MX2008010845A - Composiciones anhidras utiles para lograr bienestar sexual aumentado. - Google Patents

Abstract

La invención describe una composición anhidra que comprende una vasodilatador, por ejemplo, un derivado de niacina, y un portador aceptable en donde el vasodilatador tal como un derivado de niacina, está presente en una cantidad efectiva para incrementar el flujo sanguíneo cuando la composición se aplica a tejido humano; las composiciones de acuerdo con la invención no provocan enrojecimiento.

Description

MEDIACION DE LA CITOTOXICIDAD DE LAS CELULAS QUE EVIDENCIAN LA EXPRESION DE CD63 EN LA SUPERFICIE Campo de la Invención Esta invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de enfermedades cancerosas, particularmente a la mediación de la citotoxicidad de células tumorales; y más particularmente al uso de anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa (CDMAB), opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, como un medio para iniciar la respuesta citotóxica. La invención además se refiere a ensayos de enlace, que utilizan el CDMAB de la presente invención. Antecedentes de la Invención CD63 en cáncer: CD63 es una proteína de membrana Tipo III de la familia de la tetraspanina cuyos 20 miembros presentees están caracterizados por la presencia de cuatro segmentos de la transmembrana. Varios grupos CD63 independientemente identificados, usan anticuerpos elevados para las preparaciones enteras de la célula de plaquetas activadas, granulocitos, y células de melanoma. La clonación del ADNcs respectivo de sus antígenos cognados de la glicoproteína condujo al reconocimiento que los diferentes antígenos fueron uno y la misma molécula. El Sixth International Workshop on Leukocyte Typing (1996) posteriormente categorizó estos anticuerpos como anticuerpos CD63. Antes del taller de 1996, el CD63 fue conocido por múltiples nombres (antígeno 1 melanoma, antígeno asociado al melanoma ocular, antígeno asociado al melanoma ME491, glicoproteí na 3 de membrana asociada al lisosoma, granulofisina, antígeno asociado al melanoma MLA1), los cuales fueron algunas veces relacionados con los anticuerpos que conducen a su caracterización e identificación parcial. Así, CD63 también fue señalado como antígeno ME491 (MAb ME491), antígeno neuroglandular (MAbs LS59, LS62, LS76, LS113, LS140 y LS152), Pltgp40 (MAbs H5C6, H4F8 y H5D2), antígeno de células estromales de médula ósea humana (MAb 12F12), marcador específico osteoprogenitor (MAb HOP-26), y proteína asociada con integrina (MAb 6HI). Otros anticuerpos que fueron encontrados para cruce reactivo con humano CD63 fueron 8-1H, 8-2A (reactividad cruzada con ME491), NKI/C-3 y NKI/negri-13 (Vannegoor y Rumke, 1986; Demetrick y colaboradores, 1992; Wang y colaboradores, 1992). CD63 fue inicialmente clonado de una biblioteca de melanoma ADNc usando MAb ME491, uno de un número de anticuerpos elevados contra una preparación de células de melanoma humano. Fue mostrado que la reactividad de MAb ME491 pareció correlacionarse inversamente con la progresión del melanoma en un estudio de las biopsias de melanoma humano. La reactividad del anticuerpo ME491 fue baja en los melanocitos normales, más alta en las primeras etapas de progresión del melanoma (tumores de fase de crecimiento radial (RGP) y nevo displásticos) y disminuido o aún ausente en tumores de melanoma más avanzados tales como los de fase de crecimiento vertical (VGP) y tumores metastáticos. CD63 también fue encontrado y caracterizado parcialmente en plaquetas humanas usando MAb 2.28 (elevado contra plaquetas activadas) que detectó una glicoproteína de membrana 53 kDa de plaqueta de activación dependiente. Esta molécula también fue asociada con la membrana de gránulos internos en plaquetas no estimuladas. En el mismo estudio los gránulos internos también etiquetados MAb 2.28 en megacariocitos y células endoteliales, donde se co-localizaron con anticuerpos de la enzima catepsina D, un marcador conocido de compartimientos lisosomales. La continuación de los estudios con agrupaciones de anticuerpos y clonación de expresión, condujo a la identificación del antígeno reconocido por este anticuerpo como CD63, y además confirmó su presencia en compartimientos lisosomales, donde se co-localizó con los marcadores de compartimiento específico LAMP-I y LAMP-2. La clonación de esta molécula se identificó como CD63 y permitió su inclusión en la familia de la tetraspanina. La expresión de CD63 fue detectada en muchos diferentes tejidos y tipos de célula. En el nivel celular fue encontrado que está asociado con la membrana del plasma y también con las últimas estructuras vesiculares endosomales intracelulares. La activación de la célula condujo, en ciertos casos, a la expresión superficial creciente por movilización de almacenajes intracelulares de CD63. CD63 también fue encontrada para colocalizar, y para asociarse físicamente, con la clase MHC en B-linfocitos, particularmente en endosomas, en exosomas implicados en la exportación de complejos de MHC clase II hacia la superficie, y en vesículas secretadas. CD63 fue encontrado para interactuar con otros miembros de la familia de la tetraspanina, tales como CD9, CD81, CD11 (cadena de integrina aM,L,x) CD18 (cadena de integrina ß2), CD49C (VLA-3 o cadena de integrina a3), CD49d (cadena de integrina a4), CD49f (VLA-6 o cadena de integrina a6) y CD29 (cadena de integrina ß^, en una variedad de tipos de célula que incluyen linfocitos B- y T-, neutrófilos, cáncer de pecho y células de melanoma. La función de CD63 en cáncer ha sido confusa. Aunque CD63 fue descubierto inicialmente por varios grupos independientes que están implicados en diversos eventos tales como activación de la plaqueta y del granulocito, presentación del antígeno dependiente MHC clase II, adhesión y motilidad de la célula dependiente de integrina, y progresión del tumor en ciertos tipos de cánceres, su función tiene todavía que ser aclarada completamente. Aunque la evidencia presente soporta su función en una variedad de eventos fisiológicos celulares, no está clara si estas funciones son independientes una a otra o si hay un mecanismo celular común subyacente en el cual CD63 está implicado.

Varios grupos han investigado la asociación entre CD63 y la progresión de ciertos tipos de tumores, particularmente melanomas. Un número de otros anticuerpos monoclonales anti-CD63, en adición a Mab ME491, fueron desarrollados por el manchado inmunohistoquímico (IHC) de las muestras de cáncer obtenidas de pacientes con tumores en varias etapas de progresión. Fue observado que el manchado disminuido, interpretado por los autores como que muy probablemente refleja que la expresión de CD63 disminuyo, correlacionada con la progresión avanzada y con las características metastáticas de los tumores. Un estudio más reciente, también describió una correlación significativa entre los niveles de expresión disminuidos evidentes (después de la cuantificacion de ARNm) de varios miembros de la familia de la proteína tetraspanina, incluyendo CD63, y la invasividad in vitro de varias líneas celulares derivadas del carcinoma mamario. Otro estudio identificó CD63, por la exhibición diferencial, en las células de cáncer de pecho cultivadas sometidas a la privación del estrógeno. Esto indicó que la expresión CD63 puede ser hormona esferoide regulada y que la abundancia CD63 y/o función alterada pudieron también asociarse con la progresión del tumor de pecho.

En contraste, el trabajo con el anticuerpo monoclonal anti-CD63 MAb FC-5.01 reveló que su epitope reactivo fue variablemente expresado en diferentes tejidos normales. Aunque este anticuerpo fue encontrado para reconocer CD63, éste no distinguió entre melanomas de etapa avanzada y temprana, que incluyen melanomas metastáticos (poco probable MAb ME491), el cual sugirió que el antígeno CD63 estuvo presente en estos tumores más avanzados, pero que algunos de sus epitopes pueden haber sido enmascarados en las células de tumores en diferentes etapas. Esto pudo haber sido debido a las modificaciones pos-translación alteradas del núcleo del polipéptido CD63, o a la interacción de CD63 con otras moléculas, que pudieron haber afectado la disponibilidad de epitopes específicos para el reconocimiento y enlace del anticuerpo. Estos resultados soportaron la observación, descrita por Si y Hersey (1993), que el manchado con el anti-CD63 MAb NKI-C3, no distinguió entre las secciones del tejido de melanomas en diferentes etapas de progresión, tales como fase primaria, fase de crecimiento radial, fase de crecimiento vertical, y melanomas metastáticas. Aunque en otros estudios (Adachi y colaboradores, 1998; Huang y colaboradores, 1998) los análisis de ARNm de pecho, y de cánceres de pulmón de célula no pequeña, por PCR cuantitativo, revelaron que para dos miembros de la familia de tetraspanina (CD9 y CD82) hubo una correlación significativa entre sus niveles de expresión y la progresión del tumor y pronóstico del paciente, está correlación no fue encontrada para CD63, ya que su expresión fue similar en todas las muestras. Como un resultado de los mismos, aparentemente en conflicto, los resultados, carecieron de datos fuertes y consistentes que definitivamente demostrarían la asociación de CD63 con el cáncer. Hasta la fecha muy pocos estudios in vivo han intentado establecer una ligadura entre CD63 y una función supresora eventual del tumor de esta molécula. En üno de éstos estudios, las células NIH-3T3 H-ras-transformadas de sobreexpresión CD63 humanas, inyectadas ambas de forma subcutánea e intraperitoneal en ratones atímicos, reveló un fenotipo maligno/tumorigénico disminuido, según lo indicado por el tamaño del tumor disminuido y potencial metastático así como por tiempo de supervivencia incrementada, cuando es comparado con el comportamiento de las células de no sobreexpresión CD63 parental. Esto sugirió que la presencia de CD63 humano en las células transformadas pudiera suprimir su comportamiento maligno. Más recientemente, el trabajo con un modelo de ratón transgénico que expresa CD63 humano, y desarrollo para inducir la tolerancia a CD63, indicó que la línea celular de melanoma murino co-trasnfectada de CD63-MHC clase I (H-2Kb) humano inyectada podría ser inhibida, y la supervivencia aumentada, sobre la inmunización con CD63 humano fusionado al virus de la vacuna. Fue sugerido por los autores que el efecto terapéutico fue dependiente de T-linfocito, y que los anticuerpos endógenos anti-CD63 no parecieron estar implicados en este efecto protector, ya que la inhibición del crecimiento del tumor únicamente ocurrió cuando los animales fueron inyectados con las células co-transfectadas CD63-MHC clase I y no únicamente con la línea celular transfectada CD63. Esta interpretación fue soportada por el hecho que en animales de tipo salvaje, pre-inmunizados con CD63 humano purificado y mostrados para tener anticuerpos CD63 anti-humanos desarrollados, no hubo efecto protector contra el crecimiento de la célula tumoral. El trabajo descrito por Radford y colaboradores (1995) que usa la línea celular KM3, pensada inicialmente para ser de origen humano pero después caracterizada como siendo de linaje de rata, transfectada con CD63 humano, sugirió que la expresión de esta proteína disminuyó el desarrollo y potencial metatástico de estas células, con relación a lo observado usando las células KM3 no transfectadas parentales, cuando fueron inyectadas intradérmicamente en ratones atímicos, aunque no hubo diferencia significativa entre los índices de crecimiento in vitro de las varias líneas celulares transfectadas y no transfectadas. Estas observaciones distinguieron el efecto potencial de CD63 de los otros gens supresores del tumor conocidos por afectar los índices de crecimiento in vivo e in vitro de las células tumorales. Además, la adición del anticuerpo monoclonal ME491 anti-CD63, que fue encontrado por tener un efecto funcional en las mismas células disminuyendo su motilidad aleatoria en un ensayo in vitro (Radford y colaboradores, 1997), no impactó sus índices de crecimiento in vitro. Este estudio también describió la observación que CD63 puede promover la migración en respuesta a los quimioatrayentes derivados (ECM) de la matriz extracelular, tales como laminina, fibronectina, colágeno y vitronectina, y que este efecto puede mediarse por la implicación funcional de las integrinas tipo ß1t aunque los anticuerpos en las integrinas fueron incapaces de bloquear estos efectos. Sin embargo, pareció ser un efecto antagónico entre el desempeño del señalamiento medido por la vitronectina (un ligandoo conocido para la integrina a?ß5) y que el señalamiento mediado por otros componentes ECM tales como fibronectina, laminina y colágeno en células transfectadas CD63. Esto sugirió que bajo condiciones específicas, en presencia de los componentes ECM, la expresión de CD63 puede conducir a la migración disminuida, y que puede ser dependiente en un balance fino entre la adhesión y motilidad. En otro estudio, un anticuerpo monoclonal anti-CD63 (MAb 710F) mejoró la adhesión y esparcimiento de las células HL-60 tratadas con PMA, mientras que otros anticuerpos monoclonales anti-CD63 (MAb 2.28), promovieron un efecto similar, pero únicamente en una fracción más pequeña de la población de la célula, y únicamente cuando fueron agregados en cantidades mucho más grandes. Estos resultados mostraron que aunque muchos anticuerpos para CD63 se han desarrollado, sus efectos funcionales pueden ser absolutamente diferentes. Las tetraspaninas pueden también implicarse en la proliferación de la célula. Oren y colaboradores, (1990) describieron efectos antiproliferativos de MAb 5A6 murina, que reconocen CD81 (TAPA-1), en las líneas celulares del linfoma. En otro estudio, la ligadura de CD37 en T-linfocitos humanos con anticuerpos bloqueó la proliferación inducida por CD37. Más recientemente, un estudio con un modelo de animal deficiente en la expresión de CD37 (CD37 transgénico) reveló que los linfocitos T de este animal fueron hiperproliferativos comparados a los animales tipo salvaje en respuesta al acoplamiento receptor de la célula de CD3/T y la activación de la concanavalina A. Por lo tanto fue propuesto que un papel funcional en el desarrollo y proliferación de la célula pudo ser una característica común de la familia de la tetraspanina. Los estudios recientes con hepatoblastoma y células del carcinoma hepatocelular revelaron que el acoplamiento de estas células con los anticuerpos monoclonales anti-CD81 condujeron a la activación de la trayectoria de la cinasa de Erk/MAP. Esta trayectoria de señalamiento ha sido mostrada para estar implicada con los eventos de proliferación y desarrollo de la célula. En el trabajo paralelo, las líneas celulares de sobreexpresión CD81 humano transfectadas exhibieron la proliferación incrementada con relación a las células de control transfectadas por moc. Por lo tanto, la evidencia disponible ha señalado una función de las tetraspaninas en genral, y en particular de CD63, en eventos asociados con la proliferación del crecimiento de la célula y con la adhesión/motilidad célula. Estos dos tipos de eventos celulares son presentemente el objetivo de la intensa investigación ya que desempeñan una función central en la progresión y metástasis del tumor. Hasta ahora, ningún anticuerpo anti-CD63, u otros reactivos que específicamente marcaron las células que expresan CD63, fueron descritos y mostrados por tener un impacto simultáneo en características de crecimiento in vitro e in vivo de células tumorales, y también en el tiempo de supervivencia de los modelos de animales de crecimiento de la célula tumoral. La determinación de la secuencia del aminoácido y análisis no reveló homología entre las tetraspaninas y otras familias de la proteína, o con ningún módulo funcional previamente caracterizado, ni tiene sugerida cualquier actividad enzimática previamente conocida. Consecuentemente ha sido muy difícil investigar la función de esta familia de proteínas en la modulación de las trayectorias de transducción de señal. Sin embargo, la evidencia genrada usando reactivos específicos de tetraspanina que condujo cambios en la fisiología celular, y los cuales fueron íntimamente dependientes en la modulación de las trayectorias de transducción de señal, sugiere que las tetraspaninas tengan propiedades de transducción de señal. CD63 fue mostrado por asociarse, físicamente y funcionalmente, con un número de moléculas que son ellas mismas ya sea enzimas implicadas en la genración de las señales mensajeras secundarias, o están asociadas físicamente y/o funcionalmente con tales enzimas. Los experimentos diseñados para disecar el mecanismo que controla la interacción de neutrófilos humanos con células endoteliales, que es una de las etapas iniciales de la respuesta inflamatoria, revelaron que el pre-tratamiento de neutrófilos con varios anticuerpos monoclonal anti-CD63 (AHN-16, AHN-16.1, AHN-16.2, AHN-16.3 y AHN-16-5) promovió su adhesión a las capas celulares endoteliales cultivadas. Además este efecto fue fuertemente dependiente en presencia del ión de calcio (Ca2+), un modulador bien conocido de muchas trayectorias de señalamiento intracelular y el cuál fue restringido a un período de tiempo específico durante el cual las células fueron expuestas a la estimulación de anticuerpos. Después de una exposición más larga al anticuerpo, la adhesión de los neutrófilos a las células endoteliales llegó a ser insensible a la última adición de Ca2+, por lo tanto implica un evento (transitorio) dinámico y temporalmente regulado. En adición, CD63 fue encontrado por interactuar físicamente con el complejo de la proteína CD11/CD18, y los reactivos que marcaron específicamente este complejo mediaron una señal modulatoria En este estudio CD63 también se encontró por estar asociado físicamente con, o por ser parte de, un complejo que incluyó las cinasas Lck y Hck de la enzima tirosina. Estas enzimas son miembros de una clase de proteínas que desempeñan una función central en la mediación de las señales reguladoras intracelulares en la activación de receptores superficiales específicos y son parte de cascadas de trayectorias de señalización que resultan en cambios fisiológicos específicos de la célula. Otro estudio sugirió que la co-ligadura de tetraspaninas (incluyendo CD63) con anticuerpos monoclonales podría mejorar la fosforilación o actividad de la enzima cinasa de adhesión focal (FAK) que fue inducido por la adhesión de células de cáncer de pecho DA-MB-231 al sustrato de colágeno. Esto señaló una implicación directa de CD63 (y de otros miembros de la familia de la tetraspanina) en la modulación de las trayectorias de señalamiento de la tirosina cinasa mediada por integrina. Otras trayectorias de señalamiento que pueden intersectarse funcionalmente con la presencia y ligadura de la superficie CD63 por el anticuerpo monoclonal anti-CD63 MAb 710F parece ser dependiente en la modulación de la fosforilación por la enzima proteína cinasa C (PKC), otro modulador de trayectorias de señalización intracelulares bien conocido. En este contexto, el mejoramiento de la adhesión y de cambios morfológicos en la línea celular mieloide HL-60 por MAb 710F fue dependiente en el pre-tratamiento de las células con el acetato de miristato forbol (PMA) aunque la implicación temporal de PKC no fue concluyentemente demostrada. Sin embargo, un último trabajo de un grupo independiente demostró que la diferenciación de HL-60 inducido por PMA fue dependiente de la actividad de PKC ya que la molécula Ro31-8220, un inhibidor específico de esta enzima, bloqueó el efecto de PMA.

La evidencia adicional que soporta la asociación de CD63, y otros miembros de la familia de la tetraspanina, con trayectorias de transducción de señal, surgieron del trabajo que describió una asociación física, ya sea directa o como parte de un complejo supramolecular, entre las moléculas CD63 (y también CD53) con la actividad de la tirosina fosfatasa. En este estudio, los complejos inmunoprecipitados aislados con anticuerpos anti-CD63 fueron mostrados para estar asociados con una actividad de tirosina fosfatasa, aunque a diferencia de CD53, el cual fue mostrado por asociarse con la tirosina fosfatasa CD45, no fue posible identificar la fosfatasa asociada a CD63. Más recientemente varios miembros de la familia de la tetraspanina fueron también encontrados por estar asociados con una cinasa-4 fosfatidilinositol tipo II (tipo II Pl 4-K) (Berditchevski y colaboradores, 1997). Esta interacción pareció ser muy específica ya que fue identificada únicamente por CD9, CD63, CD81, CD151 y A15/TALLA, y no fue observada para ocurrir con CD37, CD52, CD82, o NAG-2. En adición, la asociación entre los miembros de la familia de la tetraspanina y PI-4K fue mutuamente exclusiva ya que cada complejo que contiene cinasa PI-4 fue limitado a un solo miembro de la familia de la tetraspanina. Los complejos de cinasa CD63-PI-4, en particular, fueron encontrados, casi enteramente, en compartimientos intracelulares en dominios tipo formación de balsas de lípidos, similar a los formados con los otros miembros de la tetraspanina. Esta observación sugirió que esta fracción CD63, encontrada por interactuar con la cinasa PI-4, pudiera haber estado implicada en los eventos intracelulares específicos (Claas, C, y colaboradores, 2001) relacionados a, o dependiente de, las trayectorias de la biosíntesis de fosfoinositida, que son bien conocidas por su implicación en la regulación del tráfico de la membrana (endocitosis y exocitosis) y de la reorganización de citoesqueleto, en adición a su función como moléculas mensajeras secundarias (Martin, T., 1998). El importante y directo involucramiento de todas las enzimas, encontró hasta ahora que el CD63 está asociado directamente con, en la regulación de las trayectorias de señalamiento proporcionadas de la evidencia adicional en el soporte de la asociación de CD63 con la modulación de las trayectorias de transducción de señal, ya sea como regulador o como una corriente abajo de la molécula efectora desde la actividad de estas enzimas. La elucidación de los mecanismos que conduce a la progresión del tumor es un esfuerzo muy difícil y complejo marcado con frecuencia por observaciones aparentemente contradictorias y, por consiguiente, es raro que estas observaciones se traduzcan exitosamente en terapias eficaces. En vista de qué es conocido presentemente con respecto a la asociación de CD63 con la progresión y metástasis del tumor y con los mecanismos de transducción de señal, es posible que su función pueda ser alterada, en células tumorales. El desarrollo de reactivos de antígeno específicos con efectos citotóxicos en células tumorales, que enlazan a las células que expresan el antígeno (s) reconocido y que por sí mismos, o asociados con otras moléculas, tienen actividad fisiológica celular in vivo de modo que estos reactivos inhiben el crecimiento celular tumoral, la progresión y metástasis, sin efectos deletéreos significativos en poblaciones normales de la célula, sería extremadamente beneficioso como una herramienta terapéutica potencial y o de diagnóstico. Anticuerpos Monoclonales como Terapia del Cáncer: Cada individuo quién se presenta con cáncer es único y tiene un cáncer que es tan diferente de otros cánceres como la identidad de esa persona. A pesar de esto, la terapia presente trata a todos los pacientes con el mismo tipo de cáncer, en la misma etapa, de la misma manera. Por lo menos 30 % de estos pacientes fallará en la primera línea de la terapia, conduciendo así a otros redondeos del tratamiento y la probabilidad incrementada de la falla del tratamiento, metástasis, y en última instancia, muerte. Un método superior al tratamiento sería la personalización de la terapia por individuo particular. La única terapia presente que se conduce por sí misma a la personalización es la cirugía. El tratamiento de radiación y quimioterapia no puede adaptarse al paciente, y la cirugía por sí misma, en la mayoría de los casos es inadecuada para producir curaciones.

