JP2009525334A - Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンド - Google Patents

Abstract

本発明は、医薬上許容されるビヒクル中の、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達を刺激するＮａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの医薬組成物に関する。一つの実施態様において、この組成物は皮膚障害の処置に使用することができる。別の実施態様では、この組成物は心臓線維症の抑制に使用することができる。

Description

発明の背景

関連出願の参照
本願は、２００６年１月３１日出願の米国仮出願第６０／７６３，７８３号に基づく優先権主張を伴うものである。

発明の分野
本発明は、薬学上または化粧料上許容されるビヒクル中の、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達を刺激するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドの医薬組成物に関する。一つの実施態様において、前記組成物は皮膚障害の発症の予防および治療に使用可能である。他の実施態様では、前記組成物は、組織線維症の抑制に使用可能である。本発明者らはまた、本発明が高血圧症の治療および創傷閉鎖に有用であることも見出している。

発明の背景
化合物は局所適用または全身適用を介して薬剤として使用することができる。このための調製物は、担体、保護剤および抗酸化剤（ビタミンＣまたはＥなど）、ならびに他の医薬剤および薬理剤を含み得る。また、このような化合物は、それらの化合物が標的部位に向けられる分子認識を含む送達系（経口、局所適用、注射または移植）において使用可能であることも期待される。このような送達系は、とりわけ、リポソーム技術または免疫デバイスを含み得る。皮膚疾患などの異常の治療には、受容体および巨大分子の産生または細胞作用を調節し得る天然または合成の化学物質が有用である。

ここ数十年にわたり、多くの研究者が、Ｎａ^＋、Ｋ^＋−ＡＴＰアーゼ酵素系の調節に関与する可能性のある因子の存在を同定および確認するために、哺乳類組織および体液の抽出物の研究に多大な努力を注いできた。現在、Ｎａ^＋、Ｋ^＋−ＡＴＰアーゼ酵素系を阻害すると考えられるこのような内因性の因子または因子ファミリーの存在を裏付ける多くの証拠が得られている。さらに、これらの阻害特性は、いくつかの生理学的役割におけるこのような因子の関与を意味する。しかしながら、これらの初期の研究者がもたらした多数のデータにもかかわらず、それらの作用機序、ひいてはこのような因子の生理学的重要性に関して多くの議論がある。

発明の概要

本発明は、一般に、ある特定の障害を制御するためのある特定の化合物の利用に関する。本発明者らは、医薬上許容されるビヒクル中に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達を刺激する、薬学上有効量の少なくとも１種のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含んでなる医薬組成物を用いる。

前記組成物は、シグナル伝達Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと、脂質、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、イオンチャネル、輸送体、ならびに他の可溶性タンパク質および膜タンパク質の相互作用を誘発して、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームと呼ばれる種々のシグナル伝達複合体を形成させる。この過程により、正常な皮膚構造および機能が維持される。よって、被験体に有効量の本発明の医薬組成物を投与すると、そのような予防および治療を必要とする被験体において皮膚障害の発症が予防され、皮膚障害が治療される。この方法は、前記医薬組成物の局所投与または注射投与により皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進して、加齢性の皮膚の張りの低下（aging related loss of skin tone）を予防する、または回復させる工程を含む。この方法はまた、前記医薬組成物を局所的または全身的創傷閉鎖促進剤として用いる工程を含んでもよい。

本発明者らは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが種々の脂質およびタンパク質と相互作用することを実証した。これらの相互作用の結果、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームを構成する複数の機能的複合体が生じる。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが多くの重要な細胞機能を調節でき、そのポンピング機能に依存することなくＣＴＳのシグナルを伝達できるという認識により、本発明者らは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームの分子組成およびこのシグナロソームが機能する分子機構を定義することができた。これらの研究から、細胞機能の分子介入のいくつかの新たな標的、ひいては新規な治療薬および診断薬を得た。一つの実施態様において、本発明は、加齢性の皮膚の張りの低下を予防する、または回復させるため、ならびに創傷治癒を促進するための適用の１つを提供する。

本発明者らは、強心ステロイドであるマリノブファゲニン(marinobufagenin)（ＭＢＧ）の高い循環レベルと、部分的腎切除（ＰＮｘ）により誘発した実験的腎不全における心臓線維症との間の関係を見出した。要するに、本発明者らは、ＰＮｘ動物が実質的な心臓線維症を有していたことを見出した。また、この線維症は、ＭＢＧを投与して同等の血中レベルを達成することによっても誘発できた。この線維症は、ＰＮｘ術前に動物をＭＢＧに対して免疫化することにより減弱することができた。代表的な免疫組織化学画像を例示のために以下に示す。

本発明の他の目的および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明および添付図面を参照することにより、当業者には明らかとなる。

発明の具体的説明

一つの実施態様において、前記組成物は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームと呼ばれる種々のシグナル伝達複合体の形成を誘発する。別の実施態様では、前記医薬組成物は、医薬上許容されるビヒクル中の、薬理学上有効量の少なくとも１種のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達阻害剤である。この組成物は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達の阻害剤として機能する。好ましくは、そのような処置を必要とする被験体における皮膚障害の治療は、その被験体に有効治療量の前記医薬組成物を投与する工程を含む。

より具体的には、この処置は、前記組成物を、過剰な皮膚瘢痕の形成を回復させる、またはこれを予防する局所的または注射手段として用いる工程を含む。別の実施態様では、この処置は、そのような処置を必要とする被験体において線維症を阻害することであり、被験体に有効治療量の前記医薬組成物を投与する工程を含む。この医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁錠剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ剤、エアゾール剤、軟膏、ゼラチン軟カプセル剤およびゼラチン硬カプセル剤、坐剤、クリーム、ローション、溶液、ゲルならびにペーストからなる群から選択される投与形であり得る。

これらのＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドとしては、限定されるものではないが、植物または動物または半合成品のいずれかに由来する、一般に強心ステロイドと呼ばれる化学物質群（例えば、カルデノライド(cardenolide)およびブファジエノライド(bufadienolide)）が挙げられる。阻害剤としては、限定されるものではないが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと、ＥＧＦ受容体、Ｓｒｃキナーゼおよびカベオリン(caveolin)−１などのそのシグナル伝達相手との相互作用を妨げるものが挙げられる。処置を必要とする被験体としては(限定されるものではないが)、硬皮症などの全身性線維症状を有する被験体、ならびにウイルス性肝炎またはアルコール性肝炎による肝硬変といった局所的線維症状、腎疾患および／またはアテローム性動脈硬化症に関連する進行性心不全、ならびに糸球体腎炎、糖尿病および高血圧症に起因する進行性腎疾患を有する被験体が挙げられる。

Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰを膜間の電気的・化学的勾配に変換するために生物に不可欠なＰ型ＡＴＰアーゼファミリーに属する。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼはほとんど総ての哺乳類細胞で発現し、ＡＴＰの加水分解によって生じたエネルギーを用いて細胞膜を挟んでＮａ＋およびＫ＋のポンピングを行う。ここ数年、本発明者らの研究室では、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが重要な細胞シグナル伝達体としても機能するという証拠が得られている。本発明者らは、今般、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼには少なくとも２つの別々のプールが存在し、一方はイオンポンプとして機能し、他方は脂質、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、イオンチャネル、輸送体および他の可溶性タンパク質および膜タンパク質との相互作用に関わって、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームと呼ばれる種々のシグナル伝達複合体を形成することを示している。

図１は、心筋細胞におけるナトリウムポンプのシグナル伝達を表す模式図である。強心ステロイドの存在下では、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼはシグナル伝達体に変換され、Ｓｒｃおよび上皮細胞増殖因子受容体と複合体を形成する。シグナルカスケードが開始され、これはＲａｓに依存し、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成とＥＲＫの活性化をもたらす。次に、これが、ＳＥＲＣＡ発現の低下を含む遺伝子発現の変化、ならびにカルシウム循環の変化をもたらす。

図２は、ＭＢＧが心肥大と一致して機能的および解剖学的変化をもたらすことを示す。（ａ）擬似手術（Ｓｈａｍ、ｎ＝８）、部分的腎切除術（ＰＮｘ、ｎ＝８）、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ、ｎ＝１０）、またはＭＢＧに対する免疫化後の部分的腎切除術（ＰＮｘ−ＩＭ、ｎ＝８）の４週間後の収縮期ＢＰ。（ｂ）これら４群のラットの代表的様式の心エコー図。（ｃ）後壁の肥厚、（ｄ）左心室拡張終期径、（ｅ）左心室収縮終期径、および（ｆ）Ｓｈａｍ（ｎ＝８）、ＰＮｘ（ｎ＝１０）、ＭＢＧ（ｎ＝９）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝１６）の４週間後のＦＳ。^＊Ｐ＜０．０５（対ＰＮｘ）；＃＃Ｐ＜０．０１（対ＰＮｘ）。

図３は、心臓線維症、腎線維症および肝線維症に対するＭＢＧの効果を示す。

図４は、ＭＢＧの作用が創傷治癒を促進することを示す。

図５（ａ）および（ｂ）は、プロコラーゲン発現に対するＭＢＧの効果を示す。

図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）において、ＭＢＧは拡張機能障害と一致した血行力学的変化をもたらす。（ａ）最大血圧変化率（＋ｄＰ／ｄｔ）、（ｂ）最小血圧変化率（すなわち、最も負の血圧変化率、−ｄＰ／ｄｔ）に対する＋ｄＰ／ｄｔの比、（ｃ）左心室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）、および（ｄ）擬似手術（Ｓｈａｍ、ｎ＝１４）、部分的腎切除術（ＰＮｘ、ｎ＝１５）、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ、ｎ＝１２）、またはＭＢＧに対する免疫化後の部分的腎切除術（ＰＮｘ−ＩＭ、ｎ＝１４）の４週間後の等容性弛緩の時定数。^＊Ｐ＜０．０５（対Ｓｈａｍ）；^＊＊Ｐ＜０．０１（対Ｓｈａｍ）；＃Ｐ＜０．０５（対ＰＮｘ）；＃＃Ｐ＜０．０１（対ＰＮｘ）。

図７（ａ）〜（ｈ）において、ＭＢＧは実験的尿毒症と一致した心臓形態およびタンパク質発現の変化をもたらす。（ａ）擬似手術（Ｓｈａｍ、ｎ＝１８）、部分的腎切除術（ＰＮｘ、ｎ＝２０）、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ、ｎ＝２０）、またはＭＢＧに対する免疫化後の部分的腎切除術（ＰＮｘ−ＩＭ、ｎ＝１８）の４週間後の心臓重／体重（ＨＷ／ＢＷ）比。（ｂ）Ｓｈａｍ（ｎ＝１５）、ＰＮｘ（ｎ＝１４）、ＭＢＧ（ｎ＝７）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝７）の４週間後の左心室心臓ホモジネートにおける細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ−１、ｐ４４）の活性化。５０μｇの左心室ホモジネートタンパク質をゲルにロードした。代表的な活性ＥＲＫブロットと全ＥＲＫブロットを示す。（ｃ）Ｓｈａｍ（ｎ＝１５）、ＰＮｘ（ｎ＝１３）、ＭＢＧ（ｎ＝１０）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝６）の４週間後の左心室心臓ホモジネートにおけるＳｒｃ（Ｓｒｃ ｐＹ^４１８）の活性化。７５μｇの左心室ホモジネートタンパク質をゲルにロードした。代表的な活性Ｓｒｃブロットと全Ｓｒｃブロットを示す。Ｓｈａｍ（ｎ＝１５）、ＰＮｘ（ｎ＝１３）、ＭＢＧ（ｎ＝１０）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝６）の４週間後の（ｄ）骨格筋アクチン（ｓｋＡＣＴ）、（ｅ）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ ａ１、（ｆ）Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ ａ２、および（ｇ）ＳＥＲＣＡ２ａの発現。２０μｇの左心室ホモジネートタンパク質をｄ〜ｇのゲルにロードした。（ｈ）Ｓｈａｍ（ｎ＝８）、ＰＮｘ（ｎ＝６）、ＭＢＧ（ｎ＝８）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝８）の４週間後の左心室心臓ホモジネートにおけるＳＥＲＣＡ２ａの酵素活性。ウエスタンブロットデータの棒グラフはこれらのブロットの濃度測定分析をまとめたものである。^＊＊Ｐ＜０．０１（対Ｓｈａｍ）、^＊Ｐ＜０．０５（対Ｓｈａｍ）、＃Ｐ＜０．０５（対ＰＮｘ）、＃＃Ｐ＜０．０１（対ＰＮｘ）。

図８（ａ）および（ｂ）は、ＭＢＧが心臓線維症を誘発することを示す。（ａ）擬似手術（Ｓｈａｍ）、部分的腎切除術（ＰＮｘ）、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ）、またはＭＢＧに対する免疫化後の部分的腎切除術（ＰＮｘ−ＩＭ）の４週間後の左心室心臓組織の代表的なマッソンのトリクローム染色切片。Ｓｈａｍ（ｎ＝８）、ＰＮｘ（ｎ＝１０）、ＭＢＧ（ｎ＝１０）、またはＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝１０）の４週間後の、左心室心臓切片のトリクロームスライドに対する（ｂ）半定量的グレードおよび（ｃ）定量的形態計測的線維症スコアリング。（ｄ）Ｓｈａｍ（ｎ＝９）、ＰＮｘ（ｎ＝９）、ＭＢＧ（ｎ＝９）、およびＰＮｘ−ＩＭ（ｎ＝９）からのフィブロネクチン発現および定量データ。５０μｇの左心室ホモジネートタンパク質をゲルにロードした。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（対Ｓｈａｍ）、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１（対ＰＮｘ）。

