ES2594607T3 - Procedimientos y composiciones relacionadas con el dominio Kunitz I mutante de TFPI-2 - Google Patents

Abstract

Polipéptido KD1 que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 92% de identidad con la SEC ID NO: 3, en la que, utilizando el sistema de numeración BPTI: (i) el aminoácido en el residuo 17 es un residuo de aminoácido cargado o polar; y (ii) el polipéptido inhibe una actividad de plasmina y presenta una menor actividad contra la coagulación en comparación con un polipéptido KD1 de tipo silvestre.

Description

DESCRIPCION

Procedimientos y composiciones relacionadas con el dominio Kunitz I mutante de TFPI-2.

5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] El agente principalmente responsable de la fibrinolisis es la plasmina, la forma activada del plasminogeno. Muchas sustancias pueden activar el plasminogeno, incluyendo el factor de Hageman activado, estreptoquinasa, uroquinasa (uPA), activador del plasminogeno de tipo tisular (tPA) y calicrelna plasmatica (pKA). La

10 pKA es tanto un activador de la forma zimogena de uroquinasa como un activador directo del plasminogeno.

[0002] La plasmina es indetectable en la sangre circulante normal, pero el plasminogeno, el zimogeno, esta presente a aproximadamente 3 pM. Una cantidad no medida adicional de plasminogeno esta unida a fibrina y otros componentes de la matriz extracelular y las superficies celulares. La sangre normal contiene el inhibidor fisiologico

15 de plasmina, inhibidor de plasmina a2 (a2-PI), a aproximadamente 2 pM. La plasmina y el a2-PI forman un complejo 1:1. La plasmina unida a la matriz o a la celula es relativamente inaccesible a la inhibicion por a2-PI. Por lo tanto, la activacion de plasmina puede superar la capacidad de neutralizacion de a2-PI causando un estado profibri nollti co.

[0003] La plasmina, una vez formada, degrada los coagulos de fibrina, algunas veces de forma prematura; 20 digiere el fibrinogeno (el material de construccion de coagulos) alterando la hemostasia causando la formation de

coagulos desmenuzables, que se lisan facilmente a partir de los productos de degradation y la inhibicion de la adhesion/agregacion de plaquetas por los productos de degradacion de fibrinogeno; interactua directamente con las plaquetas para escindir glucoprotelnas Ib y IIb/IIIa impidiendo la adhesion al endotelio lesionado en zonas de flujo sangulneo de alto cizallamiento y alterando la respuesta de agregacion necesaria para la formacion de un tapon de 25 plaquetas (ADEL86); inactiva proteollticamente enzimas en la ruta de coagulation extrlnseca promoviendo, ademas, un estado prolltico.

[0004] La fibrinolisis y fibrinogenolisis inapropiadas que conducen a hemorragia excesiva son una complication frecuente de procedimientos quirurgicos que requieren circulation extracorporea, tal como derivation

30 cardiopulmonar, y tambien se encuentra en terapia trombolltica y transplante de organos, particularmente de hlgado. Otras afecciones cllnicas caracterizadas por alta incidencia de diatesis hemorragica incluyen cirrosis hepatica, amiloidosis, leucemia promielocltica aguda y tumores solidos. La restauracion de la hemostasia requiere infusion de plasma y/o productos plasmaticos, lo que supone un riesgo de reaction inmunologica y exposition a patogenos, por ejemplo virus de la hepatitis y VIH.

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[0005] Una perdida de sangre muy grande puede resistir la resolution incluso con infusion masiva. Cuando se considera potencialmente letal, la hemorragia se trata con antifibrinolfticos tales como acido e-aminocaproico (Vease HOOV93) (EACA), acido tranexamico o aprotinina (NEUH89). La aprotinina tambien se conoce como Trasylolv y como Inhibidor de tripsina pancreatica bovina (BPTI). En lo sucesivo en el presente documento, la

40 aprotinina se denominara “BPTI”. El EACA y el acido tranexamico solamente impiden que la plasmina se una a fibrina uniendose a los dominios Kringle, dejando de este modo a la plasmina como una proteasa libre en el plasma. El BPTI es un inhibidor directo de plasmina y es el mas eficaz de estos agentes. Debido al potencial para complicaciones tromboticas, toxicidad renal y, en el caso de BPTI, inmunogenicidad, estos agentes se usan con precaution y habitualmente se reservan como un “ultimo recurso” (PUTT89). Todos estos tres agentes 45 antifibrinollticos carecen de especificidad y afinidad por una diana e interactuan con tejidos y organos a traves de rutas metabolicas sin caracterizar. Las dosis grandes requeridas debido a baja afinidad, efectos secundarios debidos a falta de especificidad y potencial para reaccion inmunologica y toxicidad para organos/tejidos aumentan contra el uso estos antifibrinollticos de forma profilactica para impedir la hemorragia o como una terapia postoperatoria rutinaria para evitar o reducir la terapia de transfusion. Por lo tanto, existe una necesidad de un antifibri nollti co 50 seguro.

[0006] Una hemorragia excesiva puede ser el resultado de una actividad de coagulacion deficiente, actividad fibrinolltica elevada o una combination de las dos afecciones. En la mayorla de las diatesis hemorragicas se debe controlar la actividad de plasmina. Se cree que el efecto cllnicamente beneficioso del inhibidor de tripsina

55 pancreatica bovina (BPTI) en la reduction de la perdida de sangre es el resultado de su inhibicion de plasmina (Kd aproximadamente 0,3 nM) o de calicrelna plasmatica (Kd aproximadamente 100 nM) o de ambas enzimas.

[0007] Curiosamente, la reaccion de hipersensibilidad inducida por BPTI se produce en aproximadamente del 1,2 al 2,7 por ciento de los pacientes expuestos de nuevo a aprotinina (30). De estas reacciones, el 50 por ciento

son potencialmente letales con una tasa de letalidad del 9 por ciento (30). Por lo tanto, una molecula humana que esta modificada de forma selectiva para hacerla mas potente es altamente deseable. Tambien se espera que dicha molecula sea menos inmunogena. Recientemente se han descrito problemas de efectos secundarios y toxicidad para el uso de BPTI (Manago y col., N Engl J Med 2006; 354: 353-65). La textilinina tambien se ha comparado con 5 aprotinina, sin embargo, la textilinina es una protelna de serpiente y, por lo tanto, hay problemas de inmunogenicidad asociados con ella. (Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34(4-5): 188-93 y Patente de Estados Unidos N° 7.070.969).

[0008] El documento WO 95/18830 da a conocer una variedad de polipeptidos que comprenden dominios 10 Kunitz mutados, que potencialmente actuan como inhibidores de la plasmina humana.

[0009] Lo que se necesita en la tecnica es un inhibidor de plasmina que sea tan potente (o mas potente) que BPTI, pero que sea casi identico a un dominio de protelna humana, ofreciendo de este modo potencial terapeutico similar pero planteando menos potencial para antigenicidad.

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RESUMEN DE LA INVENCION

[0010] De acuerdo con el fin o los fines de esta invention, tal como se realiza y se describe ampliamente en el presente documento, esta invencion, en un aspecto, se refiere a un polipeptido KD1, tal como se define en las

20 reivindicaciones, que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 92% de identidad con la SEC ID NO: 3, en la que, utilizando el sistema de numeration BPTI, (i) el aminoacido en el residuo 17 es un residuo de aminoacido cargado o polar; y (ii) el polipeptido inhibe la actividad de plasmina y presenta una menor actividad contra la coagulation en comparacion con un polipeptido KD1 de tipo silvestre. Para referencia, tambien se da a concoer en el presente documento la SEC ID N° 1 con una o mas de las siguientes sustituciones: leucina se cambia 25 a arginina o lisina en la position 17 (numeracion de BPTI); tirosina se cambia a acido glutamico en la position 46; tirosina se cambia a treonina en la posicion 11; acido aspartico se cambia a tirosina o acido glutamico en la posicion 10; alanina se cambia a metionina en la posicion 16; alanina se cambia a glicina en la posicion 16; alanina se cambia a serina en la posicion 16.

30 [0011] En el presente documento tambien se dan a conocer los polipeptidos que inhiben la plasmina. En el

presente documento tambien se dan a conocer polipeptidos que inhiben la plasmina y tienen actividad de anticoagulacion reducida en comparacion con el dominio Kunitz de tipo silvestre de TFPI-2. En el presente documento tambien se dan a conocer polipeptidos que son especlficos como agentes antifibrinollticos.

35 [0012] Tambien se dan a conocer composiciones que comprenden los polipeptidos descritos en el presente

documento.

[0013] Tambien se dan a conocer acidos nucleicos que codifican los polipeptidos da a conocerdos en el presente documento.

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[0014] Tambien se dan a conocer procedimientos de inhibition de al menos una actividad de plasmina que comprenden poner en contacto plasmina con una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en el presente documento.

45 [0015] Tambien se da a conocer un procedimiento de tratamiento de un sujeto que necesita inhibicion de una

actividad de plasmina, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en el presente documento. Los ejemplos de enfermedades, trastornos, y tratamientos relacionados con la necesidad de inhibicion de plasmina incluyen, aunque sin limitarse a, tumorigenesis, angiogenesis, remodelacion osea, cirugla, hemofilia, cirugla ortopedica, injerto de derivation de la arteria coronaria (CABG) y slndrome de respuesta 50 inflamatoria sistemica (SIRS).

[0016] Tambien se da a conocer un procedimiento de tratamiento de artritis reumatoide en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en el presente documento.

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[0017] Tambien se da a conocer un procedimiento de identification de un inhibidor de plasmina que comprende: modelar una estructura cristalina de plasmina con una variante de KD1; determinar la interaction entre la plasmina y la variante de KD1; en base a los resultados de la interaccion, determinar si la variante de KD1 es un inhibidor de plasmina.

[0018] Tambien se da a conocer un procedimiento de inhibicion de plasmina en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del acido nucleico da a conocerdo en el presente documento.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0019] Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran realizaciones de la invencion y, junto con la description, sirven para explicar los principios de la invention.

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La figura 1 muestra un modelo de BPTI y KD1 (dominio Kunitz de TFPI-2) con plasmina. La parte superior muestra el alineamiento de secuencia de BPTI (SEC ID N° 5) KD1 (aminoacidos 10-67 de la SEC ID N° 1). La adicion de 9 a la secuencia dara como resultado la numeration de KD1. En el modelo, la plasmina, el BPTI y el KD1 se muestran como cintas. Los residuos de plasmina se muestran con un sufijo p. A la izquierda esta el complejo BPTI:plasmina y 15 a la derecha esta el complejo KD1:plasmina. Los residuos 9, 11, 22, 33 y 35 tanto en forma BPTI como KD1 forman el nucleo hidrofobo. El parche hidrofobo en BPTI, as! como en KD1 constituido por los residuos 17, 8, 19 y 34, se muestra interactuando con el parche hidrofobo en plasmina constituido por los residuos 37{583}, 39{585} y 41{587}. El Glu39 del parche acido en KD1 interactua directamente con Arg175 {719} y posiblemente a traves de moleculas de agua con Arg100 {644} y Arg221 {767} del parche basico en plasmina; dado que en BPTI el residuo 39 es Arg, 20 dichas interacciones con plasmina no son posibles. El Tyr46 de KD1 interactua con Lys60A {607} y Arg60D {610} en plasmina; dado que el residuo 46 es Lys en BPTI, dichas interacciones no son posibles. Arg17 en BPTI interactua con Glu73 {623} en plasmina; dado que el residuo 17 es Leu en KD1, dichas interacciones no son posibles. Thr11 en BPTI establece un puente de H con la cadena lateral N de Gln192{738}; dado que el residuo 11 es Tyr en KD1, dichas interacciones no son posibles. El residuo 192 no se muestra en la figura. Tampoco se muestra el residuo 20, 25 que es Arg tanto en BPTI como en KD1 que interactua con el Glu60 {606} en plasmina. El residuo 15 P1en BPTI es Lys que se muestra que interactua con la cadena lateral O de Ser190 (736} y Asp189 {735} a traves de una molecula de agua se muestra. El residuo 15 P1 en KD1 es Arg que tambien se muestra que interactua con Ser190 y Asp 189 en plasmina. El sistema de numeracion usado para plasmina es el de quimotripsina. Donde se producen interacciones, a la numeracion de quimotripsina le sigue una letra mayuscula tal como 60A y 60D. Los numeros 30 entre llaves representan la numeracion del plasminogeno.

