JP2009519704A - うつを診断および処置するためのｆｇｆ２関連方法 - Google Patents

うつを診断および処置するためのｆｇｆ２関連方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、双極性障害、大うつ病障害、および精神分裂症を含めた気分障害の治療および診断に関する。本発明は、新規の診断的マーカーおよび分析、ならびに精神病を患う患者を治療するのに有用である薬剤および化合物の開発および発見のための研究ツールを提供する。本発明はまた、本発明の方法を実施するために、また、さらなる診断方法を開発するために、有用な組成物、ならびに精神病の治療を助けるための新規の治療薬を提供する。

Description

（関連出願の引用）
米国仮特許出願第６０／７３６，５２６号（２００５年１１月１２日出願）、および米国仮特許出願第６０／８２９，５１６号（２００６年１０月１３日出願）の優先権を主張する。
（連邦政府の資金援助を受けた研究および開発に対する権利に対する宣言）
本明細書中に記載される本発明の一定の実施形態は、米国政府の支援（Ｃｏｎｔｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｇｒａｎｔ（ＮＩＭＨ）Ｌ９９ＭＨ６０３９８）によって開発された。したがって、米国政府は、本発明の一定の実施形態に対する権利を有し得る。
（発明の背景）
双極性障害および大うつ病障害を含めた臨床的うつ病は、重大な公衆衛生的問題であり、毎年米国の成人人口の約９．５％が罹患する。大うつ病（「ＭＤＤ」）および双極性障害（「ＢＰ」）などの気分障害、ならびに精神分裂症などの精神病性障害を含めた精神病は、遺伝子的原因を有する可能性があることが仮定されているが、複合的な遺伝子起源を有する多くの疾患にも当てはまるように、こうした疾患を引き起こす役割を果たす遺伝子配列および遺伝子産物を確認することは、ほとんど進歩していない（非特許文献１を参照のこと）。
現在のバイオマーカーの欠如、および診断の無効性および信頼性、および料金は、精神障害の治療に重要な問題である。例えば、人口の約１５％は、ＭＤＤを患うのに対して、約１％は、ＢＰ障害を患う。患者が臨床医に、うつ病の症状のみを示すだけでは、時として発生する双極性障害を診断することは困難である。ＢＰ患者の少なくとも１０〜１５％は、ＭＤＤと誤診されることが報告されている。こうした誤診の結果として、気分安定薬を用いた有効な治療の導入への遅延、双極性障害に対する特別なカウンセリングを求めるあるいは受けることへの遅延が挙げられる。また、抗うつ薬単独を用いる治療は、速いサイクルの躁または混合状態への転換を誘発し、その結果として、自殺の危険度を増す。さらに、効力の欠如、作用の開始の遅さ、および副作用（性的なもの、眠気、体重増加など）に加えて、最近、糖尿病および過コレステロール血症などの代謝症候群に対する、抗うつ薬の望ましくない作用に関する懸念が存在する。
Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４５：５２２−５３２（１９９９）
特に、患者の生理学的および／または遺伝子的状況が、特定の治療計画に対する患者の応答に関連する可能性があるので、うつ状態あるいは自殺の可能性がある患者の生理学的および／または遺伝子的状況について、正確で客観的な情報を得る方法が必要であることは明らかである。
（発明の概要）
本発明は、様々な精神病の診断および検出のための新規の分析を提供する。精神障害に関連する様々な遺伝子の発現のレベルを検出するための分析を含む、この分析によって、専門家は、対象における精神病のより正確な診断を得ることができ、また、専門家は、様々な精神病と、関連する病態とを区別することができる。本発明はまた、本発明の方法を実施するために、また、さらなる診断方法を開発するために有用な組成物、ならびに精神病の治療を助けるための新規の治療薬を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２スプライスバリアントの発現をＭＤＤと相関させる方法を提供する。ＭＤＤ、ＢＰ、および精神病性障害（分裂情動障害または精神病性うつ病など）の間の関係の理由で、本明細書に記載するスプライスバリアントは、ＭＤＤに特有であり、ＭＤＤの鑑別診断、治療、および予防のために使用することができる。
別の実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２、ＮＣＡＭペプチドミメティクス、およびＦＧＦ受容体のペプチドインヒビターをラットに注射することによって、ラットの行動のプロフィールを変えるための方法を提供する。脳室内に注入される場合、ＦＧＦ２とＮＣＡＭペプチドミメティクスは両方とも、強制水泳試験における抗うつ薬様効果を有する。本明細書に示す説明および実施例は、ペプチドインヒビターの存在が、効果を逆転させることを示す。本発明の一実施形態では、ＦＧＦ受容体を作動させるリガンドは、ＭＤＤを患う個人の治療において、その抗うつ薬効果のために使用される。
別の実施形態では、本発明は、扁桃における一連の自殺関連遺伝子（表１Ａおよび表１Ｂ）と、これらの１つ以上の遺伝子の発現を自殺傾向と相関させるための方法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、自殺、すなわちＭＤＤ患者における物質乱用を伴う合併症に関連する一組の遺伝子（表１Ｃ）、ならびに、これらの１つ以上の遺伝子を検出する方法、これらの遺伝子を該当する患者における自殺の危険と相関させる方法、ならびに自殺を望んでいるあるいは自殺を望むようになる可能性があると特定される個人を治療する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明はまた、特定のリチウム応答性遺伝子（表２Ａおよび表２Ｂ）の差次的な発現を双極性感情障害と相関させる方法を提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２を用いて出生後早期に動物を治療することによって、大人の動物の記憶および学習能力を増大させるための方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２を用いて出生後早期に動物を治療することによって、活性なＦＧＦ２を欠く動物における記憶および学習障害を治療するための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象における気分障害の診断を容易にするための、以下のステップを含む方法を提供する；（ｉ）図５、図６、図７、図８、表１、表２Ｂ、表３、および／または表４に記載される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現のレベルを測定するステップ、（ｉｉ）この遺伝子が、対照と比較して異常調節されているかどうか決定するステップ（ただし、遺伝子の調節異常は、対象が気分障害を患う可能性の増大を示す）、および（ｉｉｉ）可能性の増大に関して任意の発見を記録または報告する、すなわち対象が気分障害を患う可能性の増大が存在するかしないかを報告するステップ。
関連する実施形態では、問題となる気分障害は、双極性障害であり、調節異常が分析される遺伝子は、図５、図７、図８、表２Ｂ、および／または表４に記載される遺伝子からなる群から選択される。別の関連する実施形態では、気分障害は、大うつ病障害であり、その遺伝子は、図６、図８、表１、および／または表３中に記載される遺伝子からなる群から選択される。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の、さらに別の関連する実施形態では、検出および測定される遺伝子調節異常は、対象の脳に起こる。さらに別の関連する実施形態では、調節異常が生じる脳組織は、青斑核、背側縫線、前部帯状皮質、背外側前頭前野、海馬、および扁桃体からなる群から選択される。さらに別の関連する実施形態では、遺伝子調節異常は、観察される遺伝子発現が、脳に見られる遺伝子発現を反映する細胞（例えばリンパ球）において検出される。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の、さらに別の関連する実施形態では、遺伝子発現の調節異常は、当該の遺伝子（単数または複数）から転写されるメッセンジャーＲＮＡを検出することによって分析される。さらに別の関連する実施形態では、遺伝子発現は、当該の遺伝子（単数または複数）のタンパク質産物を選択的に、直接的または間接的に検出することによって分析される。さらに別の関連する実施形態では、当該の遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡを検出することは、（ｉ）前記ｍＲＮＡを、前記メッセンジャーＲＮＡと選択的に結びつく試薬と接触させるステップと、（ｉｉ）前記ｍＲＮＡと選択的に結びつく前記試薬のレベルを検出するステップを含む。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の、別の関連する実施形態では、当該の遺伝子の発現の測定レベルは、気分障害を伴わないヒトに伴われるレベルよりも高い。さらに別の関連する実施形態では、該遺伝子の発現のレベルは、気分障害を伴わないにヒトに伴われるレベルよりも低い、すなわち、該遺伝子は、気分障害を患う対象において下方調節される。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の、別の関連する実施形態では、遺伝子の発現のレベルは、マイクロアレイ分析を使用して検出され、ここでは前記遺伝子は、マイクロアレイ上の少なくとも２つの遺伝子のうちの１つである。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の他の実施形態では、遺伝子は表１から選択され、かつ、気分障害は自殺性（ｓｕｉｃｉｄａｌ）である。関連する実施形態では、対象は、自殺行動の可能性の増大を伴う気分障害とあらかじめ診断されている。さらに別の関連する実施形態では、対象は、大うつ病、双極性障害、および精神分裂症からなる群から選択される気分障害とあらかじめ診断されている。さらに別の関連する実施形態では、この方法は、対象による自殺未遂の可能性を低下させる、対象のための治療を指示することをさらに含む。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の他の実施形態では、対象は、双極性障害と大うつ病性障害の両方の症状を有し、当該の遺伝子は、双極性障害の対象では、大うつ病障害の対象とは違うように発現され、それによって、前記対象における双極性障害または大うつ病性障害の診断が容易になる。
対象における気分障害の診断を容易にするための方法の他の実施形態では、当該の遺伝子は、薬物乱用者でないＭＤＤ対象に対して、薬物を乱用するＭＤＤ対象では異常調節され、当該の遺伝子は、表１Ｃに記載される異常調節された遺伝子から選択され、それによって、薬物乱用に伴うＭＤＤの診断に対する、ＭＤＤの診断が容易になる。
別の実施形態では、本発明は、気分障害の治療または予防のための化合物を同定する、以下のステップを含む方法を提供する：（ｉ）化合物を、図５、図６、図７、図８、表１、表２Ｂ、表３、および表４に記載される異常調節された遺伝子の群から選択される異常調節された遺伝子に相当するポリペプチドまたはポリヌクレオチドと接触させるステップと、（ｉｉ）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対するこの化合物の機能効果（例えば活性の抑制または増大）を決定し、それによって、気分障害の治療または予防のための化合物を同定するステップ。関連する実施形態では、接触ステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。さらに別の関連する実施形態では、ポリペプチドは細胞中に発現され、細胞が化合物と接触される。さらに別の関連する実施形態では、気分障害は、双極性障害、大うつ病障害、自殺性、および薬物乱用合併症からなる群から選択される。さらに別の関連する実施形態では、この方法は、同定されたあるいは候補となる化合物を動物に投与することと、動物に対する効果を決定すること（例えば、動物の精神的健康および行動の表現型に対する効果を決定すること）をさらに含む。
別の実施形態では、本発明はまた、治療有効量のポリペプチド（該ポリペプチドは、表１または表２に記載される遺伝子に相当するポリヌクレオチドによってコードされる）を対象に投与するステップを含む、自殺の傾向がある対象を治療する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明はまた、対象が、不安または不安を伴う病気と診断された後、十分な量のＦＧＦ２ペプチドを対象に投与するステップを含む、対象（例えばマウス、ネコ、イヌ、ウマ、またはヒトなどの動物）における不安の症状を治療する方法を提供する。関連する実施形態では、対象は、ヒトである。別の関連する実施形態では、ＦＧＦ２の十分な量は、少なくとも１週間の長さにわたって少なくとも週２回投与される量である。さらに別の関連する実施形態では、治療される病気は、大うつ病または大うつ病性障害である。
別の実施形態では、本発明は、慢性のストレスを患うヒトを診断するための、以下を含む方法を提供する；ａ）対象から核酸サンプルを得ること；ｂ）ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される発現された遺伝子のエキソンＩＩＩｂ：ＩＩＩｃスプライスバリアント比を決定すること。ここでは、比が１０未満であれば、前記ヒトが慢性のストレスを患う可能性の増大に関連する。関連する実施形態では、該遺伝子は、ＦＧＦＲ２である。別の関連する実施形態では、該遺伝子は、ＦＧＦＲ３である。別の関連する実施形態では、この方法は、この方法を使用して慢性のストレスと診断されたヒトに対して薬理学的な治療を施すことをさらに含む。
別の実施形態では、本発明は、生きている動物においてＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される発現された遺伝子のエキソンＩＩＩｂ：ＩＩＩｃスプライスバリアント比を変化させる化合物を同定するための、以下を含む方法を提供する：ａ）慢性のストレスを患う少なくとも１つの動物を特定すること；ｂ）前記少なくとも１つの動物においてエキソンＩＩＩｂ：ＩＩＩｃスプライスバリアント比を測定すること；ｃ）前記少なくとも１つの動物に試験化合物を投与すること；ｄ）前記試験化合物の投与の後、二回目のスプライスバリアント比の測定を行うこと；前記測定によってスプライスバリアント比が増大されることが示される場合、試験化合物の同一性を記録すること。
別の実施形態では、本発明は、グリア輸送体（ｇｌｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン合成酵素、ＡＭＰＡ、カイニン酸、ＧＲＭ１、およびＧＲＭ７からなる群から選択される分子を標的にする十分な量の化合物を対象に投与することを含む、グルタミン酸作動性の不均衡（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｉｍｂａｌａｎｃｅ）を患う対象を治療するための方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＴｒｋＢ受容体、または増殖ホルモン受容体を標的にする、あるいは、ＦＧＦ２の作用を模倣する十分な量の化合物を対象に投与することを含む、ＭＤＤを患う対象における神経突起伸張を増大させるための方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象のＬＣ領域における遺伝子発現のレベルを決定するステップを含む、ＭＤＤを患う対象における全体的なグリアの変化を検出するための方法を提供する。ここでは、レベルが調べられる少なくとも１つの遺伝子は、表３のグリアマーカー遺伝子の群から選択されるグリアマーカー遺伝子である。
さらに別の実施形態では、本発明は、ヒトの対象においてＢＰとＭＤＤとを区別するための、以下を含む方法を提供する：ａ）前記対象のＤＲ組織において少なくとも１つのＭＤＤ−またはＢＰ−特異的な遺伝子の発現のレベルを測定すること（ここでは、前記ＭＤＤ−またはＢＰ−特異的な遺伝子は、表４に記載されるＭＤＤ−またはＢＰ−特異的な異常調節された遺伝子から選択される）；ｂ）前記対象がＢＰよりもＭＤＤを患う可能性が高いことを特定すること（ここでは、表４のＭＤＤ−特異的な遺伝子の下方調節は、前記対象におけるＭＤＤの可能性の増大と相関し、表４のＢＰ−特異的な遺伝子の下方調節は、前記対象におけるＢＰの可能性の増大と相関する。関連する実施形態では、この方法は、ＢＰまたはＭＤＤを発症するリスクを記録または報告することをさらに含む。関連する実施形態では、このリスクは、医師に、あるいは対象に報告される。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＢＰまたはＭＤＤのリスクが増大されたヒトの対象を特定するための、以下を含む方法を提供する：（ｉ）表３に記載される遺伝子から選択される異常調節された遺伝子の発現のレベルを測定すること；（ｉｉ）前記測定を、前記対象におけるＢＰまたはＭＤＤのリスクの増大と相関させること。関連する実施形態では、この方法は、ＢＰまたはＭＤＤを発症するリスクを記録または報告することをさらに含む。関連する実施形態では、このリスクは、医師に、あるいは対象に報告される。
さらに別の実施形態では、本発明は、対象における大うつ病障害の診断を容易にするための、以下のステップを含む方法を提供する：（ｉ）ＦＧＦＲ２エキソン１１に対するＦＧＦＲ２エキソン５の発現の比を測定するステップと、（ｉｉ）前記比が、対照よりも低いかどうか決定するステップ（ここではより低い比は、前記対象が大うつ病障害を患う可能性の増大を示す）と、（ｉｉｉ）前記可能性の増大に関して任意の発見を記録または報告するステップ。関連する実施形態では、発現の比は、前記対象の背外側前頭前野における比である。
別の実施形態では、本発明は、対象における大うつ病障害の診断を容易にするための、以下のステップを含む方法を提供する：（ｉ）ＦＧＦＲ２エキソン９の発現を測定するステップと、（ｉｉ）前記発現が対照より低いかどうか決定するステップ（ここではより低いレベルの発現は、前記対象が大うつ病障害を患う可能性の増大を示す）と、（ｉｉｉ）前記可能性の増大に関して任意の発見を記録または報告するステップ。関連する実施形態では、発現は、前記対象の背外側前頭前野におけるものである。
別の実施形態では、本発明は、動物における記憶力を向上させるための方法であって、前記動物にＦＧＦ２を投与することを含む方法を提供する。関連する実施形態では、動物は、げっ歯類、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類、またはヒトであり、さらに別の関連する実施形態では、投与は、前記動物の出生後４８時間以内に行われ、別の関連する実施形態では、ＦＧＦ２は、皮下に投与される。さらに別の関連する実施形態では、ＦＧＦ２は、２０ｎｇ／ｇ（体重）で投与される。さらに別の関連する実施形態では、本発明は、ＦＧＦ２を用いて治療されるヒト以外の動物、例えばげっ歯類を提供し、関連する実施形態では、動物は、あらかじめ治療されなかった成体の動物と比較して記憶力が向上した、ＦＧＦ２を用いてあらかじめ治療された（例えば、出生の直後に治療された）成体の動物であり、他の関連する実施形態では、ＦＧＦ２治療された動物におけるＮＣＡＭの発現は、同様の未治療の動物において観察されるものと比較して低下する。他の関連する実施形態では、ＧＡＰ−４３、Ｒｇｓ４、ｔｒｋＢ、ＣＣＫ、ＳＳＴ、およびＶｇｆからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現は、ＦＧＦ２治療された動物では、未治療の動物と比較して増大される。
（定義）
「精神障害」または「精神病」または「精神疾患」または「精神医学的または神経精神病学的な疾患または病気または障害」は、気分障害（例えば大うつ病、躁病、および双極性障害）、精神病性障害（例えば、精神分裂症、分裂情動障害、精神分裂病型障害、妄想性障害、短期精神病性障害、および共有精神病性障害）、人格障害、不安障害（例えば強迫性障害）、ならびに、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（ＤＳＭ ＩＶ）に記載される通りの他の精神障害（物質関連障害、小児期の障害、痴呆、自閉症、適応障害、譫妄、脳血管性痴呆、およびトゥレット障害など）を指す。一般的に、こうした障害は、複雑な遺伝的および／または生化学的要素を有する。
「気分障害」は、個人によって長い期間経験される情調または感情状態の混乱を指す。気分障害としては、大うつ病障害（すなわち単極性障害）、躁病、神経不安、双極性障害、気分変調、循環気質、および他の多くのものが挙げられる。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＤＳＭ ＩＶ）を参照のこと。
「大うつ病障害」、「大うつ病性障害」、または「単極性障害」は、以下の症状のいずれかを含む気分障害を指す：持続的な悲しみ、不安、または「空虚な」気分；絶望または悲観の感情；自責の念、倦怠感、または無力感；かつては楽しんでいた趣味や行動（性行動を含めて）における関心または喜びの喪失；活力の低下、疲労、「鈍くなる（ｓｌｏｗｅｄ ｄｏｗｎ）」こと；集中力、記憶、または決定力の欠如；不眠症、早朝の覚醒、または過眠；食欲および／または体重の低下あるいは過食および体重増加；死亡または自殺の念慮あるいは自殺未遂；落ち着きのなさまたはいらいら感；あるいは、頭痛、消化障害、および慢性の痛みなどの、治療に応答しない持続的な身体症状。例えば、抑うつの様々なサブタイプは、ＤＳＭ ＩＶに記載されている。
「双極性障害」は、交代する極端な気分の期間によって特徴づけられる気分障害である。双極性障害を患う人は、通常、過度に高揚したあるいは興奮性である（躁病）から、悲しく絶望的である（抑うつ）まで揺動し、中間に普通の気分の期間があるが、その後、再び戻るという、気分の循環を経験する。例えば、双極性障害の診断は、ＤＳＭ ＩＶに記載されている。双極性障害には、双極性障害Ｉ（大うつ病を伴うあるいは伴わない躁病）および双極性障害ＩＩ（大うつ病を伴う軽躁病）が含まれる（例えばＤＳＭ ＩＶを参照のこと）。
「精神病性障害」は、現実との接触の少なくともある程度の低下をもたらす、精神に影響を及ぼす状態を指す。精神病性障害の症状には、例えば、幻覚、現実に基づかない行動の変化、妄想などが含まれる。例えばＤＳＭ ＩＶを参照のこと。精神分裂症、分裂情動障害、精神分裂病型障害、妄想性障害、短期精神病性障害、物質誘発性精神病性障害、および共有精神病性障害は、精神病性障害の例である。
「精神分裂症」は、個人による現実からの離脱を含む精神病性障害を指す。症状は、１ヵ月のうちの少なくともある期間の、以下のうちの２つまたはそれ以上の症状を含む：妄想（例えば太陽からの宇宙船内に拉致されるなど、妄想が異様な場合には、必要とされるのは１つの症状のみである）；幻覚（幻覚が、互いに話している少なくとも２つの声のもの、あるいは、患者の考えまたは動作に関する実況放送を続ける音声のものである場合には、必要とされるのは１つの症状のみである）；無秩序な話し方（例えば頻繁な脱線または矛盾）；はなはだしく無秩序な挙動、あるいは緊張型分裂病の挙動；または陰性症状、すなわち、平坦な感情、失語症、または意欲消失。精神分裂症は、例えば分裂情動障害などの障害を包含する。精神分裂症の診断は、例えばＤＳＭ ＩＶに記載されている。精神分裂症のタイプには、例えば、妄想型、無秩序型、緊張型、未分化型（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）、および残遺型がある。
「抗うつ薬」は、臨床的な抑うつを治療するために一般的に使用される薬剤を指す。抗うつ薬としては、例えば、特異的なセロトニン再摂取抑制剤（例えばフルオキセチン）三環系抗うつ薬（例えばデシプラミン）およびドーパミン再摂取抑制剤（例えばブプロピオン）を含めた異なるクラスの化合物が挙げられる。一般的に、異なるクラスの抗うつ薬は、異なる生化学的経路を介してその治療効果を発揮する。しばしば、これらの生化学的経路は重複または交差する。抗うつ薬を用いてしばしば治療されるさらなる疾患または障害としては、慢性の痛み、不安障害、およびホットフラッシュが挙げられる。
「アゴニスト」は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する、あるいは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または発現を刺激する、増大する、活性化する、容易にする、増強する、増感させる、または上方調節する薬剤を指す。
「アンタゴニスト」は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を抑制する、あるいはこれらと結合する、あるいは刺激を部分的にまたは完全にブロックする、活性化を低下させる、妨げる、遅らせる、あるいは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を不活性化する、減感させる、または下方調節する薬剤を指す。
発現または活性の「抑制剤」、「活性剤」、および「調節因子」は、それぞれ、抑制、活性化、または、調節分子（発現または活性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ分析を使用して同定される）、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびその相同体およびミメティクスを指すために使用される。用語「調節因子」には、抑制剤および活性剤が含まれる。抑制剤は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害する、あるいはこれらと結合する、あるいは刺激または酵素的活性を部分的にまたは完全にブロックする、活性化を低下させる、妨げる、遅らせる、あるいは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を不活性化、減感、または下方調節する薬剤（例えばアンタゴニスト）である。活性剤は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を誘発または活性化する、あるいはこれらと結合する、あるいは活性化または酵素的活性を刺激する、増大する、開く（ｏｐｅｎ）、活性化する、容易にする、増強する、あるいは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を増感させる、または上方調節する薬剤（例えばアゴニスト）である。調節因子には、天然に存在するおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、化学小分子などが含まれる。抑制剤および活性剤を同定するための分析には、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在下または非存在下で、推定上の調節化合物を細胞に適用すること、次いで、本発明の活性の、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する機能効果を決定することが含まれる。潜在的活性剤、抑制剤、または調節因子で処理された本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むサンプルまたは分析物を、抑制剤、活性剤、または調節因子を含まない対照サンプルと比較し、効果の程度を調べる。対照サンプル（調節因子で処理されていない）には、１００％という相対的な活性値を割り当てる。対照に対する本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性値が約８０％、場合によっては５０％または２５〜１％である場合、抑制は達成される。対照に対する本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性値が１１０％、場合によっては１５０％、場合によっては２００〜５００％、あるいは１０００〜３０００％より高い場合、活性化は達成される。
本明細書では、用語「試験化合物」または「候補薬物」または「調節因子」または文法的同義語は、天然に存在するまたは合成の任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、長さ約５から約２５アミノ酸、好ましくは長さ１０から２０または１２から１８アミノ酸、好ましくは長さ１２、１５、または１８アミノ酸）、有機小分子、多糖、脂質、脂肪酸、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、オリゴヌクレオチド、などを記述する。試験化合物は、コンビナトリアルまたはランダム化されたライブラリなどの、充分な範囲の多様性を提供する試験化合物のライブラリの形である可能性がある。試験化合物は、融合パートナー、例えば、ターゲティング化合物、レスキュー化合物（ｒｅｓｃｕｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、二量体化化合物、安定化化合物、アドレス指定可能な化合物、および他の機能的部分に、場合によっては結合される。通常、有用な特性を有する新規の化学実体は、ある望ましい特性または活性（例えば抑制活性）を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定し、リード化合物のバリアントをもたらし、そのバリアント化合物の特性および活性を評価することによって生み出される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が、こうした分析に用いられる。
「有機小分子」は、分子量が、約５０ダルトン以上かつ約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満であり、好ましくは約１００から約１０００ダルトンの間、より好ましくは、約２００から約５００ダルトンの間である天然に存在するまたは合成の有機分子を指す。
「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指す。ｓｉＲＮＡが、遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞中で発現される場合、二本鎖ＲＮＡは、遺伝子または標的遺伝子の発現を低下または阻害する能力を有する。このように、「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は、相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。ハイブリッド形成して二本鎖分子を形成する、ｓｉＲＮＡの相補的部分は、一般的に、実質的または完全な同一性を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子に対して実質的または完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸を指す。一般的に、ｓｉＲＮＡは、長さが少なくとも約１５〜５０ヌクレオチドであり（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的な配列は、長さが１５〜５０ヌクレオチドであり）、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１５〜５０塩基対、好ましくは約２０〜３０塩基のヌクレオチド、好ましくは長さが約２０〜２５または約２４〜２９ヌクレオチド、例えば、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである。
用語「表番号」は、別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、言及される表のすべての亜表（ｓｕｂ−ｔａｂｌｅ）を含む（例えば、「表１」は、表１Ａ、１Ｂ、および表１Ｃを指す）。
