡＬ.、 １９９２）にサブクローンした。プラスミドＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴは、ＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.ＴＴ （ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）に近似するが、γ２定常域の代わりに、γ１定常域をコードするゲノム断片を含む。単一アミノ酸置換を、単一ステップ遺伝子集合ＰＣＲ法によって導入した。すなわち、２２個の重複オリゴヌクレオチド（ＳＴＥＭＭＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 １９９５）をＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼと共に用いて、一組の（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ変異種（Ｖ２４Ａ、 Ｒ３８ＫおよびＶ２４Ａ、 Ｒ３８Ｋ）を生成した。部位指向性突然変異発生を、ＨＩＧＨ ＦＩＤＥＬＩＴＹ ＥＸＰＡＮＤポリメラーゼ（ＲＯＣＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＩＴＩＣＳ、 ＩＮＤＩＡＮＡＰＯＬＩＳ、 ＩＮ）使用の重複伸長ＰＣＲによって実行し、さらにもう一組の（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ変異種（ＶＩＩＬ、 Ｉ２０Ｍ、 およびＱ１１１Ａ）を生成した。ヒト化ＶＬ またはＶＨ をコードする遺伝子は、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、および、その後の哺乳類発現ベクターへのクローニング用の適切な制限酵素部位を含むミニエキソンとして設計した（図２３および２４）。ＶＬ およびＶＨ ミニエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれ、対応するヒト生殖系列ＪＫおよびＪＨから得られた。ＶＬ およびＶＨ ミニエキソンのシグナルペプチド配列は、マウス抗Ｅ/Ｐセレクチンモノクロナール抗体ＥＰＣ７ ＶＬ およびＶＨ 領域から得られた（ＨＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９８）。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ およびＶＨ 遺伝子は、それぞれ、２０および２２個の重複合成オリゴヌクレオチド（図２５および２６）を、図２７に示すようにＰＣＲ増幅で伸長することによって構築した。ＶＬ用のオリゴヌクレオチド１ー２０、およびＶＨ 用の１ー２２を混ぜ、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯ ＤＮＡポリメラーゼによって伸長した。得られたＶ遺伝子２本鎖ＤＮＡ集合体は、側接ＭＬＵＩおよびＸＢＡＩ部位を組み込むように、プライマー１および２０（ＶＬの場合）、または１および２０（ＶＨの場合）使用のＰＣＲによって増幅した。得られたＶＬ遺伝子断片は、哺乳類発現ベクターＰＶＫ（ＣＯ ＥＴ ＡＬ.、 １９９２）にクローンし、ＰＶＫー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを生成した。ＶＨ断片は、ＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴおよび ＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.ＴＴ（ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）にクローンし、それぞれ、ＰＶＧＩー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび ＰＶＧ２Ｍ３ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを生成した。
ＰＶＧＩー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたは ＰＶＧ２Ｍ３ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、およびＰＶＫー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを、２％低ＩＧ ＦＢＳ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）を含むＲＰＭＩー１６４０に維持した２９３ーＨ細胞に、供給業者の推薦にしたがってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ法を用いて共時トランスフェクトすることによって一過性トランスフェクションを行った。あらかじめ７０マイクロリットルのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００試薬と複合体を形成させておいた、それぞれ１５マイクログラムの軽鎖および重鎖プラスミドによって、約７Ｘ１０６個の細胞がトランスフェクトされた。この細胞を、５ー７日間ＣＯ２インキュベータにおいてインキュベートした。
一過性に発現された（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１および （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ２Ｍ３抗体の精製は、タンパクＡセファロース・カラムクロマトグラフィーによって行った。ヒトのＣＤ６３に対する、これら二つの抗体のアフィニティーは、ＦＡＣＳ競合アッセイにおいて分析した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１および （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ２Ｍ３抗体は、ＦＩＴＣー接合ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと、濃度依存的に競合した。コンピュータソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ （ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＩＮＣ.、 ＳＡＮ ＤＩＥＧＯ、 ＣＡ）を用いて得た、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１および （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ２Ｍ３抗体のＩＣ５０値は、それぞれ、７.０２マイクログラム/ＭＬ、２５.３マイクログラム/ＭＬ、および６２.３マイクログラム/ＭＬであった（図２８）。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１の親和性は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのものよりも３.６倍低かった。
ヒト化の際に失われた７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの抗原結合親和性を回復するために、図２９に示すように、２２個の重複合成オリゴヌクレオチドの伸長とＰＣＲ増幅（Ｖ２４ＡおよびＲ３８Ｋ）、および部位指向性突然変異発生（ＶＩＩＬ、１２０Ｍ、およびＱ１１１Ａ）によって、ＶＨにおいて、ヒトの残基からマウスの残基へ、いくつかの、単一アミノ酸置換を行った。各突然変異について、中央の数字は、アミノ酸置換の位置を示し、左および右の文字は、突然変異前後のアミノ酸を単一文字コードで示す。Ｖ２４ＡおよびＲ３８Ｋ突然変異は組み合わされて、二重アミノ酸置換突然変異（Ｖ２４Ａ、Ｒ３８Ｋ）を生成する。これら６個のＶＨ突然変異は、前述のようにＰＶＧ１にクローンされた。
この６個の変異（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＩＧＧ１抗体は、２９３ーＨ細胞において一過性に発現され、タンパクＡセファロース・カラムクロマトグラフィーによって精製され、その、ヒトＣＤ６３に対するアフィニティーは、ＦＡＣＳ競合法によって分析された。この６個の抗体は、ＦＩＴＣー接合７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと、濃度依存的に競合した。図２８に、そのＩＣ５０値が示される。中でも、ＶＩＩＬのみが、ＣＤ６３に対し、野生型および他の変異抗体よりも高い結合を示した。 ＶＨ（（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１（ＶＩＩＬ））においてＶＩＩＬ置換を担持する（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１抗体は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのものの３倍以内にあった。
重鎖発現ベクターＰＶＧ１ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡでＶＩＩＬ突然変異を担持するベクター（ＰＶＧ１ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）を前述のように生成した。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の発現のために、ＶＩＩＬ突然変異を担持する、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ遺伝子を、前述のようにＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.ＴＴ （ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）にクローンし、ＰＶＧ２Ｍ３ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＶＩＩＬを生成した。軽鎖定常域は、ヒトの生殖系列κ断片（ＨＩＥＴＥＲ ＥＴ ＡＬ.、 １９８０）から得、重鎖は、それぞれ、ヒトの生殖系列γ１ （ＥＬＬＩＳＯＮ ＥＴ ＡＬ.、 １９８２）およびヒトのγ２Ｍ３ （ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）断片から得た。ＰＶＧ２Ｍ３ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＶＩＩＬにコードされるγ２Ｍ３重鎖の、最後より一つ手前の残基はグリシンであること、すなわち、ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ. （１９９７）によって使用されるセリンよりも、より典型的な残基であることに注意すべきである。ヒトサイトメガロウィルスの大型の、直接早期プロモーターおよびエンハンサーは、軽鎖および重鎖両方の遺伝子を駆動する。選択マーカーＧＰＴ遺伝子は、ＳＶ４０の早期プロモーターによって駆動される。図３０に示す、最終的プラスミドの大まかな構造は、制限マッピングによって確認された。軽鎖および重鎖遺伝子の可変および定常域の配列は、ヌクレオチドの配列決定によって確認された。
