JP2009521935A - Ｔｆｐｉ−２の変異体クニッツドメインｉに関連した方法および組成物 - Google Patents

Abstract

プラスミン阻害に関する方法および組成物が開示される。例えば、本発明により、１種以上のアミノ酸変異を有する配列番号１を含むポリペプチドであって、第１の変異が、ＢＰＴＩ番号付けシステムを使用して１７位でのロイシンからアルギニンまたはリジンへの置換を含む、ポリペプチドが提供される。本発明によってまた、ＫＤ１変異体と一緒でのプラスミンの結晶構造をモデリングすること；該プラスミンと該ＫＤ１変異体との間の相互作用を決定すること；ステップｂの結果に基づいて、該ＫＤ１変異体がプラスミン阻害剤であるかどうかを決定すること；を含む、プラスミン阻害剤を同定する方法もまた提供される。

Description

連邦政府によって支援された研究に関する宣言
本発明は、ＮＩＨ助成金ＨＬ−７０３６９、ＨＬ６４１１９およびＨＬ−３６３６５の下で、政府によって支援されて行われた。それゆえ、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。

発明の背景
線維素溶解に主に反応する薬剤は、活性型プラスミノーゲンであるプラスミンである。多くの物質は、活性型ハゲマン因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびプラズマカリクレイン（ｐＫＡ）を含むプラスミノーゲンを活性化できる。ｐＫＡは、ウロキナーゼ形態の酵素前駆体活性化因子でもあり、直接型プラスミノーゲン活性化因子でもある。

プラスミンは、正常な血液循環において検出されないが、酵素前駆体であるプラスミノーゲンは、約３μＭ存在する。さらに、測量不能なプラスミノーゲンは、フィブリンおよび細胞外マトリクスと細胞表面の他の成分に結合する。正常血液は、プラスミンの生理学阻害剤、α２−プラスミン阻害剤（α２−ＰＩ）を約２μＭ含有する。プラスミンおよびα２−ＰＩは、１：１錯体を形成する。マトリクスまたは細胞に結合したプラスミンは、α２−ＰＩによって比較的阻害されにくい。従って、プラスミンの活性化は、プロフィブリン溶解状態を引き起こすα２−ＰＩの中和能を超えることができる。

プラスミンは、一旦形成されると、（時として時期尚早に）フィブリンクロットを分解する；分解産物からもろく容易に溶解するクロットを形成し、フィブリノーゲン分解産物による血小板粘着／凝固の阻害によって、止血を妨げるフィブリノーゲン（クロットを構築する物質）を消化する；高せん断血流の範囲で損傷した内皮への粘着を防ぎおよび血小板血栓形成に必要である凝固反応を妨げる（ＡＤＥＬ８６）糖タンパクＩｂおよびＩＩｂ／ＩＩＩａを開裂するため血小板と直接相互作用する；さらに前分解状態を促進する外因性の凝固経路においてタンパク質分解不活性を有する酵素である。

過剰な出血につながる不適切な線維素溶解およびフィブリノーゲン溶解は、心肺バイパスのような体外循環を必要とする外科的処置を複雑にすることが多く、さらに血栓溶解療法および特に肝臓の臓器移植において見られる。出血性素因の高出現率を特徴とするその他の臨床症状は、肝硬変、アミロイドーシス、急性前骨髄球性白血病および腫瘍を含む。止血の回復には、プラズマおよび／またはプラズマ産物の注入を必要とし、免疫学的な反応および病原体、たとえば、肝炎ウイルスおよびＨＩＶへの暴露という危険がある。

非常に深刻な血液の損失は、大量注入でも溶解を妨害できる。生命にかかわる大事な時、出血は、ε−アミノカプロン酸（ＨＯＯＶ９３参照）（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸またはアプロチニン（ＮＥＵＨ８９）のような抗線溶剤で治療される。アプロチニンは、Ｔｒａｓｙｌｏｌｕおよびウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）としても周知である。以下、アプロチニンは、「ＢＰＴＩ」と称す。ＥＡＣＡおよびトラネキサム酸は、クリングルを結合することによってプラスミンがフィブリンを結合することを唯一妨害し、従って、プラズマ中にフリープロテアーゼとしてプラスミンを残す。ＢＰＴＩは、プラスミンの直接阻害剤でありおよびこれらの薬剤の中で最も有効である。血栓性合併症、腎臓毒性の可能性の故に、ＢＰＴＩの場合、免疫原性剤は慎重に使用され、通常「ラストリゾート」（ＰＵＴＴ８９）として保存される。抗線溶剤の３種すべては、標的特異性および親和性を欠き、特徴のない代謝経路を通って組織および器官と相互に作用する。親和性が低いために必要な大量投与、免疫反応に対する特異性および可能性不足による副作用、および器官／組織毒性は、出血を防ぐようにまたは常用の術後の療法として輸血治療を回避または減らすようにこれらの抗線溶剤を予防的に使用する機会を増やす。従って、安全な抗線溶剤が必要とされている。

過剰出血は、不完全な凝固作用、高い抗線維素溶解活性またはこれら２つの条件の組み合わせによって生じる。最も出血しやすい体質では、プラスミンの活性を制御しなければばらない。失血を減らす際、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）の臨床的に有益な効果は、プラスミン（Ｋｄ約０．３ｎＭ）またはプラズマカリクレイン（Ｋｄ約１００ｎＭ）あるいは両方の酵素の阻害の結果であると考えられる。

興味深いことに、ＢＰＴＩ過敏反応は、アプロチニンを再投与した約１．２〜２．７パーセントの患者に起こる（非特許文献１（３０））。この反応の５０パーセントは、９パーセントの死亡率と共に生命にかかわる（非特許文献１（３０））。従って、より強力にするために選択的に改良されたヒト分子が、非常に望まれている。このような分子は、より低い免疫原性でもあり得る。ＢＰＴＩを使用するための副作用および毒性問題は、近年、概要が説明されている（非特許文献２）。テキシトリン（Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ）もアプロチニンと比較されるが、しかしながら、テキシトリン（Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎ）はヘビタンパク質であり、それ故に免疫原性の問題と関連している。（非特許文献３および特許文献１）
米国特許第７，０７０，９６９号明細書 Ｂｅｉｅｒｌｅｉｎ Ｗ，Ｓｃｈｅｕｌｅ ＡＭ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｗ，Ｚｉｅｍｅｒ Ｇ．Ｆｏｒｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ ｕｓｅ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ １２４ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．７９：７４１−７４８，２００５ Ｍａｎａｇｏら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：３５３−６５ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ．２００５；３４（４−５）：１８８−９３

当該技術分野において必要なのは、ＢＰＴＩよりも強力な（またはさらに強力な）プラスミン阻害剤であるが、それはヒトタンパク質ドメインとほぼ同一であり、それによって類似した療法候補を提供するが、抗原性の恐れが少ない。

発明の要旨
本明細書において具体化され、広く記載されるように、本発明の目的（１つ以上）によると、本発明は一様態において、１種以上の変異を有する配列番号１を含むポリペプチドに関する。たとえば、本明細書において、１種以上の以下の置換基を有する配列番号１を提供する：ロイシンは、１７位（ＢＰＴＩ配列番号）においてアルギニンまたはリジンに変わる；チロシンは、４６位においてグルタミン酸に変わる；チロシンは、１１位においてトレオニンに変わる；アスパラギン酸は、１０位においてチロシンまたはグルタミン酸に変わる；アラニンは、１６位においてメチオニンに変わる；アラニンは、１６位においてグリシンに変わる；アラニンは、１６位においてセリンに変わる。

さらに、プラスミンを阻害するポリペプチドを、本明細書において開示する。また、プラスミンを阻害およびＴＦＰＩ−２の野生型クニッツドメインと比較して抗凝固活性を軽減するポリペプチドを開示する。また、抗線溶剤として同定されたポリペプチドを本明細書において開示する。

本明細書において論じるポリペプチドを含む組成物も開示する。

本明細書において論じるポリペプチドをコードする核酸も開示する。

本明細書において論じる有効量のポリペプチドにプラスミンを接触させることを含む少なくとも１種のプラスミン活性を阻害する方法も開示する。

本明細書において論じる有効量のポリペプチドを対象へ投与することを含む、プラスミン活性の阻害を必要としている対象を治療する方法も提供する。プラスミン阻害の必要に関する病気、障害および処置の例としては、これに限定されるものではないが、腫瘍形成（Ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、血管形成、骨再形成、外科手術、血友病、整形外科手術、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が挙げられる。

本明細書において論じる有効量のポリペプチドを対象へ投与することを含む、関節リウマチの治療を必要とする対象において、それを処置する方法も開示する。

さらに、ＫＤ１変異体とプラスミンの結晶構造をモデリングすること；プラスミンとＫＤ１変異体との間の相互作用を決定すること；相互作用の結果に基づいて、ＫＤ１変異体がプラスミン阻害剤であるかどうかを決定すること；を含むプラスミン阻害剤を同定する方法を開示する。

さらに、本明細書において論じる有効量の核酸を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象においてプラスミンを阻害する方法を開示する。

本明細書に援用され、かつその一部分を成す添付の図面は、本発明の実施形態および記載をともに図解し、本発明の原理を説明するのに用いられる。

発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図面およびそれらについて前述したものと同様に以下に説明するものを参照することにより容易に理解されるであろう。

Ａ．定義
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書および添付の請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数形指示対象を含む。従って、たとえば、「１つの小分子」に関しては、１以上の小分子の混合物を含むなどである。

程度は本明細書において「約」という１つの特定の値からおよび／または「約」という別の特定の値までで表現される得る。このような程度が表現される場合、別の実施形態では、１つの特定の値からおよび／またはその他の特定の値までを含む。同様に、前例の「約」を使用して概算値を表現する場合、特定の値が別の実施形態の形を成すのは当然のことである。程度の各端点が、その他の端点と独立したその他の端点の両方に関係して重要であることがさらに理解されるであろう。

