JP2009520956A - マイコトキシン類を同定するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)導波管特異的および/または親和性結合相手が空間的に分離された方法でマイコトキシン類および/または結合相手のための化学的または生化学的認識成分として固定化される、第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する薄膜導波管を準備し、
b)1種もしくは複数のマイコトキシンを含有する試料および結合相手を該薄膜導波管上の固定化された結合相手に適用し、
c)薄膜導波管上の固定化された結合相手と試料からのマイコトキシン類および/または結合相手との相互作用による消失場における信号を検出し、
d)試料内に存在する1種もしくは複数のマイコトキシンの量を測定すること
を含んでなるマイコトキシン類の迅速検出方法により達成される。
a2O5および/またはNb2O5を含んでなる群から選択される酸化物を含んでなる光学的に透明な導波管層(a)を含んでなる。好ましくは、光学的に透明な導波管層(a)はTiO2、ZnO、Nb2O5、Ta2O5、HfO2またはZrO2、好ましくはTiO2、Ta2O5またはNb2O5から製造される。五酸化チタンの使用が、特に蛍光信号の検出のために、特に有利であることが証明された。
R−OPO3H2 (I)
の有機燐酸類および/もしくは以下の式(II)
R−PO3H2 (II)
の有機ホスホン酸類並びに/またはそれらの塩類の単層または多層の適用を含んでなり、ここでRはC10〜C24アルキルである。
ばデオキシニバレノール、ニバレノール、ゼアラレノン、T−2毒素、HT−2毒素、オクラトキシンAおよび/またはフモニシン類を含んでなる群から選択されるアフラトキシン類、オクラトキシン類、エルゴット・アルカロイド類、パツリンおよび/またはフサリウム毒素を含んでなる群から選択されるマイコトキシン類に対する抗体を含んでなる群から選択される。
具体的には、マイコトキシン類を同時に測定することが可能である。これは、ほとんどが単一のマイコトキシンだけを一回に検出可能である既知の方法と比べると大きな利点である。
たは生化学的認識成分として、第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する薄膜導波管の表面上で固定化することを提供しうる。好ましくは発蛍光団−標識付けされた抗−マイコトキシン抗体を次に分析しようとする試料と同時にまたはその前に加えることができる。薄膜導波管上に固定化されたマイコトキシン類または好ましくは発蛍光団−標識付けされたマイコトキシン−BSA抱合体の間の相互作用は消失場における信号変化として検出されうる。
ラスチック類が好ましい。
R−OPO3H2 (I)
の有機燐酸類および/もしくは以下の式(II)
R−PO3H2 (II)
の有機ホスホン酸類並びに/またはそれらの塩類の単層または多層を含んでなり、ここでRはC10〜C24アルキルである。
リーフ格子または相格子または容量格子である。格子構造は均一な周期を有する回折格子であることもできまたは多重回折格子であることもできる。格子構造は空間内で光学的に透明な導波管層(a)の中に結合された励起光の伝播方向に対して垂直にまたは平行に変動する周期性を有することができる。
うる。キットは前記請求項のいずれかに記載の検出を実施するために必要な緩衝剤および/または溶媒もさらに含んでなりうる。本発明は、キットが検出単位を含んでなることも提供する。
消失場バイオチップ上での間接的な競合免疫検定においてゼアラレノンを測定するための標準曲線の確定
18nmの格子深さを有する光学格子が刻印されそして155nmの五酸化チタンの層が備えられたガラス製の1cm×2cmの外寸法を有する7個のバイオチップ(ユナキシス(Unaxis)、リヒテンスタイン)にオクタデシルホスホン酸を、500μMのオクタデシルホスホン酸のn−ヘプタン/イソプロパノール(9:1)中溶液内にそれらを浸漬することにより、コーティングした。ゼアラレノンおよびウシ血清アルブミンの抱合体(ZEA−BSA、ZEA対BSA比=50:1、バイオピュア(Biopure)、ツルン、オーストリアにより製造された)並びに染料DyLight 647(ピアース(Pierce)、ドイツ)で標識付けされたBSA分子(DyLight 647−BSA)を「Biochip Arrayer」(パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、ドイツ)タイプのスポッターを用いてバイオチップに適用した。滴下溶液は、0.1%のBSAおよび0.1%のTween 20を含有するPBS(137mMのNaCl、2.8mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4、pH7.4)中の5×10−4mg/mlの濃度のDyLight 647−BSA、0.1%のBSAおよび0.1%のTween 20を含有するPBS中の0.5mg/mlのBSA−ZEA抱合体を含有していた。点を各場合とも10個のDyLight 647−BSA点およびBSA−ZEA抱合体点の新しい交互列の中にあるチップに2つの場(列)により適用した。