La figura 2 muestra experimentos de control que muestran la inhibicion de Plasmina por BPTI en diferentes momentos (0,5 y 1 h) y concentraciones (0,5 y 1 mM) de sustrato (S-2251). El BPTI se une a plasmina con una constante de disociacion aparente Kd de 1±0,5). Ademas, no parece haber ningun desplazamiento, inducido por el sustrato, del inhibidor unido.

35 La figura 3 muestra la inhibicion de plasmina por KD1 del tipo silvestre en diferentes momentos (0,5 y 1 h) y concentraciones de sustrato (0,5 y 1 mM) el KD1 de tipo silvestre se une a plasmina con una Kd aparente de 22±2 nM. Ademas, no hay ningun desplazamiento del inhibidor inducido por el sustrato significativo. La figura 4 muestra la inhibicion de plasmina por KD1 de tipo silvestre, R15K/L17R y R15K (observese que en las figuras, R24K=R15K y L26R=L17R, donde R24K y L26R son numeracion de KD1, y R15K y L26R son numeracion de BPTI). El tiempo de 40 incubation era de 1 h a 37°C y la concentration de sustrato era de 1 mM para las mediciones de actividad restantes. El mutante R15K/L17R inhibe la plasmina con una Kd aparente de 3±1 nM. El mutante R24K inhibe la plasmina con una Kd de 9-11 nM. El KD1 de tipo silvestre inhibe la plasmina con una Kd de 22 nM, que es dos veces diferente de la Kd de 10±2 nM para el mutante R24K. El L26R (L17r en numeracion de BPTI) dio un valor de KD de 6±2, que es ~4 veces mejor que el KD1 de tipo silvestre.

45 La figura 5 muestra un ejemplo en el que el activador superficial mas fosfollpido se mezclo con plasma humano normal a cantidades iguales (75 microlitros). Se anadieron diez microlitros de tampon que contenla inhibidor (KD1 de tipo silvestre, KD1 L26R o BPTI) y la muestra se incubo durante cinco minutos a 37°C. A continuation se anadieron setenta y cinco microlitos de CaCl2 25 mM precalentados a 37°C y se anoto el tiempo necesario para formar el coagulo a traves de la ruta intrlnseca de coagulation de la sangre. Los datos muestran que KD1 de tipo silvestre y 50 BPTI inhiben, cada uno, la ruta intrlnseca de coagulacion mientras que el mutante L26R (L17R en numeracion BPTI) de KD1 es ineficaz a este respecto. Analogamente, se espera que la ruta extrlnseca de coagulacion no sea inhibida por el cambio de L26R.

La figura 6 muestra que tanto KD1 de tipo silvestre como L26R inhiblan la plasmina de raton eficazmente. El Kd1 de tipo silvestre y el mutante L26R son bastante eficaces para inhibir la plasmina de raton con un valor de KD aparente 55 de ~80 nM. La inhibicion completa se obtuvo a 1 pM para KD1 tanto de tipo silvestre como L26R.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0020] La presente invencion puede entenderse mas facilmente en referencia a la siguiente descripcion

detallada de realizaciones preferidas de la invencion y los ejemplos incluidos en ella y a las figuras y sus anteriores as! como la siguiente descripcion.

A. DEFINICIONES

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[0021] Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”,

“uno” y “el/la” incluyen referentes en plural a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, referencia a “una molecula pequena” incluye mezclas de una o mas moleculas pequenas, y similares.

10 [0022] Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como de “aproximadamente” un valor

particular, y/o a “aproximadamente” otro valor particular. Cuando dicho intervalo se expresa, otra realizacion incluye del un valor particular y/o al otro valor particular. Analogamente, cuando se expresan valores como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “aproximadamente”, se entendera que el valor particular forma otra realizacion. Se entendera ademas que los valores extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el 15 otro valor extremo, como independientemente del otro valor extremo.

[0023] Los terminos “mayor”, “aumenta”, “eleva” o “elevacion” se refieren a aumentos por encima de los niveles basales, por ejemplo, en comparacion con un control. Los terminos “bajo”, “menor”, “reduce” o “reduction” se refieren a disminuciones por debajo de niveles basales, por ejemplo, en comparacion con un control.

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B. PROCEDIMIENTOS DE USO

[0024] El inhibidor de tripsina pancreatica bovina (BPTI) es un inhibidor de serina proteasa de tipo Kunitz. Inhibe la plasmina y esta siendo usado en cirugla a corazon abierto y esta recomendado en cirugla ortopedica para

25 minimizar la hemorragia preoperatoria y la administration de productos sangulneos (1-5). Recientemente, el sistema de plasminogeno/plasmina tambien se ha implicado en el desarrollo de artritis reumatoide (6-10) as! como en la remodelacion y la resorcion oseas (11-15) y tumorigenesis y angiogenesis (8, 16, 17).

[0025] El Inhibidor de la ruta del factor tisular humano-2 (TFPI-2), tambien conocido como inhibidor de serina 30 proteasa de la matriz o protelna placentaria 5, contiene los tres tipos de dominios Kunitz (similar a BPTI) en tandem

con un corto extremo de aminoacidos y una cola C-terminal muy basica (18, 19). Diversas celulas, incluyendo queratinocitos, fibroblastos dermicos, celulas de musculo liso, sincitiotrofoblastos, sinovioblastos y celulas endoteliales sintetizan y secretan TFPI-2 en la matriz extracelular (ECM) (20-23). El TFPI-2 se encuentra en tres formas debido a diferencias en la glucosilacion con Mr 27.000, 30.000 y 32.000 (24). El primer dominio Kunitz (KD1) 35 de TFPI-2 humano es homologo a BPTI y este tambien inhibe la plasmina (25). Aunque KD1 es especlfico para inhibir la plasmina, los otros dos dominios Kunitz en TFPI-2 no tienen actividad inhibidora discernible. La cola basica C-terminal, sin embargo, puede anclar TFPI-2 a los restos de glucosamina en la ECM para inhibition localizada de plasmina.

40 [0026] Se han determinado la estructura cristalina de BPTI (26) y la de KD1 (27) con tripsina. La estructura

cristalina del dominio proteasa de plasmina humana tambien se ha determinado (28). Usando estas estructuras como plantillas, los complejos de plasmina con BPTI as! como plasmina y KD1 se han modelado con un alto grado de precision. Las posiciones relativas de los inhibidores y el dominio proteinasa de plasmina se mantuvieron y solamente se realizaron ajustes secundarios en las cadenas laterales. Se observaron interacciones hidrofobas/de 45 van der Waals, puentes de hidrogeno e ionicas entre cada complejo proteinasa-inhibidor. Todas estas interacciones se tuvieron en consideration para evaluar cada complejo inhibidor-proteinasa, y se supuso que todos los potenciales donadores y aceptores de puentes de hidrogeno participarlan en estas interacciones. Se excluyo el disolvente a granel del complejo proteinasa-inhibidor y, por consiguiente, se anticipo que los puentes de hidrogeno y las interacciones ionicas que pueden desempenar un papel importante en la especificidad podlan evaluarse con 50 precision. Los protocolos para modelar estos complejos se han descrito previamente (29).

[0027] La figura 1 representa los residuos en BPTI y KD1 que interactuan con plasmina. A partir de los

modelos presentados en la figura 1, cambiar Leu17 a Arg, y Tyr11 a Thr en KD 1 produce una molecula que tiene una afinidad y especificidad significativamente mayores hacia plasmina humana. Cambiar Tyr46 a Glu y Asp10 a Tyr 55 (o Glu) tambien aumenta la afinidad y la especificidad hacia la inhibicion de plasmina. Por otro lado, cambiar Glu39 a Arg y Tyr46 a Lys puede dar como resultado una perdida sustancial de afinidad de KD1 por la plasmina humana. Sistematicamente, cambiar aquellos residuos que dan como resultado una ganancia de funcion tal como KD1 modificado con Thr11 y Arg17 produce una molecula que es mas potente que BPTI y KD1 nativo. Dicha molecula tambien puede ser menos inmunogena que BPTI. La cola basica para la molecula selectiva tambien puede anadirse

al extremo C que contiene unos pocos residuos extra como enlazador de modo que su semi-vida en la matriz extracelular aumente. En el presente documento se dan a conocer procedimientos de inhibicion de al menos una actividad de plasmina que comprenden poner en contacto plasmina con una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en el presente documento.

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[0028] Algunas formas de las moleculas y polipeptidos da a conocerdos pueden inhibir la plasmina pero tienen actividad de anticoagulacion reducida en comparacion con dominio Kunitz de TFPI-2 de tipo silvestre. Algunas formas de las moleculas y polipeptidos da a conocerdos tambien son especlficas como agentes antifibrinollticos. Por lo tanto, algunas formas de las moleculas y polipeptidos da a conocerdos son mas activas como agentes

10 antifibrinollticos pero ya no tienen actividad anticoagulante o tienen actividad anticoagulante reducida. Esta propiedad hace a dichas moleculas y polipeptidos bastante utiles para prevenir hemorragias.

[0029] Tambien se da a conocer un procedimiento de tratamiento de un sujeto que necesita inhibicion de una actividad de plasmina, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en

15 el presente documento. Los ejemplos de enfermedades, trastornos y tratamientos relacionados con la necesidad de inhibicion de plasmina incluyen, aunque sin limitarse a, tumorigenesis, angiogenesis, remodelacion osea, cirugla, hemofilia, cirugla ortopedica, injerto de derivacion de la arteria coronaria (CABG) y slndrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS). Tambien se da a conocer un procedimiento de tratamiento de artritis reumatoide en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipeptido da a conocerdo en 20 el presente documento.

[0030] Tambien se da a conocer un procedimiento de identification de un inhibidor de plasmina que comprende: modelar una estructura cristalina de plasmina con una variante de KD1; determinar la interaction entre la plasmina y la variante de KD1; en base a la interaccion, determinar si la variante de KD1 es un inhibidor de

25 plasmina.

[0031] Tambien se da a conocer un procedimiento de inhibicion de plasmina en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del acido nucleico da a conocerdo en el presente documento.

30

[0032] Tambien se da a conocer un procedimiento de mostrar la eficacia de un compuesto para uso humano en un modelo en raton de perdida de sangre reducida. Se ha descubierto que KD1 de tipo silvestre y los mutantes da a conocerdos inhiben, ambos, la plasmina de raton (vease el ejemplo 3). Por lo tanto, el mutante puede usarse para mostrar eficacia en un modelo en raton de perdida de sangre reducida.

35

[0033] Las protelnas de esta invention pueden producirse mediante cualquier tecnica convencional, incluyendo slntesis no biologica mediante acoplamiento secuencial de componentes, por ejemplo aminoacidos, production mediante tecnicas de ADN recombinantes en celulas huesped adecuadas, y semislntesis, por ejemplo, mediante la elimination de secuencias no deseadas y acoplamiento de secuencias de sustitucion sinteticas. Las

40 protelnas da a conocerdas en el presente documento se producen preferentemente, de forma recombinante, en un huesped adecuado, tal como bacterias de los generos Bacillus, Escherichia, Salmonella, Erwinia, y levaduras de los generos Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces y Schizosaccharomyces, o celulas de mamlfero cultivadas tales como COS-1. Los huesped mas preferidos son microorganismos de las especies Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Yarrowia lipolytica. Cualquier 45 promotor que sea funcional en la celula huesped puede usarse para controlar la expresion genica.