「より高く」「増加」「上昇する」または「上昇」という表現は、たとえば、対照物と比較して基本レベルを超えて増加することを言う。「低い」「より低い」「低減する」または「低減」という表現は、たとえば、対照物と比較して基本レベルを下回って減少することを言う。

Ｂ．使用方法
ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）は、クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤である。それはプラスミンを阻害し、開心術で使用および血液製剤の術前出血と投与を最低限に抑えるため整形外科手術において推奨されている（１−５）。近年、プラスミノーゲン／プラスミン系は、また骨再形成および融食作用（１１−１５）および腫瘍形成（Ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および血管形成（８、１６、１７）と同様に関節リウマチ（６−１０）の発生に関与している。

ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）はまた、短い酸性アミノ末端および非常に基本的なＣ末端尾（１８、１９）と並行して３種のクニッツ型（ＢＰＴＩと同類）ドメインを含有する、マトリクスセリンプロテアーゼ阻害剤または胎盤タンパク質５として周知である。ケラチノサイト、真皮線維芽細胞、平滑筋細胞、合胞体栄養細胞、滑膜芽細胞および内皮細胞を含むさまざまな細胞は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）へのＴＦＰＩ−２を合成および分泌する（２０−２３）。ＴＦＰＩ−２は、Ｍｒ２７，０００、３０，０００および３２，０００とグリコシル化の相異のため、３種の形態で現れる（２４）。ヒトＴＦＰＩ−２の第１クニッツドメイン（ＫＤ１）は、ＢＰＴＩに対して相同的であり、また、プラスミンを阻害する（２５）。ＫＤ１は、プラスミンの阻害に対して特異的であるので、ＴＦＰＩ−２のその他２つのクニッツドメインは、阻害活性を認めない。基本的なＣ末端尾は、しかしながら、プラスミンの局所化された阻害のためにＥＣＭにおいてグリコサミン部分に対してＴＦＰＩ−２を係留し得る。

トリプシンとＢＰＴＩの結晶構造（２６）およびＫＤ１の結晶構造（２７）は、決定された。ヒトプラスミンプロテアーゼドメインの結晶構造はまた、決定された（２８）。高度な正確さでモデル化されたプラスミンおよびＫＤ１同様、ＢＰＴＩとプラスミンの複合体は、テンプレートとしてのこのような構造で使用される。阻害およびプラスミンのプロテイナーゼドメインの相対位置は維持され、微調整が、側鎖において行われた。疎水性／ファンデルワールス、水素結合およびイオン相互作用は、各プロテイナーゼ−阻害剤複合体間で観察された。このような相互作用のすべては、各阻害剤−プロテイナーゼ複合体の評価において意図され、およびすべての潜在的な水素結合供与体と水素結合受容体は、これらの相互作用に関与すると仮定された。バルク溶媒は、プロテイナーゼ−阻害剤複合体から排除され、そして、それに応じて、正確に評価され得る特異性において重要な役割を果たす水素結合およびイオン相互作用が、予想された。このような複合体をモデル化するためのプロトコールは、前述されている（２９）。

図１は、プラスミンと相互作用するＢＰＴＩおよびＫＤ１中の残基を表す。図１で示されるモデルから、ＫＤ１において、Ｌｅｕｌ７からＡｒｇへおよびＴｙｒ１１からＴｈｒへの変異は、ヒトプラスミンに関して非常に高い親和性および特異性を有する分子を生じる。Ｔｙｒ４６からＧｌｕへおよびＡｓｐ１０からＴｙｒ（またはＧｌｕ）への変異はまた、プラスミン阻害に関して親和性および特異性を増す。一方、Ｇｌｕ３９からＡｒｇへおよびＴｙｒ４６からＬｙｓへの変異は、ヒトプラスミンに対するＫＤ１の親和性の相当な喪失という結果になり得る。体系的に、改良されたＴｈｒ１１およびＡｒｇ１７とＫＤ１のように、機能獲得の結果となるこのような残基の変異は、ＢＰＴＩおよび天然のＫＤ１よりもさらに強力な分子を生じる。このような分子はまた、ＢＰＴＩよりも免疫原生がない。選択的分子に対する選択的な尾はまた、細胞外マトリクスの半減期が増加するため、リンカーとしていくつかの余分な残基を含有するＣ末端に加えられる。本明細書において開示された有効量のポリペプチドにプラスミンを接触させることからなる少なくとも１種のプラスミン活性を阻害する方法を、本明細書において提供する。

開示された分子およびポリペプチドのいくつかの形態は、プラスミンを阻害するが、ＴＦＰＩ−２の野生型クニッツドメインと比較して抗凝固活性を軽減する。開示された分子およびポリペプチドのいくつかの形態はまた、抗線溶剤として同定される。従って、開示された分子およびポリペプチドのいくつかの形態は、抗線溶剤としてさらに活性するが、もはや抗凝固活性を有さず、または抗凝固活性を軽減する。この特性により、このような分子およびポリペプチドは、出血を防ぐために非常に有用となる。

また、本明細書において開示された有効量のポリペプチドを対象へ投与することからなるプラスミン活性の阻害を必要としている対象を治療する方法を、提供する。プラスミン阻害の必要に関する病気、障害および治療法の例としては、これに限定されるものではないが、腫瘍形成（Ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、血管形成、骨再形成、外科手術、血友病、整形外科手術、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を含む。

また、本明細書において開示された有効量のポリペプチドを対象へ投与することからなる関節リウマチの治療を必要とする対象において、それを治療する方法を、提供する。

さらに、ＫＤ１変異体とプラスミンの結晶構造をモデリングすること；プラスミンとＫＤ１変異体との間の相互作用を決定すること；相互作用に基づいて、ＫＤ１変異体がプラスミン阻害剤であるかどうかを決定すること；を含むプラスミン阻害剤を同定する方法を開示する。

また、本明細書において開示された有効量の核酸を対象へ投与することからなるそれを必要とする対象においてプラスミンを阻害する方法を、提供する。

また、失血を減らしたマウスモデルで、人が使用するための化合物の有効性を示す方法を、提供する。野生型ＫＤ１および開示された変異体の双方は、マウスプラスミンを阻害することが判明した（実施例３参照）。従って、変異体は、失血を減らしたマウスモデルで、有効性を示すのに使用できる。

本発明のタンパク質は、たとえば、アミノ酸、好適な宿主細胞の組換えＤＮＡ技術による産物、たとえば、好ましくない配列の除去および合成代置配列の結合による半合成によって、成分の連続的結合による非生物学的な合成を含むいずれもの従来の技術によって生産され得る。本明細書において開示されたタンパク質は、組換え的に、好適な宿主で、たとえば、バチルス、エシェリキア、サルモネラ、エルビニア属由来の細菌、およびハンゼヌラ、クリベロマイセス、ピチア、リノスポリジウム、サッカロミセスおよびシゾサッカロミセス属由来のイースト菌などを好ましくは生産し、またはＣＯＳ−Ｉのような哺乳動物細胞を培養する。より好適な宿主は、メタノール資化酵母、枯草菌、ブレビス菌、出芽酵母、大腸菌およびアルカン資化酵母種の微生物である。宿主細胞で機能的ないずれものプロモーターは、遺伝子発現をコントロールすることに慣れているであろう。

タンパク質は、分泌されることができおよび条件培地から得られる。タンパク質は、正確に折り畳まれる傾向が強く、わずかな混入物質と共に条件培地で生産されるので、分泌は好ましい経路である。分泌は必要ではない。

糖鎖基の抗原性の可能性を減らすためにＮ結合型グリコシル化部位が不足するように意図されたタンパク質は、使用でき、およびその等価なタンパク質は：１）Ｅ．ｃｏｌｉ、２）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、３）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、４）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、および５）哺乳動物細胞に含まれる多種多様な有機体中に表される。

組み換え産物を分解させるするプロテアーゼを生産している宿主細胞の問題を減らすため、いくつかの手段が存在する。大腸菌中のペプチダーゼが合図となる枯草菌の過発現は、異種融合タンパク質のさらなる発現を導く。また、ＰＭＳＦ（セリンプロテアーゼ阻害剤）の培地への追加が、融合タンパク質の生産を改良したことが報告されている。

これらの産物に影響を及ぼし得るその他の要因と、本明細書において開示されたその他のタンパク質は：１）コドン使用頻度（宿主のためにコドンの最適化が好まれる）、２）シグナル配列、３）対象とするプロセシング部位でのアミノ酸配列、プロセシング酵素の存在および局在配列、工学的産物が変更または低下し得るさまざまな酵素の削除、変異または阻害、および分泌物中にさらに許容された宿主を作る変異（許容される分泌宿主はが好まれる）を含む。

組換えＤＮＡ技術の一般的な原則の参照される参考文献には、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｒｎｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ. Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ.（１９８７）；Ｄａｒｎｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ.、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ.（１９８５）；Ｏｌｄ，ら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ.（１９８１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８７、１９９２）が挙げられる。これらの参考文献は、参照することによりその一部として本明細書に援用される。

いずれもの好適な方法は、本発明の化合物をテストするのに用いることができる。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ（Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９４９）５１：６６０−６６９）は、タンパク質結合に適用できる結合を測定および分析する古典的方法を解説した。この方法は、非結合から結合したタンパク質を区別するため、比較的純粋なタンパク質と能力を必要とする。

Ｋｄを測定する第２の適切な方法は、酵素に対する阻害活性を測定することである。測定されたＫｄが、１ｎＭから１μＭの範囲ならば、この方法は、発色性または蛍光性基質および何十マイクログラムからミリグラムの比較的純粋な阻害剤を必要とする。本発明のタンパク質は、５ｎＭから５０ｐＭの範囲でＫｄを有し、ナノグラムからマイクログラムへの阻害剤は十分である。この方法を使用するとき、阻害剤と酵素基質間の競争は、真実のＫｉより高く測定されたＫｉを与えることができる。

