JP2009521225A - invitro胚中心 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2005年12月21日に提出された米国仮特許出願第60/752,034号(参照により本明細書中にその全体が援用される)の利益を主張している。
・免疫グロブリン(Ig)のクラススイッチ、
・迅速なB細胞増殖(GC暗帯)、
・記憶B細胞の産生、
・抗原特異的なT細胞及びB細胞の選択集団の蓄積、
・超変異、
・高親和性レセプターを有する体細胞突然変異B細胞の選択、
・低親和性B細胞のアポトーシス、
・親和性成熟、
・二次抗体応答の誘導、及び
・高親和性抗体を有する血清免疫グロブリンG(IgG)の調節。
・マイトジェンでB細胞増殖を刺激すること(これは抗原(Ag)によっても実証され得る)、
・抗体の産生、例えば再生抗体応答を促進すること、
・B細胞を引き付けるケモカイン及び或る特定の集団のT細胞を産生すること、及び
・B細胞のアポトーシスを遮断すること
に関与することが示される。
培養組織構築物、並びに
培養組織構築物内に包埋されるか、又はその上に固定される少なくとも1つの三次元人工胚中心であって、
濾胞樹状細胞、
B細胞、及び
T細胞
を含む、少なくとも1つの三次元人工胚中心
を含む、動物被験体に投与せずに、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び潜在的ワクチン剤の評価を可能にする人工免疫システムに関する。
・B細胞のアポトーシスを遮断し(Schwarz et al. (1999) J. Immunol 163, 6442-6447; Qin et al. (1999) J. Immunol. Methods 226, 19-27)、
・ICで刺激したB細胞のITIM(免疫受容体チロシン系抑制モチーフ)シグナル伝達を遮断し(Aydar et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34, 98-107)、
・抗原又はマイトジェンで刺激したB細胞増殖を促進し(Burton et al.(1993) J. Immunol. 150, 31-38)、
・再生応答を促進し(Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-367)、
・IgMを産生するようにバージンB細胞を誘導し、IgGへのクラススイッチを促進し(Kraal et al. (1982) Nature 298, 377-379; Liu et al. (1996) Immunity 4, 241-250; Aydar et al. (2005) J. Immunol. 174, 5358-5366)、
・体細胞超変異及び高親和性抗体の発生を促進する(Aydar et al (2005) J. Immunol. 174, 5358-5366)
ことができる。これらは、体液性免疫応答の重要な特性である。
樹状細胞(DC)は最も強力な抗原提示細胞(APC)の1つであり、一次免疫応答においてナイーブT細胞を刺激する能力がある細胞株で唯一知られているものである。末梢血単球は、in vitroでのDC生成のための前駆細胞の確かな供給源として広く認知されている。このような単球由来のDC(mo−DC)は、in vivoのDCで見出される全表現型及び抗原提示能を有する(posses)。
動物及び免疫
正常な8〜12週齢のC57BL/6マウスをNational Cancer Institute(Frederick, MD)又はThe Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入することができる。マウスは、上部にフィルターを備えた標準的なプラスチック製のケージに入れ、特定の病原体無含有状態を維持した。食餌及び水は自由に与えることができる。CGG(ニワトリγグロブリン)初期刺激T細胞が、20μgのCGG(Pel-Freez Biologicals, Rogers, Arkansas)で免疫後に得られ、約5×108個の熱殺菌した百日咳菌が、これまでに記載されたように(5、28)硫酸アルミニウムカリウム(A7167、Sigma)中に析出した。約50μgのCGGの腹腔内注射、並びに約5μgのCGGの前肢及び後足蹠への皮下注射の2週間後、追加免疫(booster immunization)を行った。
抗体及び試薬
マウスCD45R(B220)マイクロビーズ、マウスCD90(Thy1.2)マイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、及びMACS LSカラムは、Miltenyi Biotec GmbH(Auburn, CA)から購入することができる。ビオチン標識化ラット抗マウスκは、Zymed(San Francisco, CA)から購入することができる。アルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗マウスIgG(H+L)、及びアルカリホスファターゼ標識化ヤギ抗マウスIgMは、例えばKirkegaard & Perry Laboratories(Gaithersburg, MD)から購入することができる。抗マウスFDC(FDC−M1)及び抗マウスCD21/CD35は、例えばPharmingen (San Diego, CA)から購入することができる。NIP19−OVA(1つのOVA当たり19個のNIP基を有する4−ヒドロキシ−3−ヨード(ioda)−5−ニトロフェニルアセチルオボアルブミン)、NIP5−OVA(1つのOVA当たり5つのNIP基を有する)、及びNP30−CGGは、例えばBiosearch Technologies(Novata, CA)から得ることができる。ラット抗マウスCD40は、例えばSouthern Biotechnology Associates, Incから得ることができる。low−tox−mウサギ補体は、例えばCedarlane Laboratories Limited(Westbury, NY)から購入することができ、熱不活性化は、56℃で約30分間、水浴で補体をインキュベートすることによって達成された。NP−CGG抗CGGのICは、1ng/mlのNP−CGGから6ng/mLのマウス抗CGGとの最終比で37℃で2時間、抗原及び抗体をインキュベートすることによって調製した。抗CGGは、1mg/mlを上回る抗CGGのIgGレベルで高度免疫マウスから得られた。或る特定の実験では、2時間のインキュベート中、12倍希釈でlow−tox−mウサギ補体を用いて補体担持(complement-bearing)ICを作製した。抗CD21/35は、Pierce(Rockford, IL)のImmunoPure F(ab’)2精製キット(カタログ番号44888)を用いて、F(ab’)2断片に変換した。抗CD23(クローンB3B4)は、Dr. Daniel Conradによって与えられた。
FDC単離