（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＩＧＧ２Ｍ３ （ＶＩＩＬ）を安定に生産する細胞系統を得るために、対応する重鎖および軽鎖発現ベクターを、電気穿孔により、マウス骨髄腫細胞系統ＳＰ２/０の染色体の中に導入した。ＳＰ２/０に対する安定なトランスフェクションは、事実上ＣＯ ＥＴ ＡＬ. （１９９２）の記載する通りの電気穿孔によって行った。トランスフェクション前に、ＦＳＰＩを用いて発現ベクターを直線化した。約１０７個の細胞を、それぞれ、２５マイクログラムおよび５０マイクログラムの直線化軽鎖および重鎖プラスミドで共時トランスフェクトした。このトランスフェクト細胞を、１０％ ＦＢＳ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）を含むＤＭＥＭ （ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、 ＷＡＬＫＳＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）に縣濁し、いくつかの９６ウェルプレートに１００マイクロリットル/ウェルで撒いた。４８時間後、１００マイクロリットルの選択培地（１０％ ＦＢＳ、 ＨＴ培地補給剤（ＳＩＧＭＡ、 ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）、 ０.５ ＭＧ/ＭＬのキサンチン （ＳＩＧＭＡ、 ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）、および ２.４ /ＭＬ のマイコフェノール酸（ＳＩＧＭＡ. ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）を含むＤＭＥＭ）を各ウェルに印加した。選択開始の約１０日後、培養上清を、抗体生産についてＥＬＩＳＡで定量した。０.２Ｍ 炭酸ー重炭酸ナトリウムバッファーＰＨ９.４に溶解した、１マイクログラム/ＭＬの、ＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥヤギ抗ヒトＩＧＧ ＦＣγー鎖特異的ポリクロナール抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＩＮＣ.、 ＷＥＳＴ ＧＲＯＶＥ、 ＰＡ）で、ウェル当たり１００マイクロリットルにおいて、ＩＭＭＵＬＯＮ ４ ＨＢＸイムノアッセイプレート（ＴＨＥＲＭＯＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ、 ＦＲＡＮＫＬＩＮ、 ＭＡ）をコートし、洗浄バッファー（０.１％ ＴＷＥＥＮー２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、ＴＢＳ （ＰＩＥＲＣＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、 ＲＯＣＫＦＯＲＤ、 ＩＬ）に溶解したＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ ＢＬＯＣＫＩＮＧ ＢＵＦＦＥＲで、ウェル当たり３００マイクロリットルにおいて、室温で３０分ブロックした。洗浄バッファーによる洗浄後、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａを含むサンプルを、ＥＬＩＳＡバッファー（１％ ＢＳＡおよび０.１％ ＴＷＥＥＮ ２０ を含むＰＢＳ）に適切に希釈し、１００マイクロリットル/ウェルをＥＬＩＳＡプレートに印加した。標準として、ヒト化ＩＧＧ１、カッパ抗体ＨＵＡＩＰ１２ （ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＥＳＩＧＮ ＬＡＢＳ、 ＩＮＣ.； ＷＯ２００４/１０１５１１Ａ２）、およびキメラＩＧＧ２Ｍ３、カッパ抗体ＯＫＴ３ （ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７）を用いた。プレートを室温で１.５時間インキュベーションし、洗浄バッファーで洗浄した後、ＨＲＰー接合ＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥヤギ抗ヒトＩＧＧ ＦＣγー鎖特異的ポリクロナール抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＩＮＣ.、 ＷＥＳＴ ＧＲＯＶＥ、 ＰＡ）の１：１０００希釈液を、ウェル当たり１００マイクロリットル用いて結合抗体を検出した。室温で１時間インキュベーションし、洗浄バッファーで洗浄した後、ＡＢＴＳ ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ/ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮ （ＫＰＬ、 ＩＮＣ.、 ＧＡＩＴＨＥＲＳＢＵＲＧ、 ＭＤ）をウェル当たり１００マイクロリットル加えて発色反応を行った。室温で４分インキュベーションした後、２％シュウ酸をウェル当たり１００マイクロリットル加えることによって発色反応を停止した。ＶＥＲＳＡＭＡＸマイクロプレートリーダー（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、 ＳＵＮＮＹＶＡＬＥ、 ＣＡ）を用いて、４１５ ＮＭにおいて吸収を読みとった。
高収率ＳＰ２/０トランスフェクタントＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）（クローン１８）、およびＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）（クローン５）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭで拡大し、次いで、１％低ＩＧ ＦＢＳ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）含有、タンパク無添加基本媒体２（ＰＦＢＭー２）（ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＥＳＩＧＮ ＬＡＢＳ、 ＩＮＣ.； ＳＡＵＥＲ ＥＴ ＡＬ. （２０００））に適応させ、拡張増殖し、タンパク無添加給餌媒体３（ＰＦＦＭー３）（ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＥＳＩＧＮ ＬＡＢＳ、 ＩＮＣ.； ＳＡＵＥＲ ＥＴ ＡＬ. （２０００））を添加して飽和するまで増殖した。
軽鎖および重鎖ＭＲＮＡ配列を確かめるため、ＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）（クローン１８）、およびＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）（クローン５）から、全体ＲＮＡを単離した。全体ＲＮＡを鋳型として、ランダムなヘキサデオキシヌクレオチドをプライマーとして用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＰＲＥＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）によって第１鎖ＣＤＮＡを合成した。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの軽鎖または重鎖の全コード領域を含むＤＮＡ断片を、それぞれ、５’ および３’ 非コード領域に対して結合する５’ および３’ プライマー使用のＰＣＲによって増幅した。プライマー配列を下記に示す。
軽鎖および重鎖の５’ プライマー：
ＭＢＲ３ ５’ ーＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣー３’ （配列番号１７）
軽鎖の３’ プライマー：
ＭＣ１２１ ５’ ーＡＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＡＣＴＴー３’ （配列番号１８）
重鎖の３’ プライマー：
ＭＣ１２４ ５’ ーＴＣＣＣＧＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＣＧー３’ （配列番号１９）
増幅断片は、ゲル精製し、適切なプライマーを用いて配列決定を行った。この軽鎖および重鎖の決定配列は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の既知のコード配列と、全てのヌクレオチド位置において一致した（図３１、３２、および３３）。
９０％ ＦＢＳ （ＨＹＣＬＯＮＥ、 ＬＯＧＡＮ、 ＵＴ）、 １０％ ＤＭＳＯ （ＳＩＧＭＡ、 ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）に縣濁した、ＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＶＩＩＬ.Ｇ１（クローン１８）、およびＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ.ＶＩＩＬ.Ｇ２Ｍ３（クローン５）トランスフェクタントを凍結することよって、１０バイアルから成るシードバンクを作製した。各バイアルは、約５Ｘ１０６個の細胞を含んでいた。各シードバンクの一バイアルを、ＰＦＢＭー２に撒いて育成し、この細胞培養体を、マイコプラズマ試験のために送った（ＢＩＯＮＩＱＵＥ ＴＥＳＴＩＮＧ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＳＡＲＡＮＡＣ ＬＡＫＥ、 ＮＹ）。マイコプラズマ汚染に関し、ＤＮＡーフルオロクロームアッセイおよび直接培養法は陰性であった。
