EA013337B1 - Способ быстрой идентификации микотоксинов - Google Patents

Способ быстрой идентификации микотоксинов Download PDF

Info

Publication number
EA013337B1
EA013337B1 EA200801588A EA200801588A EA013337B1 EA 013337 B1 EA013337 B1 EA 013337B1 EA 200801588 A EA200801588 A EA 200801588A EA 200801588 A EA200801588 A EA 200801588A EA 013337 B1 EA013337 B1 EA 013337B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mycotoxins
layer
mycotoxin
waveguide
thin
Prior art date
Application number
EA200801588A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801588A1 (ru
Inventor
Йенс Бурмайстер
Ингмар Дорн
Увэ Рабэ
Изольдэ Хойзер-Хан
Original Assignee
Байер Технолоджи Сервисиз Гмбх
Байер Кропсайенс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байер Технолоджи Сервисиз Гмбх, Байер Кропсайенс Аг filed Critical Байер Технолоджи Сервисиз Гмбх
Publication of EA200801588A1 publication Critical patent/EA200801588A1/ru
Publication of EA013337B1 publication Critical patent/EA013337B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу быстрой идентификации микотоксинов, который включает следующие стадии: a) приготовление тонкослойного волновода, включающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (b), причем (b) имеет более низкий коэффициент преломления, чем (а), на котором пространственно раздельно иммобилизируются специфические и/или аффинные связывающие партнеры в качестве химического или биохимического опознавательного элемента для микотоксинов и/или одного связывающего партнера, b) нанесение пробы, содержащей митотоксин(ы) и связывающие партнеры, на иммобилизированные связыващие партнеры на тонкослойном волноводе, c) детектирование эванесцентной компоненты излучения, возникающей при взаимодействии находящихся на тонкослойном волноводе иммобилизированных связывающих партнеров с микотоксинами пробы и/или со связывающими партнерами, d) определение количества микотоксина(ов), находящегося (находящихся) в пробе.

Description

Изобретение относится к технологии идентификации микотоксинов, более конкретно к способу быстрой идентификации микотоксинов.
Идентификация микотоксинов применяется в широкой области, например при анализе продуктов питания и кормов, исследованиях окружающей среды, защите растений, а также биохимических исследованиях.
Микотоксины представляют собой ядовитые вещества, образованные плесневыми грибами, с очень разной химической структурой. Микотоксины встречаются в продуктах урожая, таких как зерно, маслосодержащие семена и фрукты, и могут быть причиной смерти людей и животных. К настоящему времени идентифицировано свыше 300 различных микотоксинов, которые подразделяются на примерно 25 структурных типов и обнаруживают разное токсическое действие. Микотоксины в зависимости от вида токсинов могут вызывать острые или хронические отравления. К часто встречающимся группам микотоксинов относятся афлатоксины, охратоксины, алкалоиды спорыньи, патулин, фузарийтоксины. Среди фузарийтоксинов особо известны деоксиниваленол, цеараленон, ниваленол, Т-2-/НТ2-токсин и фумонисины, так как они часто встречаются в продуктах урожая. Соответственно необходимо проводить тест на микотоксины, например, на токсины полевых грибов, например фузариевые токсины, или на токсины складских грибов на приемных пунктах зерна, в местах торговли зерном, а также в местах переработки зерна, например, на мельницах, солодовнях, в местах производства кормов, у землевладельцев, в консультациях, университетах или министерствах, например в министерстве защиты потребителей для того, чтобы гарантировать качество продуктов питания.
Из уровня техники известен ряд способов идентификации микотоксинов. Идентификацию микотоксинов проводят, например, хроматографическим способом, таким как ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления) на хроматографах с флуоресцентным детектированием, детектированием по поглощению света и масс-спектрометрическим детектированием. Для ЖХВД-анализа, например, пробы зерна проводят обычно обогащение и очистку анализируемых образцов с помощью иммуноаффинационных колонок. Недостатки всех способов, опирающихся на ЖХВД, состоят в высоких инвестиционных затратах, относительно сложной пробоподготовке, а также больших временах анализа. В связи с указанными недостатками идентификация ЖХВД-способами не подходит для быстрого, дешевого и простого анализа, например проб зерна на предприятиях, производящих зерно, принимающих зерно, торгующих зерном или перерабатывающих зерно. Вместо этого анализ на основе ЖХВД осуществляют в специализированных, аналитических лабораториях. На практике в соответствии с этим получение результата связано с потерей времени в несколько дней.
Альтернативным способом идентификации микотоксинов является ЕЫБА-способ (Епхуше Ыпкеб 1ттипо БогЬеп! Аккау = иммуноферментный твердофазный анализ). Для ЕЬ1БА-способа приготавливают микротитровальные пластинки, углубления которых покрыты слоем антител-улавливателей, которые специфически связываются с микотоксином. Недостатками ЕЫБА-способа являются многочисленные стадии пипетирования, промывания и инкубирования, которые приводят к относительно большим временам анализа, превышающим 30 мин. Это мешает быстрому проведению тестирования на месте, за пределами лаборатории. С другой стороны, этот тест не позволяет проводить идентификацию сразу нескольких анализируемых образцов в связи с тем, что, как правило, каждая микротитровальная пластинка покрыта слоем антител одного вида.
Другим способом идентификации микотоксинов является ЬЕА-способ (Ъа1ега1 Иоте Аккаук = анализ вторичного потока). Для идентификации микотоксинов с помощью ЬЕА-способа можно проводить прямой, конкурентный иммунный анализ на нитроцеллюлозной полоске, причем анализируемая проба в результате действия капиллярных сил пропитывает всю нитроцеллюлозную полоску.
Недостаток состоит в том, что этот способ позволяет только качественный анализ микотоксинов. Другой недостаток состоит в том, что в этом тесте для каждого микотоксина требуется отдельная полоска.
Согласно уровню техники проведены работы по развитию способов идентификации микотоксинов, например, описанные в М.М. ЫдипШ и др., Апа1. Сйеш.. 2005, 77, 148-154. В этом способе приведен непрямой, конкурентный иммунный анализ для идентификации охратоксина А, при котором охратоксин А иммобилизируют на стеклянных носителях объекта. Смесь флюоресцентно маркированных антител против охратоксина А и идентифицируемой пробы наносят на стеклянный носитель объекта и после удаления промыванием несвязанных антител подвергают анализу. Недостатком этого способа является то, что стадии промывания и инкубационное время составляют от 10 до 20 мин, а флуоресцентные демонстрационные системы для интерпретации результатов являются дорогостоящими. Это препятствует проведению на этой основе быстрого теста в необходимом месте вне аналитической лаборатории.
Известные из уровня техники способы идентификации микотоксинов требуют, таким образом, высоких инвестиционных затрат в связи с высокой стоимостью приборов для идентификации и включают много ручных стадий или не могут быть выполнены вне пределов аналитической лаборатории.
В связи с этим задача данного изобретения состоит в создании способа, который устраняет по крайней мере один из указанных недостатков уровня техники, в частности, в создании способа, который позволяет быстро, доступно и дешево проводить идентификацию микотоксинов.
- 1 013337
Эта задача решается способом быстрой идентификации микотоксинов, который включает следующие стадии:
a) приготовление тонкослойного волновода, включающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем (а), на котором пространственно раздельно иммобилизируются специфические и/или аффинные связывающие партнеры в качестве химического или биохимического опознавательного элемента для микотоксинов и/или одного связывающего партнера,
b) нанесение пробы, содержащей митотоксин(ы), и связывающих партнеров на иммобилизированные связывающие партнеры на тонкослойном волноводе,
c) детектирование сигнала в эванесцентном поле, возникающего при взаимодействии находящихся на тонкослойном волноводе иммобилизированных связывающих партнеров с микотоксинами пробы и/или со связывающими партнерами,
б) определение количества микотоксина(ов), находящегося в пробе.
Другим предметом данного изобретения является устройство (прибор) для осуществления способа идентификации микотоксинов.
Предметом данного изобретения является также набор реактивов и приспособлений для осуществления способа идентификации микотоксинов.
Другие предпочтительные варианты изобретения приведены в подпунктах формулы изобретения.