強心ステロイド（ＣＴＳ）としては、ジゴキシン(digoxin)およびウワバイン(ouabain)などの植物由来ジギタリス薬、ならびにブアラン(bualin)およびマリノブファゲン(marinobufagen)などの脊椎動物由来アグリコンが挙げられる。ＣＴＳは、その発見以来、薬物としてのみ考えられてきたが、最近の研究では、ウワバインおよびマリノブファゲニンの双方は、その産生および分泌がＡＣＴＨおよびアンギオテンシンＩＩをはじめとする多数の病理学的または生理学的刺激により調節される内因性ステロイドとして確認されている。ウワバインおよびマリノブファゲニンの血圧に及ぼす影響は、現在、十分に記載されている。さらに、最近、本発明者らおよび他の研究者らは、低用量のこれらステロイドがラットにおいて高血圧症を誘発するだけでなく、血圧に対するそれらの作用には依存しない有意な心血管の再構成を起こすことを示している。さらにまた、これらのステロイドは、細胞増殖およびコラーゲンをはじめとする細胞外基質タンパク質の細胞産生を調節する。

ＣＴＳがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの特異的なリガンドであり、阻害剤であることは十分に確認されている。初期の研究では、ＣＴＳが遺伝子発現および細胞増殖を調節することが実証されている。本発明者らの研究室からの最近の研究では、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼにより媒介されるシグナル伝達とＣＴＳにより引き起こされる細胞機能の変化との間の関連が見出され、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼが細胞内Ｎａ＋およびＫ＋濃度の変化に依存しない機構によって細胞外ＣＴＳシグナルを伝達し得ることが示されている。このシグナル伝達ＮＡ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは小胞内に存在し、チロシンキナーゼＳｒｃとともに受容体複合体を形成する。ウワバインなどのＣＴＳはアゴニストとして作用し、この受容体を刺激し、シグナル伝達Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ／Ｓｒｃ複合体に会合するか、またはそれと近接しているかのいずれかであるタンパク質のチロシンリン酸化をもたらす。次に、これがＥＧＦＲなどの受容体チロシンキナーゼをトランス活性化し、タンパク質キナーゼカスケードを開始させる。同定されている経路には、Ｐ１３Ｋ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＥＲＫおよびＰＬＣ／ＰＫＣアイソザイムの活性化が含まれる。この経路はまた、ミトコンドリアの反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を増加させる。他の複合体と同様、ＣＴＳによるこの複合体の活性化は、活性化された複合体のエンドサイトーシス、ひいては活性化された複合体の終結、またはその特異的細胞内コンパートメントへの標的化を誘発する。いくつかのＲＴＫとは異なり、シグナル伝達Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、他の膜輸送体およびチャネルと相互作用し得るスキャフォールドとしても機能することができる（図１）。例えば、本発明者らは、シグナル伝達Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの足場形成およびキナーゼ調節能が、培養ＬＬＣ−ＰＫ１細胞において、ウワバインのＣａ^２＋移行を可能とすることを示している。

擬似手術、実験的腎不全（ＰＮｘ）、ミニポンプによるＭＢＧの補給（ＭＢＧ）、およびＭＢＧに対する免疫化後のＰＮｘ術を行ったラットから得られた心臓組織の免疫組織化学的研究。本発明者らは、タンパク質の存在に着目した（左のパネルはプロコラーゲン、右のパネルは平滑筋アクチン）（示されていない）。ビメンチン(vimentin)またはフィブロネクチンでも同様の写真が得られた。ウエスタンブロットデータによれば、上記で示した視覚的傾向が確認できる（データは示されていない）。

これらのデータに基づき、本発明者らは、次に、ＭＢＧが細胞培養系において線維芽細胞に直接的影響を及ぼすかどうかを調べることを選択した。以下のデータは本発明者らのこれまでの知見を示す。

ＭＢＧ濃度の関数としてのプロコラーゲンの発現。上のパネルはウエスタンブロット、下のパネルは１０回の実験の平均値＋／−ＳＥＭである。^＊＊ｐ＜０．０１（対照に対して）。心臓線維芽細胞によるコラーゲンへのプロリン組み込みは、用量依存的にＭＢＧにより誘発される。データは６回の実験の平均値＋／−ＳＥＭとして示す（^＊＊ｐ＜０．０１、対照に対して）（１の位置の水平のバー）。

次に、本発明者らは、皮膚の線維芽細胞株が同様の応答を示すかどうかを調べた。これはBashar Kahaleh博士から厚意により提供された皮膚線維芽細胞を用いて行った。培養増殖させたこれらのヒト細胞を用い、本発明者らは、以下に示すように皮膚線維芽細胞がＭＢＧに対して著しい応答を示したことに着目した。この応答の大きさは、線維症の「従来の」刺激剤であるＴＧＦβの最大用量と比較することにより示される（下記参照）。さらに、本発明者らは、不死化線維芽細胞株が、同様に、ＭＢＧ、ウワバインおよびジゴキシンに応答したことを見出した。

ＴＧＦβと比較した際のＭＢＧに対する皮膚線維芽細胞の応答。ＭＢＧにおけるコラーゲン発現の増加が、５または１０ｎＭのＭＢＧでおよそ１０倍であることは着目に値する。線維芽細胞株のプロコラーゲン発現に対するウワバイン、ＭＢＧおよびジゴキシンの匹敵する作用がウエスタンブロットで実証された。

これらのデータを合わせ、本発明者らは、プロコラーゲン発現がＭＢＧなどの強心ステロイドにより著しく増強されるという所見を得た。本明細書には示されていない他の研究において、本発明者らは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達が前線維化作用に不可欠であると思われるという所見を得た。さらに、本発明者らは、ＲＯＳの排除、Ｓｒｃの阻害またはＥＧＦＲトランス活性化の回避による、このカスケードを介したシグナル伝達の拮抗が、コラーゲン合成の誘発を妨げたという所見も得た。

ＭＢＧにより誘発されるプロコラーゲンの発現は、Ｓｒｃ阻害（ＰＰ２）、非特異的チロシンキナーゼ阻害（ハービマイシン(Herbimycin)）またはＥＧＦＲトランス活性化の回避（ＡＧ１７８）により減弱することができる。上のパネルは代表的なウエスタンブロットであり、下のパネルは６回の実験の平均値＋／−ＳＥＭである。^＊＊Ｐ＜０．０１（対照に対して）。プロリン(praline)の組み込みによって評価されるコラーゲン合成はＭＢＧにより増強される。しかしながら、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびＰＰ２は双方ともこれを妨げる。

次に、本発明者らは、創傷治癒が強心ステロイドにより有利な影響を受けるかどうかを調べた。本発明者らは、マウス線維芽細胞株であるＳＹＦ＋Ｓｒｃ株を集密状態まで増殖させ、ピペットチップで引っ掻くことにより傷を付けた。本発明者らは、このｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒モデルにおいて、ＭＢＧによる１２時間の前処理が、実験的傷害部位の閉鎖を著しく促進したという所見を得た（下記参照）。

傷害後３時間、７時間および１２時間の線維芽細胞の代表的な画像。線維芽細胞培養からの創傷閉鎖の定量。データは、Ｎ＝６の個々の実験対を表し、各々、各時点での３回の測定を含む。データは平均値＋／−ＳＥＭとして示されている。^＊＊＜０．０１。本発明者らは、強心ステロイドの局所投与または注射投与により皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を増強し、加齢性の皮膚の張りの低下を予防する、または回復させることを提案した。

