JP2009517361A - ケラチン結合エフェクター分子、およびその生成方法 - Google Patents

ケラチン結合エフェクター分子、およびその生成方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ケラチン結合エフェクター分子を生成する方法、本発明の方法の中間生成物および最終生成物、ならびに前記方法により生成したケラチン結合エフェクター分子の皮膚化粧料における使用に関する。本発明はさらに、皮膚化粧料活性成分を皮膚および/または毛髪に使用する方法ならびに活性物質が皮膚および毛髪上に滞留する時間を増加させる方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ケラチン結合エフェクター分子を生成する方法、ならびに本発明の方法の中間体および最終生成物、ならびに本発明により生成したケラチン結合エフェクター分子の皮膚化粧料における使用に関する。さらに、本発明は、皮膚化粧用活性成分を皮膚および/または毛髪に使用する方法、ならびに皮膚および毛髪上の活性成分の滞留時間を増加させる方法に関する。
脊椎動物細胞は、フィラメントを含み、その中の一群はケラチンで構成される。例えば、デスモプラキンまたはプラコフィリンなどの特定のタンパク質は、特定の配列モチーフ、いわゆるケラチン結合ドメインによって、毛髪、皮膚および指の爪および足指の爪にもあるこれらのケラチンに結合する(Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978-92. Epub 2003 Jan 26; Hopkinson SB, Jones JC., The N-terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan;11(1):277-86; Smith E.A., Fuchs E., Defining the Interactions Between Intermediate Filaments and Desmosomes, The Journal of Cell Biology, Volume 141, 1998)。
ヒトの皮膚は、何らかの老化作用に曝されており、一部は固有の作用(時間による老化)に起因し、一部は外的要因(環境、例えば光による老化)に起因する。さらに、ざ瘡、脂っぽいかもしくは乾燥した皮膚、角化症、酒さ、皮膚症および光線皮膚症などの光感受性反応、炎症反応、紅斑反応、アレルギー反応または自己免疫反応などの、皮膚の外観の一時的または持続性変化が起こり得る。
外的要因には、特に、太陽光または類似のスペクトルを有する照射の人工光源、また照射の結果生成する場合があるフリーラジカルまたはイオン化合物が挙げられる。これらの要因には、タバコの煙、ならびに皮膚の自然の生理または組織を乱す、オゾン、フリーラジカル、一重項酸素および他の活性酸素または窒素化合物などの、タバコの煙の中にある反応性化合物も挙げられる。
ドイツでは、1968年から総オゾンが全体的にちょうど10％未満減少、または10年で約3％減少してきている。同時期に紫外線は約15％増加した。日焼けの原因となるUV-B照射(波長約300nm)は、癌への影響を最も多く有する。これは、いわゆる非メラノーマ皮膚癌(棘細胞癌または扁平上皮癌または基底細胞腫もしくは基底細胞癌)を患う危険を増加させる。これに関しては、腫瘍の危険性は日焼けの回数と共に増加する。特に、生涯の最初の10年間のUVへの曝露(子供の場合は日焼け)は、癌の危険性に影響を与える。
WHO推計によると、世界中で毎年2百万人が皮膚の基底細胞癌および扁平上皮癌となり、約200000人が黒色腫となる。ドイツでは、皮膚癌の新規症例数は約120000であり、この7パーセントが黒色腫である。ドイツでは毎年、黒色腫または非メラノーマ皮膚癌によって約1600人が死亡している(Arztezeitung 5.17.2000)。
上記の障害、疾患を防止および治療し、ならびにまた皮膚、毛髪、指の爪および足指の爪を手入れし化粧処置するために、新規な活性成分および製品、ならびに革新的なその塗布方法に対する必要性が増加の一途をたどっている。
出願参照番号DE102005011988.3を有するドイツ特許出願では、化粧用調製物におけるケラチン結合ドメインの使用が記載されている。出願参照番号PCT/EP/05/005599を有する国際特許出願では、ケラチン結合ドメインが、エフェクター分子とカップリングすることができることも開示されている。
本発明の1つの目的は、皮膚、毛髪、指の爪および足指の爪に塗布するための新しいタイプの皮膚化粧活性成分化合物、ならびにそれを生成する方法も提供することであった。好都合には、活性成分化合物が、ケラチン結合特性を有し、さらに化粧用および/または皮膚化粧用配合物または調製物を製造するのに適切であることが見出された。さらに、ケラチン結合特性を有するポリペプチドに共有結合を介してカップリングすることができる適切な化合物を同定することが、本発明の1つの目的であった。特に、皮膚化粧用活性成分の革新的な使用方法を提供することが、本発明の1つの目的であった。さらに、皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪上での皮膚化粧用活性成分の滞留時間を増加させる方法を提供することが目的であった。
第1の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのヒドロキシ官能基またはアミノ官能基を担持しているエフェクター分子(i)をケラチン結合ポリペプチド(ii)上に、チオエステル結合、エステル結合、チオエーテル結合、エーテル結合およびアミド結合からなる群から選択される結合ができる少なくとも2つのカップリング官能基を有するリンカー分子(iii)を使用してカップリングすることによって、ケラチン結合エフェクター分子を生成する方法に関し、
(a)第1のカップリングステップにおいて、まずエフェクター分子(i)を、エステル結合またはアミド結合を介して、リンカー分子(iii)に結合させ、
(b)さらなるカップリングステップにおいて、(a)からの反応生成物を、リンカー分子(iii)のまだ遊離のカップリング官能基を介して、ケラチン結合ポリペプチド(ii)と結合させる。
本発明のさらなる実施形態では、リンカー分子(iii)とエフェクター分子(i)との本発明によるカップリングは、カルボジイミドまたは酸塩化物によって媒介されるエステル化反応を介して行われる。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するエフェクター分子(i)は、色素、光防護剤、ビタミン、プロビタミン、カロテノイド、抗酸化剤および過酸化物分解剤からなる群から選択される。
特に好ましい実施形態では、ヒトの皮膚、毛髪または爪のケラチンへの結合親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)が使用される。
好ましくは、本発明により使用されるケラチン結合ポリペプチド(ii)は、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つ、または
(b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドを含む。
好ましくは、本発明により使用されるケラチン結合ポリペプチド(ii)は、ヒトの皮膚、毛髪または爪のケラチンへの結合親和性を有し、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む核酸分子、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98 100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170によるポリペプチドをコードする核酸分子、
(d)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169による配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一であり、ケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(e)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(f)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(g)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200ntまたは500ntの(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(h)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子、
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によってコードされることができることが好ましい。
本発明の一実施形態では、少なくとも2つの異なるカップリング官能基を有するリンカー分子(iii)を使用することが好ましい。好ましくは、これらはマレイミド基を担持するリンカー分子(iii)である。
本発明の方法では、特に好ましく使用されるリンカー分子(iii)は、一般式1：
Figure 2009517361
(式中、「n」は0〜20の整数である)によるカルボン酸基担持マレイミドである。
本発明の方法の最も好ましい実施形態では、マレイミドカプロン酸がリンカー分子(iii)として使用される。
さらに好ましい本発明の実施形態では、これは、
(i)使用されるケラチン結合ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列の1つを含み、
(j)使用されるリンカー分子(iii)が、マレイミドカプロン酸であり、かつ
(k)エフェクター分子(i)が、パントテン酸、パンテノール、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテル、およびカチオン誘導化パンテノールからなる群から選択される、方法である。
本発明はまた、エフェクター分子(i)がリンカー分子(iii)を介してケラチン結合ポリペプチドと間接的にカップリングしており、ただし、リンカー分子(iii)はマレイミドではなく、ケラチン結合ポリペプチド(ii)は配列番号166に相当せず、エフェクター分子(ii)は蛍光色素ではない、ケラチン結合エフェクター分子に関する。好ましい実施形態では、それは、ケラチン結合ポリペプチド(ii)として、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の1つを含むポリペプチドまたはタンパク質を含み、リンカー分子(iii)として、マレイミドカプロン酸が使用されており、パントテン酸、パンテノール、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテル、およびカチオン誘導化パンテノールからなる群から選択されるエフェクター分子(i)をさらに含むケラチン結合エフェクター分子である。
本発明は、上記の本発明のケラチン結合エフェクター分子の皮膚化粧料における使用をさらに提供し、特に好ましい前記皮膚化粧料は、皮膚保護組成物、スキンケア組成物、皮膚洗浄組成物、毛髪保護組成物、ヘアケア組成物、毛髪洗浄組成物、毛髪着色剤、指の爪および足指の爪の手入れ用組成物、ならびに装飾用化粧品である。
さらに、本発明は、皮膚化粧用活性成分を皮膚、毛髪、および/または爪のケラチンに塗布する方法を提供し、この方法において、
(l)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、かつ
(m)(k)によるケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として皮膚、毛髪、および/または爪のケラチンに塗布する。
さらに、本発明は、皮膚、毛髪、および/または爪のケラチンにおける皮膚化粧用活性成分の滞留時間を増加させる方法を提供し、この方法において、
(n)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、
(o)(m)によるケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として皮膚、毛髪、および/または爪のケラチンに塗布し、かつ
(p)活性成分が、ケラチン結合ドメインを介して、皮膚、毛髪または指の爪もしくは足指の爪に間接的に結合する。
本発明は、式2：
Figure 2009517361
(式中、「n」は0〜20の整数に相当する)の化合物をさらに提供する。
本発明は、上記の方法により生成したケラチン結合エフェクター分子を含む皮膚化粧料をさらに提供し、ここでケラチン結合ポリペプチド(ii)は、配列番号166に相当しない。
定義
本発明の目的での「抗体」とは、抗原(身体に対し異質である感染症病原体または生体物質)に対して保護するためにヒトおよび顎を有する脊椎動物が産生するタンパク質である。抗体はより高等な真核生物の免疫系において中心的な成分であり、白血球の一種であるB細胞により分泌される。抗体は血液中および組織の細胞外体液中にある。
本発明の目的での「逆翻訳」とは、タンパク質配列の、そのタンパク質をコードしている核酸配列への翻訳を意味する。したがって逆翻訳は、アミノ酸配列を、それに相当する核酸配列へと解読する方法である。従来の方法は、コンピュータを使った配列比較により得た、特定の生物のためのコドン使用頻度表の作製に基づいている。コドン使用頻度表を使用して、特定の生物の特定のアミノ酸に最も頻繁に使用されるコドンを決定することができる。タンパク質の逆翻訳は、当業者には公知であり、かつこの目的のために特に作製されたコンピュータアルゴリズムを使用して行うことができる(Andres Moreira and Alejandro Maass. TIP:protein backtranslation aided by genetic algorithms. Bioinformatics, Volume 20, Number 13 Pp. 2148-2149 (2004);G Pesole, M Attimonelli, and S Liuni. A backtranslation method based on codon usage strategy. Nucleic Acids Res. 1988 March 11;16(5 Pt A):1715〜1728)。
「装飾用化粧品」は、主として手入れのためには使用されず、皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪の外見の美化または改善のために使用される化粧用助剤を意味する。このタイプの助剤は、当業者であれば適切に知られており、例えば、コールペンシル、マスカラ、アイシャドウ、着色デイクリーム、パウダー、コンシーラースティック、ほお紅、リップスティック、リップライナースティック、メーキャップ、マニキュア液、グラマーゲルなどが含まれる。皮膚または毛髪に着色するために適切な組成物もまた含まれる。
「薬用化粧料」または「皮膚化粧用組成物」または「皮膚化粧用調製物」とも称される「皮膚化粧料」は、(i)皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪へのダメージに対する保護のため、(ii)皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪へのすでにあるダメージを処置するため、ならびに(iii)皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪の手入れのための組成物または調製物であり、皮膚化粧品、爪用化粧品、毛髪用化粧品、皮膚、衛生または医薬用の組成物、調製物および配合物、ならびに皮膚(感覚特性)を改善するためのものが含まれる。装飾用化粧品用の組成物は、明示的に包含される。スキンケア用組成物もまた包含され、化粧品としての観点を考慮して薬剤として皮膚科学的な使用目的が実現される。このタイプの組成物または調製物は、皮膚の障害を助け、予防し、治療するために使用され、美容作用のほかに、生物学的作用を生じさせる。上記の定義をするために、「皮膚化粧料」は、化粧用として適合性のある媒体中に、当業者によく知られており、化粧品ハンドブック、例えばSchrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1、またはUmbach, Kosmetik:Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics:development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd extended edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9に見出すことができる、適切な助剤および添加剤を含む。
本発明の目的での「皮膚化粧活性成分」または「皮膚化粧用活性成分」とは、皮膚化粧料の個々の作用機序を実現するのに関わっている、上記の定義による皮膚化粧料中にある活性成分である。したがってこれらは例えば、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪のダメージを保護し、(ii)皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪のすでにあるダメージを処置するために使用することができ、(iii)皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪をケアする特性を有し、(iv)装飾的美化あるいは皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪の外見の改善のために使用される活性成分である。スキンケア用活性成分も含まれ、化粧品としての観点を考慮して薬剤として皮膚科学的な使用目的が実現する。このタイプの活性成分は、皮膚の障害を助け、予防し、治療するために使用され、美容作用のほかに、生物学的作用をもたらす。このタイプの活性成分は、例えば、天然または合成ポリマー、顔料、湿潤剤、油、ワックス、タンパク質、酵素、ミネラル、ビタミン、日焼け止め剤、色素、香料、抗酸化剤、過酸化物分解剤、保存料、ならびに皮膚の障害を助け、予防し、および治療するために使用され、健康な状態に回復させ、ダメージを予防し、再生させ、または皮膚の全体的状態を改善させる生物学的作用を有する医薬活性成分の群から選択される。
本発明の目的での「エフェクター分子」とは、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に、特定の予見できる効果、好ましくは生物学的または生理学的な保護効果、予防効果および/または手入れ効果を有し、ならびに/あるいは化粧用として装飾効果を有する、分子または皮膚化粧活性成分を意味する。エフェクター分子は、好ましくは色素、光防護剤、ビタミン、タンパク質、酵素、プロビタミン、抗酸化剤、過酸化物分解剤および脂肪酸、コンディショナーまたは金属イオンを含有する化合物、特に非常に好ましくはA群、B群、C群およびE群からのビタミン、プロビタミンおよびビタミン前駆体などの非タンパク質由来の化合物であり、ビタミンB1、B2およびB5が特に好ましい。特に非常に好ましいのは、パントテン酸、パンテノール、およびパンテノールの誘導体、特にパンテノールのエステルおよびエーテルであり、カチオン誘導化パンテノールもまた特に非常に好ましい。
「皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪上での皮膚化粧活性成分の滞留時間の増加」は、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングしていない活性成分と比較して、滞留時間が時間的に延長すること、したがって皮膚および/または毛髪におけるこの活性成分の有効性が増加することを意味する。好ましくは、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪上での滞留時間の増加が、その他が同一の使用条件下で同一のカップリングしていない活性成分と比較して、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪上での活性成分の存在時間について10％、15％、20％、特に好ましくは30％、40％、50％、特に非常に好ましくは75％、100％、125％、最も好ましくは150％、200％、300％、全ての中で最も好ましくは500％、750％、1000％増加することを意味する。
本発明の目的での「ケラチン」とは、ロープ様タンパク質複合体で構成される中間径フィラメントを意味する。中間径フィラメントは、平行に配置された同じタイプ(モノマー)の多くのタンパク質で構成され、チューブ様の構造をしている。中間径フィラメントは、結合し、比較的大きい束となる(張原繊維)。中間径フィラメントは、微小管およびアクチンフィラメントと共に細胞の細胞骨格を形成する。中間径フィラメントには5種類のタイプ区別がある。酸性ケラチンおよび塩基性ケラチン、デスミン、ニューロフィラメントならびにラミンである。本発明の目的のために特に好ましいのは、上皮(多細胞動物生物体の外側の体表全てを覆う単層または多層の細胞層)中にある酸性ケラチンおよび塩基性ケラチンである。1種または複数の「ケラチン」(あるいは、角質物質、硬タンパク質)は、細胞の安定性と形状に関与するタンパク質を意味する。このタンパク質は、哺乳動物の皮膚、毛髪および爪の成分である。ケラチンの強度は、繊維形成により強化される。個々のアミノ酸鎖は、右巻きのα-ヘリックスを形成し、これらのへリックスは3個毎に左巻きのスーパーヘリックス(=プロトフィブリル)を形成する。11個のプロトフィブリルが集まって、ミクロフィブリルとなり、これらの集まりがまた束となり、マクロフィブリルを形成し、これが、例えば毛髪細胞を囲んでいる。
「ケラチン結合ポリペプチド」は、上記の定義の意味の範囲内であるケラチンに結合する特性を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。したがって、ケラチン結合ポリペプチドもまた、中間径フィラメントに関連したタンパク質である。これらのケラチン結合ポリペプチドは、ケラチンに対して、あるいはプロトフィブリル、ミクロフィブリルまたはマクロフィブリルなどのケラチンからなるマクロ構造に対して結合親和性を有する。さらに、ケラチン結合ポリペプチドは、哺乳動物の皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪への結合親和性を有するポリペプチドを意味すると理解される。
「ケラチン結合ポリペプチド」は、哺乳動物生物体において、ケラチン、ケラチン繊維、皮膚または毛髪の結合と関連する生物学的機能を有するポリペプチドでもある。ケラチン結合ポリペプチドはまた、ケラチン、ケラチン繊維、皮膚または毛髪への実際の結合に必要な結合モチーフまたはタンパク質ドメインも意味する。ケラチン結合ポリペプチド(ii)のケラチンへの結合は、実施例8、9および10に記載された条件下で試験することができる。ケラチン結合ポリペプチドは、上記の定量的ケラチン結合試験において、デスモプラキン(配列番号2)のケラチン結合能、好ましくはデスモプラキン(配列番号4)のケラチン結合ドメインBのケラチン結合能の約10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは50％、60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％、125％、150％、特に非常に好ましくは200％、300％または400％、最も好ましくは500％、600％、700％または1000％またはそれ以上を有するポリペプチドである。
本発明の目的での口腔の手入れ、歯の手入れ、歯茎の手入れおよび義歯の手入れのための化粧品組成物とは、テキスト、例えば、参照により本明細書中に明示的に組み入れられるUmbach:Kosmetik:Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics:development, manufacture and use of cosmetic compositions], chapter 7, page 187-219, 2nd expanded edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9に記載されているような、口腔衛生、歯の衛生、歯茎の衛生および義歯の衛生に適切な、全ての組成物、調製物および供給形態を意味する。これらの組成物、調製物および供給形態は、当業者によく知られており、このリストには、網羅的であると見なさないが、例えば、歯磨き粉、歯磨きクリーム、練り歯磨き、子供用歯磨きクリーム、歯磨きゲル、液体歯磨きクリーム、うがい薬、口内洗浄剤、軟膏およびペーストが含まれる。このような組成物の製造は、当業者によく知られており、一般に教科書(例えば、Umbach:Kosmetik:Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics:development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd expanded edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9)中に見出すことができる。したがって、これらの組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子に加えて、当業者には公知のさらなる成分もまた含む。これらは、例えば、界面活性剤、洗浄剤、活性成分、結合剤、湿潤剤、粘度調節剤、保存料、色素、芳香剤および甘味料でもよいが、このリストは網羅的であると見なさない。特定の活性成分は、好ましくは歯茎の炎症または口腔内の傷害のために使用される活性成分である。さらに、これらの活性成分は、例えば、プラークの細菌に対抗し、または歯茎を保護するのに効果的である場合がある。教科書Umbach:Kosmetik:Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics:development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd expanded edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9、205〜207頁において示される配合例を、本明細書において明確に参照する。
「化粧用として適合性のある媒体」は、広義に理解するべきであり、化粧用または皮膚化粧用調製物の製造に適切な物質とこれらの混合物を意味する。それらは、好ましくはタンパク質と適合する媒体である。
ヒトおよび/または動物の皮膚組織または毛髪と接触する場合、「化粧用として適合性のある物質」は、刺激作用またはダメージをもたらさず、他の物質との不適合性を有さない。さらにこれらの物質は、僅かなアレルギーの可能性を有し、国の登録認定機関に化粧用調製物における使用を承認されている。これらの物質は、当業者によく知られており、例えば、化粧品ハンドブック、例えばSchrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1に見出すことができる。
「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖の形態のセンスまたはアンチセンス配向の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらのポリマーもしくはハイブリッドを意味する。核酸または核酸分子という用語は、遺伝子、DNA、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを説明するために使用することができる。
「核酸配列」は、上記の定義による核酸分子のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの連続的で結合した配列を意味し、利用可能なDNA/RNA配列決定法を使用して確認することができ、ヌクレオチドを表す略語、文字または単語のリストで表されまたは示される。
本発明の目的での「ポリペプチド」とは、アミノ酸同士が、ペプチド結合を介して線状に結合している、アミノ酸分子から構成される巨大分子を意味する。ポリペプチドは、いくつかのアミノ酸(約10個〜100個)で構成することが可能であるが、概ね少なくとも100個のアミノ酸から構成されるタンパク質も含まれる。しかし、数千個のアミノ酸を含むことも可能である。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも20個、30個、40個または50個、特に好ましくは少なくとも60個、70個、80個または90個、特に非常に好ましくは少なくとも100個、125個、150個、175個または200個、最も好ましくは少なくとも200個超のアミノ酸を含むが、上限が数千個のアミノ酸でも可能である。
2つの核酸配列の間の「相同性」または「同一性」は、対象となる全配列長に亘る、核酸配列の同一性を意味すると理解され、これはプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0、University of Wisconsin、Genetics Computer Group(GCG)社製、Madison、USA;Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389ff)の補助により、下記のパラメーター設定により比較によって計算される：
ギャップ加重:50
長さ加重:3
平均マッチ:10
平均ミスマッチ:0。
例えば、核酸をベースとして配列番号1と少なくとも80％の相同性を有する配列は、上記の一連のパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムによって、配列番号1と比較した場合、少なくとも80％の相同性を有する配列を意味すると理解される。
2つのポリペプチド間の相同性は、対象となる全配列長に亘るアミノ酸配列の同一性を意味すると理解される、これはプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0、University of Wisconsin、Genetics Computer Group(GCG)社製、Madison、USA)の補助により、下記のパラメーター設定により比較によって計算される：
ギャップ加重:8
長さ加重:2
平均マッチ:2.912
平均ミスマッチ:−2.003。
例えば、ポリペプチドをベースとして配列番号2と少なくとも80％の相同性を有する配列は、上記の一連のパラメーターによる上記のプログラムアルゴリズムによって、配列番号2と比較した場合、少なくとも80％の相同性を有する配列を意味すると理解される。