（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）抗体を、後述のように、２９３ーＨ細胞において一過性に、または、ＳＰ２/０細胞において安定に発現させた。ＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）（クローン１８）、およびＳＰ２/０ー（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）（クローン５）を、ローラーボトルにおいて１％ 低ＩＧ ＦＢＳを含むＰＦＢＭー２（ローラーボトル当たり４００ ＭＬ）で、０.８リットルまで拡大した。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）は、消費された培養上清から、タンパクＡセファロース使用のアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。遠心およびろ過の後、一過性または安定的トランスフェクタントから得られた培養上清を、ＨＩＴＲＡＰ ＰＲＯＴＥＩＮ Ａ ＨＰカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、 ＰＩＳＣＡＴＡＷＡＹ、 ＮＪ）に負荷した。カラムを、１５０ ＭＭ ＮＡＣＬを含む２０ ＭＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ＰＨ７.０）で洗浄し、次いで、抗体を、２０ ＭＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ＰＨ３.５）で溶出した。溶出し、プールした分画を、ＰＢＳに対して透析し、次いで、０.２マイクロメートルフィルターでろ過し、４℃で保存した。抗体濃度は、２８０ ＮＭにおける吸収（１ ＭＧ/ＭＬ = １.４ Ａ２８０）を測定することによって決定した。産物は、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）が５０ ＭＧ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）が２２ ＭＧであった。次に、抗体は、標準法によって実行されるＳＤＳーＰＡＧＥによって分析した。ＮＵＰＡＧＥ ＳＡＭＰＬＥ ＲＥＤＵＣＩＮＧ ＡＧＥＮＴ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）の存在下および不在下、還元および非還元条件に関する供給業者の推薦にしたがって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）抗体を７０℃で１０分加熱した。その後、抗体を、ＮＵＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ移動バッファー（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）に溶解して、４ー１２％ＢＩＳーＴＲＩＳ ＮＵＰＡＧＥゲル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）の上を、２００ボルトで２０分走らせた。タンパク標準として、ＢＲＯＡＤ ＲＡＮＧＥ ＳＤＳーＰＡＧＥ標準 （ＢＩＯーＲＡＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、 ＨＥＲＣＵＬＥＳ、 ＣＡ）を還元条件下に走らせた。ゲルを、ＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ ＳＡＦＥＳＴＡＩＮ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、 ＣＡＲＬＳＢＡＤ、 ＣＡ）によって室温で一晩染色し、次いで、Ｈ２Ｏによって室温で一晩脱色した。非還元条件下におけるＳＤＳーＰＡＧＥ分析（図３４）から、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）抗体は、約１５０ー１６０ ＫＤＡの分子量を有することが示された。還元条件下における分析から、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）抗体は、約５０ ＫＤＡの分子量を有する重鎖と、約２５ ＫＤＡの分子量を有する軽鎖とから構成されることが示された。次に、サイズ排除クロマトグラフィーによって純度を分析した。サイズ排除ＨＰＬＣは、ＲＡＩＮＩＮカラムヒーターモデルＣＨー１、 ＤＹＮＡＭＡＸ溶媒輸送システムモデルＳＤ２００、およびＫＮＡＶＥＲ変動波長モニターから成るＶＡＲＩＯＮ ＨＰＬＣシステムを用いて行った。ＶＡＲＩＡＮ ＰＲＯＳＴＡＲ/ＤＹＮＡＭＡＸ ０.２４システムコントロールバージョン５.５１ソフトウェアを用いて、自動サンプラー、ポンプ、および検出器を調節し、データを獲得、保存、および処理した。直列に接続した、二つのＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＳＫーＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬサイズ排除ＨＰＬＣカラム（７.８ ＭＭ Ｘ ３００ ＭＭ、 ５マイクロメートル粒径、２５０Å孔径；ＴＯＳＯＨＡＡＳ、 ＭＯＮＴＧＯＭＥＲＹＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）を用いて分離を実現した。移動相はＰＢＳ、 ＰＨ７.４であり、流速は１.５ ＭＬ/分であった。カラムの溶出液は、２８０ ＮＭにおいて分光光度計測によって監視した。サイズ排除ＨＰＬＣによる抗体の純度は、９５％純度よりも高いようであった（図３５）。
あらかじめ安定トランスフェクタントの培養上清からあらかじめ精製された（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）抗体の、ヒトＣＤ６３に対する親和度を、ＦＡＣＳ競合法によって分析した。ＰＣー３細胞を、滅菌ＰＢＳ（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、 ＷＡＬＫＥＲＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）によって３回洗浄した。この細胞を、２.５ ＭＭ ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ （ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ、 ＷＡＬＫＥＲＶＩＬＬＥ、 ＭＤ）において、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で５ー７分インキュベートして細胞を剥がした。細胞を、ＦＡＣＳ染色バッファー（ＦＳＢ）（０.５％ＢＳＡ （ＳＩＧＭＡ、 ＳＴ. ＬＯＵＩＳ、 ＭＯ）を含むＰＢＳ）において３回洗浄した。細胞の最終洗浄は、Ｖ底の９６ーウェルアッセイプレート（ＮＡＬＧＥＮＥ ＮＵＮＣ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、 ＲＯＣＨＥＳＴＥＲ、 ＮＹ）にて行い、上清を捨てた。各ウェルは、試験当たり１０５個の細胞を含んでいた。ＦＩＴＣー接合７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（１５マイクログラム/ＭＬの最終濃度）、および競合抗体（７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａで、４００マイクログラム/ＭＬ最終濃度で始め、３倍に連続希釈）の混合液を、アッセイプレートの細胞ペレットに、ウェル当たり１００マイクロリットル加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＳＢで３回洗浄し、ペレットを、２００マイクロリットルの１％パラフォルムアルデヒド液に再縣濁させ、二重レーザーＦＡＣＳＣＡＬＩＢＥＲフローサイトメーター（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯＭＥＴＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、 ＳＡＮ ＪＯＳＥ、 ＣＡ）使用のフローサイトメトリーによって分析した。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）抗体は、ＦＩＴＣー接合７ＢＤＩ−３３ー１１Ａと、濃度依存的に競合した。図３６に示すように、コンピュータソフトウェアＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭによって得られた７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の、ＩＣ５０の平均値は、ぞれぞれ、６.８３マイクログラム/ＭＬ、１２.７マイクログラム/ＭＬ、および３８.８マイクログラム/ＭＬであった。ＦＡＣＳ競合アッセイの代表的結果を図３７に示す。ヒトのＣＤ６３に対する（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の相対的結合度は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのものよりも約１.９および５.７倍低かった。ＩＧＧ２サブクラス抗体の結合活性は、ＩＧＧ１サブクラス抗体のものよりも２から３倍低いことが従来から示されており（ＣＯＬＥ ＥＴ ＡＬ.、 １９９７； ＭＯＲＥＬＯＣＫ ＥＴ ＡＬ.、 １９９４）、本実験においても、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）抗体の間に、同様の結合活性の差が観察された。ヒト化（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）抗体は、以下それぞれ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３と呼ばれる。