本発明者らはまた、創傷閉鎖に対する局所的または全身的促進法の開発も提案する。

最後に、このプロセスの拮抗作用により、本発明者らは、過剰な皮膚瘢痕形成（例えばケロイド）を回復させる、または予防する局所的手段または注射手段の開発を提案する。

別の実施態様では、本発明者らは、最近、ラットにおける実験的腎不全が、強心ステロイドであるマリノブファゲニン（ＭＢＧ）の循環濃度の増加および実質的な心臓線維症を伴うことを見出した。本発明者らは、ＭＢＧが心臓線維芽細胞のコラーゲン産生を直接刺激するかどうかを調べるため、以下の研究を行った。実験的腎不全（ＰＮｘ）の５／６腎切除モデル、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ）、ＭＢＧに対する免疫化後のＰＮｘ、およびＰＮｘと副腎摘出の同時処置を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。ミラーカテーテルおよび免疫組織化学を用いた生理学的測定を行った。次に、培養単離心臓線維芽細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ研究を行った。本発明者らは、ＰＮｘおよびＭＢＧが、ＭＢＧレベル、血圧、心臓サイズ、拡張期機能の障害、および心臓線維症の発生を高めるという所見を得た。ＭＢＧに対する免疫化後のＰＮｘ、およびＰＮｘと副腎摘出の同時処置も、ＰＮｘと同様に血圧を上昇させたが、心肥大、拡張機能障害および心臓線維症は軽かった。ＭＢＧは、１ｎＭ濃度で、培養心臓線維芽細胞によるプロコラーゲン−１の発現の増強を誘発した。これらのプロコラーゲン発現の増強は、プロコラーゲン−１タンパク質の安定性に明らかな上昇を示さずに、コラーゲン翻訳の増加およびプロコラーゲン−１ ｍＲＮＡの増加を伴っていた。ＭＢＧによる線維芽細胞の刺激は、チロシンのリン酸化、Ｓｒｃの活性化、上皮細胞増殖因子受容体のトランス活性化およびＮ−アセチルシステインの阻害剤の投与により妨げることができた。これらの知見に基づき、本発明者らは、ＭＢＧが線維芽細胞によるコラーゲン発現の増強を直接誘発することを提案し、また、本発明者らは、これが実験的腎不全で見られる心臓線維症において重要である可能性があることを示す。

本発明者らはこれまでに、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達を行う強心ステロイド、マリノブファゲニン（ＭＢＧ）が、ラットにおいて部分的腎切除術（ＰＮｘ）により誘発された実験的尿毒症性心筋症の多くの特徴に直接関与していることを実証した。具体的には、本発明者らは、ＰＮｘを受けたラットおよびミニポンプによりＭＢＧ補給を与えたラットの双方が４週間までに著しい心肥大と線維症をきたしたが、ＭＢＧに対して免疫化した後にＰＮｘを受けたラットではこれらの変化が減弱されたことに着目した。これらのデータから、本発明者らは、ＭＢＧが直接的に心臓線維芽細胞のコラーゲン産生を誘発し、ひいては実験的腎不全で見られる心臓線維症の大部分をもたらすという仮説を立てた。この仮説を検証し、これが起こる分子的基礎を調べるため、以下の研究を行った。

方法
動物：
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを総ての研究に用いた。本明細書に記載されている総ての動物実験は、the Medical University of Ohio Institutional Animal Use and Care Committeeにより認可されたプロトコールを用い、the National Institutes of Health Guide for the Care and use of Laboratory Animalsに従って行った。

実験群：
要約すると、外科術時に体重約２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、ＭＢＧ注入を行わない擬似手術（Ｓｈａｍ）、１０μｇ／ｋｇ／日でＭＢＧを注入するミニポンプの留置を伴う擬似手術（ＭＢＧ）、ＰＮｘ、およびＭＢＧに対する免疫化後のＰＮｘ（ＰＮｘ−ＩＭ）のいずれかを行った。極めて高純度（＞９９％）のＭＢＧがKennedyらによりオオヒキガエル（Bufa marinus）の毒液から単離された。これらの操作の他、ＰＮｘ動物群に同様に副腎摘出を施した（ＰＮｘ−ＡＤｘ）。

体重に対して標準化した心臓重、左心室血行力学（例えば、下大静脈閉塞により形成した拡張終期容積に対する拡張終期圧に当てはめた回帰直線の傾きτ値、総てミラーカテーテルを用いて測定）、血漿［ＭＢＧ］（これまでに記載のようにＤＥＬＰＨＩＡを用い、Ｃ−１８カラム上で抽出した後に測定）、アルドステロン（ＥＬＩＳＡキット１０００４３７７、Cayman Chemicalを用いて測定）および心臓免疫組織化学（下記参照(vida infra)）を、外科術４週間後に評価した。

単離心臓線維芽細胞：
成体ラット心臓線維芽細胞の調製は、これまでにBrillaらが報告している手法を改変して行った。

ウエスタンブロット解析：
ウエスタンブロット解析は、これまでに記載されているように、組織ホモジネート、細胞培養物の全細胞溶解物、または核抽出物から単離されたタンパク質に対して行った。

コラーゲンの合成：
コラーゲン合成率は、Nishidaらの方法を改変して測定した。

コラーゲン−１ ｍＲＮＡの定量的測定：
これまでに報告されているように、標準ＲＴ−ＰＣＲを用い、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ転写物を用いて遺伝子発現を測定した。

結果
血圧、心臓血行力学および線維症に対する実験的腎不全およびＭＢＧの効果：
このｉｎ ｖｉｖｏ研究において、本発明者らは、擬似手術対照に比べてＰＮｘ処置ラットおよびＭＢＧ処置ラットでＭＢＧレベルが上昇したという所見を得た。本発明者らはまた、ＰＮｘラットおよびＭＢＧラットの双方が対照よりも収縮期血圧が高いこと、また、ＰＮｘ−ＩＭラットがＰＮｘで見られたものと統計学的に同等の収縮期血圧値を有することを見出した。本発明者らの従前の報告の心エコー図法よりもむしろミラー血圧／容積センサーカテーテルを用いることにより、本発明者らは、ＰＮｘが、擬似手術対照と比較して収縮終期容積および拡張終期容積の低下ならびに駆出率の上昇を誘発したという所見を得た。ＰＮｘに比べて、ＰＮｘ−ＩＭでは、収縮終期容積および拡張終期容積が大きく、駆出率値は低かった。評価された能動的弛緩は、擬似手術対照に比べてＰＮｘおよびＭＢＧの双方により低下しており、ＰＮｘ−ＩＭはＰＮｘよりも低い値を示すことが分かった。大静脈閉塞の際に作成した血圧用量ループを用い、本発明者らは、拡張終期圧容積関係（受動的伸展性の逆測定）が対照に比べてＰＮｘ処置およびＭＢＧ処置動物で高まり、ＰＮｘラットがＰＮｘよりも低い拡張終期圧容積関係を有することを見出した。ＰＮｘおよびＭＢＧの両処置では、擬似手術対照に比べて心臓重／体重比が上昇していたが、ＰＮｘ−ＩＭ動物ではＰＮｘより低い値であった。トリクローム画像で判定された心室筋細胞の横断面面積を調べたところ、本発明者らは、ＰＮｘおよびＭＢＧ注入の双方が著しい増大を誘発し、ＰＮｘ−ＩＭの筋細胞横断面面積は、ＰＮｘ単独で見られたものよりも著しく小さいことを見出した。