「機能効果を決定すること」は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、図１、図５〜８、または表１〜４のポリヌクレオチド、あるいは図１、図５〜８、または表１〜４の遺伝子によってコードされるポリペプチド）の影響を間接的または直接的に受けるパラメータを増加または減少させる化合物について分析すること、例えば、物理および化学的または表現型的効果を測定することを指す。こうした機能効果は、例えば、タンパク質に関する分光学的（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学（例えば形状）、クロマトグラフィー、または溶解度特性の変化；タンパク質の誘導可能なマーカーまたは転写活性化を測定すること；結合活性または結合アッセイ、例えば抗体に対する結合を測定すること；リガンド結合親和性の変化を測定すること；カルシウム流入の測定；本発明のポリペプチドの酵素的産物の蓄積または基質の欠乏の測定；本発明のポリペプチドのタンパク質レベルの変化の測定；ＲＮＡ安定性の測定；Ｇタンパク質結合；ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化；シグナル伝達、例えば受容体−リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃度（例えばｃＡＭＰ、ＩＰ３、または細胞内Ｃａ２＋）；例えば化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導可能なマーカー、およびリガンド結合アッセイを介する、下流またはレポーター遺伝子発現（ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど）の同定などの、当業者に知られている任意の手段によって測定することができる。
潜在的活性剤、抑制剤、または調節因子で処理された、本明細書で開示された核酸またはタンパク質を含むサンプルまたは分析物を、抑制剤、活性剤、または調節因子を含まない対照サンプルと比較して、抑制の程度を調べる。対照サンプル（抑制剤で処理されていない）には、１００％という相対的なタンパク質活性値を割り当てる。対照に対する活性値が約８０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合、抑制は達成される。対照（活性剤で処理されていない）に対する活性値が１１０％、より好ましくは１５０％、より好ましくは２００〜５００％である（すなわち、対照と比較して２から５倍高い）、より好ましくは１０００〜３０００％より高い場合、活性化は達成される。
「生体サンプル」には、生検および剖検サンプルなどの組織の切片、および組織学的目的のために採取凍結された切片が含まれる。こうしたサンプルとしては、血液、唾液、組織、溶解した細胞、脳生検、培養細胞（例えば初代培養細胞）、外植片、および形質転換細胞、便、尿、などが挙げられる。生体サンプルは一般に、真核性の生物（例えば、チンパンジーまたはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；げっ歯類（例えばモルモット、ラット、マウス）；ウサギ；または鳥；爬虫類；または魚）、最も好ましくは霊長類などの哺乳類から得られる。
「抗体」は、特異的に分析物（抗原）を結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数もしくは複数）によって実質的にコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλとして分類されている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεと分類され、これに続いて、それぞれ、免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが定義される。
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一の対（各対は、「軽」鎖（約２５ｋｄ）および「重」鎖（約５０〜７０ｋｄ）を有する）のポリペプチド鎖からなり、各鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）はそれぞれ、こうした軽鎖および重鎖を指す。
抗体は、例えば、完全なままの免疫グロブリンとして、あるいは、様々なペプチダーゼでの消化によってもたらされる、いくつかの十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、抗体が、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で、ペプシンによって消化され、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結される軽鎖であるＦ（ａｂ）’２、すなわちＦａｂの二量体がもたらされる。ヒンジ領域中のジスルフィド結合を壊すために、Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。このＦａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の部分をもつＦａｂである（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）を参照のこと）。完全なままの抗体の消化に関して、様々な抗体フラグメントが定義される一方、当業者は、こうしたフラグメントが、化学的に、あるいは組換え型ＤＮＡ方法論を利用することによって新規に合成できることも認識するであろう。したがって、用語「抗体」は、本明細書ではまた、全抗体の改変によってもたらされる抗体フラグメントか、組換え型ＤＮＡ方法論を使用して新規に合成されるもの（例えば単鎖Ｆｖ）のいずれかを含む。
用語「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」および「ミメティクス」は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニスト、またはアゴニストと同じ構造的および機能的特性を実質的に有する合成の化合物を指す。ペプチドの類似体は、鋳型ペプチドの特性と類似した特性をもつ非ペプチド薬物として、医薬品業界中で一般に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチドミメティクス（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓまたはｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）と称される（Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）；これらを参照により本明細書に組み込む）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似であるペプチドミメティクスを、同等または増強された治療または予防的効果をもたらすために使用することができる。通常、ペプチドミメティクスは、ＣＣＸ ＣＫＲなどの、範例となるポリペプチド（すなわち生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似であるが、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって場合によっては置き換えられる、１種または複数のペプチド結合を有する。ミメティクスは、完全に、アミノ酸の合成の非天然の類似体からなるものでもよいし、部分的に天然のペプチド・アミノ酸とび部分的にアミノ酸である非天然の類似体とのキメラ分子であってもよい。こうした置換がまた、ミメティクスの構造および／または活性を実質的に変化させない限り、ミメティクスはまた、どんなに多くの天然のアミノ酸保存的な置換も組み込むことができる。例えば、ミメティクス組成物は、それが、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの結合または酵素的活性をもつ、あるいは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの酵素的活性または発現を阻害または増大することが可能な場合、本発明の範囲内である。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖をもたらすことに関与するＤＮＡの部分を意味し；これは、コード領域の前後の領域（先行部および追従部）、ならびに、個々のコード部分（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
用語「単離される」は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、基本的には、天然の状態でそれと混合されている他の細胞成分を含まないことを表す。これは、乾燥状態でも、水溶液中でもよいが、均質な状態であることが好ましい。純度および均質性は一般的に、分析化学技術（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を使用して決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離される遺伝子は、当該遺伝子と隣接し、当該の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製される」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動的なゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを表す。特に、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、明確に示された配列だけでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重するコドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列も暗黙のうちに包含する。特に、縮重するコドン置換は、１種または複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生じることによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＣａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書では同義的に使用される。これらの用語は、１種または複数のアミノ酸残基が、相当する天然に存在するアミノ酸の人工の化学ミメティクスであるようなアミノ酸ポリマーに、また、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書では、これらの用語は、全長タンパク質（すなわち抗原）を含めた、共有結合的ペプチド結合によってアミノ酸残基が結合される、任意の長さのアミノ酸の鎖を包含する。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティクスを指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに、後に改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンなど）である。アミノ酸類似体は、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどの、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物を指す。こうした類似体は、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）または改変されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸ミメティクス」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造をもつが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号によって、あるいは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって示すことができる。ヌクレオチドも同様に、一般に認められているその一文字記号によって示される可能性がある。
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」は、同一の、あるいは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、あるいは、核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定される、あらゆる位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変化させずに、記載されている相当するコドンのいずれにも変わり得る。こうした核酸の変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的に改変された変異の１種である。本明細書では、ポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異を記述する。当業者は、（ＡＵＧ（通常メチオニンに対する唯一のコドンである）およびＴＧＧ（通常トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）核酸中の各コドンを、機能的に同じ分子をもたらすように改変できることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記述されている各配列に暗黙のうちに含まれる。
アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされる配列中の、単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変化させる、付加する、あるいは欠損させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、この変更によって、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換がもたらされる場合、「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に同等のアミノ酸を提供する保存的な置換表は、当分野でよく知られている。こうした保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型のバリアント、異種間相同体、および対立遺伝子に加えて、除外しない。
以下の８つの群は、それぞれ、互いに対して保存的な置換体であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
「配列同一性の割合」は、比較ウインドウ上の２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定される。ここでは、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントに対する基準配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合の付加または欠失（すなわちギャップ）を含む可能性がある。割合は、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して適合位置の数を得、適合位置の数を、比較のウインドウ中の位置の合計で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合をもたらすことによって算出される。
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列において、用語「同一の」または「同一性」（％）は、比較ウインドウ（または以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、あるいは手動アラインメントおよび視覚による検査によって測定される所定の領域）上で最大の一致について比較およびアラインメントされる場合に、同じである、あるいは、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合が特定のものである（すなわち、特定の領域にわたって、６０％同一性、場合によっては６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性）、２つまたはそれ以上の配列または部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。そして、こうした配列は、「実質的に同一である」と言われている。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。場合によっては、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドである領域にわたって、あるいは、より好ましくは長さが１００から５００、または１０００、またはそれ以上のヌクレオチド領域にわたって存在する。
配列比較については、一般的に１つの配列が、基準配列として働き、試験配列は、これと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および基準配列がコンピュータに入力され、続いて必要に応じて部分配列座標が示され、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータが示される。デフォルトのプログラム・パラメータを使用することもできるし、代替のパラメータを使用することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラム・パラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を算出する。
「比較ウインドウ」は、本明細書では、２０から６００、通常約５０から約２００、より通常約１００から約１５０からなる群から選択される数の連続する位置のいずれか１つの部分に対する参照を含む。ここでは、配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後、同じ数の連続する位置の基準配列と比較することができる。比較のための配列のアラインメントの方法は、当分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、あるいはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメント・アルゴリズムによって、あるいはＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の「ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ」によって、あるいはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施態様（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、あるいは手動アラインメントおよび視覚による検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））を参照のこと）によって行うことができる。
配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０中に記載されている）である。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードを用いてアラインメントされた場合に何らかの正の値を有する閾値スコアＴとマッチするあるいは満たす、問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の長さＷの短いワードを特定することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）。こうした最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための調査を開始するためのシードとして働く。累積アラインメント・スコアが増大される可能性がある限り、ワードヒットは各配列に沿って、両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティ・スコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）は、累積スコアを算出するために使用される。累積アラインメント・スコアが、その最大の達成された値から量Ｘだけ減る場合；累積スコアが、１種または複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積に起因してゼロまたはそれ未満になる場合；あるいは、いずれかの配列の末端に到達される場合；各方向のワードヒットの伸張は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列については）、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似点の統計的分析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の基準核酸に対する比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、基準配列と類似であると考えられる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下で述べる通りの、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、例えば、２つのペプチドにおいて、保存的な置換のみが異なる場合、ポリペプチドは一般的に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下で述べる通り、２つの分子またはその相補体が、厳密な条件下で互いにハイブリッド形成するということである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、配列を増幅するために同じプライマーを使用できるということである。
語句「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」は、その配列が複合混合物（例えば、全細胞性またはライブラリＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、厳密なハイブリッド形成条件下で、分子が特定のヌクレオチド配列のみと結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成することを指す。
語句「厳密なハイブリッド形成条件」は、プローブが、一般的に核酸の複合混合物中で、その標的の部分配列とハイブリッド形成するが、他のいかなる配列ともハイブリッド形成しないという条件を指す。厳密な条件は、配列に依存し、異なる状況では異なることとなる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成の詳細にわたる指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。通常、厳密な条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特異的な配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い温度と選択される。Ｔｍは、標的と相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列とハイブリッド形成する（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブは５０％で平衡である）。厳密な条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオンより少ないもの、一般的に、ｐＨ ７．０から８．３で、約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）となり、温度は、短いプローブ（例えば１０から５０のヌクレオチド）については最低約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）については最低約６０℃である。厳密な条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を加えることで達成することができる。選択的または特異的なハイブリッド形成については、正のシグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、場合によってはバックグラウンドの１０倍のハイブリッド形成である。例示的な厳密なハイブリッド形成条件は、以下の通りであり得る：５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、および１％ ＳＤＳ、４２℃で保温、または５Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃で保温；０．２Ｘ ＳＳＣ、および６５℃の０．１％ ＳＤＳ中で洗浄。こうした洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分、またはそれ以上の間実施することができる。図１、図５〜８、または表１〜４に記載される遺伝子とハイブリッド形成する核酸は、本発明によって包含される。図１、図５〜８、または表１〜４に記載される２つまたはそれ以上の遺伝子の発現を検出するためのヌクレオチドを含むアレイも、本発明によって包含される。
厳密な条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸も、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一の場合には、実質的に同一である。これは、例えば遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重を用いて核酸コピーが作製された場合に生じる。そのような場合、核酸は一般的に、中程度に厳密なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。例示的な「中程度に厳密なハイブリッド形成条件」としては、３７℃の４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリッド形成、および４５℃での１Ｘ ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。こうした洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分、またはそれ以上の間実施することができる。正のハイブリッド形成は、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替のハイブリッド形成および洗浄条件を利用して、類似の厳密性の条件を提供することができることを容易に認識するであろう。
ＰＣＲについては、低い厳密性の増幅については、約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマー長さに応じて約３２℃と４８℃との間で変動し得る。高い厳密性のＰＣＲ増幅については、約６２℃の温度が典型的であるが、高い厳密性のアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高い厳密性および低い厳密性の増幅のための典型的なサイクル条件としては、３０秒〜２分間の９０℃〜９５℃の変性相、３０秒〜２分持続するアニーリング相、および１〜２分間の約７２℃の伸張相が挙げられる。低い厳密性および高い厳密性の増幅反応のためのプロトコルおよびガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）に提供されている。
語句「〜をコードする核酸配列」は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなどの、構造的ＲＮＡ、または特定のタンパク質またはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作用性調節因子のための結合部位に対する配列情報を含有する核酸を指す。この語句は特に、天然の配列（単数または複数）の縮重コドン（すなわち、単一アミノ酸をコードする異なるコドン）を包含する。これは、特定の宿主細胞におけるコドン選択に適合するように導入することができる。
用語「組換え型」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸またはタンパク質の導入、あるいは天然の核酸またはタンパク質の変更によって改変される、あるいは、細胞が、このように改変された細胞から得られることを指す。したがって、例えば、組換え型細胞は、天然の（非組換え型）形の細胞内に見いだされない遺伝子を発現する、あるいは、別の状況では異常発現される、過小発現される、あるいはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。
用語「異種の」は、核酸の一部に関して使用される場合、核酸が、天然には互いに同じ関係では見いだされない２つまたはそれ以上の部分配列を含むことを指す。例えば、その核酸は一般的に、組換えによりもたらされ、新規の機能的核酸を作製するために配置される無関係な遺伝子由来の２つまたはそれ以上の配列、例えば、１つの起源由来のプロモーターおよび別の起源由来の翻訳領域を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、天然には互いに同じ関係では見いだされない２つまたはそれ以上の部分配列を含むことを指す（例えば融合タンパク質）。
「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする、一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換えまたは合成により作製される核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部である可能性がある。一般的に、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連絡された、転写されることとなる核酸を含む。
語句「特異的に（あるいは選択的に）抗体に結合する」または「特異的に（あるいは選択的に）免疫反応する」は、タンパク質またはペプチドに関する場合、タンパク質および他の生物学的物質の不均質な集団の存在下で、タンパク質の存在を決定的するような結合反応を指す。したがって、所定のイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、ある特定のタンパク質に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質とは、有意な量では結合しない。こうした条件下での抗体に対する特定の結合は、特定のタンパク質に対して、その特異性に対して選択された抗体を必要とする可能性がある。例えば、本発明のポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生される抗体は、多型のバリアントを除いて、他のタンパク質とではなく、そのタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を得るために選択することができる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式を使用することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学が、通常使用される。特定の免疫活性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８８）を参照のこと。一般的に、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、一般的にはバックグラウンドの１０から１００倍よりも多い。