「ハイブリダイゼーション条件」は、広義に理解すべきであり、適用によってストリンジェントまたはよりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件を意味する。このようなハイブリダイゼーション条件は、とりわけSambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。当業者であれば、特異的ハイブリダイゼーションと非特異的ハイブリダイゼーションとを区別することができるハイブリダイゼーション条件を選択するであろう。例えば、洗浄ステップの間の条件は、低ストリンジェントな条件(約2×SSC、50℃)、および高ストリンジェントな条件(約0.2×SSC、50℃、好ましくは65℃)から選択することができる(20×SSC:0.3Mクエン酸ナトリウム、3M NaCl、pH7.0)。さらに、洗浄ステップの間の温度は、室温である約22℃の低ストリンジェントな条件から、約65℃のより高ストリンジェントな条件に高めることができる。塩濃度および温度の両方のパラメーターを、同時に、またはいずれの場合にも他のパラメーターを一定に保ちながら個々に変更することができる。ハイブリダイゼーションの間、例えば、ホルムアミドまたはSDSなどの変性剤を使用することもできる。ハイブリダイゼーションを、50％ホルムアミドの存在下で、42℃で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいくつかの例示的な条件を下記に示す。
1. ハイブリダイゼーション条件を、例えば下記の条件から選択することができる：
(a)4×SSC、65℃、
(b)6×SSC、45℃、
(c)6×SSC、100μg/mlの変性し断片化された魚精子DNA、68℃、
(d)6×SSC、0.5％SDS、100μg/mlの変性したサケ精子DNA、68℃、
(e)6×SSC、0.5％SDS、100μg/mlの変性し断片化されたサケ精子DNA、50％ホルムアミド、42℃、
(f)50％ホルムアミド、4×SSC、42℃、または
(g)50％(容量/容量)ホルムアミド、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、42℃、または
(i)2×または4×SSC、50℃(低ストリンジェントな条件)、
(j)30〜40％ホルムアミド、2×または4×SSC、42℃(低ストリンジェントな条件)
500mNリン酸ナトリウムバッファー(pH7.2、7％SDS(g/V)、1mMのEDTA、10μg/mlの一本鎖DNA、0.5％BSA(g/V)(Church and Gilbert, Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.81:1991. 1984)。
2. 洗浄ステップは、例えば、下記の条件から選択することができる：
(a)0.015MのNaCl/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％SDS、50℃
(b)0.1×SSC、65℃
(c)0,1×SSC、0.5％SDS、68℃
(d)0.1×SSC、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃
(e)0.2×SSC、0.1％SDS、42℃
(f)2×SSC、65℃(低ストリンジェントな条件)。
一実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、下記の通りに選択される。
ハイブリダイゼーションバッファーは、ホルムアミド、NaClおよびPEG6000を含むものを選択する。ハイブリダイゼーションバッファー中にホルムアミドがあることによって、2本鎖核酸分子が不安定化し、その結果としてハイブリダイゼーション温度は、ストリンジェント度を低下させずに42℃に低下させることができる。ハイブリダイゼーションバッファー中の塩の使用は、二本鎖の再生率またはハイブリダイゼーション効率を増加させる。PEGは、溶液の粘度を増加させるが、これは再生率に悪影響を有し、溶液中にポリマーがあることによって、残りの培地中のプローブの濃度が増加し、それによってハイブリダイゼーション率が増加する。バッファーの組成は下記の通りである。
Figure 2009517361
42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。フィルターを翌朝3回、いずれの場合にも2×SSC+0.1％SDSで約10分間洗浄する。
明細書と関連して、「ヒドロキシ官能基担持エフェクター分子」、「ヒドロキシ官能基」は、これらのOH基を担持する分子がエステル化反応を介して他の分子と共有結合することを可能にする遊離OH基またはヒドロキシル基を意味する。本発明の目的での「ヒドロキシ官能基」はまた、例えば、メトキシ、エトキシなどの誘導体などのOH官能基に化学変換することができるものである。ここで本発明のエフェクター分子は、少なくとも1つのヒドロキシル基を有する。しかし、2つ、3またはそれ以上のヒドロキシ官能基を有するエフェクター分子を使用することも可能である。
明細書と関連して、「アミノ官能基担持エフェクター分子」、「アミノ官能基」は、前記アミノ官能基担持分子がアミド結合を介して他の分子に共有結合することを可能にするアミノ基を意味する。本発明の目的での「アミノ官能基」はまた、アミノ官能基に化学変換することができるものである。ここで本発明のエフェクター分子は、少なくとも1つのアミノ官能基を有する。しかし、2つ、3またはそれを超えるアミノ官能基および/あるいは第二級アミノ基を有するエフェクター分子を使用することも可能である。
リンカー分子の、エフェクター分子またはケラチン結合タンパク質への結合に関連した「カップリング」は、前記分子の共有結合を意味する。
「カップリング官能基」は、エフェクター分子またはケラチン結合タンパク質の官能基と共有結合できる、リンカー分子の官能基である。言及することのできる非限定的な例としては、ヒドロキシ基、カルボキシル基、チオ基およびアミノ基である。「(複数の)カップリング官能基」または「カップリング官能基」および「(複数の)アンカー基」または「アンカー基」は、同義語として使用する。
本発明は、少なくとも1つのヒドロキシ官能基またはアミノ官能基を担持しているエフェクター分子(i)をケラチン結合ポリペプチド(ii)上に、チオエステル結合、エステル結合、チオエーテル結合、エーテル結合およびアミド結合からなる群から選択される結合ができる少なくとも2つのカップリング官能基を有するリンカー分子(iii)を使用してカップリングすることによってケラチン結合エフェクター分子を生成する方法を提供し、
(a)第1のカップリングステップにおいて、まずエフェクター分子(i)を、エステル結合またはアミド結合を介して、リンカー分子(iii)に結合させ、
(b)さらなるカップリングステップにおいて、(a)からの反応生成物を、リンカー分子(iii)のまだ遊離のカップリング官能基を介して、ケラチン結合ポリペプチド(ii)とカップリングさせる。
特に好ましい実施形態では、リンカー分子(iii)は、少なくとも2つのカップリング官能基またはアンカー基を有し、これらの基の少なくとも1つは、カルボキシル官能基である。リンカー分子(iii)のエフェクター分子へのカップリングは、カルボキシル官能基を介して行われ、エフェクターリンカー分子は、残りのアンカー基でケラチン結合ポリペプチド(ii)とカップリングする。
リンカー分子(iii)のケラチン結合ポリペプチド(ii)への好ましい結合は、対応するアミド、チオエステルまたはエステル結合をすることができる、アミノ官能基、チオール官能基またはヒドロキシ官能基を介して、例えば活性化の後に、適切な場合はリンカー分子(iii)のカルボキシル官能基と行われる。
特に好ましい本発明の実施形態では、リンカー分子(iii)は、少なくとも2つの異なるカップリング官能基を有し、本明細書で特に非常に好ましいのは、マレイミド基を有するリンカー分子(iii)である。
本発明の方法では、使用されるリンカー分子(iii)は、特に好ましくは一般式1：
Figure 2009517361
(式中、「n」は、0〜40または0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは0〜10、特に非常に好ましくは1〜9、または2〜8、または3〜7、全ての中で最も好ましくは5の整数である)により示されるカルボン酸基担持マレイミドである。マレイミドカプロン酸の使用が全ての中で最も好ましい。さらに、マレイミドカプロン酸クロリドの使用が、特に非常に好ましい。
さらに特に好ましい実施形態では、リンカー分子(iii)は、少なくとも2つの異なるカップリング官能基、さらに親水性または親油性を増加させるモジュールを有する。この好ましいリンカー分子を、式1bに示す。
Figure 2009517361
式中、「n」は、0〜40または0〜20、好ましくは0〜15、特に好ましくは0〜10、特に非常に好ましくは1〜9、または2〜8、または3〜7の整数であり、Xは、基O、S、N、CH2、-O-C=O、O=C-O-、-NR、-NR-C=O、O=C-NR-であり、Rは、H;メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、またはシクロアルキルなどのC1〜C12の分岐状または枝分かれしていないアルキル基;ベンゾイル、ベンジル;フェニルおよびナフチル、ヘテロアリールなどのC6〜C10-アリール基、好ましくはH、メチルおよびエチルであり、「モジュール」は、エチレングリコールまたは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するポリエチレングリコール基;あるいはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から好ましくは選択されるアミノ酸;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個のアミノ酸を有するポリペプチド(アミノ酸は、好ましくは極性アミノ酸であり、特に好ましくはグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニンおよびシステインからなる群から選択される);あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリアクリル酸基であり、あるいは親油性を高めるために、「モジュール」は、2〜40個の炭素原子を有するアルキル基;あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個の繰り返し単位を有するポリオレフィン基、あるいは好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択されるアミノ酸、あるいは2〜40個、好ましくは2〜20個、特に好ましくは2〜10個のアミノ酸を有するポリペプチド(アミノ酸は、好ましくは非極性アミノ酸であり、特に好ましくは、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニンからなる群から選択される)、あるいは2〜100個、好ましくは2〜80個、特に好ましくは2〜50個、最も好ましくは2〜20個のモノマー単位を有するポリエステル、ポリアミドまたはポリウレタンである。
さらに好ましい実施形態では、リンカー分子は、一般式1c：
Figure 2009517361
(式中、o、mまたはp位のXは、COOHまたはR-COOHであり、Rは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなどのC1〜C12直鎖状もしくは分枝状アルキル基;または1つもしくは複数のC1〜C4-アルキル基で置換されていてもよいC5〜C12-シクロアルキル基などの環状アルキル基;またはo-、m-またはp-配向性アリール、ベンジルまたはベンゾイル単位、好ましくはシクロヘキシル、フェニルおよびナフチルである)により示される分子である。
さらなる好ましい実施形態では、Rは、式1bにおいて説明した「モジュール」でもよい。
さらなる好ましい実施形態では、リンカー分子(iii)と(a)に記載したエフェクター分子(i)とのカップリングは、カルボジイミド、無水物または酸塩化物によって媒介されるエステル化反応またはアミド形成であり、リンカー分子(iii)の酸塩化物の使用が特に好ましい。カルボジイミド、無水物または酸塩化物によって媒介される反応とは、リンカー分子(iii)およびエフェクター分子(i)の間のエステルまたはアミド形成に必要な、カルボジイミドとの反応による、または対称無水物もしくは混合無水物を得る反応による、または酸塩化物を得る反応による、リンカー分子(iii)のカルボキシル基の活性化を意味する。
言及するべきカルボジイミドは、好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)であり、ジイソプロピルカルボジイミドまたはEDCの使用が特に好ましい。さらに、カルボニルジイミダゾール(CDI)による活性化を行うことが可能である。これらのエステル化は、0.1〜100mol％、好ましくは0.5〜10％、特に好ましくは1〜6％のN,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在下で行われる。アミド形成は、カルボジイミドにより活性化した化合物をアミンと反応させることによって行うことが可能である。場合により、アミド形成は、添加剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールまたはN-ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの存在下で行うことが可能である。このような添加剤は、当業者には公知である。これらの添加剤により単離可能な活性エステルが得られる場合は、これらの単離された活性エステルと、エフェクター分子との反応もまた、本発明によるカルボジイミドによって媒介されるエステル化またはアミド形成と理解される。
無水物を得るためのリンカー分子(iii)の反応は、当業者には公知の一般的な方法によって行われる。例えば、無水酢酸、無水ピバロイル、塩化アセチル、塩化ピバロイルまたはクロロギ酸エステルとの反応によって得られるような混合無水物の使用が好ましい。無水ピバロイルおよび炭酸無水物が特に好ましい。酸塩化物を使用する場合、例えば、ピリジン、トリエチルアミンなどの第三級塩基の存在下で無水物の形成を行うことが好都合である。
(a)で説明したリンカー分子(iii)のエフェクター分子(i)とのカップリングは、上記のリンカー分子(iii)の活性化の後に行うことが好ましい場合があり、塩基の存在下で無水物が得られる。言及するべき好ましい塩基は、芳香族および第三級アルキルアミン、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、エチルジイソプロピルアミンなどである。特に好ましい実施形態では、使用される塩基はトリエチルアミンである。
リンカー分子(iii)の酸塩化物との反応のために、使用される塩素化剤は、当業者には公知の従来通りの塩素化剤、例えば塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リン、塩化オキサリル、ホスゲン、またはオキシ塩化リンである。特に非常に好ましいのは、塩化チオニル(SOCl2)を使用することである。
塩化チオニルを使用すると、マレイミドカプロン酸を酸塩化物に変換することが可能である。ここで適切な溶媒は、芳香族および脂肪族炭化水素(例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタンなど)、ハロゲン化炭化水素(例えば、塩化メチレン)、エーテル(例えば、ジエチルエーテル、THFなど)、および過剰の塩素化剤それ自体である。好ましい実施形態では、トルエンが使用される。触媒ありでまたはなしで塩素化を行うことができる。塩素化のための触媒としてDMFが特に好ましい。
さらなる好ましい実施形態では、(a)で説明したリンカー分子(iii)のエフェクター分子(i)とのカップリングは、上記のリンカー分子(iii)の活性化の後に直接行われ、塩基の存在下で酸塩化物が得られる。好ましい塩基は、芳香族および第三級アルキルアミン、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリオクチルアミン、エチルジイソプロピルアミンなどである。特に好ましい実施形態では、使用される塩基はトリエチルアミンである。
驚いたことに、トリエチルアミンの存在下でのマレイミドカプロン酸クロリドによるパンテノールのアシル化の間に、可能性のある異性体の形成に関して、カルボジイミドによって媒介されるカップリング以外の選択性を実現できることが見出された。トリエチルアミンの存在下でのマレイミドカプロン酸クロリドによるパンテノールのアシル化の間に、3種類の可能性のあるモノアシル化異性体のうち2種類のみが、約4:3の比で形成される(実施例12を参照されたい)。
したがって、本発明はさらに好ましくは、反応して酸塩化物を生じるリンカー分子(iii)と組み合わせた、塩基触媒としてのトリエチルアミンの使用を提供し、リンカー分子(iii)は、特に好ましくはマレイミドカプロン酸であり、エフェクター分子(i)は、特に好ましくはパンテノールである。
場合により、ステップ(a)からの反応生成物(以下でリンカーエフェクター分子(iv)と称する)は、さらに精製され、反応生成物の可能性のある異性体を分離することができる。ここでは、化学物質を精製する全ての従来通りの方法、例えば、蒸留、精留、結晶化、抽出およびクロマトグラフィー精製方法を使用することができる。カラムクロマトグラフィーを行うことが好ましい。
上記のステップ(a)から得た反応生成物と、ケラチン結合ポリペプチド(ii)との結合は、リンカー分子の第2のまだ遊離のアンカー基を介して行われる。例えば、このようなアンカー基はチオール官能基でよく、これによってリンカーは、ケラチン結合ポリペプチド(ii)のシステイン基とジスルフィド結合することができる。
目的に合わせて作られたリンカーの使用によって、リンカーエフェクター分子(iv)のケラチン結合ポリペプチドへの結合の正確なマッチングが可能となる。さらにその結果、2つ以上のエフェクター分子をケラチン結合ポリペプチド(ii)に結合することが可能である。
使用されるリンカーは、カップリングする官能性によって左右される。適切なものは、例えば、スルフヒドリル反応性基(例えば、マレイミド、二硫化ピリジル、α-ハロアセチル、ビニルスルホン、スルファトアルキルスルホン(好ましくはスルファトエチルスルホン))によってポリペプチド(ii)をケラチン結合にカップリングする分子である。
リンカー分子(iii)とケラチン結合ポリペプチド(ii)との共有結合が好ましい。例えば、ケラチン結合ポリペプチド(ii)の側鎖を介して、特にアミノ官能基、ヒドロキシ官能基、カルボン酸官能基またはチオール官能基を介して、これを行うことができる。1つもしくは複数のリジン基のアミノ官能基;システイン基の1つもしくは複数のチオール基;セリン、トレオニンまたはチロシン基の1つもしくは複数のヒドロキシル基;アスパラギン酸またはグルタミン酸基の1つもしくは複数のカルボキシル基を介する;あるいはケラチン結合ポリペプチド(ii)のN末端またはC末端官能基を介する結合が好ましい。ケラチン結合ポリペプチド(ii)の一次配列中のアミノ酸官能基とは別に、適切な官能基(例えば、システイン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸)を有するアミノ酸を配列に加えること、またはポリペプチド配列のアミノ酸をこのようなアミノ酸官能基によって置換することもまた可能である。突然変異誘発または核酸分子操作の方法は、当業者には十分に公知である。いくつかの選択した方法を下記に記載する。
本発明の方法に好ましいとされているマレイミドカプロン酸を使用して調製したリンカーエフェクター分子(iv)を使用することが特に好ましい。このようなリンカーエフェクター分子(iv)の場合は、ケラチン結合ポリペプチド中にあるシステイン基がカップリングのために使用される。
エフェクターカップリングの成功は、2つの異なる試験によってモニターすることができる。
(i)エフェクターカップリングの前および後のタンパク質中の遊離Cys-SH基の数を決定することができるエルマン試験。カップリング後の遊離SH基の相当な減少は、良好な反応が進行したことを示す(実施例24を参照されたい)。
(ii)カップリングしているリンカーエフェクター分子がある場合およびない場合の、ケラチン結合ポリペプチドの毛髪への結合を測定することができる活性試験(実施例24aを参照されたい)。
本発明によるさらなる実施形態では、エフェクター分子の結合は、内在性酵素(例えば、エステラーゼ、リパーゼまたはグルコシダーゼ)の作用によって、または経時による皮膚上の周囲条件(例えば、湿気、酸性pH)によって、ある意味での「持続放出」または「制御放出」で、ケラチン結合ポリペプチド(II)から取り除かれ放出することができるような方法で行われる。したがって、ケラチン結合ポリペプチド(II)は、塗布系として使用することが可能であり、一度または繰り返し塗布することによって、皮膚上に少量で遊離のエフェクター分子をもたらすことができる。基本的には、エフェクターは、皮膚上でその対応する誘導体から、例えば、酢酸トコフェロール、パルミチン酸アスコルビルまたはアスコルビルグルコシドから放出されることが可能であることは当業者には公知である(代表的文献: Redoules, D. et al. J. Invest. Dermatol. 125, 2005, 270, Beijersbegen van Henegouwen, G.M.J. et al., J. Photochem. Photobiol. 29, 1995, 45.)。
さらに好ましい本発明の実施形態では、本発明の方法のために、色素、光防護剤、ビタミン、プロビタミン、カロテノイド、抗酸化剤および過酸化物分解剤からなる群から選択される、ヒドロキシル基またはアミノ基を担持するエフェクター分子(i)が使用される。ここで、使用されるエフェクター分子は、1つもしくは複数のヒドロキシル基またはアミノ基を有することができる。
色素
色素の中では、食用色素、半永久的色素、反応染料または酸化染料が好ましい。酸化染料の場合、エフェクター分子(i)として1種類の成分と、ケラチン結合ポリペプチド配列(ii)とを結合させ、次いで作用部位で、すなわち毛髪への結合の後に、第2の色素成分と酸化的カップリングさせることが好ましい。酸化染料の場合は、ケラチン結合ポリペプチド配列(ii)とのカップリングの前に、色素成分のカップリングを行うこともまた好ましい。
適切な色素は、カップリングすることができるヒドロキシル基またはアミノ基を有するという条件であれば、基本的には全ての従来通りの毛染め剤である。適切な色素は、化粧品ハンドブック、例えば、Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundaments and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989,ISBN 3-7785-1491-1から当業者には公知である。
好ましい食用色素は、アントシアン、アントシアニジン(ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、ペツニジン、マルビジン)、ベタレイン、例えば、ベタシアン、ベタキサンチンなど、カルミン、カルミン酸、ケルメス酸、コチニールレッドA、ヒドロキシクマリン(ウンベリフェロン、エスクレチン、スコポレチン、フラキセチン)、2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンである。
特に有利な色素は、下記のリストに特定されているものである。カラーインデックス番号(CIN)は、Rowe Colour Index, 3rd edition, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971から採用する。
Figure 2009517361
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上記の色素は、皮膚または爪を染める(例えば刺青)ために、皮膚または爪結合ポリペプチド配列(ii)に対するエフェクター分子(i)として使用することもできる。特に適切なのは、健康的で輝く皮膚の色合いを実現するため、および皮膚に塗布した後に光学的に皮膚の色を明るく(「美白」)するための、蛍光色素(例えば、表2に含まれる蛍光色素)を含むケラチン結合エフェクター分子の使用である。蛍光顔料の使用は、例えば、US6,753,002に記載されている。より健康的な皮膚の色合いを得るための蛍光色素は、"Filling the Fluorescent Palette, Cosmetics & Toiletries, 26-34, 121, No. 5, 2006"に記載されている。例えば、DayGlo社からの蛍光色素が好ましい。さらに、蛍光色素を含むこれらのケラチン結合エフェクター分子は、毛髪の色を明るくするため、および毛髪に特別な反射または輝きを与えるためにも使用することができる。これについては、例えば、"Hair lightening by fluorescent dyes, Cosmetics & Toiletries, 56-57, 120, No. 7, 2005"、およびその中で引用されている明細書US2004/0,258,641に記載されている。
さらに好ましいエフェクター分子(i)は、カロテノイドである。本発明によれば、カロテノイドは、下記の化合物およびそのエステル化またはグリコシル化誘導体を意味すると理解される。個別または混合物として、キサントフィル、例えば、ビオラキサンチン、ルテインおよびゼアキサンチン、またアスタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、クリプトキサンチン、ビキシン、3-ヒドロキシエキネノン、アドニルビンなどである。好ましく使用されるカロテノイドは、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ムタトキサンチン(mutatoxanthin)、ルテオキサンチンおよびアウロキサンチンである。
さらに好ましいエフェクター分子(i)は、ビタミン、特にビタミンAおよびそのエステルである。
本発明の目的でのレチノイドとは、ビタミンAアルコール(レチノール)を意味する。これに関してレチノイン酸という用語には、オールトランスレチノイン酸、また13-cis-レチノイン酸の両方が含まれる。レチノールという用語には、好ましくはオールトランス化合物が含まれる。本発明の懸濁液に使用される好ましいレチノイドは、以下でレチノールと称するオールトランスレチノールである。
さらに好ましいエフェクター分子(i)は、A群、C群およびE群からのビタミン、プロビタミンおよびビタミン前駆体、特に3,4-ジデヒドロレチノール、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびパルミチン酸エステル、アスコルビン酸のグルコシドまたはリン酸エステル、トコフェロール、特にα-トコフェロールである。
本発明の目的のためのビタミンEまたはトコフェロールには、8種類の脂溶性誘導体が含まれ、それらがさらにトコフェロールおよびトコトリエノールに分類される。トコフェロールのイソプレノイド側鎖は、フィチルピロリン酸(PP)由来である一方、トコトリエノールは、ゲラニルゲラニル-PP由来の側鎖を有する。これらのサブクラスのα、β、γおよびδ誘導体は、6-クロマノール環状構造のメチル化の程度が異なる。トコフェロールは、飽和側鎖(1)を有し、トコトリエノール(2)は、不飽和側鎖を有する。
Figure 2009517361
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本発明において、ビタミンEまたはトコフェロールは、上記のトコフェロールまたはトコトリエノールの全てを意味する。さらに、6-クロマノール誘導体もまた、本発明によるエフェクター分子として使用することができる。
本発明により使用されるのが好ましい、ビタミンB群のビタミン、プロビタミンもしくはビタミン前駆体またはその誘導体、および2-フラノンの誘導体としては、とりわけ下記が挙げられる。
ビタミンB1、慣用名チアミン、化学名3-[(4'-アミノ-2'-メチル-5'-ピリミジニル)メチル]-5-(2-ヒドロキシエチル)-4-メチルチアゾリウムクロリド。
ビタミンB2、慣用名リボフラビン、化学名7,8-ジメチル-10-(1-D-リビチル)ベンゾ[g]プテリジン-2,4(3H,10H)-ジオン。リボフラビンは、例えばホエイ中に遊離型で存在し、他のリボフラビン誘導体は、細菌および酵母から単離することができる。本発明で同様に適切なリボフラビン立体異性体はリキソフラビンであり、これは魚粉または肝臓から単離することができ、D-リビチルの代わりにD-アラビチル基を有する。
ビタミンB5(パントテン酸およびパンテノール)。パンテノールを使用することが好ましい。本発明により使用することができるパンテノールの誘導体は、特に、パンテノールのエステルおよびエーテル、ならびにカチオン誘導化パンテノールである。さらに好ましい本発明の実施形態では、パントテン酸またはパンテノールに加えて、2-フラノンの誘導体もまた使用することができる。特に好ましい誘導体は、同様に市販されている物質である、慣用名パントラクトンのジヒドロ-3-ヒドロキシ-4,4-ジメチル-2(3H)-フラノン(Merck社製)、4-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトン(Merck社製)、3,3-ジメチル-2-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン(Aldrich社製)および2,5-ジヒドロ-5-メトキシ-2-フラノン(Merck社製)であり、これらには全ての立体異性体が明確に含まれる。
好都合にも、これらの化合物は、本発明のケラチン結合エフェクター分子に対して保湿および皮膚鎮静特性を与える。
ビタミンB6。これは画一的な物質ではなく、慣用名ピリドキシン、ピリドキサミンおよびピリドキサールで知られている5-ヒドロキシメチル-2-メチルピリジン-3-オールの誘導体を意味する。
本発明では、前記化合物の適切な誘導体(塩、エステル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチドおよび脂質)は、エフェクター分子として使用することができる。この群由来の好ましい親油性、油溶性抗酸化剤は、トコフェロールおよびその誘導体、没食子酸エステル、フラボノイドおよびカロテノイド、ならびにブチルヒドロキシトルエン/アニソールである。表8に示されるフラボノイドが特に好ましい。
いわゆる過酸化物分解剤、すなわち過酸化物、特に好ましくは過酸化脂質を分解することのできる化合物がさらに好ましい。これらには、例えば、5-ピリミジノールおよび3-ピリジノール誘導体およびプロブコールなどの有機物質が含まれると理解される。