血行力学および血漿ＭＢＧに対するＰＮｘ、ＭＢＧおよびＰＮｘ−ＩＭの効果：

免疫組織化学の結果を分析したところ、ＭＢＧおよびＰＮｘを施したラット由来の心臓組織は、コラーゲン−１および平滑筋アクチン染色に著しい増加を示した。ＭＢＧに対する免疫化はこれらの増加を減弱した。ウエスタンブロット解析によれば、ＰＮｘおよびＭＢＧのプロコラーゲン−１および平滑筋アクチンの発現は擬似手術対照で見られたものの２〜２．５倍であり、ＰＮｘ−ＩＭのプロコラーゲン−１および平滑筋アクチンの両発現はＰＮｘで見られたものより実質的に低かった。

この線維症の分子機構を調べるため、本発明者らは線維芽細胞の活性化に重要ないくつかのタンパク質の発現を調べた。具体的には、本発明者らは、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、Ｓｍａｄ２／３およびＳｍａｄ４、ならびにｐＳｍａｄ２／３の組織レベルを調べた。本発明者らは、これらのタンパク質の心臓発現について、実験群間の有意差を検出することができなかった。

また、別の動物群（Ｎ＝１１）にも、グルココルチコイドおよびアルドステロンの生理学的補充を伴うＰＮｘ−ＡＤｘを行った。これらの動物はＰＮｘに比べて同程度の高血圧を生じさせたが、ＰＮｘ単独に比べて、はるかに低い血漿ＭＢＧおよびアルドステロンレベル、ならびに実質的に低い心臓重／体重比を示したことは注目に値する（表）。さらに、ＰＮｘ−ＡＤｘを施したこれらの動物は、コラーゲン−１または平滑筋アクチンに対するトリクローム染色または免疫組織化学的染色に基づく心臓線維症の証拠をほとんど示さなかった。

線維芽細胞のコラーゲン発現に対する強心ステロイドの効果：
この心臓線維症の分子的基礎をさらに調べるために、単離された心臓線維芽細胞を増加用量のＭＢＧ（１０^−１０、１０^−９、および１０^−８Ｍ）に供した。１０^−９および１０^−８Ｍ ＭＢＧに曝して２４時間後、ウエスタンブロットによって測定したプロコラーゲン含量は約２倍上昇していた（いずれもＰ＜０．０１；図３ａ）。この現象はＭＧＢに特異的なものではなく、他の強心ステロイドもプロコラーゲン含量に同様の増加を誘発した（図３ｂ）。興味深いことに、ＭＢＧの作用閾値は１０^−１０〜１０^−９Ｍの間にあると思われ、尿毒症性ラットにおいて同様の濃度で循環しているウワバインの場合、閾値は約１０倍高かった（すなわち、１０^−９〜１０^−８Ｍの間）。ＭＢＧおよびウワバインの双方に関して、コラーゲン発現を誘発する閾値は、これらの細胞における^８６Ｒｂ取り込みに対する検出可能な作用に必要な用量よりｌｏｇ単位で低かった。コラーゲンへの放射性標識プラリン（praline）の組み込みを調べるための並行研究において、本発明者らは、１０^−９および１０^−８ＭのＭＢＧがマトリックスおよび上清の双方の総タンパク質へのプラリンの組み込みにいずれも有意な増加を誘発したという所見を得た。本発明者らは、コラゲナーゼ消化を用い、プラリンの組み込みの大部分がコラーゲンへの取り込みであるという所見を得た。本発明者らは、標準ＲＴ−ＰＣＲを用い、１０ｎＭのＭＢＧに応答した２４時間時点でのコラーゲン−１のｍＲＮＡの倍増を見出した。しかしながら、本発明者らは、この濃度のＭＢＧに応答したプロコラーゲン安定性（シクロヘキシミドに曝した後にプロコラーゲン−１の発現を調べることにより測定）に増強を検出することはできなかった。

ＭＢＧにより刺激されるコラーゲン発現に対するＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達阻害の効果：
強心ステロイドがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達によりコラーゲン合成を誘発するかどうかを調べるため、本発明者らは次の研究を行った。まず、本発明者らは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼカスケードにおけるいくつかの段階で薬理学的拮抗作用を用いた。具体的には、本発明者らは、ＰＰ２によるＳｒｃ活性化の薬理学的拮抗作用、ハービマイシンによる非特異的チロシンキナーゼ阻害、ＡＧ１４７８によるＥＧＦＲトランス活性化の阻害、およびＮ−アセチルシステインによる非特異的抗酸化剤投与を用いた。これらの操作は各々、コラーゲン合成のＭＢＧ刺激を妨げた。これらのデータを確認するため、本発明者らはまた、ＰＰ２またはＮ−アセチルシステインのいずれかの存在下および不在下でＭＢＧに応答した放射性標識プラリンの組み込みを調べた。プロコラーゲン発現の場合と同様に、ＰＰ２およびＮ−アセチルシステインは双方とも、一次線維芽細胞培養物において、コラーゲンへのプラリン組み込みの増加を妨げた。次に、本発明者らは、ＳＹＦ細胞およびＳＹＦ＋細胞（詳細はオンライン増補で得られる）で研究を行った。ＳＹＦ＋細胞は、プロコラーゲン発現のアップレギュレーションに関して一次心臓線維芽細胞培養物と極めて類似した様式でＭＢＧおよびウワバインに応答し、ＳＹＦ細胞は本質的にＭＢＧまたはウワバインのいずれにも応答しなかった。

ＴＧＦ−βとＭＢＧにより刺激されるコラーゲン産生の間の関係：
強心ステロイドが線維芽細胞においてコラーゲン産生を誘発する分子機構をさらに調べるため、本発明者らは、ＴＧＦ−β発現、ならびにＳｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４およびｐＳｍａｄ２／３の発現に対するＭＢＧの効果を調べた。最初に記載されたｉｎ ｖｉｖｏ実験の場合と同様、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦ−β、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４またはｐＳｍａｄ２／３発現において有意差は見られなかった。次に、本発明者らは、ＴＧＦ−βがコラーゲン産生を誘導するかどうか、およびＴＧＦ−βとＭＢＧの間に相乗作用があるかどうかを調べた。一次培養細胞において、本発明者らは、プロコラーゲン発現に対して、強心ステロイドで見られたものと同様のＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ）の効果を見出したが、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ）とＭＢＧ（１０ｎＭ）の間に相乗作用は見られなかった。しかしながら、本発明者らは一次培養物を決して完全な血清飢餓状態にしておらず、血清は常に存在し、ＴＧＦ−βもいくらか常に存在していたということを指摘することが重要である。