第２の材料のためにタンパク質の親和性を決定する第３の方法は、Ｍ１３のように遺伝子のパッケージに表示されるタンパク質を有することであり、および固定化した「第２の材料」へ付着するため、タンパク質の能力を測定することである。遺伝子パッケージが拡大し得るので、この方法は非常に敏感である。プロテアーゼへの周知の親和性の阻害因子は、その他のファージを表示した阻害因子が判定されるのに対する標準プロファイルを確立するために使用される。

本発明のタンパク質は、多くても約５ｎＭ、多くても約３００ｐＭまたは１００ｐＭまたはそれ以下のプラスミンのために、Ｋｄを有することができる。ＫｉがＫｄと同じであるように、結合は抑制できる。プラスミンのためのＱＳ４のＫｉは、約２ｎＭである。プラスミンのためのＳＰＩ１１のＫｉは、約８８ｐＭである。

薬学的に許容される担体において、ｉｎ ｖｉｖｏ投与が可能である組成物を、本明細書において開示する。「薬学的に許容される」が生物学的ではないまたはさもなければ望ましくない物質を意味することにより、すなわち、この物質は、核酸またはベクターとともに、製剤組成物を含有するその他いずれもの成分と有害な方法においていずれもの望ましくない生物学的効果または相互作用を引き起こすことなく、対象へ投与され得る。担体は、対象において活性成分のいずれもの分解を最小限にするため、および対象においていずれもの副作用を最小限にするために必然的に選ばれ、このことは、当該技術分野において非常に周知である。

組成物は、経口、非経口（たとえば、静脈内）、筋肉注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外で、腹腔内注射で、局所的などで投与され得り、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含む。本明細書において用いられるように、「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方または両方を通る鼻および経鼻通路への組成物の吸入を意味し、および噴霧メカニズムまたは点鼻メカニズムもしくは核酸またはベクターのエアロゾル化を経由する吸入を含み得る。吸入器による組成物の投与は、噴霧または液滴メカニズムによる吸入によって鼻または口を通して可能である。吸入はまた、挿管により呼吸器系（たとえば、肺）のいずれもの領域に直接運ばれ得る。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および対象の一般の症状、治療中のアレルギー障害の重症度、特定の核酸またはベクターの使用、その投与方法などにより対象間で異なるであろう。従って、すべての組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかしながら、適量は、本明細書において教示を与える日常の実験のみを使用し、当業者によって決定され得る。

使用されるならば、組成物の非経口投与は、一般に注射によって特徴づけられる。注入物質は、注射前の液体における懸濁液の好適な固形物またはエマルジョン類として、溶液または懸濁液のどちらか一方が、従来の形で調製され得る。つい最近修正された非経口投与へのアプローチは、一定の投薬量が持続するように、ゆっくりと維持する放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）または持続した放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）システムの使用を必要とする。たとえば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照することにより本明細書に援用される。

物質は、溶液、懸濁液（たとえば、微少粒子、リポソームまたは細胞に取り込まれる）中にあり得る。それらは、抗体、受容体または受容体リガンドを通して特殊な細胞型に対して標的とされ得る。以下の参考文献は、腫瘍組織に対する特定のタンパク質を標的とする本テクノロジーの使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.、２：４４７−４５１、（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５−２８１、（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００−７０３、（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.、４：３−９、（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１−４２５、（１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７−８０、（１９９２）；ａｎｄ Ｒｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２−２０６５、（１９９１））。「ｓｔｅａｌｔｈ」のような賦形剤およびその他の抗体は、リポソーム（結腸ガンを標的とする脂質で仲介された薬剤）と共役し、受容体は特定のリガンド細胞、直接腫瘍を標的とするリンパ球を通してＤＮＡの標的を介在し、および特異的に治療力があるレトロウイルスはｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスグリオーマ細胞を標的とする。以下の参考文献は、腫瘍組織に対する特定のタンパク質を標的とする本テクノロジーの使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４−６２２０、（１９８９）；ａｎｄ Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１１０４：１７９−１８７、（１９９２））。一般に、受容体は、構造またはリガンド誘発のどちらか一方で、エンドサイトーシスの経路に関係する。このような受容体は、クラスリン被覆ピットで凝集され、クラスリン被覆小胞をによって細胞に侵入し、受容体が分類されている酸性エンドソームを通過し、その後、細胞表面に対するどちらかの再利用材料は、細胞内に分類されるかリソソーム内で分解する。内在性経路は、たとえば、栄養塩摂取、活性タンパク質の除去、高分子クリアランス、ウイルスおよび毒の日和見的侵入、リガンドの分離および分解および受容体レベルの調節など、さまざまな機能を供給する。多くの受容体が、細胞型、受容体濃度、リガンド型、リガンド価およびリガンド濃度に応じて２つ以上の細胞内経路に続く。分子と細胞の受容体依存性エンドサイトーシスメカニズムは、見直されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６、３９９−４０９（１９９１））。

薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用できる組成物を、本明細書において提供する。

好適な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに記載されている：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ.）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５。一般に、薬学的に許容される塩の適量は、製剤を等浸透圧で溶かして精製するために、製剤において使用される。薬学的に許容される担体の一例は、限定されるものではないが、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む。溶液のｐＨは、好ましくは、約５から約８および一層好ましくは約７から約７．５である。更なる担体は、抗体を含有する疎水性固形物ポリマーの半透性のマトリクスのような調整剤の持続放出を含み、このマトリクスは、造形品、たとえば、皮膜、リポソームまたは微少粒子などの形である。特定の担体が、たとえば、より好ましくは投与の経路によるものであり得、組成物の濃度が投与されることは、当業者において明らかである。

製薬担体は、当業者において周知である。これらは、より一般に、生理学的ｐＨにおいて滅菌水、食塩水および緩衝液のような溶液を含む、ヒトに対して薬を投与するための標準的な担体である。組成物は、筋肉注射または皮下注射で投与され得る。その他の化合物は、当業者によって使用される標準的な処置によって投与され得る。

製剤組成物は、選択分子を加えた担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。製剤組成物はまた、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などのような１種以上の活性成分を含み得る。

製剤組成物は、局所または全体的な処置を希望するかどうかおよび治療される領域次第でいくつもの方法によって投与され得る。投与は、局所的（経眼、経膣、経直腸、経鼻を含む）経口、吸入によりまたはたとえば点滴、経皮、腹膜内、または筋肉内注射によるなど非経口的であり得る。静注、腹膜内接種、筋肉注射、皮下注射、腔内または経皮投与で投与可能な抗体を、提供する。

非経口投与のための調製は、滅菌水または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水溶液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油があり、エチルオレイン酸塩のような注射可能な有機エステルがある。水溶性担体は、水、アルコール/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、生理食塩水および媒体緩衝液を包含する。非経口賦形剤は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは固定油を含む。静脈注射の賦形剤は、流動食および栄養補充液、電解質補給（リンガーデキストロースを主成分としたような）などを含む。防腐剤および他の添加物はまた、たとえば、抗菌物質、酸化防止剤、キレート試薬および不活性ガスなどに存在し得る。

局所投与用の製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼、坐薬、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の製薬担体は、水性、粉末または油脂主成分、増粘剤などを必要とし、または望むかもしれない。

経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水の懸濁液または溶液ならびに非水溶媒体、カプセル、小袋または錠剤を含む。増粘剤、調味料、希釈剤、乳化剤、補助分散剤または結合剤が、望ましい。

組成物のいくつかは、薬学的に許容される塩を加えた−酸または−基として、たとえば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、およびたとえば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応によって形成され、またはたとえば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基との反応によって、たとえば、モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換したエタノールアミンなどの有機塩基として潜在的に投与できる。

組成物を投与するための効果的投薬量およびスケジュールは、経験的に決定され得り、およびこのような決定は当業者の範囲内である。組成物の投与のための投薬量範囲は、障害の徴候が影響する望ましい効果を十分に生じる。投薬量は、逆に副作用、たとえば、不必要な交差反応、アナフィラキシー性の反応などを引き起こすほど大きくてはいけない。一般に、投薬量は、患者において年齢、症状、性別および病気の範囲、投与経路、または処方計画においてその他の薬を含むかどうかでさまざまであり、当業者によって決定される。投薬量は、いずれもの反対指示の場合には、各医師によって調節可能である。投薬量は変化でき、１日または数日の間、１日１回以上の投薬が可能である。ガイダンスは、医薬品の与えられた種類の適切な投薬のために資料から入手できる。

本発明のタンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏで、存在するプラスミンを測定するために、プラスミンを含有するであろういずれもの好適な試料に応用できる。このようにするため、アッセイは、存在するプラスミンの量に依存する検出可能なシグナルをもたらすシグナル生成システム（ＳＰＳ）を含み得る。シグナルは、視覚的にまたは機械的に検出されるであろう。可能なシグナルは、着色、蛍光または発光生成物の生成、アッセイ成分または産物による吸収特性または輻射放出の変性および成分または産物の沈殿または凝集を含む。

診断薬と最も密接に関与するＳＰＳの成分は、「標識」と呼ばれる。標識は、たとえば、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、酵素、補酵素、酵素基質、高電子密度化合物または凝集性粒子である。ラジオアイソトープは、たとえば、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用することによってまたはオートラジオグラフィによって検出できる。特に有用なアイソトープは、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃおよび好ましくは、１２５Ｉである。また、化合物に蛍光化合物で標識を付けることは可能である。蛍光標識された化合物を、適切な波長の光に露光させる時、その存在を検出することができる。蛍光標識化合物の中で最も一般的に使用されるのは、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。あるいは、１２５Ｅｕまたはその他ランタニドなどの蛍光発光金属は、ジエチレントリアミン５酢酸またはエチレンジアミン４酢酸のような金属キレート基を用いて結合タンパク質に結合するであろう。タンパク質はまた、ルミノール、イソルミノ、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルのような化学発光化合物にカップリングすることによって検出できるように標識化できる。同様に、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンのような生物発光化合物は、結合タンパク質を標識化するのに使用できる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。酵素標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどが好ましい。