本明細書では、「精神障害の素因がある」人は、精神障害を発症する傾向がある、あるいは一般的な集団における平均的な人と比較した場合に、その可能性が高い人を意味する。
（発明の詳細な説明）
限られた数の分子のみの分析の証拠によれば、双極性障害（ＢＰＤ）および大うつ病性障害（ＭＤＤ）の病態生理学に、また、こうした障害に対する薬物治療の機構に、遺伝子調節の変化および特有の遺伝子調節異常が関与し得ること示唆される。マイクロアレイ技術の最近の発達により、特定の遺伝子、系、およびシグナル伝達経路のｍＲＮＡ発現プロフィールの包括的な見方が可能になる。
Ｉ．導入
精神障害の遺伝的基準を理解するために、特に気分障害を患う対象の中枢神経系中に差次的に発現される遺伝子の発現パターンを調べるための研究が行われている。いくつかの研究では、知られている遺伝子および新規の遺伝子の差次的および特有の発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐｓ（登録商標）（高密度オリゴヌクレオチドプローブセットアレイを含有する）を用いて、ＢＰおよびＭＤＤ患者の死後脳から精製された全ＲＮＡサンプルを調べることによって決定した。基本的な原理は、ＢＰおよび／またはＭＤＤにおいて、（健康な対照被検者と比較して）差次的に発現される遺伝子および経路を、上述のようなトランスクリプトームの全体的な発現プロファイリングを介して、同定することによるものであり、それによって、疾患を引き起こす、疾患に影響を与える、あるいは関連する遺伝子、あるいは診断および治療用途で使用するための疾患を治療するために使用される薬物と相互作用する遺伝子を、同定することができる。
本明細書で提供される実施例は、ＢＰＤおよびＭＤＤ患者の、背外側前頭葉前部、前側帯、海馬、側坐核、扁桃体、および小脳皮質のマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングを記載する。特に、本明細書で開示される本発明の好ましい実施形態は、ＦＧＦおよびＧＰＣＲ経路に関連する遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに関連する。他の好ましい実施形態は、ＦＧＦＲ２（これもまた、異常調節される）のスプライスバリアントの検出に焦点を合わせる。さらに他の実施形態では、本発明は、ＢＰ障害の特異的療法のための、リチウムによって異常調節される遺伝子を提供する。
本発明はまた、リチウムなどの現在使用される気分安定剤の作用機序を解読するのに有用である核酸配列およびタンパク質配列を提供する。提供される配列はまた、薬物を発見する、例えば、中枢神経の分子／経路の形のより有効な治療用標的の同定に対する新規の手がかりを発見するために有用であり、これを通して、経路の全システムまたはネットワークを、ＭＤＤ、ＢＰ、またはこうした障害の主な中間表現型の根底にある混乱させられた細胞過程を修復するために調節することができる。例えば、ＧＳＫ３Ｂを操作することは、イノシトール三リン酸、ＮＦ−ｋＢファミリー、ミトコンドリアのアポトーシス、およびユビキチン−プロテアソーム経路のうちの１つ以上に影響を及ぼす可能性がある。薬物の標的特異性についての知識を向上することで、現在使用中の数多くの気分安定剤に伴う副作用を最小限にすることが助けられるはずである。本発明は、バイオマーカーと、関連する遺伝子との組み合わせを提供する。これは、ＭＤＤ、ＢＰ、および関連する障害を診断するための、また、この目的のためのさらなる道具を開発するための、さらに薬効をモニタリングするための方法に使用することができる。
本発明は、気分障害（例えば双極性障害および大うつ病障害）と診断された患者の選択された脳領域中に観察される、図１、図５〜８、または表１〜４の遺伝子の、正常な個人と比較した場合の発現変化（本明細書に示される通りの、発現の増大または低下）、または特有の差次的な発現を利用するための方法を提供する。したがって、この発明は、図１、図５〜８、または表１〜４中に記載される遺伝子の転写産物または翻訳産物のレベル、ならびにその相当する生化学的経路を検出することによって、気分障害（例えば、双極性障害、大うつ病）および遺伝的要素を有する他の精神障害などの精神障害を診断するための方法を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記述される翻訳産物または転写産物の発現の機能効果を調節する化合物（例えばＦＧＦ系のＦＧＦ２、ＮＣＡＭ、およびペプチドインヒビター）を選択することによって、こうした障害の治療に有用な化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた、例えば、本発明の化合物を投与することによって、あるいは遺伝子治療によって、こうした精神障害の患者を治療する方法を提供する。
本発明はまた、精神病および精神病の根底にある分子的原因を調査するための、非常に必要とされるツールを提供する。こうしたツールには、精神的異常のための分子基礎を解明するために、また精神的異常に対する治療を特定するために有用である表現型を示すように操作された動物モデルが含まれる。例えば、本発明は、一実施形態では、記憶力および学習能力が向上したマウスを提供する。
双極性疾患および大うつ病などの気分障害に関連する遺伝子およびそれがコードするポリペプチドは、（それだけには限らないが気分障害を含めた）すべての精神障害または選択された精神障害に特有のプローブセットを含有するＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（商標）などの、また、遺伝子カウンセリングと協力して新生児をスクリーニングするための出産前および／または出生後の診断ツールとしての、様々な分子的診断ツールの設計および開発を容易にするために有用である。他の診断的用途には、罹病性、予後の評価、および疾患または治療過程のモニタリング、ならびに例えば、特定のゲノムモチーフを、個々の薬物に対する患者の臨床効果と相関させることによる、予測的薬物プロファイリングシステムを介する個別化された医薬品の提供が含まれる。さらに、本発明は、それだけには限らないが、遺伝子、ｍＲＮＡ、タンパク質および経路レベルでの、治療的、診断的、および、薬理遺伝学的標的の同定を含めた、多重ＳＮＰおよびハプロタイプ・プロファイリングに有用である。スプライスバリアントおよび欠失のプロファイリングも、診断および治療用途に有用である。
本明細書に記述される遺伝子およびそれがコードするポリペプチドはまた、治療のための治療薬の開発、またはそれだけには限らないが気分障害を含めた精神障害の予防のための薬物標的として有用である。
異なるクラスに属する抗うつ薬、例えば、デシプラミン、アンフェブタモン、およびフルオキセチンは、異なる機構によって作用するが、一般に、臨床的うつ病の治療に対して等しく有効である。気分障害の治療に対するこれらの薬物の類似の効果によって、これらが、現在確認できない共通の経路で作用することが示唆される。本発明の遺伝子の作用機序を調べるために、ＳＳＲＩなどの知られている治療法を用いる動物の治療を含めた、抑うつの動物モデルを使用することができる。リチウムは、ＢＰを治療するための最適な薬物である。
本明細書に記述される遺伝子およびそれがコードするポリペプチドは、それだけには限らないが気分障害を含めた精神障害の治療または予防のための治療薬剤の開発のための薬物標的としても有用である。精神障害は、パーキンソン病またはアルツハイマー病などの他の神経疾患との同時罹患率が高い。したがって、本発明は、気分障害などの精神障害を含めた複数の病態を患う患者の診断および治療のために使用することができる。こうした気分障害としては、ＢＰ、ＭＤＤ、ならびに、例えば精神病性抑うつ、抑うつおよび不安特性、メランコリー型うつ病、慢性の抑うつ、ＢＰＩおよびＢＰＩＩなどの他の障害が、挙げられる。
ＩＩ．本発明と共に使用される一般的な組換え核酸法
本発明の多数の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、組換え方法を使用して単離およびクローン化される。こうしたポリヌクレオチドには、例えば図１、図５〜８、または表１〜４に記載されるものが含まれ、これらは、例えばタンパク質発現のために、またはバリアント、誘導体、発現カセットの作製中に、遺伝子発現をモニタリングするために、異なる種における本発明の配列の単離または検出のために、患者における診断目的のために（例えば、突然変異を検出するために、あるいは本発明の核酸またはポリペプチドの発現レベルを検出するために）、使用することができる。ある種の実施形態では、本発明の配列は、異種プロモーターに作動可能に連絡される。一実施形態では、本発明の核酸は、特に、例えば、ヒト、マウス、ラット、霊長類などを含めた任意の哺乳類由来である。
Ａ．一般的な組換え核酸法
本発明は、組換え遺伝学の分野の通常の技術に依存する。この発明に使用される一般的な方法を開示している基本テキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
核酸については、大きさは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で示される。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開されているＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質については、大きさは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示される。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、得られたアミノ酸配列から、または公開されているタンパク質配列から推定される。
市販品として入手できないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載される通りの自動合成装置を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホラミダイト・トリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、天然アクリルアミドゲル電気泳動によるもの、あるいは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載される通りの陰イオン交換ＨＰＬＣによるものである。
クローン化された遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅらの、Ｇｅｎｅ １６：２１−２６（１９８１）の二本鎖鋳型を配列決定するための連鎖終止反応法を使用するクローニングの後に確認することができる。
Ｂ．所望されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
一般に、対象タンパク質をコードする核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをコードするように作製されるＤＮＡ配列ライブラリからクローン化される。特定の配列は、オリゴヌクレオチドプローブ（その配列は、ＰＣＲプライマーに対する基準を提供し、特定のプローブを単離するのに適した領域を定義する、図１、図５〜８、または表１〜４に記載される遺伝子の配列から得ることができる）とハイブリッド形成させることによって位置決めすることができる。あるいは、この配列を、発現ライブラリにクローン化させる場合、発現された組換え型タンパク質を、抗血清、あるいは、図１、図５〜８、または表１〜４に記載される遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製される精製された抗体を用いて免疫学的に検出することができる。
ゲノムおよびｃＤＮＡライブラリを作製およびスクリーニングするための方法は、当業者によく知られている（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０−１８２（１９７７）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、を参照のこと）。脳細胞は、本発明のＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を単離するのに適した細胞の例である。
簡単に言うと、ｃＤＮＡライブラリを作製するためには、ｍＲＮＡが豊富である起源を選択しなければならない。次いで、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡが作製され、組換え型ベクターに連結され、増殖のための組換え型宿主に形質移入され、スクリーニングおよびクローニングされる。ゲノムライブラリについては、ＤＮＡは、適切な組織から抽出され、機械的に断片化されるか、あるいは、酵素処理で消化して、好ましくは約５〜１００ｋｂのフラグメントがもたらされる。フラグメントは、所望でない大きさのものから勾配遠心分離によって分離され、バクテリオファージλベクター中に構築される。こうしたベクターおよびファージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージされ、組換え型ファージは、プラークハイブリダイゼイションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２：３９６１−３９６５（１９７５））に記載される通りに実施されるのが一般的である。
代替法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用を、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型上のポリメラーゼ伸張と組み合わせるものである。適切なプライマーは、本発明の特定の配列から設計することができる。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリ、またはｃＤＮＡライブラリから直接的に、当該のタンパク質をコードする核酸を増幅する。プライマーには、制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むことができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のｉｎ ｖｉｔｒｏの増幅方法はまた、例えば、特定のタンパク質をコードしている核酸をクローン化し、前記タンパク質を発現させるために、あるいは生理的サンプル中の本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用されることとなる核酸を合成するために、あるいは核酸配列決定のために、あるいは他の目的のために有用である可能性もある（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照のこと）。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製し、適切なベクターにクローン化することができる。
哺乳類の組織から本発明のポリヌクレオチドを同定するための適切なプライマーおよびプローブは、本明細書に提供される配列から得ることができる。ＰＣＲの一般的な概要については、Ｉｎｎｉｓら ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）を参照のこと。
遺伝子を構築するために、合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。これは、遺伝子のセンスおよびアンチセンス鎖に相当する、一連のオーバーラップ・オリゴヌクレオチド（通常長さ４０〜１２０のｂｐ）を使用して行われる。次いで、こうしたＤＮＡフラグメントは、アニーリングされ、連結され、クローン化される。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、発現のための哺乳類細胞に形質転換するより前に、中間ベクターを使用してクローン化することができる。こうした中間ベクターは一般的に、原核生物ベクターまたはシャトルベクターである。タンパク質は、当業者によく知られた標準の方法を使用して原核生物中で、あるいは以下に記述される通りに真核生物中で発現させることができる。
ＩＩＩ．本発明のタンパク質の精製
本発明の天然に存在するまたは組換え型ポリペプチドは、機能分析で使用するために精製することができる。天然に存在するポリペプチド（例えば、図１、図５〜８、または表１〜４に記載される遺伝子によってコードされるポリペプチド）は、例えば、マウスまたは脳などのヒト組織、あるいは任意の他の起源のオルソログから精製することができる。組換え型ポリペプチドは、任意の適切な発現系から精製することができる。
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムなどの物質を用いる選択的沈殿；カラムクロマトグラフィ、免疫精製法、およびその他（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記文献；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記文献を参照のこと）を含めた標準の技術によって、かなりの純度まで精製することができる。
組換え型ポリペプチドが精製される場合、多くの手順を用いることができる。例えば、分子付着特性が確認されているタンパク質は、本発明のポリペプチドと、可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、該ポリペプチドを、精製カラムに選択的に吸着させ、その後、比較的純粋な形で、カラムから放出させることができる。その後、融合したタンパク質を、酵素活性によって取り出す。最終的に、該ポリペプチドを、免疫親和性カラムを使用して精製することができる。
Ａ．組換え型細菌からのタンパク質の精製
組換え型タンパク質が、一般的にプロモーター誘導の後、形質転換された細菌によって大量に発現される場合、発現は恒常的である可能性があるが、タンパク質は、不溶性の凝集体を形成する可能性がある。タンパク質封入体の精製に適した、いくつかのプロトコルが存在する。例えば、凝集タンパク質（以下、封入体と呼ぶ）の精製は一般的に、それだけには限らないが一般的に、約１００〜１５０μｇ／ｍｌのリゾチームおよび０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（非イオン性界面活性剤）の緩衝液中での保温による細菌細胞の破壊による、封入体の抽出、分離、および／または精製を含む。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎグラインダー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を使用して、すりつぶすことができる。あるいは、細胞を、氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解させる代替の方法は、ＡｕｓｕｂｅｌらおよびＳａｍｂｒｏｏｋら（どちらも上記文献）に記載されており、当業者には明白である。
細胞懸濁液は、遠心分離されるのが一般的であり、封入体を含有するペレットを、封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．２）１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（非イオン性界面活性剤））中に再懸濁させる。できるだけ多くの細胞の残屑を取り除くために、洗浄ステップを繰り返す必要がある可能性もある。残留する封入体のペレットを、適切な緩衝液（例えば２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁することができる。他の適切な緩衝液は、当業者に明白である。
洗浄ステップの後、封入体は、強い水素受容体でありかつ強い水素供与体である溶媒（またはこうした特性の１つをそれぞれ有する溶媒の組み合わせ）を加えることによって可溶化される。次いで、封入体を形成していたタンパク質を、適合する緩衝液を用いる希釈または透析によって復元することができる。適切な溶媒には、それだけには限らないが、尿素（約４Ｍから約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、体積／体積基準）、および塩酸グアニジン（約４Ｍから約８Ｍ）が含まれる。凝集体形成タンパク質を可溶化することができる、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸などのある種の溶媒は、免疫原性および／または活性の欠如を伴うタンパク質の不可逆的変性の可能性のため、この手順で使用するには不適当である。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は、変性剤であるが、この変性は、不可逆的ではなく、復元は、変性剤の除去（例えば透析による）または希釈時に起こり得、当該の免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再構成を可能にする。可溶化の後、タンパク質は、標準の分離技術によって他の細菌蛋白から分離することができる。
あるいは、細菌ぺリプラズムからタンパク質を精製することが可能である。タンパク質が細菌のぺリプラズムに輸送される場合、細菌のぺリプラズム分画を、当業者に対知られている他の方法に加えて、低温浸透圧ショック法によって分離することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記文献を参照のこと）。ぺリプラズムから組換え型タンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離して、ペレットを形成する。このペレットを、２０％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁させる。細胞を溶解させるために、細菌を遠心分離し、ペレットを、氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ４に再懸濁し、約１０分間氷浴を続ける。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカンテーションして、保存する。上清中に存在する組換え型タンパク質は、当業者によく知られた標準の分離技術によって、宿主タンパク質から分離することができる。
Ｂ．タンパク質を精製するための標準のタンパク質分離技術
１．溶解度分画
しばしば最初のステップとして、また、タンパク質混合物が複合的である場合、初期の塩分画によって、当該の組換え型タンパク質から、多くの望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培地から得られるタンパク質）を分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水量を効率的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。その後、タンパク質は、その溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質は、より疎水性であるほど、低い硫酸アンモニウム濃度で、より沈殿しやすいと考えられる。典型的なプロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間であるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを加えることである。これによって、大抵の疎水性タンパク質が沈殿することとなろう。（当該のタンパク質が疎水性でないならば）沈殿物を捨て、硫酸アンモニウムを、当該のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度で上清に加える。次いで、沈殿物を緩衝液に可溶化させ、必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションを介して、過剰な塩を取り除く。タンパク質の溶解度に依存する他の方法（冷エタノール沈殿など）は、当業者によく知られており、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用することができる。
２．サイズ別濾過
算出された分子量に基づいて、より大きなサイズ、またり小さなサイズのタンパク質を、異なる孔径の膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を介する限外濾過を使用して単離することができる。第一段階として、タンパク質混合物を、当該のタンパク質の分子量よりも小さい分子量出口を有する孔径をもつ膜を介して限外濾過する。次いで、限外濾過の残留物を、当該のタンパク質の分子量よりも大きい分子出口をもつ膜に対して限外濾過する。組換え型タンパク質は、膜から濾液に通過する。次いで、この濾液を、以下で述べる通りのクロマトグラフィーにかけることができる。
３．カラムクロマトグラフィ
当該のタンパク質はまた、その大きさ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離することができる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体は、カラム基材および免疫精製されたタンパク質に結合させることができる。こうした方法はすべて、当分野でよく知られている。
クロマトグラフィー技術を、任意の規模で、多くの異なる製造業者の装置を使用して実施することができることは、当業者には明白である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
ＩＶ．遺伝子発現の検出
当業者は、本発明のポリヌクレオチドの発現の検出が、多くの用途を有することを認識するであろう。例えば、本明細書に述べる通り、患者における本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの検出は、気分障害または精神病性障害、あるいは気分障害または精神病性障害の素因を診断するために有用である。さらに、遺伝子発現の検出は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現の調節因子を同定するために有用である。
核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する特異的なＤＮＡおよびＲＮＡ測定の様々な方法は、当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献を参照のこと）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えばＤＮＡを検出するためのサザンブロット、およびＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）を含むが、ＤＮＡおよびＲＮＡの測定はまた、電気泳動分離無しで（例えば、ドットブロットによって）実施することもできる。（例えばヒト由来の）ゲノムＤＮＡのサザンブロットは、本発明のポリペプチドに影響を及ぼす遺伝的障害の存在を検出するために、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）に対するスクリーニングのために使用することができる。
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に知られている。例えば、一般的な形式には、サンドイッチ分析および競合または置換分析が含まれる。ハイブリダイゼーション技法は概して、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５）；ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６３：３７８−３８３（１９６９）；およびＪｏｈｎらＮａｔｕｒｅ，２２３：５８２−５８７（１９６９）に記載されている。
ハイブリッド形成複合体の検出は、標的とプローブ・ポリヌクレオチドまたは核酸の二重鎖へのシグナル発生複合体の結合を必要とする可能性がある。一般的に、こうした結合は、リガンド結合プローブと、シグナルと結合された抗リガンドとの間のような、リガンドと抗リガンドとの相互作用を介して生じる。シグナル発生複合体の結合はまた、超音波エネルギーへの曝露によって促進されやすい。
また、標識によって、ハイブリッド形成複合体の間接的な検出を可能にすることができる。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、サンプルは、抗体を用いて検出することができる。こうした系では、シグナルは、抗体に蛍光または酵素分子を付着させることによって、あるいは、場合によっては放射性標識への付着によって産生される（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｕｒｄｏｎおよびｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５）ｐｐ．９−２０を参照のこと）。
プローブは一般的に、例えばアイソトープ、発色団、発光団、色素原などで直接的に、あるいは、例えばビオチン（これに、ストレプトアビジン複合体が後で結合し得る）などで間接的に標識される。このように、本発明の分析において使用される検出可能な標識は、一次標識（ここでは、標識は、直接的に検出される、または直接的に検出可能な要素をもたらす要素を含む）、または二次標識（ここでは、検出される標識は、例えば免疫学的な標識化でそうであるように、一次標識に結合する）であり得る。一般的に、標識されたシグナル核酸は、ハイブリッド形成を検出するために使用される。相補的な核酸またはシグナル核酸は、ハイブリッド形成されたポリヌクレオチドの存在を検出するために一般的に使用されるいくつかの方法のいずれか１つによって標識することができる。検出の最も一般的な方法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ−標識プローブなどを用いるオートラジオグラフィの使用である。
他の標識としては、例えば、標識リガンドに対する特異的な結合対メンバーとして働くことができる、標識された抗体、フルオロフォア、化学発光薬剤、酵素、および抗体に結合するリガンドが挙げられる。標識、標識化手順、および標識の検出に対する概論は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９９７）；およびＨａｕｇｌａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）において見出される。
一般に、検出試薬標識を検出するために、特定のプローブまたはプローブの組み合わせをモニタリングする検出器が使用される。典型的な検出器には、分光光度計、光電管およびフォトダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなど、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。適切な検出器の例は、当業者に知られている様々な市販の供給元から、広く入手できる。一般に、結合された標識化部分を含む基板の光学的画像は、その後のコンピュータ解析のためにデジタル化される。