さらに好ましいエフェクター分子は、シリコーン、例えば、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサン、デカメチルテトラシロキサン、1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン、オクタフェニルトリシロキサン、1,3,5-トリビニル-1,1,3,5,5-ペンタメチルトリシロキサンなどである。好ましい実施形態では、クロロシロキサンが、式1、1bまたは1cの化合物と反応して、対応するシロキシルエステルが得られる。使用することができるクロロシロキサンは、例えば、クロロペンタフェニルジシロキサン、1,3-ジクロロテトラフェニルジシロキサン、1,3-ジクロロテトラメチルジシロキサン、1,5-ジクロロヘキサメチルトリシロキサンなどである。
さらなる好ましい実施形態では、ハロメチルシロキサンが、式1、1bまたは1cの化合物と反応して、対応するメチルシロキシルエステル、例えば、クロロメチルペンタジシロキサン、クロロメチルヘプタメチルシクロテトラシロキサン、3-クロロメチルヘプタメチルトリシロキサン、1,3-ビス(ブロモメチル)テトラメチルジシロキサン、3,5-ビス(クロロメチル)オクタメチルテトラシロキサンなどが得られる。
さらなる好ましい実施形態では、ヒドロキシ基またはアミノ基を有するシリコーンが使用され、式1、1bまたは1cの化合物と反応し、エステルまたはアミドを形成することが可能である。このようなシリコーンの例は、3-アミノプロピルペンタメチルジシロキサン、3-ヒドロキシプロピルペンタメチルジシロキサン、1,1,3,3-テトラフェニルジシロキサンジオール、1,3-ビス(ヒドロキシブチル)テトラメチルジシロキサンなどである。
さらに好ましいエフェクター分子(i)は、UV光保護フィルターである。これらは、紫外線を吸収し、吸収したエネルギーをより長い波長の放射、例えば、熱の形で再び放出することのできる有機物質を意味すると理解される。有機物質は、油溶性または水溶性でもよい。
使用し得る油溶性UV-Bフィルターは、例えば、下記の物質である：
4-アミノ安息香酸誘導体、好ましくは遊離のNH官能基を有する4-(ジメチルアミノ)安息香酸2-エチルヘキシル、4-(ジメチルアミノ)安息香酸2-オクチルおよび4-(ジメチルアミノ)安息香酸アミルの誘導体。
サリチル酸のエステル、好ましくはサリチル酸2-エチルヘキシル、サリチル酸4-イソプロピルベンジル、サリチル酸ホモメンチル。
ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキシ-4'-メチルベンゾフェノン、2,2'-ジヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン。
ベンザルマロン酸のエステル、好ましくは遊離OH官能基を有する4-メトキシベンズマロン酸ジ-2-エチルヘキシルの誘導体。
プロパン-1,3-ジオン、例えば、1-(4-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-メトキシフェニル)プロパン-1,3-ジオンなど。
適切な水溶性物質は、
ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン-5-スルホン酸およびその塩である。
ケイ皮酸のエステル、好ましくは遊離OH官能基を有する4-メトキシケイ皮酸2-エチルヘキシル、4-メトキシケイ皮酸イソペンチル、2-シアノ-3-フェニルケイ皮酸2-エチルヘキシル(オクトクリレン)の誘導体の使用が特に好ましい。
さらに、ベンゾフェノンの誘導体、特に2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキシ-4'-メチルベンゾフェノン、2,2'-ジヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノンの使用、およびプロパン-1,3-ジオン、例えば、1-(4-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-メトキシフェニル)プロパン-1,3-ジオンなどの使用が好ましい。
適切で典型的なUV-Aフィルターは、
ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、1-(4'-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-ヒドロキシ-フェニル)プロパン-1,3-ジオン、4-tert-ブチル-4'-ヒドロキシジベンゾイルメタンまたは1-フェニル-3-(4'-イソプロピルフェニル)プロパン-1,3-ジオンなど、
ベンゾフェノンのアミノヒドロキシ置換誘導体、例えば、N,N-ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル-n-ヘキシル安息香酸などである。
UV-AおよびUV-Bフィルターは、当然ながら混合して使用することもできる。
適切なUVフィルター物質を、下記の表に示す。
Figure 2009517361
上記の2群の主要な光保護物質に加えて、紫外線が皮膚内に透過すると誘発される光化学反応の連鎖を中断する抗酸化タイプの二次的な光防護剤を使用することも可能である。その典型例は、トコフェロール(ビタミンE)およびアスコルビン酸(ビタミンC)である。
さらなる群は、紫外線によってダメージを受けた皮膚に対して消炎作用を有する抗刺激剤である。このような物質は、例えば、ビサボロール、フィトールおよびフィタントリオールである。
好ましいエフェクター分子のさらなる群は、ポリフェノールである。本発明の目的でのポリフェノールとは、異なる部類の物質に属する、大部分が2個を超えるフェノール基またはフェノールエーテル基を有するフェノール化合物の集合名である。
(a)ヒドロキシけい皮酸、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシ安息香酸
(b)カテキン、ロイコアントシアニジン
(c)アントシアニジン
(d)フラボノン
(e)フラボン、フラボノール。
本発明の方法では、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つを含み、あるいは
(b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つと少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドに相当する、ケラチン結合ポリペプチド(ii)が好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、使用されるケラチン結合ポリペプチド(ii)は、
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167、169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチド、特に好ましくは165および167、最も好ましくは167を含む核酸分子、
(c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170によるポリペプチドをコードする核酸分子、
(d)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169による配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つと少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(e)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(f)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(g)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200ntまたは500ntを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(h)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によりコードされる。
本発明による適切なケラチン結合ポリペプチドドメインは、デスモプラキン、プラコフィリン、プラコグロビン、プレクチン、ペリプラキン、エンボプラキン、トリコヒアリン、エピプラキンまたは毛包のタンパク質、特に好ましくはデスモプラキンおよびプラコフィリンのポリペプチド配列中に存在する。
本発明の好ましい実施形態では、配列番号2、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164もしくは166によるデスモプラキンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号18、20、26、28、32、34、36、168、170によるプラコフィリンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70の配列によるプラコグロビンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号86の配列によるペリプラキン、および/あるいは配列番号90、92、94、96、98、102、104、105の配列によるエンボプラキンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号138および140による配列を、ケラチン結合ポリペプチドとして使用する。好ましいケラチン結合ドメインは、配列番号4、6、8、10、12、14、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168もしくは170に示されるデスモプラキンポリペプチド、およびその機能的等価物である。特に好ましい本発明の実施形態では、配列番号156、157、158、160、162、164、166、168および/または170に示されるケラチン結合ポリペプチドが、本発明の方法に使用される。一番好ましい本発明の実施形態では、配列番号168に示されるケラチン結合タンパク質が使用される。配列番号168中にあるヒスチジンアンカーの有無にかかわらず、このタンパク質を使用することができることはここでは言うまでもない。したがって、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は、C末端にもある場合がある。前記ケラチン結合タンパク質の実用において(例えば、化粧用調製物中)、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は必要ない。したがって、さらなるアミノ酸配列なしでの前記タンパク質を使用することが好ましい。
本発明は、化粧用として適合性のある媒体中に、
(i)配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
(j)(b)配列番号15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチを含む核酸分子、
(k)配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170によるポリペプチドをコードする核酸分子、
(l)配列番号15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169による配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170による配列の少なくとも1つと少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
(m)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
(n)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(o)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200ntまたは500ntを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
(p)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、 、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子
からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によりコードされる少なくとも1種類のケラチン結合ポリペプチド(ii)を含むケラチン含有材料を処理するための化粧品組成物をさらに提供する。
本発明によって適切なケラチン結合ポリペプチドドメインは、デスモプラキン、プラコフィリン、プラコグロビン、プレクチン、ペリプラキン、エンボプラキン、トリコヒアリン、エピプラキンまたは毛包のタンパク質、特に好ましくはデスモプラキンおよびプラコフィリンのポリペプチド配列中に存在する。
本発明の好ましい実施形態では、配列番号2、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164もしくは166によるデスモプラキンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号18、20、26、28、32、34、36、168、170によるプラコフィリンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70に配列によるプラコグロビンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号86の配列によるペリプラキン、および/あるいは配列番号90、92、94、96、98、102、104、105の配列によるエンボプラキンまたはその部分配列、および/あるいは配列番号138および140による配列を、ケラチン結合ポリペプチドとして使用する。好ましいケラチン結合ドメインは、配列番号4、6、8、10、12、14、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168もしくは170に示されるデスモプラキンポリペプチド、およびその機能的等価物である。特に好ましい本発明の実施形態では、配列番号156、157、158、160、162、164、166、168および/または170に示されるケラチン結合ポリペプチドが、本発明の方法に使用される。一番好ましい本発明の実施形態では、配列番号168に示されるケラチン結合タンパク質が使用される。配列番号168中にあるヒスチジンアンカーの有無にかかわらず、このタンパク質を使用することができることは本明細書において言うまでもない。したがって、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は、C末端にもある場合がある。前記ケラチン結合タンパク質の実用において(例えば、化粧用調製物中)、ヒスチジンアンカー(または同様に使用される精製/検出系)は必要ない。したがって、さらなるアミノ酸配列なしでの前記タンパク質の使用が好ましい。
本発明は、薬剤的に適合性のある媒体中に、上記で定義したケラチン結合ポリペプチド(ii)の少なくとも1種類を含む、ケラチン含有材料を処理するための医薬組成物をさらに提供する。
本発明の医薬組成物の配合物基剤は、製薬上許容される助剤を好ましくは含む。薬学分野、食品技術および関連技術における使用が公知である助剤、特に関連する薬局方(例えば、DAB Ph. Eur. BP NF)において一覧表示されているもの、またその特性が生理学的使用を妨げない他の助剤は、薬剤として許容される。
本発明に同様に含まれるものは、特に開示されているケラチン結合ポリペプチド(ii)の「機能的等価物」および本発明の方法におけるこれらの使用である。
本発明の目的での、特に開示されたケラチン結合ポリペプチド(ii)の「機能的等価物」または類似体とは、例えばケラチン結合などの所望の生物学的活性も有する、ケラチン結合ポリペプチドとは異なるポリペプチドである。したがって、例えば、ケラチン結合ポリペプチドの「機能的等価物」は、実施例に記載した定量的ケラチン結合試験において、他の点では同等の条件下で、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136 138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168に示されたポリペプチドのケラチン結合能の約10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％、125％、150％、特に非常に好ましくは200％、300％または400％、最も好ましくは500％、600％、700％または1000％またはそれ以上を有するポリペプチドを意味すると理解される。
本発明によれば、「機能的等価物」とは、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置において、具体的に記載されるアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物学的活性の1つを有する変異タンパク質も特に意味すると理解される。したがって、「機能的等価物」には、任意の配列位置において特定の変化が起こる可能性がある、変異によって得られる変異タンパク質が含まれる(ただし、その変化が本発明による特性のプロファイルを有する変異タンパク質をもたらす場合)。
本発明の目的での「変異」とは、プラスミド中または生物体のゲノム中の遺伝子変異体の核酸配列の変化を意味する。変異は、例えば複製する間の誤差の結果として起こる場合、または変異源による場合がある。多数の生物的、化学的または物理的変異源が、見識ある当業者には公知ではあるが、生物体の細胞ゲノムにおける自然変異の割合は非常に低い。
変異には、1つまたは複数の核酸基の置換、挿入、欠失が挙げられる。置換は、個々の核酸塩基の置き換えを意味すると理解され、ここでは、塩基転移(プリン塩基によるプリン塩基の置換またはピリミジン塩基によるピリミジン塩基の置換)と、塩基転換(プリン塩基によるピリミジン塩基の置換(またはその反対))とを区別する。
付加または挿入は、追加の核酸基のDNAへの組込みを意味するものと理解され、読み枠の移動をもたらす可能性がある。この種類の読み枠の移動においては、「インフレーム」の挿入/付加と、「アウトフレーム」挿入とを区別する。「インフレーム」の挿入/付加の場合、読み枠は維持され、挿入された核酸によってコードされたアミノ酸の数だけ増えたポリペプチドが生じる。「アウトフレーム」挿入/付加の場合、元来の読み枠は失われ、完全な機能性ポリペプチドの形成はもはや可能でない。
欠失は、1つまたは複数の塩基対の喪失を表し、これも同様に「インフレーム」または「アウトフレーム」読み枠の移動をもたらし、および完全なタンパク質の形成に関してそれと関連する結果をもたらす。
ランダム変異または標的変異を生じさせるために使用することができる変異誘発物質(変異源)および適用できる方法および技術は当業者には公知である。このような方法および変異源は、例えば、A.M. van Harten [(1998)、「Mutation breeding: theory and practical applications」, Cambridge University Press, Cambridge, UK], E Friedberg,G Walker, W Siede [(1995)、「DNA Repair and Mutagenesis」, Blackwell Publishing],またはK. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson [(2000)「Protocols in Mutagenesis」, Elsevier Health Sciences]に記載されている。
標的変異を導入するために、例えば、vitro Mutagense Kits、LA PCR in vitro Mutagenesis Kit(宝酒造社製、京都)、またはStratagene社製QuikChange(登録商標)Kit、または適切なプライマーを使用したPCR突然変異誘発などの従来通りの分子生物学的方法およびプロセスを使用することができる。
上記ですでに述べたように、数多くの化学的、物理的および生物的変異源がある。
一覧表示した変異源を下記に例として示すが、限定的なものではない。
化学的変異源は、それらの作用機序に従って細分することができる。すなわち、塩基類似体(例えば、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン)、単官能性および二官能性アルキル化剤(例えば、エチルメチルスルホン酸、硫酸ジメチルなどの単官能性のもの、または亜硫酸ジクロロエチル、マイトマイシン、ニトロソグアニジン、ジアルキルニトロソアミン、N-ニトロソグアニジン誘導体などの二官能性のもの)、あるいは挿入物質(例えば、アクリジン、臭化エチジウム)がある。
したがって、例えば本発明の方法のために、本発明によるポリペプチドの変異の結果として得た、例えば配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168および/または170によるポリペプチドを使用することも可能である。
適切なアミノ酸置換の例を、下記の表に示す。
Figure 2009517361
配列番号2において、天然で2849位にあるセリンは、この位置でのリン酸化を避けるために、例えばグリシンで置換することが可能であることが知られている(Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230)and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978〜92. Epub 2003 Jan 26)。
上記の意味では、「機能的等価物」はまた、記載したポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
ここで「前駆体」とは、所望の生物学的活性の有無にかかわらず、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子の、カルボキシル基の塩、またはアミノ基の酸付加塩を意味すると理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知の方法によって調製することができ、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩などの無機塩;また例えば、アミン(トリエチルアミンなど)、アルギニン、リジン、ピペリジンなどの有機塩基を有する塩が挙げられる。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩なども同様に、本発明により提供される。
「機能的等価物」には当然、他の生物から取得可能なポリペプチド、および天然に存在する変異体(対立遺伝子)も含まれる。例えば、配列の比較によって、相同配列領域または保存領域の範囲を決定することができる。これらの配列を使用して、DNAデータベース(例えば、ゲノムまたはcDNAデータベース)を、生物情報学の比較プログラムを使用して同等の酵素があるかを調べることができる。公共で利用できる適切なコンピュータプログラムおよびデータベースは、十分に当業者には公知である。
公知のタンパク質配列のこれらのアラインメントは、例えば、InforMax社のベクターNTI8(2002年9月25日版)などのコンピュータプログラムを使用して行うことができる。
さらに、「機能的等価物」は、上記のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物の1つを有し、N末端またはC末端の機能的連結においてそれらと機能的に異なる(すなわち、融合タンパク質の部分の相互の本質的な機能障害がない)少なくとも1つのさらなる異種配列を有する融合タンパク質である。このような異種配列の非限定的な例は、例えば、シグナルペプチドまたは酵素である。
本発明により含まれる「機能的等価物」は、特に開示されたタンパク質の相同体である。定義において開示されているコンピュータプログラムおよびコンピュータアルゴリズムを使用して計算した場合、これらは、特に開示されたアミノ酸配列の1つに対して、少なくとも40％、45％または50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％または70％、特に好ましくは少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％または94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％または96％の相同性を有する。
タンパク質のグリコシル化が起こり得る場合は、本発明による「機能的等価物」には、脱グリコシル化型またはグリコシル化型、およびまたグリコシル化パターンの改変によって得ることができる修飾型の上記の種類のタンパク質が含まれる。
タンパク質のリン酸化が起こり得る場合は、本発明による「機能的等価物」には、脱リン酸化型またはリン酸化型、およびまたリン酸化パターンの改変によって得ることができる修飾型の上記の種類のタンパク質が含まれる。
本発明によるポリペプチドの相同体は、変異体のコンビナトリアルバンクをスクリーニングすることによって、例えば変異体の短縮によって同定することができる。例えば、タンパク質変異体のバンクは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば、合成オリゴヌクレオチド混合物を酵素的にライゲーションすることによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から相同体候補のバンクを得るために使用することができる多数の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動DNA合成機において行うことができ、次いでその合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションすることが可能である。遺伝子の縮重セットの使用によって、1つの混合物中で所望のセットのタンパク質配列候補をコードする全ての配列を提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に公知である(例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
従来技術では、点変異または短縮によって生成されたコンビナトリアルバンク中の遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAバンクをスクリーニングするためのいくつかの技術が公知である。ハイスループット分析の対象である大規模な遺伝子バンクをスクリーニングするために最も使用される技術には、複製可能発現ベクター中に遺伝子バンクをクローニングし、得られたベクターバンクで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が、産物が検出されてきた遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることが挙げられる。バンク中の機能的変異体の発生頻度を増大させる技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発(REM)を、スクリーニング試験と組み合わせて使用して、相同体を同定することができる(Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811〜7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327〜331)。
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示された核酸配列、またはその一部分をプローブとして示された核酸配列を使用した、物理的に利用可能な他の生物のcDNAまたはゲノムDNAライブラリーの検査は、他の方法で相同体を同定するための当業者には公知の方法である。ここで、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167および/または169、特に好ましくは165および167、最も好ましくは167による核酸配列から誘導されたプローブは、少なくとも20bp、好ましくは少なくとも50bp、特に好ましくは少なくとも100bp、特に非常に好ましくは少なくとも200bp、最も好ましくは少なくとも400bpの長さを有する。プローブはまた、1キロベース以上の長さ、例えば、1Kb、1.5Kbまたは3Kbを有することも可能である。ライブラリーを検査するために、20bpから数キロベースの長さの、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167および/または169、特に好ましくは165および167、最も好ましくは167に示された相補的DNA鎖の配列、またはその断片を使用することもまた可能である場合がある。使用するハイブリダイゼーション条件を上に記載する。
本発明の方法では、標準状態において、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167および/または169、特に好ましくは配列番号165および167、最も好ましくは配列番号167に示され、ケラチン結合ポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリダイズするDNA分子、および完全配列として配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されたポリペプチドと同じ特性を有するポリペプチドをコードするDNA分子を使用することもまた可能である。
特に好都合な本発明の実施形態は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されたポリペプチド配列の少なくとも1つを含むケラチン結合ポリペプチド(ii)であるが、ただし、実施例9または10による試験において測定して、前記ポリペプチドのケラチン結合が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示された対応するポリペプチド配列が有する値の少なくとも10％、20％、30％、40％または50％、好ましくは60％、70％、80％または90％、特に好ましくは100％である。