Con el advenimiento de anticuerpos monoclonales, la posibilidad de desarrollar métodos para la terapia personalizada se vuelve más realista ya que cada anticuerpo puede dirigirse a un solo epitope. Además, es posible producir una combinación de anticuerpos que son dirigidos a la constelación de epitopes que definen únicamente un tumor de un individuo particular. Se reconoció que una diferencia significativa entre las células cancerosas y normales es que las células cancerosas contienen antigenos que son específicos para las células transformadas, la comunidad científica ha sostenido largamente que los anticuerpos monoclonales pueden diseñarse para marcar específicamente células transformadas enlazando específicamente a los antígenos cancerosos; surgiendo así la creencia que los anticuerpos monoclonales pueden servir como " Balas Mágicas" para eliminar las células cancerosas. Sin embargo, ahora se reconoce ampliamente que ningún anticuerpo monoclonal solo puede servir en todos los casos de cáncer, y que los anticuerpos monoclonales pueden desplegarse, como una clase, como tratamientos de cáncer marcados. Los anticuerpos monoclonales aislados de acuerdo con las enseñanzas de la invención descrita presentemente han sido mostrados por modificar el proceso de la enfermedad cancerosa en una manera en la cual es beneficiosa al paciente, por ejemplo reduciendo la carga del tumor, y sería variablemente referido en la presente como anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa (CDMAB) o anticuerpos "anti cancerígenos". Presentemente, el paciente con cáncer tiene usualmente pocas opciones del tratamiento. El método reglamentado para la terapia de cáncer ha producido mejoramientos en índices de morbilidad y globales de supervivencia. Sin embargo, al individuo particular, estas estadísticas mejoradas no se correlacionan necesariamente con un mejoramiento en su situación personal. Así, si una metodología fue puesta en práctica la cual permitió al médico tratar cada tumor independientemente de otros pacientes en el mismo cohorte, esto permitiría el método único de personalizar la terapia justo a una persona. Tal curso de terapia, aumentaría idealmente el índice de curaciones, y produciría mejores resultados, de tal modo que satisfaga la necesidad que se percibe desde hace mucho tiempo. Históricamente, el uso de los anticuerpos policlonales ha sido utilizado con éxito limitado en el tratamiento de cánceres humanos. Los linfomas y leucemias han sido tratados con plasma humana, pero hubo poca remisión prolongada o respuestas. Además, hubo una carencia de reproductibilidad y no hubo beneficio adicional comparado a la quimioterapia. Los tumores sólidos tales como cánceres de pecho, melanomas y carcinomas de la célula renal también han sido tratados con sangre humana, suero de chimpancé, suero de caballo y plasma humano con resultados imprevisibles e ineficaces correspondientemente. Ha habido muchas pruebas clínicas de los anticuerpos monoclonales para tumores sólidos. En los años 80 había por lo menos cuatro pruebas clínicas para cáncer de pecho humano las cuales produjeron únicamente un respondedor de por lo menos 47 pacientes usando anticuerpos contra antígenos específicos o basados en la selectividad del tejido. No fue hasta 1998 que hubo una prueba clínica exitosa usando un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado (Herceptin®) en combinación con Cisplatina. En esta prueba 37 pacientes fueron evaluados por respuestas de los cuales aproximadamente un cuarto tuvo un índice de respuesta parcial y un cuarto adicional tuvo una progresión de la enfermedad estable o menor. El tiempo mediado en la progresión entre los respondedores fue de 8.4 meses con la duración de respuesta mediada de 5.3 meses. Herceptin® fue aprobado en 1998 por la primera línea de uso en combinación con Taxol®. Los resultados de estudios clínicos mostraron un incremento en el tiempo mediado a la progresión de la enfermedad para los que recibieron terapia de anticuerpo más Taxol® (6.9 meses) en comparación al grupo que recibió solo Taxol® (3.0 meses). Hubo también un aumento leve en supervivencia mediada; 22 contra 18 meses por Herceptin® más el brazo de tratamiento de Taxol® contra el brazo de tratamiento de Taxol®. En adición, hubo un aumento en el número de ambos respondedores completos (8 contra 2 por ciento) y parciales (34 contra 15 por ciento) en el anticuerpo más el grupo de combinación de Taxol® en comparación a solo Taxol®. Sin embargo, el tratamiento con Herceptin® y Taxol® condujo a una incidencia más alta de cardiotoxicidad en comparación al tratamiento de Taxol® únicamente (13 contra 1 por ciento respectivamente). También, la terapia de Herceptin® fue únicamente eficaz para pacientes quienes sobre-expresaron (según lo determinado a través de los análisis inmunohistoquímicos (IHC)) el factor del crecimiento epidérmico humano del receptor 2 (Her2/neu), un receptor, el cual presentemente no tiene una función conocida o ligandoo biológicamente importante; aproximadamente 25 por ciento de los pacientes que tienen cáncer de pecho metastático. Por lo tanto, todavía hay una gran necesidad insatisfecha para pacientes con cáncer de pecho. Incluso los que pueden beneficiarse del tratamiento de Herceptin® requerirían quimioterapia y por lo tanto tendrían que tratar con, por lo menos un cierto grado, de efectos secundarios de esta clase de tratamiento. Las pruebas clínicas que investigan el cáncer colorectal involucran anticuerpos contra ambos objetivos glicoproteína y glicolípido. Los anticuerpos tales como 17-1A, que tienen cierta especificidad para los adenocarcinomas, ha experimentado pruebas clínicas fase 2 en más de 60 pacientes con únicamente 1 paciente teniendo una respuesta parcial. En otras pruebas, el uso de 17-1A produjo únicamente 1 respuesta completa y 2 respuestas menores entre 52 pacientes en protocolos usando la ciclofosfamida adicional. Hasta la fecha, las pruebas clínicas de la Fase III de 17-1A no han demostrado eficacia mejorada como terapia adyuvante para el cáncer de colon etapa III. También el uso de un anticuerpo monoclonal murino humanizado inicialmente aprobado para imagen no produjo la regresión de tumor. Únicamente recientemente hubo algunos resultados positivos de estudios clínicos de cáncer colorectal con el uso de anticuerpos monoclonales. En 2004, ERBITUX® fue aprobado para el tratamiento secundario de pacientes con cáncer colorectal metastático que expresan EGFR que son resistentes a la quimioterapia basada en irinotecan. Los resultados de un estudio clínico de doble brazo Fase II y de un solo brazo mostraron que ERBITUX® en combinación con irinotecan tuvo un índice de respuesta de 23 y 15 por ciento respectivamente con un tiempo mediado a la progresión de la enfermedad de 4.1 y 6.5 meses respectivamente. Los resultados del mismo estudio clínico de doble brazo Fase II y otro de un solo brazo mostraron que el tratamiento con ERBITUX® solo resulto en un índice de respuesta de 11 y 9 por ciento respectivamente con un tiempo mediado a la progresión de la enfermedad de 1.5 y 4.2 meses respectivamente.

Por lo tanto en Suiza y en Estados Unidos, el tratamiento de ERBITUX® en combinación con irinotecan, y en Estados Unidos, el tratamiento solo de ERBITUX®, ha sido aprobado como un tratamiento secundario de pacientes con cáncer de colon que han fallado en la terapia de primera línea con irinotecan. Por lo tanto el tratamiento, igual que el Herceptin®, en Suiza se aprueba únicamente como una combinación del anticuerpo monoclonal y de quimioterapia. En adición, el tratamiento en Suiza y Estados Unidos es únicamente aprobado para pacientes como una terapia de segunda línea. También, en 2004, el AVASTIN® fue aprobado para uso en combinación con la quimioterapia basada en 5-fluorouracil intravenoso como un tratamiento primario de cáncer colorectal metastático. Los resultados del estudio clínico de la Fase III demostraron una prolongación en la supervivencia mediada de los pacientes tratados con AVASTIN® más 5-fluorouracil comparado a los pacientes tratados con solo 5-fluourouracil (20 meses contra 16 meses respectivamente). Sin embargo, nuevamente igual que Herceptin® y ERBITUX®, el tratamiento es aprobado únicamente como una combinación del anticuerpo monoclonal y de quimioterapia. También continúan siendo pobres los resultados para el cáncer de pulmón, cerebro, ovárico, pancreático, próstata, y de estómago. Los resultados prometedores más recientes para cáncer de pulmón de célula pequeña vino de una prueba clínica de la Fase II donde el tratamiento implicó un anticuerpo monoclonal (SGN-15; dox-BR96, anti-Sialyl-LeX) conjugado con el fármaco doxorubicina que destruye a la célula en combinación con el agente quimioterapéutico Taxotere. Taxotere es la única quimioterapia aprobada por la FDA para el tratamiento secundario del cáncer de pulmón. Los datos iniciales indican una supervivencia total mejorada comparada con solo Taxotere.

Fuera de los 62 pacientes que fueron reclutados para el estudio, dos tercios recibieron SGN-15 en combinación con Taxotere mientras que un tercio restante recibió solo Taxotere. Para los pacientes que reciben SGN-15 en combinación con Taxotere, la supervivencia total mediada fue de 7.3 meses en comparación a 5.9 meses para pacientes que reciben solo Taxotere. La supervivencia total en 1 año y 18 meses fue 29 y 18 por ciento respectivamente para los pacientes que reciben SNG-15 más Taxotere comparado a 24 y 8 por ciento respectivamente para los pacientes que reciben solo Taxotere. Están planeadas pruebas clínicas adicionales. Preclínicamente, hubo cierto éxito limitado en el uso de los anticuerpos monoclonales para el melanoma. Muy pocos de estos anticuerpos han alcanzado pruebas clínicas y hasta la fecha no ha sido aprobado ni mostrado resultados favorables en ensayos clínicos de la Fase III. El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar la enfermedad es obstaculizado por la carencia de la identificación de marcas relevantes entre los productos de 30,000 gens conocidos que contribuyen sin ambigüedades a la patogensia de la enfermedad. En la investigación de oncología, las marcas de fármacos potenciales son con frecuencia simplemente seleccionadas debido al hecho de que están sobre-expresados en células tumorales. Las marcas así identificadas son después detectadas por la interacción con una multitud de compuestos.

En el caso de terapias potenciales del anticuerpo, estos compuestos candidatos son derivados usualmente de métodos tradicionales de la generación del anticuerpo monoclonal de acuerdo a los principios fundamentales situados por Kohler y Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler y Milstein). Las células del bazo son recolectadas de ratones inmunizados con antígeno (por ejemplo células enteras, fracciones de célula, antígeno purificado) y fusionadas con parejas de hibridomas inmortalizados. Los hibridomas resultantes son detectados y seleccionados por la secreción de los anticuerpos que enlazan lo más ávidamente al objetivo. Muchos anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico dirigidos contra las células cancerosas, que incluyen Herceptin® y RITUXIMAB han sido producidos usando estos métodos y seleccionados, en base de su afinidad. Los defectos en esta estrategia son dobles. En primer lugar, la opción de las marcas apropiadas para el enlace del anticuerpo terapéutico o de diagnóstico es limitada por la escases de conocimiento acerca de los procesos carcinógenos específicos del tejido y los métodos simplistas resultantes, tales como la selección por la sobreexpresion, por el cual estos objetivos son identificados. En segundo lugar, puede no siempre ser el caso la asunción que la molécula del fármaco que enlaza al receptor con mayor afinidad usualmente tenga la probabilidad más alta para iniciar o inhibir una señal. A pesar de algunos progresos con el tratamiento del cáncer de pecho y colon, la identificación y desarrollo de terapias de anticuerpo eficaces, ya sea como agentes solos o co-tratamientos, han sido inadecuados para todos los tipos de cáncer. Patentes Anteriores: US05296348 enseña los métodos para seleccionar los anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos de la superficie de la célula cancerosa que están internalizadas, y que identifican anticuerpos monoclonales que tienen efectos anti-transcripcionales y/o anti-replica en metabolismo de la célula. A modo de ejemplo el anticuerpo ME491 fue mostrado para internalizar en células de melanoma W9, WM35, WM983, y células de carcinoma colorectal SW948. En adición el anticuerpo ME491 fue mostrado por la disminución de la transcripción y proliferación de la célula en células SW948. La Solicitud de Patente US20030211498 A1 (y sus solicitudes relacionadas: WO0175177A3, WO0175177A2 , AU0153140A5) alegan un método de inhibir el crecimiento o metástasis de un tumor ovárico con un anticuerpo que enlaza a un polipéptido marcador de tumor ovárico codificado por un gen marcador del tumor ovárico seleccionado entre un grupo que incluye el antígeno CD63. El análisis serial del gen de expresión que usa el cáncer ovárico fue realizado para identificar los gens marcadores del tumor ovárico que conducen a la identificación de CD63 como un candidato. La Solicitud de Patente WO02055551A1 (y su solicitud relacionada CN1364803A) alega nuevo antígeno CD63 56.87 del polipéptido humano. La Solicitud de Patente CN1326962A alega un nuevo antígeno CD63 14.63 del polipéptido humano. La Solicitud de Patente CN 1326951A alega un nuevo antígeno CD63 15.07 del polipéptido humano. La Solicitud de Patente CN1351054A alega un nuevo antígeno CD63 11.11 del polipéptido humano. Estas patentes y solicitudes de patente identifican los antígenos y anticuerpos CD63 pero fallan en describir al anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención, o la utilidad del anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención. El gen que codifica al antígeno del polipéptido ME491 fue clonado y la secuencia fue recibida por la publicación del 24 de febrero de 1988 (Can Res 48:2955, 1988, junio 1); el gen que codifica CD63 fue clonado y la secuencia publicada en febrero 1991(JBC 266(5):3239-3245, 1991) y la publicación claramente indicó la identidad de ME491 con CD63. El documento WO2004041170.89 (Secuencia ID No.: 89, fecha de prioridad de presentación: 29 de Junio 2004), WO2003068268-A2 (Secuencia ID No.: 1, fecha de prioridad de presentación: 13 de febrero 2003(2003WO-EP001461 ); otra fecha de prioridad: 14 de febrero 2002(2002GB-00003480)), WO2003057160-A29 (Secuencia ID No.: 40, fecha de prioridad de presentación:: 30 de diciembre 2002(2002WO-US041798); otra fecha de prioridad: 2 de enero 2002(2002US-0345444P)) todos alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia hacia CD63. El documento WO2003016475-A2(Secuencia ID No.: 9787&12101, fecha de prioridad de presentación: 14 de agosto 2002(2002WO-US025765); otra fecha de prioridad: 14 de agosto 2001 (2001 US-0312147P) alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia con 237 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento WO2003070902-A2(Secuencia ID No.:27, fecha de prioridad de presentación: 18 de febrero 2003(2003 WO-US004902); otra fecha de prioridad: 20 de febrero 2002(2002US-0358279P)) alegan que los polipéptidos tienen 94 % de homología de secuencia con 224 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento EP1033401-A2 (Secuencia ID No..4168&4913, fecha de prioridad de presentación: 21 de febrero 2000(2000EP-00200610); otra fecha de prioridad: 26 de febrero 1999(99US-0122487P)) alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia con 205 aminoácidos y con 94 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63, respectivamente. El documento WO200257303-A2 (Human prey protein for Shigella ospG#26, fecha de prioridad de presentación: 11 de enero 2002(2002WO-EP000777); otra fecha de prioridad: 12 de enero 2001 (2001 US-0261130P)) alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia cón 130 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento WO200055180-A2 (Secuencia ID No.:756, fecha de prioridad de presentación: 8 de marzo 2000(2000WO-US005918); otra fecha de prioridad: 12 de marzo 1999(99US-0124270P)) alegan que los polipéptidos tienen 99 % de homología de secuencia con 127 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento WO200200677-A1 (Secuencia ID No.:3203, fecha de prioridad de presentación: 7 de junio 2001(2001 WO-US018569); otra fecha de prioridad: 7 de junio 2000(2000US-0209467P)) alegan que los polipéptidos tienen 97 % de homología de secuencia con 132 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento WO9966027-A1 (Large extracelular loop sequence from human CD63 protein, fecha de prioridad de presentación: 15 de junio 1999(99WO-US013480); otra fecha de de prioridad de presentación: 15 de junio 1998(98US-0089226P)) alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia con 99 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento WO200270539-A2 (Secuencia ID No.: 1207, fecha de prioridad de presentación: 05 de marzo 2002(2002WO-US005095); otra fecha de prioridad: 05 de marzo 2001(2001 US-00799451)) alegan que los polipéptidos tienen 86 % de homología de secuencia con 102 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. El documento EP1033401-A2 (Secuencia ID No.: 4169, 21 de febrero 2000(2000EP-00200610); otra fecha de prioridad: 26-de febrero 1999(99US-0122487P)) alegan que los polipéptidos tienen 100 % de homología de secuencia con 74 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprenden CD63. Estas solicitudes de patente identifican a los polipéptidos que tienen variación en la homología de secuencia hacia el antígeno CD63. En la mayoría de los casos esta solicitud también alega anticuerpos y derivados de anticuerpos del polipéptido correspondiente y sus homólogos pero fallan en describir al anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención, o la utilidad del anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención. Muy importante es, que todas las solicitudes anteriores fueron presentadas después de la publicación de la secuencia del polinucleótido que codifica CD63. Breve Descripción de la Invención Los presentes inventores han sido otorgados previamente con la Patente Norteamericana 6,180,357, titulada "Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies" dirigida a un proceso para seleccionar anticuerpos anti-cancerígenos personalizados individualmente los cuales son útiles en tratar una enfermedad cancerosa. Es bien reconocido en la técnica que cierta secuencia del aminoácido puede ser variada en un polipéptido sin efecto significativo en la estructura o función de la proteína. En el reacomodo molecular de anticuerpos, las modificaciones en la secuencia del ácido nucleico o aminoácido de la región de la columna vertebral pueden genralmente tolerarse. Éstos incluyen, pero no se limitan a, sustituciones (las sustituciones conservadoras son preferidas), supresiones o adiciones. Además, está dentro del articulado de esta invención conjugar modalidades quimioterapéuticas estándares, por ejemplo radionucleidos, con el CDMAB de la presente invención, de tal modo que enfoca el uso de los quimioterapeúticos. El CDMAB también puede conjugarse con toxinas, fracciones citotóxicas, enzimas, por ejemplo enzimas conjugadas con biotin, o células hematógenas, de tal modo que forman una conjugación del anticuerpo. Esta aplicación utiliza el método para producir anticuerpos anticancerígenos específicos del paciente según lo enseñado en la patente '357 por aislar líneas celulares del hibridoma que codifican a la enfermedad cancerosa que modifica anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos pueden ser hechos específicamente para un tumor y hacer así posible la personalización de la terapia de cáncer. Dentro del contexto de esta aplicación, los anticuerpos anti cancerígenos que tienen ya sea propiedades (citoestáticas) de inhibición del crecimiento celular o destrucción de células (citotóxica) serán de aquí en adelante referidos como citotóxicos. Estos anticuerpos pueden utilizarse en la ayuda de las etapas y diagnóstico de un cáncer, y pueden utilizarse para tratar metástasis del tumor. Estos anticuerpos pueden también utilizarse para la prevención del cáncer a modo de tratamiento profiláctico. Similar a los anticuerpos genrados de acuerdo a paradigmas tradicionales del descubrimiento del fármaco, los anticuerpos genrados en esta manera pueden marcar las moléculas y trayectorias no mostradas previamente por ser integrales al crecimiento y/o supervivencia del tejido maligno. Además, la afinidad de enlace de estos anticuerpos es conveniente para los requisitos de la iniciación de los eventos citotóxicos que pueden no ser favorables a las interacciones de afinidad más fuertes. El prospecto del tratamiento anti cancerígeno individualizado traerá un cambio en la manera en que un paciente es manejado. Un probable panorama clínico es que una muestra del tumor es obtenida en el momento de la presentación, y depositada. De esta muestra, el tumor puede mecanografiarse desde un panel de los anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa preexistente. El paciente será estacionado convencionalmente pero los anticuerpos disponibles pueden ser de uso en las etapas adicionales del paciente. El paciente puede ser tratado inmediatamente con los anticuerpos existentes, y un panel de los anticuerpos específicos del tumor puede producirse ya sea utilizando los métodos delineados en la presente o a través del uso del fago que exhiben las bibliotecas en conjunto con los métodos de detección descritos en la presente. Todos los anticuerpos genrados serán agregados a la biblioteca de anticuerpos anti cancerígenos ya que hay una posibilidad de que otros tumores pueden llevar algunos de los mismos epitopes como el que es tratado. Los anticuerpos producidos de acuerdo a este método puede ser útil para tratar la enfermedad cancerosa en cualquier número de pacientes que tienen cánceres que enlazan a los anticuerpos. En adición a los anticuerpos anti cancerígenos, el paciente puede elegir recibir las terapias presentemente recomendadas como parte de un régimen multi-modal del tratamiento. El hecho de que los anticuerpos aislados vía la presente metodología son relativamente no tóxicos para las células no cancerosas permite combinaciones de anticuerpos en altas dosis que son utilizadas, ya sea solas, o en conjunto con la terapia convencional. El alto índice terapéutico permitirá también el re-tratamiento en una escala a corto tiempo que deberá disminuir la probabilidad de la aparición de células resistentes al tratamiento. Si el paciente es resistente al curso inicial de la terapia o desarrollo de metástasis, el proceso de genrar anticuerpos específicos del tumor puede repetirse para re-tratamiento. Además, los anticuerpos anti cancerígenos pueden conjugarse con las células de sangre rojas obtenidas de ese paciente y re-infundidas para el tratamiento de metástasis. Ha habido pocos tratamientos eficaces para el cáncer metastático y metástasis genralmente pronosticados con un resultado pobre con consecuencias de muerte. Sin embargo, los cánceres metastáticos están genralmente bien vascularizados y el suministro de anticuerpos anti cancerígenos por células de sangre roja puede tener el efecto de concentrar los anticuerpos en el sitio del tumor. Incluso antes de la metástasis, la mayoría de las células cancerosas son dependientes en la fuente de la sangre del hospedador por su supervivencia y un anticuerpo anti cancerígeno conjugado con las células de sangre roja puede ser también eficaz contra tumores in situ. Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse con otras células hematógenas, por ejemplo linfocitos, macrófagos, monocitos, natural de las células, etc. Hay cinco clases de anticuerpos y cada uno está asociado con una función que es conferida por su cadena pesada. Genralmente se piensa que la destrucción de la célula de cáncer por los anticuerpos desnudos está mediada ya sea con la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo o la citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo los anticuerpos murinos IgM y lgG2a pueden activar el complemento humano enlazando al componente C1 del sistema de complemento de tal modo que activa la trayectoria clásica de la activación del complemento que puede conducir a la lisis tumoral. Para los anticuerpos humanos los anticuerpos que activan el complemento más eficientemente son genralmente IgM e IgGI. Los anticuerpos murinos del isotipo lgG2a e lgG3 son eficaces en el reclutamiento de las células citotóxicas que tienen receptores Fe que conducirán a la destrucción de la célula por los monocitos, macrófagos, granulocitos y ciertos linfocitos. Los anticuerpos humanos del isotipo de IgGI e lgG3 median el ADCC. Otro mecanismo posible de la destrucción del cáncer mediado por el anticuerpo puede ser a través del uso de anticuerpos que funcionan por catalizar la hidrólisis de varios enlaces químicos en la membrana de la célula y sus glicoproteínas o glicolípidos asociados, llamados anticuerpos catalíticos. Hay tres mecanismos adicionales de destrucción de la célula cancerosa mediada por el anticuerpo. El primero es el uso de anticuerpos como una vacuna para inducir al cuerpo a producir una inmunorespuesta contra el antígeno putativo que reside en la célula cancerosa. El segundo es el uso de anticuerpos para marcar a los receptores del crecimiento e interferir con su función o subregulación del receptor de modo que su función es perdida efectivamente. El tercero es el efecto de tales anticuerpos en la ligadura directa de las fracciones de la superficie de la célula que pueden conducir a la muerte celular directa, tal como la ligadura de los receptores mortales tales como TRAIL R1 o TRAIL R2, o moléculas integrinas tales como alfa V beta 3 y similares. La utilidad clínica de un fármaco de cáncer está basada en el beneficio del fármaco bajo un perfil de riesgo aceptable hacia el paciente. En la terapia del cáncer la supervivencia ha sido genralmente la más vista después del beneficio, no obstante hay un número de otros beneficios bien reconocidos en adición de prolongar la vida. Estos otros beneficios, donde el tratamiento no afecta adversamente a la supervivencia, incluyen la paliación del síntoma, la protección contra eventos adversos, la prolongación en tiempo a la repetición o a la supervivencia libre de la enfermedad, y la prolongación en tiempo hacia la progresión. Estos criterios son aceptados genralmente y los cuerpos reguladores tales como U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.) aprueban fármacos que producen estos beneficios Hirschfeld y colaboradores Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42: 137-143 2002). Además de estos criterios es bien reconocido que hay otros términos que pueden pronosticar estos tipos de beneficios. En parte, el proceso acelerado de aprobación concedido por F.D.A. de los Estados Unidos reconoce que hay sustitutos que predecirán probablemente el beneficio del paciente. Para fines del año (2003), había dieciséis fármacos aprobados bajo este proceso, y de éstos, cuatro han sido aprobados plenamente, es decir, los estudios complementarios han demostrado el beneficio directo del paciente según lo pronosticado por los términos sustituidos. Un término importante para determinar los efectos del fármaco en tumores sólidos es la valoración de la carga del tumor midiendo la respuesta al tratamiento (Therasse y colaboradores Journal of the National Cáncer Institute 92(3):205-216 2000). Los criterios clínicos (criterios RECIST) para tal evaluación han sido promulgados por Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group, un grupo de expertos internacionales en cáncer. Los fármacos con un efecto demostrado en la carga del tumor, según lo mostrado por respuestas objetivas de acuerdo a criterios RECIST, en comparación al grupo de control apropiado tienden a, producir en última instancia, el beneficio directo del paciente. En la carga del tumor pre-clínicamente determinado es genralmente más contundente evaluar y documentar. En estos estudios pre-clínicos que pueden traducirse con la determinación clínica, los fármacos que producen supervivencia prolongada en modelos pre-clínicos tienen la utilidad clínica anticipada más grande. Análogo a la producción de respuestas positivas al tratamiento clínico, los fármacos reducen la carga del tumor en la determinación pre-clínica que puede también tener impacto directo significativo en la enfermedad. Aunque la prolongación de la supervivencia es más buscada después del resultado clínico del tratamiento del fármaco canceroso, hay otros beneficios que tienen utilidad clínica y está claro que la reducción de la carga del tumor, puede correlacionarse por retrasar la progresión de la enfermedad, supervivencia extendida o ambos, pueden también conducir a beneficios directos y tener impacto clínico (Eckhardt y colaboradores Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219).