FDCは、これまでに記載されたように(5、28)、正常で若年成体マウスのリンパ節(腋窩リンパ節、外側腋窩リンパ節、鼠径リンパ節、膝窩リンパ節、腸間膜リンパ節、及び大動脈周囲リンパ節)から単離した。簡潔には、FDC単離の1日前に、マウスの全身を放射線に曝し、ほとんどのT細胞及びB細胞を排除した(137Csソースを用いて、1000rad)(Kosco et al. (1992) J. Immunol. 148, 2331-2339)。リンパ節を回収し、2つの26ゲージ針を用いてそれぞれのリンパ節カプセルを開いた。それから、リンパ節を、20mMのHepes、2mMのグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、及びMEM非必須アミノ酸(GIBCO)を補充した1mlのコラゲナーゼD(16mg/mL、C−1088882、Roche)、0.5mLのDNaseI(5000単位/mL、D−4527、Sigma)、及び0.5mLのDMEMから成る酵素カクテルに入れた。CO2インキュベータ中で37℃で30分後、培地及び放出細胞を取り出し、20%のFCSと共に5mLのDMEMを含有する15mL容の円錐形の遠心管に移し、氷上に置いた。新たな一定分量の酵素混合物中で残存組織をさらに(second)30分消化して、細胞をこれまで通り回収した。単離細胞を洗浄した後、氷上で45分間、ラット抗マウスFDC特異的抗体(FDC−M1)とインキュベートした。細胞を洗浄し、氷上で45分間、κ軽鎖に特異的なビオチン化抗ラットIg 1μgとインキュベートした。それから、細胞を360μLのMACS緩衝液に加えた40μLの抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と氷上で15〜20分間インキュベートした。予め1mlのMACS緩衝液で湿らせたMACS LSカラム上に細胞を堆積させ、10mLの氷冷MACS緩衝液で洗浄した。LSカラムをVarioMACSから取り出し、結合細胞を10mLのMACS緩衝液で放出させた。これらの細胞の約85〜95%が、FDC表現型、FDC−M1+、CD40+、CR1&2+、及びFcγRII+を発現した(Sukumar et al.,非公開)。ヒトFDCは、これまでに記載されるように、FDC特異的mAb HJ2による正の選択を用いて単離することができる(Fakher et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 176-185)。
AID(活性化誘導性シチジンデアミナーゼ)の分析のための細胞培養物
リンパ球(約4×106個)は、5%のCO2雰囲気下で37℃で約2日間、48ウェル培養プレート(CoStar; Cambridge, MA)において約1.6×106個のFDCと共培養した。ウェルは、約1mL/ウェルの完全培地(10%のFCS、20mMのHepes、2mMのグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、及びMEM非必須アミノ酸を補充したDMEM)を含有していた。10ng/mLのLPS(L−2387、Sigma)又は100ng/mLの抗CD40+10ng/mLのIL−4(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて、リンパ球を刺激した。FDC共刺激活性が準最適(Sub-optimal)濃度の一次シグナルで最も明らかであったので、準最適レベルのLPS、抗CD40+IL−4を用いた。FDCの影響はより高濃度の一次シグナルでも明らかなままであったが、その差はより小さく、研究するのがより難しかった。48時間後、細胞を回収し、トリゾール(Invitrogen)を用いて溶解して、全RNAを製造業者のプロトコルに従い抽出した。幾つかの実験では、72時間、FDCの存在下又は非存在下で、λ+B細胞及びCGG初回刺激T細胞及びNP−CGG+抗CGG免疫複合体を培養した。72時間の終わりに、抗B220マイクロビーズ及びMACSシステムを用いて、B細胞を単離した。トリゾールを用いて、約2×106個のB細胞から全RNAを抽出した。
定量逆転写酵素PCR分析
AID(活性化誘導性シチジンデアミナーゼ)に対するmRNAレベルを、定量逆転写酵素PCR(qRT PCR)を用いて測定した。18s rRNAレベルを内部対照として用いて、AIDの発現レベルを正規化した。透明な光学品質のシールテープ(Bio-Rad)で覆った96ウェル薄壁PCRプレートでPCR反応を行った。以下の条件下で、ワンステップRT−PCRキット(Applied Biosystems)を用いて増幅を行った:48℃で30分間(cDNA合成)、95℃で10分間の最初の変性、その後の95℃で15秒間の変性、そして60℃で1分間のアニーリング/伸長工程の組合せを40サイクル。iCycler iQソフトウェア(BioRad)を用いてデータ解析を行った。最終的に、ΔΔCT法(Livak & Schmittgen (2001) Methods 25, 402-408)を用いて、mRNA発現レベルの差を算出した。PCR効率は、mRNAの連続希釈を用いて複数の標準曲線を作成することによって、100%近くまで求められた。蛍光シグナルが任意の閾値を超える(cross)PCRサイクルの数として定義される増幅サイクルの閾値(CT値)は、それぞれの反応において算出された。mRNA発現レベル間のホールド変化は以下のように求めた:ホールド変化=2−ΔΔCT(式中、ΔΔCT=(CT Gol−CT Hk)サンプル−(CT Gol−CT Hk)対照(CT=サイクル閾値、Gol=対象の遺伝子、及びHk=ハウスキーピング遺伝子)。
ナイーブB細胞の調製
完全培地(10%のFCS、20mMのHepes、2mMのグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、及びMEM非必須アミノ酸を補充したDMEM)において2つの滅菌スライドの曇り端(frosted ends)の間でナイーブマウス由来のリンパ節をグラインドすることによって、単一の細胞懸濁液を調製した。懸濁細胞を遠心分離し(5分、1000rpm、4℃)、完全培地で再懸濁した。抗B220担持マイクロビーズを用いて、κ+λ陽性B細胞(全B細胞)が正に選択された。簡潔には、リンパ球は、氷上で15〜20分間、40μLの抗B220マイクロビーズ(MACS緩衝液中で10倍希釈)とインキュベートした。1mlのMACS緩衝液で予め湿らせたMACS LSカラム上に細胞を積層させ、10mLの氷冷MACS緩衝液で洗浄した。LSカラムをVarioMACSから取り出し、10mLのMACS緩衝液によって結合した細胞を放出させ、洗浄して、κ+λ陽性B細胞として用いた。C57BL/6マウスの抗NP抗体は主にλ軽鎖を有し(Jack et al. (1977) Eur. J. Immunol. 7, 559-565; Reth et al. (1978) Eur. J. Immunol. 