２つの基本タイプのアッセイ：異種および同種がある。異種アッセイでは、分析物への親和性分子の結合は、標識化に影響を及ぼさない；従って、分析物の量を判定するため、結合した標識を遊離標識から分離しなければならない。同種アッセイでは、相互作用は標識の活性に影響を与え、分析物は分離せずに測定できる。

一般に、プラスミン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、抗プラスミン抗体を使用するのと同じ方法で診断に使用できる。従って、プラスミンを結合するその他の物質をアッセイのフォーマットによって、または競合阻害によって、プラスミンアッセイに使用できる。

試料は通常、血液、尿、リンパ液、精液、乳、または脳脊髄液、またはそれらの誘導体、または生物学的組織、たとえば、組織セクションまたはホモジネートのような生物流体であるだろう。どのようなものでも試料となる。試料が、生物流体または組織であるならば、ヒトまたはその他哺乳動物、脊椎動物または動物、またはプラントから採取されるであろう。好ましい試料は血液または断片またはその誘導体である。

一実施形態では、プラスミン結合タンパク質（ＰＢＰ）は固定化され、および試料中のプラスミンは、標識化の既知量または具体的な例には、標識化できるプラスミン類似体と競合することを許される。「プラスミン類似体」は、プラスミンそれ自体を含むＰＢＰに結合するためのプラスミンと競合できる分子である。
既に標識されていてもよく、またはプラスミンからプラスミン類似体を区別する部分に標識を特異的に結合することによって後に標識されていてもよい。相を分離しおよびある相で標識化されたプラスミン類似体は、定量化された。

「サンドイッチアッセイ」では、不溶化されたプラスミン結合剤（ＰＢＡ）および標識化されたＰＢＡの両方を用いる。プラスミン分析物は、不溶化されたＰＢＡによって捕捉され、標識化されたＰＢＡによって標識をつけられ、第３錯体を形成する。試薬は、任意の順序で試料へ加えることができる。複数のＰＢＡは同じまたは異なり、および単体のＰＢＡは、本発明によるＰＢＰでなければならない（その他のＰＢＡは、たとえば、抗体であってよい）。第３錯体の標識化されたＰＢＡの量は、試料中のプラスミンの量に正比例する。

前記記載の２つの実施形態は、ともに異種アッセイである。同種アッセイは、ＰＢＰをプラスミンに結合することにより標識が影響を受けることのみを必要とする。プラスミン阻害剤を診断薬として使用するならば、プラスミン分析物はそれ自体が標識として働くことができる。

標識は、診断薬を産生するため、直接または間接的（たとえば、標識化された抗ＰＢＰ抗体を介して）、共有結合的（たとえば、ＳＰＤＰを用いて）または非共有結合的に、プラスミン結合タンパク質に結合できる。同様に、プラスミン結合タンパク質は、固相（「捕促する」）診断薬を形成するために固相支持体に結合できる。好適な支持体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼおよびマグネタイトを含む。担体は、ある程度可溶性であり、または本発明の目的のため不溶性である。支持体物質は、結合した分子がプラスミンを結合できる限りどのような構造でもよい。

プラスミンに密接に結合するクニッツドメインは、生体内撮像のために使用される。病巣の画像診断は、モノクローナル抗体のため最大の商機のひとつと考えられたが、この好機は実現されなかった。相当な努力にもかかわらず、２種のモノクローナル抗体を基礎とした映像剤のみが認められた。モノクローナル抗体を用いて得られたこの不本意な結果は、大部分次の理由による：ｉ）不十分な親和性および／または特異性；ｉｉ）標的部位への溶け込み不良；ｉｉｉ）非標的部位からの遅いクリアランス；ｉｖ）免疫原性；およびｖ）高い生成コストおよび低い安定性。

これらの制限が、ペプチド造影剤の開発へ導いた。溶け込み不良および遅いクリアランス問題を潜在的に解決すると同時に、ペプチド造影剤は、十分な親和性、特異性およびｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有する可能性が低く、最も応用に有用である。

改変タンパク質は、造影剤としての資格に非常に適している。特に、周知のｉｎ ｖｉｖｏクリアランス率および機構を有する小さく安定したヒト起源タンパク質ドメインが工学技術によって得られる異例の特異的な親和性および特異性は、初期に、より信頼性の高い結果、低い毒性／副作用、さらに低い生産物と貯蔵コスト、および標識調整のさらなる利便性を提供するため結合する。実際に、工学処理されたタンパク質造影剤を用いてリアルタイムの映像の目的を達成できる。プラスミン結合タンパク質、たとえばＳＰＩ１１は、内出血の部位を特定するために役立つ。

放射性標識された結合タンパク質は、ヒトまたは動物の対象へ投与され得る。投与は一般に、その後の動的および／または静的画像を、好適な放射線検出装置を使用することでできるように、たとえば、静脈または動脈またはその他の投与手段の注射によって行われる。投与量は、診断に有効な画像を与えることができる最小量であり、周知の放射性画像化剤をガイドとして用いる当該技術分野において、従来の手段で決定することができる。

一般に、画像化は対象の全身、および研究中の症状または病気に関連した身体または器官の一部で行なわれた。放射標識された結合タンパク質が、蓄積した。関連する標的器官において、任意の時点で蓄積した放射性標識された結合タンパク質の量は、その後、定量化された。

特に好適な放射線検出装置は、γカメラのようなシンチレーションカメラである。カメラでの検出装置は、放射性崩壊を検知および記録（および任意にデジタル化）する。デジタル化した情報は、いずれもの好適な方法で分析でき、その多くは当該技術分野において周知である。たとえば、時間放射能分析は、時間とともに標的器官によって、放射で標識された結合タンパク質のクリアランスによる取り込みを示すことができる。

適したラジオアイソトープを選ぶ際に、さまざまな要因を考慮する。選ばれるアイソトープは：画像化の際、解像度の品質が良く、ヒトおよび動物の診断用途に安全でありおよび好ましくは、身体に受ける放射線の量を減らすように半減期が短いものである。使用するラジオアイソトープは、好ましくは薬理学的に不活性であるべきでありおよび投与量には実質的に生理学的効果を持たせない。結合タンパク質は、異なるヨウ素アイソトープ、たとえば１２３Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ（たとえば、米国特許第４，６０９，７２５号を参照）を用いて放射標識されるであろう。標識の量は、適切にモニターされる。

ヒト対象に応用する際、身体の全曝露量を減らし、標識分子の検出可能性を最適にするため、標識用に１２５Ｉとは別のラジオアイソトープを使用することが所望され得る。ヒトに使用するため臨床利用の準備を考慮すると、好ましい放射性標識としては：９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９ＯＹ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは２１１Ａｔが挙げられる。放射標識されたタンパク質は、さまざまな方法で調製できる。これらは、クロラミン−Ｔまたはラクトペルオキシダーゼ法による放射ハロゲン化、および続く高圧液体クロマトグラフィによる精製、たとえば、Ｇｕｔｋｏｗｓｋａら、「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ：（１９８７）１６（１）：１８３参照を含む。放射標識されるその他の方法は、たとえばＩＯＤＯＢＥＡＤＳ（登録商標）などを使用することができる。

放射標識されたタンパク質は、活性剤が哺乳動物における薬剤の作用部位に到達するのを可能にするいずれもの手段にっよて投与され得る。タンパク質は、対象へ経口投与するとき消化されてしまうため、非経口投与、すなわち静脈皮下注射、筋肉注射が、通常吸収を最適にするために使用されるだろう。

本発明のプラスミン結合タンパク質はまた、流体、たとえば、血液からプラスミンを精製するために使用できる。このため、ＰＢＰは、好ましくは不溶性支持体に固定化される。このような支持体は、固相診断薬を調整する際に有用なものとして既に記載されたものを含む。

タンパク質は、タンパク質の分離または精製における基準のための分子量マーカーとして使用できる。タンパク質は分子量マーカーとしての役目を果たすため、変性する必要がある。タンパク質の第２の一般用途は、栄養源として加水分解タンパク質を使用することである。タンパク質はまた、溶液の粘度を上げるために使用できる。

本発明のタンパク質は、本明細書において、さらに以前に記載されているような治療および診断目的と同様に前述の目的のいずれもに使用できる。

化学的ポリペプチド合成は当該技術分野において周知であり、および固相ポリペプチド合成の方法は、次の参考文献に詳しく記述され、参照することにより本明細書に援用される：（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）；Ｗａｄｅら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２５：Ｓ２１−Ｓ３７（１９８６）；Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ３５：１６１（１９９０）；ＭｉｌｌｉＧｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏｓ． ２および２ａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．、１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｕｐｒａ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｓｕｐｒａ．Ｔａｎ ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７７、１６：１５３１−４１）１８年前にＢＰＴＩおよび相同体を合成された。

当該技術分野において周知であるように、このような方法は、遊離アミノ、カルボキシルおよびチオ基のような反応性官能基をブロッキングまたは保護することを含む。ポリペプチド結合形成後、保護基を除去する。従って、各アミノ酸残基の添加は、保護および脱保護のためいくつかの反応ステップを必要とする。固相合成を利用した最近の方法は、Ｃ末端アミノ酸を、濾過できる不溶性樹脂粒子に共有結合させる。反応物は、自動機械を使用して適切な溶媒で樹脂粒子を洗浄によって取り除く。「ｔＢｏｃ」方法および「Ｆｍｏｃ」方法を含むさまざまな方法は、当該技術分野において周知である。とりわけ、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：５３８−５４６（１９８１）およびＳｈｅｐｐａｒｄら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ２０：４５１−４５４（１９８２）を参照する。