Usando sustancialmente el proceso del documento 6,180,357, y según lo descrito en la Patente Norteamericana 6,657,048 y en el contenido de los documentos S.N. 10/348,231 y S.N. 60/642,057 cada uno de los cuales está incorporado en la presente por referencia, los anticuerpos monoclonales de ratón, 7BDI-58, 7BDI-60, H460-22-1 , 1A245.6 y 7BD-33-11A fueron obtenidos después de la inmunización de ratones con la biopsia de un tumor de pulmón de un paciente (H460-22-1) o de pecho (7BDI-58, 7BDI-60, 7BD-33-11A y 1A245.6). El antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A fue expresado en la superficie de la célula de una amplia gama de líneas celulares humanas de diferentes orígens del tejido. El antígeno 7BDI-58 y 7BDI-60 fue expresado en la superficie de la célula de las células cancerosas de pecho. La línea celular de cáncer de pecho MDA-MB-231 (MB-231) y la línea celular del melanoma A2058 fueron susceptibles al efecto citotóxico de H460-22-1 in vitro. La línea celular de cáncer de pecho MCF-7 y la línea celular de cáncer de próstata PC-3 fueron susceptibles a los efectos citotóxicos de 1A245.6 y 7BD-33-11A in vitro. La línea celular de cáncer de pecho Hs574.T fue suceptible hacia los efectos citotóxicos de 7BDI-58 y 7BDI-60 in vitro. El resultado de la citotoxicidad de H460-22-1 contra las células cancerosas de pecho en cultivo fue extendido por su actividad anti tumoralal hacia esta indicación de cáncer in vivo (según lo descrito en S.N. 11/321,624). En el modelo preventivo in vivo del cáncer de pecho humano, H460-22-1 fue dado a ratones un día antes de la implantación de las células tumorales seguidas por las inyecciones semanales durante un período de 7 semanas. El tratamiento H460-22-1 fue significativamente (p<0.0001) más eficaz en suprimir el crecimiento del tumor durante el período del tratamiento que un anticuerpo de control de isotipo. Al final de la fase del tratamiento, a los ratones dados H460-22-1 tuvieron tumores que crecieron únicamente 17.7 por ciento del grupo de control. Durante el período que siguió al post tratamiento, los efectos del tratamiento con H460-22-1 fueron sostenidos y el volumen promedio del tumor en el grupo tratado continuó siendo significativamente más pequeño que los controles hasta el final de la fase de medición. Usando la supervivencia como una medida eficaz del anticuerpo, el grupo de control alcanzó 50 por ciento de mortalidad entre el día 74-81 de la post-implantación. En contraste, el grupo tratado con H460-22-1 no había alcanzado 50 por ciento de mortalidad al momento de la terminación del estudio. Esta diferencia fue significativa entre H460-22-1 y el grupo tratato por el control de isotipo (p<0.0015). Estos datos demostraron que el tratamiento con H460-22-1 confirió un beneficio de supervivencia comparada al grupo de control tratado. El tratamiento de H460- 22-1 pareció seguro, pues no inducida ninguna señal de toxicidad, incluyendo la reducción del peso corporal y dificultades clínicas. Así, el tratamiento H460-22-1 fue eficaz como él retrasó del crecimiento del tumor y la supervivencia mejorada comparados al grupo de control tratado en un modelo bien establecido de cáncer de pecho humano. Estos resultados fueron también reproducibles ya que los hallazgos similares fueron observados en otro estudio de esta clase y sugiere su importancia y beneficio al tratamiento de la gente con cáncer. Además del modelo del tumor in vivo preventivo de cáncer de pecho, H460-22-1 demostró la actividad anti tumoral contra las células MB-231 en un modelo de tumor in vivo establecido (según lo descrito en S.N. 11/321,624). En este injerto del modelo de tumor, las células de cáncer de pecho MB-231 fueron trasplantadas subcutáneamente en ratones inmunodeficientes de modo que el tumor alcanzó un tamaño crítico antes del tratamiento del anticuerpo. El tratamiento con H460-22-1 fue comparado con el fármaco quimioterapéutico estándar, cisplatin, y fue mostrado que los grupos de tratamientode cisplatin y H460-22-1 tuvieron significativamente (p<0.001) volúmenes de tumor promedio más pequeños comparados con el grupo tratado con el anticuerpo de control de isotipo. El tratamiento H460-22-1 medió la supresión del tumor que fue de aproximadamente dos tercios de la quimioterapia de cisplatin pero sin la pérdida significativa de peso (p<0.003) y dificultades clínicas observadas con cisplatin. La actividad anti tumoral de H460-22-1 y su toxicidad mínima hacen de éste un agente terapéutico anticancerígeno atractivo. En el período post tratramiento, H460-22-1 mantuvo la supresión del tumor retrasando el crecimiento del tumor comparado al grupo del anticuerpo de control del isotipo. En 31 días post tratamiento, H460-22-1 limitó el tamaño del tumor reduciendo el crecimiento del tumor por 42 por ciento comparado al grupo de control de isotipo, que es comparable a la reducción del 48 por ciento observado al final del tratamiento. En el modelo de tumor de cáncer de pecho establecido, estos resultados indicaron el potencial de H460-22-1 para mantener la supresión del tumor más allá de la fase del tratamiento y demostró la capacidad del anticuerpo para reducir la carga del tumor y mejorar la supervivencia en un mamífero. El resultado de la citotoxicidad de 1A245.6 y 7BD-33-11A contra las células de cáncer del pecho y próstata en cultivo fue además extendido por su actividad anti tumoral hacia estas indicaciones del cáncer in vivo (según lo descrito en S.N. 10/348,231, S.N.10/891 ,866, S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810.751). 7BD-33-11A y 1A245.6 previno el crecimiento tumoral y la carga del tumor en un modelo in vivo preventivo MB-231 del cáncer de pecho humano. La supervisión continuó más allá de 300 días de post tratamiento. 7BD-33-11A nunca desarrolló tumores y 87.5 por ciento del grupo de tratamiento 7BD-33-11A todavía estuvo vivo aproximadamente 9 meses post implantación (uno de los ratones murió por causas no relacionadas al tumor).

Inversamente, el grupo de control del isotipo tuvo 100 por ciento de mortalidad por el día 72 (23 días post tratamiento). Los ratones tratados con IA245.6 alcanzaron 100 por ciento de mortalidad por el día 151 post tratamiento, que es mayor de 6 veces más largo que el grupo de tratamiento de control del isotipo. Por lo tanto 1A245.6, y en un mayor grado 7BD-33-11A mejoró la supervivencia y previno el crecimiento del tumor (retrasando así la progresión de la enfermedad) en un modelo de cáncer de pecho. 7BD-33-11A y 1A245.6 también suprimió significativamente el crecimiento del tumor y disminuyó la carga del tumor en un modelo in vivo establecido de cáncer de pecho humano. Por el día 80 (23 días post tratramiento), 7BD-33-11A trató ratones que tuvieron 83 por ciento promedio más bajo de volúmenes en comparación al grupo de control del isotipo (p = 0.001). El tratamiento 1A245.6 redujo los volúmenes promedio del tumor en este día aproximadamente 35 por ciento, sin embargo, la reducción no alcanzó la significación en este experimento (p = 0.135). Usando la supervivencia como una medida de eficacia del anticuerpo, fue estimado que el riesgo de morir en el grupo de tratamiento 7BD-33-11A fue aproxiamdamente de 16 por ciento del grupo de control del isotipo (p = 0.0006) en aproximadamente 60 días post tratramiento. 100 por ciento del grupo de control del isotipo murieron en 50 días post tratamiento. En comparación, 1 A245.6- trató ratones que sobrevieron hasta 100 días post tratamiento y 60 por ciento de los grupos de tratamiento 7BD-33-11A todavía se mantuvieron vivos en 130 días post tratramiento. Estos datos demostraron que el tratamiento de 1A245.6 y de 7BD-33-11A confirió un beneficio de supervivencia y redujeron la carga del tumor comparada al grupo de control tratado. El tratamiento 7BD-33-11A y 1A245.6 pareció seguro, ya que no inducida ninguna muestra de toxicidad, incluyendo peso corporal reducido y dificultades clínicas. Así, el tratamiento 7BD-33-11 A y 1A245.6 fue eficaz ya que ambos retrasaron el crecimiento del tumor y mejoraron la supervivencia comparados al grupo de control tratado en un modelo establecido de cáncer de pecho humano. En un estudio descrito en S.N. 10/810,751, cuyos contenidos están incorporados en la presente por referencia, el efecto de 7BD-33-11A comparado al tratamiento del fármaco quimioterapéutico (Cisplatin) solo o en combinación fue determinado en dos diferentes modelos establecidos del injerto de cáncer de pecho. En el modelo MB-231, en el día 83 (20 días después del tratamiento), el tratamiento de 7BD-33-11A resultó en una reducción del 83 por ciento en el crecimiento del tumor con relación a los animales de control tratados con amortiguador (p = 0.002). El tratamiento de cisplatin solo resultó en una reducción de 77 por ciento del tamaño del tumor con relación al o control, mientras que Cisplatin en combinación con 7BD-33-11A resultó en una reducción de 88 por ciento en el tamaño del tumor con relación al control (p = 0.006). En el modelo MDA-MB-468 (MB-468), en el día 62 (12 días después del tratamiento) la reducción más grande en el crecimiento del tumor (97 por ciento, p = 0.001) fue observada con el tratamiento de Cisplatin en combinación con el tratamiento de 7BD-33-11A. El tratamiento de Cisplatin solo produjo una disminución de 95 por ciento del crecimiento del tumor en comparación al amortiguador de control intermediario mientras que el tratamiento 7BD-33-11A solo mostró una reducción de 37 por ciento (p=0.046). En ambos modelos MB-231 y MB-468, el tratamiento con 7BD-33-11A condujo a un mayor bienestar del animal en comparación al tratamiento con Cisplatin según lo medido por el peso corporal. Estos resultados indicaron que el tratamiento de 7BD-33-11A tuvo mayor eficacia en comparación con el tratamiento de Cisplatin solo en el modelo MB-231 y fue mejor tolerado con pocos efectos adversos, tales como pérdida de peso, que Cisplatin en ambos modelos de cáncer de pecho. Para determinar los efectos del tratamiento de 7BD-33-11A en las varias dosis, un experimento de respuesta a la dosis fue realizado en un modelo de injerto de cáncer de pecho preventivo (según lo descrito en S.N. 10/810.751). En el día 55 (5 días después del tratamiento), el grupo de tratamiento de 0.2 mg/kg había reducido el crecimiento del tumor en 85 por ciento con relación al grupo de control de isotipo tratado. También en el día 55, los grupos del tratamiento de 2 y 20 mg/kg tuvieron todavía que desarrollar tumores. Los resultados similares fueron obtenidos más allá del día 125 (75 días después del tratamiento), donde el grupo de tratamiento de 20 mg/kg todavía no había desarrollado tumores y el grupo de tratamiento de 2 mg/kg tuvo cierto crecimiento inicial del tumor. El tratamiento 7BD-33-11A también demostró un beneficio de supervivencia. Todos los ratones del grupo de control de isotipo habían muerto por el día 104 (54 días después del tratamiento) mientras que el grupo de tratamiento de 7BD-33-11A de 0.2 mg/kg sobrevivieron hasta el día 197 (147 días después del tratamiento). Incluso los mayores benéficos de la supervivencia fueron observados con los grupos de tratamiento 7BD-33-11A de 2.0 y 20 mg/kg; únicamente 50 por ciento del grupo de tratamiento de 2.0 mg/kg habían muerto por el día 290 (240 días después del tratamiento) mientras que ninguno del grupo de tratamiento de 20 mg/kg había muerto por el día 290. Por lo tanto, el tratamiento de 7BD-33-11A mostró la reducción significativa del crecimiento del tumor y aumentó la supervivencia con todas las tres dosis con mayor grado de eficacia exhibida por la dosis más alta. En adición a los efectos beneficiosos en el modelo de tumor in vivo establecido de cáncer de pecho, el tratamiento 7BD-33-11A y 1A245.6 también tuvo actividad anti tumoral contra las células PC-3 en un modelo de cáncer de próstata in vivo preventivo (descrito en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, cuyo contenido de cada uno está incorporado en la presente por referencia). El tratamiento 7BD-33-11A y 1A245.6 fue significativamente (p = 0.001 y 0.017 respectivamente) más eficaz en suprimir el crecimiento del tumor poco después del período de tratamiento que un anticuerpo de control de isotipo. Al final de la fase del tratamiento, a los ratones dados 7BD-33-11A ó 1A245.6 tuvieron tumores que crecieron únicamente 31 y 50 por ciento del grupo de control de isotipo respectivamente. Para los modelos de injerto PC-3 SCID, el peso corporal puede utilizarse como un indicador sustituto de la progresión de la enfermedad. En el día 52, el tratamiento 7BD-33-11A y 1A245.6 (p=0.002 y 0.004 respectivamente) previneron la pérdida de peso corporal en 54 y 25 por ciento respectivamente en comparación al control de isotipo. Los ratones fueron supervisados por la supervivencia post tratamiento. En 11 días post tratamiento, los ratones de control de isotipo y amortiguador habían alcanzado 100 por ciento de mortalidad. Inversamente, 7BD-33-11A y 1A245.6 alcanzó 100 por ciento de mortalidad en el día 38 post tratamiento, 3 veces más largo que los grupos de control. Así, el tratamiento 7BD-33-11A y 1A245.6 fue eficaz ya que ambos retrasaron el crecimiento del tumor, previnieron la pérdida de peso corporal y supervivencia comparada al grupo de control de isotipo tratado en un modelo bien establecido de cáncer de próstata humano. Además del modelo de tumor de cáncer de próstata in vivo preventivo, 7BD-33-11A demostró la actividad anti tumoral contra las células PC-3 en un modelo de tumor in vivo establecido (descrito en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia). El tratamiento con 7BD-33-11A fue comparado nuevamente con el control de isotipo. Se mostró que el grupo de tratamiento 7BD-33-11 tuvo volúmenes promedio de tumor significativamente más pequeños (p<0.024) comparados con el grupo tratado de control de isotipo inmediatamente después del tratamiento. El tratamiento 7BD-33-11A midió la supresión del tumor en 36 por ciento comparados al grupo de control del isotipo. Además de los efectos beneficiosos en los modelos de tumor de cáncer de pecho y próstata in vivo, el tratamiento de 7BD-33-1 1A también tuvo actividad anti tumoral contra las células BxPC-3 en un modelo de cáncer pancreático in vivo preventivo (según lo descrito en S.N. 11/321,624). El tratamiento 7BD-33-11A fue considerablemente más efectivo en la supresión del crecimiento del tumor (71 por ciento, p = 0.0009) poco después del período del tratamiento que el control del amortiguador. En adición, el tratamiento con 7BD-33-11A confirió un beneficio en la supervivencia en comparación al grupo del tratamiento de control de amortiguador. En el grupo tratado con 7BD-33-11A, 40 por ciento de los ratones estuvieron aún con vida durante 2 semanas después de que todos los ratones del grupo de control de amortiguador habían muerto. Además de los efectos beneficiosos en los modelos de tumor de pecho, próstata y cáncer pancreático in vivo, el tratamiento 7BD-33-11A también tuvo una actividad anti tumoral contra las células A2058 y A375 en dos modelos de cáncer de melanoma in vivo preventivos separados (según lo descrito en S.N. 11/321, 624). En ambos modelos A2058 y A375, el tratamiento 7BD-33-1 1A fue considerablemente más eficaz en suprimir el crecimiento del tumor (72 por ciento, p = 0.011 y 63 por ciento, p = 0.0006 respectivamente) que el control de amortiguador. Las actividades anti tumorales de 7BD-33-11A en melanoma así como en el pecho, próstata y modelos de cáncer pancreático lo hacen un agente terapéutico anticancerígeno atractivo. En adición a los efectos beneficiosos demostrados en el modelo in vivo preventivo del melanoma humano, el tratamiento 7BD-33-11A también tuvo actividad anti tumoral contra las células A2058 y A375 en dos modelos de cáncer de melanoma in vivo establecidos por separado (según lo descrito en S.N. 11/321,624). El crecimiento del tumor fue inhibido significativamente en el tratamiento 7BD-33-11A y el 7BD-33-11A más el grupo de tratamiento de dacarbazina para el modelo A2058 y A375 respectivamente. En el modelo A2058, el volumen promedio del tumor fue de 30.87 % (p<0443) de la medida del grupo de control. En el modelo A375, el grupo de tratamiento de la combinación de 7BD-33-11 A/dacarbazina resulto en un medio TTE (tiempo para terminar) de 39.1 días, que corresponde a un 147 % de retraso significativo en el crecimiento del tumor (p<0.01). No se observaron muertes tóxicas en cualquier modelo. Por lo tanto, el tratamiento con 7BD-33-11A pareció seguro y ha exhibido eficacia en el tratamiento de pecho y ahora de los modelos in vivo de melanoma de cáncer humano establecido. Para determinar si la eficacia demostrada por 7BD-33-11A in vivo es debida por completo o en parte a la actividad de ADCC, la actividad anti tumoral de 7BD-33-11A fue medida contra las células MB-231 en un modelo establecido de tumor establecido en ratones SCID y NOD SCID. Los ratones NO D SCID son funcionalmente deficientes en la destrucción natural de células (NK) y carecen del complemento de circulación y de una población funcionalmente inmadura del macrófago mientras que los ratones SCID tienen ambos el complemento y actividad celular NK robusta. 7BD-33-11A es un anticuerpo monoclonal lgG2a murino y es por lo tanto capaz de la actividad de ADCC in vivo. La actividad anti tumoral de 7BD-33-11A fue comparada a un control de amortiguador y H460-22-1, un anticuerpo monoclonal murino de IgGI que no deberá exhibir su actividad a través de ADCC basado en su isotipo. El día 54 (4 días después del último tratamiento), en el grupo SCID tratado, 7BD-33-11A y H460-22-1 trataron tumores desarrollados en ratones que fueron únicamente 1.9 y 3.6 por ciento respectivamente del volumen promedio del tumor del control de amortiguador tratado en ratones. Inversamente, en el grupo tratado NOD SCID, otra vez el día 54 (4 días después del último tratamiento), los ratones tratados con 7BD-33-11A tuvieron el crecimiento del tumor que fue de 67 por ciento del volumen promedio del tumor de los ratones tratados del control de amortiguador. Los ratones tratados H460-22-1 exhibieron un efecto similar como en los ratones SCID; el crecimiento del tumor fue de 1.4 por ciento del volumen promedio del tumor de los ratones tratados del control de amortiguador. Por lo tanto, la actividad de 7BD-33-11A in vivo parece ser en parte debido a la actividad de ADCC mientras que el efecto anti tumoral de H460-22-1 parece ser independiente de ADCC. Para validar el epitope H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11 A como un fármaco marcado, la expresión de sus antígenos marcados en los tejidos humanos normales fue determinado. Según lo descrito parcialmente en el documento S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, cuyos contenidos están incorporados en la presente por referencia, el amortiguador 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 hacia los tejidos humanos normales fue determinado. Manchando el IHC, en la mayoría de los tejidos falló en expresar el antígeno 7BD-33-11A, que incluye los órganos vitales, tales como riñon, corazón, y pulmón. 7BD-33-11A manchó la glándula saivar, hígado, páncreas, estómago, próstata y duodeno, y manchó fuertemente la amígdala. Los resultados del tejido manchado indicaron que 7BD-33-11A mostró el enlace restringido a los varios tipos de célula pero tuvieron el enlace para infiltrar macrófagos, linfocitos, y fibroblastos. Para ambos H460-22-1 y 1A245.6, un amplio intervalo de tejidos fue manchado positivamente. Para la mayoría de los casos, el manchado fue restringido hacia el epitelio o macrófagos de infiltración, linfocitos, y fibroblastos. Sin embargo, el manchado positivo fue considerado en ambos músculo cardíaco y hepatocitos. 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 exhibió la membrana y patrones de manchado citoplásmicos. Según lo descrito en el documento S.N. 10/810.751, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia, 7BD-33-11A fue comparado con los anticuerpos anti-CD63 comercialmente disponibles (RFAC4 y H5C6). Los resultados de la mancha del tejido humano normal indicaron que 7BD-33-11A nuevamente mostró el enlace restringido a los varios tipos de célula pero tuvieron que enlazar a los macrófagos de infiltración, linfocitos, y fibroblastos. Los anticuerpos de RFAC4 y H5C6 mostraron un patrón de manchado similar en comparación uno a otro. Sin embargo, el patrón de manchado de RFAC4 y H5C6 fue absolutamente diferente al observado con 7BD-33-11A. Específicamente, los anticuerpos RFAC4 y H5C6 unidos a una gama más amplia de tejidos normales, tuvieron genralmente más alta la intensidad del manchado en los tejidos donde 7BD-33-11A también fue positivo y enlazado no únicamente a macrófagos, de infiltración de linfocitos y fibroblastos sino también al epitelio en una mayoría de tejidos. La localización del antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-1 1A y la determinación de su predominio dentro de la población, tal como entre pacientes de cáncer de pecho, son importantes en la evaluación del uso terapéutico de estos anticuerpos y diseño de pruebas clínicas eficaces. Para tratar la expresión del antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A en tumores de pecho de pacientes con cáncer, la muestras del tejido del tumor de 98 pacientes con cáncer de pecho individuales fueron detectados por la expresión del antígeno 7BD-33-11A (los resultados a partir de 50 pacientes se han descrito previamente en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, cuyos contenidos están incorporados en la presente por referencia) y las muestras del tejido del tumor de 50 pacientes fueron detectados por el antígeno 1A245.6 (descrito en S.N. 10/603,006, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia) y H460-22-1 (descrito en S.N. 11/321,624, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia). Los resultados de estos estudios mostraron que 37 por ciento de las muestras del tejido se mancharon positivamente por el antígeno 7BD-33-11A. La expresión de 7BD-33-11A dentro de las muestras de pacientes apareció específica para las células cancerosas mientras que el manchado fue restringido a las células malignas. En adición, 7BD-33-11A manchó 0 de 20 muestras de tejido normal de pacientes con cáncer de pecho. Por otra parte, H460-22-1 y 1A245.6 mancharon 92 por ciento y 98 por ciento de la muestra del tejido de cáncer de pecho respectivamente. H460-22-1 y 1A245.6 también mancho 9 de 10 muestras de tejido normal de pacientes con cáncer de pecho. Sin embargo, este manchado fue genralmente mucho más débil que el observado con las muestras del tejido de cáncer de pecho y fue restringido genralmente a los fibroblastos de infiltración. La expresión del tumor de pecho del antígeno 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 apareció localizada en la membrana de la célula y el citoplasma de células malignas, haciendo al CD63 un objetivo atractivo para la terapia. Según lo descrito en S.N. 10/810,751, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia, 7BD-33-11A fue comparado con RFAC4 y H5C6 y a un anticuerpo anti-Her2 (c-erbB-2). Los resultados del estudio presente fueron similares a los resultados anteriores y mostrados que 36 por ciento de muestras del tejido del tumor mancharon positivo para el antígeno 7BD-33-11A mientras que 94 y 85 por ciento de tejidos de tumor de pecho fueron positivos para el epitope H5C6 y RFAC4 respectivamente. La expresión de 7BD-33-11A dentro de las muestras de pacientes pareció específica para las células canceroas mientras que el manchado fue restringido a las células malignas. En adición, 7BD-33-11A manchó 0 de 10 muestras de tejido normal de los pacientes con cáncer de pecho mientras que H5C6 y RFAC4 mancharon 7 de 8 muestras de tejido de pecho normal. En comparación a c-erbB-2, 7BD-33-11A mostró un perfil de manchado totalmente diferente donde la mitad de las muestras del tejido de tumor de pecho fueron positivas para el antígeno 7BD-33-11A para la expresión Her2 que indica que 7BD-33-11A marca una población paciente que no es servida por terapias existentes del anticuerpo. Hubo también diferencias en la intensidad del manchado entre las secciones del tejido del tumor de pecho que fueron positivas para 7BD-33-11A y Her2. El anticuerpo c-erbB- 2 también manchó positivamente una de las secciones normales del tejido de pecho. Según lo descrito en S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 y S.N. 11/321,624, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia, las expresiones 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 fueron además evaluadas basadas en la expresión del tumor de pecho de los receptores para las hormonas de estrógeno y progesterona, que desempeñan un papel importante en el desarrollo, tratamiento, y pronóstico de los tumores de pecho. No hay correlación evidente entre la expresión del antígeno 1A245.6 y la expresión de los receptores para el estrógeno o progesterona. Hubo una ligera correlación entre la ausencia de los receptores de estrógeno y la presencia de la expresión del antígeno 7BD-33-11A y los receptores de progesterona y la presencia de ambos receptores de estrógeno y progesterona y de la expresión de antígeno H460-22-1. Cuando los tumores fueron analizados basados en su etapa, o grado avanzado de cáncer, los resultados sugirieron una tendencia hacia la expresión positiva más grande con una etapa más alta del tumor 7BD-33-11A y H460-22-1. Los resultados similares que fueron obtenidos con RFAC4. H5C6 también mostraron una muy ligera correlación con el receptor de la expresión de estrógeno o progesterona pero no hubo correlación evidente con la etapa del tumor, sin embargo, las conclusiones fueron limitadas por el tamaño pequeño de la muestra. La localización del antígeno 7BD-33-11A y de su predominio dentro de los pacientes con cáncer de próstata es importante en la evaluación de los beneficios de la inmunoterapia de 7BD-33-11A para los pacientes con cáncer de próstata y el diseño efectivo de las pruebas clínicas eficaces. Para tratar la expresión del antígeno 7BD-33-11A en tumores de próstata de pacientes con cáncer, las muestras del tejido del tumor de 51 pacientes con cáncer de próstata individuales fueron detectadas por la expresión del antígeno 7BD-33-11A (según lo descrito en S.N. 10/810,751, cuyo contenido está incorporado en la presente por referencia). Los resultados del estudio mostraron que 88 por ciento de las muestras del tejido mancharon positivo por el antígeno de 7BD-33-1 1A. Aunque 7BD-33-11A manchó las secciones normales del tejido así como con alta intensidad, hubo un grado más alto del manchado membranoso en las muestras del tejido del tumor en comparación a las muestras normales. Hubo una muestra embrional de la muestra del tejido rabdomiosarcoma que no se manchó por el antígeno 7BD-33-11A. En el tamaño pequeño de la muestra probada no pareció estar en una correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno 7BD-33-11 A. La localización del antígeno de 7BD-33-11A y su predominio dentro de pacientes con cáncer de melanoma son importantes en la evaluación de los beneficios de la inmunoterapia de 7BD-33-11A para los pacientes con melanoma y diseño de ensayos clínicos eficaces. Para atender la expresión del antígeno 7BD-33-11 A en tumores de melanoma de pacientes con cáncer, las muestras del tejido del tumor de 39 pacientes con melanoma individuales fueron detectados por la expresión del antígeno 7BD-33-11A (según lo descrito en S.N. 11/321.624). Los resultados del estudio mostraron que 90 por ciento de muestras del tejido mancharon positivo por el antígeno 7BD-33-11A. En esta muestra pequeña, también allí no apareció estar en correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno de 7BD-33-11A. Para extender adicionalmente el beneficio de 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6, la frecuencia y localización del antígeno dentro de varios tejidos de cáncer humano también fueron determinados (descrito en S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 y S.N. 11/321,624, cuyo contenido está incorpaorado en la presente por referencia). Varios tipos de cáncer, además del cáncer de pecho y próstata, expresó el antígeno 7BD-33-11A. El cáncer humano positivo mecanografío la piel incluida (1/2), pulmón (3/4), hígado (2/3), estómago (4/5), tiroides (2/2), útero (4/4) y riñon (3/3). Algunos cánceres no expresaron el antígeno; éstos incluyeron el ovario (0/3), testis (0/1), cerebro (0/2) y nodo linfático (0/2). Para H460-22-1 y 1A245.6, como con el conjunto de tejidos normales humanos, una multiplicidad de cánceres de varios tipos de tejido humano fue manchada positivamente. El manchado mayor fue considerado en las células malignas de la piel, pulmón, hígado, útero, riñon, estómago y vejiga. Como con el tejido canceroso de pecho, próstata y melanoma, la localización de 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 ocurrió en la membrana y dentro del citoplasma de estas células tumorales. Por lo tanto, además del anticuerpo H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A que enlaza a las líneas celulares del cáncer in vitro, hay evidencia de que el antígeno es expresado en humanos, y en múltiples tipos de cánceres. Según lo descrito en S.N. 10/810.751, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia, para 7BD-33-11A y en S.N. 11/321,624 para 1A245.6 y H460-22-1, los datos bioquímicos también indican que el antígeno reconocido por H460-22-1, 1 A245.6 y 7BD-33-11A es CD63. Esto es soportado por estudios que muestran que el anticuerpo monoclonal RFAC4, reactivo contra CD63, identifica las proteínas que unen a 7BD-33-11A, H460-22-1 ó 1A245.6 por inmunoprecipitación . Además, los estudios bacterianos de expresión aclararon el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A unido al bucle extracelular 2 de CD63. El epitope 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 también fue distinguido por ser conformación dependiente. Estos resultados bioquímicos e IHC demuestran que H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A enlazan al antígeno CD63. Así, la preponderancia de la evidencia muestra que H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A median los efectos anticancerígenos a través de la ligadura del epitope (s) único conformacional presente en CD63. Para el propósito de esta invención, el epitope está definido como una "fracción antigénica CD63" caracterizado por su capacidad de unirse con un anticuerpo monoclonal codificado por los fragmentos que enlazan al antigénico 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1 en la línea celular del hibridoma del mismo, o conjugaciones del anticuerpo del mismo. En toto, estos datos demuestran que el antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A es un antígeno asociado al cáncer y está expresado en humanos, y son un objetivo patológicamente relevante del cáncer. Además, estos datos también demuestran el enlace del anticuerpo de H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A a tejidos cancerosos humanos, y pueden utilizarse apropiadamente por ensayos que pueden ser diagnóstico, predicción de terapia, o pronóstico. Además, la localización de la membrana celular de este antígeno es indicativa del estado del cáncer de la célula debido a la poca frecuencia relativa de la expresión del antígeno en la mayoría de las células no malignas, y esta observación permite el uso de este antígeno, su gen o derivados, su proteína o sus variantes que son utilizados por los ensayos que pueden ser diagnóstico, predicción de terapia, o pronóstico. La presente invención describe el desarrollo y uso de H460-22-1, 7BD-33-11A y 1A245.6, desarrollados por el proceso descrito en la Patente Norteamericana 6,180,357 e identificados por, su efecto, y un ensayos citotóxico, en el crecimiento del tumor no establecido y establecido en modelos de animales y en prolongar el tiempo de supervivencia en los que sufren de la enfermedad cancerosa. En adición, la presente invención describe el desarrollo de dos versiones humanizadas de 7BD-33-11A, una de las cuales exhibe la citotoxicidad similar en un modelo de animal profiláctico. La presente invención también describe el desarrollo y uso de los anticuerpos monoclonales del ratón AR51A994.1, 7BDI-58 y 7BDI-60. Esta invención representa un avance en el campo del tratamiento del cáncer en que describe los reactivos que se unen específicamente a un epitope o epitopes presentes en la molécula marcada, CD63, y que también tienen propiedades citotóxicas in vitro contra las células malignas del tumor pero no células normales, y que también median directamente la inhibición del crecimiento del tumor y la extensión de la supervivencia en modelos in vivo del cáncer humano. Esto es un avance en relación a cualquier otro anticuerpo anti-CD63 previamente descrito, ya que no se ha demostrado tener propiedades similares. También se proporciona un avance en el campo ya que se muestra claramente la implicación directa de CD63 en los eventos asociados al crecimiento y desarrollo de ciertos tipos de tumores. También representa un avance en terapia de cáncer puesto que tiene el potencial para exhibir propiedades anticancerígenas similares en pacientes humanos. Otro avance es que la inclusión de estos anticuerpos en una biblioteca de anticuerpos anticancerígenos mejorará la posibilidad de marcar tumores que expresan diferentes marcadores de antígeno por la determinación de la combinación apropiada de diferentes anticuerpos anticancerígenos, para encontrar el más eficaz en el marcado e inhibición de crecimiento y desarrollo de los tumores. En todos, esta invención enseña el uso del antígeno 7BD-33-11A como un objetivo para un agente terapéutico, que cuando es administrado puede reducir la carga del tumor de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero, y puede también conducir a una supervivencia prolongada del mamífero tratado. Por consiguiente, es un objetivo de la invención utilizar un método para producir anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa (CDMAB) elevados contra las células cancerosas derivadas de un individuo particular, o una o más líneas celulares particulares del cáncer, cuyos CDMAB son citotóxicos con respecto a las células cancerosas mientras que de forma simultánea son relativamente no tóxicos para las células no cancerosas, para aislar líneas celulares del hibridoma y los anticuerpos monoclonales aislados correspondientes y fragmentos que enlazan al antígeno del mismo para cuyas líneas celulares del hibridoma son codificadas. Es un objetivo adicional de la invención enseñar anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa, ligándoos y fragmentos que enlazan al antígeno del mismo. Es otro objetivo de la presente invención producir los anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa cuya citotoxicidad es mediada a través de la toxicidad celular dependiente del anticuerpo. Es aún un objetivo adicional de la presente invención producir los anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa cuya citotoxicidad es mediada a través de la toxicidad celular dependiente del complemento. Sigue siendo un objetivo de la presente invención producir anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa cuya citotoxicidad es una función de su capacidad para catalizar la hidrólisis de enlaces químicos celulares. Un objetivo adicional de la presente invención es producir los anticuerpos que modifican la enfermedad cancerosa y ligándoos que son útiles en un ensayo de enlace para el diagnóstico, pronóstico, y supervisión del cáncer. Otros objetos y ventajas de esta invención llegarán a ser evidentes de la siguiente descripción en donde se establecen, a modo de ilustración y ejemplo, ciertas modalidades de esta invención.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 compara la citotoxicidad del porcentaje y los niveles de enlace de los supernadantes del hibridoma contra las líneas celulares OCC-1, OVAR-3 y CCD-27sk. La figura 2 es una comparación de AR51A994.1 contra los controles positivos y negativos en un ensayo de citotoxicidad. La figura 3 representa el enlace de AR51A994.1 y el control anti-EGFR hacia el cáncer y las líneas celulares normales. Los datos son tabulados para presentar la intensidad del medio de fluorescencia como un doble aumento sobre el control del isotipo.