所望の生物に対する高度に特異的な親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することが好ましい。したがって、皮膚化粧品における使用には、ヒトの皮膚ケラチンに対して特に高親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することが好ましい。毛髪用化粧品における使用には、ヒト毛髪ケラチンに対して特に高親和性を有するポリペプチド配列が好ましい。
ペット分野での適用では、記述したポリペプチド配列(配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、164、166、168または170、特に好ましくは配列番号166および168、最も好ましくは配列番号168)に加えて、対応するケラチン、例えば、イヌケラチンまたはネコケラチンに対して特に高親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)が、したがって好ましい。
しかし、本発明によるエフェクター分子(i)にカップリングしている複数のケラチン結合ポリペプチド(ii)を使用することもまた可能であり、例えば、ヒトの皮膚のケラチンに対して高い結合親和性を有するケラチン結合ポリペプチド(ii)は、ヒト毛髪のケラチンに対して高親和性を有する他のケラチン結合ポリペプチド(ii)と組み合わせて、エフェクター分子と結合することができる。同一の(また異なる)ケラチン結合ポリペプチド(ii)またはそのケラチン結合ドメインの2つ以上のコピーを含むキメラポリペプチドを使用することもまた可能である。そのようにして、例えば特に効果的なケラチン結合を実現することが可能であった。
適切なケラチン結合ポリペプチド(ii)は公知である。例えば、デスモプラキンおよびプレクチンは、ケラチン結合ドメインを有する(Fontao L, Favre B, Riou S, Geerts D, Jaunin F, Saurat JH, Green KJ, Sonnenberg A, Borradori L., Interaction of the bullous pemphigoid antigen 1 (BP230) and desmoplakin with intermediate filaments is mediated by distinct sequences within their COOH terminus., Mol Biol Cell. 2003 May;14(5):1978〜92. Epub 2003 Jan 26;Hopkinson SB, Jones JC., The N-terminus of the transmembrane protein BP180 interacts with the N-terminal domain of BP230, thereby mediating keratin cytoskeleton anchorage to the cell surface at the site of the hemidesmosome, Mol Biol Cell. 2000 Jan;11(1):277〜86)。
本発明のケラチン結合ポリペプチド(i)は、(所望であれば)ケラチンから容易に再び分離することもできる。このために、例えば、ケラチンを含有するリンスを使用することが可能であり、その結果、ケラチン結合ポリペプチド(i)は、ケラチンへの従前からの結合から離れ、リンスからのケラチンで飽和する。あるいは、高含量の洗剤(例えば、SDS)を含むリンスもまた、洗い落とすことが可能である。
本発明のケラチン結合ポリペプチド(i)は、ヒトの化粧品、特にスキンケア、ネイルケアおよびヘアケア、動物の手入れ、皮の手入れおよび皮の加工においてさらなる応用分野を有する。
好ましくは、本発明のケラチン結合ポリペプチド(ii)は、皮膚化粧品および毛髪化粧品に使用される。それらは、高濃度のケアまたは保護するエフェクター分子の長い作用時間を可能にする。
本発明の特に好ましい実施形態では、ヒトの皮膚、毛髪または爪のケラチンへの結合親和性を有するケラチン結合ポリペプチドが使用される。
特に好ましい実施形態では、本発明は、
(i)使用されるケラチン結合ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168に示される配列の1つを含み、
(j)使用されるリンカー分子(iii)は、マレイミドカプロン酸であり、
(k)エフェクター分子(i)が、パントテン酸、パンテノール、パントラクトン、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテル、およびカチオン誘導化パンテノールからなる群から選択される
上記方法を提供する。
一実施形態では、本発明の方法のステップ(a)において使用されるケラチン結合ポリペプチド(ii)、およびマレイミドカプロン酸-パンテノールエフェクター分子(iv)は、等モル量で使用される。好ましくは、ケラチン結合ポリペプチド(ii)と、マレイミドカプロン酸-パンテノールエフェクター分子(iv)とのモル比は、1:1〜1:5、好ましくは1:1、1:1.1または1:1.2、好ましくは1:1.3または1:1.4、特に好ましくは1:1.5または1:1.6、特に非常に好ましくは1:1.7または1:1.8、最も好ましくは1:1.9または1:2であり、ポリペプチド中に存在する結合基の数および/または表面での天然に折り畳まれたポリペプチドにおける到達性によって、より大きな比率を選択することも可能である。ケラチン結合ドメインB(配列番号166)を使用する場合、例えば1:4の比を選択することもまた可能であり、その場合、この比は、例えば形成されたケラチン結合エフェクター分子の毛髪結合活性に影響を及ぼす(実施例24を参照されたい)。
本発明は、エフェクター分子(i)が、リンカー分子(iii)を介してケラチン結合ポリペプチドと間接的にカップリングしている、ケラチン結合エフェクター分子をさらに提供する。配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157または158、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168に示された配列による少なくとも1つのケラチン結合ポリペプチド(ii)を含むケラチン結合エフェクター分子が好ましく、その生成の間に使用されるリンカー分子(iii)はマレイミドカプロン酸であった。特に好ましいケラチン結合エフェクター分子を、表12および12aに一覧表示する。使用されるリンカー分子(iii)がマレイミドカプロン酸であり、使用されるエフェクター分子(i)が、パントテン酸、パンテノール、パントラクトン、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテルまたはカチオン誘導化パンテノールであった上記のケラチン結合エフェクター分子が特に非常に好ましい。
本発明は、皮膚化粧用調製物中における本発明により生成したケラチン結合エフェクター分子の使用をさらに提供する。好ましくは、本発明のケラチン結合エフェクター分子は、皮膚および毛髪用化粧品中で使用される。それらは、スキンケアまたは皮膚保護エフェクター物質の高濃度で長い作用時間を可能にする。さらに、歯茎および口腔の手入れにおけるケラチン結合エフェクター分子の使用が好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧料または口腔、歯および義歯のケア用組成物に、組成物の全重量に基づいて、0.001〜1重量％(wt％)、好ましくは0.01〜0.9重量％、特に好ましくは0.01〜0.8重量％、または0.01〜0.7重量％、特に非常に好ましくは0.01〜0.6重量％、または0.01〜0.5重量％、最も好ましくは0.01〜0.4重量％、または0.01〜0.3重量％の濃度で加える。さらなる実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて、1〜10重量％、好ましくは2〜8重量％、3〜7重量％、4〜6重量％の濃度で含む。同様に好ましい実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて、10〜20重量％、好ましくは11〜19重量％、12〜18重量％、13〜17重量％、14〜16重量％の濃度で含む。より好ましい実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて、20〜30重量％、好ましくは21〜29重量％、22〜28重量％、23〜27重量％、24〜26重量％の濃度で含む。
他の好ましい実施形態では、上記の本発明によるケラチン結合エフェクター分子は、(i)装飾用化粧品の分野からの化粧用助剤、(ii)皮膚化粧活性成分、ならびに(iii)適切な助剤および添加剤と組み合わせて、皮膚化粧料ならびに/または口腔、歯および義歯のケア用組成物に使用される。好ましくは、これらは、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪をダメージから保護するため、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪へのすでにあるダメージを処置するため、および皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪を手入れするために使用される、活性成分および助剤および添加剤である。これらの活性成分は、天然または合成ポリマー、顔料、湿潤剤、油、ワックス、酵素、ミネラル、ビタミン、日焼け止め剤、色素、香料、抗酸化剤、保存料および/または医薬活性成分の群から好ましくは選択される。
毛髪化粧用または皮膚化粧用調製物を製造するために適切な助剤および添加剤は、当業者によく知られており、化粧品ハンドブック、例えばSchrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Verlag, Heidelberg, 1989, ISBN 3-7785-1491-1、またはUmbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics: development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd expanded edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9に見出すことができる。
好ましくは、本発明のケラチン結合エフェクター分子は、皮膚化粧料、または口腔の手入れ、歯の手入れ、および義歯の手入れ用組成物中に、化粧用活性成分、乳化剤、界面活性剤、保存料、香油、増粘剤、毛髪ポリマー、ヘアコンディショナーおよびスキンコンディショナー、グラフトポリマー、水溶性または分散性シリコーン含有ポリマー、光防護剤、漂白剤、ゲル形成剤、ケア剤、着色剤、着色剤、タンニング剤、色素、顔料、粘度調節剤、湿潤剤、加脂肪剤、コラーゲン、タンパク質水解物、脂質、抗酸化剤、消泡剤、静電防止剤、皮膚軟化剤および軟化剤から選択されるそれとは異なる少なくとも1種類の成分と組み合わせて使用される。参照により本明細書中に明示的に組み入れられる特許/特許出願EP00974775B1、DE2311712、EP0278878、DE199947147、EP0706822B1およびWO98/16621に記載されているように、活性成分は、化粧用調製物中にカプセル化した形態で存在することもできる。
好都合には抗酸化剤は、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン)およびその誘導体、イミダゾール(例えば、ウロカニン酸)およびその誘導体、ペプチド、例えば、D,L-カルノシン、D-カルノシン、L-カルノシンおよびその誘導体(例えば、アンセリン)、カロテノイド、カロテン(例えば、β-カロテン、リコペン)およびその誘導体、クロロゲン酸およびその誘導体、リポ酸およびその誘導体(例えば、ジヒドロリポ酸)、アウロチオグルコース、プロピルチオウラシルおよび他のチオール(例えば、チオロドキシン、グルタチオン、システイン、シスチン、シスタミン、ならびにそれらのグリコシル、N-アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチルおよびラウリル、パルミトイル、オレイル、γ-リノレイル、コレステリルおよびグリセリルエステル)およびそれらの塩、チオジプロピオン酸ジラウリル、チオジプロピオン酸ジステアリル、チオジプロピオン酸およびその誘導体(エステル、エーテル、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび塩)、およびスルホキシイミン化合物(例えば、ブチオニンスルホキシイミン、ホモシステインスルホキシイミン、ブチオニンスルホン、ペンタチオニンスルホキシイミン、ヘキサチオニンスルホキシイミン、ヘプタチオニンスルホキシイミン)の非常に低い許容量(例えば、pmol〜μmol/kg)、同様に(金属)キレート剤(例えば、α-ヒドロキシ脂肪酸、パルミチン酸、フィチン酸、ラクトフェリン)、α-ヒドロキシ酸(例えば、クエン酸、乳酸、リンゴ酸)、フミン酸、胆汁酸、胆汁エキス、ビリルビン、ビリベルジン、EDTAおよびその誘導体、不飽和脂肪酸およびその誘導体(例えば、γ-リノレン酸、リノール酸、オレイン酸)、葉酸およびその誘導体、ユビキノンおよびユビキノールおよびその誘導体、ビタミンCおよびその誘導体(例えば、アスコルビン酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウム、酢酸アスコルビル)、トコフェロールおよび誘導体(例えば、ビタミンEアセテート、トコトリエノール)、ビタミンAおよび誘導体(ビタミンAパルミテート)、およびベンゾイン樹脂の安息香酸コニフェリル、ルチン酸およびその誘導体、α-グリコシルルチン、フェルラ酸、フルフリリデングルシトール、カルノシン、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ノルジヒドログアイアク酸(nordihydroguaiacic acid)、ノルジヒドログアイアレチン酸(nordihydroguaiaretic acid)、トリヒドロキシブチロフェノン、尿酸およびその誘導体、マンノースおよびその誘導体、亜鉛およびその誘導体(例えば、ZnO、ZnSO4)、セレンおよびその誘導体(例えば、セレノメチオニン)、スチルベンおよびその誘導体(例えば、スチルベンオキシド、トランス-スチルベンオキシド)からなる群から選択される。
本発明により好ましく使用されるビタミンB群のビタミン、プロビタミンもしくはビタミン前駆体、またはその誘導体、および2-フラノンの誘導体には、とりわけ、下記が挙げられる。
ビタミンB1、慣用名チアミン、化学名3-[(4'-アミノ-2'-メチル-5'-ピリミジニル)メチル]-5-(2-ヒドロキシエチル)-4-メチルチアゾリウムクロリド。
ビタミンB2、慣用名リボフラビン、化学名7,8-ジメチル-10-(1-D-リビチル)-ベンゾ[g]プテリジン-2,4(3H,10H)-ジオン。遊離形態では、リボフラビンは、例えばホエイ中に遊離型で存在し、他のリボフラビン誘導体は、細菌および酵母から単離することができる。本発明で同様に適切なリボフラビン立体異性体はリキソフラビンであり、これは魚粉または肝臓から単離することができ、D-リビチル基の代わりにD-アラビチル基を有する。
ビタミンB3。ニコチン酸およびニコチン酸アミド(ナイアシンアミド)の化合物は、この名前を有する場合が多い。本発明によれば、ニコチン酸アミドが好ましい。
ビタミンB5(パントテン酸およびパンテノール)。パンテノールを使用することが好ましい。パンテノールを使用することが好ましい。本発明により使用することができるパンテノールの誘導体は、特に、パンテノールのエステルおよびエーテル、ならびにカチオン誘導化パンテノールである。本発明のさらに好ましい実施形態では、パントテン酸またはパンテノールに加えて、2-フラノンの誘導体もまた使用することができる。特に好ましい誘導体は、同様に市販されている物質である、慣用名パントラクトンのジヒドロ-3-ヒドロキシ-4,4-ジメチル-2(3H)-フラノン(Merck社製)、4-ヒドロキシメチル-γ-ブチロラクトン(Merck社製)、3,3-ジメチル-2-ヒドロキシ-γ-ブチロラクトン(Aldrich社製)および2,5-ジヒドロ-5-メトキシ-2-フラノン(Merck社製)であり、これらには全ての立体異性体が明確に含まれる。
好都合にも、これらの化合物は、保湿および皮膚鎮静特性を本発明の皮膚化粧料に付与する。
ビタミンB6。これは画一的な物質ではなく、慣用名ピリドキシン、ピリドキサミンおよびピリドキサールで知られている5-ヒドロキシメチル-2-メチルピリジン-3-オールの誘導体である。
ビタミンB7(ビオチン)は、ビタミンHまたは「皮膚ビタミン」とも称される。ビオチンは、(3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロチエノール[3,4-d]イミダゾール-4-吉草酸である。
パンテノール、パントラクトン、ニコチン酸アミドおよびビオチンは、本発明により特に非常に好ましい。
色素
使用することができる色素は、例えば、Farbstoffkommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft [Dyes Commission of the German Research Society]からの刊行物「Kosmetische Farbemittel」 [Cosmetic Colorants](出版者Verlag Chemie, Weinheim)1984において一覧表示されているような、化粧品用途のために承認された適切な物質である。これらの色素は、全混合物をベースとして0.001〜0.1重量％の濃度で通常使用される。
顔料
好ましい一実施形態では、本発明による組成物は、少なくとも1種類の顔料を含む。顔料は、生成物塊中に溶解していない形態で存在し、0.01〜25重量％、特に好ましくは5〜15重量％の量で存在し得る。好ましい粒径は、1〜200μm、特に3〜150μm、特に好ましくは10〜100μmである。顔料は、塗布媒体中で実質上不溶の着色剤であって、無機または有機でもよい。無機、有機の混合顔料も可能である。無機顔料が好ましい。無機顔料の利点は、その優れた光安定性、天候安定性および熱安定性である。無機顔料は、例えば、チョーク、黄土、アンバー、緑土、バーントシェナーまたは黒鉛から調製した天然由来のものでよい。顔料は、例えば二酸化チタンまたは酸化亜鉛などの白色顔料;例えば黒酸化鉄などの黒色顔料;例えばウルトラマリンまたは赤酸化鉄などの有色顔料;真珠光沢顔料;金属効果顔料;真珠光沢顔料および蛍光顔料または発光顔料でよく、少なくとも1種類の顔料は、有色の白色でない顔料が好ましい。金属酸化物、金属水酸化物および金属酸化物の水和物、混合相顔料、硫黄含有ケイ酸塩、金属硫化物、錯体金属シアン化物、金属硫酸塩、金属クロム酸塩、金属モリブデン酸塩、および金属自体(ブロンズ顔料)が適切である。二酸化チタン(CI77891)、黒酸化鉄(CI77499)、黄酸化鉄(CI77492)、赤および茶酸化鉄(CI77491)、マンガンバイオレット(CI77742)、ウルトラマリン(スルホケイ酸アルミニウムナトリウム、CI77007、ピグメントブルー29)、酸化クロム水和物(CI77289)、紺青(フェロシアン化第二鉄青、CI77510)、カルミン(コチニール)が特に適切である。金属酸化物またはオキシ塩化金属、例えば、二酸化チタンまたはオキシ塩化ビスマスなど、および適切な場合はさらなる色付与物質、例えば、酸化鉄、紺青、ウルトラマリン、カルミンなどでコーティングされた雲母をベースとする真珠光沢顔料および有色顔料が特に好ましく、色は層の厚さを変化させることによって決定することができる。このタイプの顔料は、例えば、商品名Rona(登録商標)、Colorona(登録商標)、Dichrona(登録商標)およびTimiron(登録商標)(Merck社製)で販売されている。有機顔料は、例えば、天然顔料セピア、ガンボージ、カッセルブラウン、インジゴ、クロロフィルおよび他の植物顔料である。合成有機顔料は、例えば、アゾ顔料、アントラキノイド、インジゴイド、ジオキサジン、キナクリドン、フタロシアニン、イソインドリノン、ペリレンおよびペリノン、金属錯体、アルカリブルーおよびジケトピロロピロール顔料である。
一実施形態では、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子は、組成物中に0.01〜10重量％、好ましくは0.05〜5重量％の量で存在する少なくとも1種類の粒子状物質と共に使用される。適切な物質は、例えば、室温(25℃)で固体であり粒子の形態の物質である。例えば、シリカ、ケイ酸塩、アルミン酸塩、クレー土、雲母、塩、特に無機金属塩、金属酸化物、例えば二酸化チタン、ミネラルおよびポリマー粒子が適切である。粒子は組成物中に溶解しておらず、好ましくは安定的に分散した形態で存在し、塗布表面への塗布と溶媒の蒸発後に、固形で付着させることができる。好ましい粒子状物質は、シリカ(シリカゲル、二酸化ケイ素)および金属塩、特に無機金属塩であり、シリカが特に好ましい。金属塩は、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどのアルカリ金属ハロゲン化物またはアルカリ土類金属ハロゲン化物;硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウムなどのアルカリ金属硫酸塩またはアルカリ土類金属硫酸塩である。
真珠様光沢剤
適切な真珠様光沢剤は、例えば、アルキレングリコールエステル、特にジステアリン酸エチレングリコール;脂肪酸アルカノールアミド、特にヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド;部分グリセリド、特にステアリン酸モノグリセリド;任意選択でヒドロキシ置換された多塩基カルボン酸と、6〜22個の炭素原子を有する脂肪アルコールとのエステル、特に酒石酸の長鎖エステル;全部で少なくとも24個の炭素原子を有する、例えば、脂肪アルコール、脂肪ケトン、脂肪アルデヒド、脂肪エーテルおよび脂肪カルボナートなどの脂肪物質、特にラウロンおよびジステアリルエーテル;ステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸またはベヘン酸などの脂肪酸;12〜22個の炭素原子を有するオレフィンエポキシドと、12〜22個の炭素原子を有する脂肪アルコールとの、ならびに/または2〜15個の炭素原子および2〜10個のヒドロキシル基を有するポリオールとの開環生成物、ならびにこれらの混合物である。
このような配合物中の従来通りの増粘剤は、架橋ポリアクリル酸およびその誘導体、多糖類およびその誘導体、例えば、キサンタンガム、寒天、アルギナートまたはチロース、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシカルボキシメチルセルロース、脂肪アルコール、モノグリセリドおよび脂肪酸、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンである。非イオン性増粘剤を使用することが好ましい。
適切な化粧用および/または皮膚化粧用活性成分は、例えば、着色性活性成分、皮膚および毛髪染色剤、着色剤、タンニング剤、漂白剤、ケラチン硬化物質、抗菌性活性成分、光フィルター活性成分、忌避性活性成分、充血性物質、角質溶解性および角質柔軟化効果を有する物質、フケ防止活性成分、消炎剤、角質化物質、抗酸化活性成分および/またはフリーラジカル捕捉剤として作用する活性成分、皮膚加湿または保湿性物質、加脂肪活性成分、抗紅斑性または抗アレルギー性活性成分、18-メチルイコサン酸などの分枝状脂肪酸、およびこれらの混合物である。
紫外線による自然または人工の照射なしで皮膚を褐色にするのに適切な人工的皮膚タンニング活性成分は、例えば、ジヒドロキシアセトン、アロキサンおよびクルミ殻抽出物である。適切なケラチン硬化物質は、通常発汗抑制剤中にも使用されているような、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、アルミニウムヒドロキシクロリド、乳酸アルミニウムなどの活性成分である。
抗菌性活性成分は、微生物を消滅させ、またはそれらの増殖を抑制するために使用され、したがって、保存料として、および体臭が生じることまたは高まることを軽減する脱臭物質としての両方の機能を果たす。これらには、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、イミダゾリジニル尿素、ホルムアルデヒド、ソルビン酸、安息香酸、サリチル酸などの当業者には公知の従来通りの保存料が挙げられる。このような脱臭物質は、例えば、リシノール酸亜鉛、トリクロサン、ウンデシレン酸アルキルオールアミド(undecylenic acid alkylolamides)、クエン酸トリエチル、クロルヘキシジンなどである。
本発明により好都合に使用される適切な保存料は下記の通りである。
Figure 2009517361
本発明によりまた適切なものは、化粧品において通例の保存料または保存料助剤であるジブロモジシアノブタン(2-ブロモ-2-ブロモメチルグルタロジニトリル)、ブチルカルバミン酸3-ヨード-2-プロピニル、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール、イミダゾリジニル尿素、5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、2-クロロアセトアミド、塩化ベンザルコニウムおよびベンジルアルコールである。保存料としてまた適切なものは、フェニルヒドロキシアルキルエーテル、特に、いくつかの微生物に対してのその殺菌効果および殺真菌効果によってフェノキシエタノールの名称で知られている化合物である。
他の抗菌剤も、本発明による調製物中に組み込むのに同様に適切である。有利な物質は、例えば、2,4,4'-トリクロロ-2'-ヒドロキシジフェニルエーテル(イルガサン)、1,6-ジ(4-クロロフェニルビグアニド)ヘキサン(クロルヘキシジン)、3,4,4'-トリクロロカルボアニリド、第四級アンモニウム化合物、クローブ油、ハッカ油、タイム油、クエン酸トリエチル、ファルネソール(3,7,11-トリメチル-2,6,10-ドデカトリエン-1-オール)、ならびに特許公開明細書DE-3740186、DE-3938140、DE-4204321、DE-4229707、DE-4309372、DE-4411664、DE-19541967、DE-19543695、DE-19543696、DE-19547160、DE-19602108、DE-19602110、DE-19602111、DE-19631003、DE-19631004およびDE-19634019、ならびに特許明細書DE4229737、DE-4237081、DE-4324219、DE-4429467、DE-4423410およびDE-19516705に記載されている活性成分または活性成分の組合せである。炭酸水素ナトリウムもまた、好都合に使用される。微生物ポリペプチドも同様に使用することができる。
香油
化粧品組成物は、適切な場合は香油を含むことができる。言及することができる香油は、例えば、天然および合成香料の混合物である。天然香料は、花(ユリ、ラベンダー、バラ、ジャスミン、ネロリ、イランイラン)、茎および葉(ゼラニウム、パチョリ、プチグレン)、果物(アニシード、コリアンダー、キャラウェー、ジュニパー)、果皮(ベルガモット、レモン、オレンジ)、根(メース、アンゼリカ、セロリ、カルダモン、コスタス、アヤメ、ショウブ)、木(マツ、ビャクダン、グアヤックウッド、シーダーウッド、シタン)、ハーブおよび草(タラゴン、レモングラス、セージ、タイム)、針葉シタン、ハーブおよび草(タラゴン、レモングラス、セージ、タイム)、針葉および枝(トウヒ、モミ、マツ、低木マツ)、樹脂およびバルサム(ガルバヌム、エレミ、ベンゾイン、ミルラ、オリバナム、オポポナクス)から抽出される。また適切なのは、例えば、シベットおよびビーバー香などの動物原料である。典型的な合成香料化合物は、エステル型、エーテル型、アルデヒド型、ケトン型、アルコール型および炭化水素型の生成物である。エステル型の香料化合物は、例えば、酢酸ベンジル、イソ酪酸フェノキシエチル、酢酸4-tert-ブチルシクロヘキシル、酢酸リナリル、酢酸ジメチルベンジルカルビニル、酢酸フェニルエチル、安息香酸リナリル、ギ酸ベンジル、グリシン酸エチルメチルフェニル、シクロヘキシルプロピオン酸アリル、プロピオン酸スチラリルおよびサリチル酸ベンジルである。エーテルには、例えば、ベンジルエチルエーテルが挙げられ、アルデヒドには、例えば、8〜18個の炭素原子を有するアルカナール、シトラール、シトロネラール、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラール、リリアールおよびブルゲオナールが挙げられ、ケトンには、例えば、イオノン、イソメチルイオノンおよびメチルセドリルケトンが挙げられ、アルコールには、アネトール、シトロネロール、ユージノール、イソオイゲノール、ゲラニオール、リナロオール、フェニルエチルアルコールおよびテルペネオールが挙げられ、炭化水素には、主としてテルペンおよびバルサムが挙げられる。しかし、共に心地よい香りを生じる異なる香料の混合物を使用することが好ましい。主に芳香成分として使用される比較的低揮発性の精油もまた、香油として適切であり、例えば、セージ油、カミツレ油、クローブ油、メリッサ油、ハッカ油、桂皮油、リンデン花油、杜松子油、ベチバー油、オリバナム油、ガルバヌム油、ラダナム油およびラベンダー油である。好ましくは、ベルガモット油、ジヒドロミルセノール、リリアール、リラール、シトロネロール、フェニルエチルアルコール、α-ヘキシルシンナムアルデヒド、ゲラニオール、ベンジルアセトン、シクラメンアルデヒド、リナロオール、Boisambrene(登録商標)Forte、アンブロキサン、インドール、ヘジオン(hedione)、サンデリス、レモン油、マンダリン油、オレンジ油、グリコール酸アリルアミル、シクロベルタル(cyclovertal)、ラバンジン油、クラリセージ油、β-ダマスコン、ゼラニウム油バーボン、サリチル酸シクロヘキシル、Vertofix(登録商標)Coeur、Iso-E-Super(登録商標)、Fixolide(登録商標)NP、エバニール、イラルデインガンマ(iraldein gamma)、フェニル酢酸、酢酸ゲラニル、酢酸ベンジル、ローズオキシド、ロミラト(romillate)、イロチル(irotyl)およびフロラマト(floramate)が、単独でまたは混合物中で使用される。
油、脂肪およびワックス