Ｃ．組成物
本明細書において開示された方法内で使用されるように、組成物自身と同様に開示された組成物を調製するために使用される成分を、提供する。これらおよびその他の物質を本明細書において提供し、および組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどの物質を提供する時、各さまざまな個々および集団の組合せおよびこのような化合物の配列の特定指示が明確に記載されないであろう間、各々は、具体的な例として、本明細書において意図および記載されていると理解される。たとえば、特に１つ１つのアミノ酸の組合せおよび置換ならびに変更を論じ、検討するであろう配列内のいくつかの場所へ特殊なアミノ酸配列を提供および記載し、いくつかの修正がなされるならば、特に正反対を示さな限り可能である。従って、分子Ａ、ＢおよびＣの種類が、分子Ｄ、ＥおよびＦの種類ならびに組合せ分子の例と同様に提供されるならば、Ａ−Ｄは提供され、そして、各々が独立に列挙されなくとも、各々は組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが、意図して提供されることを意図し、独立におよび集団での意味を意図する。同様に、いずれものサブセットまたはこれらの組み合わせを、また提供する。従って、たとえば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループを、提供するとみなす。このコンセプトは、限定されるものではないが、開示された組成物の産生および使用の方法のステップを含む本明細書のすべての側面に適用する。従って、さまざまな追加的ステップがあるならば、このようなそれぞれの追加的ステップは、開示された方法の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで行え得ると理解する。

配列番号１（クニッツ型ドメイン１またはＫＤ１）からなるポリペプチドを、本明細書において提供する。配列番号１は次のように表される：ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＧＰＣＲＡＬＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫＶＰＫＶ。

配列番号２（ＢＰＴＩ中の番号としてアルギニンに変異した１７位のロイシン）：ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫＶＰＫＶからなるポリペプチドを、提供する。

また、配列番号１よりもさらに短いポリペプチである配列番号３を提供、およびまた、１７位（Ｌ１７Ｒ）：ＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＡＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥでの変異からなる。

配列番号４からなるポリペプチドを提供する（アルギニンとして変異したＢＰＴＩの番号としての１７位のロイシン、およびメチオニンとして変異した１６位のアラニン）：ＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＭＲＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＡＣＷＲＩＥＫＶＰＫＶ。

疎水性アミノ酸からプラスミン阻害を著しく抑制することなく、ＫＤ１の抗凝固活性に作用するアルギニンまたはリジンのような荷電アミノ酸の変化をすることが判明した。特に有用なのは、抗凝固活性を消失しおよびプラスミン阻害が増大する、このような変異体ポリペプチドである。従って、１７位の荷電または極性アミノ酸の含有物は、本明細書において具体的に意図される。

配列番号１のポリペプチドはまた、１種以上の付加的な変異を包含する。本明細書において開示されているように、変異は、アミノ酸の付加、欠失または置換でなる。たとえば、１７位でのロイシンからアルギニンへの変異に加えて、アミノ酸配列はまた、１５位でのアルギニンからリジンへの変異、１６位でのアラニンからメチオニンへの変異またはその両方を含み得る。１５位でのその他の変異例は、たとえば、米国特許第４，５９５，６７４号に記載されているように、全体を参照することにより本明細書に援用される。

また、４６位のチロシンがグルタミン酸へと変異した配列番号１からなるポリペプチドを、本明細書において提供する。もう１つの実施形態では、１１位のチロシンは、トレオニンへ変異し得る。もう１つの実施形態では、１０位のアスパラギン酸は、チロシンまたはグルタミン酸へ変異し得る。このようなポリペプチドはまた、上記記載のように１種以上の付加的な変異から成り得る。要約すると、配列番号１へ変異するアミノ酸の実施例は、表１で見られる。これらは実施例であって、当業者であれば当然わかることであるが、いずれものこれらの変異は、単独でまたは可能な順列と組み合わせで、本明細書において記載れているその他および記載されていないその他の変異と組み合わせて使用できる。

また、本明細書において記載のポリペプチドに対応する組成物および核酸を、提供する。核酸、組成物および投与方法について以下に記載する。また、本明細書において開示されたポリペプチドをコードする核酸を、提供する。ポリペプチドおよびそれに対応する核酸を、本明細書において提供する。いずれもの周知の変異体および誘導体または本明細書において開示された核酸およびタンパク質の原因を定義する一つの方法は、周知の配列を特定するため、相同性の観点から変異体および誘導体の定義付けを介することであると理解される。たとえば配列番号１は、ＫＤ１の特殊な配列を示しおよび配列番号２は、変異を含むＫＤ１の特殊な配列を示す。本発明時に、当業者は、その他の変異が野生型の核酸およびタンパク質の両方で生じ得ることを理解している。その他が積極的に官能性に影響を及ぼすことができる中、その官能性に影響を及ぼさないいくつかのその変異は、それ故選ばれる。規定の配列に対して、本明細書において開示されている少なくとも、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント相同性のこれらおよびその他の遺伝子およびタンパク質の変異体は、明確に開示されている。遺伝子など、２つのタンパク質または核酸の相同性を判定する方法を当業者は容易に理解する。たとえば、相同性がその最高レベルにあるので、相同性は、２つの配列を一列に並べた後に計算できる。

相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ.、Ａｐｐｌ. Ｍａｔｈ. ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ. Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ.Ｕ.Ｓ.Ａ．、８５：２４４４（１９８８）の類似性のサーチ方法により、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．,Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における上記アルゴリズムのコンピューター支援実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、またはインスペクションにより、行うことができる。

同じ種類の相同性は、少なくとも核酸アライメントに関連する物質を参照することにより本明細書に援用される、たとえば、Ｚｕｋｅｒで開示されたように、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８３：２８１−３０６、１９８９において開示されるアルゴリズムによって、核酸のために入手可能である。本明細書において開示される、たとえば、コード化された核酸、たとえば、さまざまな機能的な核酸同様、本明細書において開示されたその他のいずれものタンパク質と同様のＫＤ１を含む核酸塩基の分子がある。たとえば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換からなる核酸が開示されている。非限定のこれらの実施例およびその他の分子は、本明細書において記載されている。たとえば、ベクターが細胞で表される時、表されたｍＲＮＡは、一般に、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵからなると理解される。

ヌクレオチドは、塩基部分、糖成分およびホスフェート部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間の結合を引き起こすそれらのホスフェート部分および糖成分を介して結合できる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖成分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのホスフェート部分は、５価ホスフェートである。ヌクレオチドの非限定の実施例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。

ヌクレオチド類似体は塩基部分、糖成分またはホスフェート部分のどれかに対する１種の組換えをを含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの組換えは当該技術分野で周知でありおよびたとえば、糖成分またはホスフェート部分の組換え同様に、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニンを含む。

ヌクレオチド置換は、ヌクレオチドと機能的に類似した特性を有する分子であるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなホスフェート部分を含有しない。ヌクレオチド置換は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン法において核酸を結合させる分子であるが、ホスフェート部分以外の部分を介して結合している。ヌクレオチド置換は、適切な標的核酸との相互作用時、２重らせん型の構造に一致できる。たとえば、細胞取り込みなどを強めるために、他のタイプの分子（接合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体へ結合することは可能である。接合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合できる。このような接合体は、限定されるものではないが、コレステロール部分のような脂質部分を含む（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９，８６、６５５３−６５５６）。

ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換のワトソン−クリックフェイス（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ ｆａｃｅ）との少なくとも１種の相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換のワトソン−クリックフェイス（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ ｆａｃｅ）は、Ｃ２、Ｎ１およびヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換をベースとしたプリンのＣ６位置およびＣ２、Ｎ３、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換をベースとしたピリミジンのＣ４位置を含む。

フーグスティーン相互作用は、２重ＤＮＡの主溝で露出するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のフーグスティーンフェイス（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ ｆａｃｅ）で行われる相互作用である。フーグスティーンフェイス（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ ｆａｃｅ）は、Ｎ７位置およびプリンヌクレオチドのＣ６位置における反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。

たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて開示されている本明細書において記載のその他いずれものタンパク質同様に、ＫＤ１およびその変異に関連したさまざまな配列があり、これらの配列などは、その中に含有する独立した部分列のため同様に、全体を参照することにより本明細書に援用される。

さまざまな配列は、本明細書およびＧｅｎｂａｎｋ、ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ．に記載されているこれらその他において提供される。配列矛盾と配列相違を解決しおよびその他関連した配列のため特殊な配列に関連する組成物および方法を調節する方法を当業者は理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書において開示およびたとえば、において周知の情報を与えるいずれもの配列のために考案され得る。

本明細書において開示された遺伝子と相互作用することが可能なプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支えるのに使用される。一般に、プライマーは、特有な方法の配列に全力を尽くすことができる。特有な方法の配列におけるプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズしまたはさもなければプライマーの伸長によって生産された産物の組成物または配列に直接結合または影響する核酸分子の配列および／または組成物であるいずれもの方法を含む。それ故、特有な方法の配列におけるプライマーの伸長は、これに限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定法、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写または逆転写を含む。特有な方法の配列におけるプライマーを増幅する技法および状態が、好まれる。特定の実施形態では、プライマーが、ＰＣＲまたは直接配列決定のようにＤＮＡ増幅反応のため使用される。特定の実施形態では、プライマーはまた、たとえば、特有な方法の配列におけるプライマーの伸長に化学的に反応するように、プライマーの伸長に用いられるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが改良された非酵素技法を使用して伸長され得ると理解される。一般に、核酸とハイブリダイズするプライマーまたは核酸領域は開示され、またはそれらは核酸の相補体または核酸領域の相補体とハイブリダイズする。

その必要とする核酸を対象へ投与することを含む対象を治療する方法は、本明細書において開示される。たとえば本明細書において記載されているように、ＫＤ１変異体へコード化した核酸を運ぶ方法が、本明細書において開示される。これらの方法は、投与および対象の細胞へ外来性ＤＮＡの取り込み（すなわち、遺伝子形質導入またはトランスフェクション）を含む。開示された核酸は、当業者に十分理解されるように、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形であり、あるいは核酸は、抗体をコードするＤＮＡフラグメントがプロモーターの転写調節下にあることによって核酸を細胞に運ぶためにベクター中にあり得る。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．社（Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）として商用に利用可能な製剤である。細胞への核酸またはベクターの送達は、さまざまなメカニズムを経由可能である。１つの例として、送達は、たとえば、において標準の処置によって開発されるその他のリポソーム同様に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｉｎｃ．社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．社、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｉｎｃ．社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの商用に利用可能なリポソーム製剤を使用して リポソームによって経由できる。加えて、開示された核酸またはベクターは、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．社、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）の方法と同様に、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である技術、電気穿孔によってｉｎ ｖｉｖｏに運ばれ得る。