見出された。
デオキシニバレノール(DON)を測定するためおよび汚染された飼料穀類試料を測定するための標準曲線の確定
光学格子(18nmの格子深さ)が刻印され、五酸化チタン層(155nm)が備えられたガラス製の1cm×2cmの外寸法を有する15個のバイオチップ(ユナキシス、リヒテンスタイン)を、オクタデシルホスホン酸で(それらをオクタデシルホスホン酸のn−ヘプタン/イソプロパノール(9:1)中溶液の中に浸漬することにより)コーティングした。デオキシニバレノールおよびウシ血清アルブミンの抱合体(DON−BSA、DON:BSA比=100:1、バイオピュア、ツルン、オーストリアにより製造された)並びにイヌIgG(ロックランド(Rockland)、米国)をNanoplotter(ゲシム(GeSim)、ドイツ)タイプのスポッターを用いてバイオチップに適用した。滴下溶液は、トレハロースを含有するPBS(137mMのNaCl、2.8mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4、pH7.4)中の0.2mg/mlの濃度のイヌIgG、並びにトレハノースを含有するPBS中の1mg/mlの濃度のBSA−DON抱合体よりなっていた。点を各場合とも12個のイヌIgG点の2列および間にある12個のBSA−DON抱合体点の1列の形態でチップに2つの場(列)により適用した。
647で標識付けされたモノクローン性の抗−デオキシニバレノール抗体と、そして同様にDyLight 647で標識付けされたモノクローン性のヤギ抗−イヌIgG抗体と混合して、各場合とも1nMの抗体溶液を製造した。
てのDON点の蛍光強度の正規化平均を測定した。得られた蛍光強度を上記の標準曲線を用いて飼料穀類挽き割り内のDON濃度に転換して、3回の測定に関して590ppbの平均を生じた。
Claims (24)
- 以下の段階:
a)導波管特異的および/または親和性結合相手が空間的に分離された方法でマイコトキシン類および/または結合相手のための化学的または生化学的認識成分として固定化される、第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する薄膜導波管を準備し、
b)1種もしくは複数のマイコトキシンを含有する試料および結合相手を該薄膜導波管上の固定化された結合相手に適用し、
c)薄膜導波管上の固定化された結合相手と試料からのマイコトキシン類および/または結合相手との相互作用による消失場における信号を検出し、
d)試料内に存在する1種もしくは複数のマイコトキシンの量を測定すること
を含んでなるマイコトキシン類の迅速検出方法。 - 以下の式(I)
R−OPO3H2 (I)
の有機燐酸類および/もしくは以下の式(II)
R−PO3H2 (II)
の有機ホスホン酸類並びに/またはそれらの塩類の単層または多層を薄膜導波管に適用し、ここでRがC10〜C24アルキルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - Rが好ましくは非分枝鎖状のC12〜C18アルキルを含んでなる群から選択される非分枝鎖状のC10〜C20アルキルを含んでなる群から選択される有機燐酸類、有機ホスホン酸類、有機燐酸塩類および/または有機ホスホン酸塩類、好ましくはドデシル燐酸、ドデシル燐酸塩、オクタデシルホスホン酸塩および/またはオクタデシルホスホン酸を含んでなる群から選択される有機燐酸類、有機ホスホン酸類、有機燐酸塩類および/または有機ホスホン酸塩類を使用することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- TiO2、ZnO、Nb2O5、Ta2O5、HfO2および/またはZrO2を含んでなる群から選択される、好ましくはTiO2、Ta2O5および/またはNb2O5を含んでなる群から選択される酸化物を含んでなる光学的に透明な導波管層(a)を含んでなる薄膜導波管を使用することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 結合相手が抗−マイコトキシン抗体、抗−マイコトキシン−抗体抱合体、マイコトキシン類、マイコトキシン抱合体、抗−マイコトキシン抗体の断片、マイコトキシン−結合ペプチド類、マイコトキシン−結合アンチカリン類、マイコトキシン−結合アプタマー類、マイコトキシン−結合スピエゲルマー類および/またはマイコトキシン−結合インプリンテド重合体を含んでなる群から選択される、好ましくは抗−マイコトキシン抗体、抗−マイコトキシン−抗体抱合体、マイコトキシン類および/またはマイコトキシン抱合体を含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 標識付け成分、好ましくは発蛍光団をマイコトキシン類に蛋白質により、好ましくはウシ血清アルブミンにより結合させることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 