好ましくは、本発明による組成物は、油、脂肪および/またはワックスを含む。本発明による組成物の油相および/または脂肪相の成分は、レシチンおよび脂肪酸トリグリセリド、すなわち、8〜24個、特に12〜18個の炭素原子の鎖長を有する飽和および/または不飽和の分岐状および/または枝分かれしていないアルカンカルボン酸のトリグリセロールエステルの群から有利に選択される。脂肪酸トリグリセリドは、例えば、合成、半合成および天然の油、例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、大豆油、落花生油、ナタネ油、扁桃油、パーム油、ヤシ油、ヒマシ油、小麦胚芽油、グレープシード油、アザミ油、月見草油、マカデミアナッツ油などの群から好都合に選択することができる。さらなる極性油成分は、3〜30個の炭素原子の鎖長を有する飽和および/または不飽和の分岐状および/または枝分かれしていないアルカンカルボン酸と、3〜30個の炭素原子の鎖長を有する飽和および/または不飽和の分岐状および/または枝分かれしていないアルコールとのエステルの群から、ならびに芳香族カルボン酸と、3〜30個の炭素原子の鎖長を有する飽和および/または不飽和の分岐状および/または枝分かれしていないアルコールとのエステルの群から選択することができる。そしてこのようなエステル油は、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピル、ステアリン酸n-ブチル、ラウリン酸n-ヘキシル、オレイン酸n-デシル、ステアリン酸イソオクチル、ステアリン酸イソノニル、イソノナン酸イソノニル、パルミチン酸2-エチルヘキシル、ラウリン酸2-エチルヘキシル、ステアリン酸2-ヘキシルデシル、パルミチン酸2-オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、エルカ酸オレイル、オレイン酸エルシル、エルカ酸エルシル炭酸ジカプリリル(cetiol CC)およびココグリセリド(myritol331)、ジカプリル酸/ジカプリン酸ブチレングリコールおよびアジピン酸ジブチル、ならびにこのようなエステルの合成、半合成および天然混合物(例えば、ホホバ油など)からなる群から好都合に選択することができる。
さらに、1種または複数の油性成分は、分岐状および枝分かれしていない炭化水素および炭化水素ワックス、シリコーン油、ジアルキルエーテル、飽和または不飽和の分岐状または枝分かれしていないアルコールの群からから好都合に選択することができる。このような油およびワックス成分の任意の混合物もまた、本発明の目的のために好都合に使用することができる。適切な場合、ワックス、例えば、パルミチン酸セチルを、油相の単独の脂質成分として使用することもまた好都合である場合がある。本発明によれば、油性成分は、イソステアリン酸2-エチルヘキシル、オクチルドデカノール、イソノナン酸イソトリデシル、イソエイコサン、ヤシ油脂肪酸2-エチルヘキシル、C12〜15-安息香酸アルキル、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、ジカプリリルエーテルからなる群から好都合に選択される。本発明によれば、C12〜15-安息香酸アルキルとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとの混合物、C12〜15-安息香酸アルキルとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物、およびC12〜15-安息香酸アルキルとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物が好都合である。本発明によれば、特に好ましく使用される5〜50mN/mの極性を有する油は、脂肪酸トリグリセリド、特に大豆油および/または扁桃油である。炭化水素では、パラフィン油、スクアランおよびスクアレンが、本発明の目的のために好都合に使用される。
さらに、油相は、ゲルベアルコールの群から好都合に選択することができる。ゲルベアルコールは、初めてその調製について説明したMarcel Guerbetの名をとって命名されている。それらは、反応方程式：
Figure 2009517361
(アルコールの酸化によりアルデヒドが生成し、アルデヒドのアルドール縮合によって、アルドールから水が除去され、アリルアルデヒドが水素添加される)に従って形成される。ゲルベアルコールは低温でも液体であり、事実上皮膚刺激作用をもたらさない。それらは、化粧品組成物中で脂肪、過脂肪、また加脂肪成分として好都合に使用することができる。
化粧品中にゲルベアルコールを使用することは、それ自体公知である。次いでこのような種は、大半が構造：
Figure 2009517361
によって特徴付けられる。ここで、R1およびR2は、通常枝分かれしていないアルキル基である。
本発明によれば、ゲルベアルコールまたはアルコールは、
R1=プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチル、および
R2=ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシルまたはテトラデシル
の群から好都合に選択される。
本発明により好ましいゲルベアルコールは、2-ブチルオクタノール(例えば、Isofol(登録商標)12(Condea社製)として市販)および2-ヘキシルデカノール(例えば、Isofol(登録商標)16(Condea社製)として市販)である。例えば、2-ブチルオクタノールと2-ヘキシルデカノールとの混合物(例えば、Isofol(登録商標)14(Condea社製)として市販)などの、本発明によるゲルベアルコールの混合物はまた、本発明により好都合に使用される。
このような油およびワックス成分の任意の混合物もまた、本発明の目的のために好都合に使用される。ポリオレフィン中で、ポリデセンが好ましい物質である。
油性成分はまた、環状または直鎖状シリコーン油の成分を好都合に有することが可能であり、あるいは全てこのような油で構成されることも可能であるが、シリコーン油または数種類のシリコーン油とは別に、他の油相成分のさらなる成分を使用することが好ましい。低分子量シリコーンまたはシリコーン油は、一般に下記の一般式によって定義される：
Figure 2009517361
より高分子量のシリコーンまたはシリコーン油は、一般に下記の一般式によって定義される：
Figure 2009517361
式中、ケイ素原子は、ここでは基R1〜R4により一般名で示されている同一または異なるアルキル基および/またはアリール基によって置換されてもよい。しかし、異なる基の数は、必ずしも4までに限定されない。ここでmは、2〜200000の値とすることが可能である。
本発明により好都合に使用される環状シリコーンは、一般に下記の一般式によって定義される。
Figure 2009517361
式中、ケイ素原子は、ここでは基R1〜R4によって一般用語で示されている同一または異なるアルキル基および/またはアリール基によって置換されてもよい。しかし、異なる基の数は、必ずしも4までに限定されない。ここで「n」は、3/2〜20の値とすることができる。nの端数の値は、一律でない数のシロキシル基が環中に存在し得ることを考慮している。
好都合には、フェニルトリメチコーンが、シリコーン油として選択される。他のシリコーン油、例えば、ジメチコン、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、フェニルジメチコン、シクロメチコン(オクタメチルシクロテトラシロキサン)、ヘキサメチルシクロトリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ(メチルフェニルシロキサン)、セチルジメチコン、ベヘノキシジメチコンもまた、本発明の目的のために好都合に使用することができる。シクロメチコンとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物、およびシクロメチコンとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとの混合物もまた好都合である。しかし、その有機側鎖が誘導体化された、例えば、ポリエトキシ化および/またはポリプロポキシル化された上記で言及した化合物と同様の組成のシリコーン油を選択することもまた好都合である。これらには、例えば、ポリシロキサン-ポリアルキル-ポリエーテルコポリマー、例えば、セチルジメチコンコポリオールなどが挙げられる。シクロメチコン(オクタメチルシクロテトラシロキサン)は、本発明により使用されるシリコーン油として好都合に使用される。本発明により好都合に使用される脂肪および/またはワックス成分は、野菜ワックス、動物ワックス、鉱物性ワックスおよび石油化学系ワックスの群から選択することができる。例えば、カンデリラワックス、カルナウバワックス、木ろう、アフリカハネガヤワックス、コルクワックス、グアルマワックス、米ぬか油ワックス、サトウキビワックス、ベリーワックス、オーリクリーワックス、モンタンワックス、ホホバワックス、シアバター、蜜ろう、セラックワックス、鯨ろう、ラノリン(羊毛ワックス)、尾羽脂、セレシン、オゾケライト(臭ろう)、パラフィンワックスおよびマイクロワックスが好都合である。
さらなる好都合な脂肪および/またはワックス成分は、化学修飾ワックスおよび合成ワックス、例えば、Syncrowax(登録商標)HRC(トリベヘン酸グリセリル)、Syncrowax(登録商標)AW1C(C18〜36脂肪酸)など;モンタンエステルワックス;サソール(sasol)ワックス;水素化ホホバワックス;合成または変性蜜ろう(例えば、ジメチコンコポリオール蜜ろうおよび/またはC30〜50-アルキル蜜ろう);リシノール酸セチル、例えば、Tegosoft(登録商標)CRなど;ポリアルキレンワックス;ポリエチレングリコールワックス、また化学修飾脂肪、例えば、硬化植物油(例えば、硬化ヒマシ油および/または硬化ココナツ脂肪グリセリド);トリグリセリド、例えば、水添ダイズ脂肪酸グリセリル;トリヒドロキシステアリン;脂肪酸;脂肪酸エステルおよびグリコールエステル、例えば、ステアリン酸C20〜40-アルキル、ステアリン酸C20〜40-アルキルヒドロキシステアロイル、ならびに/またはモンタン酸グリコールである。さらに、特定の脂肪および/またはワックス成分と同様の物理学的性質を有する特定の有機ケイ素化合物、例えば、ステアロキシトリメチルシランなどもまた好都合である。
本発明によれば、脂肪および/またはワックス成分は、組成物中で単独でまたは混合物として使用することができる。このような油およびワックス成分の任意の混合物もまた、本発明の目的のために好都合に使用される。好都合には、油相は、イソステアリン酸2-エチルヘキシル、オクチルドデカノール、イソノナン酸イソトリデシル、ジカプリル酸/ジカプリン酸ブチレングリコール、ヤシ油脂肪酸2-エチルヘキシル、C12〜15-安息香酸アルキル、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、ジカプリリルエーテルからなる群から選択される。オクチルドデカノールとカプリル酸/カプリン酸トリグリセリドとジカプリリルエーテルと炭酸ジカプリリルとココグリセリドとの混合物、またはC12〜15-安息香酸アルキルとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとの混合物、C12〜15-安息香酸アルキルとジカプリル酸/ジカプリン酸ブチレングリコールとの混合物、およびC12〜15-安息香酸アルキルとイソステアリン酸2-エチルヘキシルとイソノナン酸イソトリデシルとの混合物が、特に好都合である。炭化水素では、パラフィン油、シクロパラフィン、スクアラン、スクアレン、水添ポリイソブテンおよびポリデセンは、本発明の目的のために好都合に使用すべきである。
油性成分はまた、リン脂質の群からも好都合に選択される。リン脂質は、アシル化グリセロールのリン酸エステルである。ホスファチジルコリンの中で最も重要なものは、例えば、一般構造：
Figure 2009517361
(式中、R'およびR"は通常、15個または17個の炭素原子および4個までのシス二重結合を有する枝分かれしていない脂肪族基である)によって特徴付けられるレシチンである。
本発明によれば、Merkur Vaseline社のMerkur Weissoel Pharma40、Shell & DEA Oil社のShell Ondina(登録商標)917、Shell Ondina(登録商標)927、Shell Oil4222、Shell Ondina(登録商標)933、Pionier(登録商標)6301S、Pionier(登録商標)2071(Hansen & Rosenthal社製)は、パラフィン油として本発明により好都合に使用することができる。適切な化粧用として適合性のある油脂成分は、その全範囲を本明細書で参照するKarl-Heinz Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], 2nd edition, Verlag Huthig, Heidelberg, pp. 319-355に記載されている。
溶媒
本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子が、溶液もしくはエマルジョンもしくは分散液である化粧用調製物または皮膚科学的調製物中で使用される場合は、使用することのできる溶媒は、水または水溶液;油、例えば、カプリン酸またはカプリル酸のトリグリセリドなど、しかし好ましくはヒマシ油;脂肪、ワックスおよび他の天然および合成の脂肪物質、好ましくは脂肪酸と、低炭素数のアルコール、例えば、イソプロパノール、プロピレングリコールまたはグリセロールとのエステル、あるいは脂肪アルコールと、低炭素数のアルカン酸との、または脂肪酸とのエステル;低炭素数のアルコール、ジオールまたはポリオール、およびそのエーテル、好ましくはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、エチレングリコールモノエチルまたはモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチル、モノエチルもしくはモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルもしくはモノエチルエーテルおよび類似の生成物である。特に、上記の溶媒の混合物が使用される。アルコール性溶媒の場合は、水がさらなる成分でもよい。
界面活性剤
本発明によれば、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子に加えて、組成物には界面活性剤も含むことが可能である。このような界面活性剤は、例えば、
・リン酸エステルおよび塩、例えば、DEA-oleth-10リン酸およびdilaureth-4リン酸など、
・スルホン酸アルキル、例えば、ナトリウムココナツモノグリセリドスルファート(sodium coconut monoglyceride sulfate)、C12〜14オレフィンスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウムおよびPEG-3コカミド硫酸マグネシウム、
・カルボン酸および誘導体、例えば、ラウリン酸、ステアリン酸アルミニウム、マグネシウムアルカノラートおよびウンデシレン酸亜鉛、エステルカルボン酸、例えば、ステアロイル乳酸カルシウム、クエン酸laureth-6およびPEG-4ラウラミドカルボン酸ナトリウムなど、
・カルボン酸の酸化エチレン、グリセロール、ソルビタンまたは他のアルコールによるエステル化によって形成されるエステル
・エーテル、例えば、エトキシ化アルコール、エトキシ化ラノリン、エトキシ化ポリシロキサン、プロポキシル化POEエーテルおよびアルキルポリグリコシド(ラウリルグルコシド、デシルグルコシドおよびココグリコシドなど)である。
ポリソルベート
本発明によれば、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子以外に、組成物は、ポリソルベートも含み得る。
ここで本発明の目的のために有利なポリソルベートは、
・ポリオキシエチレン(20)モノラウリン酸ソルビタン(Tween20、CAS番号9005-64-5)
・ポリオキシエチレン(4)モノラウリン酸ソルビタン(Tween21、CAS番号9005-64-5)
・ポリオキシエチレン(4)モノステアリン酸ソルビタン(Tween61、CAS番号9005-67-8)
・ポリオキシエチレン(20)トリステアリン酸ソルビタン(Tween65、CAS番号9005-71-4)
・ポリオキシエチレン(20)モノオレイン酸ソルビタン(Tween80、CAS番号9005-65-6)
・ポリオキシエチレン(5)モノオレイン酸ソルビタン(Tween81、CAS番号9005-65-5)
・ポリオキシエチレン(20)トリオレイン酸ソルビタン(Tween85、CAS番号9005-70-3)である。
特段に有利なものは特に、
・ポリオキシエチレン(20)モノパルミチン酸ソルビタン(Tween40、CAS番号9005-66-7)
・ポリオキシエチレン(20)モノステアリン酸ソルビタン(Tween60、CAS番号9005-67-8)である。
本発明によれば、これらは、組成物の全重量に基づいて0.1〜5重量％の濃度で、特に1.5〜2.5重量％の濃度で、個々にまたは2つ以上のポリソルベートの混合物として好都合に使用される。
コンディショニング剤
本発明の好ましい実施形態では、組成物はコンディショニング剤もまた含む。本発明により好ましいコンディショニング剤は、例えば、International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (Volume 4, editor: R. C. Pepe, J.A. Wenninger, G.N. McEwen, The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, 9th edition, 2002)の第4節において、ヘアコンディショニング剤、湿潤剤、スキンコンディショニング剤、スキンコンディショニング剤(軟化剤)、スキンコンディショニング剤(保湿剤)、スキンコンディショニング剤(その他)、スキンコンディショニング剤(吸蔵性)、および皮膚保護剤のキーワードで一覧表示されている全ての化合物、およびEP-A934956(11〜13頁)で「水溶性コンディショニング剤」および「油溶性コンディショニング剤」として一覧表示されている全ての化合物である。さらなる好都合なコンディショニング剤は、例えばINCIによりPolyquaternium(特にPolyquaternium-1からPolyquaternium-56)として示されている化合物である。
適切なコンディショニング剤にはまた、例えば、ポリマー第四級アンモニウム化合物、カチオン性セルロース誘導体および多糖類も挙げられる。
本発明により好都合なコンディショニング剤は、ここで下記の表に示された化合物から選択することができる：
Figure 2009517361
本発明により好都合なさらなるコンディショナーは、セルロース誘導体および四級化グアーガム誘導体、特にグアーヒドロキシプロピルアンモニウムクロリド(例えば、Jaguar Excel(登録商標)、Jaguar C162(登録商標)(Rhodia社製)、CAS65497-29-2、CAS39421-75-5)である。
また、非イオン性ポリ-N-ビニルピロリドン/ポリ酢酸ビニルコポリマー(例えば、Luviskol(登録商標)VA64(BASF Aktiengesellschaft社製))、アニオン性アクリル酸コポリマー(例えば、Luviflex(登録商標)Soft(BASF Aktiengesellschaft社製))、および/または両性アミド/アクリル酸/メタクリル酸コポリマー(例えば、Amphomer(登録商標)(National Starch社製))を、コンディショナーとして本発明で好都合に使用することができる。
粉末原料
粉末原料を加えることは、一般に好都合であり得る。タルクの使用が特に好ましい。
エトキシ化グリセロール脂肪酸エステル
本発明によれば、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子に加えて、組成物は適切な場合は、エトキシ化グリセロール脂肪酸エステル、特に好ましくはPEG-10オリーブ油グリセリド、PEG-11アボガド油グリセリド、PEG-11カカオバターグリセリド、PEG-13ヒマワリ油グリセリド、イソステアリン酸PEG-15グリセリル、PEG-9ココナツ脂肪酸グリセリド、PEG-54硬化ヒマシ油、PEG-7硬化ヒマシ油、PEG-60硬化ヒマシ油、ホホバ油エトキシレート(PEG-26ホホバ脂肪酸、PEG-26ホホバアルコール)、ヤシ油脂肪酸グリセレス-5、PEG-9ココナツ脂肪酸グリセリド、ヤシ油脂肪酸PEG-7グリセレス、PEG-45パーム核油グリセリド、PEG-35ヒマシ油、オリーブ油PEG-7エステル、PEG-6カプリル酸/カプリン酸グリセリド、PEG-10オリーブ油グリセリド、PEG-13ヒマワリ油グリセリド、PEG-7硬化ヒマシ油、水添パーム核油グリセリドPEG-6エステル、PEG-20トウモロコシ油グリセリド、(オレイン酸ヤシ脂肪酸)PEG-18グリセリル、PEG-40水添ヒマシ油、PEG-40ヒマシ油、PEG-60硬化ヒマシ油、PEG-60トウモロコシ油グリセリド、PEG-54硬化ヒマシ油、PEG-45パーム核油グリセリド、PEG-35ヒマシ油、ヤシ油脂肪酸PEG-80グリセリル、PEG-60扁桃油グリセリド、PEG-60月見草グリセリド、PEG-200水添パーム油脂肪酸グリセリルおよびPEG-90イソステアリン酸グリセリルの群から選択されるエトキシ化油も含むことができる。
好ましいエトキシ化油は、ヤシ油脂肪酸PEG-7グリセリル、PEG-9ココグリセリド、PEG-40硬化ヒマシ油、水添パーム油脂肪酸PEG-200グリセリルである。エトキシ化グリセロール脂肪酸エステルは、種々の目的のために水性洗浄配合物中で使用される。低いエトキシ化の程度(3〜12の酸化エチレン単位)のグリセロール脂肪酸エステルは通常、乾燥後の皮膚の感触を改善するための加脂肪剤の役割を果たし、約30〜50のエトキシ化の程度のグリセロール脂肪酸エステルは、香油などの非極性物質用の溶解度促進剤の役割を果たす。高いエトキシ化の程度のグリセロール脂肪酸エステルは、増粘剤として使用される。これらの物質全てが共通に有する側面は、水で希釈して皮膚に使用する場合、皮膚に特別の感触をもたらすことである。
光防護剤
皮膚化粧用調製物における光防護剤と組み合わせた、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子の使用も同様に本発明による。これらの化粧用および/または皮膚科学的光保護組成物は、化粧用および/または皮膚科学的光保護のために、また皮膚および/または毛髪の処置および手入れのために、および装飾用化粧品におけるメーキャップ製品として使用される。これらには、例えば、サンクリーム、サンローション、サンミルク、サンオイル、サンバルサム、サンゲル、リップケアおよびリップスティック、コンシーリングクリームおよびスティック、保湿クリーム、ローション、エマルジョン、顔、体および手のクリーム、ヘアトリートメントおよびリンス、ヘアセッティング組成物、スタイリングゲル、ヘアスプレー、ロールオン式脱臭剤またはアイリンクルクリーム、日焼け剤(tropicals)、サンブロック、日焼け後用調製物が挙げられる。全ての調製物は、少なくとも1種類のケラチン結合エフェクター分子および特定のUVフィルター物質の1種類を含む。
サンオイルは、主として1種または複数の光保護フィルターおよび香油を含む異なる油の混合物である。様々な化粧品特性によって油性成分が選択される。鉱油(例えば、パラフィン油)および脂肪酸トリグリセリド(例えば、落花生油、ゴマ油、アボガド油、中鎖トリグリセリド)などの、よく滑り皮膚にやわらかな感触をもたらす油を、塗布性とサンオイルの皮膚への吸収を改善し、粘着性を減少させ、油膜を空気および水蒸気(汗)に対して浸透性とする油と混合する。これらには、分枝鎖脂肪酸エステル(例えば、パルミチン酸イソプロピル)およびシリコーン油(例えば、ジメチルシリコーン)が挙げられる。不飽和脂肪酸をベースとする油を使用する場合は、それらを酸敗から防止するために、抗酸化剤、例えばトコフェロールを加える。無水配合物であるサンオイルは通常、保存料を含まない。サンミルクおよびサンクリームは、水中油型(O/W)エマルジョンとして、および油中水型(W/O)エマルジョンとして調製される。エマルジョンのタイプによって、調製物の特性は非常に変化する。O/Wエマルジョンは、皮膚に容易に塗り広げられ、大半は迅速に吸収され、ほとんどの場合水で容易に洗い流すことができる。W/Oエマルジョンは、塗りこむことがより難しくなり、皮膚を非常になめらかにし、したがっていくぶんより粘着性であるようであるが、一方皮膚が乾燥するのを守る度合いが高い。W/Oエマルジョンは、大半が耐水性である。O/Wエマルジョンの場合は、エマルジョン基剤、適切な光保護物質の選択、および適切な場合は、助剤(例えば、ポリマー)の使用が、耐水性の度合いを決定する。液体およびクリーム様O/Wエマルジョンのベースは、その組成に関しては、スキンケアにおいて通例の他のエマルジョンと似ている。サンミルクは、太陽、水および風によって乾燥した皮膚を十分になめらかにするべきである。暑い場合および砂と接触した場合に特に不快であると感じられるため、それらは粘着性であってはいけない。日焼け止め組成物は一般に、少なくとも1種類の油相を含む担体をベースとする。しかし、水性基剤のみの組成物も可能である。したがって、油、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョン、クリームおよびペースト、唇保護スティック組成物またはグリース非含有ゲルは適切である。適切なエマルジョンはまた、とりわけO/Wマクロエマルジョン、O/Wマイクロエマルジョン、または分散形態の表面コーティング二酸化チタン粒子を有するO/W/Oエマルジョン(DE-A-19726121におけるような位相反転技術によって得られるエマルジョン)である。
添加剤として考えられ得る従来通りの化粧用助剤は、例えば(共)乳化剤、脂肪およびワックス、安定剤、増粘剤、生体活性成分、フィルム形成剤、香料、色素、真珠様光沢剤、保存料、顔料、電解液(例えば、硫酸マグネシウム)およびpH調節剤である。使用することができる安定剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウムおよび/またはステアリン酸亜鉛などの脂肪酸の金属塩である。生体活性成分は、例えば、植物抽出液、タンパク質水解物および複合ビタミン剤を意味すると理解される。従来通りのフィルム形成剤は、例えば、親水コロイド(キトサン、微結晶性キトサンまたは四級化キトサンなど)、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン-酢酸ビニルコポリマー、アクリル酸系統のポリマー、第四級セルロース誘導体および同様の化合物である。
適切な光フィルター活性成分は、UV-BおよびUV-A領域の紫外線を吸収する物質である。これらは、紫外線を吸収し、吸収したエネルギーをより長波の放射形態、例えば熱で再び放出することができる有機物質を意味すると理解される。有機物質は、油溶性または水溶性でもよい。適切なUVフィルターは、例えば、2,4,6-トリアリール-1,3,5-トリアジンであり、この場合、アリール基はいずれの場合にも少なくとも1つの置換基を保持することができ、その置換基は、好ましくは、ヒドロキシ、アルコキシ、特にメトキシ、アルコキシカルボニル、特にメトキシカルボニルおよびエトキシカルボニルから選択される。また適切なものは、p-アミノ安息香酸エステル、ケイ皮酸エステル、ベンゾフェノン、ショウノウ誘導体、ならびに二酸化チタン、タルクおよび酸化亜鉛などの紫外線を阻止する顔料である。二酸化チタンをベースとする顔料が特に好ましい。
使用し得る油溶性UV-Bフィルターは、例えば、下記の物質である：
3-ベンジリデンカンファーおよびその誘導体、例えば、3-(4-メチルベンジリデン)カンファー、
4-アミノ安息香酸誘導体、好ましくは4-(ジメチルアミノ)安息香酸2-エチルヘキシル、4(ジメチルアミノ)安息香酸2-オクチルおよび4-(ジメチルアミノ)安息香酸アミル、
ケイ皮酸エステル、好ましくは4-メトキシケイ皮酸2-エチルヘキシル、4-メトキシケイ皮酸プロピル、4-メトキシケイ皮酸イソアミル、4-メトキシケイ皮酸イソペンチル、2-シアノ-3-フェニルケイ皮酸2-エチルヘキシル(オクトクリレン)、
サリチル酸エステル、好ましくはサリチル酸2-エチルヘキシル、サリチル酸4-イソプロピルベンジル、サリチル酸ホモメンチル、
ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキシ-4'-メチルベンゾフェノン、2,2'-ジヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、
ベンザルマロン酸エステル、好ましくは4-メトキシベンザルマロン酸2-エチルヘキシル、
トリアジン誘導体、例えば、2,4,6-トリアニリノ-(p-カルボ-2'-エチル-1'-ヘキシルオキシ)-1,3,5-トリアジン(オクチルトリアゾン)およびジオクチルブトアミドトリアゾン(Uvasorb(登録商標)HEB)、
プロパン-1,3-ジオン、例えば、1-(4-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-メトキシフェニル)プロパン-1,3-ジオンなど。
適切な水溶性物質は、
2-フェニルベンゾイミダゾール-5-スルホン酸、ならびにそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノールアンモニウムおよびグルクアンモニウム塩、
ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン-5-スルホン酸およびその塩、
3-ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体、例えば、4-(2-オキソ-3-ボルニリデンメチル)ベンゼンスルホン酸および2-メチル-5-(2-オキソ-3-ボルニリデン)スルホン酸およびその塩である。
ケイ皮酸エステル、好ましくは4-メトキシケイ皮酸2-エチルヘキシル、4-メトキシケイ皮酸イソペンチル、2-シアノ-3-フェニルケイ皮酸2-エチルヘキシル(オクトクリレン)の使用が特に好ましい。
さらに、ベンゾフェノンの誘導体、特に2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、2-ヒドロキシ-4-メトキシ-4'-メチルベンゾフェノン、2,2'-ジヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノンの使用、およびプロパン-1,3-ジオン、例えば、1-(4-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-メトキシフェニル)プロパン-1,3-ジオンなどの使用が好ましい。
適切な典型的なUV-Aフィルターは、
ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、1-(4'-tert-ブチルフェニル)-3-(4'-メトキシフェニル)プロパン-1,3-ジオン、4-tert-ブチル-4'-メトキシジベンゾイルメタンまたは1-フェニル-3-(4'-イソプロピルフェニル)プロパン-1,3-ジオンなど、
ベンゾフェノンのアミノヒドロキシ置換誘導体、例えば、n-ヘキシル安息香酸N,N-ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルである。