１つの例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージングすることができるような、レトロウイルスのベクトルシステムのようなウイルスシステムを経由可能である（たとえば、Ｐａｓｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：４４８６、１９９８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５、１９８６参照）。組換えレトロウイルスは、その後、感染およびそれによって広範の中和抗体（またはその活発な断片）をコードする核酸の感染細胞へ送達するのに使用できる。変性核酸を哺乳動物の細胞に取り込む正確な方法は、もちろん、レトロウイルスのベクターの使用に限られない。その他の技法は、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８、１９９４）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２−１５００、１９９４）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７、１９９６）、偽型レトロウイルスベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７、１９９６）の使用を含むこの手法のために広く利用可能である。リポソーム送達および受容体介在性およびその他のエンドサイトーシス機構（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２−４７８、１９９６参照）のような、身体的な形質導入技法が使われることもできます。この開示された組成物および方法は、一般的に用いられる遺伝子導入方法のこれらまたはその他のいずれもと併せて使われ得る。

１つの例として、抗体をコードする核酸がアデノウイルスベクターにおいて対象の細胞に運ばれるならば、ヒトへのアデノウイルスの投薬量は、注射につき約１０７から１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）に及び得るが、注射につき１０１２ｐｆｕまでにおよび得る（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１、１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３、１９９７）。対象は、単回投与を受けることができ、あるいは、追加的な注射が必要ならば、不明確な期間および／または処置の有効性が確立するまでの間、彼らは６ヶ月間隔（または当業者によって決定されるように、その他の適当な時間間隔）で反復投与できる。

使用されるならば、核酸またはベクターの非経口投与は、一般に注射によって特徴づけられる。注入物質は、注射前の液体における懸濁液の好適な固形物またはエマルジョン類として、溶液または懸濁液のどちらか一方が、従来の形で調製され得る。つい最近修正された非経口投与へのアプローチは、一定の投薬量が持続するように、ゆっくりと維持する放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）または持続した放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）システムの使用を必要とする。たとえば、参照することにより本明細書に援用される米国特許第３，６１０，７９５号を参照。好適な製剤および治療化合物のさまざまな投与経路の追加議論は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １９９５に参照される。

本明細書において記載のように、多数の周知であるＫＤ１タンパク質変異体があり、本明細書において意図されている。具体的な例には、配列番号２のように、野生型を考慮して、好ましいＫＤ１変異体が開示されている。本明細書において開示されている機能的なＫＤ１変異体に加えて、また本明細書において開示されているそれらの機能および本明細書において考慮するＫＤ１タンパク質の誘導体がある。タンパク質変異体および誘導体は、当業者およびアミノ酸配列組換えを必要とするかに十分理解される。たとえば、アミノ酸配列組換えは、一般に１種以上の３つのクラス：置換、挿入または欠失変異体に分類される。挿入は、単数または複数のアミノ酸残基の相互配列挿入と同様に、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合を含む。挿入は通常、たとえば、約１〜４残基のアミノまたはカルボキシル末端融合より小さな挿入であり得る。実施例において記載のように、免疫原性融合タンパク質の誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの架橋によって標的配列へ免疫原性を付与するのに十分大きいポリペプチドを溶解させることによって作られるか、または組換え細胞培養によって融合をコードするＤＮＡで転換する。削除は、タンパク質配列から１種以上のアミノ酸残基を除去することによって特徴づけられる。一般に、約２〜６しかない残基は、タンパク質分子内でどの部分においても削除された。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおいてヌクレオチドの突然変異誘発の特有の部位によって調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡを生産、およびその後組換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。周知の配列を有するＤＮＡ中の予測部位において置換変異を作る技法、たとえばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発は、よく知られている。アミノ酸置換には一般に、一つの残基があるが、すぐにいくつかの異なる場所で発生できる；挿入は通常、約１から１０のアミノ酸残基へ類似し得る；および削除は、約１から３０の残基である。削除または挿入は、好ましくは隣接した一組で作られる、すなわち２つの残基の削除または２つの残基の挿入でなされる。代用、削除、挿入またはそのいずれもの組合せは、最終構築物に到達するために結合されるかもしれない。変異は、リーディング・フレームから配列を置いてはならず、および好ましくは、第二のｍＲＮＡ構造をつくり得る相補的な領域をつくってはならない。置換変異体は、少なくとも１つの残基が取り除かれおよびその位置で異なる残基に挿入される。このような置換は一般に、次の表に従ってなされ、保存された置換と称される。

機能的または免疫学的同一性の実質的な変化は、表２に記載した置換よりも保存性の低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）たとえばシートまたは螺旋構造としての、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、もしくは、（ｃ）側鎖の嵩高さ、の維持に対する効果がより大きく異なる残基を選択することによって起こる。一般に、タンパク質特性で最も大きな変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）たとえば、セリルまたはスレオニルなどの親水性残基で（を）、たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルなどの疎水性残基を（で）置換するもの；（ｂ）その他いずれもの残基に（または、よって）置換されたシステインまたはプロリンで（を）その他いずれもの残基を（で）置換するもの；（ｃ）たとえば、リジル、アルギニルまたはヒスチジルなどの電気陽性側鎖を有する残基で（を）、たとえば、グルタミルまたはアスパルチルなどの負電荷を有する残基を（で）置換するもの、または；（ｄ）この場合、たとえば、フェニルアラニンなどの嵩高い側鎖を有する残基で（を）、たとえば、グリシンなどのそのような側鎖を有さない残基を（で）置換するもの（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増やすことだろう。たとえば、生物学上および／または化学的に類似している別のものによる１つのアミノ酸残基との代置は、同類置換として当業者に周知である。たとえば、同類置換は、ある疎水性残基を別の残基に、またはある極性残基を別の残基に置き換えることである。この置換は、たとえば、ＧＩｙ、Ａｌａ；ＶａＩ、Ｈｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、ＧＩｕ；Ａｓｎ、ＧＩｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰＨｅ、Ｔｙｒのような組み合わせを含む。各々明確に開示された配列の同類的な置換変種は、本明細書において提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。

置換または欠失の突然変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の挿入部位を使用できる。システインまたはその他の不安定な残基の削除も望まれ得る。タンパク質分解部位、たとえばＡｒｇの欠失または置換の可能性は、たとえば、塩基性残基の１つが欠失する、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基によって１つを置換することによて成し遂げられる。

特定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基になる。あるいは、これらの残基を温和な酸性条件下で脱アミド化する。その他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンの水酸化、セリンまたはスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化：構造およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆&Ｃｏ．社、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６[１９８３]）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいくつかの例では、Ｃ-末端カルボキシルのアミド化が含まれる。

本明細書において開示されたタンパク質の変異体および派生物を定める１つの方法が、特定の周知の配列に相同性/アイデンティティに関して変形と派生物を定めることを介すものと理解される。たとえば、配列番号１は、ＫＤ１の特殊な配列を示し、および配列番号２は、その変異体の特殊な配列を示す。具体的な例には、本明細書において、少なくとも定まった配列のための７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有するこれらおよびその他のタンパク質の変異体を、提供する。当業者は、２つのタンパク質の相同性の判定の仕方を容易に理解する。たとえば、相同性がその最高レベルにあるように、相同性は２つのシーケンスを一列に並べた後に計算され得る。相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実行され得る。比較のための配列の最適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピューター化実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴ）、または検定により、当該技術分野に公知の標準的技法を用いて決定される。

同じタイプの相同性は、たとえば、Ｚｕｋｅｒに開示されたアルゴリズム、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９少なくとも核酸アライメントに関する物質を本明細書において援用することによって核酸のために得ることができる。

保守的変異および相同性の説明は、変異体が保存的変異である特殊な配列のために少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のような、いずれもの組み合わせと一緒に組み合わされ得ると理解される。

本明細書において論じられるタンパク質とタンパク質配列ように、このようなタンパク質配列をコードすることができる核酸も開示されると理解される。この仕様がいろいろ議論されるように、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も明らかにされると理解される。これは、特定のタンパク質配列、すなわち、変性核酸を含有する核酸同様に１つの特殊なタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、タンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードすることに関連するすべての変性配列を含む。従って、各々の特殊な核酸配列は、本明細書において書き出されないかもしれないが、実際、どの配列も開示されたタンパク質配列を通して、本明細書において開示され、記述される。また、生物体内のタンパク質をコードする特殊なＤＮＡ配列を指示するアミノ酸配列ではないため、開示されたタンパク質の特殊な変異体は、本明細書において提供され周知の核酸配列タンパク質部位はまた、周知のおよび本明細書において提供および記述され、特殊な部位におけるタンパク質でコード化されると理解される。

開示された組成物に組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチド類似体があると理解される。たとえば、表２で示されるものより多数のＤアミノ酸または異なる機能的な置換基を有するアミノ酸がある。ペプチド類似体の立体異性体と同様に、天然に存在するペプチドの逆の立体異性体を提供する。これらのアミノ酸は、選ばれたアミノ酸とｔＲＮＡ分子を変異させることによって、およびたとえば、特殊な方法の部位において、ペプチド鎖へアミノ酸類似体挿入するための琥珀のコドンを利用する遺伝子構造工学によって、ポリペプチド鎖に容易に組み込まれ得る。たとえば、（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ、１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ、ＴＩＢ Ｔｅｃｈ、１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：６７８−６８２（１９９４）を参照、それらすべては、本明細書において少なくともアミノ酸類似体に関連する物質を参照することにより援用される。

ペプチドに類似する分子は生産され得るが、しかし、ペプチド連結を介してつながれない。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の連結は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ――（これらおよびそれらは、Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ、Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ １９８３）、Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ３、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨＨ２−−Ｓ）；Ｈａｒｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ、ＥＰ４５６６５ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；ａｎｄ Ｈｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）で見られ；を含むことができ、それぞれ本明細書に援用する。特に好ましいペプチドではない連鎖は、−−ＣＨ２ＮＨ-である。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などの結合分子間で２つ以上の原子を持つことができると理解される。