8, 393-400)、本発明者等は、λ陽性ナイーブB細胞が培養下で豊富であった場合、NP応答が高められると結論付けた。λ陽性ナイーブB細胞を得るために、本発明者等は、氷上で45分間、10μgのκ軽鎖特異的ビオチン化ラット抗マウスmAbを用いて、κ陽性B細胞を取り除き、抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)でMACSカラム上にκ陽性B細胞を捕捉した。本発明者等は、通過液中のB220陽性細胞がλ鎖を発現し、この細胞が上記のように抗B220を用いて単離したと結論付けた。ナイーブB細胞が膜IgMを発現し、本発明者等のナイーブB細胞集団におけるIgMの存在をフローサイトメトリによって確認した。正常なマウス由来のリンパ節細胞の単細胞懸濁液は、FITC B220、PE結合抗マウスIgM、及びビオチン標識化ラット抗マウスλで三重標識化した。この結果によって、本発明者等のB細胞の約95%がλ軽鎖よりもむしろκ軽鎖を発現したことが示された。しかし、λ軽鎖を発現した細胞の98%近くがIgM陽性であり、これはナイーブ状態のB細胞であると予測される。これらのドナーマウスの血清抗NIPレベルは測定するのに低く(1ng/mL未満)、またナイーブ特性のNIP特異的B細胞を支持した。同じアプローチを用いて、ナイーブヒトB細胞をPBLから得ることができ、マーカーはIgM陽性及びCD19陽性である。
CGG初回刺激T細胞の単離
CGG追加免疫後1週間以上、CGG免疫マウスのリンパ節を排出することによってCGG初回刺激リンパ球が得られた。リンパ節は外科的に取り除かれ、2つの滅菌スライドの曇り端間でグラインドした。細胞を洗浄し、氷上で約45分間40μLのマウス抗CD90(Thy1.2)マイクロビーズ(MACS緩衝液中10倍希釈)とインキュベートし、それから1mlのMACS緩衝液で予め湿らせたMACS LSカラム上に堆積させ、約10mLの氷冷MACS緩衝液で洗浄した。LSカラムをVarioMACSから取り出し、上記のように結合した細胞を回収した。血清陽性ヒト由来のTT(破傷風トキソイド)初回刺激T細胞を抗CD2で得ることができる。
in vitroでのGC反応及び抗NIP抗体応答
48ウェル培養プレート(CoStar; Cambridge, MA)において、ナイーブλ陽性B細胞(約10×105細胞数/mL)、FDC(約4×105細胞数/mL)、及びCGG初回刺激T細胞(約5×105細胞数/mL)を、NP−CGG+抗CGG IC(1つのウェル当たり100ngのNP−CGG)と共培養することによって、in vitroでのGC反応を起こさせた。このウェルは、1mL/ウェルの完全培地(10%のFCS、20mMのHepes、2mMのグルタミン、50μg/mLのゲンタマイシン、及びMEM非必須アミノ酸を補充したDMEM)を含んでいた。ICをNP−CGG及び抗CGG血清を用いて調製し、リンパ球を刺激するのに用いた。培養物を5%のCO2雰囲気下、37℃でインキュベートした。上清液を7日及び14日で回収し、固相ELISAを用いて、NIP特異的な低親和性及び高親和性のIgM抗体及びIgG抗体に対して分析した。それぞれの実験群を三連で構成した。
抗NIP及び親和性に対するELISA
異なる比率でNIPと結合するOVA、それぞれNIP19−OVA及びNIP5−OVAによるELISAを用いて、抗NIP抗体の相対的親和性を求めた。NIPは、NPよりも抗NP抗体に対する親和性が高く、この理由からNIPを用いた(44、45)。簡潔には、4℃で一晩、PBS中で平底96ウェルELISAプレート(Falcon; Becton Dickinson, CA)を100μg/mLのNIP5−OVA又はNIP19−OVAで覆った。0.1%のTween20を含有する1×PBSで三回プレートを洗浄した後、プレートをBSAで遮断した(5%、2時間、室温)。それから、応答が低いウェルに対して2倍希釈から始めて、培養物由来の上清液をプレートに加え、4℃で一晩インキュベートした。マウスのIgM又はIgGに特異的なアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗体を加え、一晩インキュベートした。pNPPホスファターゼ基質キット(Kirkegaard & Perry Laboratories, MD)を用いて、アルカリホスファターゼ活性を視覚化し、最適密度を450nmで求めた。プレートを100μg/mLの親和性精製ヤギ抗マウスのIgM又はIgG(Sigma, Saint Louis, MO)とインキュベートすることによって、IgM又はIgGに対する標準曲線を定めた。それから、プレートを洗浄し、100ng/mLから始まる2倍希釈のマウスのIgM又はIgG(Sigma)とインキュベートし、このプレートを4℃で一晩インキュベートした。標準曲線をそれぞれのプレートで作成し、直線用量範囲で標準曲線と比較することによって、抗NIPのIgM抗体又はIgG抗体の濃度を算出した。抗体の相対的親和性が、NIP19−OVAを用いる抗体のレベルによって示され、高い親和性の抗NIPだけを示すNIP5−OVAに対して高親和性及び低親和性の両方の抗NIPを測定する。
統計分析
ELISA読みの分析に対して、t検定(両側分布)を用いた。幾つかの実験では、最大5つの異なる比較を行い、複数の比較でp値が0.01未満である必要があった。Livak & Schmittgen(2001)(Methods 25, 402-408)で記載した2−ΔΔCT法を用いて、リアルタイム定量PCR結果を分析した。
組織化学的手法
「光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルでの免疫細胞化学におけるモノクローナル抗体の使用(Use of monoclonal antibodies in immunocytochemistry at the light and electron microscopic levels)」と題された章(Szakal et al. (1986)「モノクローナル抗体:ハイブリドーマ技法(Monoclonal Antibodies: Hybridoma Techniques)」 L. B. Schook, ed. Marcel Dekker, Inc, New York, pp. 229-263)は、これらを詳細に記載している。ビオチン化プローブが、HRPアビジンの使用を可能にさせ、光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルの両方の研究を可能にする。
in vitroのGCに関する研究。in vitroのGCにおけるNIP特異的なIgM応答の促進