Неожиданно было обнаружено, что способ идентификации микотоксинов согласно данному изобретению можно осуществить просто и за пределами специализированной аналитической лаборатории. Это создало возможность для осуществления способа согласно данному изобретению в виде быстрого теста, без необходимости отправлять пробы в лабораторию для анализа. Другое преимущество состоит в том, что идентификация микотоксинов способом согласно данному изобретению обычно требует небольшое число или не требует стадий промывания. В этом состоит особое преимущество, так как проведение стадий промывания связано с затратами времени, замедляет получение результатов анализа и, в частности, при не очень тщательном или ненадлежащем осуществлении промывания результаты анализа искажаются или идентификация оказывается совершенно невозможной.
Комбинация предпочтительных особенностей способа согласно данному изобретению создает возможность для проведения идентификации микотоксинов в продовольственных продуктах, например на приемных пунктах зерна, у торговцев зерном и переработчиков зерна. В частности, простое и быстрое осуществление способа создает возможность для проведения этого анализа персоналом, который не является специалистом-аналитиком лаборатории.
В предпочтительном варианте изобретения используют в качестве тонкослойного волновода биочип с эванесцентным полем (Еуапе8сеи1-Ее1б-В1осЫр), который базируется на тонкослойном волноводе, предпочтительно плоский оптический волновод-биочип, который базируется на тонкослойном волноводе.
Оптические волноводы представляют собой класс преобразователей сигнала, с помощью которых можно детектировать изменение оптических свойств среды, которая граничит с волноводным слоем, типичным диэлектриком. В том случае, когда свет, в качестве ведомой моды транспортируют в волноводный слой, световое поле на пограничной поверхности среда/волновод не обрывается резко, а спадает экспоненциально в граничащей с волноводом, так называемой детекционной среде. Это экспоненциально спадающее световое поле обозначают эванесцентным полем. В том случае, когда изменяются оптические свойства среды, граничащей с волноводом внутри эванесцентного поля, это можно детектировать по характерному падению измеряемой величины.
Преимущество применения волноводов в качестве преобразователей сигнала состоит в том, что в случае опознаваемых элементов, иммобилизированных на пограничных поверхностях волновода, можно детектировать присоединение опознаваемых элементов или реакции опознаваемых элементов в том случае, если при этом меняются оптические свойства детекционной среды на пограничной поверхности с волноводом.
Соответственно, экономится время при осуществлении идентификации, а также упрощается сама процедура.
Таким образом, детектирование сигнала, соответственно, маркированного элемента можно осуществить с помощью изменяющихся оптических свойств среды, например, подлежащей анализу пробы, непосредственно на поверхности преобразователя сигнала, соответственно, тонкослойного волновода, например, посредством изменения поглощения, флуоресценции, фосфоресценции, люминесценции и т.п.
Предпочтительно детектируют флуоресцентный сигнал в эванесцентном поле. Применяемые согласно изобретению маркирующие элементы для маркирования связываемого партнера, например микотоксинов, сопряженных микотоксинов, сопряженных антител или антител, предпочтительно представляют собой органические флуорофоры, наночастицы, флуоресцентные наночастицы, бусинки, флуоресцентные бусинки, флуоресцентные белки или другие молекулы или группы, подающие сигнал, или любые комбинации различных маркирующих элементов. Предпочтительно используются способные к люминесценции, маркирующие связывающие партнеры.
- 2 013337
Предпочтительными маркирующими элементами являются органические флуорофоры и/или флуоресцентные белки.
Способом согласно данному изобретению с помощью эванесцентного поля можно возбуждать предпочтительно флуоресцентные маркирующие связывающие элементы. В предпочтительном варианте изобретения эванесцентное поле создают с помощью плоского оптического волновода, который описан Дувенеком и др. в И8 5959292. Изотропно эмитированная флуоресценция детектируется по характерному строению. В других вариантах изобретения флуоресценция, накопленная в волноводе, может быть с помощью подходящего оптического элемента выведена из волновода и проведено детектирование по характерному убыванию оптического сигнала.
Особое преимущество состоит в том, что можно ограничить или полностью пренебречь промыванием перед детектированием предпочтительно флуоресцентного маркированного связывающего партнера или пробы, соответственно, раствора, содержащего маркированный связывающий партнер. Это позволяет экономить время при идентификации микотокисинов, а также упрощает проведение идентификации в связи с тем, что можно пренебречь приготовлением обычно используемых различных буферных растворов согласно протоколу промывания.
Применяемые тонкослойные волноводы охватывают предпочтительно оптически прозрачный волноводный слой (а), включающий оксиды, выбираемые из группы, включающей ΤίΟ2, ΖηΟ, ИЬ2О5, Та2О5, НЮ2 и ΖγΟ2, предпочтительно выбираемые из группы, включающей Т1О2, Та2О5 и ИЬ2О5. Предпочтителен оптически прозрачный волноводный слой (а), который образован из Т1О2, ΖηΟ, ИЬ2О5, Та2О5, НЮ2 и ΖιΌ2. предпочтительно из Т1О2, Та2О5 и ИЬ2О5. В частности, оказалось, что более предпочтительно применение пентоксида тантала, особенно при детектировании флуоресцентного сигнала.
В предпочтительных вариантах изобретения на тонкослойный волновод, в частности на оптически прозрачный слой волновода (а), который содержит оксиды, выбираемые из группы, включающей Т1О2, ΖηΟ, ИЬ2О5, Та2О5, Н£О2 и ΖιΌ2. наносят один или много слоев органофосфорных кислот согласно приведенной ниже формуле (I)
К-ОРО3Н2 (I) и/или органофосфоновых кислот согласно приведенной ниже формуле (II)
В-РО3Н2 (II), и/или их солей, причем В означает (Сю-С24)-алкил.
Предпочтительно применяют органофосфорные и/или органофосфоновые кислоты, более предпочтительно органофосфаты и/или органофосфонаты, с радикалом В, выбираемым из группы, включающей неразветвленные (Сю-С2о)-алкилы, еще более предпочтительно из группы, включающей неразветвленные (С12-С18)-алкилы, наиболее предпочтительно додецилфосфорную кислоту, додецилфосфат, октадецилфосфонат и/или октадецилфосфоновую кислоту.
Предпочтительно органофосфорные кислоты и органофосфаты применяют в виде растворимых в воде солей, которые могут наноситься в виде водного раствора на тонкослойный волновод.
В предпочтительном варианте изобретения органофосфорные кислоты и/или органофосфоновые кислоты, предпочтительно органофосфаты, наносят в виде монослоя на тонкослойный волновод, предпочтительно на биочип с эванесцентным полем, более предпочтительно на плоский оптический биочипволновод. Нанесение можно проводить способом окунания.
Монослой может быть нанесен в виде слоя со средством для адгезии на оптически прозрачный слой, образованный из оксидов. Предпочтительным образом органофосфорные кислоты и/или органофосфоновые кислоты могут взаимодействовать с опознавательными элементами, в частности с протеином или с присоединенными к протеинам опознавательными элементами, и усиливать присоединение опознавательных элементов к биочипу.
Применяемых присоединяемых партнеров предпочтительно выбирают из группы, которая включает антимикотоксин-антитела, конъюгаты антимикотоксин-антител, микотоксины, конъюгаты микотоксинов, фрагменты антимикотоксин-антител, пептиды, связывающие микотоксины, антикалины, связывающие микотоксины, аптамеры, связывающие микотоксины, зеркальные изомеры, связывающие микотоксины, и привитые полимеры, связывающие микотоксины, предпочтительно выбираемые из группы, которая включает антимикотоксин-антитела, конъюгаты антимикотоксин-антител, микотоксины, конъюгаты микотоксинов.
Присоединяемые партнеры взаимодействуют в каждом случае специфически и/или аффинно с другими присоединяемыми партнерами. Например, антимикотоксин-антитела, которые нанесены на тонкослойный волновод, присоединяют аффинно микотоксины, иммобилизованные на этом тонкослойном волноводе. Также антимикотоксин-антитела, иммобилизованные на тонкослойном волноводе, присоединяются аффинно к микотоксинам и конъюгатам микотоксинов, которые нанесены на тонкослойный волновод. Специфичность связывания зависит при этом от применяемых аффинных партнеров. Так применяемые перекрестнореакционные антимикотоксин-антитела присоединяются аффинно к соответствующим микотоксинам, например, из группы фумосинов, однако это происходит менее специфично, чем, например, у специального антитела по отношению к фумосину В1. Присоединяемые партнеры, которые иммобилизованы, обозначают также опознавательными элементами или «молекулами-ловушками».