試料が、好ましくは穀類、ワイン、ジュース、果実を含んでなる群から選択される人間もしくは動物用の食品、並びに/または穀類、ワイン、ジュースおよび/もしくは果実を含有する製品、或いは溶媒または溶媒混合物で抽出された該食品または製品の抽出物であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 信号の検出前に、試料を化学的もしくは生化学的認識成分としての固定化された結合相手および/または結合相手と共に15分間未満、好ましくは10分間未満にわたりインキュベートすることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- マイコトキシン類がアフラトキシン類、オクラトキシン類、エルゴット・アルカロイド類、パツリンおよび/またはフサリウム毒素を含んでなる群から選択される、例えばデオキシニバレノール、ニバレノール、ゼアラレノン、T−2毒素、HT−2毒素および/またはフモニシン類を含んでなる群から選択される、好ましくはオクラトキシンA、デオキシニバレノール、ニバレノール、ゼアラレノン、T−2毒素、HT−2毒素、フモニシンB1、フモニシンB2および/またはフモニシンB3を含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- マイコトキシン類が穀類抽出物中で0.1pM〜100nMのマイコトキシンの範囲内、好ましくは1pM〜1nMのマイコトキシンの範囲内でさえ検出されることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 検出を免疫検定、好ましくは競合免疫検定、特に好ましくは間接的な競合免疫検定により行うことを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する薄膜導波管を有することを特徴とするマイコトキシン類の迅速検出方法を実施するための装置。
- 第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する薄膜導波管の光学的に透明な層(b)がシリケート類、例えばガラスもしくは石英から、または好ましくはポリカーボネート類、ポリイミド類、ポリメタクリレート類、ポリスチレン類、環式ポリオレフィン類および/もしくは環式ポリオレフィン共重合体を含んでなる群から、好ましくは環式ポリオレフィン類から選択される透明なプラスチックから製造されることを特徴とする請求項12に記載の装置。
- 光学的に透明な導波管層(a)が40nm〜1000nmの範囲内、好ましくは40nm〜300nmの範囲内、より好ましくは80nm〜200nmの範囲内の厚さを有することを特徴とする請求項12または13に記載の装置。
- 1種もしくはそれ以上の格子構造を用いることにより励起光を光学的に透明な導波管層(a)中にカップリングさせることを特徴とする請求項12〜14のいずれかに記載の装置。
- 励起光の中へのカップリングのために使用可能な格子構造が200nm〜1000nmの範囲内、好ましくは200nm〜400nmの範囲内の周期を有することを特徴とする請求項12〜15のいずれかに記載の装置。
- 格子が3nm〜60nmの範囲内、好ましくは10nm〜40nmの範囲内変調伝達因子を有することを特徴とする請求項12〜16のいずれかに記載の装置。
- 励起光が300nm〜1100nmの範囲内、好ましくは300nm〜800nmの範囲内、より好ましくは500nm〜700nmの範囲内の波長を有することを特徴とする請求項12〜17のいずれかに記載の装置。
- 以下の式(I)
R−OPO3H2 (I)
の有機燐酸類および/もしくは以下の式(II)
R−PO3H2 (II)
の有機ホスホン酸類並びに/またはそれらの塩類の単層または多層を薄膜導波管に適用し、ここでRがC10〜C24アルキルであることを特徴とする請求項12〜18のいずれかに記載の装置。 - 認識成分が100000までの測定場により二次元配置で適用され、単一の測定場が好ましくは0.001mm2〜6mm2の範囲内、好ましくは0.1mm2〜1mm2の範囲内の面積を有することを特徴とする請求項12〜19のいずれかに記載の装置。
- 1平方センチメートル当たり10より多い、好ましくは50より多い測定場が薄膜導波管に適用されることを特徴とする請求項12〜20のいずれかに記載の装置。
- 導波管特異的および/または親和性結合相手が空間的に分離された方法でマイコトキシン類および/または結合相手のための化学的または生化学的認識成分として固定化される、第二の光学的に透明な層(b)の頂部に第一の光学的に透明な導波管層(a)を含んでなり、(b)が(a)より低い屈折率を有する少なくとも1つの薄膜導波管を含んでなることを特徴とするマイコトキシン類の迅速検出用のキット。
- 好ましくは蛍光的に標識付けされた結合相手を含んでなる試薬を含んでなることを特徴とする請求項22に記載のキット。
- マイコトキシン類の迅速検出のための請求項22または23に記載のキットの使用。
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