抗原特異的なB細胞の刺激及びクラススイッチがGCで行われ、FDCは、IgM応答及びIgクラススイッチを高めることができる。これを評価するために、本発明者等はナイーブのIgM発現B細胞を単離し、産生IgMからIgGへの切り替えが容易にモニタリングすることができる。正常なマウス由来のλ軽鎖発現B細胞(λ B細胞)、CGG免疫マウス由来の担体初回刺激T細胞(CGG−T細胞)、正常なマウス由来のFDC、及びNP−CGG−抗CGGから成るICを用いて、NIP特異的な抗体応答をin vitroのGCで開始した。一晩のインキュベート後、FDCリンパ球クラスタが見られ、これはKosco et al (1992)(J. Immunol. 148, 2331-2339)によって記載されたものと類似しており、これらのクラスタは14日の培養を通して存在した。ナイーブB細胞は最初にIgMを産生し、図2Aで示されるように(4番目の白いバー)、この組合せの免疫原及び細胞を用いて、7日までに120ngを超えるIgM抗NIPが蓄積したと考えられる。
免疫グロブリンクラススイッチ及びin vitroでのGCにおけるNIP特異的IgG応答
NIP特異的IgMに関して図2で記載されたのと同じ培養下で、IgG抗NIP応答を試験した。λ B細胞、CGG初回刺激T細胞、FDC、及びNP−CGG−抗CGGのICに対する必要性は最適IgG産生に対するものと同じであり、IgMに対しても同様であることは明らかであった(図3Aの3番目の白いバー及び3番目の黒いバー)。図3Aの1週目に蓄積した抗NIPのIgGは、図2Aの抗NIPのIgMレベルの約半分であった(約120ng/mLのIgMに対して約60ng/mLのIgG)。しかし、これらの関係は2週目で、わずか約20ng/mLのIgMに対して約140ng/mLを超えるIgGになり逆転した(図2A対図3Aにおける黒いバー)。したがって、産生したIgアイソタイプは、1週目では主にIgMから2週目では主にIgGへ切り替わった。
in vitroでの親和性成熟の検出及びFDC−ICの重要性
NIP−5を用いて高親和性抗体を検出したとき、IgMに対してIgGの量が明らかに多かった。興味深いことに、1週目で産生されたわずか約30〜50%のIgGが高親和性であった(NIP−5対NIP−19)。しかし、2週目で産出されたほとんど全てのIgGが高親和性であった(図3B)。これは、高親和性B細胞の選択、及び親和性成熟に関連した高親和性IgGを産生するためのこれらの細胞の選択刺激に一致している。さらに、抗原がFDCによって捕捉及びB細胞に提示されるIC形態であった場合にのみ親和性成熟が見られた。BCRに効率的に関与する遊離抗原(NP−CGG)は低親和性のIgGを刺激するが(図3Aの1番目の黒いバー及び4番目の黒いバー)、検出可能なレベルの高親和性IgGは刺激しなかった(図3B)。FDCの非存在下において、ICはITIM活性をもたらすBCR及びFcγRII、SHIPリン酸化及び応答性の欠乏に関与する。Ig−FCをFDC上の高レベルのFcgRIIで捕捉することによって、B細胞上のFcgRIIの関与が最小になり、生産的IgG応答を容易にする(Aydar et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34, 98-107; Aydar et al (2003) J. Immunol. 171 , 5975-5987)。したがって、生産的IgG応答に対してB細胞を刺激することができるICのみがFDCによって捕捉されると考えられる。
FDCのCD21−CD21リガンドのIgM応答及びクラススイッチに対する相互作用の重要性の計測(Gauging)
B細胞のコレセプター複合体(CD21/CD19/CD81)におけるFDC−CD21リガンドとCD21との間の相互作用は、FDC関連抗原が最適な再生応答を刺激するのに重要である(Tew et al. (2001) Trends Immunol. 22, 361-36; Qin et al. (1998) J. Immunol 161, 4549-4554)。また、CD21/CD19ノックアウトマウスのIgM応答が抑制される(Chen et al. (2000) Immunol. Rev. 176, 194-204)。したがって、FDC−CD21リガンド−CD21の相互作用を介してB細胞に伝達される遮断シグナルは、IgM産生及びクラススイッチを阻害し得る。本発明者等の結果によって、抗CD21が、クラススイッチの低減と一致してIgM応答を阻害し、IgG応答が2週目のピークで劇的に低減した(90%超)ことが示された。抗CD21で処理した培養下に存在するB細胞の数が、アイソタイプ対照を有するB細胞の数よりも有意に低くなかったので、IgG応答の低下は、CD21リガンド−CD21の相互作用の非存在下におけるB細胞の喪失に単純には起因しなかった。本発明者等は、無処理のIgG結合B細胞−CD21のFc部分がB細胞−FcγRIIと結合し、ITIMを活性化して、これにより抗CD21との抗体応答の低減を説明することができる可能性についても考慮している。しかし、抗CD21がレセプターを単純に遮断する場合、抗CD21のF(ab’)2が無傷抗体と同様に作用する必要があり、そうであることが証明された。
AID発現及びFDCの存在
AIDは、クラススイッチに重要であり、GC−B細胞及びin vitroでクラススイッチ再結合を受けるB細胞で発現される(Muramatsu et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 18470-18476; Muramatsu et al. (2000) Cell 102, 553-563; Faili et al. (2002) Nat. Immunol. 3, 815-821)。FDCは、GC−B細胞によってAID発現を調節するのを助けることができ、本発明者等はこれを調べようとした。B細胞の大部分がこれらのポリクローナルB細胞活性化因子で刺激される場合、AIDのmRNAの発現は、LPS、又はIL−4+抗CD40で刺激したリンパ球で検出することができる。FDCとのB細胞の共刺激がAIDのmRNAを増幅し得る。定量RT−PCRを用いて、AIDのmRNAのレベルを求めた。準最適な量のLPS(10ng)、IL−4(10ng)、及び抗CD40(100ng)を用いて、リンパ球における低レベルのAIDを刺激した。FDC由来のmRNAが全ての培養下で一定になるように、共刺激を与える開始時、又は培養の終了時のいずれかでFDCを加えた。正常なリンパ球におけるAIDのmRNAレベルを1倍とし、LPS、又はIL−4+抗CD40処理単独、或いはFDCの存在下での効果を比較した。RT−PCRによる分析によって、LPSがリンパ球集団のAIDを約8倍、及びFDCを約2倍増加させたことが示された。しかし、LPSとFDCとの組合せは相乗作用があり、AIDのmRNA発現は約130倍増大した。IL−4+抗CD40による結果は同様であった。FDCによるAIDのmRNAレベルが約3倍、及びIL−4+抗CD40によるAIDのmRNAレベルが約18倍であったのに対し、IL−4+抗CD40とFDCとの組合せは、約180倍のAIDのmRNAレベルの上昇をもたらした。
AID発現及びクラススイッチにおけるCD21−CD21リガンドの相互作用の関与