最も一般的には、ＲＮＡの量は、検出試薬の結合によって固体支持体に固定された標識の量を定量化することによって測定される。一般的に、保温中の調節因子の存在によって、固体支持体に固定される標識の量は、調節因子を含まない対照保温物に対して、あるいは、特定の反応型に対して確立されたベースラインと比較して、増大または低下することとなる。標識を検出および定量化する手段は、当業者によく知られている。
好ましい実施形態では、標的核酸またはプローブは、固体支持体上に固定される。本発明の分析で使用するのに適した固体支持体は、当業者に知られている。本明細書では、固体支持体は、実質的に固定された配置の材料のマトリックスである。
様々な自動化された固相分析技術も適切である。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手できる非常に大規模な固定化されたポリマーアレイ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））は、同じ調節経路に同時に関与する複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出するために使用することができる。例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、上記文献、Ｆｏｄｏｒら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：７６７−７７７；Ｓｈｅｌｄｏｎら（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８−７１９、およびＫｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３−７５９を参照のこと。
検出は、例えば、二重鎖核酸に特異的に結合する標識された検出部分（例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんに対して特異的である抗体）を用いて達成することができる。ある好ましい例は、（一般的に組換えまたは共有結合的化学結合によって）抗体が酵素に連結された、ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖を認識する抗体を使用する。酵素がその基質と反応し、検出可能な生成物をもたらす場合、抗体は検出される。Ｃｏｕｔｌｅｅら（１９８９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８１：１５３−１６２；Ｂｏｇｕｌａｖｓｋｉ（１９８６）らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８９：１２３−１３０；Ｐｒｏｏｉｊｅｎ−Ｋｎｅｇｔ（１９８２）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１４１：３９７−４０７；Ｒｕｄｋｉｎ（１９７６） Ｎａｔｕｒｅ ２６５：４７２−４７３，Ｓｔｏｌｌａｒ（１９７０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６５：９９３−１０００；Ｂａｌｌａｒｄ（１９８２） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：７９３−７９９；ＰｉｓｅｔｓｋｙおよびＣａｓｔｅｒ （１９８２） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：６４５−６５０；Ｖｉｓｃｉｄｉら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４１：１９９−２０９；およびＫｉｎｅｙら（１９８９） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：６−１２は、ホモおよびヘテロニ重鎖を含めた、ＲＮＡ二重鎖に対する抗体を記載している。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのための特異的な抗体を含むキットは、例えば、Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手できる。
入手できる抗体に加えて、当業者は、既存の技術を使用して核酸二重鎖のための特異的な抗体を容易に作製する、あるいは、商業的にまたは公的に入手できる抗体を改変することができる。上で示された技術に加えて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体をもたらすための一般的な方法が、当業者に知られている（例えば、Ｐａｕｌ（３ｒｄ ｅｄ．）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｌｉｇａｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｓｔｉｔｅｓら編、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびその中に引用される参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。抗体調製のための他の適切な技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリの選択が含まれる（ＨｕｓｅらＳｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照のこと）。特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも０．０１μＭまたはそれ以上、最も一般的かつ好ましくは、０．００１μＭのＫＤで結合する。
本発明に使用される核酸は、陽性または陰性プローブであり得る。陽性プローブは、その標的に結合するので、二本鎖形成の存在は、標的の存在の証拠である。陰性プローブは、標的と疑われるものに結合できないので、二本鎖形成が存在しないことが、標的の存在の証拠である。例えば、野生型の特異的な核酸プローブまたはＰＣＲプライマーの使用は、当該のヌクレオチド配列のみが存在する場合、分析サンプル中で陰性プローブとして働くことができる。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増大させる核酸増幅系の使用を介して増強することができる。こうした系の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系、特にＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が含まれる。当分野で最近記載されている他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱベータ・レプリカーゼ系である。こうした系は、ＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが、選択された配列が存在する場合にのみ延長または連結されるように設計される場合、突然変異体を直接的に同定するために使用することができる。あるいは、選択された配列は概して、例えば、非特異的ＰＣＲプライマーを使用して、増幅することができ、増幅された標的領域は、後に、突然変異の指標となる特異的な配列についてプローブで探索される。
本発明の核酸の発現レベルを決定するための代替の手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、よく知られており、一般に、Ａｎｇｅｒｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６４９−６６０（１９８７））に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析では、細胞、選択的には小脳または海馬由来のヒトの細胞は、固体支持体、一般的にスライドガラスに固定される。ＤＮＡをプローブで探索する場合は、細胞は熱またはアルカリで変性させる。次いで、細胞を、中温でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識された特異的なプローブのアニーリングを可能にする。プローブは、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識されることが好ましい。
Ｖ．本発明のポリペプチドの免疫学的な検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を使用するポリヌクレオチド発現の検出に加えて、本発明のポリペプチドを検出するために、イムノアッセイを使用することもできる。イムノアッセイは、ポリペプチドを質的または量的に分析するために使用することができる。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）において見出される。
Ａ．標的ポリペプチドまたは他の免疫原に対する抗体
当該のタンパク質または他の免疫原と特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体をもたらすための方法は、当業者に知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、上記文献；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記文献；Ｓｔｉｔｅｓら、上記文献、およびその中の引用文献；Ｇｏｄｉｎｇ、上記文献；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。こうした技術には、ファージまたは類似のベクターにおける、組換え抗体のライブラリからの抗体の選択による抗体調製が含まれる（Ｈｕｓｅら、上記文献；およびＷａｒｄら、上記文献を参照のこと）。例えば、イムノアッセイで使用するための抗血清を産生するために、当該のタンパク質またはその抗原性フラグメントは、本明細書に記述する通りに単離される。例えば、組換え型タンパク質は、形質転換細胞系で産生される。マウスまたはウサギの近交系は、フロイントアジュバントなどの標準のアジュバントおよび標準の免疫化プロトコルを使用して、タンパク質を用いて免疫される。あるいは、本明細書に開示された配列から得られ、かつ担体タンパク質に結合された合成ペプチドを、免疫原として使用することができる。
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイにおいて免疫原に対して力価測定する。１０４以上の力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、無関係のタンパク質、または他の生物由来の他の相同タンパク質に対するその交差反応性について、競合結合イムノアッセイを使用して試験する。特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より通常は少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはそれよりよく、最も好ましくは０．０１μＭまたはそれよりよいＫＤで結合することとなる。
免疫原を含む本発明のいくつかのタンパク質は、当該のタンパク質と特異的または選択的に反応する抗体を産生するために使用することができる。組換え型タンパク質は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のために好ましい免疫原である。表１〜４および図１に記載される遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むものなど、天然に存在するタンパク質も、純粋な形でも純粋でない形でも使用することができる。本明細書に記載されるタンパク質配列を使用して作製される合成ペプチドも、タンパク質に対する抗体の産生のための免疫原として使用することができる。組換え型タンパク質を、真核または原核生物の細胞中に発現させ、概して上に記述した通りに精製することができる。次いで、この産物を、抗体を産生することが可能な動物に注入する。該タンパク質を測定するために、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを、イムノアッセイにおけるその後の使用のために産生することができる。
ポリクローナル抗体の産生法は、当業者に知られている。手短に言えば、免疫原（好ましくは精製されたタンパク質）をアジュバントと混合し、動物を免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫反応は、試験血液を採取し、当該のポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによってモニタリングする。免疫原に対する適切に高い力価の抗体が得られる場合、その動物から血液を収集し、抗血清を調製する。所望により、タンパク質に対して反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画を行うことができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記文献を参照のこと）。
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な技術を使用して得ることができる。一般的に、所望の抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞と融合させることによって不死化させる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照のこと）。不死化の代替法には、例えば、エプスタイン・バーウイルス、ガン遺伝子、またはレトロウイルスを用いる形質転換、あるいは当分野でよく知られた他の方法が含まれる。単一の不死化された細胞から生じたコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされるが、こうした細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物の宿主の腹腔への注射を含めた、様々な技術によって増強することができる。あるいは、Ｈｕｓｅら、上記文献によって概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトのＢ細胞由来のＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
一旦、標的タンパク質特異的抗体が入手できると、タンパク質は、臨床医に入手できる、質的および量的結果を伴う様々なイムノアッセイ方法によって測定することができる。一般の免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の総説については、Ｓｔｉｔｅｓ、上記文献を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、いくつかの形態のいずれかで実施することができ、これは、Ｍａｇｇｉｏ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ、上記文献；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記文献に詳細にわたって概説されている。
ヒトのサンプル中の標的タンパク質を測定するイムノアッセイは、タンパク質（例えば、図１、図５〜８、または表１〜４に列挙された遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有するもの）、またはそのフラグメントに対して産生されたポリクローナル抗血清を使用することができる。この抗血清は、異なるタンパク質に対して低い交差反応性を有するように選択され、こうしたいずれの交差反応性も、イムノアッセイにおける使用の前に、免疫吸着によって取り除かれる。
Ｂ．免疫学的な結合アッセイ
好ましい実施態様では、当該のタンパク質は、いくつかのよく知られた免疫学的な結合アッセイのいずれかを使用して検出および／または定量化される（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；および第４，８３７，１６８号を参照のこと）。一般的なイムノアッセイの総説については、Ａｓａｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ（１９９３）；Ｓｔｉｔｅｓ、上記文献も参照のこと。免疫学的な結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は一般的に、分析物（この場合、本発明のポリペプチドまたはその抗原性の部分配列）と特異的に結合し、しばしばこれを固定するために、「捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）剤」を利用する。捕獲剤は、分析物に特異的に結合する部分である。好ましい実施態様では、捕獲剤は、例えば、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体である。抗体は、当業者によく知られたいくつかの手段のいずれかによって、上で述べた通りに産生することができる。
イムノアッセイはまた、捕獲剤と分析物によって形成される結合複合体に特異的に結合して標識するために、しばしば標識化薬剤を利用する。標識化薬剤はそれ自体、抗体／分析物複合体を含む部分の１つである。あるいは、標識化薬剤は、例えば、抗体／タンパク質複合体と特異的に結合する、別の抗体などの第３の部分である可能性もある。
好ましい実施態様では、標識化薬剤は、標識を持つ第二抗体である。あるいは、第二抗体は、標識を欠いている可能性があるが、これが、続いて、第二抗体が得られる種の抗体に特異的な、標識された第３の抗体に結合される可能性がある。第二抗体は、ビオチンなどの検出可能な部分で改変することができ、これに、酵素標識されたストレプトアビジンなどの第３の標識分子が、特異的に結合することができる。
特異的に免疫クロブリン定常領域と結合することが可能な他のタンパク質（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ）も、標識薬剤として使用することができる。こうしたタンパク質は、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）の細胞壁の通常の成分である。これらは、様々な種由来の免疫クロブリン定常領域との強い非免疫原性の反応性を示す（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）を参照のこと）。
分析全体を通して、試薬をそれぞれ組み合わせた後に、保温および／または洗浄ステップが必要とされる可能性がある。保温ステップは、約５秒から数時間まで、好ましくは約５分から約２４時間まで変動し得る。インキュベーション時間は、アッセイフォーマット、分析物、溶液の体積、濃度などに依存する。通常、分析は、周囲温度で実施されることとなるが、これは、１０℃から４０℃までの範囲にわたる温度で行うことが可能である。
１．非競合的アッセイ形式
組織サンプルから当該のタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的である可能性がある。非競合イムノアッセイは、捕獲された分析物（この場合タンパク質）の量が、直接的に測定される分析である。ある好ましい「サンドイッチ」分析では、例えば、捕獲剤（例えば図１、図５〜８、または表１〜４に列挙される遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体）を、それが固定される固体基板に直接的に結合させることができる。次いで、こうした固定された抗体は、試験サンプル中に存在するポリペプチドを捕獲する。このように固定されたポリペプチドは、次いで、標識をもつ第二抗体などの標識化薬剤によって結合される。あるいは、第二抗体は、標識を欠いている可能性があるが、これは、続いて、第二抗体が得られる種の抗体に特異的な、標識された第３の抗体に結合される可能性がある。第二抗体は、ビオチンなどの検出可能な部分で改変することができ、これに、酵素標識されたストレプトアビジンなどの第３の標識分子が、特異的に結合することができる。
２．競合アッセイ形式
競合アッセイでは、サンプル中に存在する（図１、図５〜８、または表１〜４に列挙される遺伝子によってコードされるポリペプチドなどの）分析物の量は、サンプル中に存在する分析物によって捕獲剤（例えば分析物に特異的な抗体）から置き換えられる（またはそれと競合する）加えられた（外因性の）分析物の量を測定することによって、間接的に測定される。ある競合アッセイでは、この場合では既知量の当該のタンパク質が、サンプルに加えられ、次いで、サンプルが捕獲薬剤と接触され、この場合には抗体が本発明のポリペプチドに特異的に結合する。抗体に結合される免疫原の量は、サンプル中に存在する免疫原の濃度に反比例する。特に好ましい実施形態では、抗体は、固体基板上に固定される。例えば、抗体に対する結合されるポリペプチドの量は、タンパク質／抗体複合体中に存在する対象タンパク質の量を測定することによって、あるいは、残留する非複合型タンパク質の量を測定することによって決定することができる。タンパク質の量は、標識されたタンパク質分子を提供することによって検出することができる。
競合結合形式におけるイムノアッセイは、交差反応性の決定のために使用することができる。例えば、当該のタンパク質を、固体支持体に固定することができる。タンパク質は、固定された抗原への抗血清の結合と競合する分析に加えられる。固定されたタンパク質への抗血清の結合と競合する上述のタンパク質の能力を、当該のタンパク質の能力と比較する。上述のタンパク質の交差反応性（％）は、標準の計算を使用して算出される。上で列挙されるタンパク質の各々との交差反応性が１０％未満である抗血清を、選択し、プールする。交差反応性抗体は、考慮されるタンパク質、例えば、わずかに関連する相同体を用いる免疫吸着によって、プールされた抗血清から場合によっては取り除かれる。
次いで、免疫吸着されたプールされた抗血清を、おそらく本発明のタンパク質であると考えられる第２のタンパク質を、免疫原タンパク質と比較するために、上で述べた通りに競合結合イムノアッセイに使用する。この比較を行うために、２つのタンパク質は、多様な濃度でそれぞれ分析され、固定されたタンパク質に対する抗血清の結合の５０％を阻害するために必要とされる各タンパク質の量が決定される。必要とされる第２のタンパク質の量が、必要とされる本明細書の配列によって部分的にコードされるタンパク質の量の１０倍未満である場合、第２のタンパク質は、標的タンパク質からなる免疫原に対して産生される抗体に特異的に結合すると言われる。
３．他の分析形式
特に好ましい実施形態では、サンプル中の本発明のポリペプチドの存在を検出および定量化するために、ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析が使用される。この技術は一般に、分子量に基づいて、ゲル電気泳動によってサンプルタンパク質を分離すること、適切な固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化されたナイロンフィルターなど）に、分離されたタンパク質を移すこと、および当該のタンパク質と特異的に結合する抗体と共にサンプルを保温することを含む。例えば、抗体は、固体支持体上の当該のポリペプチドに特異的に結合する。こうした抗体は、直接的に標識することもできるし、当該のタンパク質に対する抗体に特異的に結合する標識された抗体（例えば標識されたヒツジ抗マウス抗体）を使用して、その後検出することもできる。
他の分析形式としては、特定の分子（例えば抗体）と結合するために設計されたリポソームを使用し、カプセル化された試薬またはマーカーを放出するリポソーム・イムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられる。その後、放出された化学物質は、標準の技術に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８６）Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１を参照のこと）。
４．標識
分析において使用される特定の標識または検出可能な基は、それが分析において使用される抗体の特定の結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理または化学特性を有している任意の材料であり得る。こうした検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、一般に、こうした方法に有用なほとんどの標識を、本発明に適用可能である。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識が含まれる。
標識は、当分野でよく知られた方法に従って、所望の分析の成分に、直接的または間接的に結びつけることができる。上で示した通り、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性要件、利用可能な機器、および廃棄設備に応じた標識の選択に伴い、非常に様々な標識が使用される可能性がある。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。これらの分子はまた、例えば、酵素または蛍光化合物との結合によって、シグナル発生化合物に直接的に結合させることができる。様々な酵素および蛍光化合物を、本発明の方法と共に使用することができ、また、これらは当業者よく知られている（使用される可能性がある様々な標識化またはシグナル産生系の総説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと）。
標識を検出する手段は、当業者によく知られている。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィにおける写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、それは、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、得られる蛍光を検出することによって検出することができる。蛍光は、電子検出器（電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管など）を使用することにより、写真フィルムを用いて、視覚的に検出することができる。同様に、酵素的標識は、酵素に適した基質を提供し、得られる反応生成物を検出することによって検出することができる。最終的に単純な比色標識は、標識に伴われる色を観察することによって、直接的に検出することができる。したがって、様々なディップスティック分析では、結合された金は、しばしばピンクに見えるのに対して、様々な結合されたビーズは、ビーズの色に見える。
ある種の分析形式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、標的抗体の存在を検出するために、凝集分析を使用することができる。この場合、抗原でコートされた粒子が、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、成分のいずれも標識される必要はなく、標的抗体の存在は、単純な外観検査によって検出される。
ある種の実施形態では、患者におけるＢＰまたはＭＤＤは、例えば、図１、図５〜８、または表１〜４などの、本明細書に特定される１つ以上の適切に異常調節された遺伝子配列のｉｎ ｓｉｔｕ発現を視覚化することによって、診断または評価することができる。生きている患者の脳内の核酸、ポリペプチド、および他の生化学物質を含めた分子の存在または発現を視覚化する当業者は、本明細書に記述される遺伝子発現情報が、様々な視覚化方法において利用される可能性があることを認識するであろう。こうした方法には、それだけには限らないが、単光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）方法が含まれる。例えば、ＶａｓｓａｕｘおよびＧｒｏｏｔ−ｗａｓｓｉｎｋ、「Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：９２−１０１（２００３）を参照のこと。
ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングは、器官および組織の化学的な機能を示すのに対して、他の撮像技術−Ｘ線、ＣＴ、およびＭＲＩなど−は、構造を示す。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングの使用は、双極性障害、大うつ病障害、精神分裂症、および関連する障害を含めた脳疾患の発生を定量化およびモニタリングするために有用である。場合によっては、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージングの使用により、症状発現の数年前に疾患の検出が可能になる。ポリペプチドおよびヌクレオチドの存在または発現を標識化および視覚化するのための小分子の使用は、例えば、Ｈｅｒｈｏｌｚ Ｋら、Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．，６（４）：２３９−６９（２００４）；Ｎｏｒｄｂｅｒｇ Ａ、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，３（９）：５１９−２７（２００４）；Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ Ｒｅｖ．、Ｚａｋｚａｎｉｓ ＫＫら、１３（１）：１−１８（２００３）；Ｋｕｎｇ ＭＰら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１０２５（ｌ−２）：９８−１０５（２００４）；およびＨｅｒｈｏｌｚ Ｋ、Ａｎｎ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．，１７（２）：７９−８９（２００３）によって記載される通り、アルツハイマー病患者の脳内のタンパク質を視覚化することにおいて成功している。
図１、図５〜８または表１〜４に開示される異常調節された遺伝子またはそのコードされたペプチド（もしあれば）、あるいはそれらのフラグメントを、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージング用途に使用することができる。ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ用途に適切なトレーサー（ｔｒａｃｅｒ）残基での改変の後、図１、図５〜８、または表１〜４中における転写産物と、あるいは転写産物によってコードされる任意のポリペプチドと、相互作用または結合する分子を、遺伝子発現のパターンを視覚化するために、また、本明細書に記述する通りの精神分裂症、ＭＤＤ、ＢＰ、および関連する障害の診断を容易にするために使用することができる。同様に、コードされるポリペプチドが酵素をコードする場合、酵素による触媒反応の生成物と相互作用する標識分子を、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングおよび本明細書に記述する診断用途で使用することができる。
アンチセンス技術は、特に、図１、図５〜８、または表１〜４に特定される転写産物を検出するのに適している。例えば、１１１Ｉｎなどの適切な放射性核種で標識され、生体膜バリアを横切る輸送を可能にする脳薬物ターゲティングシステムに結合させたアンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用は、脳ガンにおける内因性の遺伝子発現のイメージングを可能にすることが実証されている。Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０：１７６６−１７７５（２００４）を参照のこと。Ｓｕｚｕｋｉらは、血液脳関門でトランスフェリン受容体を標的にし、血液脳関門を横切るＰＮＡの輸送を容易にする、モノクローナル抗体を含む送達システムを利用している。この技術の改変された実施形態を、分裂病患者、ＢＰ、またはＭＤＤ患者を治療する方法において、精神分裂症、ＢＰまたはＭＤＤに関連する上方調節された遺伝子（図１、図５〜８、または表１〜４に載せた上方調節された遺伝子など）を標的にするために使用することができる。