アミノ酸類似および類似体およびペプチド類似体には、より経済的な生産、より大きな化学安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、有効性など）、特異性変化（たとえば、生物活性の広範囲スペクトル）、抗原性の軽減などのような、頻繁に強化または望ましい特性がある。

Ｄ−アミノ酸がペプチダーゼその他によって認められないので、Ｄ−アミノ酸はより安定したペプチドを生み出すのに用いられる。同じタイプ（たとえば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）のＤ−アミノ酸とのコンセンサス配列の１種以上のアミノ酸の組織的置換は、より安定したペプチドを生み出すのに用いられる。システイン残基は環化するか、または一緒に２つ以上のペプチドを付けるのに用いられる。これは、特殊な形態にペプチドを拘束するために有益であり得る。（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、本明細書に援用する）。

開示された核酸、ベクターおよび／または細胞を投与することからなる遺伝子組換え生物体を製造方法を開示する。

本発明は、より詳細に以下の実施例で記述される。これらは一例に過ぎず、多数の改良および変形が、当業者には明らかとなる。

本プロセスは、その特定の実施形態の詳細な記述を参照して記載してきたが、添付の請求の範囲に含まれる場合を除いて、および含まれる限り、本発明の範囲を限定するものとみなされるものではない。

以下の実施例は、本明細書における請求の範囲に記載されている化合物、組成物、記事、デバイスおよび／または方法がどのように作られて評価されたかを当業者に完全に開示し、説明するために提示するものであり、本発明の純粋な模範であることを意図しており、発明者が発明と考える範囲を限定するものではない。数字（例えば、量、温度など）に関しては、確実に誤記のないよう努めてきたが、いくつかの誤字や差異は考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、そして、圧力は大気または大気に近いものである。

Ｄ．実施例
１．実施例１
物質および方法：発色性基質Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１）は、ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．（ウェストチェスター、ＯＨ）社より購入した。ヒトプラスミンは、Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入した。ウシアプロチニン（ＢＰＴＩ）は、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社製を利用した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓおよびｐＥＴ２８ａ発現ベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．（マディソン、ＷＩ）社の製品であった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）位置指定突然変異導入キットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラホヤ、ＣＡ）社より入手した。

野生型および変異体タンパク質の発現および精製。ヒトＴＦＰＩ−２（ＫＤ１）の第１クニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメインは、ヒスチジンタグを含有するｐＥＴ２８ａベクターでクローン化された。この変異体は、位置指定突然変異導入によって得られた。このタンパク質は、Ｔ７プロモーターシステムを使用した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのＮ末端ヒスチジンタグ融合タンパク質として過剰発現した。過剰発現したタンパク質は、封入体として回収され、そしてタンパク質は、ヒスチジンタグフリーで屈曲し精製された（２７）。濃度は、ＵＶ分光法によって決定された。

プラスミン阻害アッセイ。プラスミン阻害アッセイは、９６穴マイクロタイタープレートで、３７℃、１時間、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−ＨＣ１緩衝液に、さまざまな濃度の阻害製剤（ＢＰＴＩ、ＫＤ１ＷＴ、ＫＤ１変異体であるＲ２４Ｋ、Ｌ２６ＲまたはＲ２４Ｋ／Ｌ２６Ｒ）とプラスミンを培養することによって行われた。その後、発色性基質Ｓ−２２５１を加え、そして残りのアミド分解活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＵＶｍａｘカイネティックマイクロプレートリーダーで、異なるエンドポイント（０．５および１時間）とＳ２２５１（０．５および１ｍＭ）濃度において測定された。プラスミンを阻害するデータは、２次結合発現により分析された。

対照実験において、基質濃度の増加によっていずれもの基質が結合阻害剤の置換を誘発するのかが最初の調査であった。ＢＰＴＩ（図２）およびＷＴ ＫＤ１（図３）の両方がアッセイされおよび我々の結果は、基質濃度の増加によって、一見、結合阻害剤の変異がないように見えた。また、プラスミン阻害剤の培養時間の増加が、必ず阻害増強を起こすかどうか試験された。これはどちらのケース（図２および図３）でもない。これらの結果は、図４で提示された結果確認された。プラスミン抑制研究より得られた結果は、Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ変異体がプラスミンの強力な阻害剤であり、および野生型ＫＤ１やＲ２４Ｋ変異体のどちらよりもプラスミン多様体を強力に阻害する（図４）ことを示す。ＷＴに対して２２ｎＭ、Ｒ１５Ｋに対して１０ｎＭ、Ｌ２６Ｒに対して６ｎＭおよびＲ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒに対して３ｎＭのＫｉ^＊（阻害定数）値が得られた。従って、Ｌ１７Ｒ変化はとても重要である。Ｌ１７Ｒ変化は、分子モデリングに基づいて行われた。Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ変異体は、ＷＴ ＫＤ１（７倍）またはＲ１５Ｋ（２倍まで）変異体よりプラスミンにより強く結合する。Ｌ１７Ｒ変異体は、ＷＴ ＫＤ１より約４倍強くプラスミンと結合し、従って、Ｌ２６ＲまたはＲ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒは、臨床療法においてＢＰＴＩと置き換えることができる。

本出願全般にわたって、さまざまな刊行物が参照される。最先端の本発明をより完全に記述するために、これら刊行物の開示はその全体を参照により本出願に引用する。

２．実施例２：ＴＦＰＩ−２のクニッツドメイン１（ＫＤ１）の内因系凝固阻害剤活性の緩和
命名法情報
Ｒ２４（Ｒ１５としても周知）は、Ｐ１である
Ａ２５（Ａ１６としても周知）は、Ｐ１’である
Ｌ２６（Ｌ１７としても周知）は、Ｐ２’である
ＴＦＰＩ−２は、おそらくＸＩａ因子の阻害を経由して内因系凝固を阻害する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６ Ｊａｎ ９；３５（１）：２６６−２７２）。セリンプロテアーゼ同様に、ＸＩａ因子は、Ｐ１−Ｐ１’残基ＴＲＡＥまたはＴＲＶＶ（Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’）の間で開裂する。従って、Ｐ２’配列でＬｅｕ（Ｖａｌのような疎水性残基）を有するＫＤ１ＷＴは、ＸＩａ因子を阻害すべきである。従って、Ｐ２’配列でＬｅｕからＡｒｇへの変異は、この阻害を軽減／無効にするだろう。

凝固の阻害試験に対する常法は、正常プラズマのａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を分析することである。この試験において、リン脂質と表面活性剤は、等量（７５マイクロリットル）の正常プラズマと混合された。阻害剤（ＫＤ１ＷＴ、ＫＤ１Ｌ２６ＲまたはＢＰＴＩ）を含有する緩衝液１０マイクロリットルは添加され、そして試料は３７℃で５分間インキュベートされた。３７℃に温める前に、７５マイクロリットルの２５ｍＭＣａＣｌ_２は、その後添加され、クロットを形成するのに要する時間が指摘された。このデータは、図５に示されている。

ａＰＴＴ系において、凝固は、カリクレイン系を含む接触相によって、ＸＩＩ因子からＸＩＩａ因子への活性化によって起こった。ＸＩＩａ因子は、その後、凝固カスケードにおいて、ＸＩ因子からＸＩａ因子へ活性化する。

ＢＰＴＩは、カリクレインを阻害するのに対してＫＤ１ＷＴは、カリクレインおよびＸＩａ因子を阻害する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９６）。これは、ＢＰＴＩによるａＰＴＴの延長をもたらす結果となり、およびＫＤ１ＷＴに対してＫＤ１のＬ２６Ｒ変異体は、ａＰＴＴを阻害（延長）しないことで示されたようにどちらも阻害しないはずである（図５）。この観察は、特定のプラスミン阻害剤Ｌ２６ＲＫＤ１を作る。プラスミンに対する阻害力は、また増加する。従って、Ｌ２６ＲＫＤ１は、クロット（凝固）に影響がなくおよびＷＴ ＫＤ１よりもさらに強力な阻害剤である。

変異体タンパク質Ｌ２６Ｒは、抗凝固剤として活性を失い、抗線溶剤として特定される。それ故、変異体は抗線溶剤としてより活性化するが、それはまたもはや抗凝固剤ではない。この特性は、出血を防ぐのに有用である。

３．実施例３：マウスプラスミン阻害データ
ＷＴ ＫＤ１およびＬ２６Ｒはどちらも、効果的にマウスプラスミンを阻害した。これは、図６に示されている。明らかにＷＴ ＫＤ１およびＬ２６Ｒ変異体は、明らかな８０ｎＭまでのＫｄ値でマウスプラスミンを阻害するのにかなり効果的である。ＷＴおよびＬ２６Ｒ ＫＤ１のどちらにも、１μＭで完全な阻害を得た（Ｍａｓｃｉら、血液 Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２０００、Ｖｏｌ１１、Ｎｏ４、ｐａｇｅｓ ３８５−３９３、ｉｎ ｖｉｖｏプラスミン阻害に関してその全体およびその内容を参照することにより本明細書に援用される）。野生型および変異体のどちらもマウスプラスミンを阻害するので、１つは動物の出血モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでの効果を示すために変異体を使用することができる。