Ａ２０５８細胞によるインビボ腫瘍実験
図３８および３９を参照すると、４から６週齢の雌性ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの生殖液に縣濁させた５００、０００個のヒトメラノーマ細胞（Ａ２０５８）を、後頸部の皮下に注入することによって移植した。これらのマウスを、群当たり８匹から成る四つの治療群にランダムに分けた。移植後１日目に、２０ ＭＧ/ＫＧの７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３試験抗体またはバッファーコントロールを、２.７ ＭＭ ＫＣＬ、 １ ＭＭ ＫＨ２ＰＯ４、 １３７ ＭＭ ＮＡＣＬ、および２０ ＭＭ ＮＡ２ＰＯ４を含む希釈液による保存濃度希釈後３００マイクロリットルとして、各群に腹腔内投与した。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３治療群は、抗体の供給都合のため合計３回の投与を受けた。動物たちが大きな潰瘍性病巣によるＣＣＡＣ終末点に達したため、実験は３４日後に停止した。この時点で、コントロール、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１治療群は、６回の投与を受けた。実験期間の間、週に１度動物の体重を測定した。実験の終了時、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインにしたがって安楽死させた。
マウス７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１は共に、ヒトのメラノーマ癌の確立されたＡ２０５８インビボモデルにおいて腫瘍増殖を抑えた。図３８は、バッファーコントロールと比較した場合の、２ ＭＧ/ＫＧで与えた３種の抗体の、腫瘍増殖に及ぼす作用を示す。２７日目、この時点で治療群のマウスは全て依然として生存していたが、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、腫瘍増殖を５６％抑え（Ｐ=０.００８６）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１は腫瘍増殖を６３％抑え（Ｐ=０.００１６）たが、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３は、腫瘍の増殖に対し著明な作用を及ぼさなかった（１０％の腫瘍抑制）。これらの結果は、ヒト化ＩＧＧ１は、マウス抗体の効力を保持するが、一方、効力は、ＩＧＧ２Ｍ３版では著明に低下することを示す。観察されたこの低下は、少なくとも一部は、ＩＧＧ２Ｍ３治療群が受けた投与回数がより低かったこと、または、該異性形（上記参照）の結合活性のより低いことに起因するものと思われる。
実験を通じて毒性の臨床的兆候は無かった。週間隔で測定された体重は、健康状態および節約繁栄失敗の代用物とされた。図３９は、実験進行時における各治療群の体重の結果を示す。２７日目、または、実験の終了時（３４日目）において、バッファーコントロールと比べた場合、抗体治療群のいずれにおいても体重に著明な変化は無かった。
要約すると、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１は、Ａ２０５８メラノーマモデルにおいて、マウス抗体と比べ、同じか、それ以上の効力を発揮した。一方、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３キメラ抗体は、ヒトのＡ２０５８メラノーマから成るこのモデルにおいて腫瘍増殖を抑えなかった。さらに、このマウスおよびヒト化抗体は、マウスによって十分耐忍されるようであった。
ＣＤ６３に対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、Ｈ４６０ー２２ー１、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３の結合親和性の定量
７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、Ｈ４６０ー２２ー１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１ および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３の結合親和性を、ヒトのＣＤ６３の細胞外ドメイン２（ＧＳＴーＥＣ２）の、細菌発現、精製後の、組み換えタンパクＧＳＴー融合構築体に対し結合させた後、それぞれの解離定数を定めることによって比較した。
ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ、 ＵＰＰＳＡＬＡ、 ＳＷＥＤＥＮ）の表面を、Ｈ２Ｏに溶解した０.０５Ｍ ＮＨＳおよび０.２Ｍ ＥＤＣを含む混合液３５ ＭＬを注入することによって活性化した。抗ＧＳＴ抗体を、１０ ＭＭの酢酸ナトリウムＰＨ５.０に溶解し３０ ＭＧ/ＭＬの濃度で、５０、０００ＲＵから１００、０００Ｕが捕捉されるまで注入した。最後に、１.０ＭエタノールアミンーＨＣＬ ＰＨ８.５、３５ ＭＬを注入して、センサーチップ表面の全ての活性部位をブロックした。ＧＳＴーＥＣ２ （２５ ＭＬ）を５ ＭＧ/ＭＬで注入し、次いで、抗体２５ー５０ ＭＬを注入した。その後の注入のためのセンサーチップ表面の再生は、２０ ＭＭグリシンＰＨ２.２、１０ ＭＬを２回印加することによって行った。抗体は、１２.５から２００ ＮＭの濃度範囲において連続注入した。コントロールとして、各抗体濃度を、ＧＳＴーＥＣ２の代わりにＧＳＴが捕捉される表面に注入した。測定された定常結合レベルから、ＥＣ２に対する様々な抗体の親和度を計算した。抗体注入終了２０秒前に報告点を採取した（ＲＥＱ）。各抗体濃度について、抗体をＧＳＴの上に注入したときに得られるＲＥＱを、抗体をＧＳＴーＥＣ２の上に注入したときに得られるＲＥＱから差し引いた。ＲＥＱ/ＣＯＮＣ対ＲＥＱプロットの勾配を求めた。これは、会合定数（ＫＡ）を表した。解離定数は、ＫＡの逆数として計算した。実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００システム（ＢＩＡＣＯＲＥ、 ＵＰＰＳＡＬＡ、 ＳＷＥＤＥＮ）を用いて実行した。この実験は、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、および１Ａ２４５.６について、それぞれ、１３５ ＮＭ、 ４２ ＮＭ、 および１０ ＮＭをもたらした（図４０）。すなわち、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａが、本実験で使用した抗体の内でもっとも低い親和度を有することを示した。実験はさらに、ヒト化抗体、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１ および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３の親和度は、親の、マウス７ＢＤＩ−３３ー１１Ａのものよりも高いことを示す。この結果は、実施例８に報告したものとは異なる。結果におけるこの差は、一部は下記によるものと考えられる。先ず第一に、ＦＡＣＳ対表面プラズモン共鳴という、異なる技術背景の方法が用いられた。さらに、実施例８では、ＰＣー３細胞が用いられたが、実施例１０では、細菌によって発現された組み換えＣＤ６３が用いられた。これらの二つの供給源は、ＣＤ６３について、やや異なる立体配座、または糖鎖結合形態を表す可能性がある。
証拠の大部分は、ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、Ｈ４６０ー２２ー１、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および１Ａ２４５.６が、ＣＤ６３上に存在するエピトープへの連結を通じて抗癌作用を仲介することを示す。実施例４において、ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体は、ＭＤＡーＭＢー２３１細胞などの発現細胞から認識抗原を免疫沈降させるのに使用することが可能であることが示された。さらに、ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３抗体は、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣ、ただしこれらに限定されないが、によって例示される技術を利用して、それらの抗体に特異的に結合するＣＤ６３抗原成分を発現する細胞および/または組織の検出に使用することが可能であることが示された。
したがって、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣアッセイによって免疫沈降されたＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗原は、抗体の、そのような細胞または組織への結合を抑制することが可能であることが示された。さらに、ＡＲ５１Ａ９９４.１、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、および７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体同様、他の抗ＣＤ６３抗体も、他の形のＣＤ６３抗原を免疫沈降し、分離するために使用することが可能であり、この抗原はさらに、同じタイプのアッセイを用いて、該抗原を発現する細胞または組織に対するこれらの抗体の結合を抑制するのに使用することが可能である。
本明細書に引用した特許および公刊物は全て、本発明の関わる当業者のレベルを示す。特許および公刊物は全て、各個別の公刊物が、特異的に、個別的に引用により含められることが示されるのと同程度に、引用により本明細書に含められる。