La figura 4 incluye histogramas FACS representativos de los anticuerpos AR51A994.1 y anti-EGFR dirigidos contra varias líneas celulares no cancerosas y cancerosas. La figura 5 es una comparación de 7BDI-58 y 7BDI-60 contra los controles positivos y negativos en un ensayo de citotoxicidad.

La figura 6 representa el enlace del control de 7BDI-58, 7BDI-60 y anti-Her2 hacia las líneas celulares normales y cacerosas. Los datos son tabulados para presentar la intensidad del medio de fluorescencia como un doble aumento sobre el control de isotipo. La figura 7 incluye histogramas FACS representativos de los anticuerpos 7BDI-58, 7BDI-60 y anti-Her2 dirigidos contra varias líneas celulares cancerosas y no cancerosas. La figura 8 demuestra el efecto de 7BDI-58 en el crecimiento del tumor en un modelo profiláctico del cáncer de pecho MDA-MB- 231. Las líneas discontinuas verticales indican el período durante el cual el anticuerpo fue administrado. Los puntos de referencias representan el medio +/-SEM. La figura 9 demuestra el efecto de 7BDI-58 en el peso corporal en un modelo profiláctico del cáncer de pecho MDA-MB-231. Los puntos de referencias representan el medio +/-SEM. Figura 10. Las muestras Western blot obtenidas de la fracción total de la membrana de las células MDA-MB-231 (línea 1) y de los lisatos de la célula entera de PC-3 (línea 2) y de las líneas celulares CCD-27sk (línea 3). Las transferencias fueron probadas con 7BDI-58, 7BD1-60, AR51A994.1, 7BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1 según lo descrito arriba. Figura 11. I nmunocomplejo preparado por inmunoprecipitación con 7BD-33-11A de la fracción de la membrana total de la línea celular MDA-MB-231. Las líneas individuales de la transferencia fueron probadas con 7BDI-58 (línea 1), AR51A994.1 (línea 2), 7BD-33-11A (línea 3) y con los anticuerpos del control de isotipo (líneas 4 y 5). Figura 12. I nmunocomplejo preparado por la inmunoprecipitación con 1A245.6 de la fracción de la membrana total de la línea celular carcinoma pancreática humana ASPC-I. La replica de las líneas de transferencia fueron probadas con 7BDI-60 (línea 1), 1A245.6 (línea 2), anti-CD63 clon H5C6 (línea 3) y con un anticuerpo de control de isotipo (línea 4). Figura 13. Constructor GST-EC2(CD63) de fusión recombinante humana de Westrn blot. Las líneaes individuales de transferencia fueron probadas con 7BDI-58 (línea 1), 7BDI-60 (línea 2), AR51A994.1 (línea 3), 7BD-33-11A (línea 4), H460-22-1 (línea 5), 1A245.6 (línea 6) y con controles negativos H460-16-2 (anti-CD44; línea 7) y anticuerpos de control de isotipo (líneas 8 y 9). La figura 14 es un resumen de 7BD-33-11A que enlaza en un tumor pancreático humano y un tejido normal en micromatrices. Figura 15. Micrográfos representativos que muestran el patrón de enlace en el tejido del tumor peincreatic obtenido con 7BD-33-11A (A) o el anticuerpo de control de isotipo (B) y un tejido pancreático no neoplástico obtenido con 7BD-33-11A (C) o el anticuerpo de control de isotipo (D) de un tejido humano en micromatrices. 7BD-33-11A exhibió el manchado positivo fuerte para las células tumorales y el manchado débil-moderado en el tejido normal. La ampliación es 200X. Figure 16. Actividad citotóxica in vitro, de las células efectoras de ratón contra las células de cáncer de pecho humano, elicitadas por 7BD-33-11A. Células MDA-MB-231 etiquetadas de 51Cr- fueron incubadas con células efectoras esplénicas de ratón (a) no adherentes y adherentes (b) en presencia de concentraciones que varían de 7BD-33-11A o del control de isotipo. Figura 17. Resumen del número de macrófagos de los injertos MDA-MB-231 después de varios regímenes de dosificación con 7BD-33-11A o control de amortiguador. Figura 18. Secuencia de los aminoácidos N-terminal del anticuerpo 7BD-33-11A. Figura 19, secuencia de ADNc para la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de 7EJD-33-11A (SEC ID NO.:1). Se muestra la secuencia del aminoácido deducido debajo de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:2). La secuencia del de la señal del péptido está en itálica. Los CDRs están subrayados (nomenclatura Kabat). La cadena ligera madura comienza con un residuo de asparragina (subrayado doble y en negrilla). Figura 20. Secuencia de ADNc para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 7BD-33-11A (SEC ID NO:3). Se muestra la secuencia del aminoácido deducido debajo de la secuencia de nucleótido (SEC ID NO:4). La secuencia de la señal del péptido está en itálica. Los CDRs están subrayados (nomenclatura Kabat). La cadena pesada madura comienza con un residuo de ácido glutámico (subrayada doble y en negrilla). Figura 21. Alineación de las secuencias del aminoácido de la región VL. Las secuencias del aminoácido de las regiones VL de 7BD-33-11A (Mu33-1 IA) y (hu)AR7BD-33-11 A (Hu33-11A), y el aceptador humano 1LVE y JK2 se muestran en un solo código de letra. Las secuencias de CDR (nomenclatura Kabat) están subrayadas en la secuencia 7BD-33-11A VL. Las secuencias de CDR en el segmento VL humano están omitidas en la figura. El único aminoácido subrayado en la secuencia VL (hu)AR7BD-33-11 A se predice para hacer contacto con las secuencias de CDR, y por lo tanto han sido sustituidos con el residuo del ratón correspondiente. Las secuencias descritas, como se leen desde arriba, son los residuos del aminoácido 21-50 de la SEC ID NO:2; residuos del aminoácido 22-52 de la SEC ID NO:6; SEC ID NO:62; residuos del aminoácido de la 51-80 SEC ID NO:2; residuos del aminoácido 53-82 de la SEC ID NO:6; residuos del aminoácido 63-77 de la SEC ID NO:6; residuos del aminoácido 81-110 de la SEC ID NO:2; residuos del aminoácido 83-112 de la SEC ID NO:6; residuos del aminoácido 85-112 de la SEC ID NO:6; residuos del aminoácido 111-132 de la SEC ID NO:2; residuos del aminoácido 113-134 de la SEC ID NO:6; residuos del aminoácido 113-116 de la SEC ID NO:6 y residuos del aminoácido 125-134 de la SEC ID NO:6. Figura 22. Alineación de las secuencias del aminoácido de la región VH. Las secuencias del aminoácido de las regiones de VH de 7BD-33-11A (Mu33-11 A), (hu)AR7BD-33-11 A (Hu33-11A), (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L) y el aceptador humano AAR32409 y JH6 se muestran en un solo código de letra. Las secuencias de CDR (nomenclatura Kabat) están subrayadas en la secuencia de 7BD-33-11A VH. Las secuencias de CDR en el segmento VH humano son omitidas en la figura. Los únicos aminoácidos subrayados en la secuencia VH (hu)AR7BD-33-11 A y (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L) se predicen para hacer contacto con las secuencias CDR, y por lo tanto han sido sustituidos con los residuos del ratón correspondiente. Los aminoácidos subrayados dobles han sido sustituidos con residuos humanos del consenso para reducir la inmunogenticidad potencial. Las secuencias se describieron, según lo leído desde arriba, residuos de aminoácido 20-49 de la SEC ID NO:4; residuos del aminoácido 20-49 SEC ID NO:8; residuos del aminoácido 20-49 de la SEC ID NO:12; SEC ID NO:63; residuos del aminoácido 50-79 de la SEC ID NO:4; residuos del aminoácido 50-79 de la SEC ID NO:8; residuos del aminoácido 50-79 de la SEC ID NO:12; SEC ID NO:64; residuos del aminoácido 80-109 de la SEC ID NO:4; residuos del aminoácido 80-109 de la SEC ID NO:8; residuos del aminoácido 80-109 de la SEC ID NO:12; SEC ID NO:65; residuos del aminoácido 110-138 de la SEC ID NO:4; residuos del aminoácido 110-138 de la SEC ID NO:8; residuos del aminoácido 110-138 de la SEC ID NO:12; SEC ID NO:66 y residuos del aminoácido 128-138 de la SEC ID NO:8 y 12. Figura 23. Secuencia de nucleótido (SEC ID NO:5) y secuencia del aminoácido deducido (SEC ID NO:6) de la región variable de cadena ligera de (hu)AR7BD-33-11 A en el mini exón. La secuencia de la señal del péptido está en itálica. Se subrayan los CDRs (nomenclatura Kabat). La cadena ligera madura comienza con un residuo de ácido aspártico (subrayado doble y en negrilla). La secuencia es flanqueada por los sitios únicos de Mlul (ACGCGT) y Xbal (TCTAGA). Figura 24. Secuencia del nucleótido (SEC ID NO:7) y secuencia del aminoácido deducido (SEC ID NO:8) de la región variable de cadena pesada de (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L) en el mini exón. La secuencia de la señal del péptido está en itálica. Se subrayan los CDRs (nomenclatura Kabat). La cadena pesada madura comienza con un residuo de ácido glutámico (subrayado doble y en negrilla). La secuencia mostrada es flanqueada por los sitios únicos de Mlul (ACGCGT) y Xbal (TCTAGA). Figura 25. Cebadores usados para la construcción del gen 7BD-33-11A VL. Las secuencias descritas, según lo leído arriba, son las SEC ID NOS:21-39. Figura 26. Cebadores usados para la construcción del gen 7BD-33-11A VH. Las secuencias descritas, según lo leído arriba, son las SEC ID NOS:40-61. Figura 27. Esquema para la síntesis de (hu)AR7BD-33-11 A VL o VH mini-exones. Una serie de oligonucleótidos traslapados 20 (para VL) o 22 (para VH; según lo ilustrado en la figura) fueron utilizados. Los oligonucleótidos 1-20 (para VL) o 1-22 (para VH) fueron recocidos y extendidos con la polimerasa Pfu Turbo. El gen V doblemente filamentado acoplado fue amplificado por los oligonucleótidos que flanquen 5' y 3' para rendir los fragmentos del gen VL y VH, que fueron gel purificado, digerido con Mlul y Xbal, y subclonado en los vectores pVk y pVgl.D.Tt o pVg2M3.D.T., respectivamente. Figura 28. Resumen de los experimentos de competición FACS.

Figura 29. Esquema para genrar mutantes VH en una solo sustitución de aminoácido por mutagénesis dirigida al sitio. Dos redondeos separados de PCR fueron realizados. En el primer redondeo de PCR, dos fragmentos del gen VH parciales fueron amplificados. Estos dos fragmentos fueron además amplificados juntos en el segundo redondeo de PCR, para genrar un fragmento del gen completo VH integrado con una sola sustitución del aminoácido. El gen VH con la mutación deseada fue subclonado en pVgl.D.Tt y pVg2M3.D.T usando los sitios de Mlul y Xbal que flanquen. Figura 30. Constructors del plasmido para la expresión de anticuerpos (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L). Los genes VL y VH fueron construidos como mini-exones flanqueados por sitios Mlul y Xbal. Las regiones V fueron incorporadas en los vectores de expresión correspondientes. Figura 31. ADNc de cadena ligera kapa (hu)AR7BD-33-11 A (SEC ID NO:9) y secuencia traducida de aminoácido (SEC ID NO: 10). Los aminoácidos se muestran en un solo código de letra; el punto (·) indica el codon de la terminación de la traducción. El primer aminoácido de la cadena ligera madura está subrayado doble y en negrilla, precedido por su secuencia de señal de péptido. Figura 32, ADNc de cadena pesada yl (hu)AR7BD-33-11 A (SEC ID NO:11) y secuencia traducida del aminoácido (SEC ID NO:12). Los aminoácidos se muestran en un solo código de letra; el punto (·) indica el codon de la terminación de la traducción. El primer aminoácido de la cadena pesada madura está subrayado doble y en negrilla, precedido por su secuencia de la señal del péptido. Figura 33, ADNc de cadena pesada ?2?3 (hu)AR7BD-33-11 A (SEC ID NO:13) y secuencia traducida del aminoácido (SEC ID NO:14). Los aminoácidos se muestran en un solo código de letra; el punto (·) indica el codon de la terminación de la traducción. El primer aminoácido de la cadena pesada madura está subrayado doble y en negrilla, precedido por su secuencia de la señal del péptido. Figura 34. Análisis SDS-PAGE de 7BD-33-11A ( u33-1 1A), (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI (V11L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) bajo condiciones no reductoras y reductoras según lo descrito en el texto. Figura 35. Análisis HPLC de (A) (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11L) y (B) (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 (V11L) por cromatografía de exclusión de tamaño. Figura 36. Resumen de los experimentos de competición de FACS. Figura 37. Competición FACS para comparar la afinidad de enlace relativa a CD63 humano entre 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11L), y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L). El enlace de 7BD-33-11A etiquetado con FITC con células CD63+ PC-3 humanas fue analizado en presencia de diferentes cantidades del competidor 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11 L) o (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) según lo descrito en el texto. La figura 38 muestra el efecto del tratamiento con 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI, y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 en el crecimiento del tumor en un modelo del ratón de melanoma humano. El volumen del tumor es presentado como el medio del grupo ±SEM. Las líneas discontinuas verticales indican el primero y último día de dosificación. La figura 39 muestra el efecto del tratamiento con los anticuerpos monoclonales en peso corporal sobre la duración del estudio. Se presenta el peso corporal como el medio del grupo ± SEM. Figura 40. Afinidad de enlace del anti-CD63 7BD-33-11A, H460-22-1, 1A245.6, y de los anticuerpos humanizados (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3.

Constantes disociaciones para el enlace de los anticuerpos con el constructor de la proteína de fusión GST recombinante GST-EC" (CD63) fue valorada por la resonancia de plasmón superficial. Detallada Detallada de la Invención En genral, las siguientes palabras o frases tienen la definición indicada cuando es utilizada en el resumen, descripción, ejemplos, y reivindicaciones. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específico de cubrir, por ejemplo, solo anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos agonistas, antagonistas, y de neutralización, anticuerpos desinmunizados, murinos, quimerizados o humanizados), las composiciones del anticuerpo con especificidad poliepitópica, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de fragmentos e inmunoconjugados (ver abajo). El término "anticuerpo monoclonal" según lo utilizado en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de las mutaciones posibles que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste a las preparaciones del anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que pueden ser sintetizados incontaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya que es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe ser interpretado como que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que son utilizados de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el primer método (murino o humano) del hibridoma descrito por Kohler y colaboradores, Nature, 256:495 (1975), o puede ser por métodos recombinantes de ADN (véase, por ejemplo, U.S. Pat. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden también aislarse de bibliotecas fago de anticuerpo usando las técnicas descritas en Clackson y colaboradores, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol Biol, 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los "fragmentos del anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente que comprende el enlace del antígeno o la región variable del mismo. Los ejemplos de los fragmentos del anticuerpo incluyen menos que los anticuerpos integrados, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena; anticuerpos de una sola cadena, moléculas de anticuerpo de un solo dominio, proteínas de fusión, proteínas recombinantes y anticuerpos multiespecíficos formados del fragmento (s) del anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de enlace del antígeno así como un dominio constante de cadena ligero (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de la secuencia nativa humana) o variante de la secuencia del aminoácido del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Dependiendo en la secuencia del aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos pueden dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de la subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. El anticuerpo "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región de secuencia nativa Fe o región variable de Fe de la secuencia del aminoácido) de un anticuerpo. Los ejemplos de las funciones efectoras del anticuerpo incluyen el enlace Clq; citotoxicidad dependiente del complemento; enlace del receptor Fe; citotoxicidad mediada por las células dependientes del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; sub-regulación de los receptores de la superficie de la célula (por ejemplo receptor de la célula B; BCR), etc. La "citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por las células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fe (FcRs) (por ejemplo las células Destructoras Naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado en una célula marcada y causan posteriormente el lisis de la célula marcada. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan únicamente F CY R III, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FCYRII y FCYRIII. La expresión FcR en las células hematopoiéticas es resumido es la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, en un ensayo in vitro de ADCC, tal como lo descrito en la U.S. Pat. No. 5,500,362 ó 5,821, 337 pueden realizarse. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como es descrito en Clynes y colaboradores PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Las "células efectoras" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan las funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células destructoras naturales (NK), monocitos, células citotóxicas T y neutrófilos; con células PBMCs y NK que son preferidas. Las células efectoras pueden aislarse desde una fuente nativa de la misma, por ejemplo de la sangre o PBMCs según lo descrito en la presente. Los términos "receptor Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que enlaza a la región FE de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Más aún, un FcR preferido es uno que enlaza un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye los receptores las subclases FcyRI, FCYRII, y FcyRIII, que incluye variantes alélicos y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias similares del aminoácido que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos del mismo. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en el inmunoreceptor de tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor que inhibe FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en un inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico, (ver la revisión M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y colaboradores, Immunomethods 4:25-34 (1994); y Haas y colaboradores, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, que incluyen los que son identificados en el futuro, son comprendidos por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternal al feto (Guyer y colaboradores, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim y colaboradores, Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)). La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para Usar un objetivo en presencia del complemento. La trayectoria de la activación del complemento es iniciado por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) complejo con un antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo de CDC, por ejemplo según lo descrito en Gazzano-Santoro y colaboradores, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), puede realizarse. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en la secuencia entre anticuerpos y son utilizadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables en los dominios variables de cadena y pesada y de cadena ligera. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones estructurales (FRs). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando en gran parte una configuración de la hoja ß, conectada por tres regiones hipervariables, que forman los bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructra de la >hoja. Las regiones hipervariables en cada cadena están ligadas en proximidad cercana por el FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio que enlaza al antígeno de anticuerpos Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, sino exhiben varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). El término "región hipervariable" cuando es utilizado en la presente se refiere a los residuos del aminoácido de un anticuerpo que son responsables del enlace del antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácido de una "región de determinación complementaria" o " CDR" (por ejemplo residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable "(por ejemplo residuos 2632 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de la "Región Estructural" o "Fr" son los residuos de dominio variable con excepción de los residuos de la región hipervariable según lo definido en la presente. La digestión de la papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de enlace de antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de enlace de un solo antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina rinde un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace del antígeno y que es aún capaz de reticular al antígeno. "Fv" es el fragmento mínimo del anticuerpo que contiene un sitio de enlace de antígeno y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste en un dimero de una cadena pesada y de un dominio variable de cadena ligera en asociación no covalente, estrecha. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o mitad de un Fv que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y de enlazar el antígeno, aunque en una afinidad más baja que el sitio de enlace entero. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de ta cadena ligera y del primer dominio constante (CHI) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el termino carboxi del dominio de la cadena pesada CHI que incluyen una o más cisteinas de la región de la unión del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en el cuál los residuos de cisteína (s) de los dominios constantes llevan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 fueron originalmente producidos como pares de fragmentos de Fab' los cuales tienen unión de cisteinas entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos del anticuerpo también son conocidos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (a), basados en las secuencias del aminoácido de sus dominios constantes. Los fragmentos del anticuerpo "Fv de una sola cadena" o " scFv" comprenden los dominios del anticuerpo VH y VL, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende una ligadura de polipéptido entre los dominios H y VL que permiten a scFv formar la estructura deseada para el enlace del antígeno. Para una revisión de scFv Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag , New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antigeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena del polipéptido (VH-VL). Usando una ligadura que es demasiado corta para permitir aparearse entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos están más completamente descritos en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y colaboadores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son los materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado será preparado por lo menos en una etapa de purificación. Un anticuerpo "que enlaza" un antígeno de interés, por ejemplo la fracción antigénica CD63, es uno capaz de enlazar ese antígeno con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente terapéutico o de diagnóstico en marcar una célula que expresa el antígeno. Donde el anticuerpo es uno que enlaza a la fracción antigénica CD63 genralmente enlazará de forma preferente a la fracción antigénica CD63 en comparación a otros receptores, y no incluye el enlace incidental tal como el contacto FC no específico, o enlaza a las modificaciones post translación comunes a otros antígenos y puede ser uno que no reacciona significativamente al cruce con otras proteínas. Los métodos, para la detección de un anticuerpo que enlaza a un antígeno de interés, son bien conocidos en la técnica y pueden incluir pero no estar limitados a los ensayos tales como FACS, célula ELISA y Western Blot. Según lo utilizado en la presente, las expresiones "célula", " "línea célular" y "cultivo celular" se utilizan alternativamente, y todas estas designaciones incluyen la progenie. También se entiende que toda la progenie no puede ser exactamente idéntica en el contenido del ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie del mutante que tiene la misma función o actividad biológica según lo detectado en la célula originalmente transformada es incluida. Será claro del contexto en donde se desean las designaciones distintas. "Tratamiento" se refiere a ambos, tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas preventivas, en donde el objeto es prevenir o retrasar (disminuir) la condición o trastorno patológico marcado. Aquellos en la necesidad del tratamiento incluyen los ya con el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o a quienes el trastorno debe ser prevenido. Por lo tanto, el mamífero que será tratado en la presente pudo haber sido diagnosticado teniendo el trastorno o puede estar predispuesto o susceptible al trastorno. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que es caracterizada normalmente por el crecimiento o muerte celular no regulada. Los ejemplos del cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o desórdenes linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen el cáncer de célula escamosa (por ejemplo cáncer de célula escamosa epitelial), el cáncer de pulmón incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, gástrico o estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma glandular salival, cáncer renal o riñon, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, así como cáncer de cuello y cabeza. Un "agente quimioterapéutico" es un útil compuesto químico en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracil; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina, carnomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácidos folíeos tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactono; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido folico tal como ácido frolinico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrin; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; spirogermano; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Mayers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También en esta definición están incluidos los agentes anti hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de la hormona en tumores tales como anti estrógenos que incluyen por ejemplo tamoxifen, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-¡midazoles, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, biicalutamida, leuprolida, y goserelin; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. "Mamífero" para propósitos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye humanos, ratones, ratones SCID o desnudos o cepas de ratones, animales domésticos y de campo, y de zoológico, deportivos, o mascotas, tales como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero en la presente es humano. "Oligonucleótidos" son polideoxinucleótidos de doble filamento o sencillo, de larga longitud, que están químicamente sintetizados por métodos conocidos (tales como fosfotriéster, fosfito, o química de fosforamidito, usando técnicas de fase sólida tales como las descritas en el documento EP 266.032, publicado el 4 de mayo de 1988, o vía los intermediarios de H-fosfonato deoxinucleosido según lo descrito por Froehier y colaboradores Nucí. Acids Res., 14:5399-5407, 1986. Estos son purificados después en geles de poliacrilamida. A menos que se indique lo contrario, el término "fracción antigénica CD63" cuando es utilizado en la presente se refiere a la proteína de la membrana Tipo III de la familia de la tetraspanina también referida como antígeno del melanoma 1, antígeno asociado al melanoma ocular, antígeno ME491 asociado al melanoma, membrana glicoproteína 3 asociada al lisosoma, granulofisina, antígeno MLA1 asociado al melanoma. Los anticuerpos "quiméricos" son las inmunoglobulinas en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecen a una clase o subclase particular del anticuerpo, mientras que el resto de la cadena (s) es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (U.S.-Pat. No. 4,816,567 y Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)2 u otras subsecuencias de anticuerpos que enlazan al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) del anticuerpo receptor son sustituidos por los residuos de CDRs de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos de FR no humano correspondiente. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no son encontrados ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias importadas de CDR o FR. Estas modificaciones se hacen para refinar y para optimizar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En genral, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente a todos de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a las inmunoglobulinas no humanas y todos o sustancialmente todos los residuos FR son los de una secuencia humana del consenso de la inmunoglobulina. El anticuerpo óptimamente humanizado también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente de una inmunoglobulina humana.