UV-AおよびUV-Bフィルターは、当然ながら混合物中でも使用することができる。
さらなる適切なUVフィルター物質を下記の表に示す：
Figure 2009517361
Figure 2009517361
主要な光保護物質の2種類の上記の群以外に、紫外線が皮膚を貫通するときに引き起こされる光化学反応連鎖を妨げる抗酸化型の第2の光防護剤を使用することも可能である。その典型的な例は、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、トコフェロール(ビタミンE)およびアスコルビン酸(ビタミンC)である。
さらなる群は、紫外線によってダメージを受けた皮膚の抗炎症作用を有する抗刺激剤である。このような物質は、例えば、ビサボロール、フィトールおよびフィタントリオールである。
同様に本発明によるのは、皮膚化粧用調製物中における、紫外線を止める無機顔料と組み合わせた、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子の使用である。水中で不溶性または微溶性であり、亜鉛(ZnO)、チタン(TiO2)、鉄(例えば、Fe2O3)、ジルコニウム(ZrO2)、ケイ素(SiO2)、マンガン(例えば、MnO)、アルミニウム(Al2O3)、セリウム(例えば、Ce2O3)の酸化物、対応する金属の混合酸化物およびこのような酸化物の混合物の群から選択された、金属酸化物および/または他の金属化合物をベースとする顔料が好ましい。
ここで、無機顔料はコーティングされた形態で、すなわち表面処理されて存在することができる。この表面処理は、例えば、DE-A-3314742に記載されている、それ自体公知の方法によって顔料に薄い疎水性層を付与することである場合がある。
適切な忌避性活性成分は、特定の動物、特に昆虫をヒトに寄せつけずまたは追い払うことのできる化合物である。これらには、例えば、2-エチル-1,3-ヘキサンジオール、N,N-ジエチル-m-トルアミドなどが挙げられる。皮膚を通る血流を促進する適切な充血性物質は、例えば、低木マツ抽出液、ラベンダー抽出液、ローズマリー抽出液、杜松子抽出液、セイヨウトチノキ抽出液、カバノキ葉抽出液、ヘイフラワー抽出液、酢酸エチル、ショウノウ、メントール、ハッカ油、ローズマリー抽出液、ユーカリ油などの精油である。適切な角質溶解性および角質柔軟化物質は、例えば、サリチル酸、チオグリコール酸カルシウム、チオグリコール酸およびその塩、硫黄などである。適切なフケ防止活性成分は、例えば、硫黄、硫黄ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート、硫黄リシノールポリエトキシラート、ジンクピリチオン、アルミニウムピリチオンなどである。皮膚刺激作用を抑制する適切な消炎剤は、例えば、アラントイン、ビサボロール、ドラゴサントール(dragosantol)、カミツレ抽出液、パンテノールなどである。
少なくとも1種類の化粧用または製薬上許容されるポリマーと組み合わせた、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子の使用は、同様に本発明によるものである。
適切なポリマーは、例えば、PolyquaterniumというINCI名を有するカチオン性ポリマー、例えば、ビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat FC、Luviquat HM、Luviquat MS、Luviquat Care)、硫酸ジエチルで四級化したN-ビニルピロリドン/メタクリル酸ジメチルアミノエチルのコポリマー(Luviquat PQ11)、N-ビニルカプロラクタム/N-ビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat E Hold)、カチオン性セルロース誘導体(Polyquaternium-4および-10)、アクリルアミドコポリマー(Polyquaternium-7)およびキトサンである。
適切なカチオン性(四級化)ポリマーはまた、Merquat(塩化ジメチルジアリルアンモニウムをベースとしたポリマー)、Gafquat(ポリビニルピロリドンと第四級アンモニウム化合物とを反応させることによって形成する第四級ポリマー)、ポリマーJR(カチオン基を有するヒドロキシエチルセルロース)および植物をベースとするカチオン性ポリマー、例えば、Rhodia社からのJaguar gradesなどのグアーポリマーである。
さらなる適切なポリマーはまた、中性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、N-ビニルピロリドンおよび酢酸ビニルおよび/またはプロピオン酸ビニルのコポリマー、ポリシロキサン、ポリビニルカプロラクタムおよびN-ビニルピロリドンとの他のコポリマー、ポリエチレンイミンおよびその塩、ポリビニルアミンおよびその塩、セルロース誘導体、ポリアスパラギン酸塩および誘導体である。これらには、例えば、Luviflex Swing(ポリ酢酸ビニルおよびポリエチレングリコールの部分加水分解コポリマー、BASF Aktiengesellschaft社製)が挙げられる。
適切なポリマーはまた、非イオン性の水溶性もしくは水分散性のポリマーまたはオリゴマーである(ポリビニルカプロラクタム、例えばLuviskol 0 Plus(BASF社製)、またはポリビニルピロリドンおよびそのコポリマー、特に酢酸ビニルなどのビニルエステルとのそのコポリマー、例えば、Luviskol VA37(BASF社製)、ポリアミド、例えばイタコン酸および脂肪族ジアミンをベースとするもの(例えばDE-A-4333238に記載されている)など)。
適切なポリマーはまた、Amphomer(National Starch社製)の名称で入手可能なオクチルアクリルアミド/メタクリル酸メチル/メタクリル酸tert-ブチルアミノエチル-メタクリル酸ヒドロキシプロピルコポリマーなどの両性または双性イオン性ポリマー、ならびに例えばドイツ特許出願DE3929973、DE2150557、DE2817369およびDE3708451に開示されている双性イオン性ポリマーである。塩化アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム/アクリル酸またはメタクリル酸コポリマーおよびそのアルカリ金属およびアンモニウム塩が、好ましい双性イオン性ポリマーである。さらなる適切な双性イオン性ポリマーは、Amersette(AMERCHOL社製)の名称で市販されているメタクロイルエチルベタイン/メタクリル酸コポリマー、およびメタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸N,N-ジメチルアミノエチルおよびアクリル酸のコポリマー(Jordapon(D))である。
適切なポリマーはまた、非イオン性でシロキサン含有の、水溶性または水分散性ポリマー、例えば、Tegopren(Goldschmidt社製)などのポリエーテルシロキサンである。
同様に本発明によるものは、アセチルサリチル酸、アトロピン、アズレン、ヒドロコルチゾンおよびその誘導体(例えば、ヒドロコルチゾン-17-バレラート)、BおよびD系のビタミン、特にビタミンB1、ビタミンB12、ビタミンD、ビタミンAまたはその誘導体(レチニルパルミテートなど)、ビタミンEまたはその誘導体(例えば、酢酸トコフェロールなど)、ビタミンCおよびその誘導体(例えば、アスコルビルグルコシドなど)、またナイアシンアミド、パンテノール、ビサボロール、ポリドカノール、不飽和脂肪酸(例えば、必須脂肪酸(通常ビタミンFと称される)、特にγ-リノレン酸、オレイン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびその誘導体など)、クロラムフェニコール、カフェイン、プロスタグランジン、チモール、ショウノウ、スクアレン、野菜および動物由来の抽出物または他の生成物(例えば、月見草油、ルリヂサ油またはカロブ種油、魚油、タラ肝油またはセラミドおよびセラミド様化合物、香料抽出液、緑茶エキス、スイレン抽出液、カンゾウ抽出液、ハマメリス)、フケ防止活性成分(例えば、二硫化セレン、ジンクピリチオン、ピロクトンオラミン、クリムバゾール、オクトピロックス、ポリドカノールおよびこれらの組合せ)、複合活性成分(例えば、γ-オリザノールの複合活性成分など)、およびカルシウム塩(パントテン酸カルシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウムなど)からなる群から好都合に選択される皮膚化粧活性成分(1種または複数の化合物)と組み合わせた、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子の使用である。加脂肪物質、例えば、ピュアセリンオイル、Eucerit(登録商標)およびNeocerit(登録商標)の群からの活性成分を選択することもまた好都合である。1種または複数の活性成分は、特に、本発明による調製物が、固有および/または外因性の皮膚老化の徴候の処置および予防のために、ならびに皮膚および毛髪への紫外線の悪影響の処置および予防のために使用される場合、NO合成阻害剤の群から特に好都合に選択される。好ましいNO合成阻害剤は、ニトロアルギニンである。1種または複数の活性成分は、カテキン;カテキンの胆汁酸エステル;カテキンまたはカテキンの胆汁酸エステルの成分物を有する植物または植物の部分からの水性または有機抽出物(例えば、ツバキ科(Theaceae)の植物のファミリー、特に種チャノキ(Camellia sinensis)(緑茶)の葉など)を含む群から好都合にさらに選択される。これらの典型的な成分(例えば、ポリフェノールまたはカテキン、カフェイン、ビタミン、糖、ミネラル、アミノ酸、脂質)は、特に好都合である。カテキンは、水素化フラボンまたはアントシアニジンとして理解すべき化合物の群であり、「カテキン」の誘導体(カテコール、3,3',4',5,7-フラバンペンタオール、2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)クロマン-3,5,7-トリオール)を表す。エピカテキン((2R,3R)-3,3',4',5,7-フラバンペンタオール)は、本発明の目的のために好都合の活性成分である。また好都合なものは、カテキンの内容物を有する植物抽出エキス、特に緑茶の抽出液、例えば、ツバキ属の植物、とりわけ特に茶のタイプである中国種(Camellia sinensis)、アッサム種(C.assamica)、タリエンシス(C.taliensis)、イナワジエンシス(C.inawadiensis)、および、例えばツバキ(Camellia japonica)とのこれらのハイブリッドの葉からの抽出液などである。好ましい活性成分はまた、(-)-カテキン、(+)-カテキン、(-)-カテキンガレート、(-)-ガロカテキンガレート、(+)-エピカテキン、(-)-エピカテキン、(-)-エピカテキンガレート、(-)-エピガロカテキン、(-)-エピガロカテキンガレートの群からのポリフェノールおよびカテキンである。
フラボンおよびその誘導体(集合的に「フラボン」と称される場合が多い)は、本発明の目的のために好都合な活性成分である。それらは、下記の基本構造(置換位置を示す)によって特徴付けられる：
Figure 2009517361
好ましくは本発明による調製物中に使用されることもできるより重要なフラボンのいくつかを、下記の表8に一覧表示する：
Figure 2009517361
フラボンは、通常天然でグリコシル化型として生じる。
本発明によれば、フラボノイドは、一般式：
Figure 2009517361
(式中、Z1からZ7は、互いに独立に、H基、OH基、アルコキシ基およびヒドロキシアルコキシ基の群から選択され、アルコキシ基またはヒドロキシアルコキシ基は、分岐状または枝分かれしておらず、1〜18個の炭素原子を有してもよく、Glyは、モノおよびオリゴグリコシド基の群から選択される)の物質の群から好ましくは選択される。
さらに、活性成分(1種または複数の化合物)はまた、親水性活性成分、特に下記の群から非常に好都合に選択され得る：
乳酸またはサリチル酸またはその塩(例えば、乳酸Na、乳酸Ca、乳酸TEAなど)などのα-ヒドロキシ酸;尿素、アラントイン、セリン、ソルビトール、グリセロール、乳タンパク質、パンテノール、キトサン。
本発明による調製物中のこのような活性成分(1種または複数の化合物)の量は、調製物の全重量に基づいて、好ましくは0.001〜30重量％、特に好ましくは0.05〜20重量％、特に1〜10重量％である。本発明による調製物中に使用することができる特定の活性成分およびさらなる活性成分は、この時点でその全範囲を参照するDE10318526A1の12〜17頁に示されている。
さらに、本発明は、例えば、ざ瘡または脂っぽい皮膚、角化症、酒さ、光過敏性、炎症性、紅斑性、アレルギー性または自己免疫性反応などの皮膚の外観の望ましくない変化を防止するための、上記の調製物の使用に関する。
使用するためには、本発明による化粧用調製物を、化粧品または皮膚化粧料では通例の方法で、皮膚、毛髪、指の爪もしくは足指の爪または歯茎に塗布する。
本発明は、ケラチン結合エフェクター分子を含む皮膚化粧料、好ましくは本発明の方法によって生成したケラチン結合エフェクター分子、特に好ましくはその生成のために上記のように、色素、光防護剤、ビタミン、プロビタミン、カロテノイド、抗酸化剤および過酸化物分解剤からなる群から選択されたエフェクター分子を使用したケラチン結合エフェクター分子をさらに提供する。表11において一覧表示したようなケラチン結合エフェクター分子を含む皮膚化粧料が特に好ましい。
配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、好ましくは配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170、特に好ましくは166および168、最も好ましくは168において示した配列による、少なくとも1種類のケラチン結合ポリペプチド(ii)を含むケラチン結合エフェクター分子を含んだ皮膚化粧料がとりわけ好ましく、その調製のために使用されるリンカー分子(iii)は、マレイミドカプロン酸であった。特に非常に好ましいのは、使用されるリンカー分子(iii)がマレイミドカプロン酸であり、パントテン酸、パンテノール、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテルまたはカチオン誘導化パンテノールを、エフェクター分子(i)として使用した、上記のケラチン結合エフェクター分子である。
本発明の好ましい実施形態では、皮膚化粧料または口腔の手入れ、歯の手入れおよび義歯の手入れ用組成物、好ましくは皮膚および毛髪処置組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて、0.001〜1重量％(wt％)、好ましくは0.01〜0.9重量％、特に好ましくは0.01〜0.8重量％、または0.01〜0.7重量％、特に非常に好ましくは0.01〜0.6重量％、または0.01〜0.5重量％、最も好ましくは0.01〜0.4重量％、または0.01〜0.3重量％の濃度で含む。さらなる実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて1〜10重量％、好ましくは2〜8重量％、3〜7重量％、4〜6重量％の濃度で含む。同様に好ましい実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて10〜20重量％、好ましくは11〜19重量％、12〜18重量％、13〜17重量％、14〜16重量％の濃度で含む。同様に好ましい実施形態では、組成物は、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子を、組成物の全重量に基づいて20〜30重量％、好ましくは21〜29重量％、22〜28重量％、23〜27重量％、24〜26重量％の濃度で含む。
本発明による組成物は、好ましくは皮膚保護組成物、スキンケア組成物、皮膚洗浄組成物、毛髪保護組成物、ヘアケア組成物、毛髪洗浄組成物、毛髪着色剤、うがい薬および口内洗浄剤、または装飾用化粧品のための調製物であり、これらは使用する分野によって、軟膏、クリーム、エマルジョン、懸濁液、ローション、ミルク、ペースト、ゲル、フォームまたはスプレーの形態で好ましくは使用される。
本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子に加えて、本発明の皮膚化粧料は、ポリマー、顔料、湿潤剤、油、ワックス、酵素、ミネラル、ビタミン、日焼け止め剤、色素、香料、抗酸化剤、保存料および/またはすでに上記で一覧表示した医薬活性成分の全てを含むことができる。
さらに下記は、本発明の皮膚化粧料に適用される：
本発明による組成物の配合ベースは、化粧用または皮膚化粧用/製薬上許容される助剤を好ましくは含む。製薬上許容される助剤は、薬学分野、食品技術および関連する分野における使用が知られて助剤であり、特に関連する薬局方(例えば、DAB Ph.Eur.BP NF)において一覧表示されている助剤、およびその特性が生理的応用を妨げない他の助剤である。
適切な助剤は、流動促進剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存料、抗酸化剤、刺激防止剤、キレート剤、エマルジョン安定剤、フィルム形成剤、ゲル形成剤、臭いのマスキング剤、樹脂、親水コロイド、溶媒、溶解度促進剤、中和剤、浸透促進剤、顔料、第四級アンモニウム化合物、加脂肪剤および過脂肪剤、軟膏、クリームまたは油が主成分の物質、シリコーン誘導体、安定剤、滅菌剤、噴射剤、乾燥剤、乳白剤、増粘剤、ワックス、軟化剤、ホワイトオイルでよい。これに関する実施形態は、例えば、Fiedler, H. P. Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete [Lexicon of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields], 4th edition, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996に示されているような専門知識に基づいている。
本発明による皮膚化粧用組成物を製造するために、活性成分を適切な助剤(賦形剤)で混合または希釈することができる。賦形剤は、活性成分のためのビヒクル、担体または媒体としての役割を果たすことのできる固形、半固形または液体の材料でよい。さらなる助剤の混合は、所望であれば、当業者には公知の態様で行われる。さらに、ポリマーおよび分散液は、調剤において、好ましくは固形薬物形態のためのコーティング組成物または結合剤として、またはそれらの中にある助剤として適切である。それらは、クリーム中で、ならびに錠剤コーティングおよび錠剤結合剤として使用することもできる。
さらなる好ましい実施形態によると、本発明による組成物は、皮膚および毛髪の手入れおよび保護のための化粧品組成物、ネイルケア組成物、または装飾用化粧品用の調製物である。
適切な皮膚化粧用組成物は、例えば、顔用トニック、フェースマスク、脱臭剤および他の化粧用ローションである。装飾用化粧品中に使用するための組成物には、例えば、コンシーラースティック、ステージメーキャップ、マスカラおよびアイシャドウ、リップスティック、コールペンシル、アイライナー、ほお紅、パウダーおよびアイブローペンシルが挙げられる。
さらに、本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子は、毛穴清浄のための毛穴パック、にきび止め組成物、忌避剤、ひげそり用組成物、ひげそり後およびひげそり前の手入れ用組成物、日焼け後の手入れ用組成物、毛髪除去組成物、毛髪着色剤、膣洗浄組成物(intimate care compositions)、足の手入れ用組成物、およびベイビーケアにおいて使用される。
本発明によるスキンケア組成物は、特に、W/OまたはO/Wスキンクリーム、デイクリームおよびナイトクリーム、アイクリーム、フェースクリーム、しわ取りクリーム、日焼け止めクリーム、保湿クリーム、漂白クリーム、セルフタンニングクリーム、ビタミンクリーム、スキンローション、手入れ用ローションおよび保湿ローションである。
本発明による皮膚化粧品および皮膚科学的組成物は、本発明のおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子に加えて、酸化過程および関連する老化過程または皮膚および/もしくは毛髪へのダメージに対する保護として、フリーラジカルを分解する活性成分もまた含むことができる。これらの活性成分は、好ましくはその参照の内容が本明細書中に明確にされている特許出願WO/0207698およびWO/03059312に記載されている物質、好ましくはそこに記載されているホウ素含有化合物であり、それによって過酸化物またはヒドロペルオキシドを減少させ、フリーラジカルのその後の状態を形成することなく対応するアルコールを得ることができる。さらに、一般式3によるヒンダードアミンを、この目的のために使用することができる：
Figure 2009517361
式中、基Zは下記の意味を有する。H;C1〜C22アルキル基、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなどのC1〜C12アルキル基;C1〜C22-アルコキシル基、好ましくはアルコキシメチル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルコキシイソプロピル、アルコキシブチル、アルコキシイソブチル、アルコキシ-sec-ブチル、アルコキシ-tert-ブチル、アルコキシペンチル、アルコキシイソペンチル、アルコキシネオペンチル、アルコキシ-tert-ペンチル、アルコキシヘキシル、アルコキシヘプチル、アルコキシオクチル、アルコキシノニル、アルコキシデシル、アルコキシウンデシル、アルコキシドデシルなどのC1〜C12-アルコキシル基;フェニル基がC1〜C4アルキル基によって置換されることができる、フェニルおよびナフチルなどのC6〜C10-アリール基;上記のようにC1〜C22アルキル基またはC1〜C22-アルコキシ基によって、好ましくはC1〜C12アルキル基またはC1〜C12-アルコキシ基によって置換されることができる、C6〜C10-O-アリール基。
また、基R1〜R6は互いに独立に、下記の意味を有する。H、OH、O、C1〜C22アルキル基、好ましくはC1〜C12アルキル基(メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルなど)、C1〜C22-アルコキシル基、好ましくはC1〜C12-アルコキシル基(アルコキシメチル、アルコキシエチル、アルコキシプロピル、アルコキシイソプロピル、アルコキシブチル、アルコキシイソブチル、アルコキシsec-ブチル、アルコキシ-tert-ブチル、アルコキシペンチル、アルコキシイソペンチル、アルコキシネオペンチル、アルコキシ-tert-ペンチル、アルコキシヘキシル、アルコキシヘプチル、アルコキシオクチル、アルコキシノニル、アルコキシデシル、アルコキシウンデシル、アルコキシドデシルなど)、フェニル基がC1〜C4アルキル基によって置換されることができる、フェニルおよびナフチルなどのC6〜C10-アリール基、上記のようにC1〜C22アルキル基またはC1〜C22-アルコキシル基によって、好ましくはC1〜C12アルキル基またはC1〜C12-アルコキシル基によって置換されてもよいC6〜C10-O-アリール基。
組成物の全重量に基づいて、0.001〜1重量％(wt％)、好ましくは0.01〜0.1重量％、0.1〜1重量％の量の、立体障害性アミンである3-ドデシル-N-(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、3-ドデシル-N-(1,2,2,6,6-ペンタメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、3-オクチル-N-(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、3-オクチル-N-(1,2,2,6,6-ペンタメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、3-オクテニル-N-(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、3-オクテニル-N-(1,2,2,6,6-ペンタメチル-4-ピペリジニル)スクシンイミド、および/またはUvinul(登録商標)5050Hの使用が特に好ましい。
上記の本発明の化合物および適切な担体に加えて、皮膚化粧用調製物は、上記のような皮膚化粧品において通例であるさらなる活性成分および助剤もまた含むことができる。これらには、好ましくは、乳化剤、保存料、香油、化粧用活性成分、例えばフィタントリオール、ビタミンA、EおよびC、レチノール、ビサボロール、パンテノール、光防護剤、漂白剤、着色剤、着色剤、タンニング剤、コラーゲン、タンパク質水解物、安定剤、pH調節剤、色素、塩、増粘剤、ゲル形成剤、粘度調節剤、シリコーン、湿潤剤、加脂肪剤および/またはさらなる従来通りの添加剤が挙げられる。
皮膚化粧品および皮膚化粧用組成物の好ましい油脂成分は、上記の鉱油および合成油(例えば、パラフィン、シリコーン油など)、および8個超の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、動物および植物油(例えば、ヒマワリ油、ヤシ油、アボガド油、オリーブ油、ラノリン)、またはワックス、脂肪酸、脂肪酸エステル(例えば、C6〜C30脂肪酸のトリグリセリドなど)、ワックスエステル(例えば、ホホバ油など)、脂肪アルコール、ワセリン、水素化ラノリンおよびアセチル化ラノリン、およびこれらの混合物である。
手ざわり感覚、拡散挙動、耐水性ならびに/または活性成分および顔料などの助剤の結合性を改善するなどの特定の特性を得るために、皮膚化粧品および皮膚化粧用調製物は、シリコーン化合物に基づいたコンディショニング物質もさらに含むことができる。
適切なシリコーン化合物は、例えば、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアリールアルキルシロキサン、ポリエーテルシロキサンまたはシリコーン樹脂である。
化粧用または皮膚化粧用調製物は、当業者には公知の従来通りの方法によって製造される。
好ましくは、化粧用および皮膚化粧用組成物は、エマルジョン、特に油中水型(W/O)または水中油型(O/W)エマルジョンの形態で存在する。
しかし、他のタイプの配合物、例えば、ゲル、油、オレオゲル、多層エマルジョン(例えば、W/O/WまたはO/W/Oエマルジョンの形態)、無水軟膏または軟膏基剤などを選択することもまた可能である。水性分散物、ヒドロゲルまたはピッカリングエマルジョンなどの乳化剤を含有しない配合物もまた、好都合な実施形態である。
エマルジョンは、公知の方法によって製造される。少なくとも1種類のケラチン結合エフェクター分子に加えて、エマルジョンは、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、特に、脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸、ラノリンおよびその誘導体、天然油もしくは合成油またはワックス、および乳化剤などの通常従来通りの成分を水の存在下で含む。エマルジョンの種類に特有の添加剤の選択および適切なエマルジョンの製造は、例えば、参照により本明細書中に明示的に組み入れられるSchrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika [Fundamentals and formulations of cosmetics], Huthig Buch Verlag, Heidelberg, 2nd edition, 1989, third part、またはUmbach, Kosmetik: Entwicklung, Herstellung und Anwendung kosmetischer Mittel [Cosmetics: development, manufacture and use of cosmetic compositions], 2nd expanded edition, 1995, Georg Thieme Verlag, ISBN 3 13 712602 9, pages 122 ff.において記載されている。
例えば、スキンクリームなどのためのW/Oエマルジョンの形態の適切なエマルジョンは、一般に、適切な乳化剤系を用いて油または脂肪相中に乳化されている水相を含む。高分子電解質複合体は、水相を提供するために使用することができる。
エマルジョンの脂肪相中に存在させてよい好ましい脂肪成分は、パラフィン油、ピュアセリンオイル、ペルヒドロスクアレンおよびこれらの油中のマイクロクリスタリンワックスの溶液などの炭化水素油;甘扁桃油、アボガド油、テリハボク油、ラノリンおよびその誘導体、ヒマシ油、ゴマ油、オリーブ油、ホホバ油、カリテ油、ヒウチダイ油などの動物または植物油;例えば、ワセリン油などの大気圧下で蒸留開始点が約250℃であり、蒸留終点が410℃である鉱油;ミリスチン酸アルキル、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチルまたはミリスチン酸セチル、ステアリン酸ヘキサデシル、パルミチン酸エチルまたはパルミチン酸イソプロピル、オクタン酸トリグリセリドまたはデカン酸トリグリセリドおよびリシノール酸セチルなどの飽和または不飽和脂肪酸のエステルである。
また脂肪相は、他の油に可溶性のシリコーン油、例えばジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンおよびシリコーングリコールコポリマー、脂肪酸および脂肪アルコールを含むことができる。
本発明による上記の化合物以外に、スキンケア組成物は、例えば、カルナウバワックス、カンデリラワックス、蜜ろう、マイクロクリスタリンワックス、オゾケライトワックスおよびオレイン酸、ミリスチン酸、リノール酸、ステアリン酸Ca、MgおよびAlなどのワックスも含むことができる。
さらに、本発明のエマルジョンは、O/Wエマルジョンの形態でもよい。このようなエマルジョンは通常、油相、水相中で油相を安定化させる乳化剤、および粘稠な形態で通常存在する水相を含む。適切な乳化剤は、好ましくはポリグリセロールエステル、ソルビタンエステルまたは部分エステル化グリセリドなどのO/W乳化剤である。
さらなる好ましい実施形態によると、本発明による組成物は、光保護組成物、シャワー用ゲル、シャンプー配合物または入浴用調製物であり、光保護調製物が特に好ましい。
このような配合物は、少なくとも1種類の本発明によるおよび/または本発明の方法によって生成したケラチン結合エフェクター分子と、通常、塩基性界面活性剤としてアニオン性界面活性剤、ならびに共界面活性剤として両性および/または非イオン性界面活性剤とを含む。さらなる適切な活性成分および/または助剤は一般に、脂質、香油、色素、有機酸、保存料および抗酸化剤、および増粘剤/ゲル形成剤、スキンコンディショニング剤および湿潤剤から選択される。