本発明のある一形態が図示されるが、その形態は、本明細書に記載され、図示される特異的形態または配置に限定されるべきものではない。本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更が実行可能であること、本発明は、本明細書に図示し、記載したものに限定されると考えるべきではないことは、当業者には明白であろう。本発明は、実際に言及したものばかりでなく、本発明に内在するものを含め、目的を実行し、目標および利点を獲得するために本発明を十分に適応させることが可能であることを当業者であればすぐに理解するであろう。本明細書に記載されたオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的関連化合物、方法、過程、および技術は、いずれものであれ、単に好ましい実施態様を表すもので、例示を意図するものであり、本範囲の制限となることを意図するものではない。本発明の精神の中に含まれ、付属の特許請求の範囲によって定義される、本発明の変更、およびその他の使用が、当業者に思い浮かぶことがあろう。本発明は、上に特異的な好ましい実施態様との関連において説明されてきたけれども、ここに請求される本発明は、そのような特異的実施態様に不当に限定すべきではないことを理解しなければならない。実際、本発明を実行するための、記載の方式に関する、当業者には明白な各種修飾は、頭書の特許請求の範囲内に納まることが意図される。
細胞系統ＯＣＣー１、ＯＶＡＲー３、およびＣＣＤー２７ＳＫに対するーハイブリドーマ上清のパーセント細胞傷害性および結合レベルを比較する。 細胞傷害性アッセイにおける、ＡＲ５１Ａ９９４.１・対・陽性および陰性コントロールの比較である。 癌および正常細胞系統に対する、ＡＲ５１Ａ９９４.１および抗ＥＧＦＲコントロールの結合を示す。データは、平均蛍光強度を、異性形コントロールに対する倍数増加として示して表に掲げる。 いくつかの癌および非癌細胞系統に向けられる、ＡＲ５１Ａ９９４.１および抗ＥＧＦＲ抗体の、代表的ＦＡＣＳヒストグラムを含む。 細胞傷害性アッセイにおける、７ＢＤＩー５８および７ＢＤＩー６０・対・陽性および陰性コントロールの比較である。 癌および正常細胞系統に対する、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６８、および抗ＨＥＲ２コントロールの結合を示す。データは、平均蛍光強度を、異性形コントロールに対する倍数増加として示して表に掲げる。 いくつかの癌および非癌細胞系統に向けられる、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、および抗ーＨＥＲ２抗体の、代表的ＦＡＣＳヒストグラムを含む。 予防的ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に及ぼす７ＢＤＩー５８の作用を示す。垂直破線は、抗体投与期間を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す。 予防的ＭＤＡーＭＢー２３１乳癌モデルの体重に及ぼす７ＢＤＩー５８の作用を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す。 ＭＤＡーＭＢー２３１細胞の全体膜分画（レーン１）、ＰＣー３の全体細胞分解物（レーン２）、およびＣＣＤー２７ＳＫ細胞系統の全体細胞分解物（レーン３）から得られたサンプルのウェスタンブロット。ブロットは、前述のように、７ＢＤＩー５８、７ＢＤＩー６０、ＡＲ５５Ａ９９４.１、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、１Ａ２４５.６、およびＨ４６０ー２２ー１をプローブとして行った。 ＭＤＡーＭＢー２３１細胞系統の全体膜分画から得られた７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによる免疫沈降によって調製される免疫複合体である。ブロットの個別レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、ＡＲ５１Ａ９９４.１（レーン２）、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（レーン３）、および異性形コントロール抗体（レーン４および５）をプローブとして得た。 ＡＳＰＣー１ヒトすい臓癌細胞系統の全体膜分画から得られた１Ａ２４５.６による免疫沈降によって調製される免疫複合体である。ブロットの複製レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、１Ａ２４５.６（レーン２）、抗ＣＤ６３クローンＨ５Ｃ６（レーン３）、および異性形コントロール抗体（レーン４）をプローブとして得た。 ヒトの組み換え融合構築体ＧＳＴーＥＣ２（ＣＤ６３）のウェスタンブロット。ブロットの個別レーンは、７ＢＤＩー５８（レーン１）、７ＢＤＩー６０（レーン２）、ＡＲ５１Ａ９９４.１（レーン３）、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（レーン４）、Ｈ４６０ー２２ー１（レーン５）、１Ａ２４５.６（レーン６）、および、陰性コントロールＨ４６０ー１６ー２（抗ＣＤ４４、レーン７）、および、異性形コントロール抗体（レーン８および９）をプローブとして得た。 ヒトすい臓の、腫瘍および正常組織マイクロアレイに対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ結合のまとめである。 すい臓組織において得られた結合パターンを示す代表的顕微鏡写真であって、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（Ａ）、または異性形コントロール抗体（Ｂ）によってすい臓腫瘍組織において得られたもの、および、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（Ｃ）、または異性形コントロール抗体（Ｄ）によって非新生物性すい臓組織において得られたものである。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａは、腫瘍細胞に対しては強い、陽性の染色度を示すが、正常組織に対しては弱ー中等の染色度を示した。倍率は２００Ｘである。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａによって惹起された、ヒトの乳癌細胞に対するマウスエフェクター細胞のインビトロ細胞傷害活性。５１ＣＲ標識ＭＤＡーＭＢー２３１細胞を、各種濃度の７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたは異性形コントロールの存在下に、非接着性（Ａ）および接着性（Ｂ）マウスの脾臓エフェクター細胞とインキュベートした。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａまたはバッファーコントロールによる各種投与スケジュール実行後に見られる、ＭＤＡーＭＢー２３１異種移植片由来マクロファージ数の要約である。 ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡのＮ末端アミノ酸の配列である。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の軽鎖可変域のＣＤＮＡ配列（配列番号１）である。演繹されたアミノ酸配列（配列番号２）を、ヌクレオチド配列の下に示す。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟軽鎖は、アサパラギン残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ抗体の重鎖可変域のＣＤＮＡ配列（配列番号３）である。演繹されたアミノ酸配列（配列番号４）を、ヌクレオチド配列の下に示す。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟重鎖は、グルタミン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。 ＶＬ領域アミノ酸配列同士の整列である。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＭＵ３３ー１１Ａ）および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＨＵ３３ー１１Ａ）のＶＬ領域、およびヒトのアクセプター１ＬＶＥおよびＪＫ２のアミノ酸配列が、単一文字コードとして示される。ヒトのＶＬセグメントのＣＤＲ配列は図から除かれている。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ中の１本下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触すると予想されており、したがって、対応するマウスの残基によって置換された。上から読むと、開示の配列は、配列番号２のアミノ酸残基２１ー５０；配列番号６のアミノ酸残基２２ー５２；配列番号６２；配列番号２のアミノ酸残基５１ー８０；配列番号６のアミノ酸残基５３ー８２；配列番号６のアミノ酸残基６３ー７７；配列番号２のアミノ酸残基８１ー１１０；配列番号６のアミノ酸残基８３ー１１２；配列番号６のアミノ酸残基８５ー１１２；配列番号２のアミノ酸残基１１１ー１３２；配列番号６のアミノ酸残基１１３ー１３４；配列番号６のアミノ酸残基１１３ー１１６；および配列番号６のアミノ酸残基１２５ー１３４である。 ＶＨ領域アミノ酸配列同士の整列である。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＭＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ （ＨＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）のＶＨ領域、およびヒトのアクセプターＡＡＲ３２４０９およびＪＨ６のアミノ酸配列が、単一文字コードとして示される。７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ配列においてＣＤＲ配列（ＫＡＢＡＴ命名法）に下線を施す。ヒトのＶＨセグメントのＣＤＲ配列は図から除かれている。（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａおよび（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩ） ＶＨ中の１本下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触すると予想されており、したがって、対応するマウスの残基によって置換された。二重下線を施したアミノ酸は、可能な免疫原性を下げるために、ヒトの共通残基で置換した。