他の実施形態では、図１、図５〜８、または表１〜４に列挙される異常調節された遺伝子は、出生前および新生児の診断法に使用することができる。例えば、胎児または新生児のサンプルを得ることができ、適切な転写産物（例えば、図１、図５〜８、または表１〜４における転写産物）の発現レベルを、精神障害（例えばＭＤＤ）の存在または可能性の増大を測定し、その存在または可能性の増大と関連づけることができる。同様に、図１に特定されるＳＮＰの１つ以上の存在は、胎児期、新生児、小児、および成人患者における気分障害の遺伝子の異常調節された発現およびその可能性を推定するまたは確証するために使用することができる。
他の実施形態では、本明細書に記述される脳標識化および撮像技術、またはそれらの変形を、法医学的分析において、すなわち、死亡した人が精神分裂症、ＢＰ、またはＭＤＤを患っていたかどうか決定するために、図１、図５〜８、または表１〜４における異常調節された遺伝子配列のいずれかと共に使用することができる。
ＶＩ．本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの調節因子のスクリーニング
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調節因子、すなわちその活性のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の調節因子は、気分障害または精神病性障害を含めたいくつかのヒトの疾患を治療するために有用である。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節するアゴニスト、アンタゴニスト、または他の薬剤の投与を、気分障害または精神病性障害を患う患者を治療するために使用することができる。
Ａ．スクリーニング法
細胞、特に哺乳類細胞、とりわけヒト細胞における本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの発現レベルまたは活性を調節する薬剤を同定するために、いくつかの異なるスクリーニング・プロトコルを利用することができる。一般的には、スクリーニング法は、例えば、本発明のポリペプチドに結合させること、あるいはポリペプチドに結合する抑制剤を調節すること、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を活性化することによって、ポリペプチド活性を調節する薬剤を特定するために、複数の薬剤をスクリーニングすることを含む。
１．結合アッセイ
こうして特定される少なくともいくつかの薬剤が、おそらくポリペプチド活性の調節因子であると考えられるので、本発明のポリペプチドへの結合が可能な薬剤に対するスクリーニングによって、予備的なスクリーニングが行われる可能性がある。結合アッセイは通常、本発明のポリペプチドを、１つ以上の試験薬剤と接触させることと、タンパク質と試験薬剤が結合複合体を形成するのに十分な時間を与えることを含む。形成されるいずれの結合複合体も、いくつかの確立された解析手法のいずれかを使用して検出することができる。タンパク質結合アッセイには、それだけには限らないが、共沈、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の共遊走およびウェスタンブロット上の共遊走を測定する方法が含まれる。Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．ら編）内の、ＢｅｎｎｅｔおよびＹａｍａｍｕｒａ、（１９８５）「Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ」（ｐｐ．６１−８９）を参照のこと。こうした分析に利用されるタンパク質は、天然に発現される可能性もあるし、クローン化される可能性もあるし、合成される可能性もある。
結合アッセイはまた、例えば、本発明のポリペプチドと相互作用する内因性のタンパク質を特定するために有用である。例えば、結合アッセイでは、本発明のポリペプチドと結合する抗体、受容体、または他の分子を、特定することができる。
２．発現分析
特定のスクリーニング法は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を上方または下方調節する化合物についてスクリーニングすることを含む。こうした方法は、概して、試験化合物を、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する１つ以上の細胞と接触させるような、細胞に基づく分析を行うことと、その後、発現の増減（転写産物、翻訳産物、または触媒産物のいずれか）を検出することが必要である。ある種の分析は、末梢細胞、または本発明の内因性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する他の細胞を用いて実施される。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現は、いくつかの異なる方法で検出することができる。以下に記述する通り、細胞中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルは、本発明のポリヌクレオチドの転写産物（またはそこから得られる相補的な核酸）と特異的にハイブリッド形成するプローブを用いて細胞中に発現されるｍＲＮＡを探索することによって決定することができる。探索は、細胞を溶解させてノーザンブロットを行うことによって、あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成技術を使用して細胞を溶解させずに行うことができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する細胞可溶化物が抗体を用いて探索されるような、免疫学的な方法を使用して検出することができる。
細胞に基づく他の分析は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現しない細胞を用いて行われるレポーター分析である。こうした分析のうちのあるものは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドのプロモーターを含む異種核酸構築物を用いて行われる。多くの異なるレポーター遺伝子を利用することができる。ある種のレポーターは、本質的に検出可能である。こうしたレポーターの例は、蛍光検出器で検出可能な蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。他のレポーターは、検出可能な産物を生じる。こうしたレポーターはしばしば、酵素である。例示的な酵素レポーターには、それだけには限らないが、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ（１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびアルカリ性ホスファターゼが含まれる（Ｔｏｈら（１９８０） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８；およびＨａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）。
こうした分析では、レポーター構築物を内在する細胞を、試験化合物と接触させる。それに結合することによってプロモーターを活性化する、あるいは、プロモーターを活性化する分子を産生するカスケードを誘発する試験化合物は、検出可能なレポーターを発現させる。他の特定のレポーター分析は、本発明のポリヌクレオチドと、それに作動可能に連結されるレポーターの発現を活性化する転写調節因子を含む異種構築物を内在する細胞を用いて行われる。ここではまた、転写制御因子に結合してレポーターの発現を活性化する薬剤、あるいは、転写制御要素に結合する薬剤の形成を誘発してレポーター発現を活性化するための薬剤を、レポーター発現に伴うシグナルの産生によって特定することができる。
発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。上で示した通り、ベースライン値は、対照サンプル（例えば気分障害または精神病性障害のリスクを有さない健康な個人）の値、または対照群の発現レベルの代表である統計的値であり得る。発現レベルは、また、負の調節として本発明のポリヌクレオチドを発現しない細胞についても決定することができる。こうした細胞は概して、他の点では試験細胞と実質的に遺伝的に同じである。
レポーター分析では、異なるタイプの様々な細胞を利用することができる。本発明の内因性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する細胞には、例えば、小脳、前部帯状皮質、背外側前頭前野、扁桃体、海馬、または側座核由来の細胞を含めて、脳細胞が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを内因的に発現しない細胞は、原核性であってもよいが、好ましくは真核性である。真核細胞は、組換え型核酸構築物を内在する細胞を生じる際に一般的に利用される細胞のいずれかであり得る。例示的な真核細胞には、それだけには限らないが、酵母および様々な高等真核細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯ、およびＨｅＬａ細胞系統など）が含まれる。
観察された活性が確実であることを確認するために、レポーター構築物を欠く細胞を用いる並行反応、あるいは、レポーター構築物を内在する細胞を試験化合物と接触させないことによる平衡反応を行うことを含めた様々な対照を行うことができる。化合物はまた、以下で述べるように、さらに検証することができる。
３．触媒活性
本発明のポリペプチドの触媒活性は、酵素による産物の産生を測定することによって、あるいは基質の消費を測定することによって決定することができる。活性は、触媒反応の速度か、該ポリペプチドが基質と結合する（Ｋｍ）あるいは触媒産物（Ｋｄ）を放出する能力かのいずれかを指す。
本発明のポリペプチドの活性の分析は、一般的な生化学的分析に従って実施される。こうした分析には、精製されたまたは部分的に精製されたポリペプチドまたは未精製の細胞可溶化物を使用する、細胞に基づく分析、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ分析が含まれる。これらの分析は概して、既知量の基質を提供することと、時間の関数として産物を定量化することを含む。
４．検証
前述のスクリーニング法のいずれかによって最初に特定された薬剤は、明確な活性を検証するために、さらに試験することができる。こうした研究は、適切な動物モデルを用いて行われることが好ましい。こうした方法の基本形式は、最初のスクリーニング中に特定されたリード化合物を、人間に対するモデルとして働く動物に投与し、その後、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が実際に上方調節されたかどうか決定することを含む。検証研究に利用される動物モデルは概して、任意の種類の哺乳類である。適切な動物の具体例としては、それだけには限らないが、霊長類、マウス、およびラットが挙げられる。本明細書に記述する通り、既知の治療薬の投与を使用するモデルが、有用であり得る。
５．動物モデル
精神障害の動物モデルはまた、調節因子のスクリーニングへの使用が見いだされている。一実施形態では、ショウジョウバエモデルなどの無脊椎動物モデルを、本明細書に開示されるヒト遺伝子のショウジョウバエ・オルソログの調節因子のスクリーニングのために使用することができる。別の実施形態では、例えば、適切な遺伝子ターゲティングベクターを用いる相同的組換えまたは遺伝子過剰発現の結果としての遺伝子ノックアウト技術を含めたトランスジェニック動物技術は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を、存在させない、低下させる、あるいは増大させることとなる。同じ技術はまた、ノックアウト細胞を作製するためにも適用することができる。所望される場合、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの組織特異的発現またはノックアウトが必要である可能性がある。こうした方法によって産生されるトランスジェニック動物は、精神病の動物モデルとしての使用が見い出されており、精神病の調節因子のスクリーニングに有用である。
ノックアウト細胞およびトランスジェニックマウスは、相同的組換えを介して、マウスゲノムにおける内因性遺伝子部位に、マーカー遺伝子または他の異種遺伝子を挿入することによって作製することができる。こうしたマウスはまた、本発明の内因性のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドの突然変異型で置換することによって、あるいは内因性のポリヌクレオチドを突然変異させることによって、例えば、発癌物質への曝露によって作製することができる。
適切な幹細胞の開発については、ＤＮＡ構築物は、胚性幹細胞の核に導入される。新たに操作された遺伝的病変を含有する細胞を、宿主マウス胚に注入し、これを、レシピエントの雌に再移植する。こうしたの胚うちのいくつかは、発生すると、突然変異体細胞系に部分的に由来する生殖細胞を持つキメラマウスになる。したがって、キメラマウスを飼育することによって、導入された遺伝的病変を含有する新規の系統のマウスを得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８（１９８９）を参照のこと）。キメラ標的化マウスは、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、およびＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，（１９８７）に従って得ることができる。
Ｂ．本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調節因子
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調節因子として試験される薬剤は、任意の小さな化学物質または生物学的実体（タンパク質、糖、核酸、または脂質など）であり得る。あるいは、調節因子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの遺伝子改変型（例えば、ＦＧＦ２、ＮＣＡＭ、またはＦＧＦ系のペプチドインヒビターの組換え型または変化型）であり得る。一般的に、試験化合物は、化学小分子およびペプチドである。基本的には、いずれの化学物質も、本発明の分析において潜在的な調節因子またはリガンドとして使用される可能性があるが、多くの場合、水性または有機（とりわけＤＭＳＯベースの）溶媒に溶解可能である化合物が使用される。これらの分析は、一般には並行して行われる、分析ステップを自動化すること、また、分析に対する任意の好都合な起源由来の化合物を提供することによって（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式で）、大きな化学的なライブラリをスクリーニングするために設計される。周知のことだが、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含めて、化学物質の多くの供給会社が存在する。また、調節因子としては、本発明のｍＲＮＡ（例えばアンチセンス分子、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅなど）のレベル、またはｍＲＮＡからの翻訳のレベルを低下させるために設計された薬剤が含まれる。
ある好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療化合物（潜在的な調節因子またはリガンド化合物）を含有するコンビナトリアルケミカルライブラリまたはペプチドライブラリを提供することを含む。次いで、こうした「コンビナトリアルケミカルライブラリ」または「リガンドライブラリ」は、所望の特徴的な活性を示すライブラリメンバー（特定の化学種または亜種）を特定するために、本明細書に記述する通りに、１つ以上の分析でスクリーニングされる。このようにして特定された化合物を、従来の「リード化合物」として作用させることもできるし、潜在的治療薬または実際の治療薬として、それ自体で使用することもできる。
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などのいくつかの化学的「構築ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）」を組み合わせることによる、化学合成または生物学的合成のいずれかによって産生される様々な化学物質の集団である。例えば、ポリペプチドライブラリなどの線状のコンビナトリアルケミカルライブラリは、所与の化合物長（すなわちポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）に対するあらゆる可能な方法で、一連の化学的構築ブロック（アミノ酸）を組み合わせることによって形成される。何百万もの化合物を、化学的な構築ブロックのこうしたコンビナトリアルミキシングを介して合成することができる。
コンビナトリアルケミカルライブラリの調製およびスクリーニングは、当業者によく知られている。こうしたコンビナトリアルケミカルライブラリには、それだけには限らないが、ペプチドライブラリが含まれる（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）、およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）。化学的多様性のライブラリを産生するための他の化学も使用することができる。こうした化学には、それだけには限らないが、以下が含まれる：ペプトイド（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２０２４２）、ランダムなバイオ−オリゴマー（例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル様（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース足場材料（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を用いる非ペプチド性ペプチドミメティクス（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小さな化合物ライブラリの類似の有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホナート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリ（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、すべて上記文献を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリ（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリ（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機小分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ，Ｊａｎ １８，ｐａｇｅ ３３（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
コンビナトリアルライブラリの調製のための装置は、市販品として入手できる（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ；４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリそれ自体を、市販品として入手できる（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
Ｃ．固体状態および可溶性のハイスループット分析
本発明のハイスループット分析では、１日で、数千にも及ぶ異なる調節因子またはリガンドをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択される潜在的調節因子に対して別々の分析を行うために使用することもできるし、濃度またはインキュベーション時間の影響が観察されることになっている場合、５〜１０のウェル毎に、単一の調節因子が試験される可能性もある。このように、単一の標準のマイクロタイタープレートは、約１００（例えば９６）の調節因子を分析することができる。１５３６ウェルのプレートが使用される場合、単一のプレートは、約１００から１５００の異なる化合物を容易に分析することができる。１日につきいくつかの異なるプレートを分析することが可能であり、本発明の統合されたシステムを使用して、最高約６，０００〜２０，０００までの異なる化合物に対する分析スクリーニングが可能である。最近では、試薬操作に対する微小流体アプローチが開発されている。
当該の分子は、共有結合的または非共有結合的な結合を介して、例えば、タグを介して、固体状態成分に直接的または間接的に結合することができる。タグは、様々な成分のいずれかであり得る。一般に、タグ（タグ結合剤）と結合する分子は、固体支持体に固定され、当該の標識分子は、タグとタグ結合剤の相互作用によって固体支持体に付着される。
文献中に十分に記述されている既知の分子的相互作用に基づく、多くのタグおよびタグ結合剤を使用することができる。例えば、タグは、天然の結合剤、例えば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧを有する場合、適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免疫クロブリンのＦｃ領域）と共に使用することができる。ビオチンなどの天然の結合剤を伴う分子に対する抗体も、広く利用可能であり、かつ、適切なタグ結合剤である（ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯを参照のこと）。
同様に、任意のハプテン性または抗原性の化合物を、タグ／タグ結合剤対を形成するために、適切な抗体と組み合わせて使用することができる。何千もの特異的抗体が、市販品として入手でき、多くのさらなる抗体が文献中に記述されている。例えば、ある共通の構造では、タグは第一抗体であり、タグ結合剤は、第一抗体を認識する第二抗体である。抗体−抗原の相互作用に加えて、細胞膜受容体のアゴニストとアンタゴニストなどの受容体−リガンドの相互作用も、タグおよびタグ結合剤対として適切である（例えば、細胞受容体−リガンドの相互作用、例えば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫クロブリン受容体、および抗体、カドヘリン・ファミリー、インテグリン・ファミリー、セレクチン・ファミリーなど；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ＆Ｐｏｗｅｒ、Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ（１９９３）を参照のこと）。同様に、毒素および毒、ウイルス性のエピトープ、ホルモン（例えばオピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、これは、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド、およびビタミンＤ；ペプチドを含めて、様々な小さなリガンドの作用を仲介する）、薬物、レクチン、糖、核酸（線状および環状ポリマー構造）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、および抗体はすべて、様々な細胞受容体と相互作用することができる。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテートなどの合成ポリマーも、適切なタグまたはタグ結合剤を形成する可能性がある。多くの他のタグ／タグ結合剤対も、この開示の総説に関して当業者には明白であろうような、本明細書に記述される分析システムにおいて有用である。
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーも、タグとして作用することができ、これは、約５アミノ酸と２００アミノ酸の間のポリ−Ｇｌｙ配列などのポリペプチド配列を含む。こうしたフレキシブルリンカーは、当業者に知られている。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手できる。こうしたリンカーは、場合によっては、アミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
タグ結合剤は、現在利用できる様々な方法のいずれかを使用して、固体基板に固定される。固体基板は一般に、基質のすべてまたは一部を、タグ結合剤の一部と反応性である表面に化学基を固定する化学試薬に露出させることによって誘導体化される、あるいは官能性をもたせられる。例えば、より長い鎖部分に付着させるのに適した基には、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基が含まれるであろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス面などの様々な表面に官能性をもたせるために使用することができる。こうした固相生体高分子アレイの構築は、文献に十分に記載されている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えばペプチドの固相法を記載している）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相成分の合成を記載している）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成を記載している）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３７５９（１９９６）（すべて、固体基板に固定された生体高分子のアレイを記載している）を参照のこと）。基質にタグ結合剤を固定するための非化学的な手法には、他の一般的な方法（例えば熱、紫外線による架橋など）が含まれる。
本発明は、ハイスループット形式で、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節することができる化合物を同定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を提供する。好ましい実施態様では、本発明の方法は、こうした対照反応を含む。記載されている各々の分析形式については、調節因子を含まない「調節因子なしの」対照反応は、結合活性のバックグラウンドレベルを提供する。
ある種の分析では、分析の成分が適切に機能していることを確認するために、陽性対照を含めることが望ましいこととなる。少なくとも２つのタイプの陽性対照が、適切である。第１に、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの既知の活性剤を、分析の一サンプルと共に保温することができ、そこから得られるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルまたは活性の増大をもたらすシグナルの増加を、本明細書の方法に従って決定することができる。第２に、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの知られている抑制剤を加えることができ、そこから得られる発現または活性のシグナルの減少を、同様に検出することができる。
Ｄ．コンピュータに基づく分析
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する化合物に対するさらに別の分析は、コンピュータ支援ドラッグデザインを含む。ここでは、コンピュータシステムは、そのアミノ酸またはヌクレオチド配列によってコードされる構造情報に基づいて、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの三次元構造を作り出すために使用される。入力シーケンスは、コンピュータプログラム中にあらかじめ確立されたアルゴリズムを用いて、直接的かつ能動的に相互作用し、分子の二次、三次、および、四次構造モデルがもたらされる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの潜在的受容体または結合パートナーに関して、類似の分析を実施することができる。次いで、例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する能力を有する構造の領域を特定するために、タンパク質またはヌクレオチド構造のモデルを調べる。次いで、こうした領域を、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合するポリペプチドを特定するために使用する。
タンパク質の三次元構造モデルは、コンピュータシステムに、潜在的受容体をコードする少なくとも１０アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列または相当する核酸配列を入力することによって作製される。本明細書に提供される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、タンパク質の構造情報をコードする、タンパク質の一次配列または部分配列を表す。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を、コンピュータのキーボードから、それだけには限らないが、電子記憶媒体（例えば磁気フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、カートリッジ、およびチップ）、光学式媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）を含めて、コンピュータに読込可能な基体から、インターネット・サイトによって配信される情報から、およびＲＡＭによって、コンピュータシステムに入力する。次いで、当業者に知られているソフトウェアを用いて、アミノ酸配列とコンピュータシステムの相関によって、タンパク質の三次元構造モデルを作製させる。
アミノ酸配列は、当該のタンパク質の二次、三次、および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造に相当する。ソフトウェアは、構造モデルを作製するために、一次配列によってコードされる特定のパラメータに注目する。こうしたパラメータは、「エネルギー項」と呼ばれ、これには、主として静電ポテンシャル、疎水性ポテンシャル、溶媒接触可能表面、および水素結合が含まれる。二次エネルギー項には、ファンデルワールス力が含まれる。生体分子は、累積的様式でエネルギー項を最小限にするような構造をなす。したがって、コンピュータプログラムは、一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの項を使用して、二次構造モデルをもたらすものである。