- 3 013337
Конъюгаты антимикотоксин-антител и конъюгаты микотоксинов можно получить, например, из протеина и антимикотоксин-антитела или микотоксина.
В предпочтительном варианте изобретения при непрямом конкурентном анализе иммобилизованными связывающими партнерами являются конъюгаты микотоксинов. Конъюгаты микотоксинов предпочтительно можно получить из микотоксина, связанного с протеином, например альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота (В8А = Воуше 8етит А1Ьитше). Особым преимуществом применения такого конъюгата микотоксин-В8А является улучшение присоединения микотоксина к тонкослойному волноводу в результате взаимодействия между протеином и органофосфорными кислотами и/или органофосфоновыми кислотами. Это может приводить к лучшей адгезии опознавательного элемента на тонкослойном волноводе.
Маркирующий элемент, например флуоресцентный краситель или люминофор, может быть связан или непосредственно со связывающим партнером, например с антимикотоксин-антителом, или с микотоксином, или через пространственный элемент, например через протеин или алкильную или полиэтиленгликольную цепочку. Маркирующий элемент, например флуоресцентный краситель или люминофор, предпочтительно присоединен к микотоксину через протеин. Подходящим протеином является, например, В8А. Присоединение флуорофора к микотоксину с помощью В8А может отчетливо улучшить соединение маркирующего элемента со связывающим партнером, например антителом. Другое преимущество состоит в том, что удается избежать затратного способа прямого связывания, например, флуорофора с микотоксином. Предпочтительно в качестве связывающего партнера для иммобилизованных антимикотоксин-антител используют флуоресцентно маркированные конъюгаты микотоксин-В8А, например, при прямом конкурентном анализе.
Идентификация микотоксинов в принципе может проводиться в пробах, растворах или других средах, наносимых на тонкослойный волновод. В предпочтительном варианте изобретения пробы представляют собой продукты питания для человека или животных. Предпочтительно способом согласно данному изобретению осуществляют идентификацию микотоксинов в зерне, зерновых продуктах, вине, соке, фруктах и/или продуктах, содержащих зерно, вино, соки и/или фрукты. При этом анализируемую пробу, например продовольствие или продукт или экстракт пищевых продуктов, или продукт, полученный при экстрагировании растворителем или смесью растворителей, наносят на тонкослойный волновод. Экстракт может применяться в разбавленном или концентрированном виде.
Микотоксины могут быть получены растворением из анализируемой пробы, например, зерна и других продуктов питания, в результате обработки растворителем или смесью растворителей. Например, микотоксины можно извлечь из проб зерна в результате перемалывания и последующей экстракции водой или органическим растворителем или смесью растворителей, например, смесями, состоящими из воды, которая при необходимости может содержать буферные вещества, соли, кислоты или основания и другие добавки, и органических растворителей, например смесями воды и метанола или этанола, или смесями воды и ацетонитрила. Другие способы, которые связаны с экстракцией микотоксинов, известны специалистам. Полученные растворенные микотоксины могут быть после этого подвергнуты анализу, непосредственно или после разбавления или обогащения на тонкослойном волноводе или чипе.
Применяемые опознавательные элементы, которые также обозначают «молекулами-ловушками», предпочтительно выбирают из группы, которая включает антимикотоксин-антитела, конъюгаты антимикотоксин-антител, микотоксины и/или конъюгаты микотоксинов, предпочтительно два или несколько различных, могут быть иммобилизованы на поверхность тонкослойного волновода или чипа ковалентно или нековалентно, например, в результате гидрофобной адсорбции. Иммобилизацию можно осуществить, например, в результате нанесения опознавательных элементов в виде полей измерения (пятно = 8ро1 = спот), обозначаемых «споттинг», на поверхность тонкослойного волновода или чипа. Предпочтительно осуществляют «споттинг» раствора, предпочтительно буферного раствора, который содержит один или несколько связывающих партнеров в качестве опознавательных элементов, с помощью приборов для автоматического нанесения, так называемых «споттеров». После нанесения «слотов» (пятен) на тонкослойные волноводы или чипы предпочтительно пережидают один или несколько инкубационных часов, для того чтобы опознавательный элемент мог прикрепиться к тонкослойному волноводу или чипу.
Предпочтительно, чтобы биочип после «споттинга» в течение, как минимум, одного часа, более предпочтительно в течение от 2 до 6 ч, еще более предпочтительно в течение от 3 до 4 ч был обработан раствором протеина, предпочтительно раствором применяемого блокирующего протеина, например В8А. После удаления из раствора тонкослойные волноводы или биочипы можно отправить на хранение.
Нанесение пробы и предпочтительно флуоресцентно маркированного связывающего партнера на иммобилизованные опознавательные элементы на тонкослойном волноводе, предпочтительно, на биочипе с эванесцентным полем, более предпочтительно на плоском оптическом волноводе-биочипе, можно осуществлять одновременно или последовательно. Так, добавление предпочтительно флуоресцентно маркированных связывающих партнеров, например, одного или нескольких флуоресцентно маркированных микотоксинов, конъюгатов микотоксинов или антител на один или несколько микотоксинов можно осуществлять перед инкубацией или во время инкубации пробы, например экстракта на чипе. Можно также, например, экстракт пробы, подлежащей исследованию, в смеси с предпочтительно маркирован
- 4 013337 ными, более предпочтительно флуоресцентно маркированными микотоксинами, конъюгатами микотоксинов или антителами наносить на один или несколько микотоксинов на чипе.
Особое преимущество состоит в том, что в способе согласно данному изобретению проба может быть инкубирована менее чем за 15 мин, предпочтительно менее чем за 10 мин, более предпочтительно менее чем за 5 мин до детектирования сигнала вместе с иммобилизованным связывающим партнером в качестве химического или биохимического опознавательного элемента на тонкослойном волноводе и/или на связывающих партнерах.
Это создает большое преимущество по сравнению с известными способами, для которых инкубационное время для нанесенных конъюгатов микотоксинов с раствором маркированных микотоксинантител требует иногда до двух часов, или по сравнению со способами, у которых необходима предварительная инкубация проб с маркированными антимикотоксин-антителами. Это приводит к тому, что идентификация микотоксинов способом согласно данному изобретению осуществляется заметно быстрее по сравнению с известными способами, в частности, можно значительно сократить время инкубации. В более предпочтительном варианте изобретения время инкубации может быть меньше 10 мин или даже составлять 5 мин. В особенности в комбинации с другим преимуществом, состоящим в том, что можно пренебречь стадией промывания, создается возможность того, что способ согласно данному изобретению позволяет получить результат менее чем за 20 мин, предпочтительно менее чем за 15 мин, более предпочтительно менее чем за 10 мин.
Применяя способ согласно данному изобретению, можно количественно и предпочтительно с малой вариацией идентифицировать микотоксины. Например, так называемый межлабораторный вариационный коэффициент, являющийся мерой точности при сравнении, составляет менее 50%, предпочтительно менее 40%. Далее, так называемый внутрилабораторный вариационный коэффициент, являющийся мерой вариации при повторении, составляет менее 20%. Это позволяет применение способа согласно данному изобретению в рамках стандартизированного и простого способа идентификации микотоксинов в продовольствии, например в зерне, зерновых продуктах или вине.
Идентифицируемые микотоксины предпочтительно выбирают из группы, включающей афлатоксины, охратоксины, алкалоиды спорыньи, патулин и/или фузарийтоксины, например, выбираемые из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, охратоксин А и/или фумонисины. Фумонисины предпочтительно выбирают из группы, включающей фумонисин В1, фумонисин В2 и/или фумонисин В3.
Соответственно, используемые связывающие партнеры предпочтительно выбирают из группы микотоксинов, включающей афлатоксины, охратоксины, алкалоиды спорыньи, патулин и/или фузарийтоксины, например, выбираемые из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, охратоксин А и/или фумонисины и антитела к микотоксинам, выбираемые из группы включающей афлатоксины, охратоксины, алкалоиды спорыньи, патулин и/или фузарийтоксины, например, выбираемые из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин и/или фумонисины.