[0034] Las protelnas pueden secretarse y pueden obtenerse a partir de medio acondicionado. La secretion en la ruta preferida, dado que es mas probable que las protelnas se plieguen correctamente y puedan producirse en medio acondicionado con pocos contaminantes. No se requiere secrecion.

50

[0035] Pueden usarse protelnas disenadas para carecer de sitios de glucosilacion unidos a N para reducir el potencial de antigenicidad de glucogrupos, y de modo que protelnas equivalentes puedan expresarse en una amplia diversidad de organismos incluyendo: 1) E. coli, 2) B. subtilis, 3) P. pastoris, 4) S. cerevisiae, y 5) celulas de mamlfero.

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[0036] Existen varios medios para reducir el problema de celulas huesped que producen proteasas que degradan el producto recombinante. La sobreexpresion de la peptidasa senal de B. subtilis en E. coli conduce a una expresion aumentada de una protelna de fusion heterologa. Tambien se ha descrito que la adicion de PMSF (un inhibidor de serina proteasas) al medio de cultivo mejoraba el rendimiento de una protelna de fusion.

[0037] Otros factores que pueden afectar a la production de estas y otras protelnas da a conocerdas en el presente documento incluyen: 1) uso de codones (se prefiere codones de optimization para el huesped), 2) secuencia senal, 3) secuencia de aminoacidos en sitios de procesamiento pretendidos, presencia y localization de

5 enzimas de procesamiento, deletion, mutation o inhibition de diversas enzimas que podrlan alterar o degradar el producto manipulado y mutaciones que hacen al huesped mas permisivo en secretion (se prefieren huespedes de secretion permisiva).

[0038] Las obras de referencia sobre los principios generales de tecnologla de ADN recombinante incluyen 10 Watson y col., Molecular Biology of the Gene, Volumenes I y II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.,

Menlo Park, Calif. (1987); Darnell y col., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Nueva York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1985); Old, y col., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2a edition, University of California Press, Berkeley, Calif. (1981); Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y 15 Ausubel y col, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992).

[0039] Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para ensayar los compuestos de esta invention. Scatchard (Ann NY Acad Sci (1949) 51: 660-669) describio un procedimiento convencional de medicion y analisis de la union que es aplicable a la union de protelnas. Este procedimiento requiere protelna relativamente pura y la

20 capacidad de distinguir protelna unida de no unida.

[0040] Un segundo procedimientos apropiado de medicion de Kd es medir la actividad inhibidora contra la enzima. Si la Kd a medir esta en el intervalo de 1 nM a 1 pM, este procedimiento requiere sustratos cromogenos o fluorogenos y decenas de microgramos a miligramos de inhibidor relativamente puro. Para las protelnas de esta

25 invencion, que tienen una Kd en el intervalo de 5 nM a 50 pM, bastan de nanogramos a microgramos de inhibidor. Cuando se usa este procedimiento, la competition entre el inhibidor y el sustrato enzimatico puede dar una Ki medida que es mayor que la autentica Ki.

[0041] Un tercer procedimiento de determination de la afinidad de una protelna por un segundo material es 30 hacer que la protelna sea presentada en un paquete genetico, tal como M13, y medir la capacidad de la protelna

para adherirse al “segundo material” inmovilizado. Este procedimiento es altamente sensible, dado que los paquetes geneticos pueden amplificarse. Los inhibidores de afinidad conocida por la proteasa se usan para establecer perfiles convencionales contra los cuales se valoran otros inhibidores presentados en fagos. Tambien puede usarse cualquier otro procedimiento adecuado de medicion de la union de protelnas.

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[0042] Las protelnas de esta invencion pueden tener una Kd para plasmina de, como maximo, aproximadamente 5 nM, como maximo, aproximadamente 300 pM o 100 pM o menos. La union puede ser inhibidora, de modo que Ki sea la misma que Kd. La Ki de QS4 para plasmina es de aproximadamente 2 nM. La Ki de SPI11 para plasmina es de aproximadamente 88 pM.

40

[0043] Las composiciones da a conocerdas en el presente documento pueden administrarse in vivo en un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Por “farmaceuticamente aceptable” se entiende un material que no es biologicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto, junto con el acido nucleico o vector, sin causar efectos biologicos indeseables algunos o interactuar de manera perjudicial con

45 cualquiera de los otros componentes de la composition farmaceutica en la que esta contenido. El vehlculo se seleccionarla de forma natural para minimizar cualquier degradation del ingrediente activo y para minimizar cualesquiera efectos secundarios adversos en el sujeto, tal como conocerla bien un experto en la materia.

[0044] Las composiciones pueden administrarse por via oral, por via parenteral (por ejemplo, por via 50 intravenosa), mediante inyeccion intramuscular, mediante inyeccion intraperitoneal, por via transdermica, por via

extracorporal, por via topica o similares, incluyendo administration intranasal topica o administration mediante inhalante. Tal como se usa en el presenten documento, “administracion intranasal topica” significa administracion de las composiciones en el interior de la nariz y los pasajes internos a traves de una o ambas de las fosas nasales y puede comprender la administracion mediante un mecanismo de pulverization o mecanismo de gotas, o a traves de 55 aerosolizatcion del acido nucleico o vector. La administracion de las composiciones mediante inhalante puede ser a traves de la nariz o la boca mediante administracion mediante un mecanismo de pulverizacion o gotas. La administracion tambien puede ser directamente a cualquier zona del aparato respiratorio (por ejemplo, los pulmones) mediante intubation. La cantidad exacta de las composiciones requeridas variara de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad, el peso y el estado general del sujeto, la gravedad del trastorno alergico que esta siendo tratado,

el acido nucleico o vector particular usado, su modo de administracion y similares. Por lo tanto, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composicion. Sin embargo, una cantidad apropiada puede ser determinada por un experto en la materia usando solamente experimentos rutinarios, dadas las ensenanzas en el presente documento.

5

[0045] La administracion parenteral de la composicion, si se usa, se caracteriza generalmente por inyeccion. Pueden prepararse inyectables de formas convencionales, como soluciones o suspensiones llquidas, formas solidas adecuadas para solucion de suspension en llquido antes de la inyeccion, o como emulsiones. Un enfoque revisado mas recientemente para administracion parenteral implica el uso de un sistema de liberacion lenta o liberacion

10 sostenida de modo que se mantenga una dosificacion constante. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 3.610.795.

[0046] Los materiales pueden estar en solucion, suspension (por ejemplo, incorporados en micropartlculas, liposomas o celulas). Estos pueden dirigirse a un tipo de celula particular mediante anticuerpos, receptores o

15 ligandos del receptor. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnologla para dirigir protelnas especlficas a tejido tumoral (Senter, y col., Bioconjugate Chem., 2: 447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60: 275-281, (1989); Bagshawe, y col., Br. J. Cancer, 58: 700-703, (1988); Senter, y col., Bioconjugate Chem., 4: 39, (1993); Battelli, y col., Cancer Immunol. Immunother., 35: 421-425, (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129: 57-80, (1992); y Roffler, y col., Biochem. Pharmacol, 42: 2062-2065, (1991)). Vehlculos tales como 20 “furtivos” y otros liposomas conjugados a anticuerpos (incluyendo direccion de farmacos mediada por llpidos a

carcinoma de colon), direccion de ADN mediada por receptores a traves de ligandos especlficos de celulas,

direccion a tumores dirigida por linfocitos, y direccion retroviral terapeutica altamente especlfica a celulas de glioma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnologla para dirigir protelnas especlficas a tejido tumoral (Hughes y col., Cancer Research, 49: 6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et

25 Biophysica Acta, 1104: 179-187, (1992)). En general, los receptores estan implicados en rutas de endocitosis,

constitutivas o inducidas por ligando. Estos receptores se agrupan en pozos recubiertos de clatrina, la celula mediante veslculas recubiertas de clatrina, pasan a traves de un endosoma acidificado en el que los receptores se clasifican, y a continuation se reciclan a la superficie celular, se vuelven almacenados de forma intracelular o se degradan en los lisosomas. Las rutas de internalization sirven para diversas funciones, tales como captation de 30 nutrientes, elimination de protelnas activadas, aclaramiento de macromoleculas, entrada oportunista de virus y toxinas, disociacion y degradation de ligando y regulation a nivel del receptor. Muchos receptores siguen mas de una ruta intracelular, dependiendo del tipo de celula, la concentration del receptor, el tipo de ligando, la valencia del ligando, y la concentracion del ligando. Se han revisado mecanismos moleculares y celulares de endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10: 6, 399-409 (1991)).

35

[0047] Las composiciones da a conocerdas en el presente documento pueden usarse de forma terapeutica en combination con un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

[0048] Los vehlculos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice 40 of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Tlpicamente, una cantidad

apropiada de una sal farmaceuticamente aceptable se usa en la formulation para hacer a la formulation isotonica. Los ejemplos del vehlculo farmaceuticamente aceptable incluyen, aunque sin limitarse a, solucion salina, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. El pH de la solucion es, preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y mas preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Vehlculos adicionales incluyen 45 preparaciones de liberacion sostenida tales como matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, matrices que estan en forma de artlculos conformados, por ejemplo, pellculas, liposomas o micropartlculas. Sera evidente para los expertos en la materia que algunos vehlculos pueden ser mas preferibles dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administracion y la concentracion de composicion que esta siendo administrada.

50

[0049] Los vehlculos farmaceuticos son conocidos por los expertos en la materia. Estos serlan de la manera mas tlpica vehlculos convencionales para administracion de farmacos a seres humanos, incluyendo soluciones tales como agua esteril, solucion salina y soluciones tamponadas a pH fisiologico. Las composiciones pueden administrarse por via intramuscular o por via subcutanea. Otros compuestos se administraran de acuerdo con

55 procedimientos convencionales usados por los expertos en la materia.

[0050] Las composiciones farmaceuticas pueden incluir vehlculos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares ademas de la molecula de eleccion. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir uno o mas ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, agentes

antiinflamatorios, anestesicos y similares.

[0051] La composicion farmaceutica puede administrarse en una serie de maneras dependiendo de si se

desea tratamiento local o sistemico, y de la zona a tratar. La administracion puede ser por via topica (incluyendo por 5 via oftalmica, por via vaginal, por via rectal, por via intranasal), por via oral, por inhalacion o por via parenteral, por ejemplo mediante goteo intravenoso, inyeccion subcutanea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos da a conocerdos pueden administrarse por via intravenosa, por via intraperitoneal, por via intramuscular, por via subcutanea, por via intracavitaria o por via transdermica.

10 [0052] Las preparaciones para administracion parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones

esteriles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehlculos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo solucion salina y medios tamponados. Los vehlculos parenterales incluyen solucion de cloruro sodico, dextrosa de Ringer, dextrosa y

15 cloruro sodico, lactato de Ringer, o aceites fijados. Los vehlculos intravenosos incluyen regeneradores de fluido y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. Conservantes y otros aditivos tambien pueden estar presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares.

20 [0053] Las formulaciones para administracion topica pueden incluir pomadas, lociones, cremas, geles, gotas,

supositorios, pulverizadores, llquidos y polvos. Los vehlculos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, pulverulentas u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables.

[0054] Las composiciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en

25 agua o medios no acuosos, capsulas, sobrecitos o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes,

diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersion o aglutinantes.