CD21リガンド−CD21の相互作用が遮断された際に見られたクラススイッチの低減によって、FDC−CD21リガンドと、B細胞−CD21との間の相互作用がコレセプター複合体を通って伝わり、AIDの発現の調節を助けることが示唆された。これを調べるために、抗CD21/35を用いて、FDC−CD21リガンド−B細胞−CD21の相互作用を妨げ、AID発現レベルを約90%低減し、このことはこの相互作用が働いていることを示した。
AID応答のFDC媒介性増大に対するIC及びCD21リガンドの重要性
本発明者等は、最適な高親和性抗体応答を促進するために、ICがFDCの能力に寄与するか否かを判定しようとした。促進されるクラススイッチ及び親和性成熟におけるFDC−ICの重要性を考慮して、本発明者等は、IC及びCD21リガンド−CD21の相互作用が、NP−CGGシステムにおけるAID発現のFDC媒介性増大に重要であったか否かを判定しようとした。NP−CGGに対して応答するB細胞が少数なので、AID調節の研究はより困難になる。しかし、72時間の培養後のRNA精製に約2×106個の精製B細胞を用いた場合、AIDのmRNAのFDC媒介性増大を検出することが可能であった。NP−CGG抗CGGのICは増大を刺激したが、NP−CGGは検出可能な増大を刺激することはできなかった。さらに、抗CD21/35は、ポリクローナル活性因子で刺激したB細胞の研究で見られたものと同じ様式で抗原刺激応答を阻害した。
in vitroのCGにおける体細胞超変異
in vitroのGCにおける体細胞超変異を調べるために、本発明者等はPCRを用いて、抗NPを作製するためにマウスで用いられるVH186.2遺伝子を増幅した。PCR産物を電気泳動ゲルから切り取り、抽出して、クローン化した後に、複数のクローンをシークエンシングした。20個の読み取り可能な配列のうち7つの配列がVh186.2生殖系列と相同性であり、VH186クローンと呼ばれた。この配列は、VH186.2生殖系列コード遺伝子に対してアラインしている。突然変異は置換ヌクレオチドで示される。図10で示されるように、かなりの突然変異が、体細胞超変異と一致して可変遺伝子で起こった。これらの突然変異はCDR配列でより高頻度であった(図11)。突然変異の分析によって、以下のことが明らかになった:
・平均41個の突然変異(32〜45個の範囲)が、シークエンシングされたVH186遺伝子(306ヌクレオチド)1つ当たりで見られた。これはin vivoのGCの研究で得られた結果と一致して高いものである。
・ほとんどの突然変異は、1つの欠失を有する点突然変異であった。これは、in vivoの胚中心及び体細胞超変異に特有でもある。
・1つを除く全ての突然変異がCDRにおける置換突然変異であった一方で、フレームワーク領域におけるサイレント突然変異に対する置換の比率はほぼ1:1であり、両方とも強い選択圧を示した。
・トランスバージョンによる転移の優位性が見られた。
・本発明者等は、シークエンシングされた全てのCγ領域において1つだけ突然変異を認め、PCR増幅の忠実性(fidelity)に対する内部対照を与えた。
FDCによって分泌されるケモカインであるCXCL13はヒトのB細胞及びT細胞を濾胞帯に引き付けることが示されている(Estes et al. (2004) J. Immunol. 173, 6169-6178)。他の実施形態では、このケモカイン又はその受容体CXCR5の遮断は、B細胞及びT細胞がFDC豊富域に移動するのを阻害し得る。さらに、GCのB細胞が活性化され、特有の表現型、PNA+、GL−7+、CD95hi及びCD23loを発現し、B細胞が中心細胞である場合は明帯に、B細胞が胚中心細胞である場合は暗帯に分かれる。他の実施形態では、これらの特性はリンパ節濾胞のin vitroモデルに存在し得る。
他の実施形態において、FDC、B細胞、又はT細胞の精製調製物は、例えばセルロースベースのマイクロキャリア、コラーゲンクッション及びリンパ節細胞外材料を含むETC中に包埋させることができる。これは、固まる前に細胞をETC懸濁液に加えること、又は懸濁液をETCに直接注入することによって行うことができる。これらの細胞をマトリクス中で平衡化することができ、それから視覚化され、それが2週間にわたって続く可能性がある。ヒトのB細胞及びT細胞は、抗14、抗CD19、抗CD3、及び抗CD56を用いる負の選択によって、健常なドナーの末梢血から単離し、不要な細胞を取り除くことができる。マウスのB細胞及びT細胞はリンパ節から得て、これまでに記載されたように、正の選択によって精製することができる。
FDCは、MHC又は種の制限なしでB細胞を共培養することができ、本発明の実施形態では、FDCは、これまでに記載されたようにFDC特異的mAb HJ2を用いて、ナイーブのマウス又は若年患者から外科的に取り除いたヒトの甲状腺のリンパ節から単離することができる(Fakher et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 176-185)。
他の実施形態において、FDCを組み込む場合、「in situゼリー化(jellification)」、「注射」、「クッション−ビーズ組合せ」、加えて小クッションとの組合せ、全ての細胞型に対する単一クッション、及びクッションの貫通等の様々な手法を一般的なLTEアーキテクチャに用いることができる。他の実施形態では、ETCとしては、例えばコラーゲンクッション、セルロースベースのマイクロキャリア、合成及び他の天然の生体材料、及び/又はリンパ節細胞外材料が挙げられ得る。
さらなる実施形態において、FDC、T細胞、及びB細胞は同じETCではあるが、異なる位置に配置することができる。まずFDCがETC内に入り、ETCと接着することが可能になり、それからT細胞及びB細胞が近くに配置され得る。リンパ球がFDCに引き付けられ、FDCの周りで集合化し、in vitroでGCを形成することができる。本発明者等は、CD3選択T細胞及び陰性選択B細胞は、ケモカインの非存在下でコラーゲンクッションにおける低い細胞運動性を示すことを認めている。FDC及び関連のケモカインの存在が、リンパ球の自然の運動性を増大させる可能性がある。
さらに他の実施形態において、FDC、T細胞、及びB細胞は、単一のETCに配置され、クラスタ化を視覚化するか、又は別々のETCに配置され、リンパ節のT細胞域及びB細胞域を刺激することができる。正規の顕微鏡解析に加えて、細胞をクッションで蛍光標識して、共焦点顕微鏡によって視覚化することができる。さらに、他の実施形態では、破傷風トキソイド(TT)免疫した人々から単離したBリンパ球及びTリンパ球は、FDC含有ETCで共培養し、さらにTT−抗TTのICで刺激することができ、抗原特異的GCに対するモデルとして有用である。