マウスの尾静脈出血モデルは、ヘビプラスミン阻害剤の効果を研究するのに記載されている（Ｍａｓｃｉら；Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２０００、Ｖｏｌ １１、ｐａｇｅｓ ３８５−３９３）。マウスの尾静脈出血モデルの使用において、生理食塩水対照群と比べ、アプロチニン、ＷＴ ＫＤ１または変異体Ｌ２６Ｒのどちらかを約１００マイクログラム／マウスの静脈内投与した時、６７−７０％の失血減少が観察された。これらの実験で使用されたプラスミン阻害剤の用量は、ヒトＣＰＢ（心肺バイパス）外科手術中の使用と類似しており、マウスの体重で調整される。ＵＣＬＡの動物倫理委員会が承認した全てのマウス実験およびマウスの体重で調整されるヒト外科手術の使用量は、実際これらの初期研究をベースにしたものである。血清ＢＵＮ／クレアチニンレベルは、薬剤の投与ののち、２日後および７日後は正常であった。組織の顕微鏡検査は、腎臓、心臓および脳などの主要組織に損傷がないことを明らかにした。ＫＤ１ＷＴおよびＫＤ１Ｌ２６Ｒは、アプロチニンと同様に効果的な失血を減少した。しかしながら、使用量は、異なる阻害剤（アプロチニン、ＷＴ ＫＤ１またはＬ２６Ｒ変異体）間で、違いが十分に分からない可能性のあることが予想された。さらにヒトＫＤ１Ｌ２６Ｒは、選択的にヒトプラスミンを阻害しおよび凝固を阻害しないので、ヒトにおいてより効果的になったかもしれない。

図１は、プラスミンとＢＰＴＩおよびＫＤ１（ＴＦＰＩ−２のクニッツドメイン）のモデルを示す。上端は、ＢＰＴＩ（配列番号５）ＫＤ１（配列番号１のアミノ酸１０〜６７）Ｉの配列アライメントを示す。配列への９の追加は、ＫＤ１の番号付けをすることになる。モデルにおいて、プラスミン、ＢＰＴＩおよびＫＤ１は、リボンとして示される。プラスミン残基は、サフィックスｐと共に示される。左側はＢＰＴＩ：プラスミン複合体であり、右側はＫＤ１：プラスミン複合体である。ＢＰＴＩおよびＫＤ１の両方の残基９、１１、２２、３３および３５は、疎水性コアを形成する。残基１７、８、１９および３４からなるＫＤ１同様のＢＰＴＩの疎水性パッチは、残基３７｛５８３｝、３９｛５８５｝および４１｛５８７｝からなるプラスミンの疎水性パッチの相互作用を示す。ＫＤ１における酸性パッチのＧｌｕ３９は、Ａｒｇ１７５｛７１９｝と直接相互作用し、および水分子がプラスミン中で基本パッチＡｒｇ１００｛６４４｝およびＡｒｇ２２１｛７６７｝を介する可能性がある；ＢＰＴＩ中の残基３９はＡｒｇなので、プラスミンとのこのような相互作用は不可能である。ＫＤ１のＴｙｒ４６は、プラスミン中のＬｙｓ６０Ａ｛６０７｝およびＡｒｇ６０Ｄ｛６１０｝と相互作用し；残基４６はＢＰＴＩ中のＬｙｓなので、このような相互作用は不可能である。ＢＰＴＩ中のＡｒｇ１７は、プラスミン中のＧｌｕ７３｛６２３｝と相互作用し；残基１７はＫＤ１中のＬｅｕなので、このような相互作用は不可能である。ＢＰＴＩ中のＴｈｒ１１は、Ｇｌｎ１９２｛７３８｝のＮ側鎖とＨ結合し；残基１１はＫＤ１中のＴｙｒなので、このような相互作用は不可能である。残基１９２は図に示されていない。また、プラスミン中のＧｌｕ６０｛６０６｝と相互作用するＢＰＴＩおよびＫＤ１両方においてＡｒｇである残基２０は、図示されていない。ＢＰＴＩ中のＰ１残基１５は、Ｓｅｒ１９０｛７３６｝のＯ側鎖と相互作用するＬｙｓでありおよび水分子を介するＡｓｐ１８９｛７３５｝が示される。ＫＤ１中のＰ１残基１５は、Ｓｅｒ１９０と相互作用するＡｒｇでありおよびプラスミン中のＡｓｐ１８９が示される。付番方式でプラスミンに用いられるのは、キモトリプシンである。挿入が起こる場合、キモトリプシン付番は、６０Ａおよび６０Ｄのようにその後引き続いて大文字となる。波括弧中の番号は、プラスミノーゲンの付番を表す。 図２は、異なる時間（０．５および１時間）におけるＢＰＴＩによるプラスミンの阻害および基質（Ｓ−２２５１）濃度（０．５および１ｍＭ）を示す対照実験を示す。ＢＰＴＩは、１±０．５）の見掛けの解離定数Ｋｄでプラスミンと結合する。また、それらは、いずれもの基質によって誘発された結合阻害剤の変位に見えない。 図３は、異なる時間（０．５および１時間）および基質濃度（０．５および１ｍＭ）におけるＷＴ ＫＤ１によるプラスミンの阻害を示し、ＷＴ ＫＤ１は、２２±２ｎＭの見掛けのＫｄでプラスミンと結合する。また、阻害剤の変位を誘発するいずれもの重要な基質はない。 図４は、ＷＴ ＫＤ１、Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７ＲおよびＲ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ（図に留意する、Ｒ２４Ｋ＝Ｒ１５ＫおよびＬ２６Ｒ＝Ｌ１７Ｒ、ここでＲ２４ＫおよびＬ２６Ｒは、ＫＤ１付番であり、Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７ＲおよびＬ２６Ｒは、ＢＰＴＩ付番である）によってプラスミンの阻害を示す。インキュベーションの時間は、３７℃、１時間でありおよび基質濃度は、残存活性測定のため１ｍＭである。Ｒ１５Ｋ／Ｌ１７Ｒ変異体は、３±１ｎＭの見掛けのＫｄでプラスミンを阻害する。Ｒ２４Ｋ変異体は、９−１１ｎＭのＫｄでプラスミンを阻害する。ＷＴ ＫＤ１は、Ｒ２４Ｋ変異体のための１０±２ｎＭのＫｄと２倍異なる２２ｎＭのＫｄでプラスミンを阻害する。Ｌ２６Ｒ（ＢＰＴＩ付番におけるＬ１７Ｒ）は、ＷＴ ＫＤ１より４倍まで多い６±２のＫＤ値を得た。 図５は、リン脂質を加えた表面活性因子が、等量（７５マイクロリットル）において、正常ヒトプラズマと混合された例を示す。阻害剤（ＫＤ１ＷＴ、ＫＤ１Ｌ２６ＲまたはＢＰＴＩ）を含有する１０マイクロリットルのバッファを加えおよび試料を３７℃で５分間インキュベートした。３７℃に温める前に、７５マイクロリットルの２５ｍＭＣａＣｌ_２はその後添加され、血液凝固の内因系経路を介してクロットを形成するのに時間が必要であることが認められた。このデータは、ＫＤ１ＷＴおよびＢＰＴＩが、ＫＤ１のＬ２６Ｒ変異体（ＢＰＴＩ付番中Ｌ１７Ｒ）がこの件については無効であるのに対して、凝固の内因系経路を各々阻害することを示す。同様に、凝固の外因系経路は、Ｌ２６Ｒ変異によって阻害されないことが期待される。 図６は、マウスプラスミンを効果的に阻害したｗｔ ＫＤ１およびＬ２６Ｒの両方を示す。Ｗｔ Ｋｄ１およびＬ２６Ｒ変異体は、８０ｎＭまでの見掛けのＫＤ値でマウスプラスミンをかなり効果的に阻害する。ｗｔおよびＬ２６ＲＫＤ１の両方のために、１μＭで完全な阻害が得られた。

Claims (24)

1. １種以上のアミノ酸変異を有する配列番号１を含むポリペプチドであって、第１の変異が、ＢＰＴＩ番号付けシステムを使用して１７位でのロイシンからアルギニンまたはリジンへの置換を含む、ポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが第２の変異を含み、該第２の変異が、４６位でのチロシンからグルタミン酸への置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが第２の変異を含み、前記第２の変異が、１１位でのチロシンからトレオニンへの置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記ポリペプチドが第２の変異を含み、前記第２の変異が、１０位でのアスパラギン酸からチロシンへの置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが第２の変異を含み、前記第２の変異が、１０位でのアスパラギン酸からグルタミン酸への置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 前記ポリペプチドが第２の変異を含み、前記第２の変異が、１６位でのアラニンからメチオニン、グリシンまたはセリンへの置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
7. 前記アミノ酸変異が、４６位でのチロシンからグルタミン酸への置換、１１位でのチロシンからトレオニンへの置換、１６位でのアラニンからメチオニン、グリシン、またはセリンへの置換、および１０位でのアスパラギン酸からチロシンまたはグルタミン酸への置換からなる群より選択される１種以上の変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量をプラスミンと接触させることを含む、少なくとも１種のプラスミン活性を阻害する方法。
11. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を対象へ投与することを含む、プラスミン活性の阻害を必要としている対象を処置する方法。
12. 前記対象が血管形成を有する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記対象が腫瘍形成を有する、請求項１１に記載の方法。
14. 前記対象が骨再形成を受けている、請求項１１に記載の方法。
15. 前記対象が血友病を有する、請求項１１に記載の方法。
16. 前記対象が整形外科手術を受けている、請求項１１に記載の方法。
17. 前記対象が冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）を受けている、請求項１１に記載の方法。
18. 前記対象が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、請求項１１に記載の方法。
19. 請求項１に記載のポリペプチドの有効量を対象へ投与することを含む、関節リウマチの治療をする必要とする対象において、それを治療する方法。
20. ＫＤ１変異体と一緒でのプラスミンの結晶構造をモデリングすること；
    該プラスミンと該ＫＤ１変異体との間の相互作用を決定すること；
    ステップｂの結果に基づいて、該ＫＤ１変異体がプラスミン阻害剤であるかどうかを決定すること；
    を含む、プラスミン阻害剤を同定する方法。
21. 請求項９に記載の核酸の有効量を対象へ投与することを含む、プラスミンの阻害を必要とする対象においてプラスミンを阻害する方法。
22. リガンドが前記ポリペプチドに結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
23. 請求項９に記載の核酸を含む、トランスジェニック動物。
24. 前記ポリペプチドが、ＴＦＰＩ−２の野生型クニッツドメインと比較して低減した抗凝固活性を有する、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の方法。

Images