次いで、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造が、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。この時点で使用者は、タンパク質が膜結合型であるか可溶性であるかどうか、体内におけるその局在、およびその細胞内での局在（例えば、細胞質、表面、または核）などのさらなる変数を入力することができる。二次構造のエネルギー項の他に、これらの変数が、三次構造のモデルを形成するために使用される。三次構造のモデリングでは、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水性面を同様のものとマッチさせ、二次構造の親水性面を同様のものとマッチさせる。
一旦構造が作り出されると、コンピュータシステムによって、潜在的リガンド結合領域が特定される。潜在的リガンドの三次元構造は、上で述べた通りに、化合物のアミノ酸またはヌクレオチド配列または化学式を入力することによって作製される。次いで、潜在的リガンドの三次元構造は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのそれと比較され、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの結合部位が特定される。どのリガンドが、タンパク質への結合の可能性を増強させるかを決定するために、エネルギー項を使用して、タンパク質とリガンドの間の結合親和性が決定される。
コンピュータシステムはまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレチドをコードする遺伝子の、突然変異、多型のバリアント、対立遺伝子、および異種間相同体のスクリーニングに使用される。こうした突然変異は、病態または遺伝形質に関連する可能性があり、診断のために使用することができる。上で述べた通り、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）および関連する技術も、突然変異、多型のバリアント、対立遺伝子、および異種間相同体のスクリーニングに使用することができる。一旦バリアントが特定されると、診断検査法を使用して、こうした突然変異した遺伝子を有する患者を特定することができる。本発明の突然変異したポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同定には、本発明のポリペプチドの第１のアミノ酸配列（または本発明のポリペプチドをコードする第１の核酸配列）、例えば、当該のアミノ酸配列と少なくとも６０％、場合によっては少なくとも７０％または８５％の同一性を有する任意のアミノ酸配列、またはそれらの保存的に改変された型の、入力を受けることが必要である。配列は、上で述べた通りにコンピュータシステムに入力される。次いで、第１の核酸またはアミノ酸配列は、第１の配列に対して実質的な同一性を有する第２の核酸またはアミノ酸配列と比較される。第２の配列は、上述した方式で、コンピュータシステムに入力される。一旦、第１の配列と第２の配列が比較されると、配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の違いが特定される。こうした配列は、本発明の様々なポリヌクレオチドにおける対立遺伝子の違い、ならびに病態および遺伝形質に関連する突然変異に相当する可能性がある。
ＶＩＩ．組成物、キット、および統合されたシステム
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのための特定の抗体などを使用する、本明細書に記述する分析を実践するための組成物、キット、および統合されたシステムを提供する。
本発明は、固相分析で使用するための分析組成物を提供し、こうした組成物は、例えば、固体支持体上に固定された本発明の１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および標識化試薬を含むことができる。例えば、このキットは、図１、図５〜８、または表１〜４に列挙される有益な配列のセットまたはサブセットからなるアレイを含む可能性がある。各場合において、分析組成物はまた、ハイブリッド形成にとって望ましいさらなる試薬を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性の調節因子も、分析組成物に含めることができる。
本発明はまた、本発明の治療および診断分析を実施するためのキットを提供する。キットは一般的に、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体を含むプローブ、およびプローブの存在を検出するための標識を含む。キットは、本発明のポリペプチドをコードするいくつかのポリヌクレオチド配列を含むことができる。キットは、上記文献の組成物のいずれかを含むことができ、場合によってはさらに、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現に対する、または本発明のポリペプチドの活性に対する影響について分析するハイスループット方法を実施するための、指示書などのさらなる構成部品（例えば、プローブ、標識などを保持するための）１つ以上の容器または区画、本発明のポリペプチドの発現または活性の対照調節因子、キット構成部品を混合するためのロボット電機子などを含む。
本発明は、また、本発明のポリペプチドの発現または活性に対する影響について潜在的調節因子をハイスループットスクリーニングするための統合されたシステムを提供する。このシステムは一般的に、流体を出所から目的地まで移動させるロボット電機子、ロボット電機子を制御するコントローラ、標識検出器、標識検出を記録するデータ記憶装置、および反応混合物、または固定された核酸または固定化部分を含む基板を有するウェルを備えるマイクロタイター皿などの分析部品を含む。
いくつかのロボット流体輸送システムが入手可能である、あるいは、既存の構成部品から容易に作製することができる。例えば、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ；Ｒｅｎｏ，ＮＶ）ピペッティングステーションを使用する、Ｚｙｍａｔｅ ＸＰ（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）自動化ロボットを使用して、いくつかの並行する同時ＳＴＡＴ結合アッセイを始めるために、９６ウェル・マイクロタイタープレートに並行サンプルを移すことができる。
カメラまたは他の記録装置によって眺められる（場合によっては記録される）光学的画像（例えばフォトダイオードおよびデータ記憶装置）は、本明細書の実施形態のいずれかにおいては、例えば、画像をデジタル化し、コンピュータ上の画像を保存および分析することによって、場合によってはさらに加工される。様々な市販品として入手できる周辺装置およびソフトウェアは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ ｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ｃｈｉｐ−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＤＯＳ（登録商標）、ＯＳ２（登録商標）ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標） ＮＴ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９５（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）９８（登録商標）、またはＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）２０００（登録商標）に基づくコンピュータ）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ（登録商標）またはＵＮＩＸ（登録商標）に基づく（例えば、ＳＵＮ（登録商標）ワークステーション）コンピュータを使用して、デジタル化された映像またはデジタル化された光学的画像をデジタル化し、保存し、分析するために利用できる。
従来のあるシステムは、標本域から、当分野で常用の冷却された電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまで光を運ぶ。ＣＣＤカメラは、画素（ピクセル）のアレイを含む。標本からの光は、ＣＣＤ上に撮像される。各位置についての光強度読取り値を得るために、標本の領域に相当する特定ピクセル（例えば一連の生物重合体上の個々のハイブリダイゼーション部位）が、サンプリングされる。速度を増大するために、複数のピクセルが並行して加工される。本発明の装置および方法は、例えば、蛍光または暗視野顕微鏡技術によって、任意のサンプルを調査するために容易に使用される。
ＶＩＩＩ．投薬および薬剤組成物
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの調節因子（例えば、ＦＧＦ２、ＮＣＡＭなどのアンタゴニストまたはアゴニスト、ＦＧＦ系のペプチドインヒビター、または精神障害を患う対象において過剰発現する遺伝子のｓｉＲＮＡおよび／またはアンチセンスインヒビターを、ｉｎ ｖｉｖｏでそれらの分子の活性を調節するために、哺乳類の対象に直接的に投与することができる。投与は、調節因子化合物を、治療される組織と最終的に接触させるために通常使用され、当業者によく知られている経路のいずれかによるものである。特定の組成物を投与するために、２つ以上の経路を使用することもできるが、ある特定の経路が、別の経路よりも即時的で、より有効な反応をしばしば提供する可能性がある。
治療することが可能な疾患には、以下が含まれ、これらには、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＤＳＭ−ＩＶ Ｍａｄｅ Ｅａｓｙ，１９９５からの対応する参照番号が含まれる：精神分裂症、緊張型、亜慢性（２９５．２１）；精神分裂症、緊張型、慢性（２９５．２２）；急性増悪を伴う精神分裂症、緊張型、亜慢性（２９５．２３）；急性増悪を伴う精神分裂症、緊張型、慢性（２９５．２４）；精神分裂症、緊張型、緩解中（２９５．５５）；精神分裂症、緊張型、詳細不明（２９５．２０）；精神分裂症、無秩序型、亜慢性（２９５．１１）；精神分裂症、無秩序型、慢性（２９５．１２）；急性増悪を伴う精神分裂症、無秩序型、亜慢性（２９５．１３）；急性増悪を伴う精神分裂症、無秩序型、慢性（２９５．１４）；精神分裂症、無秩序型、緩解中（２９５．１５）；精神分裂症、無秩序型、詳細不明（２９５．１０）；精神分裂症、妄想型、亜慢性（２９５．３１）；精神分裂症、妄想型、慢性（２９５．３２）；急性増悪を伴う精神分裂症、妄想型、亜慢性（２９５．３３）；急性増悪を伴う精神分裂症、妄想型、慢性（２９５．３４）；精神分裂症、妄想型、緩解中（２９５．３５）；精神分裂症、妄想型、詳細不明（２９５．３０）；精神分裂症、未分化型、亜慢性（２９５．９１）；精神分裂症、未分化型、慢性（２９５．９２）；急性増悪を伴う精神分裂症、未分化型、亜慢性（２９５．９３）；急性増悪を伴う精神分裂症、未分化型、慢性（２９５．９４）；精神分裂症、未分化型、緩解中（２９５．９５）；精神分裂症、未分化型、詳細不明（２９５．９０）；精神分裂症、後遺症（ｒｅｓｉｄｕａｌ）、亜慢性（２９５．６１）；精神分裂症、後遺症、慢性（２９５．６２）；急性増悪を伴う精神分裂症、後遺症、亜慢性（２９５．６３）；急性増悪を伴う精神分裂症、後遺症、慢性（２９５．９４）；精神分裂症、後遺症、緩解中（２９５．６５）；精神分裂症、後遺症、詳細不明（２９５．６０）；妄想型障害（２９７．１０）；短期反応性精神病（２９８．８０）；精神分裂病型障害（２９５．４０）；分裂情動障害（２９５．７０）；誘発性精神病障害（２９７．３０）；精神病性障害ＮＯＳ（非定型精神病）（２９８．９０）；人格障害、妄想型（３０１．００）；人格障害、精神分裂病性（３０１．２０）；人格障害、統合失調型（３０１．２２）；人格障害、反社会的（３０１．７０）；人格障害、境界性（３０１．８３）、および双極性障害、気分変調、軽躁、躁病、または循環病、物質誘発性気分障害、大うつ病、精神病（妄想型精神病、緊張型精神病、錯覚型（ｄｅｌｕｓｉｏｎａｌ）精神病（分裂情動障害を有する）、および物質誘発性精神病障害を含めて）。
ある種の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの調節因子は、例えば、精神分裂症、双極性障害、または大うつ病などの気分障害を治療するのに有用であるものを含めた、精神障害を治療するのに有用な他剤と組み合わせることができる。ある種の好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物は、例えば、米国特許第６，２９７，２６２号；第６，２８４，７６０号；第６，２８４，７７１号；第６，２３２，３２６号；第６，１８７，７５２号；第６，１１７，８９０号；第６，２３９，１６２号、または第６，１６６，００８号に記載されているものなどの、精神分裂症、双極性障害、または大うつ病を治療するのに有用な少なくとも１種の化合物と組み合わせられた本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調節因子を含む。他の実施形態では、本発明の調節因子またはポリペプチド、特にＦＧＦ２は、学習障害、記憶喪失、または学習障害および記憶喪失に伴う障害を治療および／または予防するために使用することができる。
本発明の薬剤組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、また、組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、非常に様々な本発明の薬剤組成物の適切な処方物が存在する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現または活性の調節因子（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）を、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に（すなわち、これらを、「霧状にする」）、あるいは注射に有用な組成物に作製することができる。エアロゾル製剤は、加圧許容性のある噴射剤（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に入れることができる。
投与に適切な処方物は、水性および非水性の溶液（等張性の無菌液）を含み、これは、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および処方物を等張性にさせる溶質、および水性および非水性滅菌懸濁液（これは、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含む可能性がある）を含有することができる。本発明の実施においては、組成物は、例えば、経口的に、経鼻的に、局所的に、静脈内に、腹膜内に、あるいはクモ膜下腔内に投与することができる。化合物の処方物は、単位用量または多回用量密封容器（例えばアンプルおよびバイアル）で存在可能である。溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌した粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。調節因子はまた、調製済みの食品または薬物の一部として投与することもできる。
本発明においては、患者に投与される量は、時間とともに対象に有益な応答をもたらすのに十分でなければならない。いずれの患者に対する最適な投与レベルは、用いられる特定の調節因子の有効性、患者の年齢、体重、身体活動、および食事を含めた様々な因子に、他剤との可能な組み合わせに、かつ、精神障害の重症度に依存する。投与量の大きさはまた、特定の対象における特定の化合物またはベクターの投与に付随する、いずれかの有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
投与される調節因子の有効な量を決定する際に、医師は、調節因子の循環する血漿レベル、調節因子毒性、および抗調節因子抗体の産生を評価する可能性がある。一般に、調節因子の用量相当量は、典型的な対象について、約１ｎｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである。
投与については、本発明の調節因子は、様々な濃度における調節因子のＬＤ−５０、および、調節因子の副作用によって、対象の質量および健康全般に適合するように決定される割合で投与することができる。投与は、単回用量または分割された用量を介して達成できる。
ＩＸ．遺伝子治療の適用
様々なヒトの疾患は、遺伝子が転写され、遺伝子産物が細胞中に産生されるように、遺伝子をヒト細胞に安定に導入することを含む治療アプローチによって治療することができる。この手法による治療が適用できる疾患には、単一または複数の遺伝子に欠損があるものを含めた遺伝性疾患が含まれる。遺伝子治療はまた、後天性疾患および他の状態の治療にも有用である。遺伝性疾患ならびに後天性疾患の治療に対する遺伝子治療の適用に関する議論については、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；およびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）を参照のこと。
本発明においては、遺伝子治療は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが関係している様々な障害および／または疾患を治療するために使用することができる。例えば、精神障害の治療に有効な化合物（ポリヌクレオチドを含めて）を、本発明の方法によって特定することができる。次いで、こうしたポリヌクレオチドの遺伝子治療による導入を、例えば、気分障害および精神病性障害を含めた精神障害を治療するために使用することができる。
Ａ．遺伝子送達のためのベクター
細胞または生物への送達のために、本発明のポリヌクレオチドを、ベクターに組み込むことができる。こうした目的のために使用されるベクターの例には、標的細胞中の核酸の発現を導くことが可能な発現プラスミドが含まれる。他の例では、ベクターは、ウイルスベクター系であり、ここでは、核酸は、標的細胞を形質移入することが可能であるウイルスゲノムに組み込まれる。好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは、所望の標的宿主細胞の遺伝子の発現を導くことが可能な発現および制御配列に作動可能に連結することができる。このように、適切な状態下で、標的細胞における核酸の発現を達成することが可能である。
Ｂ．遺伝子送達系
核酸の発現に有用なウイルスベクター系には、例えば、天然に存在するまたは組換え型のウイルスベクター系が含まれる。特定の用途に応じて、適切なウイルス性のベクターには、自律複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、自律複製不能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）、および条件つきで複製可能な（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ウイルスベクターが含まれる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトまたはウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウスのマイニュートウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、および（それだけには限らないがラウス肉腫ウイルスを含めて）レトロウイルス、およびＭｏＭＬＶのゲノムから得ることができる。一般的に、当該の遺伝子は、一般的に、ウイルスＤＮＡに付随する遺伝子構築物のパッケージング、それに続く感受性宿主細胞の感染、および当該の遺伝子の発現を可能にするために、こうしたベクターに挿入される。
本明細書では、「遺伝子送達系」は、本発明の核酸を標的細胞に送達するためのいずれの手段も指す。本発明のある実施形態では、核酸は、適切な連結部分（例えばＤＮＡ連結部分）を介して、取り込みを促進するために細胞受容体リガンドに結合される（例えば被覆小窩の陥入およびエンドソームの内部移行）（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；ＷＯ ９２／０６１８０）。例えば、核酸は、ポリリジン部分を介して、アシアロ−オロムコシド（ｏｒｏｍｕｃｏｃｉｄ）（これは、肝実質細胞のアシアロ糖蛋白受容体に対するリガンドである）に連結させることができる、
同様に、本発明の核酸を含む遺伝子構築物をパッケージングするために使用されるウイルスのエンベロープは、特定の細胞への受容体依存性エンドサイトーシスを可能にするために、受容体に対して特異的な受容体リガンドまたは抗体の添加によって改変することができる（例えば、ＷＯ ９３／２０２２１、ＷＯ ９３／１４１８８、およびＷＯ ９４／０６９２３を参照のこと）。本発明のある実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、エンドサイトーシスを容易にするために、アデノウイルス粒子などのウイルスタンパク質に連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８８５０−８８５４（１９９１））。他の実施形態では、本発明の分子結合体として、微小管インヒビター（ＷＯ／９４０６９２２）、インフルエンザウイルス血球凝集素を模倣する合成ペプチド（Ｐｌａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））、およびＳＶ４０ Ｔ抗原などの核局在化シグナル（ＷＯ９３／１９７６８）を挙げることができる。
レトロウイルスベクターも、本発明の核酸を標的細胞または生物体に導入するために有用である。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスを遺伝子操作することによって産生される。レトロウイルスのウイルスゲノムは、ＲＮＡである。感染時に、このゲノムＲＮＡは、ＤＮＡコピーに逆転写され、これは、形質導入される細胞の染色体ＤＮＡに、高度な安定性および効率を伴って組み込まれる。組み込まれたＤＮＡコピーは、プロウイルスと呼ばれ、他の任意の遺伝子がそうであるように、娘細胞によって遺伝する。野生型のレトロウイルスのゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を有し、これらは、２つの末端反復（ＬＴＲ）配列によって隣接している。ｇａｇ遺伝子は、内部の構造的（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし；ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエンベロープの糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するために役割を果たす。５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノム（ｔＲＮＡプライマー結合部位）の逆転写のために、また、ウイルスＲＮＡの粒子（Ψ部位）への効率的な被包のために必要な配列である。（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｉｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ（編）、１５５−１７３（１９８３）；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９（１９８３）；ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６３４９−６３５３（１９８４）を参照のこと）。
レトロウイルスベクターの設計は、当業者に周知である。手短に言えば、キャプシド形成（または感染性のビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列が、ウイルスのゲノムから失われる場合、その結果は、ゲノムＲＮＡのキャプシド形成を妨げるシス作用欠損である。しかし、得られる突然変異体が、すべてのビリオン・タンパク質の合成を導くことは、依然として可能である。これらの配列が欠損させられたレトロウイルスのゲノム、ならびに、安定に染色体に組み込まれる突然変異体ゲノムを含有する細胞系は、当分野でよく知られており、レトロウイルスベクターを構築するために使用される。レトロウイルスベクターの調製およびその使用は、例えば、欧州特許出願ＥＰＡ ０ １７８ ２２０；米国特許第４，４０５，７１２号、Ｇｉｌｂｏａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：５０４−５１２（１９８６）；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９（１９８３）；ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９−６３５３（１９８４）；ＥｇｌｉｔｉｓらＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４（１９８８）；ＭｉｌｌｅｒらＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８１−９９０（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）上記文献；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）上記文献；およびＷＯ ９２／０７９４３を含めて、多くの刊行物に記載されている。
レトロウイルスのベクター粒子は、所望のヌクレオチド配列を組換えによりレトロウイルスベクターに挿入し、パッケージング細胞系を使用することによって、レトロウイルスのカプシドタンパク質を用いてベクターをパッケージングすることによって調製される。得られたレトロウイルスのベクター粒子は、宿主細胞中で複製できないが、所望のヌクレオチド配列を含有するプロウイルスの配列として宿主細胞ゲノムに組み込むことが可能である。その結果、患者は、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを産生することが可能であり、したがって、細胞は通常の表現型に復活する。
レトロウイルスのベクター粒子を調製するために使用されるパッケージング細胞系は、一般的に、パッケージングに必要とされる不可欠なウイルスの構造タンパク質を産生するが、感染性のビリオンを産生する能力がない、組換え型の哺乳類組織培養細胞系である。使用される、欠損があるレトロウイルスベクターは、一方では、こうした構造遺伝子を欠いているが、パッケージングのために必要な残留するタンパク質をコードする。パッケージング細胞系を調製するために、パッケージング部位が欠損させられた所望のレトロウイルスの感染性のクローンを構築することができる。この構築物を含む細胞は、すべての構造的ウイルスタンパク質を発現するが、導入されるＤＮＡは、パッケージされ得ないこととなる。あるいは、パッケージング細胞系は、適切なコアおよび外膜タンパクをコードする１つ以上の発現プラスミドで細胞系を形質転換することによって産生することができる。こうした細胞において、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子は、同じかまたは異なるレトロウイルスから得ることができる。
本発明に適したいくつかのパッケージング細胞系はまた、従来の技術で入手できる。こうした細胞系の例としては、Ｃｒｉｐ、ＧＰＥ８６、ＰＡ３１７およびＰＧ１３が挙げられる（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）を参照のこと）。他のパッケージング細胞系の例は、ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８１：６３４９−６３５３（１９８４）；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８５：６４６０−６４６４（１９８８）；Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８）、上記文献；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）、上記文献に記載されている。
キメラ外膜タンパクを伴うレトロウイルスのベクター粒子を産生することが可能なパッケージング細胞系を使用することができる。あるいは、ＰＡ３１７およびＧＰＸパッケージング細胞系によって産生されるものなどの、両栄養性または異種栄養性外膜タンパクを、レトロウイルスベクターをパッケージするために使用することができる。
本発明のある実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子とハイブリッド形成するアンチセンスポリヌクレオチドが投与される。アンチセンスポリペプチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして提供することができる（Ｍｕｒａｙａｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１０９−１１４（１９９７）を参照のこと）。アンチセンス核酸をコードする遺伝子も提供することができ、こうした遺伝子は、当業者に知られている方法によって、細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクター中に、Ｂ型肝炎ウイルス中に（Ｊｉら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．４：１６７−１７３（１９９７）を参照のこと）、アデノ随伴ウイルス中に（Ｘｉａｏら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７５６：７６−８３（１９９７）を参照のこと）、あるいは、これらに限定されないが、ＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム遺伝子送達系（Ｋａｎｅｄａら、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１１：２９９−３０８（１９９７）を参照のこと）、「ペプチドベクター」（Ｖｉｄａｌら、ＣＲ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＩＩＩ ３２：２７９−２８７（１９９７）を参照のこと）を含めた他の系中に、エピソームまたはプラスミドベクター中の遺伝子として（例えば、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：６４５０−６４５５（１９９７）、ＹｅｗらＨｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５７５−５８４（１９９７）を参照のこと）、ペプチド−ＤＮＡ凝集体中の遺伝子として（Ｎｉｉｄｏｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５３０７−１５３１２（１９９７）を参照のこと）、「裸のＤＮＡ」として（米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号を参照のこと）、脂質型ベクター系中に（例えば、Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１４：１７３−２０６（１９９７））を参照のこと）、ポリマーコートされたリポソーム（米国特許第５，２１３，８０４号および第５，０１３，５５６号）、カチオン性リポソーム（Ｅｐａｎｄら、米国特許第５，２８３，１８５号；第５，５７８，４７５号；第５，２７９，８３３号；および第５，３３４，７６１号）、ガス充填されたマイクロスフィア（米国特許第５，５４２，９３５号）、リガンド標的にされるカプセル化された高分子（米国特許第５，１０８，９２１号；第５，５２１，２９１号；第５，５５４，３８６号；および第５，１６６，３２０号）、アンチセンスヌクレオチド配列を導入することができる。