この点にさらに取り組むため、本発明者らはまた、ＭＢＧにより刺激されるコラーゲン産生に対するＴＧＦ−β受容体アンタゴニストとしてのＳＢ４３１５４２の効果を調べた。興味深いことに、ＳＢ４３１５４２は１００μｍｏｌ／Ｌの濃度で、ウエスタンブロットにおいて、プロコラーゲン発現をベースライン以下に低下させることはなかった(did not educe)が、放射性標識プロリンの組み込みを対照細胞で見られたものより低く低下させた。ＳＢ４３１５４２はコラーゲン発現および放射性標識プロリンの組み込みのＴＧＦ−βおよびＭＢＧ（１０ｎＭ）双方の刺激を完全に遮断した。

心臓線維症は多くの心筋症の重要な要素であり、尿毒症性心筋症の極めて特徴的な要素である。本発明者らおよび他の研究者らは、ＭＢＧおよび他の強心ステロイドが、小胞に存在する原形質膜Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達カスケードを誘発し、その結果、Ｓｒｃの活性化、ＥＧＦＲのトランス活性化、反応性酸素種の生成および最後にはｐ４２／４４マイトジェン(mitrogen)活性化タンパク質キナーゼの活性化をもたらすことを見出した。興味深いことに、腎不全以外の心臓線維症に関連するいくつかの臨床状況（例えば、高血圧、原発性アルドステロン症およびうっ血性心不全）が強心ステロイドの循環濃度の上昇に関連している。腎不全以外の心筋症に対する本発明者らの知見の関連性の可能性が予備的に考察されているが、本発明者らは、Ferrandiらが、内因性強心ステロイドのＰＳＴ２２３８との拮抗作用が高血圧ならびにミラン高血圧ラットの心肥大を改善することを見出したことを指摘しておくべきであろう。

本研究において、本発明者らは、ＰＮｘおよびＭＢＧ処置が、血行力学および心臓形態学において、類似してはいるが同一でない表現型変化を誘発することを確認した。ＭＢＧ以外のいくつかの因子がＰＮｘで見られる表現型変化に寄与している可能性もかなり高い。すなわち、ＰＮｘ−ＩＭおよびＰＮｘ−ＡＤｘは双方とも、循環ＭＢＧを引き下げ、血圧に有意な影響を及ぼさずに心臓の機能的および形態学的変化を実質的に減弱する。本発明者らは、培養増殖させた副腎細胞はＭＢＧを産生すると思われることから、この手順がこのホルモンの循環レベルを低下させる可能性があるという理由から、このＰＮｘ−ＡＤｘモデルにおける実験を行ったことを指摘しておくべきであろう。しかしながら、ＰＮｘ−ＡＤｘ動物における本発明者らのデータは、副腎がｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＢＧ産生の主要部位（唯一というわけではない）であるという概念を裏付けるものであるが、副腎において産生された他のホルモンが他所でのＭＢＧの産生を調節するという可能性もある。正常条件および病的条件下でＭＢＧが厳密にどこで産生されるかを明確にするにはさらなる研究が必要である。

心臓線維症の病理におけるＭＢＧに関するこれらの知見により、本発明者らは線維症の分子機構に特に着目した。興味深いことに、ＴＧＦ−βまたはＳｍａｄタンパク質を介したシグナル伝達の増強の証拠は明白ではなかった。本発明者らは、これらのデータがこのプロセスにおけるＴＧＦ−βの役割を排除するものではないことを強調するが、その理由は、これらのタンパク質の初期の増強、Ｓｍａｄの転移および／またはこの経路を介したシグナル伝達の許容的役割（下記参照(vida infra)）が確かに存在し得るためである。

これらのｉｎ ｖｉｖｏデータに基づき、本発明者らは単離心臓線維芽細胞において研究を行った。本発明者らは、ＭＢＧが生理学的濃度で、もっとコラーゲンを産生するよう線維芽細胞を直接刺激することを見出した。このコラーゲン産生の増加は他の強心ステロイドでも見られたが、その閾値濃度は、ウワバインよりもＭＢＧに負うまで約１ｌｏｇであると思われる。本発明者らは、コラーゲン発現の刺激に必要なＭＢＧおよびウワバイン双方の濃度は、両物質について、Ｒｂの取り込みを明らかに阻害するのに必要な濃度よりも低かったことを強調する。この現象がＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達に依存しているさらなる証拠は、この増強が、本発明者らがＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームを介したシグナル伝達を遮断したことを従前に示した操作である、反応性酸素種の排除、拮抗作用、またはＳｒｃのノックアウト、ならびにＥＧＦＲトランス活性化の回避により妨げられたということである。本発明者らはまた、コラーゲン産生の増強がプラリンの組み込みの増加ならびにプロコラーゲン−１のｍＲＮＡの増加に関連していることを見出した。ＭＢＧに応答したコラーゲン−１の安定性の上昇は示すことができなかった。

ＴＧＦ−βまたはＳｍａｄタンパク質の増加は、ＭＢＧで処置した線維芽細胞においても見られなかったが、本発明者らが研究した線維芽細胞は決して真の血清飢餓状態でなかったことに着目することが重要である。これらの線維芽細胞は、血清枯渇（１％ＦＢＳ）培地で培養した際でも、≧０．１２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βに曝されていた。このことは、１つには、ＳＢ４３１５４２がＭＢＧにより刺激されるコラーゲン産生の妨害になぜ有効であるかの説明となる。LijnenおよびPetrovは同様の調製物を用いて研究を行い、コラーゲン産生の最大増強（２倍）を誘導するには長時間のインキュベーション（４８時間）と高濃度のＴＧＦ−β（１５ｎｇ／ｍＬ）が必要であったことに着目している。本発明者らはまた、ＳＢ４３１５４２によるＴＧＦ−βの遮断が、ＭＢＧ合成の状況下であっても、実際にプロリンの組み込みをベースライン以下に低下させたが、ウエスタンブロットで測定した場合には、この同じ薬理学的操作がプロコラーゲンの発現をベースラインまで低下させたに過ぎないことを述べておくべきであろう。本発明者らは、ＴＧＦ−β経路が妨害されている場合に、コラーゲン合成の調節の他の機構（例えば、プロコラーゲンの安定性）が働くようになると推測しているが、本研究では、本発明者らはこの点をさらに探索していない。結局のところ、本発明者らのデータは、予備的なものであるが、強心ステロイドにより誘発される線維芽細胞コラーゲン産生の増強におけるＴＧＦ−βの主要な役割またはＳｍａｄタンパク質のアップレギュレーションに議論を投げかけている。