これらの配合物は、配合物の全重量に基づいて2〜50重量％、好ましくは5〜40重量％、特に好ましくは8〜30重量％の界面活性剤を好都合に含む。
洗浄、シャワーおよび入浴用調製物では、通例体洗浄用組成物中に使用される全てのアニオン性、中性、両性またはカチオン性界面活性剤を使用することができる。
適切なアニオン性界面活性剤は、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルコイルサルコシン酸塩、アシルタウリン酸塩、アシルイソチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、αオレフィンスルホン酸塩、特にアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩である。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に1〜10個の酸化エチレンまたは酸化プロピレン単位、好ましくは1〜3個の酸化エチレン単位を有することが可能である。
これらには、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸アンモニウム、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、オレイルコハク酸ナトリウム、ラウリルスルホコハク酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミンが挙げられる。
適切な両性界面活性剤は、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルスルホベタイン、グリシン酸アルキル、カルボキシグリシン酸アルキル、アンホ酢酸アルキルまたはプロピオン酸アルキル、アンホ二酢酸アルキルまたは二プロピオン酸アルキルである。
例えば、ココジメチルスルホプロピルベタイン、ラウリルベタイン、コカミドプロピルベタイン(cocamidopropylbetaine)またはココアンホプロピオン酸ナトリウム(sodium cocamphopropionate)を使用することができる。
適切な非イオン性界面活性剤は、例えば、直鎖状もしくは分枝状でよいアルキル鎖中に6〜20個の炭素原子を有する脂肪族アルコールまたはアルキルフェノールと、酸化エチレンおよび/または酸化プロピレンとの反応生成物である。アルキレンオキシドの量は、アルコール1モル当たり約6〜60molである。さらに、アルキルアミンオキシド、モノまたはジアルキルアルカノールアミド、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、エトキシ化脂肪酸アミド、アルキルポリグリコシドまたはソルビタンエーテルエステルが適切である。
さらに、洗浄、シャワーおよび入浴用調製物は、従来通りの例えば第四級アンモニウム化合物などのカチオン性界面活性剤、例えば塩化セチルトリメチルアンモニウムを含むことができる。
さらに、シャワー用ゲル/シャンプー配合物は、増粘剤、例えば、塩化ナトリウム、PEG-55、オレイン酸プロピレングリコール、PEG-120ジオレイン酸メチルグルコースおよびその他など、また保存料、さらなる活性成分および助剤および水を含むことができる。
ヘアトリートメント組成物
さらなる好ましい実施形態によると、本発明の皮膚化粧料は、ヘアトリートメント組成物である。
好ましくは、本発明によるヘアトリートメント組成物は、セッティングフォーム、ヘアムース、ヘアゲル、シャンプー、ヘアスプレー、ヘアフォーム、仕上げ液、パーマ用の中和剤、毛髪着色剤および漂白剤またはホットオイルトリートメントの形態である。使用する分野に応じて、毛髪化粧用調製物は、(エアロゾル)スプレー、(エアロゾル)フォーム、ゲル、ゲルスプレー、クリーム、ローションまたはワックスとして塗布することができる。ここでヘアスプレーには、エアロゾルスプレーおよびまた噴射ガスを含まないポンプスプレーの両方が含まれる。ヘアフォームには、エアロゾルフォームおよびまた噴射ガスを含まないポンプフォームの両方が含まれる。ヘアスプレーおよびヘアフォームには、大部分または全てが水溶性もしくは水分散性の成分が好ましくは含まれる。本発明によるヘアスプレーおよびヘアフォーム中に使用される化合物が水中で分散性である場合、粒径が通常1〜350nm、好ましくは1〜250nmの水性微小分散物の形態でそれらを塗布することができる。ここではこれらの調製物の固形分含量は、通常約0.5〜20重量％の範囲である。これらの微小分散物は、その安定化のために乳化剤または界面活性剤を通常必要としない。
さらなる成分は、化粧品において通例の添加剤、例えば、噴射剤、消泡剤、界面活性化合物、すなわち界面活性剤、乳化剤、泡形成剤および可溶化剤を意味すると理解すべきである。使用される界面活性化合物は、アニオン性、カチオン性、両性または中性でもよい。さらなる従来通りの成分はまた、例えば、保存料、香油、乳白剤、活性成分、UVフィルター、手入れ用物質(パンテノール、コラーゲン、ビタミンなど)、タンパク質水解物、α-およびβ-ヒドロキシカルボン酸、安定剤、pH調節剤、色素、粘度調整剤、ゲル形成剤、塩、湿潤剤、加脂肪剤、錯化剤およびさらなる従来通りの添加剤でもよい。
極めて特定の特性を得ようとする場合は、本発明のケラチン結合エフェクター分子と組み合わせて使用することができる、化粧品において公知の全てのスタイリングおよびコンディショナーポリマーもまたここに含まれる。
適切な従来の毛髪化粧用ポリマーは、例えば、上記のカチオン性、アニオン性、中性、非イオン性および両性ポリマーであり、それについて本明細書で言及している。
特定の特性を確立するために、調製物はさらにまたシリコーン化合物をベースとするコンディショニング物質を含むことができる。適切なシリコーン化合物は、例えば、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアリールアルキルシロキサン、ポリエーテルシロキサン、シリコーン樹脂またはジメチコンコポリオール(CTFA)およびアモジメチコン(CTFA)などのアミノ官能性シリコーン化合物である。
噴射剤は、ヘアスプレーまたはエアロゾルフォームに通例使用される噴射剤である。プロパン/ブタン混合物、ペンタン、ジメチルエーテル、1,1-ジフルオロエタン(HFC-152a)、二酸化炭素、窒素または圧縮空気が好ましい。
使用することのできる乳化剤は、ヘアフォームにおいて通常使用される全ての乳化剤である。適切な乳化剤は、非イオン性、カチオン性またはアニオン性または両性でもよい。非イオン性乳化剤(INCI命名法)の例は、laureth、例えばlaureth-4、ceteth、例えばceteth-1、ポリエチレングリコールセチルエーテル、ceteareth、例えばceteareth-25、ポリグリコール脂肪酸グリセリド、水酸化レシチン、脂肪酸のラクチルエステル、アルキルポリグリコシドである。
カチオン性乳化剤の例は、リン酸二水素セチルジメチル-2-ヒドロキシエチルアンモニウム、塩化セチルトリモニウム、臭化セチルトリモニウム、メチル硫酸ココトリモニウム(cocotrimonium methyl sulfate)、quaternium-1〜x(INCI)である。
アニオン性乳化剤は、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルコイルサルコシン酸塩、アシルタウリン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、αオレフィンスルホン酸塩、特にアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩の群から選択することができる。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に1〜10個の酸化エチレンまたは酸化プロピレン単位、好ましくは1〜3個の酸化エチレン単位を有することが可能である。
使用することができるゲル形成剤は、化粧品において通例の全てのゲル形成剤である。これらには、僅かかに架橋されているポリアクリル酸、例えば、Carbomer(INCI)、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カチオン変性セルロース、多糖類、例えば、キサンタンガム、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、アクリル酸ナトリウムコポリマー、Polyquaternium-32(および)流動パラフィン(INCI)、アクリル酸ナトリウムコポリマー(および)流動パラフィン(および)PPG-1Trideceth-6、塩化アクリルアミドプロピルトリモニウム/アクリルアミドコポリマー、steareth-10アリルエーテル、アクリル酸コポリマー、Polyquaternium-37(および)流動パラフィン(および)PPG-1Trideceth-6、Polyquaternium-37(および)ジカプリン酸/ジカプリル酸プロピレングリコール(および)PPG-1Trideceth-6、Polyquaternium-7、Polyquaternium-44が挙げられる。
シャンプー配合物中では、シャンプー中に通例使用される全てのアニオン性、中性、両性またはカチオン性界面活性剤を使用することができる。
適切なアニオン性界面活性剤は、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルコハク酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、N-アルコイルサルコシン酸塩、アシルタウリン酸塩、アシルイソチオン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩、αオレフィンスルホン酸塩、特に、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩である。アルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびアルキルエーテルカルボン酸塩は、分子中に1〜10個の酸化エチレンまたは酸化プロピレン単位、好ましくは1〜3個の酸化エチレン単位を有することが可能である。
適切なものは、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸アンモニウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、オレイルコハク酸ナトリウム、ラウリルスルホコハク酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミンである。
適切な両性界面活性剤は、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルスルホベタイン、グリシン酸アルキル、カルボキシグリシン酸アルキル、アンホ酢酸アルキルまたはプロピオン酸アルキル、アンホ二酢酸アルキルまたは二プロピオン酸アルキルである。
例えば、ココジメチルスルホプロピルベタイン、ラウリルベタイン、コカミドプロピルベタインまたはコカンホプロピオン酸ナトリウムを使用することができる。
適切な非イオン性界面活性剤は、例えば、アルキル鎖中に直鎖状もしくは分枝状でもよい6〜20個の炭素原子を有する脂肪族アルコールまたはアルキルフェノールと、酸化エチレンおよび/または酸化プロピレンとの反応生成物である。アルキレンオキシドの量は、アルコール1モル当たり約6〜60molである。さらに、アルキルアミンオキシド、モノまたはジアルキルアルカノールアミド、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシドまたはソルビタンエーテルエステルが適切である。
さらに、シャンプー配合物は、従来通りのカチオン性界面活性剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、例えば塩化セチルトリメチルアンモニウムなどを含むことができる。
シャンプー配合物中に、特定の効果を実現するために、本発明のケラチン結合エフェクター分子と組み合わせて、従来通りのコンディショニング剤を使用することができる。
これらには、例えば、INCI名Polyquaterniumの上記のカチオン性ポリマー、特にビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat FC、Luviquat MS、Luviquat Care)、硫酸ジエチルで四級化したN-ビニルピロリドン/メタクリル酸ジメチルアミノエチルのコポリマー(Luviquat D PQ11)、N-ビニルカプロラクタム/N-ビニルピロリドン/N-ビニルイミダゾリウム塩のコポリマー(Luviquat D Hold)、カチオン性セルロース誘導体(Polyquaternium-4および-10)、アクリルアミドコポリマー(Polyquaternium-7)が挙げられる。さらに、タンパク質水解物を使用することができ、またシリコーン化合物をベースとするコンディショニング物質、例えば、ポリアルキルシロキサン、ポリアリールシロキサン、ポリアリールアルキルシロキサン、ポリエーテルシロキサンまたはシリコーン樹脂も使用することができる。さらなる適切なシリコーン化合物は、ジメチコンコポリオール(CTFA)およびアミノ官能性シリコーン化合物(アモジメチコン(CTFA)など)である。さらに、Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride(INCI)などのカチオン性グアー誘導体を使用することができる。
さらなる実施形態では、この毛髪化粧用または皮膚化粧用調製物は、皮膚または毛髪の手入れおよび保護に役立ち、エマルジョン、分散液、懸濁液、水性界面活性剤調製物、ミルク、ローション、クリーム、バルサム、軟膏、ゲル、顆粒、粉末、例えば口紅などのスティック調製物、フォーム、エアロゾルまたはスプレーの形態である。このような配合物は、局所用調製物に非常に適切である。適切なエマルジョンは、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョンまたはマイクロエマルジョンである。
一般に毛髪化粧用または皮膚化粧用調製物は、皮膚(局所用)または毛髪への塗布に使用される。局所用調製物はここでは、微細な分散状態で、好ましくは皮膚を通して吸収できる形態で、活性成分を皮膚に塗布するのに適切である調製物を意味すると理解される。この目的に適切なものは、例えば、水性溶液および含水アルコール溶液、スプレー、フォーム、フォームエアロゾル、軟膏、水性ゲル、O/WまたはW/O型のエマルジョン、マイクロエマルジョンまたは化粧用スティック調製物である。
本発明による化粧品組成物の好ましい一実施形態では、組成物は担体を含む。好ましい担体は、水、ガス、水ベースの液体、油、ゲル、エマルジョンまたはマイクロエマルジョン、分散液、あるいはこれらの混合物である。特定の担体は、良好な皮膚適合性を示す。局所用調製物に特に好都合なのは、水性ゲル、エマルジョンまたはマイクロエマルジョンである。
使用することができる乳化剤は、非イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤またはアニオン性乳化剤である。乳化剤は、組成物に基づいて、0.1〜10重量％、好ましくは1〜5重量％の量で本発明による組成物中に存在し得る。
使用される非イオン性界面活性剤は、例えば、下記の群の少なくとも1種類からの界面活性剤でよい：
8〜22個の炭素原子を有する直鎖状脂肪アルコール、12〜22個の炭素原子を有する脂肪酸、およびアルキル基中に8〜15個の炭素原子を有するアルキルフェノールと、2〜30molの酸化エチレンおよび/または0〜5molの酸化プロピレンとの付加物、
1〜30molの酸化エチレンとグリセロールとの付加物のC12/18-脂肪酸モノエステルおよびジエステル、
6〜22個の炭素原子を有する飽和および不飽和脂肪酸ならびにその酸化エチレン付加物のグリセロールモノエステルおよびジエステルならびにソルビタンモノエステルおよびジエステル、
アルキル基中に8〜22個の炭素原子を有するアルキルモノグリコシドおよびオリゴグリコシド、ならびにそのエトキシ化類似体、
ヒマシ油および/または硬化ヒマシ油と15〜60molの酸化エチレンとの付加物、
ポリオールエステル、特にポリグリセロールエステル、例えば、ポリリシノール酸ポリグリセロール、ポリ-12-ヒドロキシステアリン酸ポリグリセロールまたはダイマー酸ポリグリセロールなど(同様に、これらの物質クラス由来の2つ以上からの化合物の混合物も適している)、
ヒマシ油および/または硬化ヒマシ油と2〜15molの酸化エチレンとの付加物、
直鎖状、分枝状、不飽和または飽和のC6/22脂肪酸、リシノール酸、12-ヒドロキシステアリン酸およびグリセロール、ポリグリセロール、ペンタエリトリトール、ジペンタエリトリトール、糖アルコール(例えば、ソルビトール)、アルキルグルコシド(例えば、メチルグルコシド、ブチルグルコシド、ラウリルグルコシド)、およびポリグルコシド(例えば、セルロース)をベースとする部分エステル、
モノ-、ジ-およびトリアルキルホスファート、およびモノ-、ジ-および/またはトリ-PEGアルキルホスファートならびにその塩、
羊毛ワックスアルコール、
ポリシロキサン-ポリアルキルポリエーテルコポリマーおよび対応する誘導体、
独国特許第1165574号に開示されているペンタエリトリトール、脂肪酸、クエン酸および脂肪アルコールの混合エステル、ならびに/または6〜22個の炭素原子を有する脂肪酸、メチルグルコース、およびポリオール、好ましくはグリセロールまたはポリグリセロール、およびポリアルキレングリコールの混合エステル。
さらに、双性イオン性界面活性剤を、乳化剤として使用することができる。双性イオン性界面活性剤は、分子中に少なくとも1個の第四級アンモニウム基、および少なくとも1個のカルボン酸基またはスルホン酸基を有する界面活性化合物を言及するために使用される用語である。特に適切な双性イオン性界面活性剤は、いわゆるベタインであり、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニウムグリシナート(例えば、ココアルキルジメチルアンモニウムグリシナート)、N-アシルアミノプロピル-N,N-ジメチルアンモニウムグリシナート(例えば、ココアシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシナート)、および2-アルキル-3-カルボキシルメチル-3-ヒドロキシエチルイミダゾリン(いずれの場合にも、アルキル基またはアシル基中に8〜18個の炭素原子を有する)、ならびにココアシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシナートなどである。CTFA名コカミドプロピルベタインで知られている脂肪酸アミド誘導体が特に好ましい。
同様に適切な乳化剤は、両性界面活性剤である。両性界面活性剤は、C8/18-アルキル基または-アシル基以外に、分子中に少なくとも1個の遊離アミノ基および少なくとも1個の-COOH-基または-SO3H基を含み、内部塩を形成することができる界面活性化合物を意味すると理解される。適切な両性界面活性剤の例は、N-アルキルグリシン、N-アルキルプロピオン酸、N-アルキルアミノ酪酸、N-アルキルイミノジプロピオン酸、N-ヒドロキシエチル-N-アルキルアミドプロピルグリシン、N-アルキルタウリン、N-アルキルサルコシン、2-アルキルアミノプロピオン酸およびアルキルアミノ酢酸(いずれの場合にも、アルキル基中に約8〜18個の炭素原子を有する)である。
特に好ましい両性界面活性剤は、N-ココアルキルアミノプロピオン酸塩、ココアシルアミノエチルアミノプロピオン酸塩およびC12/18-アシルサルコシンである。両性乳化剤以外に、第四級乳化剤もまた適切であり、エステルクアット型のもの、好ましくはメチル四級化ジ脂肪酸トリエタノールアミンエステル塩が特に好ましい。さらに、使用し得るアニオン性乳化剤は、アルキルエーテル硫酸塩、モノグリセリド硫酸塩、脂肪酸硫酸塩、スルホコハク酸塩および/またはエーテルカルボン酸である。
適切な油体は、6〜18個、好ましくは8〜10個の炭素原子を有する脂肪アルコールをベースとするゲルベアルコール;直鎖状C6〜C22-脂肪酸と直鎖状C6〜C22-脂肪アルコールとのエステル;分枝状C6〜C13-カルボン酸と直鎖状C6〜C22-脂肪アルコールとのエステル;直鎖状C6〜C22-脂肪酸と分枝状アルコール、特に2-エチルヘキサノールとのエステル;直鎖状および/または分枝状脂肪酸と、多価アルコール(例えば、プロピレングリコール、ジメルジオールまたはトリメルトリオール(trimertriol)など)および/またはゲルベアルコールとのエステル;C6〜C10-脂肪酸をベースとするトリグリセリド;C6〜C18-脂肪酸をベースとする液体モノ/ジ、トリグリセリド混合物;C6〜C22-脂肪アルコールおよび/またはゲルベアルコールと、芳香族カルボン酸、特に安息香酸とのエステル;C2〜C12-ジカルボン酸と、1〜22個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルコール、または2〜10個の炭素原子および2〜6個ヒドロキシル基を有するポリオールとのエステル;植物油;分枝状第一級アルコール;置換シクロヘキサン;直鎖状C6〜C22脂肪アルコール炭酸エステル;ゲルベ炭酸エステル;安息香酸と直鎖状および/または分枝状C6〜C22-アルコールとのエステル(例えば、Finsolv(登録商標)TN);ジアルキルエーテル;エポキシ化脂肪酸エステルとポリオールとの開環生成物;シリコーン油および/または脂肪族またはナフテン系炭化水素である。使用し得る油体はまた、シリコーン化合物、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状シリコーン、およびアミノ-、脂肪酸-、アルコール-、ポリエーテル-、エポキシ-、フッ素-、アルキル-および/またはグリコシド修飾型シリコーン化合物であり、これは室温で液体の形態または樹脂の形態でもよい。油体は、本発明による組成物中に、組成物に基づいて1〜90重量％、好ましくは5〜80重量％、および特に10〜50重量％の量で存在し得る。
本発明によるおよび/または本発明の方法により生成されたケラチン結合エフェクター分子と共に使用することができる特定の成分の一覧は、当然ながら網羅的または限定的であると考えるべきではない。成分は、個々に、または互いに組み合わせて使用することができる。
本発明は、皮膚化粧用活性成分を、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に塗布する方法をさらに提供し、この方法では、
(l)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、
(m)(k)によるケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に塗布する。
さらに、本発明は、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪上に、皮膚化粧用活性成分の滞留時間を増加させる方法を提供し、この方法では、
(n)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、
(o)(m)によるケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に塗布し、
(p)活性成分を、ケラチン結合ドメインを介して、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に間接的に結合させる(この方法では、ケラチン結合ポリペプチドに結合する活性成分の滞留時間は、(ケラチン結合ポリペプチドに結合していない)遊離活性成分と他の点では同等の条件下で比較して、少なくとも20％または30％、好ましくは少なくとも40％、50％または60％、特に好ましくは少なくとも75％、100％または125％、特に非常に好ましくは少なくとも150％、200％または250％、最も好ましくは500％、750％または1000％増加する)。
本発明は、式2、4および5の化合物をさらに提供する。
Figure 2009517361
式中、「n」は、0〜20、好ましくは3〜15、特に好ましくは3〜10、特に非常に好ましくは3〜8、全ての中で最も好ましくは5の整数である。ここで特に好ましいのは、式2の化合物である。
本発明のさらなる実施形態では、特定の化合物の混合物を本発明の方法において使用することができる。ここで、残りのヒドロキシ基がよりエステル化された類似体、および/またはそれらの混合物を使用することも可能である。
配列
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
実験的実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために開示する。これらの実施例は、網羅的なもの、または本発明の対象を限定するものとして考えるべきではない。
実験の説明において、下記の略語を使用する：
(2-アミノ-2-メチルプロパノール)AMP、(摂氏温度)℃、(エチレンジアミン四酢酸)EDTA、(ヒンダードアミン安定化剤)HAS、(1,1-ジフルオロエタン)HFC152、(国際化粧品成分命名法)INCI、(ミリリットル)ml、(分)min、(油/水)O/W、(ポリエチレングリコール)PEG-25、(パラアミノ安息香酸)PABA、(百万分率)ppm、(十分量)q.s.、(ビニルピロリドン)VP、(水/油)W/O、(活性成分)AI、(ポリビニルピロリドン)PVP、(ケラチン結合ドメイン)KBD、(ヒトデスモプラキンのケラチン結合ドメインB)KBD-B、(ヒトデスモプラキンのケラチン結合ドメインC)KBD-C、(ヒトプラコフィリンのケラチン結合ドメイン)KBD-D。
実施例1：発現ベクターおよび産生菌株
ケラチン結合ドメイン(KBD)の発現に関して様々な発現ベクターを試験した。この目的で、様々なプロモーター(例えば、IPTG誘導性、ラムノース誘導性、アラビノース誘導性、メタノール誘導性、構成的プロモーターなど)を使用した。同様に、KBDを融合タンパク質として(例えば、チオレドキシン、またはeGFP、またはYaaD[枯草菌(B.subtilis)、SWISS-PROT:P37527、PDX1]などとの融合物として)発現する構築物についても試験した。ここでは、様々な発現系を使用して、記載されたKBD-B(ケラチン結合ドメインB、配列番号4)、およびKBD-C(ケラチン結合ドメインC、配列番号10)の両方、ならびに2種類のドメインの組合せであるKBD-BCを発現させた。言及するベクター構築物は、特許請求の範囲を限定するものではない。
代表例として、IPTG誘導性ベクターpQE30-KBD-B(図1)、メタノール誘導性ベクターpLib15(図2)およびpLib16(図3)、ならびに誘導性ベクターpLib19(図4)のベクターマップを挙げる。KBD-Cに関する手順もまた、記載するベクター構築および発現と同様とすることができる。
KBDの発現のためには、様々な産生宿主、例えば、大腸菌株を使用した(実施例2を参照されたい。例えば、XL10-Gold[Stratagene社]、BL21-CodonPlus [Stratagene社]など)。しかし、他の細菌の産生宿主、例えば、巨大菌(Bacillus megaterium)または枯草菌(Bacillus subtilis)などもまた使用した。巨大菌におけるKBD発現の場合、Barg, H., Malten, M. & Jahn, D. (2005). Protein and vitamin production in Bacillus megaterium. In Methods in Biotechnology-Microbial Products and Biotransformations (Barredo, J.-L., ed, 205-224)と同様の手順を行った。
使用した真菌の産生菌株は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(実施例3を参照されたい。例えば、GS115およびKM71[両方ともInvitrogen社製]など)、ならびにアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)(実施例4を参照されたい。例えば、RMS011 [Stringer, MA, Dean, RA, Sewall, TC, Timberlake, WE (1991) Rodletless, a new Aspergillus developmental mutant induced by direct gene activation. Genes Dev 5:1161-1171]およびSRF200 [Karos, M, Fischer, R (1999) Molecular characterization of HymA, an evolutionarily highly conserved and highly expressed protein of Aspergillus nidulans. Mol Genet Genomics 260:510-521]など)であった。しかし、他の真菌の産生宿主、例えば、クロカビ(Aspergillus niger)(EP0635574A1および/またはWO98/46772と同様のKBD発現)などをKBD発現に使用することも可能である。
実施例2：大腸菌株における、例えば、発現プラスミドpQE30-KBD-BによるIPTG誘導性プロモーターを用いたKBD発現
発現には、様々な産生宿主、例えば、様々な大腸菌株(例えば、XL10-Gold [Stratagene社]、BL21-CodonPlus [Stratagene社]など)、巨大菌、枯草菌などを使用した。
例示的な説明として、ここに記載するのは、KBD-BのクローニングおよびpQE30-KBD-Bで形質転換された大腸菌によるKBD-Bの発現についてである。
pQE30-KBD-Bのクローニング
・Lambda-MaxiDNA(DNA-Lambda Maxi Kit、Qiagen社製)を、ヒトケラチン生成細胞のcDNAバンク(BD Bioscience、Clontech社製、ヒトケラチン生成細胞cDNA、包皮、対数期の初代培養、ベクター:λgt11)から調製した。
下記のオリゴヌクレオチドを使用してPCRを行った：
Bag43(5'-GGTCAGTTACGTGCAGCTGAAGG-3')(配列番号141)、および
Bag44(5'-GCTGAGGCTGCCGGATCG-3')(配列番号142)。
PCR混合物50μl：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity: 5μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1μl(1:30希釈)
dNTPミックス(10mM) 1μl
オリゴBag43(192ng/μl) 0.5μl