Los anticuerpos "desinmunizados" son las inmunoglobulinas que no son inmunogenéticas, o menos inmunogénicas, a una especie dada. La desinmunización puede alcanzarse a través de alteraciones estructurales hacia el anticuerpo. Cualquier técnica de desinmunización conocida por los expertos en la técnica puede usarse. Una técnica conveniente para los anticuerpos de desinmunización se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/34317 publicado el 15 de junio, 2000. La "homología" es definida como el porcentaje de los residuos en la variante de la secuencia del aminoácido que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir cavidades, si es necesario, para alcanzar la máxima homología del por ciento. Los métodos y programas de computadora para la alineación son bien conocidos en la técnica. A través de la presente especificación, las líneas celulares del hibridoma, así como los anticuerpos monoclonales aislados que son producidos desde los mismos, son referidas alternativamente por su designación interna, 7BDI-58, 7BDI-60, 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, o AR51A994.1 o Designación Depositorío, IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06. Como es usado en la presente "ligandoo" incluye una fracción que exhibe la especificidad de enlace para un antígeno objetivo, y que puede ser una molécula intacta del anticuerpo y cualquier molécula que tiene por lo menos una región de enlace con el antígeno o porción de la misma (es decir, la porción variable de una molécula del anticuerpo), por ejemplo, una molécula Fv, molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab').sub.2, un anticuerpo biespecífico, una proteína de fusión, o cualquier molécula genéticamente diseñada la cual reconoce y enlaza específicamente la unión del antígeno por el anticuerpo monoclonal aislado producido por la línea celular del hibridoma designado como, IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06 (el antígeno IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06). Como es usado en la presente "la región que enlaza al antígeno" significa una porción de la molécula que reconoce el antígeno marcado. Según lo utilizado en la presente "inhibe competitivamente" significa que es capaz de reconocer y unir un sitio determinante al cual el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular del hibridoma designado como IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06, (el anticuerpo IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06) está dirigido usando ensayos de competición de anticuerpo recíprocos convencionales. (Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clínica Chimica Acta 48, 15). Según lo utilizado en la presente "antígeno marcado" es el antígeno IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06 o porciones del mismo. Según lo utilizado en la presente, un "inmunoconjugado" significa cualquier molécula o ligandoo tal como un anticuerpo químicamente o biológicamente ligado a una citotoxina, un agente radiactivo, enzima, toxina, a un fármaco antitumoral o a un agente terapéutico. El anticuerpo puede ligarse a la citotoxina, al agente radiactivo, al fármaco anti tumoral o al agente terapéutico en cualquier localización tanto como sea capaz de enlazar el objetivo. Los ejemplos de los inmunoconjugados incluyen conjugados químicos de la toxina del anticuerpo y proteínas de fusión de la toxina del anticuerpo. Según lo utilizado en la presente, una "proteína de fusión" significa cualquier proteína quimérica en donde una región de enlace del antígeno está conectada a una molécula biológicamente activa, por ejemplo, toxina, enzima, o fármaco de la proteína. Para poder entender más completamente la invención descrita en la presente, se establece la siguiente descripción. La presente invención proporciona ligándoos (es decir los ligándoos IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, IDAC 141205-06) que reconocen y enlazan específicamente al antígeno IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06. El ligandoo de la invención puede estar en cualquier forma siempre y cuando tenga una región que enlace al antígeno el cual inhibe competitivamente el enlace inmunoespecífico del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06 a su antígeno marcado. Así, cualquier proteína recombinante (por ejemplo, proteínas de fusión en donde el anticuerpo está combinado con una segunda proteína tal como un linfocina o un factor de crecimiento inhibitorio del tumor) que tiene la misma especificidad de enlace que la caída del anticuerpo IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06 dentro del alcance de esta invención. En una modalidad de la invención, el ligandoo es el anticuerpo IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06. En otras modalidades, el ligandoo es un fragmento que enlaza al antígeno el cual puede ser una molécula Fv (tal como una molécula Fv de una sola cadena), una molécula Fab, molécula Fab', molécula F(ab')2, una proteína de fusión, un anticuerpo biespecífico, un heteroanticuerpo o cualquier molécula recombinante que tiene la región de enlace del antígeno del anticuerpo IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06. El ligandoo de la invención está dirigido al epitope al cual está dirigido el anticuerpo monoclonal IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06. El ligandoo de la invención puede modificarse, es decir, por modificaciones del aminoácido dentro de la molécula, para producir las moléculas derivadas. La modificación química puede también ser posible. Las moléculas derivadas conservarían la propiedad funcional del polipéptido, es decir, la molécula que tiene tales sustituciones permitirá el enlace del polipéptido hacia el antígeno IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622, o IDAC 141205-06 o porciones del mismo.

Estas sustituciones de aminoácido incluyen, pero no se limitan necesariamente a, las sustituciones de aminoácido conocidas en la técnica como "conservador". Por ejemplo, es un principio bien establecido de la química de la proteína que ciertas sustituciones del aminoácido, tituladas "sustituciones conservadoras del aminoácido" pueden hacerse con frecuencia en una proteína sin alterar la conformación o la función de la proteína. Tales cambios incluyen sustituir cualquier isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspartico (D) para el ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparragina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones pueden también considerarse conservadoras, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su desempeño en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden con frecuencia ser intercambiables, al igual que alanina y valina (V). Metionina (M), que es relativamente hidrofóbica, puede intercambiarse con frecuencia con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. La Usina (K) y arginina (R) son con frecuencia intercambiables en localizaciones en donde la característica significativa del residuo del aminoácido es su carga y los pK's que difieren de estos dos residuos de aminoácido no son significativos. Todavía otros cambios pueden considerarse "conservadores" en ambientes particulares. En un anticuerpo dado, un experto en la técnica puede generar un ligandoo que inhiba competitivamente, por ejemplo un anticuerpo competente, que es uno que reconoce el mismo epitope (Belanger y colaboradores, 1973). Un método podría implicar la inmunización con un inmunogen que expresa el antígeno reconocido por el anticuerpo. La muestra puede incluir pero no está limitada al tejido, proteína (s) aislada o línea celular (s). Los hibridomas resultantes podrían detectarse usando un ensayo competente, que es uno que identifica los anticuerpos que inhiben el enlace del anticuerpo de prueba, tal como ELISA, FACS o inmuno-precipitación. Otro método podría hacer uso de bibliotecas que exhiben fago y titulación para anticuerpos que reconocen el antígeno (Rubinstein y colaboradores, 2003). En cualquier caso, los hibridomas serían seleccionados basados en su capacidad por competir el enlace del anticuerpo original en su antígeno marcado. Tales hibridomas por lo tanto poseerían la característica de reconocer el mismo antígeno como el anticuerpo original y más específicamente reconocería el mismo epitope. EJEMPLO 1 Producción de Hibridoma - Línea Celular de Hibridroma AR51A994.1 y 7BDI-58 Las líneas celulares del hibridoma 7BDI-58 y AR51A994.1 fueron depositadas, de acuerdo con el Budapest Treaty, con International Depository Authority of Canadá (IDAC), Bureau of Microbiology, Health Canadá, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá, R3E 3R2, el 14 de diciembre, 2005, bajo los Números de Acceso 141205-01 y 141205-06 respectivamente. De acuerdo con 37 CFR 1.808, los depositantes aseguran que todas las restricciones impuestas ante la disponibilidad al público de los materiales depositados serán retiradas irrevocablemente hasta el otorgamiento de una patente. El hibridoma que produce el anticuerpo anticancerígeno 7BDI-58 fue producido según lo descrito en S.N. 10/713,642. Para producir el hibridoma que produce el anticuerpo anticancerígeno AR51A994.1, una suspensión unicelular del tejido del tumor adenocarcinoma endometroide ovárico humano congelado (Genomics Collaborative, Cambridge, MA) fue preparada en PBS. IMMUNEASY™ (Qiagen, Venlo, Netherlands), el adyuvante fue preparado para uso por mezclado suave. Ratones BALB/c de cuatro a seis semanas de edad fueron inmunizados inyectándolos subcutáneamente 2 millones de células en 50 microlitros de adyuvante antígeno. El adyuvante antígeno recientemente preparado fue utilizado para estimular intraperitonealmente a los ratones inmunizados, 2 y 5 semanas después de la inmunización inicial, con aproximadamente 2 millones de células en 50-60 microlitros. Un bazo fue utilizado para la fusión tres días después de la última inmunización. Los hibridomas fueron preparados fusionando los esplenocitos aislados con patrones de mieloma NSO-I. Los supernadantes de las fusiones fueron probados de los subclones de los hibridomas.

Un ensayo de ELISA fue usado para determinar si los anticuerpos secretados por las células del hibridoma son del isotipo IgG u IgM. 100 microlitros/pozo de cabra anti-ratón IgG + IgM (H + L) en una concentración de 2.4 microgramos/mL en el amortiguador de recubrimiento (amortiguador de 0.1 M carbonato/bicarbonato, pH 9.2-9.6) a 4°C fueron agregados a las placas de ELISA durante la noche. Las placas fueron lavadas tres veces en amortiguador de lavado (PBS + 0.05 % Tween). 100 microlitros/pozo de amortiguador de bloqueo (5 % leche en amortiguador de lavado) fueron agregados a la placa durante 1 hora a temperatura ambiente y después lavados tres veces en amortiguador de lavado. 100 microlitros/pozo de supernadante de hibridoma fueron agregados y la placa incubada durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces con el amortiguador de lavado y dilución de 1/100,000 en ya sea el conjugado de peroxidasa de rábano picante IgM o de cabra antiratón IgG (diluidas en PBS que contiene 5 % de leche), 100 microlitros/pozo, fueron agregados. Después de incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente, la placa fue lavada tres veces con el amortiguador de lavado. 100 microlitros/pozo de la solución TMB fueron incubados durate 1-3 minutos a temperatura ambiente. La reacción de color fue terminada agregando 50 microlitros/pozo 2M H2S04 y la placa fue leída en 450 nm con un lector de placa Perkin-Elmer HTS7000. Según lo indicado en la figura 1, el hibridoma AR51A994.1 secretó principalmente anticuerpos del isotipo IgG. Para determinar la subclase del anticuerpo secretado por las células del hibridoma, un experimento de istotipo fue realizado usando un Kit de Isotipo de Anticuerpo Monoclonal de Ratón (HyCult Biotechnology, Frontstraat, Netherlands). 500 microlitros de solución del amortiguador fueron agregados a la tira de prueba que contenía anticuerpos específicos de la subclase de rata antiratón. 500 microlitros de supernadante de hibridoma fueron agregados al tubo de prueba, y sumergidos por agitación suave. Las inmunoglobulinas capturadas de ratón fueron detectadas directamente por un segundo anticuerpo monoclonal de rata que está acoplado a las partículas coloides. La combinación de estas dos proteínas crea una señal visual usada para analizar el isotipo. El anticuerpo anticancerígeno AR51 A994.1 es del isotipo kappa, IgGI. Después de un redondeo para limitar la dilución, los supernadantes de hibridoma fueron probados por los anticuerpos que enlazan a las células marcadas en un ensayo de ELISA. Dos líneas celulares cancerosas ováricas humanas, y 1 línea celular de piel normal humana fueron probadas: OCC-I, OVCAR-3 y CCD-27sk respectivamente. Las células en placas fueron fijadas antes de uso. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS que contiene MgCI2 y CaCI2 a temperatura ambiente. 100 microlitros de 2 % de paraformaldehído diluidos en PBS fueron agregados a cada pozo por 10 minutos a temperatura ambiente y después desechados. Las placas fueron lavadas nuevamente con PBS que contiene MgCI2 y CaCI2 tres veces a temperatura ambiente. El bloqueo fue hecho con 100 microlitros/pozo de 5 % de leche en amortiguador de lavado (PBS + 0.05 % Tween) por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces con el amortiguador de lavado y el supernadante de hibridoma fue agregado en 75 microlitros/pozo por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas 3 veces con el amortiguador de lavado y fueron agregados 100 microlitros/pozo de la dilución 1/25,000 del conjugado del anticuerpo de cabra anti-ratón IgG a peroxidasa de rábano picante (diluido en PBS que contiene 5 % de leche). Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente las placas fueron lavadas 3 veces con el amortiguador de lavado y 100 microlitros/pozo de sustrato de TMB fueron incubados por 1-3 minutos a temperatura ambiente. La reacción fue terminada con 50 microlitros/pozo de 2M H2S04 y la placa leída en 450 nm con un lector de placa Perkin-Elmer HTS7000. Los resultados según lo tabulado en la figura 1 fueron expresados como el número de veces de los antecedentes anteriores comparados al control de isotipo IgG interno que ha sido mostrado previamente para no enlazar a las líneas celulares probadas. Los anticuerpos del hibridoma AR51A994.1 mostraron el enlace con la línea celular de cáncer ovárico OVCAR-3 y con la línea celular de piel normal CCD-27sk. En conjunto con la prueba para el enlace del anticuerpo, el efecto citotóxico de los supernadantes de hibridoma fue probado en las líneas celulares: OCC-I, OVCAR-3 y CCD 27sk. Calceina AM fue obtenida de las Pruebas Moleculares (Eugen, O). Los ensayos fueron realizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante con los cambios delineados abajo. Las células fueron colocadas en placas antes del ensayo en la densidad apropiada predeterminada. Después de 2 días, 75 microlitros de supernadante de las placas microtitre de hibridoma fueron transferidos a las placas de la célula e incubados en una incubadora con C02 al 5 por ciento por 5 días. Los pozos sirvieron mientras que los controles positivos fueron aspirados hasta vaciarse y 100 microlitros de azida de sodio (NaN3) o cicloheximida fueron agregados. Después de 5 días de tratamiento, las placas fueron después vaciadas por inversión y transferencia de secado. La temperatura ambiente DPBS (Dulbecco salino amortiguado de fosfato) que contiene MgCI2 y CaCI2 fue dispensada en cada pozo de una botella de aplique de varios canales, golpeada ligeramente 3 veces, vaciada por inversión y después transferida por secado. Los 50 microlitros de tinte de calceina fluorescente diluido en DPBS que contiene MgCI2 y CaCI2 fueron agregados a cada pozo e incubados a 370°C en una incubadora con C02 al 5 % por 30 minutos. Las placas fueron leídas en un lector de placa de fluorescencia Perkin-Elmer HTS7000 y los datos fueron analizados en Microsoft Excel. Los resultados fueron tabulados en la figura 1. El supernadante del hibridoma AR51A994.1 produjo la citotoxicidad específica de 14 por ciento y 10 por ciento en las células OCC-1 y OVCAR-3 respectivamente. En OCC-1, éste fue de 16 y 15 por ciento de citotoxicidad obtenida con los controles positivos de azida de sodio y cicloheximida, respectivamente. En OVCAR-3, éste fue de 22 por ciento de citotoxicidad obtenida con el control positivo de cicloheximida. Los resultados de la figura 1 demostraron que los efectos citotóxicos de AR51A994.1 no fueron proporcionales a los niveles de enlace en los tipos de células cancerosas. Hubo un mayor nivel de citotoxicidad producido en las células OCC-1 con respecto a las células OVCAR-3, aunque el nivel de enlace en las células OVCAR-3 fue más alto. Según lo tabulado en la figura 1, AR51A994.1 no produjo citotoxicidad en la línea celular normal CCD-27sk. Los agentes citotóxicos no conocidos específicamente cicloheximida y NaN3 produjeron genralmente citotoxicidad según lo esperado. EJEMPLO 2 Producción del Anticuerpo Los anticuerpos monoclonales AR51A994.1, 7BDI-58 y 7BDI-60 fueron producidos cultivando los hibridomas en los matraces CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON) con colecciones y replanteamiento que ocurren dos veces/semana. El anticuerpo fue purificado de acuerdo a procedimientos estándares de purificación del anticuerpo con la Proteína G Sefarosa 4 de Flujo Rápido (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC). Está dentro del alcance de esta invención utilizar anticuerpos monoclonales que son desinmunizados, humanizados, quimerizados o murinos.