В зависимости от используемого иммунного анализа иммобилизуют на тонкослойном волноводе один из связывающих партнеров, например, в случае непрямого конкурентного иммунного анализа один или несколько микотоксинов, в качестве опознавательных элементов, тогда как другие связывающие партнеры, например, в случае непрямого конкурентного иммунного анализа одно или несколько антимикотоксин-антител перед пробой или одновременно с пробой помещают на тонкослойный волновод, при этом подлежащий добавлению связывающий партнер предпочтительно маркирован с возможностью люминесценции, более предпочтительно маркирован флуорофором.
Применяемые связывающие партнеры предпочтительно выбирают из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, охратоксин А и/или фумонисин В1, фумонисин В2 и/или фумонисин В3, и антитела к микотоксинам выбирают из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, охратоксин А и/или фумонисин В1, фумонисин В2 и/или фумонисин В3.
При этом предпочтительно применяются моноклональные антитела к микотоксинам, например, антифумонисин В1, антифумонисин В2 или антифумонисин В3. Далее применяются антитела, которые действуют против группы фумосинов. Применяемые связывающие партнеры, предпочтительно антитела против микотоксинов, могут применяться по отдельности или в смеси, кроме того, также применяются перекрестно реакционные антитела.
Особое преимущество способа согласно данному изобретению вытекает из того, что идентификация микотоксинов способом согласно данному изобретению осуществляется с повышенной чувствительностью. Так, например, микотоксины в средствах питания человека и животных, например зерне, вине, соках, фруктах и/или продуктах, изготовленных из них, или в экстрактах из средств питания или продуктах, могут идентифицироваться даже в интервале наномолярных или пикомолярных концентраций микотоксинов. Так, например, микотоксины в экстрактах зерна могут быть идентифицированы в интервале от 0,1 пМ до 100 нМ микотоксина, предпочтительно в интервале от 1 пМ до 1 нМ микотоксина, в частности, могут быть идентифицированы концентрации менее 1 нМ микотоксина, предпочтитель
- 5 013337 но менее 100 пМ микотоксина, более предпочтительно менее 10 пМ микотоксина, еще более предпочтительно менее 1 пМ микотоксина.
Далее возможна идентификация микотоксинов в экстракте зерна в интервале от 10-4 млрд (миллиардных) долей до 10000 млрд долей микотоксина, в зерне в интервале от 10-2 млрд долей до 10000 млрд долей микотоксина. Предпочтительно можно идентифицировать микотоксины в экстракте зерна в области меньшей или равной 0,1 млрд доли микотоксина, более предпочтительно в области меньшей или равной 0,01 млрд доли микотоксина, еще более предпочтительно в области меньшей или равной 10-4 млрд доли микотоксина, а в зерне в области меньшей или равной 0,1 млрд доли микотоксина, более предпочтительно в области меньшей или равной 0,01 млрд доли микотоксина, еще более предпочтительно в области меньшей или равной 10-4 млрд доли микотоксина.
Это позволяет проводить относительно точное определение микотоксинов, содержащихся в средствах питания, за пределами аналитической лаборатории, которое до этого было невозможным.
Способ согласно данному изобретению позволяет идентифицировать, как минимум, 2 микотоксина, предпочтительно 2-1000 микотоксинов, еще более предпочтительно 5-100 микотоксинов. В частности, микотоксины могут быть установлены одновременно. Это является большим преимуществом по сравнению с известными способами, которые позволяют идентифицировать одновременно только один микотоксин.
Предпочтительный вариант способа идентификации микотоксинов предусматривает, что на поверхность тонкослойного волновода, охватывающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем слой (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем слой (а), пространственно раздельно иммобилизуют специфические и/или аффинные связывающие партнеры, в качестве химических или биологических опознавательных элементов для микотоксинов и/или одного связывающего партнера. Затем можно одновременно или последовательно добавить анализируемую пробу и связывающий партнер, предпочтительно маркированный флуорофором.
Специфическое и/или аффинное взаимодействие между связывающими партнерами, иммобилизованными на тонкослойном волноводе, микотоксином(ами) пробы, и/или связывающими партнерами, предпочтительно меченными флуорофором, можно детектировать как изменение сигнала в эванесцентном поле. Присутствие микотоксина в пробе при этом ведет к изменению сигнала в эванесцентном поле.
Согласно изобретению идентификация микотоксина может происходить в результате анализа, например иммунного анализа на чипе. Идентификация микотоксина происходит предпочтительно в виде иммунного анализа, предпочтительно конкурентного иммунного анализа, например прямого или непрямого конкурентного иммунного анализа, более предпочтительно в виде непрямого конкурентного иммунного анализа.
Предпочтительный вариант способа изобретения по идентификации микотоксинов в форме непрямого конкурентного иммунного анализа может предусматривать, что на поверхность тонкослойного волновода, охватывающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем слой (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем слой (а), пространственно раздельно иммобилизуют антимикотоксин-антитела в качестве химических или биологических опознавательных элементов для микотоксинов. В заключение могут быть добавлены микотоксины, предпочтительно маркированные флуорофором, или конъюгаты микотоксин-В8А, предпочтительно маркированные флуорофором, одновременно с анализируемой пробой или перед ней. Взаимодействие антимикотоксин-антител, иммобилизованных на тонкослойном волноводе, митотоксина(ов) пробы и/или микотоксинов, предпочтительно маркированных флуорофором или конъюгатов микотоксин-В8А можно детектировать как изменение сигнала в эванесцентном поле.
В случае прямого конкурентного иммунного анализа можно ковалентно или нековалентно иммобилизовать предпочтительно два или несколько различных антимикотоксин-антител на поверхности чипа, например, с помощью споттинга. Когда наносят на чип, например, экстракт анализируемой пробы в смеси с предпочтительно флуоресцентно маркированными микотоксинами или конъюгатами микотоксинов, происходит конкуренция маркированных и немаркированных микотоксинов, соответственно, конъюгатов микотоксинов в борьбе за доступные на чипе связывающие места антител. Добавление флуоресцентно маркированных микотоксинов может происходить как перед, так и во время инкубации экстракта на чипе. Количество маркированных микотоксинов, присоединенных к иммобилизованным антителам, обратно пропорционально количеству микотоксинов, находящихся в экстракте.
Идентификацию можно также проводить в виде сэндвич-анализа. В этом случае вместо маркированных микотоксинов или конъюгатов микотоксина применяют для детектирования маркированные антитела, которые присоединяются к иммобилизованному комплексу, образованному на поверхности чипа иммобилизованным антителом и микотоксином. В случае сэндвич-анализа количество флуорофора, присоединенного к антителам, пропорционально концентрации микотоксина в экстракте.
Другой предпочтительный вариант способа идентификации микотоксинов в форме непрямого, конкурентного иммунного анализа может предусматривать, что на поверхность тонкослойного волновода, охватывающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем слой (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем слой (а), пространственно
- 6 013337 раздельно иммобилизуются микотоксины или предпочтительно меченные флуорофором конъюгаты микотоксин-В8А, в качестве химических или биологических опознавательных элементов для микотоксинов. В заключение можно добавить предпочтительно меченные флуорофором антимикотоксин-антитела одновременно или перед анализируемой пробой. Взаимодействие иммобилизованных на тонкослойном волноводе микотоксинов или предпочтительно меченных флуорофором конюгатов микотоксин-В8А с микотоксином(ами) пробы и/или предпочтительно меченными флуорофором антимикотоксин-антителами можно детектировать в виде изменения сигнала в эванесцентном поле.
Согласно изобретению идентификацию микотоксинов можно проводить и с помощью непрямого, конкурентного иммуноанализа. В этом случае можно иммобилизовать на чипе микотоксины или конъюгаты микотоксина, например, конъюгаты микотоксин-протеин, предпочтительно конъюгаты микотоксинВ8А. В том случае, когда на чип помещают экстракт анализируемой пробы в смеси с предпочтительно флуоресцентно маркированными антимикотоксин-антителами, происходит конкуренция иммобилизованных микотоксинов и микотоксинов, находящихся в растворе, в борьбе за доступные места присоединения на флуоресцентно маркированных антителах. Добавление флуоресцентно маркированных антимикотоксин-антител можно проводить перед или во время инкубации экстракта на чипе. Количество связанных маркированных антител в этом случае обратно пропорционально количеству микотоксинов, находящихся в экстракте.