精神障害と相関する、本発明のバイオマーカー表中に列挙される上方調節される転写産物を、上で述べた通りに、標的における特異的な配列とハイブリッド形成する１種または複数の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を用いて標的にすることができる。ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡを用いた特定の脳転写産物の標的化が、例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．，１２：１０３９−４５（２００３）によって報告されている。彼らは、リポソームでカプセル化されたｓｉＲＮＡ分子の脳血液関門の通過を容易にするために、トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体を利用している。標的にされるｓｉＲＮＡは、例えば、ＭＤＤ、ＢＰ、および他の精神障害などの病態に関連する、過度に発現された転写産物を減ずるのに有用な治療的化合物を代表する。
別の実施形態では、条件付き発現系（ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系によって代表されるものなど）を使用することができる（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ、ＰＮＡＳ ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８））。こうした系は、当該の標的遺伝子（単数または複数）の発現に対する小分子制御を与える。
別の実施形態では、当該の転写産物を発現するように操作された脳に、幹細胞を移植する。
Ｃ．薬剤処方物
医薬品目的で使用される場合、遺伝子治療のために使用されるベクターは、適切な緩衝液中に調製される。これは、リン酸緩衝生理食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびＧｏｏｄらＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７（１９６６）によって記載されているものなどの当業者に知られている他の緩衝液などの、任意の薬学的に許容される緩衝液であり得る。
該組成物は、さらに安定剤、増強剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、または他の薬学的に許容される担体または媒体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、例えば、本発明の核酸および任意の関連するベクターを安定化するために作用する、生理的に許容される化合物を含有することができる。生理的に許容される化合物としては、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンなどの酸化防止剤；キレート剤；低分子タンパク質または他の安定剤または賦形剤を挙げることができる。他の生理的に許容される化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、あるいは微生物の増殖または活動を妨げるために特に有用である保存剤が挙げられる。様々な保存剤は、よく知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。担体、安定剤、または補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）において見出される。
Ｄ．処方物の投与
本発明の処方物は、当業者に知られている任意の送達方法を使用して、任意の組織または器官に送達することができる。本発明のある実施形態では、本発明の核酸は、粘膜、局所用、および／または口腔内処方物、特に、粘膜付着性ゲルおよび局所用ゲル処方物で調製される。経皮送達のための例示的な浸透増強組成物、ポリマーマトリックス、および粘膜付着性ゲル調製物は、米国特許第５，３４６，７０１に開示されている。
Ｅ．治療の方法
本発明の遺伝子治療処方物は一般的に、細胞に対して投与される。細胞は、上皮性膜などの組織の一部として、あるいは組織培養におけるものなどの、単離された細胞として提供することができる。細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで提供することができる。
処方物は、様々な方法によって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、当該の組織に導入することができる。本発明のある実施形態では、本発明の核酸は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合、または微粒子銃などの方法によって細胞に導入される。さらなる実施形態では、核酸は、当該の組織によって直接的に取り込まれる。
本発明のある実施形態では、本発明の核酸は、細胞または患者から外植された組織にｅｘ ｖｉｖｏで投与され、その後、患者に戻される。治療的な遺伝子構築物の生体外投与の例には、Ｎｏｌｔａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（６）：２４１４−９（１９９６）；Ｋｏｃら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２３（ｌ）：４６−６５（１９９６）；Ｒａｐｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２２３（２）：１１６−２６（１９９６）；Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉ．Ｓｕｒｇ．，１１（２）：４１６−２２（１９９６）；およびＭａｋａｒｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（ｌ）：４０２−６（１９９６）が挙げられる。
Ｘ．気分障害および精神病性障害の診断
本発明はまた、気分障害（大うつ病または双極性障害など）、精神病性障害（精神分裂症など）、またはこうした障害の症状の少なくともいくつかの素因を診断する方法を提供する。診断は、患者における本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを決定すること、次いで、そのレベルをベースラインまたは範囲と比較することを含む。一般的に、ベースライン値は、気分障害または精神病性障害を患っていない健康な人における、あるいは薬物投与または他剤に対する影響下での、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを表すものである。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの、ベースライン範囲からの（上または下への）変動は、患者が、気分障害または精神病性障害を患う、あるいは気分障害または精神病性障害の少なくともある種の様相を呈するリスクがあることを示唆する。ある実施形態では、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルは、患者から血液、尿、または組織サンプルを取り出し、本明細書に論じられるものなどの多くの検出方法を使用して、サンプル中の本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を測定することによって測定される。
抗体は、患者サンプルにおける差次的なタンパク質発現を検出するために、分析、例えば、ＥＬＩＳＡ分析、免疫沈降反応分析、および免疫組織化学分析に使用することができる。核酸の発現レベルを検出するために、また、ゲノム構造または転写におけるバリアント（図１に示される、また、実施例中に記載されているＦＧＦＲスプライスバリアントなど）を区別するために、ＰＣＲ分析も使用することができる、
遺伝子発現の欠如が、障害に関連する場合には、遺伝子のゲノム構造は、罹病性関連の欠失または挿入突然変異を検出するために、ＰＣＲなどの既知の方法を用いて評価することができる。逆に、特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはタンパク質の存在は、個人が、遺伝子発現の欠如を伴う遺伝子突然変異またはそれに付随する障害を有さないことを示唆するだろう。したがって、ｍＲＮＡまたはタンパク質の有無を検出することによって、または遺伝子のゲノム構造を調べることによって診断を行うことができる。
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析は、また、本発明のポリヌクレオチド（例えば遺伝子）の対立遺伝子間の違いを検出するために有用である。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と関連付けられるＳＮＰは、例えば、その存在が本発明の遺伝子配列と関連付けられるような疾患（例えば双極性疾患、大うつ病および精神分裂症障害などの気分障害）の診断のために有用である。例えば、個人が、本発明の遺伝子配列の疾患関連対立遺伝子と関連付けられる少なくとも１つのＳＮＰを持つ場合、個人はおそらく、これらの疾患のうちの１つ以上の素因がある。個人が疾患と関連付けられるＳＮＰについてホモである場合、個人は、特にその疾患の存在の素因がある。ある実施形態では、本発明の遺伝子配列に関連するＳＮＰは、その遺伝子配列から、３００，０００；２００，０００；１００，０００；７５，０００；５０，０００；または１０，０００塩基対以内に位置する。
例えば、Ｔａｑｍａｎまたは分子ビーコンに基づく分析を含めた、様々なリアルタイムＰＣＲ方法（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２号；Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３（１９９６）；およびＰＣＴ ＷＯ ９５／１３３９９）を、ＳＮＰを検出するために使用することができ、ＳＮＰの有無についてモニタリングするために有用である。さらなるＳＮＰ検出方法には、例えば、ＤＮＡ塩基配列決定、ハイブリッド形成による配列決定、ドットブロッティング、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）ハイブリッド形成分析が含まれる、あるいは、例えば、米国特許第６，１７７，２４９号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：７６９−７７６（１９９８）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３２：３１４−３３１（１９８０）；Ｍｅｙｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５５：５０１−５２７（１９８７）；Ｋｅｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：５（１９９１）；Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２−１２４６（１９８５）；およびＫｗｏｋら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：１３８−１４４（１９９４）に記載されている。欠失／挿入多型性（例えばＢＰに対する感受性に関連するＰＳＰＨＬ遺伝子の欠失多型性）を検出するために、ＰＣＲ法も使用することができる。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの酵素産物のレベルが測定され、健康な人（単数または複数）のベースライン値と比較される。ベースラインとの比較における産物の調節レベルによって、患者が、気分障害または精神病性障害を有する、あるいは気分障害または精神病性障害の少なくともある種の様相を呈する危険にさらされていることが示唆される。患者サンプルは、例えば、血液、尿、または組織サンプルであり得る。場合によっては、当業者は、脳の１つ以上の領域におけるこれらの遺伝子の発現を評価するのに代わるものとして、例えば、リンパ球などの、容易に得られる細胞の遺伝子の発現を使用してもよい。
本明細書に記載されている実施例および実施形態は、例示目的に過ぎないこと、またこれらに照らせば様々な改変または変更が、当業者に示唆されることとなり、これらは、この出願の趣旨および範囲および添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解されよう。
実施例１：ＢＰおよびＭＤＤ対象における自殺に関連する遺伝子の差次的な発現
以前の研究では、遺伝子発現を分析するために、マイクロアレイおよびＰＣＲを使用して、気分障害および自殺の傾向に関連する遺伝子を調査していた（Ｓｉｂｉｌｌｅら、２００４；Ｙａｎａｇｉ Ｍら、Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，５０（４）：２１０−６（２００５））。しかし、どちらの調査も、自殺に最も典型的である可能性がある遺伝子を検出する、気分障害と比較した場合の自殺、および対照と比較した場合の自殺の厳密な分析を使用していなかった。この実施例は、自殺をしたＢＰＤおよびＭＤＤ患者由来の死後脳の扁桃体、前側帯、および小脳におけるマイクロアレイ遺伝子発現プロフィールを、白質、乏突起膠細胞、ミエリン、および他の経路を調節する分子のｍＲＮＡ発現レベルに焦点を合わせて記述する。ここで同定される遺伝子は、自殺の挙動を検出および治療するためのバイオマーカーとして使用することができる。
遺伝子は、ｍＲＮＡクオリティ＞１．４、ｐＨ＞６．６、およびＡＦＳ＝０で、Ｕ１３３Ｐチップ上で実施される対象を選択することによって発見された。気分障害を患う自殺犠牲者（ｎ＝１４）を、気分障害を患う非自殺犠牲者（ｎ＝９）および対照（ｎ＝２７）と比較した。年齢およびｐＨは、各群の間で異なり、ＡＮＣＯＶＡにおける共変量として入力した。扁桃体においては、ミエリンおよび乏突起膠細胞遺伝子発現は、非自殺の気分障害対象または対照と比較して、自殺の気分障害対象では異常調節されていることが判明した。非自殺の気分障害患者に対して、自殺の患者で異常調節された同定された遺伝子の完全なリストを、表１Ａに示す。表１Ｂは非自殺のＭＤＤ患者に対して、自殺のＭＤＤ患者で異常調節された遺伝子、および、対照患者に対して、自殺のＭＤＤ患者で異常調節された遺伝子を列挙する。
類似の研究を、薬物乱用者であることが知られているＭＤＤ対象の脳を使用し、これらの対象の遺伝子発現を、薬物乱用者ではないＭＤＤ対象における遺伝子発現と、、ならびに対照被検者と比較することによって実施した。表１Ｃは、薬物乱用者ではないＭＤＤ患者に対して、薬物を乱用していたＭＤＤ患者で異常調節されることが示された遺伝子のリストである。表１Ｃはまた、対照被検者に対して、薬物を乱用していたＭＤＤ患者で異常調節された遺伝子を示す。
関連研究では、正常な患者に対して、ＢＰおよびＭＤＤ患者における遺伝子発現を研究および比較するために、２つのコホートを使用した。コホートＡは、７人の対照、６人のＢＰＤ患者、および９人のＭＤＤ患者から構成されていた。コホートＢは、７人の対照および５人のＭＤＤ患者を含んでいた。対象は、苦痛の事象（ａｇｏｎａｌ ｅｖｅｎｔ）、組織ｐＨ、ＲＮＡ完全性、性別、および年齢の混乱させる影響の可能性を回避するように選択された。図５〜８中にまとめる結果は、気分障害患者の、大脳皮質における、とりわけ前部帯状皮質におけるＧＰＣＲ、およびｃＡＭＰおよびホスファチジルイノシトール・シグナル伝達経路を調節する分子の発現レベルの変化が観察されたことを示す。ｃＡＭＰシグナル伝達における負の調節因子として作用する分子の発現レベルは、ＢＰＤにおいて増大したのに対して、ｃＡＭＰシグナル伝達を活性化する分子は変化しなかった。ＢＰＤの変化と対照的に、ｃＡＭＰシグナル伝達を抑制する分子は、ＭＤＤでは低下した。イノシトールポリリン酸−１−ホスファターゼおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼの発現レベルは、ＢＰＤで変化したのに対して、プロテインキナーゼＣベータ−１、イノシトール三リン酸受容体−１、イノシトールポリリン酸−５−ホスファターゼは、ＭＤＤでは増大した。２つのオーファンＧＰＣＲ遺伝子、すなわちＧＰＲＣ５ＢおよびＧＰＲ３７は、ＭＤＤでは、３つの皮質において一貫して有意な減少を示し、ＢＰＤの前部帯状皮質では、有意な増加を示した。図５〜８に特定される遺伝子の発現の違いを測定することは、対象が特定の精神病、特にＢＰまたはＭＤＤを患うかどうかを決定するための有用なツールである。
実施例２：ＢＰＤにおいて異常調節されるリチウム応答性遺伝子の同定
この実施例は、ヒト以外の霊長類（健康なアカゲザル）における特定の遺伝子が、気分安定薬、リチウム（Ｌｉ）、すなわちＢＰの治療のための最適な薬物を用いる治療に応答して、差次的に発現されることを実証する。アカゲザルの前部帯状皮質（ＡｎＣｇ）、背外側前頭前野（ＤＬＰＦＣ）、海馬（ＨＣ）、および扁桃体（ＡＭＹ）に対して、本明細書に記載されている遺伝子発現検出方法を使用して、遺伝子発現プロファイリングを実施し、上述のヒトの剖検結果と比較した。表２Ａは、文献中にあらかじめ特定されていたリチウム応答性遺伝子と、本発明の調査によって確認されたリチウム応答性遺伝子を示す。表２Ｂは、霊長類におけるリチウム応答性遺伝子として新たに特定された遺伝子（これはまた、双極性障害を患うヒトの対象において異常調節される）を示す。
実施例３：気分障害におけるＦＧＦＲ２バリアントの違い
ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２）転写産物は、うつ状態の対象のいくつかの脳領域において低下することが、一貫して発見されている（例えば、２００４年８月５日に米国特許公開番号２００４０１５２１１１−Ａ１として公開された、米国２００３年１１月３日に出願の特許出願第１０／７０１，２６３号を参照のこと）。ヒトのＦＧＦＲ２遺伝子は、１９のエキソンを含有し、１３ものスプライスバリアントを産生する。こうしたバリアントは、３つの主要な機能的クラスに分類される：第１は、可溶性の受容体であると考えられる膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを欠くバリアント；第２は、エキソン９によってコードされるＩｇ ＩＩＩｃ型ドメインを含有するバリアント；第３は、エキソン８によってコードされるＩｇ ＩＩＩｂ型ドメインを含有するバリアント。Ｉｇ ＩＩＩ型ドメインは、リガンド特異性を与えるので、これら後者の２バリアントは、ＩＩＩｃまたはＩＩＩｂドメインのその使用に基づく異なる薬理学的プロファイルを有する。この実施例は、ヒトの皮質（背外側前頭前野および前側帯）および海馬から得られる全ＲＮＡ中に存在するエキソンのＰＣＲに基づく測定を記載する。
方法。死後のヒトの脳を得て、以前に記載された通りに解剖した（Ｅｖａｎｓら、ＰＮＡＳ １０１（４３）：１５５０６−１１（２００４））。マイクロアレイ分析および半定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌを使用して別々の脳領域から抽出した。
マイクロアレイ・データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ １３３Ａ ａｎｔｉ １３３ｐｌｕｓ ２．０チップと組み合わせて作製し、ＲｅｆＳｅｑデータベースの最近の作製に基づくカスタム・プローブ・マッピングファイルを使用して分析した（ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ＣｕｓｔｏｍＣＤＦ）。各生体サンプルを、２つの部位で独立に実施した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｉｒｖｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｒｕｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｄａｖｉｓまたはｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ）。プローブ・セット・シグナルは、ＲＭＡを使用して算出し（Ｂｏｌｓｔａｄら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９（２）：１８５−９３（２００３））、（独立したコホートおよび部位にわたって）各技術ブロックについて別々に、ＲＭＡデータの中央値センタリングを行った後、統計的比較を行った。ｐ値は、患者と対照との間のｔ検定から構築された。最終の対象構成は、１３人の大うつ病対象と１６人の対照を含んでいた。すべて、苦痛ファクター（ａｇｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ）を含まず、脳ｐＨ測定値は、６．８よりも大きく、他の性質も測定値を満たしていた。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲデータは、ＢｉｏＲａｄ ｉＣｙｃｌｅｒを使用して、エキソン特異的なプライマーおよびＳＶＢＲグリーン法を用いて作製した。定量的反応で使用されるすべてのプライマー対は、有効性について試験され、約１００％であると決定された。サイクル閾値（Ｃｔ）値を、増幅の線形範囲以内で選択し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって決定された全ｃＤＮＡ濃度に対して規準化した。ゲノムＤＮＡの汚染は、ｃＤＮＡ合成の前に、ランダムヘキサマーとポリ−Ｔプライマーの混合物と共にＤＮアーゼを用いることによって排除され、より小さなイントロンにわたるフラグメント（エキソン３からエキソン４、およびエキソン７からエキソン１０）を増幅することによって、排除が確認された。イントロンを含有するアンプリコンは、検出されなかった。
結果。上述の研究の結果を、図１に部分的にまとめる。これは、対照被検者に対するうつ状態の対象における、エキソン５および１１の差次的な発現を示す。より詳細には、これらの結果は、特にＤＬＰＦＣ領域では、エキソン１１に対するエキソン５の発現の割合は、ＭＤＤ患者では有意に低下することを示す。エキソン９（ＩＩＩｃバリアントをコードする）の発現の類似の分析では、ＡｎＣｇおよびＨＣ領域におけるエキソン９発現は、ＭＤＤ対象では低下することが示された。
実施例４：げっ歯類の挙動に対する、ＦＧＦ２、ＦＧＬペプチド（ＮＣＡＭ）およびＦＧＦ受容体のペプチドインヒビターの注射の影響
Ａ．ＦＧＦ２のマイクロインジェクション
この一連の実験は、対象動物における抑うつを評価するための、強制水泳試験（ＦＳＴ）および高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使用する、ＦＧＦ２のマイクロインジェクション後の有意な影響を示す。ＦＳＴでは、ＦＧＦ２注射された動物（ｎ＝１２）は、対照（ｎ＝１３）よりも多くの水泳（ｔ［２３］＝２．２０、ｐ＜０．０５）および少ない不動（ｔ［２３］＝２．８８、ｐ＜０．０ｌ）を示した。これは、ＦＧＦ２動物では、より抑うつ様でない挙動を示すこととなる。しかし、ＥＰＭでは、ＦＧＦ２注射された動物は、クローズドアームで過ごす時間が有意に多く（ｔ［１３］＝３．１８、ｐ＜０．０１）、オープンアームで過ごす時間は有意に少なかった（ｔ［１３］＝２．４６、ｐ＜０．０５）。これらの結果（図２）は、ＦＧＦ２の急性注射の後、不安様挙動が増大されることを示す。
Ｂ．ＮＣＡＭ（ＦＧＬペプチド）のマイクロインジェクション
この一連の実験は、ＮＣＡＭ投与の後の強制水泳試験における動物の気分に対する有意な影響を示す（アミノ酸配列＝ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ；図３を参照のこと）。ここでは、ＮＣＡＭ注射された動物（ｎ＝１３）は、対照（ｎ＝１３）よりも少ない不動（ｔ［２４］＝２．１３、ｐ＜０．０５）を示した。また、これは、より抑うつ様でない挙動の指標である。これはまた、ＦＧＦ２データと同じ傾向であり、ＦＧＦ２およびＮＣＡＭがＦＧＦ受容体と相互作用するという事実と整合性がある。同様に、ＮＣＡＭ注射された動物は、クローズドアームで過ごす時間が多く（有意に長い時間ではないが）、オープンアームで過ごす時間が短く、不安様挙動の増大と整合性があった。ＮＣＡＭ注射された動物はまた、センターの４分の１で過ごす時間が有意に短かった（ｔ［１８］＝２．４０、ｐ＜０．０５）。
Ｃ．ＦＧＦＲのペプチドインヒビターのマイクロインジェクション
この一連の実験は、強制水泳試験および高架式十字迷路試験を使用する、ＦＧＦ系ペプチドインヒビター（アミノ酸配列＝ＨＦＫＤＰＫＲＬＹ）を用いる注射の後の、動物の気分に対する有意な影響を示す。結果を図４に示す。ＦＳＴでは、インヒビターを注射された動物（ｎ＝７）は、対照（ｎ＝７）よりも、有意に少ないクライミング（ｔ［１２］＝２．０６、ｐ＜０．０５）、有意に少ない水泳（ｔ［１２］＝１．９２、ｐ＜０．０５）、および有意に多い不動（ｔ［１２］＝３．５８、ｐ＜０．００５）を示した。これらの結果は、ＦＧＦ系の抑制が、抑うつ様挙動の増大をもたらす可能性があることを示す。これらの結果は、以前のデータセットの結果を確認し、進歩させるものであり、大うつ病を伴う個人の死後組織の研究と整合性があった。インヒビターを注射された動物はまた、ＥＰＭのセンターの４分の１で過ごす時間が有意に長かった（Ｔ［７，７］＝３５．０、ｐ＝０．０３）。同じ動物は、オープンアームで過ごす時間が短く、不安様挙動の増大の指標となるクローズドアームで過ごす時間は等しかったが、過ごす時間の長さに有意な差はなかった）。しかし、これらの知見は、上述のマイクロインジェクション研究から引き出される結論と整合性がある。
Ｄ．ＦＧＦ２の投与は、海馬の遺伝子発現の長期変化を誘導する
方法。スプラーグ‐ドーリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ）に、出生の翌日、賦形剤またはＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｇ、皮下）を注射し、成体としてのモリス水迷路試験を行った後、屠殺した。本発明者らは、歯状回のレーザー捕獲顕微手術、それに続くマイクロアレイ分析を用いる、候補遺伝子探索法（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ）と遺伝子発見アプローチの両方を使用して、遺伝子発現の変化を評価した。
結果。ＦＧＦ２を注射されたラットは、学習および記憶試験において、有意に良い結果であった（例えばモリス水迷路試験中に、隠れたプラットフォームを発見するのに、賦形剤注射されたラットについては平均で２５秒であったのに対して、平均で２０秒であった）。神経可塑性に関連するいくつかの遺伝子はまた、組織化学的およびＲＮＡ発現分析によって示される通り、成体ラットにおいて変化することが判明した。例えば、ＧＡＰ−４３、Ｒｇｓ４、ｔｒｋＢ、ＣＣＫ、ＳＳＴおよびＶｇｆの発現が増大されたのに対して、ＮＣＡＭの発現は低下した。
実施例５：長期にわたって投与されたＦＧＦ２の抗不安作用
不安障害は、大うつ病（ＭＤ）を含めた他の神経精神病学的障害との同時罹患率が高い。この実施例は、長期にわたるＦＧＦ２投与が、ラットにおける抗不安作用を有することを示す。ラットは、様々な運動試験および行動試験におけるその挙動に基づいて「高い不安」（ＬＲ）または低い不安」（ＨＲ）群に配置した。どちらの群の動物にも、３週間、４８時間ごとにＦＧＦ２（５ｎｇ／ｇ）または賦形剤を、腹腔内注射によって投与した。このＦＧＦ２注射の１日後、すべての動物を、高架式十字迷路（ＥＰＭ）および明暗（ＬＤ）不安試験で試験した。
ＥＰＭ試験のための装置は、４本の高いオープンアーム（床から７０ｃｍ、長さ４５ｃｍ、および幅１２ｃｍ）を備えた黒色プレキシグラスで構築される。照明は、クローズドアームのうちの１つの後に置かれた、壁に面する４０ワット電気スタンドによって提供された。科学者は、このシステム内に動物を置いた。より不安でない動物は、オープンアーム中で過ごす時間がより多いのに対し、より不安である動物は、オープンアーム中で過ごす時間がより少ない。
ＬＤ試験は、透光性カバーを備えた３０×６０×３０ｃｍのプレキシガラス・シャトルボックス中で行われる。各箱は、幅１２ｃｍの開口扉を備える壁によって２つの等しいサイズの区画に分割される。片方の区画は、白色に塗られ、明るく照らされ、もう片方の区画は、非常に薄暗い照明を伴い、黒色に塗られている。各ラットが各区画中で過ごす時間を、各区画の格子床の２．５ｃｍ上に位置される５つの光電管の列によってモニタリングする。より不安でない動物は、明るい区画でより多くの時間を過ごす。
結果は、長期にわたってＦＧＦ２を投与された動物が、賦形剤を与えられた動物よりも不安が小さいことを示す（図９、上）。ＦＧＦ２の不安低下効果は、ＦＧＦ２レジメンの前に、生来の不安がより大きい（ＬＲ）ラットにおいて、明らかに顕著である（図９、上）。
ＦＧＦ２の発現と不安との間の関係をさらに理解するために、ＦＧＦ２発現を、（ＥＰＭ試験によって測定された）不安のレベルが変動したラットから摘出されたラット脳の海馬のＣＡ−２領域中で測定した。結果（図１０）は、ＦＧＦ２レベルは、不安と逆に関連する、すなわち、ラットにおける生来のＦＧＦ２発現のレベルがより高いことは、不安レベルがより低いことと相関することを示す。
全体として見ると、この実施例は、長期間にわたるＦＧＦ２投与は、不安を抱く動物における、また、不安に関連するＭＤＤなどの障害を患う対象における不安の症状を軽減するために有用であることを示す。このデータはまた、ＦＧＦ２レベルの検出が、不安を診断するために、あるいは大うつ病障害などの不安に関連する障害を特徴づけるために有用であることも示す。
実施例６：長期にわたるストレスに関連するＦＧＦＲスプライスバリアントの差次的調節
成体のＣＮＳでは、線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）と線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）は、差次的に分布している。これらの受容体のｍＲＮＡは、Ｉｇ様ドメインＩＩＩのカルボキシル末端をコードするエキソンにおいて、選択的スプライシングを受ける。この相互排他的なｍＲＮＡスプライシングによって、有意に異なるリガンド結合プロフィールをもつ、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３という２つのアイソフォームが産生される：片方のアイソフォームは、エキソンＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２ｂ／ＦＧＦＲ３ｂ）を発現し、もう片方のアイソフォームは、エキソンＩＩＩｃ（ＦＧＦＲ２ｃ／ＦＧＦＲ３ｃ）を発現する。エキソン選択は、発生中に、厳密に組織依存性であり、エキソンＩＩＩｂは上皮性系統に発現され、エキソンＩＩＩｃは、間葉性系統に発現される。しかし、細胞周期依存性のＩＩＩｂからＩＩＩｃへのスイッチは、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の外因的な添加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。この実施例は、長期間にわたるストレスが、ＦＧＦＲ２のエキソンＩＩＩｃ：ＩＩＩｂスプライスバリアント発現割合の低下を誘導することを示す。
動物。２２０〜２５０ｇの重さの２４匹の雄スプラーグ‐ドーリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から提供され、１週間そのままにして、収容状態に順応させた。この動物を、２匹一組で収容し、自由に入手できる食品および水と共に、１２時間の明暗サイクル（午前６時００分に点灯）にかけた。すべての実験は、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ ＡｎｉｍａｌｓおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓに従って行われた。