[0055] Algunas de las composiciones pueden administrarse potencialmente como una sal de adicion de acidos o de bases farmaceuticamente aceptable, formada mediante reaccion con acidos inorganicos tales como

30 acido clorhldrico, acido bromhldrico, acido perclorico, acido nltrico, acido tiocianico, acido sulfurico y acido fosforico, y acidos organicos tales como acido formico, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido lactico, acido piruvico, acido oxalico, acido malonico, acido succlnico, acido maleico y acido fumarico, o mediante reaccion con una base inorganica tal como hidroxido sodico, hidroxido de amonio, hidroxido potasico, y bases organicas tales como mono-, di-, trialquil y arilaminas y etanolaminas sustituidas.

35

[0056] Las dosificaciones y programas eficaces para administrar las composiciones pueden determinarse emplricamente, y la realizacion de dichas determinaciones esta dentro del alcance de la tecnica. Los intervalos de dosificacion para la administracion de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que los slntomas del trastorno estan afectados. La dosificacion no debe ser tan grande como

40 para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilacticas, y similares. Generalmente, la dosificacion variara con la edad, el estado, el sexo y el grado de la enfermedad en el paciente, la via de administracion o si otros farmacos estan incluidos en el regimen, y puede ser determinada por un experto en la materia. La dosificacion puede ser ajustada por el facultativo individual en caso de contraindicaciones cualesquiera. La dosificacion puede variar, y puede administrarse en una o mas administraciones de la dosis al dla,

45 durante uno o varios dlas. Puede encontrarse orientacion en la bibliografla para dosificaciones apropiadas para clases dadas de productos farmaceuticos.

[0057] Las protelnas de esta invention pueden aplicarse in vitro a cualquier muestra adecuada que pudiera contener plasmina para medir la plasmina presente. Para hacer esto, el ensayo puede incluir un Sistema Productor

50 de Senales (SPS) que proporciona una senal detectable que depende de la cantidad de plasmina presente. La senal puede detectarse de forma visual o instrumental. Las posibles senales incluyen la production de productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes, la alteration de las caracterlsticas de absorcion o emision de radiation mediante un componente o producto del ensayo, y precipitation o aglutinacion de un componente o producto.

55 [0058] El componente del SPS asociado de manera mas Intima con el reactivo de diagnostico se denomina la

“marca”. Una marca puede ser, por ejemplo, un radioisotopo, un fluoroforo, una enzima, una coenzima, un sustrato enzimatico, un compuesto electrodenso, o una partlcula aglutinable. Un isotopo radiactivo puede detectarse mediante el uso de, por ejemplo, un contador g o un contador de centelleo o mediante autorradiografla. Los isotopos que son particularmente utiles son 3H, 125I, l3ll, 35S, 14C y, preferentemente, 125I. Tambien es posible marcar un

compuesto con un compuesto fluorescente. Cuando el compuesto marcado de forma fluorescente es expuesto a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada. Entre los compuestos de marcado fluorescente usados mas habitualmente estan isotiocianato de fluorescelna, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o- ftaldehldo y fluorescamina. Como alternativa, metales emisores de fluorescencia, tales como 125Eu u otro lantanido, 5 pueden fijarse a la protelna de union usando grupos quelantes de metales tales como acido dietilenitriaminopentaacetico o acido etilendiaminotetraacetico. Las protelnas tambien pueden marcarse de forma detectable mediante acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente, tales como luminol, isoluminol, ester teromatico de acridinio, imidazol, sal de acridinio y ester de oxalato. Del mismo modo, un compuesto bioluminiscente, tal como luciferina, luciferasa y acuorina, puede usarse para marcar la protelna de union. La 10 presencia de una protelna bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Se prefieren marcas enzimaticas, tales como peroxidasa de rabano rusticano y fosfatasa alcalina.

[0059] Hay dos tipos basicos de ensayos: heterogenos y homogeneos. En los ensayos heterogeneos, la union de la molecula de afinidad al analito no afecta a la marca; por lo tanto, para determinar la cantidad de analito,

15 la marca unida debe separarse de la marca libre. En los ensayos homogeneos, la interaccion afecta a la actividad de la marca, y el analito puede medirse sin separacion.

[0060] En general, una protelna de union a plasmina (PBP) puede usarse para diagnostico, de la misma manera que se usa un anticuerpo antiplasmina. Por lo tanto, dependiendo del formato del ensayo, puede usarse

20 para ensayar plasmina o, mediante inhibicion competitiva, otras sustancias que se unen a plasmina.

[0061] La muestra sera normalmente un fluido biologico, tal como sangre, orina, linfa, semen, leche o llquido cefalorraquldeo, o un derivado de los mismos, o un tejido biologico, por ejemplo, una seccion u homogenado tisular. La muestra podrla ser cualquier cosa. Si la muestra es un fluido o tejido biologico, puede ser tomada de un ser

25 humano u otro mamlfero, vertebrado o animal, o de una planta. La muestra preferida es sangre, o una fraccion o derivado de la misma.

[0062] En una realizacion, la protelna de union a plasmina (PBP) esta inmovilizada, y a la plasmina en la muestra se le permite competir con una cantidad conocida de un analogo de plasmina marcado o marcable de forma

30 especlfica. El “analogo de plasmina” es una molecula capaz de competir con plasmina por la union a la PBP, que incluye la propia plasmina. Puede estar ya marcado, o puede marcarse posteriormente uniendo especlficamente la marca a un resto que diferencie al analogo de plasmina de la plasmina. Las fases se separan, y se cuantifica el analogo de plasmina marcado en una fase.

35 [0063] En un “ensayo en sandwich”, se emplean tanto un agente de union a plasmina (PBA) insolubilizado,

como un PBA marcado. El analito de plasmina es capturado por el PBA insolubilizado y es etiquetado por el PBA marcado, formando un complejo terciario. Los reactivos pueden anadirse a la muestra en cualquier orden. Los PBA pueden ser iguales o diferentes, y solamente es necesario que un PBA sea una PBP segun esta invencion (el otro puede ser, por ejemplo, un anticuerpo). La cantidad de PBA marcado en el complejo terciario es directamente 40 proporcional a la cantidad de plasmina en la muestra.

[0064] Las dos realizaciones descritas anteriormente son ambas ensayos heterogeneos. Un ensayo homogeneo requiere solamente que la marca resulte afectada por la union de la PBP a plasmina. El analito de plasmina puede actuar como su propia marca si se usa un inhibidor de plasmina como reactivo de diagnostico.

45

[0065] Una marca puede estar conjugada, directa o indirectamente (por ejemplo, a traves de un anticuerpo anti-PBP marcado), covalentemente (por ejemplo, con SPDP) o no covalentemente, a la protelna de union a plasmina, para producir un reactivo de diagnostico. Analogamente, la protelna de union a plasmina puede estar conjugada a un soporte en fase solida para formar un reactivo de diagnostico (“de captura”) en fase solida. Los

50 soportes adecuados incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, Nylon, amilasas y magnetita. El vehlculo puede ser soluble en cierta medida o insoluble para los fines de esta invencion. El material de soporte puede tener cualquier estructura, siempre que la molecula acoplada sea capaz de unirse a plasmina.

[0066] Un dominio Kunitz que se une muy estrechamente a plasmina puede usarse para imaginologla in vivo. 55 La imaginologla de diagnostico de focos de enfermedad se consideraba una de las mayores oportunidades

comerciales para anticuerpos monoclonales, pero esta oportunidad no se ha conseguido. A pesar de un esfuerzo considerable, solamente se han aprobado dos agentes de imaginologla a base de anticuerpos monoclonales. Los decepcionantes resultados obtenidos con anticuerpos monoclonales se deben en gran medida a: i) afinidad y/o especificidad inadecuadas; ii) mala penetracion en sitios diana; iii) lento aclaramiento de sitios no diana; iv)

inmunogenicidad; y v) coste de produccion elevado y mala estabilidad.

[0067] Estas limitaciones han conducido al desarrollo de agentes de imaginologla de base peptldica. Aunque potencialmente resuelven los problemas de mala penetracion o lento aclaramiento, es improbable que los agentes

5 de imaginologla de base peptldica posean afinidad, especificada y estabilidad in vivo adecuadas para ser utiles en la mayorla de las aplicaciones.

[0068] Las protelnas manipuladas son adecuadas de forma unica para los requisitos para un agente de imaginologla. En particular, la afinidad y especificidad extraordinarias que pueden obtenerse manipulando dominios

10 proteicos de origen humano, estables y pequenos que tienen velocidades y mecanismos de aclaramiento in vivo conocidos, se combinan para proporcionar resultados mas tempranos y mas fiables, menos toxicidad/efectos secundarios, un menor coste de produccion y almacenamiento, y mayor comodidad de preparacion de la marca. De hecho, es posible conseguir el objetivo de imaginologla en tiempo real con agentes de imaginologla de protelnas manipuladas. Las protelnas de union a plasmina, por ejemplo SPI11, pueden ser utiles para localizar sitios de 15 hemorragia interna.

[0069] La protelna de union radiomarcada puede administrarse al sujeto humano o animal. La administracion es tlpicamente por inyeccion, por ejemplo, intravenosa o arterial u otros medios de administracion en una cantidad suficiente para permitir la posterior imaginologla dinamica y/o estatica usando dispositivos de radiodeteccion

20 adecuados. La dosificacion es la cantidad mas pequena capaz de proporcionar una imagen eficaz desde el punto de vista del diagnostico, y puede determinarse mediante medios convencionales en la tecnica, usando agentes de radioimaginologla conocidos.

[0070] Tlpicamente, la imaginologla se lleva a cabo en todo el cuerpo del sujeto, o en esa parte del cuerpo u 25 organo relevante para la afeccion o enfermedad en estudio. La protelna de union radiomarcada se ha acumulado. La

cantidad de protelna de union radiomarcada acumulada en un punto en el tiempo dado, en organos diana relevantes puede cuantificarse a continuacion.

[0071] Un dispositivo de radiodeteccion particularmente adecuado es una camara de centelleo, tal como una 30 camara g. El dispositivo de detection en la camara detecta y registra (y opcionalmente digitaliza) la desintegracion

radiactiva. La information digitalizada puede analizarse de cualquier manera adecuada, muchas de las cuales se conocen en la tecnica. Por ejemplo, un analisis de tiempo-actividad puede ilustrar la captation a traves del aclaramiento de la protelna de union radiomarcada por los organos diana con el tiempo.

35 [0072] Diversos factores se tienen en consideration para seleccionar un radioisotopo apropiado. El isotopo se

selecciona: para permitir una resolution de buena calidad despues de la imaginologla, para que sean seguros para uso de diagnostico en seres humanos y animales y, preferentemente, para tener una corta semi-vida para reducir la cantidad de radiation recibida por el cuerpo. El radioisotopo usado debe ser, preferentemente, farmacologicamente inerte, y las cantidades administradas no deben tener ningun efecto fisiologico sustancial. La protelna de union 40 puede estar radiomarcada con diferentes isotopos de yodo, por ejemplo 123I, 125I o 131I (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.609.725). La cantidad de marcado debe monitorizarse adecuadamente.

[0073] En aplicaciones a sujetos humanos, puede ser deseable usar radioisotopos diferentes de 125I para marcado para reducir la exposition de dosimetrla total del cuerpo y para optimizar la detectabilidad de la molecula

45 marcada. Considerando la disponibilidad cllnica lista para su uso en seres humanos, las radiomarcas preferidas incluyen: 99mTc, 67Ga, 68Ga, 90Y, 111In, 113mIn, 123I, 186Re, 188Re o 211At. La protelna radiomarcada puede prepararse mediante diversos procedimientos. Estos incluyen radiohalogenacion mediante el metodo de cloramina-T o lactoperoxidasa y posterior purification mediante cromatografla de llquidos de alta resolucion, por ejemplo, vease Gutkowska y col en “Endocrinology and Metabolism Clinics of America: (1987) 16 (1): 183. Pueden usarse otros 50 procedimientos de radiomarcado, tales como IODOBEADS™.