上から読むと、開示の配列は、配列番号４のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号８のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号１２のアミノ酸残基２０ー４９；配列番号６３；配列番号４のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号８のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号１２のアミノ酸残基５０ー７９；配列番号６４；配列番号４のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号８のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号１２のアミノ酸残基８０ー１０９；配列番号６５；配列番号４のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号８のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号１２のアミノ酸残基１１０ー１３８；配列番号６６、；および配列番号８および１２のアミノ酸残基１２８ー１３８である。 ミニエキソンにおける（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの軽鎖可変域のヌクレオチド配列（配列番号５）および演繹アミノ酸配列（配列番号６）である。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟軽鎖は、アスパラギン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。配列は、一意のＭＬＵＬ（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸＢＡＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位によって側接される。 ミニエキソンにおける（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）の重鎖可変域のヌクレオチド配列（配列番号７）および演繹アミノ酸配列（配列番号８）である。シグナルペプチド配列をイタリック体で表す。ＣＤＲ（ＫＡＢＡＴ命名法）には下線を施す。成熟重鎖は、グルタミン酸残基（ボールド体で、二重下線）から始まる。配列は、一意のＭＬＵＬ（ＡＣＧＣＧＴ）およびＸＢＡＩ（ＴＣＴＡＧＡ）部位によって側接される。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ遺伝子の構築のために使用されるプライマー。開示の配列は、上から、配列番号２１ー３９である。 ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＨ遺伝子の構築のために使用されるプライマー。開示の配列は、上から、配列番号４０ー６１である。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ ＶＬ またはＶＨミニエキソンの合成スキームである。一連の２０個（ＶＬの場合）または２２個（ＶＨの場合；図示される）が、アニールされ、ＰＦＵ ＴＵＲＢＯポリメラーゼによって伸長される。得られた集合２本鎖Ｖ遺伝子は、５’ および３’ 側接オリゴヌクレオチドによって増幅され、ＶＬ およびＶＨ遺伝子断片を生成する。この断片を、ゲル精製し、ＭＬＵＬおよびＸＢＡＩによって消化し、次に、それぞれ、ＰＶＫ、およびＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴまたはＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.Ｔベクターにサブクローンした。 ＦＡＣＳ競合実験の要約である。 部位指向性突然変異発生法によって、単一アミノ酸置換ＶＨ突然変異を生成するためのスキーム。別々の２ラウンドのＰＣＲを実行した。第１ラウンドのＰＣＲでは、二つの部分的ＶＨ遺伝子断片が増幅された。これらの二つの断片は、第２ラウンドのＰＣＲでさらに増幅されて、単一アミノ酸置換を有する、完全長ＶＨ遺伝子断片を生成する。所望の突然変異を有するＶＨ遺伝子を、側接ＭＬＵＬおよびＸＢＡＩ部位を用いて、ＰＶＧ１.Ｄ.ＴＴおよびＰＶＧ２Ｍ３.Ｄ.Ｔにサブクローンした。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）抗体発現のためのプラスミド構築体である。ＶＬ およびＶＨ遺伝子は、ＭＬＵＬＩおよびＸＢＡＩ部位によって側接されるミニエキソンとして構築された。Ｖ領域は、対応する発現ベクターの中に組み込まれた。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａカッパ軽鎖のＣＤＮＡ（配列番号９）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１０）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）γ１重鎖ＣＤＮＡ（配列番号１１）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１１）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。 （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＶＩＩＬ）γ２Ｍ３重鎖ＣＤＮＡ（配列番号１３）、および翻訳アミノ酸配列（配列番号１４）である。アミノ酸は、単一文字コードで示される。ドット（・）は、翻訳終止コドンを示す。成熟軽鎖の第１アミノ酸には二重下線を施し、ボールド体で表す。先行するのはシグナルペプチド配列である。 本文中に記述されるように、非還元および還元条件下における７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ（ＭＵ３３ー１１Ａ）、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）のＳＤＳーＰＡＧＥ分析。 サイズ排除クロマトグラフィーによる（Ａ） （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（Ｂ） （ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）のＨＰＬＣ分析。 ＦＡＣＳ競合実験の要約である。 ヒトのＣＤ６３に対する、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の相対的結合親和度を比較するためのＦＡＣＳ競合である。本文中に記載するように、ヒトのＣＤ６３＋細胞に対する、ＦＩＴＣ標識７ＢＤＩ−３３ー１１Ａの結合を、様々な量の競合抗体７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１（ＶＩＩＬ）、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３（ＶＩＩＬ）の存在下に分析した。 ヒトメラノーマのマウスモデルにおける、７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１、および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３による治療の、腫瘍増殖に及ぼす作用を示す。腫瘍体積は、群の平均±ＳＥＭとして表す。垂直破線は、投与の初日および最終日を示す。 実験期間中の体重に対する、モノクロナール抗体治療の作用を示す。体重は群の平均±ＳＥＭとして表す。 項ＣＤ６３ ７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、Ｈ４６０ー２２ー１、１Ａ２４５．６、およびヒト化抗体（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ１ および（ＨＵ）ＡＲ７ＢＤＩ−３３ー１１ＡーＩＧＧ２Ｍ３の結合親和性である。精製組み換えＧＳＴ融合構築体タンパクＧＳＴーＥＣ２（ＣＤ６３）に対する抗体結合の解離定数を、表面プラズモン共鳴によって評価した。

Claims (59)

  1. アクセス番号１４１２０５ー０１としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる単離モノクロナール抗体。
  2. ヒト化されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
  3. キメラ化されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
  4. アクセス番号１４１２０５−０１としてＩＤＡＣに寄託される単離クローン。
  5. ヒト腫瘍から選ばれた組織サンプルにおける癌様細胞に対し、抗体誘発の、細胞性細胞傷害性を起動するための方法であって：
    前記ヒトの腫瘍から組織サンプルを準備すること；
    アクセス番号１４１２０５−０１としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドを準備すること；および、
    前記単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドを、前記組織サンプルに接触させること、を含み、
    前記単離モノクロナール抗体、または細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドの、前記組織サンプルに対する結合が、細胞性細胞傷害性を誘発することを特徴とする、前記方法。
  6. 請求項１の単離モノクロナール抗体のリガンド。
  7. 請求項２のヒト化抗体のリガンド。
  8. 請求項３のキメラ化抗体のリガンド。
  9. 細胞傷害性成分、酵素、放射性化合物、および造血細胞から成る群から選ばれる一員と接合される、請求項１、２、３、６、７、または８のいずれか１項に記載の単離抗体またはリガンド。