FDCは、B細胞及び濾胞Tヘルパー細胞の両方に対する化学誘引物質として作用するケモカインCXCL13を分泌し、これらの細胞をGCに補充する(54)。他の実施形態では、B細胞及びT細胞をFDC含有ETCに加え、CXCL13、又はそのレセプターであるCXCR5に対する中和抗体の存在下又は非存在下で、例えばLPS又はConAを用いて刺激することができる。他の実施形態では、CXCL13ノックアウトマウス由来のFDCを用いることができる。他の実施形態では、抗CD21抗体、抗ICAM−1抗体、抗VCAM抗体、及び抗BAFF抗体をこれらの培養物に別々に加え、FDC−B細胞−T細胞クラスタの形成におけるこれらの表面分子の重要性を調べることができる。これまでの研究によって、培養ウェル中のFDC周辺のB細胞のクラスタ化におけるこれらの分子の役割が示されている。
FDCが抗原を備えている場合のGC及び包括的なB細胞の特徴
一次抗原チャレンジ後、約6〜8日でGCが形成され、特有のGCのB細胞表現型(PNA+、GL−7+、CD95hi、CD23lo)を発現する迅速分裂B細胞から成る暗帯に隣接して存在する明帯におけるICが施されたFDC及び補体断片の存在によって検出される。これらのGCのB細胞は、特異的抗原に応答するB細胞であり、クラススイッチ及び体細胞超変異を受け、高親和性のIgG抗体を生成させる。
他の実施形態において、TT免疫した個体から単離したB細胞及びT細胞をコラーゲンクッション含有FDCで培養し、TT−抗TTのICで刺激することができる。培養の約10日後、B細胞を回収し、標識化して、フローサイトメトリによってPNA、GL−7、CD95及びCD23の表面発現に対して分析することができる。これらの濾胞形態の詳細な分析は、共焦点顕微鏡を用いて行うこともできる。
さらに別の実施形態において、抗原免疫した個体から単離したB細胞及びT細胞をコラーゲンクッション含有FDCで培養し、抗原−抗抗原(antigen-anti antigen)のICで刺激することができる。培養の約10日後、B細胞を回収し、標識化して、フローサイトメトリによってPNA、GL−7、CD95及びCD23の表面発現に対して分析することができる。これらの濾胞形態の詳細な分析は、共焦点顕微鏡を用いて行うこともできる。
本発明者等がin vitroで研究している二次元クラスタにおいて、GC又はT細胞周辺にマントル領域を形成し、集合し、別個のユニットを形成するB細胞は見られなかった。しかし、二次元配置は細網繊維、又は細胞の配列を助ける他の構造を有していない。本発明の他の実施形態では、ETCを用いて、T細胞及びB細胞がGC周辺で分離され、別々の領域を形成するような状態を提供することができる。GC周辺の細胞は、T細胞特異的抗体及びB細胞特異的抗体を用いて調べることができる。GCのB細胞がIgDを発現しないが、マントル帯のB細胞がIgDを発現するので、抗IgDによる標識化が有益である可能性もある。
リンパ組織が消化され、細胞を従来の組織培養物に入れる場合、これらは濾胞組織を失い、組織を壊し二次元状態を維持する。本発明の実施形態では、FDCをこのような培養物に加え、FDC−B細胞−T細胞クラスタを形成することができる。本発明者等は、このようなin vitroのGCにおける免疫グロブリンのクラススイッチ、体細胞超変異、及び親和性成熟を実証している。
本発明の実施形態において、濾胞白血球を天然又は合成されたETCマトリクス中に入れることができ、FDCを固定することができ、T細胞及びB細胞をFDC周辺に配置し、濾胞のin vivo環境面を再生させることができる。ETCに好適な材料としては、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、細胞外マトリクス(ECM)、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜、PLGA、ヒドロゲル、反転性コロイド結晶マトリクス、マイクロキャリア、及びコラーゲンで覆われたプレートが挙げられる。本発明の他の実施形態では、ETCマトリクスは存在せず、T細胞、B細胞及びFDCが標準的な二次元ウェルで単純に培養される。
本発明の他の実施形態において、機能的なLTE含有FDC、及び確定した又は未確定のT細胞帯及びB細胞帯を用いて、ワクチンを評価することができる。FDCを用いて、T細胞帯及びB細胞帯を確定するのを助けることができ、これらの細胞帯を予め形成させる必要はない。同様に、別の実施形態では、T細胞帯及びB細胞帯は必要ではない。一次免疫応答では、統合されたin vitroワクチン接種部位から初回刺激を受けた単球由来の樹状細胞を用いることができ、モデル抗原、例えば再生応答のための破傷風及び一次応答におけるモデルを検証するためのインフルエンザを用いることができ、同様に他の抗原、免疫原及び/又はアレルゲンを用いることができる。
マウス細胞を用いた実験において、本発明者等は二次元培養物における機能的なin vitroのGCに対する証拠が提示される。具体的には、ナイーブλ陽性B細胞、FDC、NP−CGG(トリγグロブリン)+抗CGGのIC、及びCGG初回刺激T細胞を共培養することによって、マウスGCをin vitroで作製した。これによって、FDC−リンパ球クラスタ及び抗NIPのIgM及びIgGの産生がもたらされた。
本発明の実施形態において、AISで統合することができる三次元培養組織構築物におけるヒト細胞系が構築される。in vivo状態であれば、FDCはコラーゲン繊維と接着することができ、GCが三次元で発生することができる足場を提供する。マウスシステムで認められたNIP特異的なIgM及びIgGの産生、クラススイッチ、体細胞超変異及び親和性成熟は、二次元のin vitroでのGCを用いたこれまでの研究の結果と比較することができる。
本発明の実施形態において、TT特異的な記憶T細胞がほとんどの人々に豊富に存在するので、ヒトGCはキャリアとして破傷風トキソイド(TT)を用いて確立することができる。他の実施形態では、NP破傷風トキソイドを用いて、GCを作製することができる。それから、抗NP産生によって、高親和性抗体及び低親和性抗体の両方の産生を単純に測定でき、親和性成熟を調べることが可能になるので、抗NP産生を調べることができる。他の実施形態では、ナイーブヒトT細胞をin vitroで初回刺激し、それからそれを用いて、T細胞の補助をin vitroのGCに与えることができる。培養物、又はCGGで刺激したin vitroワクチン接種部位(VS)細胞のいずれかからの単球由来のDCを用いて、ナイーブヒトT細胞をCGGで初回刺激することができる。それから、このような初回刺激T細胞は、CGG−NPを有するマウスシステムに用いたのと同じ方法に用いることができる。
FDCはin vivoで細網繊維と接着し、濾胞内で固定した網目構造である。リンパ球は再循環するが、FDCは静止したままである。しかし、in vivoでこの状態のFDCは成熟している。ラットの尾のコラーゲンから作製されたコラーゲンクッションが確立された。FDCが接着し、コラーゲン上にクラスタを配置した。
in vitroのLTEに免疫複合体が包含されていることは、完全に分化した記憶B細胞の生成に重要である。本発明の実施形態では、2段階のLTEが用いられる。第1段階において、ナイーブ抗原特異的B細胞が刺激され、T細胞に依存して抗体を産生する。FDCに合わせてこの構築物から導かれた免疫複合体及び記憶T細胞はシグナルを与え、第2のLTE構築物で完全に分化するようにナイーブB細胞の新たなバッチを誘発した。