[0074] Una protelna radiomarcada puede administrarse mediante cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de action del agente en un mamlfero. Dado que las protelnas estan sometidas a digestion cuando se administran por via oral, habitualmente se usarla administracion parenteral, es decir, intravenosa

55 subcutanea, intramuscular, para optimizar la absorcion.

[0075] Las protelnas de union a plasmina de esta invention tambien pueden usarse para purificar plasmina de un fluido, por ejemplo, sangre. Para este fin, la PBP se inmoviliza preferentemente sobre un soporte insoluble. Dichos soportes incluyen aquellos ya mencionados como utiles para preparar reactivos de diagnostico en fase

solida.

[0076] Las protelnas pueden usarse como marcadores de peso molecular para referencia en la separacion o purificacion de protelnas. Puede ser necesario desnaturalizar las protelnas para que sirvan como marcadores de

5 peso molecular. Una segunda utilidad general para las protelnas es el uso de protelna hidrolizada como fuente de nutrientes. Las protelnas tambien pueden usarse para aumentar la viscosidad de una solucion.

[0077] La protelna de esta invencion puede usarse para cualquiera de los fines anteriores, as! como para fines de diagnostico terapeutico tal como se ha descrito adicionalmente anteriormente en esta memoria descriptiva.

10

[0078] La slntesis qulmica de polipeptidos es conocida en la tecnica, y procedimientos de slntesis de polipeptidos en fase solida se describen bien en las siguientes referencias: (Merrifield, J Amer Chem Soc 85: 21492154 (1963); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986); Wade y col., Biopolymers 25: S21-S37 (1986); Fields, Int J Polypeptide Prot Res 35: 161 (1990); MilliGen Report N° 2 y 2a, Millipore Corporation, Bedford, Mass., 1987)

15 Ausubel y col, supra, y Sambrook y col, supra. Tan y Kaiser (Biochemistry, 1977, 16: 1531-41) sintetizaron BPTI y un homologo hace dieciocho anos.

[0079] Tal como se conoce en la tecnica, dichos procedimientos implican bloquear o proteger grupos funcionales reactivos, tales como grupos amino, carboxilo y tio libres. Despues de la formacion del enlace

20 polipeptldico, los grupos protectores se eliminan. Por lo tanto, la adicion de cada residuo de aminoacido requiere varias etapas de reaccion para proteger y desproteger. Los procedimientos actuales utilizan slntesis en fase solida, en la que el aminoacido C-terminal esta enlazado covalentemente a partlculas de resina insolubles que pueden filtrarse. Los reactantes se eliminan lavando las partlculas de resina con disolventes apropiados usando una maquina automatizada. Diversos procedimientos, incluyendo el metodo “tBoc” y el metodo “Fmoc” son bien 25 conocidos en la tecnica. Vease, inter alia, Atherton y col., J Chem Soc Perkin Trans 1: 538-546 (1981) y Sheppard y col, Int J Polypeptide Prot Res 20: 451-454 (1982).

C. COMPOSICIONES

30 [0080] Se dan a conocer los componentes a usar para preparar las composiciones da a conocerdas, as!

como las propias composiciones a usar en los procedimientos da a conocerdos en el presente documento. Estos y otros materiales se dan a conocer en el presente documento, y se entiende que, cuando se dan a conocer combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc., de estos materiales que, aunque puede no da a conocerrse expllcitamente una referencia especlfica de cada diversas combinaciones individual y colectiva y 35 permutacion de estos compuestos, cada uno se contempla de forma especlfica y se describe en el presente documento. Por ejemplo, si una secuencia de aminoacidos particular se da a conocer y describe y una serie de modificaciones que pueden realizarse a una serie de lugares dentro de la secuencia pueden realizarse y describirse, se contemplan especlficamente todas y cada combinacion y permutacion del aminoacido y las modificaciones son posibles a menos que se indique especlficamente lo contrario. Por lo tanto, si se dan a conocer una clase de 40 moleculas A, B y C, as! como una clase de moleculas D, E y F y se da a conocer un ejemplo de una molecula de combinacion, A-D, entonces incluso aunque cada una no se mencione individualmente, cada una es contemplada individual y colectivamente lo que significa que las combinaciones, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se consideran da a conocerdas. Del mismo modo, cualquier subconjunto o combinacion de estas tambien se da a conocer. Por lo tanto, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se considerarla da a conocerdo. Este concepto se 45 aplica a todos los aspectos de esta solicitud incluyendo, aunque sin limitarse a, etapas en procedimientos de preparacion y de uso de las composiciones da a conocerdas. Por lo tanto, si existen diversas etapas adicionales que pueden realizarse se entiende que cada una de estas etapas adicionales puede realizarse con cualquier realizacion especlfica o combinacion de realizaciones de los procedimientos da a conocerdos.

50 [0081] En el presente documento se da a conocer: para referencia, un polipeptido que comprende la SEC ID

N° 1 (Dominio de Tipo Kunitz 1, o KD1). La SEC ID N° 1 se representa mediante la siguiente: DAAQEPTGNNAEICLLPLDY GPCRALLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRIEKVPKV.

[0082] Tambien se dan a conocer: para referencia, polipeptidos que comprenden la SEC ID N° 2 (en la que la 55 leucina en la posicion 17 tal como se ha numerado en BPTI se ha cambiado a arginina): DAAQEPTGNNAEICLL

PLDYGPCRARLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRIEKVPKV.

[0083] Tambien se da a conocer la SEC ID N° 3, que es un polipeptido mas corto que la SEC ID N° 1, y

tambien comprende el cambio en la posicion 17 (L17R): nAeICLLPLDYGPCRaR

LLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRIE.

[0084] Tambien se dan a conocer: para referenda, polipeptidos que comprenden la SEC ID N° 4 (en la que la leucina en la posicion 17 tal como se ha numerado en BPTI se ha cambiado a arginina y la alanina en la posicion 16

5 se ha cambiado a metionina): DAaQePTGNNAEIClLpLDYGPC

RMRLLRYYYDRYTQSCRQFLYGGCEGNANNFYTWEACDDACWRIEKVPKV.

[0085] Se ha descubierto que un cambio del aminoacido hidrofobo en la posicion 17 (leucina) a un aminoacido cargado tal como arginina o lisina, afecta a la actividad de anticoagulacion de KD1 sin reducir

10 significativamente la inhibicion de plasmina. Son particularmente utiles dichos polipeptidos mutantes donde la actividad de anticoagulacion es eliminada y la inhibicion de plasmina aumenta. Por lo tanto, la inclusion de un aminoacido cargado o polar en la posicion 17 se contempla especlficamente en el presente documento.

[0086] El polipeptido de SEC ID N° 1 para referencia tambien puede comprender una o mas mutaciones 15 adicionales. Tal como se da a conocer en el presente documento, una mutacion puede ser una adicion, delecion o

sustitucion de un aminoacido. Por ejemplo, ademas del cambio de leucina a arginina en la posicion 17, la secuencia de aminoacidos puede comprender tambien el cambio de arginina a lisina en la posicion 15, el cambio de alanina a metionina en la posicion 16, o ambos. Los ejemplos de otros cambios en la posicion 15 pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4.595.674.

20

[0087] Tambien se da a conocer en el presente documento un polipeptido que comprende la SEC ID N° 1, en la que tirosina se cambia a acido glutamico en la posicion 46. En otra realizacion, la tirosina puede cambiarse a treonina en la posicion 11. En otra realizacion, el acido aspartico puede cambiarse a tirosina o acido glutamico en la posicion 10. Estos polipeptidos tambien pueden comprender una o mas mutaciones adicionales, tales como aquellas

25 descritas anteriormente. Para resumir, los ejemplos de cambios de aminoacidos para la SEC ID N° 1 pueden encontrarse en la tabla 1. Estos son solamente ejemplos, y un experto en la materia entenderla que cualquiera de estas mutaciones podia usarse en solitario o en combinacion con las otras mutaciones enumeradas en el presente documento, o con otras no enumeradas, en cualquier permutacion o combinacion posible.

TABLA 1 - Mutaciones de la SEC ID N° 1

_______________R15K_______________

_______________L17R_______________

________________L17K_______________

_______________D10Y_______________

_______________D10E_______________

_______________Y11T_______________

_______________Y46E_______________

_______________A16G_______________

_______________A16M_______________

_______________A16S_______________

30

[0088] Tambien se dan a conocer composiciones y acidos nucleicos que corresponden a los polipeptidos

descritos en el presente documento. Una descripcion de acidos nucleicos, composiciones, y procedimientos de administracion se da a continuacion. Tambien se dan a conocer acidos nucleicos que codifican los polipeptidos da a conocerdos en el presente documento. En el presente documento se dan a conocer polipeptidos y sus acidos 35 nucleicos correspondientes. Se entiende que una manera de definir cualesquiera variantes y derivados conocidos o aquellos que podrlan surgir de los acidos nucleicos y protelnas da a conocerdos en el presente documento es mediante la definicion de las variantes y derivados en terminos de homologla con secuencias conocidas especlficas. Por ejemplo la SEC ID N° 1 describe una secuencia particular de KD1 y SEC ID N° 2 describe una secuencia particular de KD1 que contiene una mutacion. Un experto en la materia en el momento de la invention habrla 40 entendido que pueden producirse otras mutaciones tanto en el acido nucleico como en la protelna de tipo silvestre. Algunas mutaciones de los mismos que no afectarlan a su funcionalidad, mientras que otras pueden afectar a la funcionalidad de una manera positiva, y por lo tanto se seleccionan. Se dan a conocer especlficamente variantes de estos y otros genes y protelnas da a conocerdas en el presente documento que tienen al menos, el 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de 45 homologia con la secuencia indicada. Los expertos en la materia entienden facilmente como determinar la homologia de dos proteinas o acidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homologia puede calcularse despues de alinear las dos secuencias de modo que la homologia este en su nivel mas alto.

[0089] Otra manera de calcular la homologla puede realizarse mediante algoritmos publicados. El

alineamiento optimo de secuencias para compararlas puede realizarse mediante el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologla de 5 Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspeccion.

10 [0090] Los mismos tipos de homologla pueden obtenerse para acidos nucleicos por ejemplo mediante los

algoritmos da a conocerdos en Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 7706-7710, 1989, Jaeger y col. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989. Existen moleculas da a conocerdas en el presente documento que estan basadas en acidos nucleicos, incluyendo por ejemplo los acidos nucleicos que codifican, por ejemplo, kD1 as! como cualesquiera otras protelnas da a conocerdas en el presente 15 documento, as! como diversos acidos nucleicos funcionales. Los acidos nucleicos da a conocerdos se componen por ejemplo, de nucleotidos, analogos de nucleotidos, o sustitutos de nucleotidos. Los ejemplos no limitantes de estas y otras moleculas se describen en el presente documento. Se entiende que, por ejemplo, cuando un vector se expresa en una celula, el ARNm expresado estara tlpicamente compuesto por A, C, G y U.

20 [0091] Un nucleotido es una molecula que contiene un resto de base, un resto de azucar y un resto fosfato.

Los nucleos pueden estar unidos conjuntamente a traves de sus restos fosfato y restos de azucar creando un enlace internucleosldico. El resto de base de un nucleotido puede ser adenin-9-ilo (A), citosin-1-ilo (C), guanin-9-ilo (G), uracil-1-ilo (U) y timin-1-ilo (T). El resto de azucar de un nucleotido es una ribosa o una desoxirribosa. El resto fosfato de un nucleotido es fosfato pentavalente. Un ejemplo no limitante de un nucleotido serla 3'-AMP (3'-adenosln 25 monofosfato) o 5'-GMP (5'-guanosln monofosfato).

[0092] Un analogo de nucleotido es un nucleotido que contiene algun tipo de modificacion de los restos de base, azucar o fosfato. Las modificaciones a nucleotidos son bien conocidas en la tecnica e incluirlan por ejemplo, 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina y 2-aminoadenina, as! como modificaciones en los

30 restos azucar o fosfato.