  10. 哺乳動物において、抗体誘発による細胞性細胞傷害性に対して感受性を持つヒト腫瘍の治療法であって、前記ヒトの腫瘍が、アクセス番号１４１２０５−０１としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドに対して特異的に結合する抗原を発現することを特徴とし、前記モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、その前記リガンドを、細胞性細胞傷害性を誘発し、それによって前記哺乳動物の腫瘍負荷を低減するのに有効な量において前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  11. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、細胞傷害性成分に接合されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記細胞傷害性成分が放射性同位元素であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが補体を活性化することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、抗体依存性細胞性細胞傷害性を仲介することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記モノクロナール抗体がヒト化されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記モノクロナール抗体がキメラ化されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  17. アクセス番号１４１２０５−０６としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる単離モノクロナール抗体。
  18. ヒト化されることを特徴とする、請求項１７に記載の抗体。
  19. キメラ化されることを特徴とする、請求項１７に記載の抗体。
  20. アクセス番号１４１２０５−０６としてＩＤＡＣに寄託される単離クローン。
  21. ヒト腫瘍から選ばれた組織サンプルにおける癌様細胞に対し、抗体誘発の、細胞性細胞傷害性を起動するための方法であって：
    前記ヒトの腫瘍から組織サンプルを準備すること；
    アクセス番号１４１２０５−０６としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドを準備すること；および、
    前記単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドを、前記組織サンプルに接触させること、を含み、
    前記単離モノクロナール抗体、または細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドの、前記組織サンプルに対する結合が、細胞性細胞傷害性を誘発することを特徴とする、前記方法。
  22. 請求項１７の単離モノクロナール抗体のリガンド。
  23. 請求項１８のヒト化抗体のリガンド。
  24. 請求項１９のキメラ化抗体のリガンド。
  25. 細胞傷害性成分、酵素、放射性化合物、および造血細胞から成る群から選ばれる一員と接合される、請求項１７、１８、１９、２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の単離抗体または抗原リガンド。
  26. 哺乳動物において、抗体誘発による細胞性細胞傷害性に対して感受性を持つヒト腫瘍の治療法であって、前記ヒトの腫瘍が、アクセス番号１４１２０５−０６としてＩＤＡＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドに対して特異的に結合する抗原を発現することを特徴とし、前記モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、その前記リガンドを、細胞性細胞傷害性を誘発し、それによって前記哺乳動物の腫瘍負荷を低減するのに有効な量において前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  27. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、細胞傷害性成分に接合されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記細胞傷害性成分が放射性同位元素であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが補体を活性化することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、抗体依存性細胞性細胞傷害性を仲介することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記モノクロナール抗体がヒト化されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記モノクロナール抗体がキメラ化されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
  33. アクセス番号ＰＴＡ−４６２３としてＡＴＣＣに寄託されるクローンによってコードされる単離モノクロナール抗体。
  34. ヒト化されることを特徴とする、請求項３３に記載の抗体。
  35. キメラ化されることを特徴とする、請求項３３に記載の抗体。
  36. アクセス番号ＰＴＡ−４６２３としてＡＴＣＣに寄託される単離クローン。
  37. ヒト腫瘍から選ばれた組織サンプルにおける癌様細胞に対し、抗体誘発の、細胞性細胞傷害性を起動するための方法であって：
    前記ヒトの腫瘍から組織サンプルを準備すること；
    アクセス番号ＰＴＡ−４６２３としてＡＴＣＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドを準備すること；および、
    前記単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドを、前記組織サンプルに接触させること、を含み、
    前記単離モノクロナール抗体、または細胞性細胞傷害性を誘発するそのリガンドの、前記組織サンプルに対する結合が、細胞性細胞傷害性を誘発することを特徴とする、前記方法。
  38. 請求項３３の単離モノクロナール抗体のリガンド。
  39. 請求項３４のヒト化抗体のリガンド。
  40. 請求項３５のキメラ化抗体のリガンド。
  41. 細胞傷害性成分、酵素、放射性化合物、および造血細胞から成る群から選ばれる一員と接合される、請求項３３、３４、３５、３８、３９、または４０のいずれか１項に記載の単離抗体またはリガンド。
  42. 哺乳動物において、抗体誘発による細胞性細胞傷害性に対して感受性を持つヒト腫瘍の治療法であって、前記ヒトの腫瘍が、アクセス番号ＰＴＡ−４６２３としてＡＴＣＣに寄託されるクローンによってコードされる、単離モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、そのリガンドであって、前記単離モノクロナール抗体の、その標的抗原に対する結合を競合的に抑制する能力によって特徴づけられるリガンドに対して特異的に結合する抗原を発現することを特徴とし、前記モノクロナール抗体、または、細胞性細胞傷害性を誘発する、その前記リガンドを、細胞性細胞傷害性を誘発し、それによって前記哺乳動物の腫瘍負荷を低減するのに有効な量において前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
  43. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、細胞傷害性成分に接合されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記細胞傷害性成分が放射性同位元素であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが補体を活性化することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記モノクロナール抗体またはリガンドが、抗体依存性細胞性細胞傷害性を仲介することを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  47. 前記モノクロナール抗体がヒト化されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  48. 前記モノクロナール抗体がキメラ化されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  49. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体であって、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１から獲得することが可能なモノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数エピトープと反応することを特徴とする、モノクロナール抗体。
  50. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体またはリガンドであって、前記モノクロナール抗体、またはそのリガンドは、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８８９を有する−ハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６から獲得することが可能な単離モノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数のエピトープと反応し；前記モノクロナール抗体、またはリガンドが、前記単離モノクロナール抗体の、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する結合を競合的に抑制する能力を有することによって特徴づけられる、モノクロナール抗体またはリガンド。