本実施例において、LPSをB細胞に加え、シグナルを提供した後、FDCを加え、共刺激シグナルを提供して、実験を行った。次に抗体産生が試験された。本発明者等は2週間細胞を追跡した。培養培地を1週目の終わりに回収し、タイターは1日目〜7日目まで抗体合成を示す。培地を交換し、上清液を14日目に回収した。これらのタイターは7日目〜14日目まで抗体合成を示す。FDCは、予測通り潜在的共刺激活性を有していたが、7日目ではコラーゲンと接着するFDCと、プラスチックプレート上に浮かぶFDCとの間の抗体産生に差はなかった。しかし、14日目では、コラーゲンに接着したFDCは、プラスチックプレート上に浮かぶFDCと比較すると、抗体産生を促進する活性が約3倍であった。2週目のIgG 応答は1週目より低かったが、これは迅速に応答し、そして迅速に減衰するLPS刺激細胞に特有のものである。対して、抗原刺激細胞は典型的に、2週目にIgG産生がピークに達する。これらの結果は、コラーゲン上にFDCを置くことによって、生物学的活性が高まることを示している。
図12は、新たに単離したFDCを示す。モノクローナル抗体であるFDC−M1を用いて、正の選択前に典型的なプロセスで幾つかのFDCを見出すことができる。しかし、正の選択後、ほとんどのプロセスは残らない(図13、図14、図15)。
本発明者等は、in vitroでヒトIgGの一次応答を誘導しようと、また抗体が低濃度で機能することができるような親和性を有する高品質抗体を生成しようとした。オボアルブミン(OVA)を例示的な抗原として用い、用いた遮断ドナーはOVA血清反応が陰性であった。T細胞を単球由来のDCで初回刺激した。単球(約1×107個)をIL−4(約1000U/mL)及びGM−CSF(約800U/mL)で培養し、未成熟DCを生成した。5日後、OVA(1μg/mL)を加え、抗原を処理し、LPS(1μg/mL)を加え、DC成熟を刺激した。8日後、OVA初回刺激のために、約20×106個のCD4+T細胞を加えた。マウス実験において5日間(実験1)及び10日間(実験2)、ヘルパーT細胞に対する初回刺激及び成熟を続けた。この初回刺激期間後、T細胞及びDCを、実験1ではナイーブB細胞(約15×106個)、並びに実験2では約10×106個のナイーブB細胞に混合した。OVA(約5μg)+マウス抗OVA(約30μg)を複合体化して、OVAのICを生成し、実験1では、細胞及びICを放射線照射マウスの首の後ろに注射し、実験2では、in vitroでICを約3×106個の新たに単離したFDCと共に入れた。このようにして、本発明者等は、実験1において14日目で約30ng/mLの抗OVAを得た。
全マウスIgGが、IC及び補体の有り又は無しで、マウスリンパ球及びLPSとインキュベート後のコラーゲンI型ビーズ上で新たなマウスFDCによって産生された。本実施例では、本発明者等は、FDCがコラーゲン上で網目構造を構成した後に、新たな免疫複合体及び補体を加えることによって、FDCを活性化させようとした。本発明者等は、約8000〜9000ngの新たなFDCを有する抗体を測定し、7日後でもまだ、ICを有するFDCの抗体濃度は約8000〜9000ng/mLであった。14日後では、抗体濃度は4000〜5000ng/mLであり、ビーズ上で維持されたIC及びFDCは、プラスチック上に維持されたものよりも良好であった。したがって、FDCは少なくとも約2週間、ビーズ上で良好な活性を維持することができる。ヒトFDCはIC及び補体から利益を受けた。
化学架橋なしでのコラーゲンの直接沈着
本実施例において、PuraCol(1mMの硝酸における超純粋ウシI型コラーゲン、Inamed, CA)溶液(約50μL)を250μL容プラスチックピペットチップに入れ、ピペッティングせずにマニュアルでパターン形成するための「ペン」として用いた。この方法は洗浄及び細胞培養物とのインキュベートに耐えることができる楕円形及び円形スポット(約800〜1000μm)のプリントを可能にした。このようにしてコラーゲンでスポットされた組織培養プレート又はペトリ皿はバイオハザードフードに入れ、フードのUV光下で約1時間乾燥させた。記載されたようにコラーゲンでパターン形成した組織培養物(マルチウェル)プレート又はペトリ皿をPBSで満たし、約10分間室温でインキュベートした。それから、ペトリ皿を空にし、蒸留水で満たして、約5分間インキュベートした。この蒸留水の洗浄を3回繰り返し、その後さらにUV光に約30分間曝すことを含めて3時間、ペトリ皿をバイオハザードフードで乾燥させた(図16)。
化学架橋によるコラーゲンの沈着
別の実施形態において、コラーゲンスポットの耐久性(hardiness)を増大させるために、化学架橋法を用いることができる。例えば、グルタルアルデヒドを洗浄/中和溶液に添加し、コラーゲンの架橋を開始させることができる。未反応グルタルアルデヒドを、トリメチルアミンの溶液で洗浄することによって中和し、蒸留水で複数回洗浄することで取り除くことができる。
レーザーマイクロマシンによるパターン形成
別の実施形態において、コラーゲンによるペトリ皿の連続被覆、及びその後のレーザービームを用いたパターン形成は、規則的なパターンを作成するのに用いることができる方法である。レーザーマイクロマシーンは、コラーゲンパターンの接着及び安定性を改善するプラスチック表面の化学修飾及び活性化にも有用であり得る。
記憶B細胞は、in vivoでの胚中心で大量に形成される
記憶B細胞は、本発明のin vitro胚中心でも見出される。これを評価するために、本発明者等はin vitroの一次応答の開始後12日でヒトリンパ球を採取し、新たにFDC及び免疫複合体を加え、二次応答を引き起こさせた。これらの培養物由来の上清液は回収され、測定可能なレベルの高親和性の特異的IgG抗体を含んでいた。
本発明の実施形態において、in vitroで危険性の高い免疫原に対する一次応答を誘導し、in vitroのGCで特異的記憶細胞を広げた後に、より多くのFDC及び免疫原を有するこれらの記憶細胞を用いて、培養物をさらに広げることができる。このプロセスは、1回又は複数回繰り返すことができる。最終産物は、ヒトに危険性の高い免疫原を曝すことのない大量の高親和性で特異的なヒトIgG抗体である。
図16は、実施例43に従って調製したコラーゲンドットを示す。図17の結果はコラーゲン被覆Cytodexビーズによるものであり、CytodexにおいてFDCによる1mL当たり約7000ngのIgGが典型的な結果である。図18の結果はコラーゲンドットパターンによるものである。ここで、本発明者等は約47000ngのIgGを測定した。
Claims (29)
- 動物被験体に投与せずに、アレルゲン、免疫原、免疫調節剤、免疫治療剤及び潜在的ワクチン剤の評価を可能にする人工免疫システムであって、
培養組織構築物、並びに
前記培養組織構築物内に包埋されるか、又はその上に固定される少なくとも1つの三次元人工胚中心であって、