ＦＧＦ２注射治療および長期間にわたる予測不可能なストレス（ＣＵＳ）状態。半分のラット（ｎ＝１２）には、賦形剤（１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍ ＰＢＳ）を投与し、他の半分（ｎ＝１２）には、５ｎｇ／ｇの量で賦形剤中に溶解したヒト組換え型ＦＧＦ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、３週間、４８時間ごとに投与した。すべての治療薬は、腹膜内に注射された。ＦＧＦ２治療と同じ３週間の期間中、賦形剤群は、手で触られるか（ｈａｎｄｌｅｄ）（ｎ＝６）、あるいはＣＵＳに曝された（ｎ＝６）。同様に、ＦＧＦ２注射された群も、手で触られる（ｎ＝６）、あるいはＣＵＳに曝された（ｎ＝６）。動物は、以下の長期間にわたる予測不可能なストレッサーに曝された（Ｉｓｇｏｒら（２００４）に記載されている）：エーテル（３０ｓ）、低温（２ｈ）、騒音（１５ｍ）、隔離（２４ｈ）、または拘束（２ｈ）。慣れを回避するために、ストレッサーはランダム化された；１日に１回、朝または午後のいずれかにセッションを行った。２×２（治療による条件）設計では、対象をストレスなし／賦形剤（ＮＳ／Ｖ）、ストレスなし／ＦＧＦ２注射（ＮＳ／Ｆ）、ストレスあり／賦形剤（Ｓ／Ｖ）、およびストレスあり／ＦＧＦ２注射（Ｓ／Ｆ）群に分割した。
強制水泳試験。他の研究のために、抗うつ挙動に対するＦＧＦ２注射の影響の可能性を試験するために、ＦＧＦ２治療およびＣＵＳ状態の終了の２４時間後、すべての動物を、Ｌｕｃｋｉ（１９９７）による強制水泳試験にかけた。
脳。ラットは、強制水泳試験の終了の３日後に、断頭によって屠殺した。次いで、脳を摘出し、イソペンタン中で−８０℃で急速凍結させた。
全ＲＮＡ抽出。肉眼での解剖を、すべての脳の前頭部皮質に対して実施した。全ＲＮＡ抽出は、試薬製造業者の指示書に伴って実行された。組織は、ＴＲＩｚｏｌ中にホモジナイズされた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；単相性のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート）。クロロホルムおよび２−プロパノールを用いて相分離およびＲＮＡ沈殿を、それに続いて遠心分離を行った。ＲＮＡサンプルを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製し、スピンカラムを介して繰り返しサンプルを洗浄した。純粋なＲＮＡサンプルを、ＲＮアーゼを含まない水で再構成し、それに続いて、２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＬａｂＣｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）システムを用いる２８ｓ／１８ｓのリボソームＲＮＡピークに対する完全性分析を行った。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの濃度読取りを使用して、サンプルを、２５ｎｇ／μＬの全ＲＮＡ／対象に規準化し、−８０℃で保存した。
ｃＤＮＡ合成。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して合成した。すべての２４ ＲＮＡサンプルを、ｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて逆転写させ、オリゴ（ｄＴ）およびランダムなヘキサマープライマーを用いてプライミングした。反応混合物は、製造業者の標準の４０ｍｉｎプロトコルに従って、ｉＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で保温した。次いで、二本鎖ｃＤＮＡ溶液を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキットを使用して、質および濃度について分析した。２μｇ／ｍＬ（高い範囲）と５０ｎｇ／ｍｌ（低い範囲）のストックＤＮＡを用いて、１０倍連続希釈物を調製し、標準曲線を作り出した。蛍光標識したサンプルは、基本的なフルオレセイン・プロトコルを使用する１４２０ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて分析した。全ｃＤＮＡサンプルを、高い範囲の標準曲線の線型回帰に適合させるために、さらに標準化した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプライマー設計。ラットＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３エキソンについての配列は、ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびＥｎｓｅｍｂｌ−Ｒａｔ遺伝子データベース（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から得られた。エキソン配列は、ＮＣＢＩのヌクレオチドおよびタンパク質ＢＬＡＳＴを使用して分析し、受容体構造内のその相当するタンパク質産物とマッチさせた（図１１）。ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３エキソン配列は、Ｍｆｏｌｄ核酸フォールディング・ウェブサーバーを使用して、二次構造について分析させた。ヘアピン領域の確率が高い部分は、プライマー設計では排除されることが有名である。最適化されたプライマー配列（図１１）は、Ｐｒｉｍｅｒ３ウェブベースのソフトウェアを使用して産生した。すべてのプライマーは、７５〜１５０ｂｐｓのアンプリコンを標的にする１８〜２２塩基対であり、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｕｓｔｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスから購入した。プライマー配列（５０ｎｍｏｌ／ｍｌ）は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ検出を使用して、プールされたｃＤＮＡの５倍連続希釈物を用いて、効率について検証および試験した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量化。選択されるＦＧＦＲ２およびＲ３エキソンの（ｃＤＮＡに対して逆転写された）ｍＲＮＡの相対的な存在量を定量化するために、リアルタイム逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅反応を実施した。状態群（ｎ＝６）ごとの各々の４種の治療におけるｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ検出が、指示された５０μＬではなく１９μＬの反応物を調製することを除いては製造業者の勧告に従って、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で使用された。全ｃＤＮＡプールが標準化されたので、基準遺伝子は省略された。反応は、二重に行い、各群の大きさは、ｎ＝１２まで増大させた。近位の２つのエキソンは、相対的な比較のために、プレートごとに増幅させた（エキソンＩＩＩｂおよびエキソンＩＩＩｃに重点を置いた）。すべての群の間の位置表示を均一にするように、反応ウェルを配置した。ＰＣＲプロトコルは、以下の通りであった：３０ｓ間の９５℃でのホットスタート、それに続いて、１５ｓ間の９５℃での変性、１５ｓ間の６０℃でのアニーリング、および１５ｓ間の７２℃での伸長を４０サイクル。蛍光は、サイクルごとに定量化し、単一の産物反応を確認するために、増幅後に、融解曲線分析を実施した。完全な方法論は、Ｋｅｒｍａｎら（２００６）によって記載されている。
データ分析。確実な検出のための最適の蛍光閾値を算出するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータは、Ｂｉｏ−ＲａｄのｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱソフトウェアのアルゴリズムを使用して、サイクル閾値（Ｃｔ）として出力された（最初の１０回のＰＣＲサイクルの平均の蛍光値プラス１０の標準偏差）。基本的には、より小さいＣｔ値は、蛍光閾値に到達するために必要とされるＰＣＲサイクルが、より少ないので、初期標的ｃＤＮＡの量がより大きいことを示唆する。次いで、すべての反応に対するＣｔ値をグループ化し、標準誤差を伴う平均値として示した。サンプルの大きさは、異常値（平均から ≧２ ＳｔＤｅｖ）排除により、グループあたり９〜１２であった。平均の変化の倍率（ｍｅａｎ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）は、ある変数（ある状態に対する治療効果またはある治療の範囲内の状態の影響）内の平均Ｃｔ値と比較する、２ΔＣｔ方法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）によって記載されている技術の改変）を使用して算出した。この２ΔＣｔ方法は、等しいプライマー効率を想定するが、相対的な発現を定量化するために、プライマーが検証される場合、それは許容される。エキソンＩＩＩｂに対するエキソンＩＩＩｃの割合を、２つのエキソンの相当する反応間の、個々の２ΔＣｔ値を算出することによって決定した。割合を、Ｃｔ値グループに対して同様にソートし、標準誤差を伴う平均の割合として示した。複数のエキソン平均Ｃｔ値の違いおよび個々のＩＩＩｃ：ＩＩＩｂの割合についての統計的有意差試験を、各比較変数について、２因子分散分析およびスチューデントのｔ検定を使用して実施した。有意水準は、ｐ＜０．０５としてセットした。すべての統計解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３で行った。
結果。長期間にわたるストレスは、賦形剤グループにおいて（Ｐ＜０．００００４）、また、ＦＧＦ２注射グループにおいて（Ｐ＜０．００５）、エキソンＩＩＩｂに対するエキソンＩＩＩｃ（相互排他的な発現）スプライスバリアント率の有意な減少を誘導した（図１２）。エキソンＩＩＩｃ発現は、すべてのグループにおいて、ＩＩＩｂよりも比較的高いままであったが、ストレスに伴い、ＩＩＩｂ発現は有意に増大し、それに対してＩＩＩｃ発現は、わずかしか変化しなかった。したがって、ストレスは、ＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ３の両方について、ＩＩＩｃバリアントに対してＩＩＩｂバリアントの発現を増大させる。ＦＧＦ２注射は、ＮＳまたはＳグループ（Ｐ＞０．１）においてＩＩＩｃ：ＩＩＩｂ率を有意に変化させず、ストレスによって引き起こされるＩＩＩｃ：ＩＩＩｂ率の変化の大きさにも有意に影響を及ぼさなかった。
これらの結果は、ＦＧＦ２およびＦＧＦ９などの内因性リガンド（これらは、ＭＤＤ対象において差次的に発現される）に対する、あるいは外因性リガンド（例えば薬理学的なペプチドまたは他の化合物）に対するＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３の親和性は、ストレスによって変化させられる可能性があることをを示す。本明細書に記載されている発明は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３スプライシングにおけるバリエーションを検出し、それに応じて対象のケアを改変する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、抑うつおよび関連する病気を治療するための治療法を特定し、最適化するための方法を提供する。
実施例７：双極性および大うつ病障害を患う対象における、青斑核および背側縫線における遺伝子の調節差異
青斑核（ＬＣ）および背側縫線（ＤＲ）は、それぞれ、脳のノルアドレナリン作動性およびセロトニン作動性神経支配の主な源である。これらの神経伝達物質の調節異常は、精神障害に関係している。この実施例は、その脳のＬＣおよびＤＲ領域中の遺伝子発現プロフィールを比較するために、ＭＤＤ（Ｎ＝１２）、ＢＰＤ（Ｎ＝６）を患う患者、および健康な対象（Ｎ＝９）の死後脳を使用する。すべての対象は、脳ｐＨ＞６．６および苦痛ファクターゼロという包含基準を満たしていた。レーザー捕獲顕微解剖されたＬＣおよびＤＲサンプルから得られる全ＲＮＡサンプルを抽出し、増幅し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高密度オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを用いてプローブで探索した。遺伝子発現データは、確固たるマルチチップ平均アルゴリズム（ｐ≦０．１）のＡＮＯＶＡによって、また、ＭＡＳ５．０「現在の（ｐｒｅｓｅｎｔ）」コール（ｃａｌｌ）アルゴリズム（３種の健康状態のうちの１つにおける５０％存在の最小値）によって分析した。これらの基準を満たしている遺伝子を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して分析した。健康な個人と比較すると、７７４および６３６遺伝子は、ＬＣでは発現変化を示し、６２７および６５６遺伝子は、それぞれ、ＭＤＤおよびＢＰＤ患者のＤＲで発現変化を示す。
ＬＣ遺伝子発現パターン：このデータを、表３にまとめる。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓによって、グルタミン酸受容体シグナル伝達経路の１０遺伝子が、ＭＤＤで有意に（ｐ＜０．０１）変化するが、ＢＰＤでは変化しないことが示された。グルタミン酸シグナル伝達遺伝子発現変化は、青斑核の以下のシナプス区画中に存在する：グリア細胞、シナプス前ニューロン、およびシナプス後ニューロン。これは、グルタミン酸シグナル伝達が、ＭＤＤ患者のＬＣにおいて変化することを示す。したがって、グリア輸送体、グルタミンシンテターゼ、ＡＭＰＡ、カイニン酸、ＧＲＭ１およびＧＲＭ７は、グルタミン酸作動性不均衡を治療するための標的である。
増殖に関連する遺伝子、すなわち線維芽細胞成長因子の発現も、ＭＤＤ患者のＬＣにおいて有意に変化する。ＦＧＦＲ３、ＴｒｋＢ受容体、成長ホルモン受容体を標的にする、あるいはＦＧＦ−２の作用を模倣する薬物は、ＬＣにおける神経突起伸張、および予備ニューロンの喪失を増大するであろう。
グリアにおいてほぼ独占的に発現される遺伝子は、有意に下方調節される。これらの遺伝子は、ＭＤＤ患者における全体的なグリアの変化に対する有用なマーカーである。
ＤＲ遺伝子発現パターン。このデータを、表４にまとめる。ＤＲのＩＰＡ分析は、ＭＤＤにおける成長因子関連の経路におけるいくつかの遺伝子の発現の変化を示した。変化させられた遺伝子の大部分の発現は、下方調節されていた。同様に、成長因子関連の経路におけるいくつかの遺伝子の発現は、ＢＰコホートからのサンプルでは下方調節された。しかし、これらの遺伝子は、ＭＤＤコホート中で検出されるものとは異なっていた。どちらの障害にも共通していたいくつかの遺伝子が、同定され、その発現は、ＭＤＤおよびＢＰＤ対象において同じ方向に、変化させられていた。
本明細書に引用されるすべての刊行物、データベース、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願は、本明細書に組み込まれるものとする。
気分障害におけるＦＧＦＲ２バリアントの違いを示す。ＦＧＦＲ２可溶性受容体スプライスバリアントは、対照におけるよりもＭＤＤにおいて、全受容体の、より小さな割合に相当する可能性がある。 それぞれ移動性試験（上図）および高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験（下図）によって測定されたものとしての、マウス抑うつおよび不安に対するＦＧＦ２の急性の注射の効果を示す。「オープン」、「センター」、および「クローズド」はそれぞれ、ＥＰＭのオープン、センター、およびクローズド部分で過ごした時間を指す。 それぞれクライミングおよび強制水泳試験（上図）および高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験（下図）によって測定されたものとしての、マウス抑うつおよび不安に対するＮＣＡＭペプチドの注射の効果を示す。「オープン」、「センター」、および「クローズド」はそれぞれ、ＥＰＭのオープン、センター、およびクローズド部分で過ごした時間を指す。 それぞれクライミングおよび強制水泳試験（上図）および高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験（下図）によって測定されたものとしての、マウス抑うつおよび不安に対するペプチドインヒビターの注射の効果を示す。「オープン」「センター」、および「クローズド」はそれぞれ、ＥＰＭのオープン、センター、およびクローズド部分で過ごした時間を指す。 その発現が、双極性障害（ＢＰＤ）患者由来の前部帯状皮質（ＡｎＣｇ）において有意に異常調節される、ｃＡＭＰシグナル伝達経路における遺伝子を列挙する表を示す。 その発現が、大うつ病障害（ＭＤＤ）患者の前部帯状皮質（ＡｎＣｇ）において有意に異常調節される、ｃＡＭＰシグナル伝達経路における遺伝子を列挙する表を示す。 その発現が、双極性障害（ＢＰＤ）患者の前部帯状皮質（ＡｎＣｇ）において有意に異常調節される、ホスファチジルイノシトール・シグナル伝達経路における遺伝子を列挙する表を示す。 その発現が、大うつ病障害（ＭＤＤ）患者の前部帯状皮質（ＡｎＣｇ）において有意に異常調節される、ホスファチジルイノシトール・シグナル伝達経路における遺伝子を列挙する表を示す。 げっ歯類が、この試験システムの明るい区画で過ごす時間によって測定されるものとしての、げっ歯類における不安に対する長期にわたるＦＧＦ−２投与（５ｎｇ／ｇ、３週）の効果を示す、違いを伴う２つの図を示す。ＬＲ、本来備っている不安が高い動物；ＨＲ、本来備っている不安が低い動物；ＨＲＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２が投与された、不安の低い動物；ＬＲＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２が投与された、不安の高い動物。 「オープンアーム」試験を使用する、ＦＧＦ−２遺伝子発現と不安挙動との間の反比例の関係を示す。ＣＡ−２、海馬領域ＣＡ−２。 図１１上：増幅され、実施例に記載されたエキソンを有する、アラインメントされたＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の基本構造の模式図を示す。両方の受容体（Ｒ２およびＲ３）の第３のＩｇ様ドメインのＣ末端におけるＩＩＩｂ／ＩＩＩｃスプライスバリアントに、重点が置かれる。ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３のエキソン配列は、決して同一ではない（図１１下を参照のこと）が、エキソン命名は、Ｒ２およびＲ３両タンパク質構造上の相当する領域に対する各エキソン数にマッチするように合わせられた。ＦＧＦ受容体の先端を切り取られたアイソフォームおよび切断されたアイソフォームは、模式図から除外される。図１１下：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量分析のために設計されたフォワードおよびリバースＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３プライマーの配列を示す。プライマーは、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の両方のＩＩＩｂ／ＩＩＩｃスプライスバリアントの差次的な検出についての効率を得るように最適化および設計された。 ＦＧＦＲ２（上のパネル）とＦＧＦＲ３（下のパネル）の両方における、エキソンＩＩＩｃ：ＩＩＩｂスプライスバリアント発現比の、長期にわたるストレスによって誘発される低下を示す２つの図を示す。Ｖ（賦形剤）；ＮＳ（ストレスなし）；長期にわたるストレス（Ｓ）；ＦＧＦ−２（Ｆ）。

Claims (49)

  1. 対象における気分障害の診断を容易にするための方法であって、
    （ｉ）図５、図６、図７、図８、表１、表２Ｂ、表３、および表４に列挙される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルを測定するステップと、
    （ｉｉ）前記遺伝子が対照に対して異常調節されるか否かを決定する（ここでは、前記遺伝子の調節異常は、前記対象が気分障害を患う可能性の増大を示唆する）ステップと、
    （ｉｉｉ）前記増大された可能性に関する任意の発見を記録または報告するステップ
    を含む方法。
  2. 前記気分障害が双極性障害であり、前記遺伝子が、図５、図７、図８、表２Ｂ、および表４に列挙される遺伝子からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  3. 前記気分障害が大うつ病障害であり、前記遺伝子が、図６、図８、表１、および表３に列挙される遺伝子からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  4. 前記遺伝子調節異常が、前記対象の脳組織内に生ずる請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記脳組織が、青斑核、背側縫線、前部帯状皮質、背外側前頭前野、海馬、および扁桃体からなる群から選択される請求項４に記載の方法。
  6. 前記遺伝子発現が、前記遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡを検出することによって分析される請求項２または３に記載の方法。
  7. 前記遺伝子発現が、前記遺伝子のタンパク質産物を選択的に検出することによって分析される請求項２または３に記載の方法。
  8. 前記遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡを検出することが、
    （ｉ）前記ｍＲＮＡを、前記メッセンジャーＲＮＡと選択的に結びつく試薬と接触させることと、
    （ｉｉ）前記ｍＲＮＡと選択的に結びつく前記試薬のレベルを検出すること
    を含む請求項６に記載の方法。
  9. 前記遺伝子の発現レベルが、気分障害を患わない人間に関するレベルよりも高い請求項１に記載の方法。
  10. 前記遺伝子の発現レベルが、気分障害を患わない人間に関するレベルよりも低い請求項１に記載の方法。
  11. 前記遺伝子の発現レベルが、マイクロアレイ分析を使用して検出され、かつ前記遺伝子が、マイクロアレイ上の少なくとも２つの遺伝子のうちの１つである請求項１に記載の方法。
  12. 前記遺伝子が表１から選択され、前記気分障害が自殺性である請求項１に記載の方法。
  13. 前記対象が、自殺行動の可能性の増大を伴う気分障害とあらかじめ診断されている請求項１２に記載の方法。
  14. 前記対象が、大うつ病、双極性障害、および精神分裂症からなる群から選択される気分障害とあらかじめ診断されている請求項１２に記載の方法。
  15. 前記対象による自殺企図の可能性を低下させる前記対象のための治療を指示することをさらに含む請求項１２に記載の方法。
  16. 前記対象が、双極性障害および大うつ病性障害の症状を有し、前記遺伝子が、双極性の対象において、大うつ病障害の対象とは違うように発現され、それによって、前記対象における双極性障害または大うつ病性障害の診断が容易になる請求項１に記載の方法。
  17. 前記遺伝子が、薬物乱用者でないＭＤＤ対象に対して、薬物を乱用するＭＤＤ対象において異常調節され、かつ前記遺伝子が、表１Ｃに列挙される異常調節された遺伝子から選択され、それによって、薬物乱用と結びつけられるＭＤＤに対するＭＤＤの診断が容易になる請求項１に記載の方法。
  18. 気分障害の治療または予防のための化合物を特定する方法であって、
    （ｉ）図５、図６、図７、図８、表１、表２Ｂ、表３、および表４に列挙される異常調節された遺伝子の群から選択される異常調節された遺伝子に相当するポリペプチドと化合物を接触させるステップと、
    （ｉｉ）前記ポリペプチドに対する前記化合物の機能効果を決定し、それによって、気分障害の治療または予防のための化合物を特定するステップ
    を含む方法。
  19. 前記接触ステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ポリペプチドが細胞中に発現され、前記細胞が前記化合物と接触される請求項１８に記載の方法。
  21. 前記気分障害が、双極性障害、大うつ病障害、自殺性、および薬物乱用合併症からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
  22. 動物に前記化合物を投与し、前記動物に対する効果を決定することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
  23. 前記決定ステップが、前記動物の精神機能を試験することを含む請求項２２に記載の方法。
  24. 自殺の傾向がある対象を治療する方法であって、前記対象に、表１または表２に列挙される遺伝子に相当するポリヌクレオチドによってコードされる治療有効量のポリペプチドを投与するステップを含む方法。
  25. 対象における不安の症状を治療する方法であって、前記対象が不安または不安を伴う病気と診断された後、前記対象に十分な量のＦＧＦ２ペプチドを投与するステップを含む方法。
  26. 前記対象がヒトである請求項２５に記載の方法。
  27. 前記十分な量が、少なくとも１週間の長さの期間にわたって、少なくとも毎週２回投与される量である請求項２５に記載の方法。
  28. 前記病気が、大うつ病または大うつ病性障害である請求項２５に記載の方法。
  29. 長期にわたるストレスを患うヒトを特定するための方法であって、
    ａ）対象から核酸サンプルを得ることと、
    ｂ）ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される発現遺伝子のエキソンＩＩＩｂ：ＩＩＩｃスプライスバリアント比を決定すること（ここでは、約１０を下回る比は、前記ヒトが長期にわたるストレスを患う可能性の増大を伴う）を含む方法。
  30. 前記遺伝子がＦＧＦＲ２である請求項２９に記載の方法。
  31. 前記遺伝子がＦＧＦＲ３である請求項２９に記載の方法。
  32. 前記方法が、前記同定に応答して、薬理学的な治療を施すことをさらに含む請求項２９に記載の方法。
  33. 生きている動物におけるＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３からなる群から選択される発現遺伝子のエキソンＩＩＩｂ：ＩＩＩｃスプライスバリアント比を変化させる化合物を特定するための方法であって、
    ａ）長期にわたるストレスを患う少なくとも１つの動物を特定することと、
    ｂ）前記少なくとも１つの動物における前記スプライスバリアント比を測定することと、ｃ）前記少なくとも１つの動物に試験化合物を投与することと、
    ｄ）前記試験化合物の前記投与の後、２度目の前記スプライスバリアント比を測定することと、
    前記測定によって、前記スプライスバリアント比が増大することが示される場合、前記試験化合物の同一性を記録すること
    を含む方法。
  34. グルタミン酸作動性不均衡を患う対象を治療するための方法であって、グリア輸送体、グルタミンシンテターゼ、ＡＭＰＡ、カイニン酸、ＧＲＭ１、およびＧＲＭ７からなる群から選択される分子を標的にする十分な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
  35. ＭＤＤを患う対象において神経突起伸張を増大させるための方法であって、ＦＧＦＲ３、ＴｒｋＢ受容体、または成長ホルモン受容体を標的にするあるいはＦＧＦ２の作用を模倣する十分な量の化合物を対象に投与することを含む方法。
  36. ＭＤＤを患う対象において全体的なグリアの変化を検出するための方法であって、対象のＬＣ領域における遺伝子発現レベルを決定する（ここでは、前記遺伝子は、表３中のグリアのマーカー遺伝子の群から選択されるグリアのマーカー遺伝子である）ステップを含む方法。
  37. ヒトの対象においてＢＰとＭＤＤとを区別するための方法であって、
    ａ）前記対象のＤＲ組織における、ＭＤＤまたはＢＰ特異的な少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する（ここでは前記ＭＤＤまたはＢＰ特異的な遺伝子は、表４に列挙されるＭＤＤまたはＢＰ特異的な異常調節された遺伝子から選択される）ことと、
    ｂ）前記対象がＭＤＤを患う可能性に対しＢＰを患う可能性の増大を特定すること（ここでは、表４のＭＤＤ特異的な遺伝子の下方調節は、前記対象におけるＭＤＤの可能性の増大と相関し、表４のＢＰ特異的な遺伝子の下方調節は、前記対象におけるＢＰの可能性の増大と相関する）
    を含む方法。
  38. ＢＰまたはＭＤＤのリスクが増大されたヒトの対象を特定するための方法であって、
    （ｉ）表３中に列挙された遺伝子から選択される異常調節された遺伝子の発現レベルを測定することと、
    （ｉｉ）前記測定を、前記対象におけるＢＰまたはＭＤＤの増大されたリスクと相関させることを含む方法。
  39. ＢＰまたはＭＤＤを発症する前記リスクを記録または報告することをさらに含む請求項３８に記載の方法。
  40. 双極性障害を発症する前記リスクが、医師または前記ヒトの対象に報告される請求項３８に記載の方法。
  41. 対象における大うつ病障害の診断を容易にするための方法であって、
    （ｉ）ＦＧＦＲ２エキソン１１に対するＦＧＦＲ２エキソン５の発現の比を測定するステップと、
    （ｉｉ）前記比が対照より低いかどうかを決定するステップ（ここでは、より低い比は、前記対象が大うつ病障害を患う可能性の増大を示唆する）と、
    （ｉｉｉ）前記増大された可能性に関する任意の発見を記録または報告するステップ
    を含む方法。
  42. 前記発現が、前記対象の背外側前頭前野におけるものである請求項４１に記載の方法。
  43. 対象における大うつ病障害の診断を容易にするための方法であって、
    （ｉ）ＦＧＦＲ２エキソン９の発現を測定するステップと、
    （ｉｉ）前記発現が対照より低いかどうか決定するステップ（ここでは、より低い発現レベルは、前記対象が大うつ病障害を患う可能性の増大を示唆する）と、
    （ｉｉｉ）前記可能性の増大に関する任意の発見を記録または報告するステップを含む方法。
  44. 前記発現が、前記対象の背外側前頭前野におけるものである請求項４３に記載の方法。
  45. げっ歯類において記憶力を向上させるための方法であって、前記動物の出生の４８時間以内に前記動物にＦＧＦ２を投与することを含む方法。
  46. 前記ＦＧＦ２が皮下に投与される請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ＦＧＦ２が２０ｎｇ／ｇ（体重）で投与される請求項４５に記載の方法。
  48. 請求項４５、４６、または４７に記載の方法に従って治療されたげっ歯類。
  49. 成体のげっ歯類であり、未治療のげっ歯類に対して記憶力が向上され、前記げっ歯類におけるＮＣＡＭの発現は、未治療のげっ歯類に対して低下し、ＧＡＰ−４３、Ｒｇｓ４、ｔｒｋＢ、ＣＣＫ、ＳＳＴ、およびＶｇｆからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が、未治療のげっ歯類に対して増大された請求項４８に記載のげっ歯類。
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