Другое преимущество состоит в том, что детектирование сигнала в эвалесцентном поле можно проводить с помощью считывающего прибора. Считывающий прибор может быть, например, надежным и недорогим считывающим прибором.
Интерпретацию интенсивности сигнала, например интенсивности флуоресценции можно проводить с помощью компьютерной программы, так же можно проводить расчет количества микотоксинов, содержащихся в пробе.
Указанные преимущества способа согласно данному изобретению, в частности комбинация просто осуществляемых способов, возможность одновременной количественной идентификации нескольких микотоксинов на надежном и недорогом считывающем приборе, создают возможность простой и быстрой идентификации микотоксинов за пределами аналитической лаборатории.
Другим предметом изобретения является устройство для осуществления способа идентификации микотоксинов.
Устройство для осуществления способа идентификации микотоксинов состоит из тонкослойного волновода, предпочтительно плоского оптического волновода-биочипа, который базируется на тонкослойном волноводе, охватывающем первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем слой (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем слой (а). Опознавательные элементы предпочтительно иммобилизуют на слое (а).
Подходящие плоские оптические волноводы описаны, например, в \УО 01/92870 или в И8 5959292.
В предпочтительном варианте устройства оптически прозрачный слой (Ь) тонкослойного волновода, предпочтительно плоского оптического волновод-биочипа, образован из силикатов, таких как стекло или кварц, или из прозрачных пластмасс, предпочтительно выбираемых из группы, включающей поликарбонаты, полиимиды, полиметакрилаты, полистиролы, циклические полиолефины и сополимеры циклических полиолефинов, более предпочтительно циклические полиолефины или сополимеры циклических полиолефинов. Подходящие пластмассы для получения оптически прозрачного слоя (Ь) описаны, например, в \УО 03/020488.
Предпочтительны прозрачные термопластичные или напыляемые пластмассы, например, выбираемые из группы, включающей поликарбонат, полиимид, акрилат, в частности полиметилакрилат, или полистирол.
В предпочтительном варианте устройства оптически прозрачный волноводный слой (а) может состоять из оксидов, выбираемых из группы, включающей Т1О2, ΖηΟ, №2О5, Та2О5, НЮ2 и ΖτΟ2, предпочтительно выбирают из группы, включающей Т1О2, Та2О5 и №2О5. Возможны также комбинации нескольких оксидов такого рода. Предпочтителен оптически прозрачный волноводный слой (а), который образован из Т1О2, ΖηΟ, №2О5, Та2О5, НЮ2 или ΖιΌ;. более предпочтительно из Т1О2, Та2О5 или №2О5. В частности, оказалось, что более предпочтителен пентоксид тантала.
В предпочтительном варианте изобретения тонкослойный волновод охватывает, в частности, на оптически прозрачном слое волновода (а), содержащем оксиды, выбираемые из группы, включающей Т1О2, ΖηΟ, №2О5, Та2О5, НЮ2 и/или ΖιΌ;. один или много слоев органофосфорных кислот согласно формуле (I)
К-ОРО3Н2 (I) и/или органофосфоновых кислот согласно формуле (II)
В-РО3Н2 (II), и/или их солей, причем К означает (С10-С24)-алкил.
Предпочтительно применяют органофосфорные и/или органофосфоновые кислоты, более предпочтительно органофосфаты и/или органофосфонаты, с радикалом К, выбираемым из группы, включающей неразветвленные (С10-С20)-алкилы, более предпочтительно из группы, включающей неразветвленные
- 7 013337 (С12-С18)-алкилы, еще более предпочтительно додецилфосфорную кислоту, додецилфосфат, октадецилфосфонат и/или октадецилфосфоновую кислоту.
Предпочтительно органофосфорные кислоты, соответственно органофосфаты, применяют в виде растворимых в воде солей, которые могут наноситься в виде водного раствора на тонкослойный волновод.
В предпочтительном варианте изобретения органофосфорные кислоты и/или органофосфоновые кислоты, предпочтительно органофосфаты наносят в виде монослоя на тонкослойный волновод, предпочтительно на биочип с эванесцентным полем, более предпочтительно на плоский оптический волновод-биочип.
Монослой может быть нанесен в виде слоя со средством для адгезии на оптически прозрачный слой, образованный из оксидов. Предпочтительным образом органофосфорные кислоты и/или органофосфоновые кислоты могут взаимодействовать с опознавательными элементами, в частности, с присоединенными к несущим протеинам опознавательными элементами и усиливать присоединение опознавательных элементов к биочипу.
В предпочтительном варианте устройства органофосфорные кислоты и/или органофосфоновые кислоты, предпочтительно органофосфаты нанесены на тонкослойный волновод, предпочтительно на оптически прозрачный слой, образованный из оксидов, в виде слоя, способствующего адгезии. Слой, способствующий адгезии, может усиливать связь опознавательного элемента с тонкослойным волноводом или чипом.
Предпочтительно, чтобы слой, способствующий адгезии, имел толщину менее 200 нм, более предпочтительно менее 20 нм.
Предпочтительно вовлечение возбуждающего света в оптически прозрачный волноводный слой (а) происходит с использованием одной или нескольких решеточных структур.
Решеточная структура предпочтительно представляет собой рельефную решетку с любым профилем, например с прямоугольным, треугольным или полукруглым профилем, или представляет собой фазовую или объемную решетку с периодической модуляцией коэффициента преломления в существенной мере плоском оптически прозрачном слое (а). Структура решетки может также представлять собой дифракционную решетку с одинаковым периодом или мультидифракционную решетку. Структура решетки может проявлять пространственно варьирующуюся периодичность перпендикулярную или параллельную направлению распространения возбуждающего света вовлеченного в оптически прозрачный волноводный слой (а).
Предпочтительно, чтобы решеточные структуры, используемые для вовлечения возбуждающего света, имели период в интервале от 200 до 1000 нм, предпочтительно в интервале от 200 до 400 нм. Далее предпочтительно, чтобы глубина модуляции решетки находилась в интервале от 3 до 60 нм, предпочтительно в интервале от 10 до 40 нм. Предпочтительно, чтобы отношение глубины модуляции к толщине первого оптически прозрачного волноводного слоя (а) было равно или меньше 0,4. Также предпочтительно, чтобы модуляция коэффициента преломления как на граничной поверхности между слоем (а) и слоем (Ь), так и на граничной поверхности между слоем (а) и анализируемой средой была четко выраженной.
Предпочтительно, когда оптически прозрачный волноводный слой (а) имеет толщину в интервале от 40 до 1000 нм, более предпочтительно в интервале от 40 до 300 нм, еще более предпочтительно в интервале от 80 до 200 нм.
Различие коэффициентов преломления у слоя (а) и слоя (Ь) предпочтительно больше или равно 0,2, более предпочтительно больше или равно 0,5, еще более предпочтительно составляет около 0,56.
Длина волны возбуждающего света предпочтительно лежит в интервале от 300 до 1100 нм, более предпочтительно лежит в интервале от 300 до 800 нм, еще более предпочтительно лежит в интервале от 500 до 700 нм.
Подходящий возбуждающий свет может быть вовлечен через решеточную структуру, к которой в направлении распространения вовлеченного и через слой (а) ведомого света примыкает немодулированная область слоя (а) с находящимися на ней многочисленными областями измерения одного массива (аггау), на которых происходит идентификация различных микотоксинов. К ней может примыкать в направлении распространения вовлеченного света предпочтительно одна или несколько других решеточных структур с находящимися за ними областями измерения одного упорядочения. Альтернативно области измерения одного упорядочения или многих упорядочений могут находиться на модулированной области слоя (а).
Предпочтительно, чтобы каждой упорядоченной области измерения, находящейся в направлении распространения вовлеченного возбуждающего света, предшествовала специфическая для этой области решеточная структура для вовлечения (выделения) возбуждающего света, причем эти перпендикулярные к распространению вовлеченного света решеточные структуры могут быть сформированы специфически для отдельных областей или также простираться по всему тонкослойному волноводу в этом направлении.