本発明者らのデータは、本発明者らの実験的齧歯類モデルにおいて、ＭＢＧが心臓線維症の病理に関連し、この状況で生じたＭＢＧならびに他の強心ステロイドの濃度がこの所見と一致したｉｎ ｖｉｔｒｏ作用を有することを示す。すぐに思い浮かぶ１つの問題が、ジギタリスの臨床使用が類似の作用を示すかどうかということである。この問題に対し、本発明者らは以下の可能性を示す。まず、ｉｎ ｖｉｖｏに存在するジゴキシンの遊離濃度は実質的な心臓線維症を誘発するには十分でない可能性がある。ジゴキシンで処置された患者において総ジゴキシンレベルは一般に＜２ｎｇ／ｍＬに維持され、この濃度は約２．５ｎＭ濃度に相当する。しかしながら、血漿ジゴキシンの７０％〜８０％だけが遊離型であり、この遊離濃度はヒト心臓（または他の組織）の線維芽細胞を刺激するのに必要なジゴキシンの閾値レベル以下に落ちかねない。おそらくはより重要なこととして、本発明者らは、作用閾値に到達すると、線維芽細胞のコラーゲン産生の刺激に関して、ＭＢＧおよびウワバインのかなり平坦な用量応答曲線を見出した。本発明者らは、ＭＢＧおよび他の強心ステロイドの増強に関連することが知られている症状である心不全の状況で、治療用量のジゴキシンの添加が検出可能な作用を示さない可能性があることを示す。最後に、本発明者らは、ジゴキシンがヒトにおける心臓線維症を誘発するかどうか、または影響を及ぼすかどうかという体系的検討は十分に行われなかったが、うっ血性心不全の処置におけるこの薬剤の臨床有効性は十分検討されたことを指摘しておく。ヒトが心臓線維症を発症する速度は齧歯類で見られるものよりも著しく遅いと思われ、これはさらにジゴキシンが臨床被験体において前線維化作用を有するかどうかを不明瞭にする可能性があることに着目することは重要である。

まとめると、本発明者らは、実験的腎不全で生じるものと同様のＭＢＧ濃度で、培養で増殖させた一次心臓線維芽細胞におけるコラーゲン合成の増強が、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ−Ｓｒｃ−ＥＧＦＲ−反応性酸素種シグナル伝達カスケードを介したシグナル伝達に依存してもたらされたことを見出した。これらのデータはヒトで確認すべきであるが、この洞察は臨床的尿毒症性心筋症において有用な治療標的を提供し得る。

結論
心臓線維症は種々の病態で見られる心疾患の重要な要素である。本発明者らの実験的腎不全モデルにおけるデータは、ＭＢＧなどの強心ステロイドがこの状況下で見られる心臓線維症における極めて実質的な役割に寄与する可能性があることを示している。ＭＢＧの増強は多様な容積拡張状態を伴う可能性があり、本発明者らの所見の関連は心臓線維症が併発する他の状況にも及び得る。

他のデータとしては、擬似手術（Ｓｈａｍ）、ＰＮｘ、ＭＢＧ注入（ＭＢＧ）およびＭＢＧ−アルブミンコンジュゲートに対する免疫化後のＰＮｘ（ＰＮｘ−ＩＭ）を施したラットから、大静脈閉塞の際に得られた代表的な血圧容積ループが含まれる。収縮終期圧容積の関係（ＥＳＰＶＲ、点線）および拡張終期圧容積の関係（ＥＤＰＶＲ、実線）に回帰直線を当てはめた。Ｂ、Ｓｈａｍ、ＰＮｘ、ＭＢＧおよびＰＮｘ−ＩＭ動物から得られた組織のトリクローム染色から求めた心室横断面面積（各群：Ｎ＝８動物、各動物の平均値を求めるため約１００測定値の平均をとった；データはＮ−８を用いた群の平均値±ＳＥＭとして示す）。（ｃ）コラーゲン−１および（ｄ）平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）に関して染色した心臓組織の代表的な免疫組織化学画像。ｃおよびｄの双方の対比染色はヘマトキシリンであった。（ｅ）プロコラーゲン−１および（ｆ）ａＳＭＡのウエスタンブロットおよび対応する濃度分析。コラーゲン−１およびａＳＭＡ染色の双方とも、Ｓｈａｍに比べ、ＰＮｘ群およびＭＢＧ群で強度がはるかに高く、ＰＮｘ−ＩＭ染色はＳｈａｍと同等であることに着目されたい。同様に、プロコラーゲンおよびａＳＭＡ発現は、Ｓｈａｍに比べ、ＰＮｘおよびＭＢＧ動物で実質的に高く、ＭＢＧに対する免疫化（ＰＮｘ−ＩＭ）はＰＮｘで見られた変化を減弱した。ｅおよびｆのデータは各群Ｎ＝６の実験からのものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。Ｓｈａｍは対照動物から単離された心臓を指し、ＰＮｘはＰＮｘ、ＭＢＧはＭＢＧ補充、そしてＰＮｘ−ＩＭはＰＮｘ術前にＭＧＢに対して免疫化した動物を指す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（対Ｓｈａｍ）；＃Ｐ＜０．０１（対ＰＮｘ）。

（ａ）ＴＧＦ−β１、（ｂ）Ｓｍａｄ２／３、（ｃ）Ｓｍａｄ４、および（ｄ）ｐＳｍａｄ２／３の代表的なウエスタンブロットおよび定量的濃度分析データである。データは各群Ｎ＝６の実験からのものであり、平均値±ＳＥＭとして示す。４つの実験群の総てにおいて、これらのタンパク質の発現は同等であったことに着目されたい。

（ａ）種々の用量のＭＢＧ（総てＮ＝１０）、（ｂ）種々の用量のウワバイン（０．１〜１００ｎＭ）およびジゴキシン（１０ｎＭ）との対比におけるＭＢＧ１０ｎＭ（総てＮ＝８）に応答して得られたプロコラーゲンの代表的ウエスタンブロットおよび定量的濃度分析データ。ｃ、ＭＢＧおよびウワバイン濃度の関数としてのウワバイン感受性Ｒｂ取り込み（ＭＢＧおよびウワバイン双方について各濃度Ｎ＝４；データは対照分率として表す）。ｄ、上清およびマトリックスにおける相対的プロリン組み込み、双方ともコラゲナーゼ消化を行う場合と行わない場合（全体）。各群（対照および種々の用量のＭＢＧ）はＮ＝７の反復（replicants）を含む。全体とコラゲナーゼ消化後の間の違いをコラーゲンとして報告する。このマトリックスは、上清を除去し、培養皿を掻き取った後に得られたサンプルである。ｅ、ＭＢＧ処置（１０ｎＭ；Ｎ＝８）または対照（Ｎ＝８）線維芽細胞におけるコラーゲン１のｍＲＮＡ。ｆ、シクロヘキシミド処置後のプロコラーゲンの安定性。０時点は、シクロヘキシミド（２０μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションの１時間後である。対数スケールで示した濃度分析データ。対照（ＣＴＬ）およびＭＢＧデータに最小二乗回帰直線を当てはめた。定量グラフのバーは平均値±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５および^＊＊Ｐ＜０．０１（対照に対して）。