[0093] Los sustitutos de nucleotidos son moleculas que tienen propiedades funcionales similares a nucleotidos, pero que no contienen un resto fosfato, tal como acido peptidonucleico (APN). Los sustitutos de nucleotidos son moleculas que reconoceran acidos nucleicos a la manera de Watson-Crick o Hoogsteen, pero que

35 estan enlazados juntos a traves de un resto diferente de un resto fosfato. Los sustitutos de nucleotidos son capaces de adaptarse a una estructura de tipo doble helice cuando interactuan con el acido nucleico diana apropiado. Tambien es posible enlazar otros tipos de moleculas (conjugados) a nucleotidos o analogos de nucleotidos para mejorar, por ejemplo, la captacion celular. Los conjugados pueden estar enlazados qulmicamente al nucleotido o analogos de nucleotidos. Dichos conjugados incluyen, aunque sin limitarse a, restos de llpidos tales como un resto 40 de colesterol. (Letsinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1989, 86, 6553-6556).

[0094] Una interaccion de Watson-Crick es al menos una interaccion con la cara de Watson-Crick de un

nucleotido, analogo de nucleotido o sustituto de nucleotido. La cara de Watson-Crick de un nucleotido, analogo de nucleotido o sustituto de nucleotido incluye las posiciones C2, N1 y C6 de un nucleotido, analogo de nucleotido o

45 sustituto de nucleotido a base de purina y las posiciones C2, N3, C4 de un nucleotido, analogo de nucleotido o

sustituto de nucleotido a base de pirimidina.

[0095] Una interaccion de Hoogsteen es la interaccion que tiene lugar en la cara de Hoogsteen de un nucleotido o analogo de nucleotido, que esta expuesto en el surco principal del ADN bicatenario. La cara de

50 Hoogsteen incluye la posicion N7 y grupos reactivos (NH2 u O) en la posicion C6 de nucleotidos purlnico.

[0096] Existen diversas secuencias relacionadas con, por ejemplo, KD1 y mutaciones del mismo, as! como cualquier otra protelna da a conocerda en el presente documento que se dan a conocer en el Genbank, y estas y otras secuencias se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad, as! como para

55 subsecuencias individuales contenidas en su interior.

[0097] En el presente documento se proporcionan diversas secuencias y estas y otras pueden encontrarse en el Genbank, en
www.pubmed.gov. Los expertos en la materia entienden como resolver discrepancias y diferencias de secuencias y ajustar las composiciones y procedimientos que relacionan una secuencia particular con

otras secuencias relacionadas. Pueden disenarse cebadores y/o sondas para cualquier secuencia, dada la informacion da a conocerda en el presente documento y conocida en la tecnica.

[0098] Se dan a conocer composiciones que incluyen cebadores y sondas, que son capaces de interactuar

5 con los genes da a conocerdos en el presente documento. En algunas realizaciones, los cebadores se usan para soportar reacciones de amplificacion de ADN. Tlpicamente, los cebadores seran capaces de extenderse de una manera especlfica de secuencia. La extension de un cebador de manera especlfica de secuencia incluye cualesquiera procedimientos en los que la secuencia y/o composicion de la molecula de acido nucleico con la que el cebador hibrida o se asocia de otra manera, dirige o influye en la composicion o secuencia del producto producido 10 por la extension del cebador. La extension del cebador de manera especlfica de secuencia incluye por lo tanto, aunque sin limitarse a, PCR, secuencia de ADN, extension de ADN, polimerizacion de ADN, transcripcion de ARN o transcripcion inversa. Se prefieren tecnicas y condiciones que amplifican al cebador de manera especlfica de secuencia. En algunas realizaciones, los cebadores se usan para las reacciones de amplificacion de ADN, tales como PCR o secuenciacion directa. Se entiende que, en algunas realizaciones, los cebadores tambien pueden 15 extenderse usando tecnicas no enzimaticas, donde por ejemplo, los nucleotidos u oligonucleotidos usados para extender el cebador se modifican de modo que reaccionaran qulmicamente para extender el cebador de manera especlfica de secuencia. Tlpicamente, los cebadores da a conocerdos hibridan con el acido nucleico o la region del acido nucleico o hibridan con el complemento del acido nucleico o el complemento de una region de acido nucleico.

20 [0099] En el presente documento se dan a conocer procedimientos de tratamiento de un sujeto que

comprenden administrar al sujeto que lo necesita un acido nucleico. Por ejemplo, en el presente documento se dan a conocer procedimientos de administracion de un acido nucleico que codifica un mutante de KD1, tales como los da a conocerdos en el presente documento. Estos procedimientos incluyen la administracion y captacion de ADN exogeno en las celulas de un sujeto (es decir, transduccion o transfeccion de genes). Los acidos nucleicos da a 25 conocerdos pueden estar en forma de ADN o ARN desnudo, o los acidos nucleicos pueden estar en un vector para administrar los acidos nucleicos a las celulas, con lo que el fragmento de ADN que codifica el anticuerpo esta bajo la regulacion transcripcional de un promotor, tal como entenderla bien un experto en la materia. El vector puede ser una preparation disponible en el mercado, tal como un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada). La administracion del acido nucleico o vector a celulas puede ser mediante diversos mecanismos. 30 Como un ejemplo, la administracion puede ser mediante un liposoma, usando preparaciones de liposomas disponibles en el mercado tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-bRl, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), as! como otros liposomas desarrollados segun procedimientos convencionales en la tecnica. Ademas, el acido nucleico o vector da a conocerdo puede administrarse in vivo mediante electroporation, cuya tecnologla esta disponible de 35 Genetronics, Inc. (San Diego, CA) as! como por medio de una maquina SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).

[0100] Como un ejemplo, la administracion del vector puede ser mediante un sistema viral, tal como un vector retroviral que puede empaquetar un genoma retroviral recombinante (vease por ejemplo, Pastan y col., Proc. Natl.

40 Acad. Sci. Estados Unidos 85: 4486, 1988; Miller y col., Mol. Cell. Biol. 6: 2895, 1986). El retrovirus recombinante puede usarse a continuation para infectar y, de este modo, administrar a las celulas infectadas acido nucleico que codifica un anticuerpo ampliamente neutralizante (o fragmento activo del mismo). El procedimiento exacto de introduction del acido nucleico alterado en celulas de mamlfero no esta, por supuesto, limitado al uso de vectores retrovirales. Otras tecnicas estan ampliamente disponibles para este procedimiento, incluyendo el uso de vectores 45 adenovirales (Mitani y col., Hum. Gene Ther. 5: 941-948, 1994), vectores virales adenoasociados (AAV) (Goodman y col., Blood 84: 1492-1500, 1994), vectores lentivirales (Naidini y col., Science 272: 263-267, 1996), vectores retrovirales pseudotipados (Agrawal y col., Exper. Hematol. 24: 738-747, 1996). Tambien pueden usarse tecnicas de transduccion flsica, tales como administracion de liposomas y mecanismos de endocitosis mediados por receptores y otros (vease, por ejemplo, Schwartzenberger y col., Blood 87: 472-478, 1996). Estas composiciones y 50 procedimientos da a conocerdos pueden usarse junto con cualquiera de estos u otros procedimientos de transferencia de genes usados habitualmente.

[0101] Como un ejemplo, si el acido nucleico que codifica un anticuerpo es administrado a las celulas de un sujeto en un vector de adenovirus, la dosificacion para administracion de adenovirus a seres humanos puede variar

55 de aproximadamente 107 a 109 unidades formadoras de placas (pfu) por inyeccion pero puede ser de hasta 1012 pfu por inyeccion (Crystal, Hum. Gene Ther. 8: 985-1001, 1997; Alvarez y Curiel, Hum. Gene Ther. 8: 597-613, 1997). Un sujeto puede recibir una unica inyeccion o, si son necesarias tecnicas adicionales, pueden repetirse a intervalos de seis meses (u otros intervalos de tiempo apropiados, segun lo determinado por el facultativo experto) durante un periodo indefinido y/o hasta que la eficacia del tratamiento se ha establecido.

[0102] La administracion parenteral del acido nucleico o vector, si se usa, se caracteriza generalmente por inyeccion. Pueden prepararse inyectables de formas convencionales, como soluciones o suspensiones llquidas, formas solidas adecuadas para solucion o suspension en llquido antes de la inyeccion o como emulsiones. Una

5 estrategia revisada mas recientemente para administracion parenteral implica el uso de un sistema de liberacion lenta o liberacion sostenida, de modo que se mantenga una dosificacion constante. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 3.610.795. Para descripcion adicional de formulaciones adecuadas y diversas vlas de administracion de compuestos terapeuticos, vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995.

10

[0103] Tal como se describe en el presente documento, existen numerosas variantes de la protelna KD1 que se conocen y se contemplan en el presente documento. Especlficamente, se dan a conocer mutaciones de KD1 que son preferibles en vista del tipo silvestre, tales como la SEC ID N° 2. Ademas de las variantes de KD1 funcionales da a conocerdas en el presente documento, existen derivados de la protelna KD1 que tambien funcionan con los da a

15 conocerdos en el presente documento, y se contemplan en el presente documento. Las variantes y derivados de protelnas son bien entendidas por los expertos en la materia y pueden implicar modificaciones de la secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoacidos tlpicamente estan en una o mas de tres clases: variantes por sustitucion, insercion o delecion. Las inserciones incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo as! como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoacidos individuales o multiples. Las inserciones 20 habitualmente seran inserciones mas pequenas que las de fusiones de los extremos amino o carboxilo, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Los derivados de protelnas de fusion inmunogenos, tales como los descritos en los ejemplos, se preparan fusionando un polipeptido suficientemente grande para otorgar inmunogenicidad a la secuencia diana mediante reticulacion in vitro o mediante cultivo celular recombinante transformado con ADN que codifica la fusion. Las deleciones se caracterizan por la eliminacion de uno o mas residuos de aminoacidos de la 25 secuencia proteica. Tlpicamente, no mas de aproximadamente de 2 a 6 residuos se delecionan en cualquier sitio dentro de la molecula proteica. Estas variantes habitualmente se preparan mediante mutagenesis especlfica de sitio de nucleotidos en el ADN que codifica la protelna, produciendo de este modo ADN que codifica la variante, y seguidamente expresando el ADN en el cultivo de celulas recombinantes. Las tecnicas para realizar mutaciones por sustitucion en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida se conocen bien, por ejemplo 30 mutagenesis por cebador M13 y mutagenesis por PCR. Las sustituciones de aminoacidos son tlpicamente de residuos individuales, pero pueden producirse en una serie de diferentes ubicaciones al mismo tiempo; las inserciones seran habitualmente del orden de aproximadamente de 1 a 10 restos de aminoacidos; y las deleciones variaran aproximadamente de 1 a 30 residuos. Las deleciones o inserciones preferentemente se realizan en pares adyacentes, es decir una delecion de 2 residuos o la insercion de 2 residuos. Pueden combinarse sustituciones, 35 deleciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas para llegar a una construccion final. Las mutaciones no deben colocar a la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearan regiones complementarias que podrlan producir estructura de ARNm secundario. Las variantes por sustitucion son aquellas en las que al menos un residuo se ha eliminado y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Dichas sustituciones generalmente se realizan de acuerdo con la siguiente tabla y se denominan como sustituciones conservativas.

40

TABLA 2: Sustituciones de aminoacidos

Sustituciones conservativas ejemplares del residuo original, otras se conocen en la tecnica.