Устройство может содержать большое число отдельных полей измерения. В предпочтительных ва
- 8 013337 риантах изобретения специфические и/или аффинные связывающие партнеры в качестве химических или биохимических опознавательных элементов в виде вплоть до 100000 измерительных полей или «спотс» с двухмерным положением, причем одно измерительное поле предпочтительно занимает площадь в интервале от 0,001 до 6 мм2, более предпочтительно в интервале от 0,1 до 1 мм2. Предпочтительно более 10, более предпочтительно более 50 измерительных полей нанесено на каждый квадратный сантиметр тонкослойного волновода или чипа.
Другим предметом изобретения являются набор для идентификации микотоксинов. Набор включает, как минимум, один тонкослойный волновод, включающий первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем слой (а), на котором пространственно раздельно иммобилизуются специфические и/или аффинные связывающие партнеры в качестве химического или биохимического опознавательного элемента для микотоксинов и/или одного связывающего партнера.
Набор далее может включать, как минимум, один реагент, который охватывает связывающий партнер и который предпочтительно маркирован. Набор может также включать несколько реагентов, предпочтительно маркированных связывающих партнеров, или реагент, содержащий смесь различных маркированных связывающих партнеров. Набор далее может включать буфер и/или растворитель, которые используются для осуществления идентификации по одному из предыдущих вариантов способа. Также может быть предусмотрено, что набор включает детектирующую единицу.
Набор применяют для быстрой идентификации микотоксинов.
Ниже приведен пример для иллюстрации данного изобретения.
Пример 1. Установление стандартной кривой для измерения зеараленона при непрямом, конкурентном иммуно-анализе на биочипе с эвалесцентным полем.
Берут семь биочипов (фирма ЦиахЦ, Лихтенштейн) с размерами 1x2 см, сделанных из стекла, на которое нанесена оптическая решетка с глубиной решетки 18 нм, снабженных слоем из пентоксида тантала толщиной 155 нм, и покрывают слоем октадецилфосфоновой кислоты, окуная в 500 мкМ раствор октадецилфосфоновой кислоты в н-гептан/изопропаноле в соотношении 9:1. Используя споттер типа ВюсЫр Аггауег (фирма Регкт Е1тег, Германия), наносят на биочип конъюгат зеараленона (ΖΕΑ) и альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота (Β8Α) (ΖΕΑ-Β8Α, соотношение ΖΕΑ:Β8Α = 50:1, изготовитель фирма Вюрите, Туллн, Австрия), а также маркированные красителем ΌλΕφΙιΙ 647 (фирмы Р1егсе, Германия) ΒδΑ-молекулы (ЭуЫдЫ 647-Β8Α). Споттинг-растворы содержат ОуЫдЫ 647-Β8Α в концентрации 5х10-4 мг/мл в ΡΒ8 (буферный раствор, содержащий 137 мМ ЫаС1, 2,8 мМ КС1, 10 мМ Иа2НРО4, 1,8 мМ КН2РО4, рН 7,4) с 0,1% Β8Α и 0,1% Т\тееп 20, конъюгат Β8Α-ΖΕΑ с концентрацией 0,5 мг/мл в РР8 с 0,1% Β8Α и 0,1% Тетееи 20. Пятна (κροΐδ) наносят на чип в виде новых альтернирующих рядов в каждом 10 ОуЫдй! 647-Β8Α-пятен и конъюгат ΒδΑ-ΖΕΑ-пятен в форме двух полей-множеств (Αγπ·ι\·5).
Пятна (κροΐδ) инкубируют в течение ночи при высокой влажности воздуха (40%), после этого биочипы обрабатывают в течение 4 ч 3-процентным раствором Β8Α в РРЛ На чипы наносят измерительные камеры, так что на каждом чипе образуются два поля (ΑΓΠ-ινδ) с раздельными реакционными камерами. Готовят водные растворы зеараленона с разными концентрациями в интервале от 0 до 31 мкг/л и добавляют к этим растворам моноклональные антизеараленон-антитела (фирма РюЮх. Берлин) которые маркированы ΌνΓφΙιΙ 647, таким образом, что в каждом случае получают 1 нМ раствор антител.
Смеси с различными концентрациями подают в каждом случае в измерительные камеры и биочипы, исключая дальнейшие стадии обработки, подвергают в течение, как максимум, 10 мин измерению на флуоресцентном считывающем устройстве М1П1Дио IV (фирмы Рауег Тесйио1о§у 8егу1се5, Германия). Полученные значения интенсивности флуоресценции для каждого пятна (спот) зеараленона делят на среднее значение интенсивности флуоресценции пятен ОуЫдй! 647-Β8Α, находящихся над и под каждым пятном зеараленона. Определяют средние значения интенсивностей флуоресценции для всех 40 пятен одного поля-множеста (Αϊτήν). Полученные концентрационно зависимые интенсивности флуоресценции с помощью компьютерной программы Опдш 70 (фирмы Опдш ЬаЬ СотротаНои, США) обрабатывают сигмоидальной подгонкой.
Было установлено, что в интервале от 0,4 до 4 млрд долей зеараленона, соответственно 80 или 20% максимальной интенсивности флуоресценции в подогнанной сигмоидальной кривой, соответственно в интервале от 1 до 10 нМ использованной концентрации зеараленона в растворе возможно количественное определение концентрации зеараленона в результате обработки интенсивности флуоресценции проб.
Пример 2. Установление стандартной кривой для измерения деоксиниваленола (ООИ) и измерение загрязненной пробы зерна кормовой пшеницы.
Берут 15 биочипов (фирма Циахщ, Лихтенштейн) с размерами 1x2 см, сделанных из стекла, на которое нанесена оптическая решетка (глубина решетки 18 нм), снабженных слоем из пентоксида тантала (толщина 155 нм), и покрывают слоем октадецилфосфоновой кислоты (окуная в раствор октадецилфосфоновой кислоты в н-гептан/изопропаноле в соотношении 9:1). Используя споттер типа Маиор1ойет (фирмы Ое81М, Германия), наносят конъюгат деоксиниваленола и альбумина сыворотки крови крупного
- 9 013337 рогатого скота (ΌΟΝ-ВБЛ, отношение ΌΘΝ:Β§Ά = 100:1, изготовленный фирмой Вюрцге, Ти11п, Австрия), а также йод-1дС (фирмы йод-1дС. Коск1апй, США) на биочип. Споттинг-растворы содержат йод-Ю в концентрации 0,2 мг/мл в РВ8 (137 мМ №С1, 2,8 мМ КС1, 10 мМ Να2ΗΡΟ4, 1,8 мМ КН2р04, рН 7,4) с трегалозой, а также конъюгат ΌΟΝ-ВБА в концентрации 1 мг/мл в РВ8 с трегалозой. Пятна наносят на чип в виде двух рядов в каждом по 12 пятен йодЭдС и лежащего между ними ряда из 12 пятен конъюгата ΌΟΝ-ВБА в форме двух полей-множеств (Аггаук).
Пятна инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С, после этого биочипы обрабатывают в течение 4 ч раствором В8А в РВ8. На чипы наносят измерительные камеры, так что на каждом чипе образуются два множества (Аггаук) с раздельными реакционными камерами. Проводят экстракцию встряхиванием 5 г незараженной пшеничной муки 70-процентным раствором метанола в воде (об./об.). Экстракт центрифугируют и в заключение разбавляют трис-цитратным буфером (рН 7,4), который содержит В8А, казеин, обезжиренный порошок сухого молока, Тетееп 20, полиэтиленгликоль и сукрозу, в соотношении 1:4 об./об. (экстракт : буфер). Приготавливают растворы деоксиниваленола с различной концентрацией (от 15 до 150 мкг/л) и добавляют к этим растворам моноклональные анти-деоксиниваленол-антитела, которые маркированы БуЫдЫ 647, а также моноклональные 21еде-Ап11-0од-1дС-антитела, которые также маркированы БуЫдЫ 647, таким образом, что в каждом случае получают 1 нМ раствор антител.