プロコラーゲン発現のＭＢＧ（１０ｎＭ）刺激に対するＰＰ２（１μｍｏｌ／Ｌ）、ハービマイシン（１μｍｏｌ／Ｌ）、ＡＧ１４７８（２５０ｎＭ）、およびＮ−アセチルシステイン（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）の効果も見出された。ＰＰ２、ハービマイシン、ＡＧ１４７８およびＮ−アセチルシステインはＭＢＧを添加する２時間前から投与し、ＭＢＧインキュベーション２４時間中継続した（計２６時間）。各バーは、ｎ＝８の実験の平均値±ＳＥＭを表す。ｂ、ＭＢＧ（１０ｎＭ）により刺激されるコラーゲンへのプロリン組み込みに対するＰＰ２（１μｍｏｌ／Ｌ）およびＮ−アセチルシステイン（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）の効果。ここでも、ＰＰ２およびＮ−アセチルシステインはＭＢＧに曝す２時間前に加えた。各バーは、Ｎ＝５の実験の平均値±ＳＥＭを表す。ｃ、ＳＹＦ細胞およびＳＹＦ＋細胞におけるプロコラーゲン含量に対するＭＢＧ１０ｎＭの効果。定量データの上に代表的なウエスタンブロットを示す。ＳＹＦブロットにはタンパク質１５μｇが含まれ、ＳＹＦ＋ブロットにはタンパク質１０μｇが含まれる。各バーは、各群Ｎ−６の測定の平均値±ＳＥＭを表す。^＊＊Ｐ＜０１．１０（対照に対して）。

ウエスタンブロットにより測定したＴＧＦ−β、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４およびｐＳｍａｄ２／３の発現に対するＭＢＧ（１および１０ｎＭ）２４時間の効果。ｂおよびｃ、プロコラーゲン−１の発現（ウエスタンブロット）および放射性標識プロリンの組み込みに対するＭＢＧ（１０ｎＭ）、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦ−β受容体アンタゴニストＳＢ４３１５４２（１００（１μｍｏｌ／Ｌ）２４時間の効果をそれぞれ調べた。ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ−βまたはＭＢＧのいずれかに曝す２時間前に加えた（計２６時間曝露）。各バーは、６〜８回の測定の平均値±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（対照に対して）。

以上の本発明の具体的説明は説明のために示されるものである。本発明の範囲を逸脱することなく多くの変更および改変を行えることが当業者には明らかである。よって、以上の全記載は例示のためであって、限定を示すものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。

Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームの経路を示す。 収縮期ＢＰに対するマリノブファゲニン（ＭＢＧ）の効果を示す。 心臓線維症、腎線維症および肝線維症に対するＭＧＢの効果を示す。 ＭＧＢの作用は創傷治癒を促進することを示す。 プロコラーゲン発現に対するＭＧＢの効果を示す。 プロコラーゲン発現に対するＭＧＢの効果を示す。 ｄＰ／ｄｔデータを示す。 ｄＰ／ｄｔデータを示す。 ＬＶＥＤＰデータを示す。 ＭＳＥＣデータを示す。 ＨＷ／ＢＷデータを示す。 ウエスタンブロットで証明されたプロコラーゲンの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたプロコラーゲンの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたプロコラーゲンの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたプロコラーゲンの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたＳＥＲＣＡの発現を示す。 ウエスタンブロットで証明されたＳＥＲＣＡの発現を示す。 線維症スコアデータを示す。 線維症データを示す。 フィブロネクチン発現データを示す。

Claims (25)

1. 薬学上または化粧料上許容されるビヒクル中に、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達を刺激する、薬理学上有効量の少なくとも１種のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼリガンドを含んでなる、組成物。
2. 前記リガンドが、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合する少なくとも１種の強心ステロイドまたはその誘導体である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ステロイドがカルデノライドまたはブファジエノライドである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ステロイドが、植物、動物、半合成品または合成品に由来するものである、請求項２に記載の組成物。
5. 錠剤、丸剤、懸濁錠剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ剤、エアゾール剤、軟膏、ゼラチン軟カプセル剤およびゼラチン硬カプセル剤、坐剤、クリーム、ローション、溶液、ゲルならびにペーストからなる群から選択される投与形である、請求項１に記載の組成物。
6. Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームの刺激剤として機能する、請求項１に記載の組成物。
7. Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと、脂質、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、イオンチャネル、輸送体、ならびに他の可溶性タンパク質および膜タンパク質との相互作用を誘発して、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームと呼ばれる種々のシグナル伝達複合体を形成させる、請求項１に記載の組成物。
8. そのような処置を必要とする被験体において皮膚障害の発症を予防する、または皮膚障害を治療する方法であって、その被験体に有効治療量の請求項１に記載の組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
9. 前記医薬組成物の局所投与または注射投与により皮膚線維芽細胞のコラーゲン産生を促進して、加齢性の皮膚の張りの低下を予防する、または回復させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記医薬組成物を局所的または全身的創傷閉鎖促進剤として用いる工程を含む、請求項８に記載の方法。
11. 医薬上許容されるビヒクル中に、薬理学上有効量の少なくとも１種のＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達阻害剤を含んでなる、医薬組成物。
12. 前記阻害剤が、リガンド−Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ相互作用またはＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとそのシグナル伝達相手との相互作用を妨げるものである、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記シグナル伝達相手が、Ｓｒｃキナーゼ、ＳｒｃファミリーキナーゼおよびＥＧＦ受容体、Ｐ１３キナーゼまたはカベオリン−１である、請求項１２に記載の組成物。
14. 錠剤、丸剤、懸濁錠剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ剤、エアゾール剤、軟膏、ゼラチン軟カプセル剤およびゼラチン硬カプセル剤、坐剤、クリーム、ローション、溶液、ゲルならびにペーストからなる群から選択される投与形である、請求項１１に記載の医薬組成物。
15. Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介したシグナル伝達の阻害剤として機能する、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 脂質、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、イオンチャネル、輸送体および他の可溶性タンパク質および膜タンパク質との相互作用に関わって、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナロソームと呼ばれるシグナル伝達複合体の形成および／または該複合体を介するシグナル伝達を阻害する、請求項１１に記載の医薬組成物。
17. そのような処置を必要とする被験体において皮膚障害を治療する方法であって、その被験体に有効治療量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
18. 前記組成物を、過剰な皮膚瘢痕の形成を回復させる、またはこれを予防する局所的または注射手段として用いる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
19. そのような処置を必要とする被験体において組織線維症を治療する方法であって、その被験体に有効治療量の請求項１１に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
20. 前記組織線維症が、心臓線維症、腎線維症または肝線維症である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記被験体が、全身性線維症状、局所的線維症状、進行性心不全または進行性腎疾患の処置を必要とする被験体である、請求項１９に記載の方法。
22. 全身性線維症状が硬皮症である、請求項２１に記載の方法。
23. 局所的線維症状が、ウイルス性肝炎またはアルコール性肝炎による肝硬変である、請求項２１に記載の方法。
24. 進行性心不全が腎疾患またはアテローム性動脈硬化症に関連するものである、請求項２１に記載の方法。
25. 進行性腎疾患が、糸球体腎炎、糖尿病または高血圧症に起因するものである、請求項２１に記載の方法。