Ala; ser

Arg; lys, gln

Asn; gln; his

Asp; glu

Cys; ser

Glu; asn, lys

Glu; asp

Gly; pro

His; asn; gln

Ile; leu; val

Leu; ile; val

Lys; arg; gln

Met; leu; ile

Phe; met; leu; tyr

Ser; thr

Thr; ser

Trp; tyr

Tyr; trp; phe

Val; ile; leu

5 [0104] Se realizan cambios sustanciales en la funcion o la identidad inmunologica seleccionando

sustituciones que son menos conservativas que las de la tabla 2, es decir, seleccionando residuos que difieren de forma mas significativa en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptldica en la zona de la sustitucion, por ejemplo como una conformacion en lamina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que 10 produzcan los mayores cambios en las propiedades de la protelna seran aquellas en las que (a) un residuo hidrofilo, por ejemplo serilo o treonilo, sustituye a (o es sustituido por) un residuo hidrofobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistelna o prolina sustituye a (o es sustituida por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, sustituye a (o es sustituido por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral 15 voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye a (o es sustituido por) uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina, en este caso, (e) aumentando el numero de sitios para sulfatacion y/o glucosilacion. Por ejemplo, la sustitucion de un residuo de aminoacido por otro que es biologica y/o qulmicamente similar es conocida por los expertos en la materia como una sustitucion conservativa. Por ejemplo, una sustitucion conservativa serla sustituir un residuo hidrofobo por otro, o un residuo polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por 20 ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Dichas variaciones sustituidas de forma conservativa de cada secuencia da a conocerda de forma expllcita estan incluidas en los polipeptidos de mosaico proporcionados en el presente documento.

[0105] La mutagenesis por sustitucion o por delecion puede emplearse para insertar sitios para IN-

25 glucosilacion (Asn-X-Thr/Ser) u O-glucosilacion (Ser o Thr). Las deleciones de cistelna u otros residuos labiles tambien pueden ser deseables. Las deleciones o sustituciones de potenciales sitios de proteolisis, por ejemplo Arg, se consiguen, por ejemplo, delecionando uno de los residuos basicos o sustituyendo uno por residuos glutaminilo o histidilo.

30 [0106] Algunas derivaciones postraduccionales son el resultado de la accion de celulas huesped

recombinantes sobre el polipeptido expresado. Residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados de forma postraduccional a los residuos glutamilo y asparilo correspondientes. Como alternativa, estos residuos se desamidan en condiciones levemente acidas. Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, mutilacion de los 35 grupos o-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pags. 79-86 [1983]), acetilacion de la amina N-terminal y, en algunos casos, amidacion del carboxilo C-terminal.

[0107] Se entiende que una manera de definir las variantes y derivados de las protelnas da a conocerdas en el presente documento es mediante la definicion de las variantes y derivados en terminos de homologla/identidad con respecto a secuencias conocidas especlficas. Por ejemplo, la SEC ID N° 1 describe una secuencia particular de KD1, y la SEC ID N° 2 describe una secuencia particular de un mutante del mismo. Se dan a conocer

5 especlficamente variantes de estas y otras protelnas da a conocerdas en el presente documento que tienen al menos el 70% o el 75% o el 80% o el 85% o el 90% o el 95% de homologla con la secuencia indicada. Los expertos en la materia entienden facilmente como determinar la homologla de dos protelnas. Por ejemplo, la homologla puede calcularse despues de alinear las dos secuencias de modo que la homologla este en su nivel mas alto. Otra manera de calcular la homologla puede realizarse mediante algoritmos publicados. El alineamiento optimo de 10 secuencias para comparacion puede realizarse mediante el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologla de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 15 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspection.

[0108] Los mismos tipos de homologla pueden obtenerse para acidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos da a conocerdos en Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 7706-7710, 1989, Jaeger y col. Methods Enzymol. 183: 281-306, 1989.

20

[0109] Se entiende que la description de mutaciones conservativas y homologla pueden combinarse conjuntamente en cualquier combination, tal como realizaciones que tienen al menos el 70% de homologla con respecto a una secuencia particular en la que las variantes son mutaciones conservativas.

25 [0110] Dado que esta memoria descriptiva describe diversas protelnas y secuencias de protelna, se entiende

que los acidos nucleicos que pueden codificar estas secuencias de protelna tambien se dan a conocer. Esto incluirla todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de protelna especlfica, es decir todos los acidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de protelna particular, as! como todos los acidos nucleicos, incluyendo acidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y derivados de las secuencias de 30 protelna da a conocerdas. Por lo tanto, aunque cada secuencia de acido nucleico particular puede no estar escrita en el presente documento, se entiende que todas y cada secuencia son, de hecho, da a conocerdas y descritas en el presente documento a traves de la secuencia de protelna da a conocerda. Tambien se entiende que, aunque ninguna secuencia de aminoacidos indica que secuencia de ADN particular codifica esa protelna dentro de un organismo, donde variantes particulares de una protelna da a conocerda estan da a conocerdas en el presente 35 documento, la secuencia de acido nucleico conocida que codifica esa protelna en la region particular de la que surge esa protelna tambien es conocida y se da a conocer y describe en el presente documento.

[0111] Se entiende que existen numerosos analogos de aminoacidos y peptldicos que pueden incorporarse en las composiciones da a conocerdas. Por ejemplo, existen numerosos D-aminoacidos o aminoacidos que tienen

40 un sustituyente funcional diferente de los mostrados en la tabla 2. Los estereoisomeros opuestos de peptidos de origen natural se dan a conocer, as! como los estereoisomeros de analogos peptldicos. Estos aminoacidos pueden incorporarse facilmente en las cadenas polipeptldicas cargando moleculas de ARNt con el aminoacido de election y manipulando construcciones geneticas que utilizan, por ejemplo, codones ambar, para insertar el aminoacido analogo en una cadena peptldica de una manera especlfica del sitio. Vease, por ejemplo, (Thorson y col., Methods 45 in Molec. Biol. 77: 43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3: 348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13: 197-216 (1995), Cahill y col., TIBS, 14(10): 400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12: 158-163 (1994); Ibba y Hennecke, Bio/technology, 12: 678-682 (1994)

[0112] Pueden producirse moleculas que recuerdan a peptidos, pero que no estan conectadas mediante un 50 enlace peptldico natural. Por ejemplo, los enlaces para aminoacidos o analogos de aminoacidos pueden incluir

CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (cis y trans), -COCH2 -,-CH(OH)CH2-, y -CHH2SO- (Estos y otros pueden encontrarse en Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pag. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), Vol. 1, Numero 3, Peptide Backbone Modifications (revision general); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pags. 463-468; 55 Hudson, D. y col., Int J Pept Prot Res 14: 177-185 (1979) (--CH2NH-, CH2CH2--); Spatola y col. Life Sci 38: 12431249 (1986) (--CH H2--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH--, cis y trans); Almquist y col. J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (1980) (-COCH2--); Jennings-White y col. Tetrahedron Lett 23: 2533 (1982) (-- COCH2--); Szelke y col. Solicitud Europea, EP 45665 CA (1982): 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2--); Holladay y col. Tetrahedron. Lett 24: 4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2-); y Hruby Life Sci 31: 189-199 (1982) (--CH2-S-). Un enlace

no peptldico particularmente preferido es --CH2NH-. Se entiende que los analogos peptldicos pueden tener mas de un atomo entre los atomos enlazados, tales como b-alanina, acido g-aminobutlrico, y similares.

[0113] Los analogos de aminoacidos y analogos y analogos peptldicos a menudo tienen propiedades 5 mejoradas o deseables, tales como, produccion mas economica, mayor estabilidad qulmica, propiedades

farmacologicas mejoradas (semi-vida, absorcion, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biologicas), antigenicidad reducida, y otros.

[0114] Pueden usarse D-aminoacidos para generar peptidos mas estables, dado que los D aminoacidos no 10 son reconocidos por peptidasas como tales. La sustitucion sistematica de uno o mas aminoacidos de una secuencia

consenso por un D-aminoacido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar peptidos mas estables. Pueden usarse residuos de cistelna para ciclar o unir dos o mas peptidos conjuntamente. Esto puede ser beneficioso para limitar peptidos a conformaciones particulares. (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)).

15

[0115] Se dan a conocer procedimientos de preparacion de un organismo transgenico que comprenden administrar los acidos nucleicos, vectores y/o celulas da a conocerdos.

[0116] La presente invencion se describe mas particularmente en los siguientes ejemplos, que pretenden ser 20 ilustrativos solamente, dado que numerosas modificaciones y variaciones en su interior seran evidentes para los

expertos en la materia.

[0117] Aunque el presente proceso se ha descrito en referencia a detalles especlficos de ciertas realizaciones del mismo, no se pretende que dichos detalles deban considerarse limitaciones sobre el alcance de la

25 invencion excepto en cuanto a la medida en que esten incluidos en las reivindicaciones adjuntas.

[0118] Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgacion y descripcion completas de como se preparan y evaluan los compuestos, composiciones, artlculos, dispositivos y/o procedimientos reivindicados en el presente documento, y se pretende que sean puramente ejemplares de la

30 invencion y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precision con respecto a los numeros (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura es en °C o es a temperatura ambiente, y la presion esta en o cerca de la presion atmosferica.

35

D. EJEMPLOS

1. Ejemplo 1

40 [0119] Materiales y procedimientos: El sustrato cromogeno H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida (S-2251) se

adquirio de DiaPharma Group Inc. (West Chester, OH). La plasmina humana se adquirio de Enzyme research laborotories. La aprotinina bovina (BPTI) se uso de Zymogenetics. La cepa de Escherichia coli BL21(DE3)pLys y el vector de expresion pET28a eran productos de Novagen Inc. (Madison, WI). El kit de mutagenesis dirigida QuikChange® se obtuvo de Stratagene (La Jolla, CA).

45

[0120] Expresion y purificacion de protelnas de tipo silvestre y mutantes. El primer dominio inhibidor de proteinasa de tipo Kunitz de TFPI-2 humano (KD1) se clono en el vector pET28a que contenla una etiqueta de His. Los mutantes se obtuvieron mediante mutagenesis dirigida. Las protelnas se sobreexpresaron como protelnas de fusion etiquetadas con His N-terminal en la cepa de E. coli BL21 (DE3) pLys S. usando el sistema promotor T7. Las

50 protelnas sobreexpresadas se recuperaron como cuerpos de inclusion y las protelnas se plegaron y se purificaron para liberarlas de la etiqueta de His (27). Las concentraciones se determinaron mediante espectroscopla UV.

[0121] Ensayos de inhibicion de plasmina. Se realizaron ensayos de inhibicion de plasmina incubando plasmina con diversas concentraciones de preparaciones de inhibidor (BPTI, KD1 de tipo silvestre, mutantes de KD1

55 R24K, L26R o R24K/L26R) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 que contenlan NaCl 100 mM, 0,1 mg/ml de BSA, CaCl2 5 mM durante 1 h a 37°C en una placa de microvaloracion de 96 pocillos. El sustrato cromogeno S-2251 se anadio a continuacion, y la actividad del aminoacido residual se midio en un lector de microplacas cinetico UVmax de Molecular Devices con diferentes valores extremos (0,5 y 1 h) y concentraciones de S2251 (0,5 y 1 mM). Los datos de inhibicion de plasmina se analizaron de acuerdo con la expresion de union cuadratica.