Растворы с различными концентрациями подают в каждом случае в измерительные камеры и биочипы, исключая дальнейшие стадии обработки, подвергают в течение как максимум 10 мин измерению на флуоресцентном считывающем устройстве М1пгПио IV (фирмы Вауег Тес1по1оду Бегуюек, Германия). Полученные значения интенсивности флуоресценции для каждого пятна деоксиниваленола делят на среднее значение интенсивности флуоресценции пятен Бод-ЕдС БуЬ1дй1, находящихся над и под каждым пятном деоксиниваленола. Определяют нормированные средние значения интенсивностей флуоресценции для всех 12 ΒΟΝ-пятен одного поля-множества (Аггау). Полученные концентрационно зависимые нормированные интенсивности флуоресценции с помощью компьютерной программы обрабатывают потенциальной подгонкой.
Аналогично описанному выше способу экстракции, экстрагируют пробу из 5 г муки из зерна кормовой пшеницы с ΌΟΝ-заражением (фирмы Соппд, Германия, сертифицировано ΌΟΝ-содержание 526 млрд. долей) и разбавляют экстракт. К 300 мкл разбавленного экстракта добавляют моноклональные антидеоксиниваленол-антитела, которые маркированы БуЬ1дй1 647, а также моноклональные 21еде-Апййод-1дС-антитела, которые также маркированы БуЫдЫ 647, таким образом, что в каждом случае получают 1 нМ раствор антител. В каждом случае подают 100 мкл раствора в измерительные камеры и биочипы, исключая дальнейшие стадии обработки, подвергают в течение, как максимум, 10 мин измерению на флуоресцентном считывающем устройстве М1пгПио IV (фирмы Вауег Тес1по1оду Бегуюек, Германия). Полученные значения интенсивности флуоресценции для каждого пятна деоксиниваленола делят на среднее значение интенсивности флуоресценции пятен йод-1дС БуЬ1дй1, находящихся над и под каждым пятном деоксиниваленола. Определяют нормированные средние значения интенсивностей флуоресценции для всех 12 ΒΟΝ-пятен одного поля-множества (Аггау). Полученные интенсивности флуоресценции пересчитывают с помощью описанной выше стандартной кривой в ΌΟΝ-концентрации в муке из зерна кормовой пшеницы, причем среднее значение в случае трех измерений дает величину в 590 млрд долей.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ быстрой идентификации микотоксинов, который включает следующие стадии:
    a) приготовление тонкослойного волновода, включающего первый оптически прозрачный волноводный слой (а) на втором оптически прозрачном слое (Ь), причем (Ь) имеет более низкий коэффициент преломления, чем (а), на котором пространственно раздельно иммобилизируются специфические и/или аффинные связывающие партнеры в качестве химического или биохимического опознавательного элемента для микотоксинов и/или одного связывающего партнера,
    b) нанесение пробы, содержащей митотоксин(ы) и связывающие партнеры, на иммобилизированные связыващие партнеры на тонкослойном волноводе,
    c) детектирование эванесцентной компоненты излучения, возникающей при взаимодействии находящихся на тонкослойном волноводе иммобилизированных связывающих партнеров с микотоксинами пробы и/или со связывающими партнерами,
    й) определение количества микотоксина(ов), находящегося (находящихся) в пробе.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на тонкослойный волновод наносят один или несколько слоев органофосфорных кислот согласно формуле (I)
    К-0РО3Н2 (I) и/или органофосфоновых кислот согласно формуле (II)
    Р-РО3Н2 (II), и/или их солей, где К означает (Сю-С24)алкил.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что применяют органофосфорные кислоты, органофос- 10 013337 фоновые кислоты, органофосфаты и/или органофосфонаты с радикалом К, выбираемым из группы, включающей неразветвленные (Сю-С2о)алкилы, предпочтительно из группы, включающей неразветвленные (С|2-С|Х)алкилы. более предпочтительно органофосфорные кислоты, органофосфоновые кислоты, органофосфаты и/или органофосфонаты из группы, включающей додецилфосфорную кислоту, додецилфосфат, октадецилфосфонат и октадецилфосфоновую кислоту.
  4. 4. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что волноводный слой (а) включает оксиды, выбираемые из группы, включающей ΤίΟ2, ΖηΟ, Ν62Ο5, Та2О5, ΗίΌ2 и ΖτΟ2, предпочтительно выбираемые из группы, включающей Т1О2, Та2О5 и Ν62Ο5.
  5. 5. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что присоединяемые партнеры выбирают из группы, которая включает антимикотоксин-антитела, конъюгаты антимикотоксин-антител, микотоксины, конъюгаты микотоксинов, фрагменты антимикотоксин-антител, пептиды, связывающие микотоксины, антикалины, связывающие микотоксины, аптамеры, связывающие микотоксины, зеркальные изомеры, связывающие микотоксины, и привитые полимеры, связывающие микотоксины, предпочтительно выбирают из группы, которая включает антимикотоксин-антитела, конъюгаты антимикотоксин-антител, микотоксины и конъюгаты микотоксинов.
  6. 6. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что к микотоксинам присоединяют маркирующий элемент, предпочтительно флуорофор, с помощью протеина, предпочтительно альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота.
  7. 7. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что проба представляет собой продукт питания человека или животных, предпочтительно выбираемый из группы, которая включает зерно, вино, соки, фрукты и продукты, содержащие зерно, вино, соки и фрукты, или экстракты пищевых продуктов, или продукты, экстрагированные в растворителе или смеси растворителей.
  8. 8. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что пробу инкубируют менее чем за |5 мин, предпочтительно менее чем за |о мин до детектирования сигнала вместе с иммобилизованным связывающим партнером, в качестве химического или биохимического опознавательного элемента, на тонкослойном волноводе и/или на связывающих партнерах.
  9. 9. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что микотоксины выбирают из группы, включающей афлатоксины, охратоксины, алкалоиды спорыньи, патулин и фузарийтоксины, например, выбираемые из группы, включающей деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, охратоксин А и фумонисины, предпочтительно выбираемые из группы, включающей охратоксин А, деоксиниваленол, ниваленол, зеараленон, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, фумонисин В1, фумонисин В2 и фумонисин В3.
  10. 10. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что идентификацию микотоксинов в экстрактах зерна осуществляют в интервале от 0,1 пМ до 100 нМ микотоксина, предпочтительно в интервале от 1 пМ до 1 нМ микотоксина.
  11. 11. Способ по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что идентификацию осуществляют в форме иммуноанализа, предпочтительно конкурентного иммуноанализа, более предпочтительно в форме непрямого, конкурентного иммуноанализа.