El anticuerpo AR51A994.1 fue comparado a un número de ambos positivos (anti-EGFR (C225, IgGI, kappa, 5 mícrogramos/mL, Cedarlane, Hornby, ON), Cicloheximida (100 micromolar, Sigma, Oakville, ON), NaN3 (0.1 %, Sigma, Oakville, ON)) y negativo (107.3 (anti-TNP, IgGI, kappa, 20 microgramos/mL, BD Biosciences, Oakville, ON), y 1 B7.11 (anti-TNP), IgGI, kappa, 20 microgramos/mL internos purificados)), así como un control del diluyente del amortiguador en un ensayo de citotoxicidad (Figura 2). El cáncer pancreático (BxPC-3), cáncer ovárico (OCC-1 y OVCAR-3) y líneas celulares no cancerosas (CCD-27sk, Hs888.Lu) fueron probados (todos de ATCC, Manassas, VA). La calceina fue obtenida de las Sondas Moleculares (Eugen, OR). Los ensayos fueron realizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante con los cambios delineados abajo. Las células fueron colocadas en placas antes del ensayo en la densidad apropiada predeterminada. Después de 2 días, 100 microlitros de anticuerpo purificado o controles fueron diluidos en el medio, y después transferidos a las placas de la célula e incubados en una incubadora con C02 al 5 por ciento durante 5 días. Las placas después fueron vaciadas por inversión o transferencia por secado. La temperatura ambiente DPBS que contiene MgCI2 y CaCI2 fue dispensada en cada pozo desde una botella de aplique, golpeada ligeramente 3 veces, vaciada por inversión y después transferida por secado. 50 µ? de tinte de calceina fluorescente diluido en DPBS que contiene MgCI2 y CaCI2 fueron agregados a cada pozo e incubados a 37°C en una incubadora con C02 al 5 por ciento por 30 minutos. Las placas fueron leídas en un lector de placa de fluorescencia Perkin-Elmer HTS7000 y los datos fueron analizados en Microsoft Excel y los resultados fueron tabulados en la figura 2. Cada anticuerpo recibió una puntuación entre 5 y 50 basados en la citotoxicidad promedio observada en cuatro experimentos probados en triplicado, y una puntuación entre 25 y 100 basados en la variabilidad observada entre los ensayos. La suma de estas dos puntuaciones (la puntuación de citotoxicidad) es presentada en la figura 2. Una puntuación de citotoxicidad mayor que o igual a 55 fue considerada por ser positiva en la línea celular probada. El anticuerpo AR51A994.1 produjo la citotoxicidad específica en la línea celular cancerosa ovárica OVCAR-3 y la línea celular cancerosa pancreática BxPC-3 con relación a controles negativos de isotipo y del amortiguador. Esto es consistente con los datos del supernadante de hibridoma del clon AR51A994.1, que también mostraron citotoxicidad específica contra la línea celular OVCAR-3 (ver ejemplo 1). AR51A994.1 no produjo puntuaciones positivas de citotoxicidad en la línea celular cancerosa ovárica OCC-I. De forma importante, AR51A994.1 no produjo citotoxicidad significativa comparada a controles negativos, contra las líneas celulares no cancerosas tales como CCD-27sk o Hs888.Lu, que sugieren que el anticuerpo es específicamente citotóxico hacia las células cancerosas. Los agentes citotóxicos químicos indujeron su citotoxicidad prevista contra las líneas celulares múltiples. El enlace de AR51A994.1 con las líneas celulares del cáncer pancreático (BxPC-3), cáncer ovárico (OCC-1 y OVCAR-3) y no cancerosas (CCD-27sk, Hs888.Lu) fue evaluado por el flujo de citrometría (FACS). Las células fueron preparadas por FACS inicialmente lavando la monocapa de la célula con DPBS (sin Ca++ y g++). El amortiguador de disociación de célula (INVITROGEN, Burlington, ON) fue después utilizado para desalojar las células de sus placas de cultivo celular a 37°C. Después de la centrifugación y colección, las células fueron resuspendidas en DPBS que contiene MgCI2, CaCI2 y 2 por ciento de suero vacuno fetal a 4°C (medio de manchado) y contadas, alicuotadas para la densidad celular apropiada, girando para granular las células y resuspenderlas en el medio de manchado a 4°C en presencia de los anticuerpos de prueba (AR51A994.1) o para controlar anticuerpos (control de isotipo, anti-EGFR) en 20 pg/mL en hielo por 30 minutos. Antes de la adición del anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 546 las células fueron lavadas una vez con el medio de manchado. El anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 546 en el medio de manchado fue después agregado durante 30 minutos a 4°C. Las células fueron después lavadas por el tiempo de termino y resuspendidas en medios de fijación (medio de manchado que contiene 1.5 % de paraformaldehido). La adquisición citométrica de flujo de las células fue evaluada funcionando las muestras en un FACSarray™ usando el FACSarray™ System Software (BD Biosciences, Oakville, ON). La esparción frontal (FSC) y lateral (SSC) de las células fue establecida ajustando los aumentos de voltaje y amplitud en los detectores FSC y SSC. Los detectores para el canal de fluorescencia (Alexa-546) fueron ajustados activando las células sin manchas de modo que las células tuvieron un pico uniforme con una intensidad fluorescente promedio de aproximadamente 1- 5 unidades. Para cada muestra, aproximadamente 10,000 eventos limitados (células fijas manchadas) fueron adquiridos por el análisis y los resultados son presentados en la figura 3. La figura 3 presenta las veces de aumento de intensidad de fluorescencia en el medio de control de isotipo anterior. Los histogramas representativos de los anticuerpos AR51A994.1 fueron compilados por la figura 4. AR51A994.1 mostró el fuerte enlace con las líneas celurares cancerosas ováricas OCC-I y OVCAR-3 (16 y 14.8 veces respectivamente) y a la línea celular de pulmón no cancerosa Hs888.Lu (24.6 veces) con un enlace más débil con la línea celular cancerosa pancreática BxPC-3 (8.6 veces) y con la línea celular de piel no cancerosa CCD-27sk (5.1 veces). Estos datos demuestran que AR51A994.1 exhibió especificidad funcional en que aunque hubo un enlace claro con un número de líneas celulares probadas, allí hubo únicamente citotoxicidad asociada con el cáncer pancreático BxPC-3 y ovárico OVCAR-3 in vitro. Más allá de los resultados de la citotoxicidad in vitro y del enlace de arriba, el anticuerpo AR51A994.1 fue probado con cáncer de pulmón (A549), cáncer pancreático adicional (AsPC-l y PL45) y cáncer ovárico (C-13, ES-2, Hey, OV2008, OVCA-429 y OVCAR-3) líneas celulares (A549, AsPC-l, PL45 y OVCAR-3 fueron de ATCC, Manassas, VA. C-13, ES-2, Hey, OV2008 y OVCA-429 fueron obtenidas de Ottawa Regional Cacer Center (Ottawa, Ontario)) junto con los controles positivos y negativos según lo mencionado arriba, en un ensayo de citotoxicidad. El ensayo de citotoxicidad de Vida/Muerte fue realizado según lo descrito arriba. El anticuerpo AR51A994.1 produjo citotoxicidad específica en las líneas celulares cacerosas ováricas ES-2, OV2008 y OVCA-429 y la línea celular de cáncer de pulmón A549 con relación a los controles negativos de isotipo y amortiguador (Figura 2). También, el anticuerpo AR51A994.1 produjo citotoxicidad específica en la línea celular ovárica OVCAR-3. Esto es consistente con los datos de citotoxicidad OVCAR-3 de arriba. AR51A994.1 no produjo puntuaciones positivas de citotoxicidad en las lineas celulares cancerosas ováricas C-13 y líneas celulares cancerosas ováricas Hey o AsPC-1 y las líneas celulares pancreáticas PL45. Los agentes citotóxicos químicos indujeron su citotoxicidad esperada contra las líneas celulares múltiples. El enlace de AR51A994.1 con las líneas celulares de cáncer de pulmón (A549), cáncer pancreático adicional (AsPC-l y PL45) y cáncer ovárico (C-13, ES-2, Hey, OV2008, OVCA-429 y OVCAR-3) fue determinado por el flujo de citometría (FACS) según lo delineado arriba. La figura 3 presenta el promedio de veces del aumento de intensidad de fluorescencia sobre el control de isotipo. Los histogramas representativos de los anticuerpos AR51A994.1 fueron compilados por la figura 4. AR51A994.1 mostró mayor enlace con las líneas celulares cancerosas ováricas ES-2 y OV2008 (22.2 y 19.8 veces respectivamente) y un enlace más débil con las líneas celulares cancerosas ováricas C-13, Hey, OVCA-429 y OVCAR-3 (9.8, 4.4, 3.9 y 4.3 veces respectivamente), las líneas celulares pancreáticas AsPC-l y PL45 (4.1 y 2.4 veces respectivamente) y la línea celular cancerosa de pulmón A549 (4.6 veces). Estos datos demuestran que AR51A994.1 exhibió especificidad funcional en que aunque hubo enlace claro con todas las líneas celulares probadas, hubo únicamente citotoxicidad asociada con algunas de las líneas celulares cancerosas. El anticuerpo 7BDI-58 y 7BDI-60 fueron comparados a un número de ambos positivo (anti-Her2 (IgGI , kappa, 10 microgramos/mL, Inter Medico, Markham, ON), Cícloheximida (100 micromolar, Sigma, Oakville, ON)) y negativa (107.3 (anti-TNP, IgGI, kappa, 20 microgramos/mL, BD Biosciences, Oakville, ON)), así como un control de amortiguador diluyente en un ensayo de la citotoxicidad (Figura 5). Las líneas celulares de cáncer ovárico (OVCAR-3) y cáncer de pecho (MDA-MB-468 (MB-468)) y no cancerosas (Bst549, CCD-27sk, Hs888.Lu) fueron probadas (todas de ATCC, Manassas, VA). El ensayo de citotoxicidad de Vida/Muerte fue obtenido de Pruebas Moleculares (Eugen, OR). Los ensayos fueron realizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante con los cambios delineados abajo. Las células fueron colocadas en placas antes del ensayo en la densidad apropiada predeterminada. Después de 2 días, 100 microlitros de anticuerpo purificado o controles fueron diluidos en el medio, y después transferidos a las placas celulares e incubados en una incubadora con C02 al 5 por ciento por 5 días. Las placas después fueron vaciadas por inversión y transferencia de secado. La temperatura ambiente DPBS que contiene MgCI2 y CaCI2 fue dispensada en cada pozo desde una botella de aplique, golpeada ligeramente 3 veces, vaciada por inversión y después transferida por secado. 50 mililitros de tinte de calceina fluorescente diluido en DPBS que contiene MgCI2 y CaCI2 fueron agregados a cada pozo e incubados a 37°C en una incubadora con C02 al 5 por ciento por 30 minutos. Las placas fueron leídas en un lector de placa de fluorescencia Perkin-Elmer HTS7000 y los datos fueron analizados en Microsoft Excel y los resultados fueron tabulados en la figura 2. Cada anticuerpo recibió una puntuación entre 5 y 50 basados en el promedio de citotoxicidad observada en cuatro experimentos probados en triplicado, y una puntuación entre 25 y 100 basada en la variabilidad observada entre los ensayos. La suma de estas dos puntuaciones (puntuación de citotoxicidad) es presentada en la figura 5. Una puntuación de citotoxicidad mayor que o igual a 55 fue considerada por ser positiva en la línea celular probada. El anticuerpo 7BDI-58 produjo la citotoxicidad específica en la línea celular cancerosa ovárica OVCAR-3 con relación a los controles negativos del amortiguador y del isotipo. 7BDI-58 no produjo puntuaciones positivas de citotoxicidad en la línea celular de cáncer de pecho MB-468. De forma impórtente, 7BDI-58 no produjo citotoxicidad significativa, comparada a los controles negativos, contra las líneas celulares no cancerosas tales como Bst549, CCD-27sk o Hs888.Lu, sugiriendo que el anticuerpo tiene citotoxicidad específica para células cancerosas. El anticuerpo 7BDI-60 produjo citotoxicidad específica en la línea celular de cáncer de pecho MB-468 con relación a los controles negativos de isotipo y del amortiguador. 7BDI-60 no produjo puntuaciones positivas de citotoxicidad en la línea celular de cáncer ovárico OVCAR-3. De forma impórtente, 7BDI-60 no produjo citotoxicidad significativa, comparada a los controles negativos, contra las líneas celulares no cancerosas tales como Bst549, CCD-27sk o Hs888.Lu, sugiriendo que el anticuerpo tiene citotoxicidad específica para células cancerosas. El agente citotóxico químico inducida su citotoxicidad esperada contra las múltiples líneas celulares. El enlace 7BDI-58 y 7BDI-60 con las líneas celulares de cáncer de pecho (MB-468), cáncer ovárico (OVCAR-3) y no cancerosas (Bst549, CCD-27sk, Hs888.Lu) fue evaluado por la citometría de flujo (FACS). Las células fueron inicialmente preparadas por FACS lavando la monocapa de la célula con DPBS (sin Ca++ y Mg++). El amortiguador de disociación de la célula (INVITROGEN, Burlington, ON) fue después utilizado para desalojar las células de sus placas de cultivo celular a 37°C. Después de la centrifugación y colección las células fueron resuspendidas en salino amortiguado de fosfato Dulbecco que contiene MgCI2, CaCI2 y 25% por ciento de suero vacuno fetal a 4°C (medio de lavado) y contado, aliquota para la densidad celular apropiada, girando para granular las células y resuspenderlas en el medio de manchado (DPBS que contiene MgCI2, y CaCI2) que contiene los anticuerpos de prueba (7BDI-58 o 7BDI-60) o anticuerpos de control (control de isotipo o anti-EFGR) en 20 microgramos/mL en hielo por 30 minutos. Antes de la adición del anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 las células fueron lavadas una vez con el medio de lavado. El anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 488 en el medio de manchado fue después agregado durante 20 minutos. Las células fueron después lavadas por el tiempo final y resuspendidas en medios de manchado que contiene 1 microgramo/mL de yoduro de propidio. La adquisición citométrica de flujo de las células fue evaluada activando las muestras en un FACScan usando el software CelIQuest (BD Biosciences). La esparción frontal (FSC) y lateral (SSC) de las células fue establecida ajusfando los aumentos de voltaje y amplitud en los detectores FSC y SSC. Los detectores para los tres canales de fluorescencia (FL1, FI2 y FI3) fueron ajustados activando las células manchadas con el isotipo purificado de modo que las células tuvieron un pico uniforme con una intensidad fluorescente promedio de aproximadamente 1-5 unidades. Las células vivas fueron adquiridas por separación de FSC y exlusión de yoduro de propidio. Para cada muestra, aproximadamente 10,000 células vivas fueron adquiridas por análisis y los resultados presentados en la figura 6.

La figura 6 presenta el promedio de veces de aumento de intensidad de la fluorescencia sobre el control del isotipo para cada anticuerpo. Los histogramas representativos de los anticuerpos 7BDI-58 y 7BDI-60 fueron compilados por la figura 7. 7BDI-58 mostró el mayor enlace con la línea celular cancerosa ovárica OVCAR-3 (13.8 veces), línea celular de pulmón no cancerosa Hs888.Lu (18.3 veces), línea celular no cancerosa de pecho Bst549 (10.8 veces) y línea celular de piel no cancerosa CCD-27sk (22.5) con un enlace más débil con la línea celular cancerosa de pecho MB-468 (3.8 veces). Estos datos demuestran que 7BDI-58 exhibió especificidad funcional en que aunque había enlace claro con un número de lineas celulares probadas, hubo únicamente citotoxicidad asociada con el cáncer ovárico OVCAR-3. 7BDI-60 mostró el enlace con la línea celular cancerosa ovárica OVCAR-3 (5.7 veces), línea celular cancerosa de pecho MB-468 (5.1 veces), línea celular de pulmón no cancerosa Hs888.Lu (9.1 veces), línea celular no cancerosa de pecho Bst549 (3.7 veces) y la línea celular de piel no cancerosa CCD-27sk (8.1 veces). Estos datos demuestran que 7BDI-60 exhibió especificidad funcional en que aunque había enlace claro a un número de líneas celulares probadas, hubo únicamente citotoxicidad asociada con el cáncer de pecho MB-468. EJEMPLO 3 Experimentos de tumor in vivo con células MDA-MB-231 Con referencia a las figuras 8 y 9, los ratones SCID hembras de 4 a 6 semanas de edad fueron implantados con 5 millones de células humanas de cáncer de pecho (MDA-MB-231 ) en 100 microlitros de salino inyectados subcutáneamente en la nuca del cuello. Los ratones fueron divididos aleatoriamente en 2 grupos de tratamiento de 5. En el día después de la implantación, 20 mg/kg de control de anticuerpo de prueba 7BDI-58 o control de amortiguador fueron administrados intraperitonealmente a cada cohorte en un volumen de 300 microlitros después de la dilución de la concentración común con un diluyente que contenía 2.7 mM KCI, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCI y 20 mM Na2HP04. El anticuerpo y las muestras de control fueron administradas después una vez por semana por la duración del estudio, un total de 8 dosis, en la misma manera. El crecimiento del tumor fue medido aproximadamente cada séptimo día con los calibradores. Los pesos corporales de los animales fueron registrados una vez por semana por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales fueron eutanizados de acuerdo a la directriz de CCAC. 7BDI-58 redujo marcadamente el crecimiento del tumor en el modelo profiláctico in vivo MDA-MB-231 del cáncer de pecho humano. En la poste-implantación del día 55, 5 días después de la dosis del último tratamiento, el volumen promedio del tumor en el grupo tratado 7BDI-58 fue 91.2 por ciento más bajo que el volumen del tumor en el grupo de control de amortiguador tratado.

(Figura 8). El volumen del tumor en el final del estudio fue significativamente diferente del de control (p = 0.0105, t-prueba). No hubo señales clínicas de toxicidad a través del estudio. El peso corporal medido en los intervalos semanales fue un sustituto para que el bienestar y la falla prosperen. Según lo visto en la figura 9, no hubo diferencias significativas en los pesos corporales de los grupos de control o tratados con 7BDI-58 en el curso del estudio. No hubo tampoco diferencia significativa en el peso corporal entre los dos grupos al final del período del tratamiento. En conclusión, 7BDI-58 fue bien tolerado y disminuyó la carga del tumor en este modelo de injerto de cáncer de pecho humano. EJEMPLO 4 Determinación de la reactividad cruzada entre los anticuerpos monoclonales 7BDI-58, 7BDI-60, AR55A994.1 y anticuerpos anti-CD63 Los resultados de Western Blot de las fracciones totales de la membrana y de los lisatos celulares enteros, cuando fueron examinados con los anticuerpos monoclonales 7BDI-58, 7BDI-60 y AR51A994.1 revelaron una fuerte similitud con los obtenidos con los anticuerpos monoclonales CD637BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1 (Figura 10). Para determinar si los anticuerpos anteriores reaccionados cruzados con CD63, fueron utilizados como pruebas en complejos inmunoprecipitados Western blots obtenidos con cualquiera de 73D-33-11A o con 1A245.6 de la fracción total del crecimiento de las células en cultivo. 300 microgramos de la fracción total de la membrana MDA-MB-231 (1 mg/mL de concentración final de la proteína) fueron incubados brevemente con los granos de la Proteína G Sefarosa conjugada con 7BD-33-11A durante 2 horas a 4°C. Después del lavado los granos fueron hervidos en el amortiguador muestra SDS-PAGE no reductor IX y la muestra fue analizada por electroforesis en 10 % gel de poliacrilamida. Después de la electrotransferencia en una membrana PVDF las transferencias fueron probadas con los anticuerpos 7BDI-58, AR51A994.1, 7BD-33-11 A y con los controles de isotipo IgGI e lgG2a de acuerdo al procedimiento Western Blot estándar. Todos los anticuerpos primarios fueron utilizados en una concentración de 5 microgramos/mL. La imagen de las trasnferencias resultantes (figura 11) muestran que ambos el 7BDI-58 y AR51A994.1 reaccionaron cruzados con el mismo antígeno que el anticuerpo 7BD-33-11A, y por lo tanto se enlazan específicamente con CD63.

Para determinar si el anticuerpo 7BDI-60 reaccionado cruzado con CD63, los inmunocomplejos de CD63 humano y el anticuerpo 1A245.5, fueron preparados de la fracción total de la membrana aislada de la línea celular ASPC-1. Después de analizar los inmunocomplejos por electroforesis, bajo condiciones no reductoras, en 10 % de gel poliacrilamida SDS, y después de la electrotransfererencia de las proteínas en una membrana PVDF, las transferencias fueron probadas con los anticuerpos 7BDI-60, 1A245.6, anti-CD63, clon H5C6, y con un control de isotipo IgGI. Todos los anticuerpos primarios fueron utilizados en una concentración de 5 microgramos/mL. La figura 12 muestra que todos los anticuerpos, a excepción del control de isotipo, reaccionaron curzados con el mismo antígeno, CD63. Para confirmar además la reactividad cruzada entre 7BDI-58, 7BDI-60 y AR51A994.1 contra CD63 humano, los anticuerpos fueron utilizados como pruebas en un Western blot de un constructor de fusión GST recombinante expresado de E. coli del bucle extracelular más grande de CD63 humano. 5 microgramos de proteína de fusión GST recombinante purificada fueron brevemente analizados por electroforesis en un gel preparatorio de 10 % poliacrilamida SDS. Después de transferir la transferencia fue probada con el 7BDI-58, 7BDI-60 y AR51A994.1, y con los anticuerpos anti-CD63 7BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1, con un anticuerpo anti-CD44 (clon H460-16-2) y con los anticuerpos de control de isotipo IgGI e lgG2a, de acuerdo al procedimiento Western blot estándar. Todos los anticuerpos primarios fueron utilizados en una concentración de 5 microgramos/mL. Los resultados de este experimento (figura 13) revelaron que todos los anticuerpos, con excepción del control de isotipo, reaccionaron cruzados específicamente con el constructor de fusión GT recombinante del bucle extracelular más grande de CD63 humano, por lo tanto demuestra que 7BDI-58, 7BDI-60 y AR51A994.1 enlaza específicamente con CD63 humano.

EJEMPLO 5 O Manchado del Tejido de Tumor Pancreático Humano Los estudios IHC fueron conducidos para además (manchado inicial de adenocarcinoma pancreático descrito en S.N. 10/603.006) evaluar el enlace de 7BD-33-11A al tejido del tumor pancreático humano. Los estudios de optimización de IHC fueron realizados previamente para determinar las condiciones para otros experimentos. Las secciones del tejido fueron desparafinizados secándose en un horno a 58°C durante 1 hora y descerados por sumersión en xileno 5 veces por 4 minutos cada uno en tarros de Coplina. Siguiendo el tratamiento con una serie de lavados graduados de etanol (100 %-75 %) las secciones fueron rehidratadas en agua. Las diapositivas fueron sumergidas en 10 mM del amortiguador de citrato en pH 6 (Dako, Toronto, Ontario) después calentadas en microondas en una energía establecida en alta, media, y baja por 5 minutos cada una y finalmente sumergidas en PBS. Las diapositivas fueron después sumergidas en la solución de 3 % de peróxido de hidrógeno por 6 minutos, lavadas con PBS tres veces por 5 minutos cada una, secadas, incubadas con la solución de bloqueo Universal (Dako, Toronto, Ontario) por 5 minutos a temperatura ambiente. 7BD-33-11A, contra-actinia de ratón monoclonal (Dako, Toronto, ON) o anticuerpo de control de isotipo (dirigido hacia Aspergillus niger oxidasa glucosa, una enzima la cual no está ni presente ni inducible en tejidos mamíferos; Dako, Toronto, Ontario) fueron diluidos en el amortiguador de dilución de anticuerpo (Dako, Toronto, Ontario) en su concentración de trabajo (5 microgramos/mL por cada anticuerpo a excepción de anti-actinia que fue diluida en 2 microgramos/mL) e incubados por 1 hora a temperatura ambiente. Las diapositivas fueron lavadas con PBS 3 veces por 5 minutos cada una. La inmunoreactividad de los anticuerpos primarios fue detectada/visualizada con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP como provisto por (Dako Envision System, Toronto, Ontario) por 30 minutos a temperatura ambiente. Siguiendo esta etapa las diapositivas fueron lavadas con PBS 3 veces por 5 minutos cada una y desarrollo una reacción de color agregando la solución de substrato cromogen DAB (3,3'-diaminobencidina tetrahidracloruro, Dako, Toronto, Ontario) para el manchado de inmunoperoxidasa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lavando las diapositivas en agua dando golpecitos terminó la reacción cromogénica. Siguiendo la contratinción con Meyer's Hematoxylin (Sigma Diagnostics, Oakville, ON), las diapositivas fueron deshidratadas con etanoles graduados (75 - 100 %) y aclaradas con xileno. Usando el medio de montaje (Dako Faramount, Toronto, Ontario) las diapositivas fueron cubiertas con vidrio. Las diapositivas fueron examinadas microscópicamente usando un Axiovert 200 (Zeiss Canadá, Toronto, ON) y las imágenes digitales adquiridas y almacenadas con Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON). Los resultados fueron leídos, anotados e interpretados por un histopatologísta. La prueba de enlace de anticuerpos a 32 tumores pancreáticos y 4 tejidos pancreáticos normales humanos fue realizada usando una micromatriz de tejido de tumor normal y pancreático humanos, (Pentagen, Seúl, Corea). La figura 14 presenta un resumen de los resultados del manchado de 7BD-33-11A de una hilera de tejidos de tumores pancreáticos y normales humanos. Cada muestra del tumor es representada por 2 sitios para superar la heterogenidad del tejido. El promedio de la puntuación para los 2 sitios fue considerada como el final de la sección del tumor. Había únicamente un sitio disponible para cada uno de los cuatro tejidos no neoplásticos. Según lo mostrado en la figura 14, el enlace total de 7BD-33-11 A con el cáncer pancreático probado en la micromatriz fue de 27/32 (84 %). El anticuerpo mostró manchado fuerte ( + + + ) en 3/32, moderado ( + + ) en 7/32, débil ( + ) en 9/32 y equívoco (+/-) en 8/32. El enlace fue restringido a las células tumorales. La localización celular fue citoplásmica y membranosa con un patrón de manchado granular. El porcentaje de las células manchadas mostró el enlace heterogéneo con las células tumorales, teniendo un intervalo entre <10 % a >50 %. De acuerdo el tipo histológico de los tumores pancreáticos disponible en el tejido de la micromatriz, hubo un enlace de 26/30 (87 %) del adenocarcinoma ductal y hasta 1/2 (50 %) de carcinomas de endocrina. Hubo un enlace de 4/4 (100 %) de tejidos pancreáticos no neoplásticos; el enlace fue en el epitelio acinar e islotes de langerhans (Figura 15). De acuerdo al grado histológico de los tumores pancreáticos, hubo un elace del anticuerpo de 1/1 (100 %), 2/3 (67 %), 9/12 (75 %), 2/2 (100 %), 6/6 (100 %), y 1/1 (100 %) con las secciones graduadas como Gl, G1-G2, G2, G2-G3, G3, G4, respectivamente. Hubo un enlace de 5/5 (100 %) de las secciones con grado desconocido. En relación a las etapas del tumor TNM de adenocarcinoma del páncreas, hubo un enlace del anticuerpo de 1/1 (100 %), 14/17 (82 %), 1/1 (100 %) y 10/11 (91 %) de las secciones de las etapas I, II, III y IV, respectivamente. Por lo tanto, ninguna relación podría encontrarse entre el enlace del anticuerpo y los varios parámetros del cáncer (tipos de tumor histiológico, grados y etapas TNM). Esta carencia de correlación puede ser debido a los tamaños pequeños de la muestra que representan algunas de las etapas del cáncer. El antígeno 7BD-33-11A parece ser expresado en tejido del tumor pancreático. 7BD-33-11A por lo tanto tiene potencial como un fármaco terapéutico en el tratamiento del cáncer pancreático. EJEMPLO 6 Demostración de la actividad de la Citotoxicidad Celuar Dependiente del Anticuerpo in vitro (ADCC) del anticuerpo 7BD-33-11A La evidencia anterior del uso terapéutico in vivo de 7BD-33- 11 A en modelos de cáncer de pecho humanos profilácticos, obtenido comparando su eficacia en SCID contra ratones NOD/SCID (según lo descrito en S.N. 60/642,057), indicó que ADCC es un mecanismo posible para la actividad in vivo de este anticuerpo en ese modelo animal. La demostración adicional de la capacidad de 7BD-33-11A para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo contra la línea celular de cáncer de pecho MDA-MB-231 fue obtenida por un ensayo de citotoxicidad in vitro. Las células efectoras murinas fueron obtenidas de los bazos ratones BALB/cAJcl'nu" y fueron estimulados con IL-2 murino (20 nM) por cuatro días. Las células efectoras adherentes y no adherentes fueron separadas y utilizadas en el ensayo de citotoxicidad in vitro. Las células marcadas MDA-MB-231 fueron disociadas de la placa del cultivo de la célula y 10 millones de células fueron etiquetadas por 60 minutos con 40µ?? de Na251Cr04 (GE Healthcare Amersham Biosciences) y 104 células/pozo fueron agregados a las placas de 96 pozos. 7BD-33-11A o un control igualado al isotipoemparejado lgG2a fueron agregados a las células marcadas etiquetadas 5 Cr-, en variar concentraciones finales inmediatamente antes de agregar las células effector murine en el efector: marca (E:T) relación de 25:1. Después de una incubación de 4 horas a 37°C el 5 Cr liberado de las células Usadas fue medido. Cada ensayo fue realizado en triplicado y los resultados fueron expresados como el porcentaje de lisis específico que es definido como: (cpm espontáneo-cpm experimental)x100/(cpm máximo-cpm espontáneo). Los resultados de este experimento (figura 16) demuestran claramente que 7BD-33-11A induce una específica y lisis celular marcada MDA-MB-231 dependendiente de la dosis, con células efectoras adherentes y no-adherentes, que no es observado cuando las células marcadas están incubadas en la presencia del control de isotipo emparejado, en concentraciones idénticas. Por lo tanto, los datos demuestran que 7BD-33-11A pueden mediar el ADCC por el reclutamiento de la actividad celular efectora. EJEMPLO 7 Acumulación de macrófago en injertos MDA-MB-231 La demostración adicional de la capacidad de 7BD-33-11A en mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo contra la línea celular de cáncer de pecho MDA-MB-231 fue obtenida de un estudio in vivo por inmunohistoquímica. Ratones SCID hembras de seis a ocho semanas de edad fueron implantados con 5 millones de células de cáncer de pecho humano (MDA-MB-231) en 100 microlitros de salino inyectados subcutáneamente en la nuca del cuello. El crecimiento del tumor fue medido con calibradores cada semana. Cuando la mayoría del cohorte alcanzó un volumen de tumor promedio de 100 mm3 (intervalo 80-120 mm3), 3 ratones fueron sacrificados, y sus tumores fueron cosechados y las porciones fueron preservadas en formalina y OCT. El resto de los ratones fue asignado a los grupos de tratamiento o control con 3 ratón/grrupo. El día después de la asignación, el anticuerpo de prueba 7BD-33-11A o el control de amortiguador fue administrado intraperitonealmente a cada cohorte, con la dosificación en 15 mg/kg de anticuerpos en un volumen de 300 microlitros después de la dilución de la concentración común con un diluyente que contuvo 2.7 mM KCI, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCI y 20 mM Na2HP04. Después de 3, 6 ó 10 dosis de anticuerpo o control de prueba, dadas 3 veces/semana, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron cosechados y preservados en formalina y OCT. Las muestras del tumor fueron transferidas al Pathology Research Lab in the Toronto General Hospital (Toronto, ON) para procesamiento. Las secciones del tejido fueron desparafinizadas por secado en un horno a 58°C durante 1 hora y desceradas sumergiendo en xileno 5 veces por 4 minutos cada una en frascos de Coplina. Siguiendo el tratamiento con una serie de lavados de etanol graduado (100 % - 75 %) las secciones fueron rehidratadas en agua. Las diapositivas fueron sumergidas en 10 mM del amortiguador de citrato en pH 6 (Dako, Toronto, Ontario) después calentadas en microondas en una energía establecida en alta, media, y baja por 5 minutos cada una y finalmente sumergidas en PBS. Las diapositivas fueron después sumergidas en la solución de 3 % de peróxido de hidrógeno por 6 minutos, lavadas con PBS tres veces por 5 minutos cada una, secadas, incubadas con la solución de bloqueo Universal (Dako, Toronto, Ontario) por 5 minutos a temperatura ambiente, en la solución bloqueante Avidina D (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por 15 minutos a temperatura ambiente y en la solución bloquante Biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) por 15 minutos a temperatura ambiente. Anti-Mac-3 (BD Bioscience, Oakville, ON) fue diluido en el amortiguador de dilución del anticuerpo (Dako, Toronto, Ontario) en su concentración de trabajo (0.75 microgramos/mL) e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Las diapositivas incubadas con el amortiguador de dilución del anticuerpo únicamente fueron utilizadas como un control negativo. Las diapositivas fueron lavadas con PBS 3 veces por 5 minutos cada una. La inmunoreactividad de los anticuerpos primarios fue detectada/visualizada con anti-rata biotinilada (BD Bioscience, Oakville, ON). La reacción de color fue detectada con el reactivo Vectastain EliteABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Lavando las diapositivas en agua con golpecitos terminó la reacción cromogénica. Siguiendo la contratinción con Meyer's Hematoxylin (Sigma Diagnostics, Oakville, ON), las diapositivas fueron deshidratadas con etanoles graduados (75-100 %) y despejadas con xileno. Usando los medios de montaje (Dako Faramount, Toronto, Ontario) las diapositivas fueron cubiertas con vidrio. Las diapositivas fueron examinadas microscópicamente usando un Axiovert 200 (Zeiss Canadá, Toronto, ON) y las imágenes digitales adquiridas y almacenadas usando el Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON). Los resultados fueron leídos, anotados e interpretados por un histopatologista. La exploración de las diapositivas fue hecha en la energía de ampliación 100x (Ziess Axiovert 200M). Los macrófagos (Mac-3 positivo) fueron contados aleatoriamente seleccionando 5 diferentes sitios calientes. Las áreas intratumorales fueron seleccionadas para conteo mientras que evitan las zonas densas periféricas. Después de seleccionar las áreas para ser contadas, la energía de ampliación fue cambiada a 400X y las imágens fueron capturadas usando una cámara Qlmaging Rtiga y el software Northern Eclipse (versión 7.0). El conteo manual de células positivas fue hecho usando la función de conteo manual de Northern Eclipse. Las áreas necróticas y los espacios vasculares fueron evitados durante el conteo. La examinación de las secciones del tumor mostró 3 patrones de distribución de macrófagos asociados al tumor. Hubo infiltración periférica en una banda tipo patrón entre la periferia del tumor y del tejido conectivo circundante. Este patrón fue obvio en todos los tumores tratados 7BD-33-11A pero únicamente en algunos tumores tratados con amortiguadores. Hubo también agregación en grupos entre las células tumorales, y por último, hubo solo células esporádicas entre o rodeando a las células tumorales. Según lo exhibido en la figura 17, el tratamiento 7BD-33-11A resultó en una acumulación más alta de macrófagos comparados al tratamiento del amortiguador en todas las 3 dosis. La acumulación más alta fue con las 6 dosis muestras, y fue estadísticamente significativa (p = 0.047). Esto correlacionó con los datos que ilustran que el porcentaje más grande de inhibición del crecimiento del tumor fue considerado después de 6 dosis de 7BD-33-11A. Además, cuando se tomo en cuenta todos los datos de las 3 dosis, la acumulación de macrofagos en los tumores tratados 7BD-33-11A fue también perceptiblemente más alta (p=0.037). Todas las muestras incubadas solo con el amortiguador de dilución del anticuerpo fueron negativas. Por lo tanto, en los injertos MDA-MB-231 , hubo acumulación significativa de macrofagos asociados al tumor en el tratamiento 7BD-33-11A contra los injertos del tratamiento con amortiguador. Estos datos soportan la evidencia anterior de ADCC como un mecanismo de acción para 7BD-33-11A. EJEMPLO 8 Humanización de 7BD-33-11A La humanización de 7BD-33-11A fue realizada esencialmente de acuerdo al procedimiento de Queen y colaboradores (1989) por Protein Design Labs (PDL, Fremont, CA). Fueron identificadas primero las regiones variables humanas (V), con alta homología en las secuencias de aminoácido de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras (VH y VL, respectivamente) de 7BD-33-11A. Después, las secuencias de CDR junto con la importante estructura del aminoácido que mantiene las estructuras de CDRs fueron injertadas en las secuencias de la estructura humana seleccionada. En adición, los aminoácidos de estructura humana que son encontrados para ser atípicos en el subgrupo de la región V humano correspondiente fueron sustituidos con aminoácidos de consenso por reducir la inmunogenticidad potencial. Las regiones variables humanizadas resultantes fueron expresadas en las formas IgGI e lgG2M3 ((hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L), respectivamente) en la línea celular mieloma de ratón Sp2/0. La línea celular del hibridoma 7BD-33-11A, que produce el anticuerpo monoclonal CD63 anti-humano de ratón fue cultivada en DMEM (HyClone, Logan, UT) que contiene 10 % FBS (HyClone, Logan, UT), 1 % MEM Aminoácidos no esenciales (BioWhittaker, Walkersville, MD), 0.1 % 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), 1 % de piruvato de sodio (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 % L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA). La línea celular mieloma de ratón Sp2/0-Agl4 (ATCC, Manassus, VA; referida como Sp2/0 de aquí en adelante) fue mantenido en DMEM que contiene 10 % FBS. El anticuerpo monoclonal 7BD-33-11A de ratón fue purificado del supernadante de cultivo por cromatografía de afinidad usando una columna de la Proteía G Sefarosa. 7BD-33-1 1A conjungado con FITC fue preparado usando el FluoReporter Fluorescein-EX Protein Labeling Kit (Molecular Probes, Eugen, OR). La línea celular de cáncer de próstata humana PC-3, la cual fue obtenida originalmente del National Cáncer Institue, fue mantenida en RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD) conteniendo 10 % FBS. Todas las líneas celulares fueron mantenidas a 37°C en una incubadora de C02 al 7.5 %. La secuencia de los aminoácidos de terminal-N de 7BD-33-11A fue realizada en Argo BioAnalytica, Inc. (Kenilworth, NJ). La secuencia observada del aminoácido mostrada en la figura 18 fue consistente con la secuencia predecida de los genes de las regiones variables de la cadena ligera y cadena pesada de ratón.