[0122] En experimentos de control, en primer lugar se estudio si habla cualquier desplazamiento, inducido por el sustrato, de inhibidor unido aumentando las concentraciones de sustrato. Tanto BPTI (figura 2) como KD1 de tipo silvestre (figura 3) se ensayaron y los resultados muestran que, aparentemente, no hay ningun desplazamiento

5 de inhibidor unido aumentando las concentraciones de sustrato. Tambien se ensayo si un tiempo de incubacion de inhibidor con plasmina aumentado darla o no como resultado una inhibicion mejorada. Este no era el caso (figura 2 y figura 3). Estos resultados validan los resultados presentados en la figura 4. Los resultados obtenidos a partir de los estudios de inhibicion de plasmina muestran que el R15K/L17R mutante es un potente inhibidor de plasmina e inhibe la plasmina con muchas veces mas fuerza que el KD 1 de tipo silvestre o el mutante R24K (figura 4). Se obtuvieron

10 valores de Ki* (constante inhibidora) de 22 nM para el tipo silvestre, 10 nM para R15K, 6 nM para L26R y 3 nM para el R15K/L17R. Por lo tanto el cambio de L17R es muy importante. El cambio de L17R se realizo en base a modelado molecular. El mutante R15K/L17R se une de forma mucho mas fuerte a plasmina que el KD1 de tipo silvestre (7 veces) o el mutante R15K (~2 veces). Los mutantes L17R se unen a plasmina con aproximadamente 4 veces mas fuerza que el KD1 de tipo silvestre. Por lo tanto, L26R o R15K/L17R pueden sustituir a BPTI en terapeutica cllnica.

15

2. Ejemplo 2: Abolicion de la actividad inhibidora de la coagulacion intrfnseca del dominio Kunitz 1 (KD1) de TFPI-2

[0123]

20 Informacion sobre nomenclatura

R24 (tambien conocido como R15) es P1 A25 (tambien conocido como A16) es P1'

L26 (tambien conocido como L17) es P2'

25 [0124] TFPI-2 inhibe la coagulacion intrlnseca presumiblemente mediante la inhibicion del factor XIa

(Petersen y col. Biochemistry. 9 de enero de 1996; 35(1): 266-272). Como todas las serina proteasas, el factor XIa escinde entre los residuos P1-P1' a TRAE o TRVV (P2-P1-P1'-P2'). Por lo tanto, KD1 de tipo silvestre que tiene Leu (residuo hidrofobo como Val) en la posicion P2' debe inhibir el factor XIa. Por lo tanto el cambio de Leu a Arg en la posicion P2' debe reducir/suprimir esta inhibicion.

30

[0125] Un procedimiento habitual para ensayar la inhibicion de la coagulacion es examinar el aPTT (tiempo

de tromboplastina parcial activada) del plasma normal. En este ensayo, se mezclo activador superficial mas fosfollpido con plasma normal a cantidades iguales (75 microlitros). Se anadieron diez microlitros de tampon que contenla inhibidor (KD1 de tipo silvestre, KD1 L26R o BPTI) y la muestra se incubo durante cinco minutos a 37°C. A

35 continuation se anadieron setenta y cinco microlitros de CaCl2 25 mM precalentado a 37°C y se anoto el tiempo necesario para formar el coagulo. Los datos se muestran en la figura 5. En el sistema de aPTT, la coagulacion se inicia mediante la activation del factor XII a Factor XIIa mediante fase de contacto que implica el sistema de calicrelna. El Factor XIIa activa a continuacion el factor XI a factor XIa en la cascada de coagulacion.

40 [0126] El BPTI inhibe la calicrelna mientras que KD1 de tipo silvestre inhibe tanto la calicrelna como al factor

XIa (Petersen y col 1996). Esto puede dar como resultado la prolongation del aPTT mediante BPTI y KD1 de tipo silvestre mientras que se espera que el mutante L26R de KD1 no inhiba ninguna, tal como se indica mediante ninguna inhibicion (prolongacion) de aPTT (figura 5). Esta observation hace del L26R KD1 un inhibidor especlfico de plasmina. Esto tambien aumenta su potencia inhibidora tambien hacia la plasmina. Por lo tanto, L26R KD1 no tiene

45 ningun efecto sobre la coagulacion y es un inhibidor mas potente que el kD1 de tipo silvestre.

[0127] La protelna mutante L26R pierde actividad como anticoagulante y se vuelve especlfica como agente antifibrinolllito. Por lo tanto, el mutante es mas activo como agente antifibrinolltico pero ademas ya no es un anticoagulante. Esta propiedad le hace util para prevenir hemorragias.

50

3. Ejemplo 3: Datos de inhibicion de plasmina de raton

[0128] Tanto KD1 de tipo silvestre como L26R inhiblan la plasmina de raton de forma eficaz. Esto se muestra en la figura 6. Claramente el KD1 de tipo silvestre y el mutante L26R son bastante eficaces para inhibir la plasmina

55 de raton con un valor de Kd aparente de ~80 nM. La inhibicion completa se obtuvo a 1 pM tanto para KD1 de tipo silvestre como L26R (Masci y col. Blood Coagulation and Fibrinolysis 2000, Vol 11, N°. 4, paginas 385-393). Dado que tanto el tipo silvestre como el mutante inhiben la plasmina de raton, puede usarse el mutante para mostrar eficacia in vivo en un modelo animal de hemorragia.

[0129] Se ha descrito un modelo de hemorragia de la vena caudal de raton para estudiar la eficacia de un inhibidor de plasmina de serpiente (Masci y col; Blood Coagulation and Fibrinolysis 2000, Vol 11, paginas 385-393). Usando este modelo de hemorragia de la vena caudal de raton, comparado con control de solucion salina, se observo una reduccion del 67-70% de la perdida de sangre donde la Aprotinina, KD1 de tipo silvestre o el mutante

5 L26R se administro por via intravenosa a aproximadamente 100 microgramos/raton. Las dosis de los inhibidores de plasmina usadas en estos experimentos eran similares a la usada durante cirugla de CPB (derivation cardiopulmonar) humana, ajustadas al peso del raton. El Comite de Etica Animal de UCLA aprobo todos los experimentos con ratones y la dosis usada en cirugla humana ajustada al peso del raton era una base realista para estos estudios iniciales. Los noveles de BUN/Creatinina en suero eran normales despues de dos dlas y siete dlas 10 despues de la administration del farmaco. El examen microscopico de tejidos no revelo ningun dano a organos fundamentales tales como el rinon, el corazon y el cerebro. El KD1 de tipo silvestre y el KD1 L26R reduclan la perdida de sangre de forma casi tan eficaz como la Aprotinina. Sin embargo, esto se espera, dado que la dosis usada puede ser lo suficientemente alta para no observar diferencias entre los diferentes inhibidores (aprotinina, KD1 de tipo silvestre o el mutante L26R). Ademas, el KD1 L26R humano podia tener una mejor eficacia en seres 15 humanos dado que inhibe la plasmina humana de forma mas selectiva y no inhibe la coagulation.

REFERENCIAS

[0130]

20

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REALIZACIONES

35

[0131]

1. Un polipeptido que comprende la SEC ID NO: 1 con una o mas mutaciones de aminoacidos, en el que la primera mutacion comprende una sustitucion de leucina a arginina o lisina en la posicion 17, utilizando el sistema de

40 numeracion BPTI.

2. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que el polipeptido comprende una segunda mutacion, en el que la segunda mutacion comprende una sustitucion de tirosina a acido glutamico en la posicion 46.

3. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que el polipeptido comprende una segunda mutacion, en el que la segunda mutacion comprende una sustitucion de tirosina a treonina en la posicion 11.

45 4. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que el polipeptido comprende una segunda mutacion, en el que la segunda mutacion comprende una sustitucion de acido aspartico a tirosina en la posicion 10.

5. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que el polipeptido comprende una segunda mutacion, en el que la segunda mutacion comprende una sustitucion de acido aspartico a acido glutamico en la posicion 10.

6. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que el polipeptido comprende una segunda mutacion, en el que la 50 segunda mutacion comprende una sustitucion de alanina a metionina, glicina o serina en la posicion 16.

7. El polipeptido, segun el parrafo 1, en el que las mutaciones de aminoacidos comprenden una o mas mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitucion de tirosina a acido glutamico en la posicion 46, una sustitucion de tirosina a treonina en la posicion 11, una sustitucion de alanina a metionina, glicina o serina en la posicion 16, y una sustitucion de acido aspartico a tirosina o acido glutamico en la posicion 10.

55 8. Una composicion que comprende el polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-7.

9. Un acido nucleico que codifica el polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-7.

10. Un procedimiento de inhibicion de al menos una actividad de plasmina que comprende poner en contacto la plasmina con una cantidad eficaz del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-7.

11. Un procedimiento de tratamiento de un sujeto con necesidad de inhibicion de una actividad de plasmina, que

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipeptido KD1 que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 92% de identidad con la SEC ID NO: 3, en la que, utilizando el sistema de numeracion BPTI:

   5 (i) el aminoacido en el residuo 17 es un residuo de aminoacido cargado o polar; y

   (ii) el polipeptido inhibe una actividad de plasmina y presenta una menor actividad contra la coagulacion en comparacion con un polipeptido KD1 de tipo silvestre.
2. 2. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que el aminoacido en el residuo 17 se selecciona del grupo que 10 consiste en arginina y lisina.
3. 3. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que

   (i) el residuo 18 es una leucina;

   (ii) el residuo 19 es una leucina;

   15 (iii) el residuo 31 es una arginina; y (iv) el residuo 34 es una leucina.
4. 4. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, que se selecciona entre:

   (i) el polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 93% de 20 identidad con la SEC ID NO: 3,

   (ii) el polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 94% de identidad con la SEC ID NO: 3,

   (iii) el polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 95% de identidad con la SEC ID NO: 3, y

   25 (iv) el polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 96% de identidad con la SEC ID NO: 3.
5. 5. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 97% de identidad con la SEC ID NO: 3; o en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 98% de identidad con la

   30 SEC ID NO: 3; o en el que la secuencia de aminoacidos tiene al menos un 99% de identidad con la SEC ID NO: 3.
6. 6. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de aminoacidos comprende la SEC ID NO: 3.
7. 7. Polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, en el que:

   35 (i) el residuo 17 de la SEC ID NO: 3 es un residuo de arginina;

   (ii) el polipeptido KD1, segun la reivindicacion 1, comprende ademas una sustitucion de tirosina a treonina en la posicion 11;

   (iii) el residuo 18 de la SEC ID NO: 3 es un residuo de leucina;

   (iv) el residuo 19 de la SEC ID NO: 3 es un residuo de leucina;

   40 (v) el residuo 31 es un residuo de arginina; y

   (vi) el residuo 34 es un residuo de leucina.
8. 8. Polipeptido KD1, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en combinacion con un ligando de receptor especlfico de un tipo de celula unido al polipeptido.

   45
9. 9. Composicion que comprende el polipeptido KD1, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
10. 10. Acido nucleico que codifica el polipeptido KD1, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

    50 11. Animal transgenico no humano que comprende el acido nucleico segun la reivindicacion 10.
11. 12. Composicion para utilizar en el tratamiento de un sujeto con necesidad de inhibicion de una actividad de plasmina que se selecciona entre (a) una composicion que comprende una cantidad eficaz del acido nucleico, segun la reivindicacion 10, y (b) una composicion que comprende una cantidad eficaz del polipeptido, segun cualquiera de

    55 las reivindicaciones 1-7.
12. 13. Composicion para utilizar, segun la reivindicacion 12, en la que el sujeto presenta una afeccion seleccionada entre angiogenesis; tumorigenesis; hemofilia; artritis reumatoide; remodelacion osea; hemofilia o slndrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS); esta sometido a cirugla ortopedica o esta sometido a un injerto de

    derivation de la arteria coronaria (CABG).
13. 14. Composition, segun la reivindicacion 9, o composition para utilizar, segun la reivindicacion 12 o 13, en las que el polipeptido presenta una menor actividad contra la coagulation en comparacion con el dominio Kunitz de tipo

    5 silvestre de TFPI-2.
14. 15. Procedimiento de inhibicion de al menos una actividad de plasmina que comprende poner en contacto la plasmina in vitro con una cantidad eficaz del polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7; en el que preferiblemente el inhibidor de plasmina presenta una menor actividad contra la coagulacion en comparacion con el

    10 dominio Kunitz de tipo silvestre de TFPI-2.