  51. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体またはリガンドであって、前記モノクロナール抗体、またはそのリガンドは、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８９０を有するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３−１１Ａから獲得することが可能な単離モノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数のエピトープと反応し；前記モノクロナール抗体、またはリガンドが、前記単離モノクロナール抗体の、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する結合を競合的に抑制する能力を有することによって特徴づけられる、モノクロナール抗体またはリガンド。
  52. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体またはリガンドであって、前記モノクロナール抗体、またはそのリガンドは、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０から獲得することが可能な単離モノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数のエピトープと反応し；前記モノクロナール抗体、またはリガンドが、前記単離モノクロナール抗体の、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する結合を競合的に抑制する能力を有することによって特徴づけられる、モノクロナール抗体またはリガンド。
  53. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体またはリガンドであって、前記モノクロナール抗体、またはそのリガンドは、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０１を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８から獲得することが可能な単離モノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数のエピトープと反応し；前記モノクロナール抗体、またはリガンドが、前記単離モノクロナール抗体の、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する結合を競合的に抑制する能力を有することによって特徴づけられる、モノクロナール抗体またはリガンド。
  54. ヒトのＣＤ６３に対し特異的に結合することが可能なモノクロナール抗体またはリガンドであって、前記モノクロナール抗体、またはそのリガンドは、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から獲得することが可能な単離モノクロナール抗体のものと同じ、ヒトＣＤ６３のエピトープ、または複数のエピトープと反応し；前記モノクロナール抗体、またはリガンドが、前記単離モノクロナール抗体の、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する結合を競合的に抑制する能力を有することによって特徴づけられる、モノクロナール抗体またはリガンド。
  55. ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８８９を有する−ハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８９０を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３−１１Ａ、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０１を有するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８、およびＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から成る群から選ばれる−ハイブリドーマによって生産されるモノクロナール抗体によって認識されるものと同じエピトープ、または複数エピトープを認識する、モノクロナール抗体またはリガンド。
  56. ヒトＣＤ６３抗原を発現する、ヒトの癌様腫瘍を治療するためのプロセスであって：
    ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡー４８８９を有するーハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８９０を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３−１１Ａ、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５ー０１を有するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８、およびＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５ー０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から成る群から選ばれる−ハイブリドーマによって生産される単離モノクロナール抗体によって認識されるものと同じエピトープ、または複数エピトープを認識する、少なくとも一つのモノクロナール抗体またはリガンドを、前記ヒト癌に苦しむ個体に投与することを含み；
    前記エピトープ、または複数エピトープの結合が、腫瘍負荷を低減するのに有効であることを特徴とする、前記プロセス。
  57. ヒトＣＤ６３抗原を発現する、ヒトの癌様腫瘍を治療するためのプロセスであって：
    ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８８９を有する−ハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８９０を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０１を有するーハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８、およびＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から成る群から選ばれる−ハイブリドーマによって生産される単離モノクロナール抗体によって認識されるものと同じエピトープ、または複数エピトープを認識する、少なくとも一つのモノクロナール抗体またはリガンドを、少なくとも一つの化学療法剤と組み合わせて、前記ヒト癌に苦しむ個体に投与することを含み；
    前記投与が、腫瘍負荷を低減するのに有効であることを特徴とする、前記プロセス。
  58. 霊長動物組織サンプルにおいてＣＤ６３のエピトープまたは複数エピトープを発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって：
    前記霊長動物から組織サンプルを準備すること；
    ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８８９を有する−ハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡー４８９０を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３−１１Ａ、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０１を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８、およびＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から成る群から選ばれる−ハイブリドーマによって生産される単離モノクロナール抗体によって認識されるものと同じエピトープ、または複数エピトープを認識する、少なくとも一つのモノクロナール抗体またはリガンドを準備すること；
    前記少なくとも一つのモノクロナール抗体、またはそのリガンドを、前記霊長動物サンプルに接触させること；および、
    前記少なくとも一つのモノクロナール抗体、またはそのリガンドの、前記霊長動物組織サンプルとの結合を定量することを含み；
    それによって前記霊長動物組織サンプルにおける前記細胞の存在が示される、
    ことを特徴とする、前記結合アッセイ。
  59. ヒト腫瘍から選ばれる組織サンプルにおいてＣＤ６３のエピトープまたは複数エピトープを発現する癌様細胞の存在を決定するための結合アッセイであって：
    前記ヒト腫瘍から組織サンプルを準備すること；
    ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２２を有する−ハイブリドーマ細胞系統Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８８９を有する−ハイブリドーマ細胞系統１Ａ２４５.６、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４８９０を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−３３ー１１Ａ、ＡＴＣＣアクセス番号ＰＴＡ−４６２３を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−６０、ＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０１を有する−ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤＩ−５８、およびＩＤＡＣアクセス番号１４１２０５−０６を有する−ハイブリドーマ細胞系統ＡＲ５１Ａ９９４.１から成る群から選ばれる−ハイブリドーマによって生産される単離モノクロナール抗体によって認識されるものと同じエピトープ、または複数エピトープを認識する、少なくとも一つのモノクロナール抗体またはリガンドを準備すること；
    前記少なくとも一つのモノクロナール抗体、またはそのリガンドを、前記組織サンプルに接触させること；および、
    前記少なくとも一つのモノクロナール抗体、またはそのリガンドの、前記組織サンプルとの結合を定量することを含み；
    それによって前記組織サンプルにおける前記癌様細胞の存在が示される、
    ことを特徴とする、前記結合アッセイ。
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