El ARN total fue extraído de aproximadamente 107 de células de hibridoma 7BD-33-11A usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Burlington, ON) y poli (A)+ ARN fue aislado con el Sistema de Aislamiento PoIyATtract mRNA (Promega Corporation, Madison, Wl) de acuerdo a los protocolos de los proveedores. El ADNc de doble filamento fue sintetizado usando el kit de Amplificación SMART RACE (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo el protocolo del proveedor. La región variable de ADNcs para las cadenas pesadas y ligeras fue amplificada por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores 3' que templan, respectivamente, a las regiones C de la cadena kappa y gama del ratón, y el cebador universal 5' proporcionado en el Kit de amplificación de ADNc SMART. Para VH PCR, el cebador 3" tuvo la secuencia 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(SEC ID NO: 15). Para VL PCR, el cebador 3' tuvo la secuencia 5'-GATGGATACAGTTGGTGC AGC-3' (SEC ID N0:16). Los ADNcs de VH y VL fueron clonados en el vector de pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) por la determinación de secuencia. La secuencia de ADN fue realizada por las reacciones de secuencia del ciclo PCR con los adaptadores fluorescentes de la cadena de dideoxi (Byosystems, Foster City, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuencia fueron analizadas en un Analizador Genético modelo 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fueron identificadas las secuencias únicas homologas a las típicas regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón. Las secuencias VL y VH fueron encontradas por pertenecer a los subgrupos I e NA, respectivamente. Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de la cadena pesada y ligera son mostradas en las figuras 19 y 20, respectivamente. Las secuencias deducidas de los aminoácidos de la terminal-N 20 de los análisis de secuencia de ADNc igualó a las secuencias correspondientes determinadas por la secuencia de aminoácido para ambas cadenas ligeras y pesadas. El diseño de las regiones humanizadas V del anticuerpo fue realizado según lo descrito por Queen y colaboradores (1989). Las estructuras de la región humana V usadas como aceptores para el CDRs de 7BD-33-11A fueron elegidos basados en la homología de secuencia. Los programas de computadora ABMOD y ENCAD (Levitt, 1983) fueron utilizados para construir un modelo molecular de las regiones variables. Los aminoácidos en las regiones humanizadas V que predijeron tener contacto con CDRs fueron sustituidos con los residuos correspondientes de 7BD-33-11A. Los aminoácidos en la región humanizada V que son encontrados por ser atípicos en el mismo subgrupo de la región V fueron cambiados a los aminoácidos de consenso para eliminar la inmunogenticidad potencial. Basado en una búsqueda homologa contra las secuencias de la región humana V y J, la región humana V AAR32409 (Huang y colaboradores, 1997) y el segmento J JH6 (Ravetch y colaboradores, 1981) fueron seleccionadas por proporcionar las estructuras para la región variable de cadena pesada (hu)AR7BD-33-11 A. Fueron utilizados para la región variable de cadena ligera (hu)AR7BD-33-11 A, la región humana V 1 L VE (Miura y colaboradores 2003) y el segmento J JK2 (Hieter y colaboradores, 1982). La identidad de la estructura de los aminoácidos entre 7BD-33-11A VH y el aceptor humano AAR32409/JH6 fue 77 %, mientras que la identidad entre 7BD-33-11A VL y el aceptor humano IL VE/JK2 fue de 88 %. En las posiciones de la estructura en las cuales el modelo de computadora sugirió el contacto significativo con los CDRs, los aminoácidos de las regiones V fueron sustituidos por los aminoácidos de la estructura humana original. Esto fue hecho en residuos 30, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 97 y 98 de la cadena pesada. Para la cadena ligera, el reemplazo fue hecho en el residuo 22. Los residuos de la estructura que ocurrieron únicamente de forma rara en sus posiciones respectivas en los subgrupos humanos de la región V humana correspondiente fueron sustituidos por aminoácidos humanos del consenso en esas posiciones. Esto fue hecho en los residuos 38, 40 y 84 de la cadena pesada. Las alineaciones de 7BD-33-11A, diseñadas (hu)AR7BD-33-11 A y las secuencias de aminoácido de la región aceptora V humana para L y VH son mostradas en las figuras 21 y 22, respectivamente. Los genes de la región variable de cadena pesada y ligera fueron construidos y amplificados usando 20 (para de cadena ligera) o 22 (para la cadena pesada) oligonucleótidos sintéticos traslapados aproximadamente en 40 pares base en longitud (Stemmer y colaboradores, 1995). Los oligonucleótidos fueron templados y extendidos con Pfu Polimerasa Turbo (Stratagene, La Jolla, CA), rindiendo un acomplamiento de gen V integral de doble filamento. Los fragmentos acoplados del gen V de cadena pesada y ligera fueron amplificados por PCR usando Pfu Polimerasa Turbo. Los fragmentos amplificados de PCR fueron purificados con gel, digeridos con Mlul y Xbal, purificados con gel, y subclonados, respectivamente, en pVgl D.Tt o pVg2M3.D.Tt (Colé y colaboradores, 1997) y pVk (Co y colaboradores, 1992). El plásmido pVgl D.Tt es similar a pVg2M3.D.Tt (Colé y colaboradores, 1997), pero contiene un fragmento genómico que codifica la región constante ?1 en vez de la región constante ?2. Las sustituciones de aminoácido solas fueron introducidas por un método de acoplamiento del gen de una sola etapa basada en PCR con 22 oligonucleótidos traslapados (Stemmer y colaboradores, 1995) usando Pfu Polimerasa Turbo para genrar un conjunto de variantes VH (hu)AR7BD-33-11 A (V24A, R38K, y V24A.R38K). La mutagénesis dirigida al sitio fue realizada por traslapar la extensión PCR usando Polimerasa de Expansión de Alta Fidelidad (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) para genrar otro conjunto de variantes VH (hu)AR7BD-33-11 A (V11L, I20M, y Q111A). El VL o VH humanizados que codifica los genes fueron diseñados como mini-exones (figuras 23 y 24) que incluyen señales de péptidos, señales donadoras de unión, y sitios apropiados de restricción de la enzima para la clonación posterior en vectores de expresión mamífera. Las señales donadoras de unión en los mini-exones VL y VH fueron derivadas de las secuencias JK y JH de germlina humano correspondiente, respectivamente. Las secuencias de la señal de péptido en los mini-exones VL y VH humanizados fueron derivadas de las regiones VL y VH EP5C7 del anticuerpo monoclonal selectina anti-E/P de ratón (He y colaboradores, 1998). Los genes VL y VH (hu)AR7BD-33-11 A fueron construidos por la extensión de 20 y 22 oligonucleótidos sintéticos traslapados (figuras 25 y 26), respectivamente, y la amplificación PCR, según lo ilustrado en la figura 27. Los oligonucleótidos 1-20 para VL y 1-22 para VH fueron mezclados, templados y extendidos por PCR con Pfu Polimerasa de ADN Turbo. El acoplamiento de ADN de doble filamento del gen V resultante fue amplificado por PCR con los cebadores 1 y 20 (para VL) ó 1 y 22 (para VH) para incorporar los sitios que flanquean Mlul y Xbal. El fragmento del gen VL resultante fue clonado en el vector de expresión mamífera pVk (Co y colaboradores, 1992) para genrar pVk-(hu)AR7BD-33-11 A. El fragmento VH fue clonado en pVgl D.Tt y pVg2M3.D.Tt (Colé y colaboradores, 1997) para genrar pVgl-(hu)AR7BD-33-11 A y pVg2M3-(hu)AR7BD-33-11 A, respectivamente. El transfección transitoria fue hecha por co-transfección de pVg1-(hu)AR7BD-33-11 A o pVg2M3-(hu)AR7BD-33-11 A y pVk-(hu)AR7BD-33-11 A en células 293-H mantenidas en RPMI-1640 que contienen 2 % de Ig FBS bajo (HyClone, Logan, UT) usando el método de Lipofectamina de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Aproximadamente 7 x 106 células fueron transfectadas con 15 microgramos por cada uno de los plasmidos de cadena ligera y pesada que han sido dejadas para formar complejos con 70 microlitros de reactivo Lipofectamina 2000. Las células fueron incubadas durante 5-7 días en una incubadora con C02. La purificación de los anticuerpos expresados transitoriamiente (hu)AR7BD-33-11 A.lgGI y (hu)AR7BD-33-11A.lgG2 3 fue realizado por cromatografía de columna de la Proteína G Sefarosa. La afinidad de estos dos anticuerpos a CD63 humano fue analizada en un ensayo de competición FACS. Los anticuerpos 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11 A.lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A.lgG2M3 compitió con AR7BD-33-11A conjugada con FITC de una manera dependiente de la concentración. Los valores IC50 de los anticuerpos 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3, obtenidos usando el software de la computadora GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), fueron 7.02 microgramos/mL, 25.3 microgramos/mL y 62.3 microgramos/mL, respectivamente (figura 28). La afinidad de (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI fue 3.6-veces más bajo que el de 7BD-33-11A. Para recuperar la afinidad del enlace del antígeno de 7BD-33-11A que fue pérdido durante la humanización, varias sustituciones solas del aminoácido de residuos humanos en los residuos del ratón fueron hechas en el VH por la extensión de 22 oligonucleotidos sintéticos traslapados y la amplificación de PCR (V24A y R38K) y por mutagénesis dirigida al sitio (V11L, I20M y Q111A) según lo ilustrado en la figura 29. Para cada mutante, el número en el centro denota la localización de sustitución del aminoácido, y las letras izquierdas y derechas denotan la mutación de los aminoácidos antes y después en una sola letra código, respectivamente. Los mutantes V24A y R38K fueron combinados para genrar un mutante de doble sustitución de aminoácido (V24A, r38k). Los seis mutantes VH fueron clonados en pVgl según lo descrito arriba. La seis variantes de anticuerpos (hu)AR7BD-33-11 A IgG fueron expresados transitoriamente en las células 293-H y purificados por la cromatografía de columna de la Proteína A Sefarosa, y su afinidad con CD63 humano fue analizada por el método de competición FACS. Los seis anticuerpos compitieron con 7BD-33-11A conjugado con FITC de una manera dependiente de la concentración. Sus valores IC5o son mostrados en la figura 28. Entre ellos, únicamente la variante V11 L mostró un enlace más alto con CD63 que el tipo salvaje y otros anticuerpos variables. La afinidad del anticuerpo (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI que lleva la sustitución V11L en el VH ((hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11 L)) estuvo dentro de las 3 veces del 7BD-33-11A. El vector de expresión de la cadena pesada pVgl-(hu)AR7BD-33-11 A que lleva la mutación V11L (pVgl-(hu)AR7BD-33-11 A( V11 L) fue generado según lo descrito arriba. Para la expresión de (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L), el gen (hu)AR7BD-33-11 A VH que lleva la mutación V11 L fue clonado en pVg2M3.D.Tt (Colé y colaboradores, 1997) según lo descrito arriba, generando pVg2M3-(hu)AR7BD-33-11 A.V11 L. La región constante de cadena ligera fue derivada del fragmento k de germlina humano (Hieter y colaboradores, 1980), y las cadenas pesadas fueron derivadas de germlina ?1 humano (Ellison y colaboradores, 1982) y fragmentos humanos ?2?3 (Colé y colaboradores, 1997), respectivamente. Deberá observarse que el penúltimo residuo de la cadena pesada ?2?3 que codificó en pVg2M3(hu)AR7BD-33-11 A.V11 L es glicina, un residuo más típico que la serina usado por Colé y colaboradores (1997). El promotor y activador anterior inmediato del citomegalovirus principal humano conducen tanto a los genes de cadena ligera y pesada. El marcador de selección, un gen gpt, es conducido por el promotor anterior SV40. Las estructuras gruesas de los plásmidos finales, según lo mostrado en la figura 30, fueron verificados por la distribución de restricción. Las secuencias de los exonos de la región variable y constante de los genes de la cadena pesada y ligera fueron verificadas por la secuencia de nucleótido. Para obtener las líneas celulares estables que producen (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11 L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L), los vectores de expresión de cadena pesada y ligera correspondientes fueron introducidos en el cromosoma de la línea celular Sp2/0 mieloma del ratón por electroporacion. La transfección estable en Sp2/0 fue realizada por electroporacion esencialmente según lo descrito por Co y colaboradores (1992). Antes de la transfección, los vectores de expresión fueron linearizados usando Fspl. Aproximadamente 107 células fueron co-transfectadas con 25 microgramos y 50 microgramos de plásmidos de cadena ligeras y pesada linearizados, respectivamente. Las células transfectadas fueron suspendidas en DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) que contiene 10 % FBS (HyClone, Logan, UT) y colocadas en placas en 100 microlitros/pozo en varias placas de 96-pozos. Después de 48 horas, 100 microlitros de los medios de selección (DMEM que contienen 10 % FBS, medios de suplemento HT (Sigma, St. Louis, MES), 0.5 mg/mL xantina (Sigma, St. Louis, MES) y 2.4 microgramos/mL de ácido micofenólico (Sigma, St. Louis, MES) fueron aplicados a cada pozo. Aproximadamente 10 días después de la iniciación de selección, los supernadantes del cultivo fueron ensayados, por ELISA, para la producción del anticuerpo. Las placas de inmunoensayo de Immulon 4 HBX (ThermoLabsystems, Franklin, MA) fueron revestidas durante la noche a 4°C con 100 microlitros/pozo de 1 microgramo/mL de anticuerpos policlonales específicos de la cadena IgG Fcy anti-humano de cabra AffiniPure (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) en el amortiguador de carbonato-bicarbonato de sodio en 0.2M, pH 9.4, lavadas con el Amortiguador de Lavado (PBS que contiene 0.1 % Tween-20), y bloqueadas por 30 minutos a temperatura ambiente con 300 microlitros/pozo de Amortiguador de Bloqueo SuperBIock en TBS (Pierce Biotechnology , Rockford, IL). Después del lavado con el Amortiguador de Lavado, las muestras que contienen (hu)AR7BD-33-11 A fueron diluidas apropiadamente en el Amortiguador ELISA (PBS que contenía 1 % BSA y 0.1 % Tween 20) y 100 microlitros/pozo fueron aplicados a las placas ELISA. Como estándares, el anticuerpo HuAIP12 kappa, IgGI humanizado, (Protein Design Labs, Inc.; WO 2004/101511 A2) y el anticuerpo OKT3 kappa, lgG2M3 quimérico, (Colé y colaboradores, 1997) fueron utilizados. Después de incubar las placas durante 1.5 horas a temperatura ambiente, y lavarse con el Amortiguador de Lavado, los anticuerpos enlazados fueron detectados usando 100 microlitros/pozo de una dilución de 1:1000 de los anticuerpos policlonales específicos de cadena IgG Fcy anti-humana de cabra AffiniPure (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Después de incubar por 1 hora a temperatura ambiente, y lavarse con el Amortiguador de Lavado, el desarrollo de color fue realizado agregando 100 microlitros/pozo de ABTS de Sustrato de Peroxidasa/Solución de Peroxidasa B (KPL, Inc., Gaithersburg , MD). Después de incubar por 4 minutos a temperatura ambiente, el desarrollo de color fue parado agregando 100 microlitros/pozo de 2 % de ácido oxálico. La absorbencia fue leída en 415 nm usando un lector microplaca de VersaMax (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA). Los transfectantes de alto rendimiento Sp2/0, Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11 L) (clon #18) y Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) (clon # 5), fueron extendidos en DMEM que contenía 10 % FBS, después adaptados y ampliados al crecimiento en el Medio-2 Básico Libre de Proteína (PFBM-2) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer y colaboradores (2000)) que contiene 1 % Ig FBS bajo (HyClone, Logan, UT), suplementado con el Medio-3 de Alimentación Libre de Proteína (PFBM-3) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer y colaboradores (2000)), y crecidos hasta agotamiento. Para confirmar las secuencias de ARN de la cadena ligera y pesada, el ARN total fue aislado de Sp2/0(hu)AR7BD-33-11 A- lgG1(V11L) (clon #18) y Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) (clon # 5). El primer filamento de ADNc fue sintetizado con el Superscript Preampliciation System (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando el ARN total como un hexadeoxinucleótido patrón y aleatorio como cebadores. La reacción fue realizada con transcriptasa inversa SuperScript II de acuerdo al protocolo del proveedor. Los fragmentos de ADN que contienen la región de codificación completa de la cadena pesada y ligera de (hu)AR7BD-33-11 A fueron amplificados por PCR usando los cebadores 5' y 3' que enlazan a las regiones no codificadas, de 5' y 3' respectivamente. Las secuencias del cebador se muestran abajo: Cebador 5' para cadena pesada y cadena ligera: mbr35'-CCATAGAAGACACCGGGACC-3' (SEC ID NO:17) Cebador 3' para cadena ligera: mc121 5'-AGGTGCAAAGATTCACTT-3" (SEC ID NO:18) Cebador 3' para cadena pesada: mc124 S'-TCCCGTCGCGACCCACG-S' (SEC ID NO:19) Los fragmentos amplificados fueron purificados y sometidos en gel para secuenciar con los cebadores apropiados. Las secuencias determinadas de las cadenas ligeras y pesadas convinieron en cada posición del nucleótido con las secuencias de codificación conocidas de (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(VIIL) y (hu)AR7BD-33-11A-lgG2M3(V11L) (Figuras 31, 32 y 33). Un banco de semillas de diez frascos fueron hechos congelando Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A.V11 L.G1 (clon # 18) y Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A.V11 L.G2M3 (clon # 5) transfectantes en 90 % FBS (HyClone, Logan, UT), 10 % DMSO (Sigma, St. Louis, MO). Cada frasco contuvo aproximadamente 5x106 células. Un frasco de cada banco de semillas fue deshelado y crecido en PFBM-2 y el cultivo celular fue enviado para prueba de micoplasma (Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake, NY).EI ensayo de fluorocromo de ADN y los métodos de cultivo directos fueron negativos por la contaminación del micoplasma. Los anticuerpos (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11 L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) fueron expresados transitoriamente en las células 293-H o estables en células Sp2/0 según lo descrito abajo. Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 A-lgGI (V11L) (clon # 18) y Sp2/0-(hu)AR7BD-33-11 AlgG2M3(V11 L) (clon # 5) fueron expandidos en 0.8 litros en PFBM-2 que contenía 1 % de Ig FBS bajo en las botellas de cultivo giratorias (400 mL por botella de cultivo giratoria). Los anticuerpos monoclonales (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) fueron purificados del supernadante de cultivo gastado por cromatografía de afinidad en la Proteína A Sefarosa. Después de la centrifugación y filtración, el supernadante del cultivo de transfectantes transitorios o estables fue cargado en una columna HiTrap de la Proteína A HP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La columna fue lavada con 20 mM de amortiguador Na-Citrato (pH 7.0) que contiene 150 mM NaCI antes que el anticuerpo fuera eluido con 20mM del amortiguador Na-Citrato (pH 3.5). Las fracciones agrupadas eluidas fueron neutralizadas con 1.5M del amortiguador Na-Citrato (pH 6.5). La proteína fue dializada contra PBS y después filtrada a través de un filtro de 0.2 micrómetros antes del almacenaje a 4°C. La concentración del anticuerpo fue determinado midiendo la absorbencia en 280 nm (1 mg/mL = 1.4 ?2ß?)· El rendimiento fue 50 mg para (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI (V11L) y 22 mg para (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L). Los anticuerpos fueron después analizados por SDS-PAGE que fue realizado de acuerdo a los procedimientos estándares. Los anticuerpos 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11 L), y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) fueron calentados a 70°C por 10 minutos en presencia y ausencia del Agente de Reducción de la Muestra NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las recomendaciones del proveedor para reducir y no reducir las condiciones, respectivamente. Después de esto, los anticuerpos fueron activados en un gel 4-12 % Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 20 minutos en 200 voltios en el amortiguador de Activación NuPAGE MES SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Como estándares de la proteína, el intervalo del estándar de SDS-PAGE (BIO-RAD Laboratories, Hércules, CA) fue activado bajo condiciones de reducción. El gel fue manchado durante la noche a temperatura ambiente con SirnplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA) y después desteñido durante la noche a temperatura ambiente con H20. Los análisis SDS-PAGE (figura 34) bajo condiciones no reductoras indicaron que los anticuerpos de (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L) tienen un peso molecular de aproximadamente 150-160 kDa. El análisis bajo condiciones de reducción indicó que los anticuerpos (hu)AR7BD-33-11 A(V11 L) son comprendidos de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa y una cadena ligera con peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La pureza fue después analizada por cromatografía de exclusión de tamaño. La exclusión de tamaño de HPLC fue realizada usando un sistema Varion HPLC que consiste en un calentador de columna Rainin modelo CH-I, un sistema de suminitro de solvente Dynamax modelo SD200, y un monitor variable de longitud de onda Knaver. El software del sistema de control Varían Prostar/Dynamax 0.24 versión 5.51 fue utilizado para controlar el automuestreador, bomba, y detector, y para adquirir, almacenar, y procesar los datos. La separación fue lograda usando dos columnas TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL tamaño de exclusión HPLC (7.8 mm x 300 mm, tamaño de partícula de 5 micrómetros, tamaño de poro 250Á; TosoHaas, Montgomeryville, MD) conectado en serie. La fase móvil fue PBS, pH 7.4, y el caudal fue 1.5 mL/minuto. La columna de elución fue supervisada espectrofotométricamente en 280 nm. La pureza de los anticuerpos por tamaño de exclusión HPLC pareció ser mayor de 95 % puro (figura 35). La afinidad con CD63 humano de los anticuerpos (hu)AR7BD-33-11 A (V11L) que habían sido purificados de los supernadantes del cultivo de transfectantes estables fueron analizados por el método de competición FACS. Las células PC-3 fueron lavadas tres veces con PBS estéril (BioWhittaker, Walkersville, MD). Las células fueron incubadas en HBSS (BioWhittaker, Walkersville, MD) que contienen medios de 2.5 mM EDTA a 37°C en una incubadora con C02 por 5-7 minutos para separar las células. Las células fueron lavadas tres veces en FACS Amortiguador de Manchado (FSB) (PBS que contiene 0.5 % BSA (Sigma, St. Louis, MO)). El lavado final de las células fue realizado en las placas de ensayo de 96/pozo botón V (Nalgen Nunc Internacional, Rochester, NY) y el supernadante fue desechado. Cada pozo contuvo 106 células por prueba. Una mezcla de 7BD-33-11A conjugado con FITC (15 microgramos/mL de concentración final) y del anticuerpo competidor (7BD-33-11 A o (hu)AR7BD-33-11 A inicia en 400 microgramos/mL de concentración final y diluida en series de tres veces) en 100 microlitros/pozo fue agregada al gránulo de la célula en la placa de ensayo e incubada a 4°C durante 1 hora. Las células fueron lavadas tres veces en FSB, y después el gránulo fue resuspendido en 200 microlitros de 1 % de la solución de paraformaldehído y analizado pora la citometría de flujo en un citómetro de flujo láser dual FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San José, CA). Los anticuerpos 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI(V11 L) y (hu)AR7BD-33-11 A- lgG2M3(V11 L) compitieron con 7BD-33-11A conjugado con FITC en una manera dependiente de la concentración. Según lo mostrado en la figura 36, los valores del medio IC50 de 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) obtenidos usando el software de la computadora GraphPad Prism fueron 6.83 microgramos/mL, 12.7 microgramos/mL y 38.8 microgramos/mL, respectivamente. Un resultado representativo del ensayo de la competición FACS es mostrado en la figura 37. El enlace relativo de (hu)AR7BD-33-1 1A-lgGI(V11 L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) con CD63 humano fue aproximadamente 1.9- y 5.7- veces menor que el de 7BD-33-11A. Se ha mostrado previamente que la avidez de los anticuerpos de subclase lgG2 es de 2 a 3 veces más bajos que los de los anticuerpos de la subclase IgGI (Colé y colaboradores, 1997; Morelock y colaboradores, 1994) y aquí la misma diferencia de avidez fue observada entre los anticuerpos (hu)AR7BD-33-11A-lgGI(V11 L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L). Los anticuerpos humanizado (hu)AR7BD-33-11A-IgGI (V11L) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3(V11 L) son referidos de aquí en adelante como (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI y (hu)AR7BD-33-1 1A-lgG2M3 respectivamente. EJEMPLO 9 Experimentos del tumor in vivo con células A2058 Con referencia a las figuras 38 y 39, ratones SCID hembras de 4 a 6 semanas de edad fueron implantados con 500,000 células de melanoma humanas (A2058) en 100 microlitros de salino inyectados subcutáneamente en la nuca del cuello. Los ratones fueron divididos aleatoriamente en 4 grupos de tratamiento de 8 ratón/grupo. En el día después de la implantación, 2 mg/kg de los anticuerpos de prueba 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI, (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 o control de amortiguador fueron administrados intraperitonealmente a cada cohorte en un volumen de 300 microlitros después de la dilución de la concentración común con un diluyente que contuvo 2.7 mM KCI, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCI y 20 mM Na2HP04. El anticuerpo y las muestras de control fueron después administrados una vez por semana por la duración del estudio en la misma manera. El crecimiento del tumor fue medido aproximadamente cada séptimo día con calibradores. El grupo tratado con (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 recibió un total de 3 dosis debido a la disponibilidad del anticuerpo. El estudio fue terminado después de 34 días, ya que los animales alcanzaron los puntos finales de CCAC debido a las grandes lesiones ulceradas. En este punto, el control, 7BD-33-11A, y (hu)AR7BD-33-11A-lgGI trató a grupos que habían recibido 6 dosis. Los pesos corporales de los animales fueron registrados una vez por semana por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales fueron eutanizados de acuerdo al lineamiento de CCAC.