濾胞樹状細胞、
B細胞、及び
T細胞
を含む、少なくとも1つの三次元人工胚中心
を含む、人工免疫システム。 - 前記培養組織構築物が、コラーゲンクッション、ゼラチン、ヒアルロン酸、小腸粘膜下組織、膀胱粘膜、PLGA、ヒドロゲル、コラーゲンで覆われたプレート、マイクロキャリア、反転性(inverted)コロイド結晶マトリクス、合成細胞外マトリクス材料、及び天然細胞外マトリクス材料から成る群より選択される、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 前記B細胞及び前記T細胞が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤(biologic)、及び化合物から成る群より選択される作用物質で免疫された個体から単離される、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 濾胞白血球をさらに含む、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 前記培養組織構築物が、コラーゲンスポットで覆われたプレートを含む、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 前記コラーゲンスポットが架橋される、請求項5に記載の人工免疫システム。
- 前記濾胞樹状細胞が、前記コラーゲンスポットと接着する、請求項5に記載の人工免疫システム。
- 前記システムが、前記培養組織構築物に分布する間質細胞をさらに含む、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 前記システムが、IL−4抗体、CD40L抗体、及び抗CD40抗体から成る群より選択される可溶性因子をさらに含む、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 前記システムが、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される作用物質をさらに含む、請求項1に記載の人工免疫システム。
- 作用物質に対する動物の潜在的な反応を評価する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、及び
前記作用物質に対する前記B細胞及び/又は前記T細胞の応答を評価すること
を含む、方法。 - 前記作用物質が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記作用物質が、該作用物質に特異的な抗体と結合する、請求項11に記載の方法。
- 作用物質に特異的な抗体を産生する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、及び
前記作用物質に特異的な抗体を前記人工免疫システムから単離すること
を含む、方法。 - 作用物質に特異的な抗体を産生するB細胞を産生する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、及び
前記作用物質に特異的な抗体を産生するB細胞を前記人工免疫システムから単離すること
を含む、方法。 - 作用物質に特異的なT細胞を産生する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、及び
前記作用物質に特異的なT細胞を前記人工免疫システムから単離すること
を含む、方法。 - 前記作用物質が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記作用物質が、該作用物質に特異的な抗体と結合する、請求項14に記載の方法。
- 前記作用物質が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記作用物質が、該作用物質に特異的な抗体と結合する、請求項15に記載の方法。
- 前記作用物質が、ワクチン、アジュバント、免疫調節剤、免疫治療剤候補、化粧品、薬剤、生物製剤、及び化合物から成る群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記作用物質が、該作用物質に特異的な抗体と結合する、請求項16に記載の方法。
- ワクチンに対する非応答者(non-responders)を同定する方法であって、
濾胞樹状細胞、被験体から単離されたB細胞、及び被験体から単離されたT細胞を培養組織構築物に加えること、
ワクチンを、前記濾胞樹状細胞、前記B細胞、及び前記T細胞を含む前記培養組織構築物に投与すること、並びに
前記ワクチンに対する前記B細胞及び前記T細胞の応答を評価すること(ここで、B細胞及びT細胞の応答の欠如が、前記被験体は該ワクチンに対する非応答者であることを示す)
を含む、ワクチンに対する非応答者を同定する方法。 - ワクチンに対する非応答者を良好な応答者(responders)に変えることができる免疫調節剤を同定する方法であって、
請求項23に記載の方法を用いて、非応答者を同定すること、
濾胞樹状細胞、前記非応答者から単離されたB細胞、及び該非応答者から単離されたT細胞を培養組織構築物に加えること、
免疫調節剤を、前記濾胞樹状細胞、前記B細胞、及び前記T細胞を含む前記培養組織構築物に投与すること、
ワクチンを、前記濾胞樹状細胞、前記B細胞、及び前記T細胞を含む前記培養組織構築物に投与すること、並びに
前記免疫調節剤の存在下で前記ワクチンに対する前記B細胞及び/又は前記T細胞の応答を評価すること(ここで、該ワクチンに対するB細胞及び/又はT細胞の応答が、該免疫調節剤は前記非応答者を良好な応答者に変えるのに有効であることを示す)
を含む、方法。 - 抗原に特異的な抗体を産生するB細胞を不死化する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、
前記抗原に特異的な抗体を産生するB細胞を前記人工免疫システムから単離すること、及び
前記抗原に特異的な抗体を産生する前記B細胞を不死化すること
を含む、方法。 - 抗原に対してモノクローナルなB細胞を不死化する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、
前記抗原に対してモノクローナルなB細胞を同定すること、並びに
前記抗原に対してモノクローナルな前記B細胞を単離、クローン化及び不死化すること
を含む、方法。 - 抗原に対する免疫応答を試験する方法であって、
作用物質を請求項1に記載の人工免疫システムに投与すること、及び
前記T細胞の応答及び/又は前記B細胞の応答に対して前記抗原が有する効果を分析すること
を含む、方法。 - 前記T細胞の応答に対して前記抗原が有する効果が分析される、請求項27に記載の方法。
- 前記B細胞の応答に対して前記抗原が有する効果が分析される、請求項27に記載の方法。
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