EA200801588A 2005-12-23 2006-12-13 Способ быстрой идентификации микотоксинов EA013337B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005062377A DE102005062377A1 (de) 2005-12-23 2005-12-23 Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Mykotoxinen
PCT/EP2006/012000 WO2007079893A1 (de) 2005-12-23 2006-12-13 Vorrichtung und verfahren zum nachweis von mykotoxinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801588A1 EA200801588A1 (ru) 2008-12-30
EA013337B1 true EA013337B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=37909504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801588A EA013337B1 (ru) 2005-12-23 2006-12-13 Способ быстрой идентификации микотоксинов

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20090081808A1 (ru)
EP (1) EP1966594B1 (ru)
JP (1) JP2009520956A (ru)
KR (1) KR101232499B1 (ru)
CN (1) CN101384896A (ru)
AR (1) AR058616A1 (ru)
AU (1) AU2006334802B2 (ru)
BR (1) BRPI0620376A2 (ru)
CA (1) CA2634559A1 (ru)
CR (1) CR10087A (ru)
DE (1) DE102005062377A1 (ru)
DK (1) DK1966594T3 (ru)
EA (1) EA013337B1 (ru)
ES (1) ES2400919T3 (ru)
PL (1) PL1966594T3 (ru)
PT (1) PT1966594E (ru)
UA (1) UA97792C2 (ru)
WO (1) WO2007079893A1 (ru)
ZA (1) ZA200805457B (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102460127A (zh) * 2009-04-09 2012-05-16 拜尔农作物科学股份公司 用于识别和定量分析被分析物，特别是真菌毒素的装置和方法
DE102009016712A1 (de) 2009-04-09 2010-10-14 Bayer Technology Services Gmbh Einweg-Mikrofluidik-Testkassette zur Bioassay von Analyten
WO2011023230A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-03 Foss Analytical Ab Method of extracting mycotoxins from cereal grains
CN101666752B (zh) * 2009-09-29 2011-07-20 济南大学 一种糖基功能化细菌毒素分子印迹柱的制备方法及应用
JP5840845B2 (ja) * 2011-02-25 2016-01-06 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 危害要因定量方法、危害要因定量装置、および、プログラム
ITMO20110109A1 (it) * 2011-05-11 2012-11-12 Generon S R L Metodo per l'analisi di aflatossine nel latte e nei derivati del latte
CN102279268A (zh) * 2011-07-29 2011-12-14 上海交通大学 同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法
CN102517290A (zh) * 2011-11-25 2012-06-27 国家纳米技术与工程研究院 伏马毒素b2核酸适体及其应用
CN102443585A (zh) * 2011-11-25 2012-05-09 国家纳米技术与工程研究院 玉米赤霉烯酮核酸适体及其应用
EP2810070B1 (en) * 2012-02-03 2020-04-01 Charm Sciences Inc. Extraction of mycotoxins
JP5731016B2 (ja) * 2012-04-27 2015-06-10 キリン株式会社 リガンドを高感度に検出する核酸分子並びに該核酸分子のスクリーニング方法および該核酸分子の感度の最適化方法
CN103743913B (zh) * 2014-01-23 2015-07-08 福建农林大学 快速鉴定与黄曲霉毒素b1互作的宿主蛋白的方法
CN104293793B (zh) * 2014-07-24 2018-05-18 江南大学 一种特异识别t-2毒素的寡核苷酸适配体
FR3028318A1 (fr) * 2014-11-12 2016-05-13 Phuong Lan Tran Procede et dispositif de tri selectif, specifique et simultane de cellules rares cibles dans un echantillon biologique
CN104593374B (zh) * 2015-03-02 2017-05-17 江南大学 一种特异识别棒曲霉素的寡核苷酸适配体
WO2016182589A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Waters Technologies Corporation Composition and methods for extracting mycotoxins
KR102042661B1 (ko) * 2015-08-06 2019-11-08 광주과학기술원 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법
DE202016106024U1 (de) 2016-10-26 2016-11-08 Matthias Godejohann Vorrichtung zur Halterung zu einer Halbleiterplatte
CN108614054A (zh) * 2016-12-12 2018-10-02 北京农学院 基于聚苯乙烯-二乙烯苯树脂为载体的真菌毒素免疫亲和柱的制备方法
CN108490169B (zh) * 2018-03-27 2021-09-03 广东一家人食品有限公司 一种米粉中真菌毒素的双水相萃取联合酶联免疫检测的方法
MX2021015837A (es) * 2019-07-03 2022-02-03 Intervet Int Bv Desoxinivalenol conjugado para proteger contra micotoxicosis.
JP7387524B2 (ja) 2020-04-06 2023-11-28 Ｔｉａｎｍａ Ｊａｐａｎ株式会社 蛍光を用いた免疫分析法で測定するための試料溶液の調製方法、測定用セル、測定キットおよび試料溶液の調製装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043552A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Ut-Battelle, Llc Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use
WO2002020873A2 (de) * 2000-09-05 2002-03-14 Zeptosens Ag Verfahren zur abscheidung von mono- und mehrfachschichten von organophosphor- und -phosphonsäuren und deren salzen sowie deren verwendung

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US5178832A (en) * 1987-09-28 1993-01-12 The Texas A&M University System Selective immobilization and detection of mycotoxins in solution
US5429952A (en) * 1988-02-02 1995-07-04 Biocode, Inc. Marking of products to establish identity and source
US5814565A (en) * 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
WO1999040415A1 (de) * 1998-02-05 1999-08-12 Novartis Ag Verfahren und vorrichtung zur lumineszenzmessung
AU2001274068A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-11 Zeptosens Ag Kit and method for determining a plurality of analytes
US6812380B2 (en) * 2001-03-27 2004-11-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of zearalenone detoxification
JP4203826B2 (ja) * 2003-09-29 2009-01-07 独立行政法人産業技術総合研究所 自動分析方法及び装置
US20060210425A1 (en) * 2005-03-21 2006-09-21 Laura Mirkarimi Inorganic coatings for optical and other applications

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043552A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Ut-Battelle, Llc Multifunctional and multispectral biosensor devices and methods of use
WO2002020873A2 (de) * 2000-09-05 2002-03-14 Zeptosens Ag Verfahren zur abscheidung von mono- und mehrfachschichten von organophosphor- und -phosphonsäuren und deren salzen sowie deren verwendung

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIGLER FRANCES S. ET AL.: "Array biosensor for detection of toxins." ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY OCT 2003, vol. 377, no. 3, October 2003 (2003-10), pages 469-477, XP002430514 ISSN: 1618-2642 the whole document *
MARK J FELDSTEIN ET AL.: "Array Biosensor: Optical and Fluidics Systems" BIOMEDICAL MICRODEVICES, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, vol. 1, no. 2, 1 December 1998 (1998-12-01), pages 139-153, XP019205048 ISSN: 1572-8781 page 139, column 2, paragraph 3 - page 141, column 2, paragraph 1 *
NGUNDI MIRIAM M. ET AL.: "Array biosensor for detection of ochratoxin A in cereals and beverages." ANALYTICAL CHEMISTRY 1 JAN 2005, vol. 77, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 148-154, XP002430515 ISSN: 0003-2700 cited in the application the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
US20090081808A1 (en) 2009-03-26
AU2006334802B2 (en) 2013-03-14
CA2634559A1 (en) 2007-07-19
EP1966594B1 (de) 2013-01-23
EP1966594A1 (de) 2008-09-10
AR058616A1 (es) 2008-02-13
PT1966594E (pt) 2013-03-13
UA97792C2 (ru) 2012-03-26
KR20080083682A (ko) 2008-09-18
BRPI0620376A2 (pt) 2011-11-08
WO2007079893A1 (de) 2007-07-19
DE102005062377A1 (de) 2007-06-28
ES2400919T3 (es) 2013-04-15
EA200801588A1 (ru) 2008-12-30
PL1966594T3 (pl) 2013-06-28
DK1966594T3 (da) 2013-04-15
KR101232499B1 (ko) 2013-02-12
CR10087A (es) 2009-01-27
JP2009520956A (ja) 2009-05-28
CN101384896A (zh) 2009-03-11
AU2006334802A1 (en) 2007-07-19
ZA200805457B (en) 2010-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013337B1 (ru) Способ быстрой идентификации микотоксинов
US5219763A (en) Agglutination method for the determination of multiple ligands
Zherdev et al. Ways to reach lower detection limits of lateral flow immunoassays
US20210072237A1 (en) Method and device for determining biological analytes
US20120316077A1 (en) System And Method For Detection And Analysis Of A Molecule In A Sample
JP7017310B2 (ja) スポットに分析方法を実行するための対照マーカー
KR101451733B1 (ko) 아플라톡신 ｂ1 검출용 표지물질 및 이를 포함한 아플라톡신 ｂ1 검출용 키트
WO2011032278A1 (en) A method and apparatus for lateral flow determination of analyte concentration
US9146233B2 (en) Detecting molecular interactions by fluorescence resonance energy transfer on a solid-phase support
KR100908641B1 (ko) 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지혈액 단백질의 분석방법
Çimen et al. Proteomic applications of plasmonic sensors
WO2006062427A1 (fr) Procede de detection quantitative de toxines biologiques
MX2008008004A (en) Device and method for identifying mycotoxins
CN111770955B (zh) 包含非共价连接的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜
WO2009040364A1 (en) Multiparameter assay
RU2320994C1 (ru) Способ количественного обнаружения биологических токсинов
CN117881963A (zh) 用于同时检测多种分析物的系统
WO2024137691A2 (en) Fluorescent immunoassays enhanced using plasmonic nanostructures
RU2519023C2 (ru) Способ детектирования концентрации аналита с широким динамическим диапазоном
Abbas Recent Developments in Immunochemical Methods
BG66582B1 (bg) Имунофлуоресцентен метод за определяне концентрацията на веще­ ства с малка молекулна маса

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ RU