Ambos 7BD-33-11A y (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI murinos redujeron el crecimiento del tumor en un modelo in vivo establecido A2058 de cáncer de melanoma humano. La figura 38 muestra el efecto de los 3 anticuerpos en el crecimiento del tumor en 2 mg/kg comparados al control del amortiguador. En el día 27, cuando todos los ratones en los grupos del tratamiento continuaron vivos, 7BD-33-11A disminuyó el crecimiento del tumor aproximadamente 56 % (p = 0.0086), (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI disminuyó el crecimiento del tumor aproximadamente 63 % (p = 0.0016) y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 no tuvo ningún efecto significativo en el crecimiento del tumor (supresión del tumor 10 %). Estos resultados demuestran que el IgGI humanizado conserva la eficacia del anticuerpo murino, mientras que la eficacia es marcadamente disminuida en la versión lgG2M3. Esta disminución observada pudo ser debida, por lo menos en parte, al número más bajo de las dosis recibidas por el grupo de tratamiento lgG2M3, o a la avidez más baja del isotipo (ver arriba). No hubo señas clínicas de toxicidad a través del estudio. El peso corporal medido en los intervalos semanales fue un sustituto para que el bienestar y falla prosperen. La figura 39 presenta los resultados de peso corporal de cada uno de los grupos tratados durante el curso del estudio. No hubo cambios significativos en el peso corporal en ratones de cualquiera de los grupos de anticuerpos tratados comparados al grupo de control de amortiguador, en el día 27 o al final de estudio (día 34). En resumen, (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI demostró la misma o mayor eficacia comparada al anticuerpo murino en el modelo de melanoma A2058. Por el contrario, el anticuerpo quimérico de (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 no redujo el crecimiento del tumor en este modelo de melanoma humano A2058. Además, los anticuerpos murino y humanizados aparecen para ser bien tolerados por los ratones. EJEMPLO 10 Determinación de la afinidad de enlace de 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, (hu)AR7BD-33-11A-lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 con CD63 La afinidad de enlace de 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, y de (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3, fue comparada por la determinación de la disasociación respectivada constante después de enlazar a las bacterias expresadas y al constructor de la proteína de fusión GST recombinante purificada del dominio extracelular 2 (GST-EC2) de CD63 humano. Un anticuerpo anti-GST fue inmovilizado usando el procedimiento de acoplamiento estándar de la amina. La superficie de una chip sensor CM5 (Biacore, Uppsala, Suecia) fue activada por la inyección de 35 mL de una mezcla que contiene 0.05 M NHS y 0.2 M EDC en H20. El anticuerpo anti-GST fue inyectado en una concentración de 30 mg/mL en 10 mM de acetato de sodio pH 5.0 hasta 50,000 RU a 100,000 RU fueron capturados. Finalmente, 35 mL de 1.0 M etanolamina-HCI, pH 8.5, fueron inyectados para bloquear cualquier sitio activado en la superficie del chip sensor. GST-EC2 (25 mL) fue inyectado en 5 mg/mL seguidos por una inyección de 25-50 mL del anticuerpo. La regenración de la superficie del chip sensor para inyecciones posteriores fue lograda por la aplicación de dos pulsos de 10 mL de 20 mM de glicina pH 2.2. Los anticuerpos fueron inyectados en serie en la concentración que tiene un intervalo de 12.5 a 200 nM. Como un control, cada concentración del anticuerpo fue inyectada sobre una superficie donde GST, en vez de GST-EC2, fue capturado. La afinidad de los diferentes anticuerpos para el EC2 fue calculada de los niveles de enlace del estado constante medido. Para cada sensorgrama, un punto del informe fue tomado en 20 segundos antes de finalizar la inyección del anticuerpo (Req). Para cada concentración de anticuerpo, el Req obtenido cuando el anticuerpo fue inyectado sobre GST fue restado del Req obtenido cuando el anticuerpo fue inyectado sobre el GST-EC2. La cuesta de un diagrama de Req/Conc contra Req fue determinada y representada por la constante de asociación (KA). La constante disociación (KD) fue calculada como el recíproco de KA. Los experimentos fueron realizados usando un sistema Biacore 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia). Este experimento rindió los valores de 135 nM, 42 nM y 10 nM para 7BD-33-11A, A245.6 y H460-22-1, respectivamente (figura 40), por lo tanto indica que 7BD-33-11A tiene la afinidad más baja de los utilizados en este estudio. También indica que las afinidades de los anticuerpos humanizados (hu)AR7BD-33-11 A- IgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 son más altos que el del 7BD-33-11 A murino parental. Estos resultados son diferentes de los descritos en el ejemplo 8. Las diferencias en los resultados pueden ser debido, en parte, a lo siguiente. Antes que todo, diferentes metodologías fueron utilizadas, FACS contra resonancia por plasmón de superficie. También, en el ejemplo 8, las células PC-3 fueron utilizadas mientras que en el ejemplo 10, CD63 recombinante bacterianamente expresado fue utilizado. Estas dos fuentes pudieron representar ligeramente conformación diferente o formas glicosiladas de CD63. La preponderancia de la evidencia muestra que AR51A994.1, 7BDI-58, 7BDI-60, H460-22-1 , 7BD-33-11A, (hu)AR7BD-33-11 A-lgGI y 1A245.6 median los efectos anticancerígenos a través de la ligadura de los epitopes presentes en CD63. Se ha mostrado, en el ejemplo 4, que el anticuerpo AR51A994.1, 7BDI-58, 7BDI-60 y 7BD-33-11A puede utilizarse para inmunoprecipitar el antígeno cognado de las céluas de expresión tales como las células MDA-MB-231. Además podría mostrarse que el anticuerpo AR51A994.1, 7BDI-58, 7BDI-60, 73D-33-11A, (hu)AR7BD-33-M A-lgGI y (hu)AR7BD-33-11 A-lgG2M3 podría utilizarse en la detección de las células y/o tejidos que expresan un fracción antigénica CD63 que enlaza específicamente en el mismo, utilizando técnicas ilustradas por, pero no limitadas a FACS, célula ELISA o IHC. Así, podría ser mostrado que el inmunoprecipitado del antígeno AR51A994.1, 7BDI-58, 7BDI-60 y 7BD-33-11A puede inhibir el enlace de cualquier anticuerpo a tales células o tejido usando ensayos de FACS, célula ELISA o IHC. Además, como con el anticuerpo de AR51A994.1, 7BDI-58, 7BDI-60 y 7BD-33-11A, otros anticuerpos CD63 podrían utilizarse para inmunoprecipitar y aislar otras formas de antígeno CD63, y el antígeno puede también utilizarse para inhibir el enlace de los anticuerpos a las células o tejidos que expresan el antígeno usando los mismos tipos de ensayos. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a quienes la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones en la presente son incorporadas por referencia al mismo grado como si cada publicación individual fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada por referencia. Debe ser entendido que mientras que cierta forma de la invención es ilustrada, no debe ser limitado a la forma o al arreglo específico de las partes en la presente descritas y mostradas. Será evidente para los expertos en la técnica que los varios cambios pueden ser realizados sin salirse del alcance de la invención y la invención no deberá considerarse limitada a lo que se muestra y se describe en la especificación. El experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para realizar los objetivos y obtener los términos y ventajas mencionadas, así como los inherentes en el mismo. Cualquier oligonucleótido, péptido, polipéptido, biológicamente relacionados a los compuestos, métodos, procedimientos y técnicas descritas en la presente que son actualmente representativos de las modalidades preferidas, están deseadas para ser ejemplares y no están deseadas como limitaciones en el alcance. Los cambios en la misma y otros usos ocurrirán a los expertos en la técnica los cuales están comprendidos dentro del espíritu de la invención y están definidos por el alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con las modalidades preferidas específicas, deberá entenderse que la invención como es reivindicado no deberá limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, las varias modificaciones de los modos descritos para realizar la invención que son obvios a los expertos en la técnica son deseadas para estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (59)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal aislado codificado por el clon depositado con el IDAC como número de acceso 141205-01.

2. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, el cual es humanizado.

3. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, el cual es quimerizado.

4. Clon aislado depositado con el IDAC como número de acceso 141205-01.

5. Método para iniciar la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo de células cancerosas en una muestra de tejido seleccionada de un tumor humano que comprende: proporcionar una muestra de tejido de tumor humano; proporcionar al anticuerpo monoclonal aislado codificado por un clon depositado con el IDAC como número de acceso 141205-01 o un ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad para inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado a su antígeno marcado; y hacer contacto con el anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra de tejido; en donde el enlace del anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra del tejido induce la citotoxicidad celular.

6. Ligandoo del anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1.

7. Ligando del anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 2.

8. Ligando del anticuerpo quimerizado de conformidad con la reivindicación 3.

9. Anticuerpo o ligando aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 7 u 8 conjugados con un miembro seleccionado del grupo que consiste de fracciones citotóxicas, enzimas, compuestos radiactivos, y células hematógenas.

10. Método de tratar un tumor humano susceptible a la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo en un mamífero, en donde el tumor humano expresa un antígeno que enlaza específicamente al anticuerpo monoclonal aislado codificado por una clon depositado con IDAC como número de acceso 141205-01 o una citotoxicidad celular que induce el ligando del mismo, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad para inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado a su antígeno marcado, que comprende administrar al mamífero el anticuerpo monoclonal o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo en una cantidad efectiva para inducir la citotoxicidad celular y de tal modo reducir la carga del tumor del mamífero.

11. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal es conjugado con una fracción citotóxica.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la fracción citotóxiao es un isótopo radiactivo.

13. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal activa el complemento.

14. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal media la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

15. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo monoclonal es humanizado.

16. Método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo monoclonal es quimerizado.

17. Anticuerpo monoclonal aislado codificado por el clon depositado con el IDAC como número de acceso número 141205-06.

18. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, el cual es humanizado.

19. Anticuerpo de de conformidad con la reivindicación 17, el cual es quimerizado.

20. Clon aislado depositada con el IDAC como número de acceso número 141205-06.

21. Método para iniciar la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo de células cancerosas en una muestra de tejido seleccionada del tumor humano que comprende: proporcionar una muestra de tejido de tumor humano; proporcionar al anticuerpo monoclonal aislado codificado por un clon depositado con el IDAC como número de acceso 141205-06 o un ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad para inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado a su antígeno marcado; y hacer contacto con el anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra de tejido; en donde el enlace del anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra del tejido induce la citotoxicidad celular.

22. Ligando del anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 17.

23. Ligando del anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 18.

24. Ligando del anticuerpo quimerizado de conformidad con la reivindicación 19.

25. Ligando del antígeno o anticuerpo aislado de conformidad con las reivindicacións 17, 18, 19, 22, 23 ó 24 conjugado con un miembro seleccionado del grupo que consiste en fracciones citotóxicas, enzimas, compuestos radiactivos, y células hematógenas.

26. Método de tratar un tumor humano susceptible a la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo en un mamífero, en donde el tumor humano expresa un antígeno que enlaza específicamente con el anticuerpo monoclonal aislado codificado por un clon depositado con el IDAC como número de acceso 141205-06 o un ligando que induce la citotoxicidad celular, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad para inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno marcado, que comprende administrar al mamífero el anticuerpo monoclonal monoclonal o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo una cantidad eficaz para inducir la citotoxicidad celular y de tal modo reducir la carga del tumor del mamífero.

27. Método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal es conjugado a una fracción citotóxica.

28. Método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la fracción citotóxica es un isótopo radiactivo.

29. Método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal activa el complemento.

30. Método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o ligando monoclonal media la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

31. Método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo monoclonal es humanizado.

32. Método de conformidad con la reivindicación 26, en donde el anticuerpo monoclonal es quimerizado.

33. Anticuerpo monoclonal aislado codificado por el clon depositado con el ATCC como número de acceso PTA -4623,

34. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, el cual es humanizado.

35. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, el cual es quimerizado.

36. Clon aislado depositado con ATCC como número de acceso PTA-4623.

37. Método para iniciar la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo de células cancerosas en una muestra de tejido seleccionado que comprende un tumor humano: proporcionar una muestra de tejido de tumor humano; proporcionar al anticuerpo monoclonal aislado codificado por un clon depositado con el ATCC como número de acceso PTA-4623 o un ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad para inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno marcado; y hacer contacto con el anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra de tejido; en donde el enlace del anticuerpo monoclonal aislado o ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo con la muestra del tejido induce la citotoxicidad celular.

38. Ligando del anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 33.

39. Ligando del anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 34.

40. Ligando del anticuerpo quimerizado de conformidad con la reivindicación 35.

41. Anticuerpo o ligando aislado de cualquiera de las reivindicacións 33, 34, 35, 38, 39 ó 40 conjugado con un miembro seleccionado del grupo que consiste de fracciones citotóxicas, enzimas, compuestos radiactivos, y células hematógenas.

42. Método de tratar un tumor humano susceptible a la citotoxicidad celular inducida por el anticuerpo en un mamífero, en donde el tumor humano expresa un antígeno que une específicamente al anticuerpo monoclonal aislado codificado por un clon depositado con el ATCC como número de acceso PTA-4623 o un ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo, cuyo ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno marcado, que comprende administrar al mamífero el anticuerpo monoclonal o el ligando que induce la citotoxicidad celular del mismo en una cantidad eficaz para inducir la citotoxicidad celular y de tal modo reducir la carga del tumor del mamífero.

43. Método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando es conjugado con una fracción citotóxica.

44. Método de conformidad con la reivindicación 43, en donde la fracción citotóxica es un isótopo radiactivo.

45. Método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el complemento activa al anticuerpo monoclonal o ligando.

46. Método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando media la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

47. Método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el anticuerpo monoclonal es humanizado.

48. Método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el anticuerpo monoclonal es quimerizado.

49. Anticuerpo monoclonal capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal obtenible de una línea celular de hibridoma H460-22-1 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4622.

50. Anticuerpo monoclonal o ligando capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando del mismo reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal aislado obtenible de una línea celular de hibridoma 1A245.6 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4889; el anticuerpo monoclonal o ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno CD63 humano marcado.

51. Anticuerpo monoclonal o ligando capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando del mismo reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal aislado obtenible de una línea celular de hibridoma 7BDI-33-11A que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4890; el anticuerpo monoclonal o ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno CD63 humano marcado.

52. Anticuerpo monoclonal o ligando capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando del mismo reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal aislado obtenible de una línea celular de hibridoma 7BDI-60 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4623; el anticuerpo monoclonal o ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno CD63 humano marcado.

53. Anticuerpo monoclonal o ligando capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando del mismo reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal aislado obtenible de una línea celular de hibridoma 7BDI-58 que tiene el IDAC No. de Acceso 141205-01; el anticuerpo monoclonal o ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno CD63 humano marcado.

54. Anticuerpo monoclonal o ligando capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, en donde el anticuerpo monoclonal o ligando del mismo reacciona con el mismo epitope o epitopes de CD63 humano que el anticuerpo monoclonal aislado obtenible de una línea celular de hibridoma AR51A991.1 que tiene el IDAC No. de Acceso 141205-06; el anticuerpo monoclonal o ligando es caracterizado por una capacidad de inhibir competitivamente el enlace del anticuerpo monoclonal aislado con su antígeno CD63 humano marcado.

55. Anticuerpo monoclonal o ligando que reconoce el mismo epitope o epitopes como los reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4622, línea celular de hibridoma 1 A245.6 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4889, línea celular de hibridoma 7BD-33-11A que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4890, línea celular de hibridoma 7BDI-60 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4623, línea celular de hibridoma 7BDI-58 que tiene el IDAC No. de Acceso 141205-01 y línea celular de hibridoma AR51A994.1 que tiene el IDAC No. de Acceso 141205-06.

56. Proceso para tratar un tumor canceroso humano el cual expresa el antígeno CD63 humano que comprende: administrar a un individuo que sufre de cáncer humano, por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando que reconoce el mismo epitope o epitopes como los reconocidos por el anticuerpo monoclonal aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular de hibridoma H460-22-1 que tiene el ATCC No. de Acceso PTA-4622, línea celular de hibridoma 1A245.6 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4889, línea celular de hibridoma 7BD-33-11A que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4890, línea celular de hibridoma 7BDI-60 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4623, línea celular de hibridoma 7BDI-58 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-01 y la línea celular de hibridoma AR51A994.1 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-06; en donde el enlace del epitope o epitopes es eficaz en la reducción de la carga del tumor.

57. Proceso para tratar un tumor canceroso humano que expresa el antígeno CD63 humano que comprende: administrar a un individuo que sufre de cáncer humano, por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando que reconoce el mismo epitope o epitopes que los reconocidos por el anticuerpo monoclonal aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea de la celular de hibridoma H460-22-1 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4622, línea celular de híbridroma 1A245.6 que tiene ATCC No de Acceso PTA-4889, línea celular de hibridroma 7BD-33-11A que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4890, línea celular de hibridroma 7BDI-60 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4623, línea celular de hibridroma 7BD1-58 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-01 y línea celular de hibridroma AR51A994.1 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-06; en conjunto con por lo menos un agente quimioterapéutico; en donde la administración es eficaz en la reducción de la carga del tumor.

58. Ensayo de enlace para determinar una presencia de las células que expresan un epitope o epitopes de CD63 en una muestra de tejido de primate que comprende: proporcionar una muestra de tejido de primate que comprende; proporcionar por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando que reconoce el mismo epitope o epitopes que los reconocidos por el anticuerpo monoclonal aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular de hibridroma H460-22-1 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4622, línea celular de hibridoma 1A245.6 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4889, línea celular de hibridoma 7BD-33-11A que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4890, línea celular de hibridoma 7BDI-60 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4623, línea celular de hibridoma 7BDI-58 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-01 y la línea celular de hibridoma AR51A994.1 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-06; hacer contacto con por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando del mismo con la muestra del tejido de primate; y determinar el enlace de por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando del mismo con la muestra de tejido de primate; por lo que la presencia de las células en la muestra del tejido de primate es indicado.

59. Ensayo de enlace para determinar una presencia de células cancerosas que expresan un epitope o epitopes de CD63 en una muestra de tejido seleccionado de un tumor humano que comprende: proporcionar una muestra de tejido de tumor humano proporcionar por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando que reconocen el mismo epitope o epitopes los cuales son reconocidos por el anticuerpo monoclonal aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular de hibridoma H460-22-1 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4622, línea celular de hibridoma 1A245.6 que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4889, línea celular de hibridoma 7BD-33-11A que tiene ATCC No. de Acceso PTA-4890, línea celular de hibridoma 7BDI-60 que tiene ATCC No. de Acceso PTA- 4623, línea celular de hibridoma 7BDI-58 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-01 y línea celular de hibridoma AR51A994.1 que tiene IDAC No. de Acceso 141205-06; hacer contacto con por lo menos un anticuerpo monoclonal o ligando del mismo con la muestra del tejido; y determinar el enlace de por lo menos un anticuerpo ligando monoclonal del mismo con la muestra del tejido; por lo que la presencia de las células cancerosas en muestra del tejido es indicada.