オリゴBag44(181ng/μl) 0.5μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ 1μl
H2O 41μl。
温度プログラム：
Figure 2009517361
・サイズが約1102bpの得られたPCR産物を、アガロースゲルから切り出して精製した。
・精製済PCR産物を鋳型として使用し、次いで2回目のPCRを行った。
使用したオリゴヌクレオチド：
Bag53:(5'-CGCGCCTCGAGCCACATACTGGTCTGC-3')(配列番号143)、および
Bag51(5'-GCTTAGCTGAGGCTGCCGGATCG-3')(配列番号144)。
PCR混合物50μl：
10×PCRバッファーTAQ: 5μl
上記PCRからの鋳型 3.5μl
dNTPミックス(10mM) 1μl
オリゴBag53(345ng/μl) 0.5μl
オリゴBag51(157ng/μl) 0.5μl
TAQ ポリメラーゼ 1μl
H2O 39μl。
温度プログラム：
Figure 2009517361
・サイズが約1073bpの得られたPCR産物をアガロースゲルから切り出して精製し、下記のベクターにクローニングした:pCR2.1-TOPO(Invitrogen社製)。
・次いで、得られたベクターpCR2.1-TOPO+KBD-B(5027bp)を、形質転換し、大腸菌中で増幅した後、XhoIおよびEcoRIで切断し、得られたKBD-B断片をpBAD/HisA(Invitrogen社製、XhoIおよびEcoRIで同様に切断)にクローニングした。
・新たに形成されたベクターpBAD/HisA+KBD-B(5171bp)を、SacIおよびStuIで再度切断し、得られたKBD-B断片をpQE30(Qiagen社製、SacIおよびSmaIで切断)にクローニングした。得られた発現ベクターpQE30-KBD-B(4321bp、図1も参照されたい)を、下記のKBD-B発現に使用した。
ベクターpQE30-KBD-Bによって大腸菌で発現したKBD-B(配列番号4)は、N末端にアミノ酸MRGSHHHHHHGSACEL、およびC末端にアミノ酸GVDLQPSLIS(配列番号166)をさらに含むものとした。
pQE30-KBD-Bによる大腸菌でのKBD-Bの発現
・pQE30-KBD-Bで形質転換された大腸菌株(例えば、XL10-Gold [Stratagene社])をプレートまたはグリセロール培養物から前培養に接種した。本培養の規模に応じて、培地(約1:100)による接種を、試験管または小型フラスコ中で行った。
・使用する菌株に従って抗生物質を使用した(pQE30-KBD-Bでは、アンピシリン100μg/ml)。
・250rpmおよび37℃でインキュベーションを行った。
・本培養物に、前培養物を約1:100で接種した。本培養:対応する抗生物質を含むLB培地または適切な最小培地。250rpm、37℃でインキュベートする。
・0.5を超える光学密度(600nm)で1mMのIPTGによる発現誘導を行った。
・発現誘導の4時間後、細胞を遠心分離した。
発酵槽中での手順は同様であったが、はるかに高いOD単位で発現誘導を行うことができ、したがって細胞およびタンパク質収率を大幅に上昇させることが可能であった。
実施例3：メタノール誘導性プロモーターを使用する（例えば、発現プラスミドpLib15およびpLib16による）ピキア・パストリス株によるKBDの細胞内および分泌発現(振とうフラスコ)
KBD発現のために、様々なピキア・パストリス株、例えば、GS115およびKM71などを使用した(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen Life Technologies社製)。
以下、代表例として、pLib15(細胞内発現ベクター、図2を参照されたい)またはpLib16(分泌発現ベクター、図3を参照されたい)で形質転換されたピキア・パストリスによるKBD-Bの発現について記載する。
・pLib15の構築のために、948bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号145)を、オリゴヌクレオチドLib148(5'-GCTAAGGAATTCACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号147))およびLib149(5'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号148))、およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図1)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した。このときPCR産物の両端に、EcoRI制限部位を導入した。
・pLib16の構築のために、942bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号149)を、オリゴヌクレオチドLib149(5'-GCTGGAGAATTCTCAGCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号148))およびLib150(5'-GCTAAGGAATTCCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号151))およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図1)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した。このときPCR産物の両端に、EcoRI制限部位を導入した。
・下記の組成を有する50μlの反応混合物中でPCRを行った：
1μlのプラスミド-DNA pQE30-KBD-B
1μlのdNTP-Mix(各10mM、Eppendorf社製)
5μlの10×PCRバッファー+MgCl2(Roche社製)
1μlのLib148またはLib150の5'プライマー(50pmolに相当)
1μlのLib149の3'プライマー(50pmolに相当)
5U Pwoポリメラーゼ(Roche社製)。
PCR反応を下記のサイクル条件下で行った：
ステップ1:5分、95℃(変性)
ステップ2:45秒、95℃
ステップ3:45秒、50℃(アニーリング)
ステップ4:2分、72℃(伸長)
30サイクルのステップ2〜4
ステップ5:10分、72℃(後伸長)
ステップ6:4℃(停止)。
・オリゴヌクレオチドLib148/Lib149によって増幅したPCR産物(配列番号145)を、EcoRIで消化し、EcoRIで切断されたベクターpPIC3.5(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にライゲーションした。ライゲーションから得たベクターpLib15(図2)を配列決定することによって、正しいKBD-B増幅であるかどうか検査した。
・オリゴヌクレオチドLib149/Lib150によって増幅したPCR産物(配列番号149)を、EcoRIで消化し、EcoRIで切断されたベクターpPIC9(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にライゲーションした。ライゲーションから得たベクターpLib16(図3)を配列決定することによって、正しいKBD-B増幅であるかどうか検査した。
・ピキア・パストリス株のエレクトロコンピテントセルおよびスフェロプラストを、製造業者の指示に従って環状ベクターおよびStuI線形ベクターpLib15およびpLib16で形質転換した(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)。
・染色体DNAを使用したPCRおよびサザンブロットによって、形質転換体を分析した。
・前培養のために、プレートまたはグリセロール培養物からKBD-Bを発現しているピキア・パストリス形質転換体を接種した。本培養物の規模に応じて、試験管または小型フラスコ中のMGY、BMGまたはBMGY培地(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)(約1:100)に接種した。
・培養物を、250〜300rpm、30℃でOD600=2〜6までインキュベートした。
・室温にて5分間1500〜3000×gで細胞を回収した。
・本培養のために、回収した細胞ペレットを、メタノール含有mM、BMMまたはBMMY培地(Pichia Expression Kit、Version M、Invitrogen社製)中にOD600=1の濃度で加え、発現を誘導した。
・本培養物を、250〜300rpm、30℃で、1〜96時間インキュベートした。
・100％メタノールをメタノール最終濃度0.5％で加えることによって、24時間毎に発現誘導を維持した。
・細胞内発現の場合は、本培養の終了後に細胞の回収およびMenton-Gaulinを用いた破壊を行った。
・分泌発現の場合は、培養上清を回収し、そこからKBD-Bを直接的に精製した。
・ピキア・パストリスにおいて細胞内発現したKBD-B(配列番号145)(pLib15)には、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸MHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。
・ピキア・パストリスにおいて分泌発現したKBD-B(配列番号149)(pLib16)には、プロセシング前に、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAYVEFHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。
・ピキア・パストリスによってプロセシングおよび分泌されたKBD-B(配列番号149)(pLib16)には、ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、N末端にアミノ酸YVEFHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISをさらに含むものとした。
実施例4：誘導性alcAプロモーターを使用する（例えば、発現プラスミドpLib19を介する）アスペルギルス・ニデュランス株によるKBDの発現(振とうフラスコ)
発現のために、例えばRMS011またはSRF200などのアスペルギルス・ニデュランス野生型株を使用した。以下、例示的な説明として、pLib19で形質転換されたアスペルギルス・ニデュランスによるKBD-Bの発現について記載する(図4)。
・pLib19の構築のために、922bpのサイズのKBD-BをコードするDNA断片(配列番号152)を、オリゴヌクレオチドLib151(5'-CACCATGCATCACCATCACCATCACGAGCCACATACTGGTCTGCT-3'(配列番号154))およびLib152(5'-GCTAATTAAGCTTGGCTGCA-3'(配列番号155))、およびベクターpQE30-KBD-B(実施例2、図1)を鋳型として使用して、PCRによって増幅した(プライマーLib151およびLib152のTm値に適合させ、53℃のPCRプログラムのアニーリング温度を用いて、上記のPCR条件を使用)。PCR産物を、ベクターpENTR/D(pENTR(商標)Directional TOPO(登録商標)Cloning Kit、Version E、Invitrogen社製)中にライゲーションした。配列決定によって正しいKBD-B増幅を検査した。
・「Gateway(登録商標)LR clonase(商標)酵素ミックス」(Invitrogen社製)を使用して、KBD-BをコードするDNA断片の、ベクターpMT-OvEへの組換えを行った(Toews MW, Warmbold J, Konzack S, Rischitor P, Veith D, Vienken K, Vinuesa C, Wei H, Fischer R; Establishment of mRFP1 as a fluorescent marker in Aspergillus nidulans and construction of expression vectors for high-throughput protein tagging using recombination in vitro (GATEWAY). (2004) Curr Genet 45: 383-389)。これによってベクターpLib19が生成された(図4)。
・アスペルギルス・ニデュランス野生型株のプロトプラストを、環状ベクターpLib19で形質転換した(Yelton MM, Hamer JE, Timberlake WE; Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 1479-1474)。染色体DNAを使用したPCRおよびサザンブロットによって、形質転換体を分析した。
・KBD-Bを発現しているアスペルギルス・ニデュランス形質転換体の前培養のために、500mlフラスコ中の100mlの最小培地(0.6％NaNO3、0.152％KH2PO4、0.052％KCl[pH6.5]、0.8％グルコース、0.05％MgSO4、1ml微量元素溶液[1g/lのFeSO4×7H2O、8.8g/lのZnSO4×7H2O、0.4g/lのCuSO4×5H2O、0.15g/lのMnSO4×4H2O、0.1g/lのNa2B4O7×10H2O、0.05g/l(NH4)6Mo7O24×4H2O]、+菌株特異的添加物)または100mlの完全培地(2％麦芽エキス、0.1％ペプトン、2％グルコース、+菌株特異的添加物)に、106〜107個の胞子を接種し、200〜250rpm、37℃で16〜24時間インキュベートした。
・前培養の後に、濾過によって真菌の菌糸体を回収し、蒸留水で洗浄し、100〜500mlの新鮮な最小培地と共にフラスコに移した。この本培養培地において、C供給源としてグルコースの代わりに0.1％フルクトースを使用した。KBD発現を誘導するために、エタノール(1％最終濃度)またはグリセロール(50mM)または酢酸ナトリウム(50mM)またはエチルアミンまたはトレオニンを、さらに培地に加えた。発現を誘導するために言及した添加剤は、特許請求の範囲を制限するものではない。本培養物を、200〜250rpmおよび37℃でさらに5〜48時間インキュベートした。
・培養終了後に、室温で5分間、1500〜3000×gで真菌の菌糸体を回収し、Menton-Gaulinを用いて破壊した。
・ポリペプチド配列(配列番号4)に加えて、アスペルギルス・ニデュランス中で発現したKBD-B(配列番号152)(pLib19)には、N末端にアミノ酸MHHHHHH、C末端にアミノ酸GVDLQPSLISKGGRADPAFLYKVVMIRLLTKPERKLLEGGPGTQLLFPLVRVNCALGVIMVIAVSCVKLLSAHNSTQHTSRKHKVをさらに含むものとした。
実施例5：細胞破壊および細胞内封入体精製(pQE30-KBD-B)
可溶性発現したKBDを、(例えば、Menton-Gaulinによる)細胞破壊の後に直接使用し、またはクロマトグラフィーによって精製することができた(実施例6を参照されたい)。(例えば、封入体中で)不溶性発現したKBDを、下記のように精製した。
・発酵槽内容物を遠心分離し、ペレットを20mMのリン酸バッファー(pH=7.5)に懸濁させ、Menton-Gaulinを用いて破壊した。
・破壊した細胞を再び遠心分離(15000g)し、そのペレットを、20mMリン酸、500mM NaClおよび8M尿素で処理し、そして撹拌した(封入体の溶解)。
・上清のpHを7.5に調節した。
・次いで、遠心分離を再び行い、実施例6に記載のように、上清をNiキレートセファロースカラムに加え、精製した。
実施例6：Niキレートセファロースでのケラチン結合ドメインBの精製
結合したHisタグを介して、NiカラムによってKBDをクロマトグラフィーによって精製することができた。
カラム材料:Ni-セファロースHigh Performance
Amersham Biosciences社、品番17-5268-02。
材料をカラム(例えば、直径2.6cm、高さ10cm)中に詰め、バッファーA+4％バッファーB(20mMのイミダゾールに相当)で平衡化した。
タンパク質抽出物(例えば、細胞破壊および細胞内封入体精製を参照されたい)を、Superloop(AKTA system)を使用してカラムに加えた(pH7.5)(流量、約5ml/分)。
添加の後、バッファーA+20mMイミダゾールで洗浄を行った。
バッファーB(バッファーA中、500mMイミダゾール)によって溶出を行った。
フラクションコレクターを使用して溶出液を画分として回収した。
次いで、溶出液を脱塩した(濃縮する試料には好都合である)。このために、例えばセファデックスG25中型カラム(Amersham社製)によって、溶出液を脱塩した。続いて、濃縮のために、例えば、Amiconチャンバー(撹拌限外濾過セル、Millipore社製)が可能であった。
バッファーA:20mMのリン酸二水素ナトリウム
500mM NaCl(所望であれば、低濃度のNaClを有するバッファーを使用することも可能である。)
8M 尿素(すでに可溶性発現した「活性」KBDを、クロマトグラフィーによって分離する場合は、尿素を使用する必要はない。尿素がない場合、その後のタンパク質の再生は必要ない。)
pH=7.50
バッファーB:20mMリン酸二水素ナトリウム
500mMのNaCl(所望であれば、低濃度のNaClを有するバッファーを使用することも可能である。)
8Mの尿素
500mMイミダゾール
pH=7.50。
実施例7：ケラチン結合ドメインBの再生
不溶性発現した(例えば、封入体からの)ケラチン結合ドメインを、下記のように再生し、ゆえに活性化することができる。
方法1:不連続透析
Cellytic IB(Sigma社製、品番C5236)6.5mlおよび5mMのDTTを、8M尿素(Niキレート溶出液、HiTrap)中のKBD-B封入体6.5mlに加えた。次いで、再生対象の溶液を透析チューブに注ぎ入れた(Spectrum社製:Spectra Por MWCO:12〜14kD)。
注意深く撹拌しながら、4℃で約12時間、6Mの尿素溶液1Lに対して透析を行った。
25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを加え、同様に4℃で9時間透析を行った。次いで、さらなるトリスバッファー(上記を参照されたい)250mlを加え、さらに12時間透析を行った。
次いで、25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを再度加え、4℃で9時間、同様に透析を行った。次いで、さらなるトリスバッファー(上記を参照されたい)250mlを加え、さらに12時間透析を行った。
次いで、25mM Tris/HCl(pH=7.50)500mlを再度加え、4℃で9時間、同様に透析を行った。次いで、透析物を含有する透析チューブを、25mM Tris+150mM NaCl(pH=7.50)2L中に加えた。次いで、4℃で12時間、再度透析を行った。
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。
方法2:連続透析
8M尿素(Niキレート溶出液、HiTrap)中のKBD-B封入体20mlを、Cellytic IB(Sigma社製、品番C5236)10mlおよび5mMのDTTで処理した。次いで、その溶液を透析チャンバー(Slide-A-Lyzer Dialyses Cassette PIERCE、MWCO:10kD、品番66830)に注いだ。
次いで、6M尿素溶液1Lに対して、4℃で約1時間透析を行った。
次いで、48時間に亘り、下記のバッファー2Lを、蠕動ポンプによって計量しながら連続供給した(25mM Tris/HCl、pH=7.5)。
次いで、透析物を含有する透析チューブを、最終バッファー(25mM Tris+150mM NaCl、pH=7.50)2Lに加え、4℃で約12時間、透析を行った。
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。
実施例8：皮膚への結合1(定性的)
KBDが皮膚に結合するかどうかを調べるために、視覚による定性試験を開発した。
使用する溶液:
ブロッキング溶液:ウェスタンブロッキング試薬1921673Roche(10×溶液)をTBSで希釈したもの
TBS:20mM Tris、150mM NaCl(pH7.5)
TTBS:TBS+0.05％Tween20。
第1のステップは、皮膚の外側角質層を安定的な支持材に移すことである。この目的で、透明な接着テープを、脱毛済みのヒト皮膚にしっかりと貼り、そして剥がす。試験は、透明な接着ストリップ上で直接行うことができ、または接着した角質層をスライドガラスに再度接着させて移すことができる。下記のように結合を実証した。
・様々な試薬とのインキュベーションのために、ファルコン容器に移す。
・適切な場合、脱脂のためにエタノールを加え、エタノールを除去し、スライドを乾燥させる。
・ブロッキングバッファーと室温で1時間インキュベートする。
・TTBSで5分間、2回洗浄する。
・TBSで5分間、1回洗浄する。
・試験対象のKBD(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリングされている)または対照タンパク質と共に、TBS/0.05％Tween20中、室温で2〜4時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・TBSで3回洗浄する。
・TBS+0.01％ブロッキング中で1:2000に希釈されたモノクローナル抗ポリヒスチジン(または特異的KBDウサギ)抗体と室温で1時間インキュベートする。
・TTBSで2回、5分間洗浄する。
・TBSで1回、5分間洗浄する。
・TBS+0.01％ブロッキング中で1:5000に希釈された抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲートと室温で1時間インキュベートする。
・TTBSで2回、5分間洗浄する。
・TBSで1回、5分間洗浄する。
・ホスファターゼ基質を加える(NBT-BCIP;Boehringer MA1錠/水40ml、2.5分、水で停止)。
・肉眼でまたは顕微鏡を使用して、有色沈殿物を光学的に検出する。青色沈殿物は、KBDが皮膚に結合したことを示す。
実施例9：皮膚への結合2(定量的)
KBDの毛髪/皮膚結合強度を非特異的タンパク質と比較することのできる、定量試験を開発した。
5mm穿孔器を使用して、毛髪のない解凍した乾燥片(ヒトまたはブタ)からの切片に孔をあけた(あるいは、表面試験の場合、皮膚の切片をファルコン蓋中に入れる)。次いで、皮膚試料を2〜3mmの厚さにし、存在する全ての組織を除去する。次いで、皮膚試料を、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移し、結合の実証を行う(図6も参照されたい。あるいは、L'Oreal社製Episkin system[再構成したヒトの皮膚]も使用することができる)。
・PBS/0.05％Tween20により2回洗浄する。
・PBS中の1％BSA1mlを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で1時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・PBS中のKBD100μgを0.05％Tween20に加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で2時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・PBS/0.05％Tween20により3回洗浄する。
・穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、1mlのモノクローナルマウス抗タグ(His6またはHAまたは特異的KBD)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(0.05％Tween20を含むPBS中、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で2〜4時間インキュベートする。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・ペルオキシダーゼ基質(1ml/エッペンドルフ容器;組成は下記参照のこと)を加える。
・青色に呈色するまで反応を進行させる(約90秒)。
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。
・405nmでの吸収を測定した。
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中42mM TMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウムpH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)。
実施例10：毛髪への結合(定量的)
他のタンパク質と比較してのKBDの毛髪への結合強度を示すことができるように、定量的アッセイを開発した(図6も参照されたい)。この試験において、まず毛髪をKBDと共にインキュベートし、過剰なKBDを洗い落とした。次いで、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、KBDのHisタグを介してカップリングさせた。結合していない抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、再び洗い落とした。結合している抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲート[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]は、無色の基質(TMB)を有色生成物に変換することができ、これを405nmでの光度測定によって測定することができる。吸収強度は、結合しているKBDまたは比較タンパク質の量を示す。選択した比較タンパク質は、例えば、枯草菌由来のYaaDであり、本試験で必要であるので、それは検出用のHisタグを同様に有するものとした。Hisタグの代わりに、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされている他の特異的抗体を使用することもできる。
毛髪(ヒト)5mgを、長さ5mmに切断し、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移して、結合の実証を行う。
・脱脂のためエタノール1mlを加える。
・遠心分離し、エタノールを除去し、毛髪をH2Oで洗浄する。
・PBS中の1％BSA1mlを加え、穏やかに回旋運動させながら、室温で1時間インキュベートする。
・遠心分離し、上清を除去する。
・1mlのPBS/0.05％Tween20中の試験対象のケラチン結合ドメイン(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリングされている)または対照タンパク質を加え、穏やかに回旋運動させながら、4℃で16時間(または室温で少なくとも2時間)インキュベートする。
・遠心分離し、上清を除去する。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・穏やかに回旋運動させながら、1mlのモノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(PBS/0.05％Tween20中、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で2〜4時間インキュベートする。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・ペルオキシダーゼ基質(1ml/エッペンドルフ容器)を加える。
・青色に呈色するまで反応を進行させる(約2分)。
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。
・405nmでの吸収を測定する。
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)
TMB溶液0.1ml(DMSO中の42mM TMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウム、pH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)
BSA=ウシ血清アルブミン
PBS=リン酸緩衝食塩水
Tween20=モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、nは約20
TMB=3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン。
KBD-Bについて例示的に行った毛髪への結合試験では、比較タンパク質YaaDの有意に不十分な結合と比較して、KBD-B(配列番号166)の毛髪への結合性が大変優れていることが示された。
Figure 2009517361
実施例11：IPTG誘導性プロモーターを有する発現プラスミドpRee024を使用した大腸菌株によるKBD-D(配列番号167)の発現(図8)
発現のために、大腸菌株XL10 Gold[Stratagene社]を使用した。
ここで、代表例として、KBD-D(配列番号167)のクローニング、その後のpRee024で形質転換された大腸菌でのKBD-Dタンパク質(配列番号168)の発現(図8)について記載する。
pRee024のクローニング
・Lambda-MaxiDNA(DNA-Lambda Maxi Kit、Qiagen社製)を、ヒトケラチン生成細胞のcDNAバンク(BD Bioscience、Clontech社製、ヒトケラチン生成細胞cDNA、包皮、対数期の初代培養、ベクター:λgt11)から調製した。
KBD-D遺伝子の増幅のためのPCRを、2つのステップで行った。まず5'末端および3'末端を別々に増幅させた。これらの断片は、KBD-D遺伝子全体の増幅のためのマトリックスであった。
5'末端の増幅のためのPCRを下記のように行った。
プライマーは、下記の配列を有した：
HRe6:5'-ATGAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTG-3'(配列番号171)
HRe9:5'-CGTTCCCGGTTCTCCTCAGGAGGCTGACTG-3'(配列番号172)。
100μlのPCR混合物：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity: 10μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1μl(1:10希釈)
dNTPミックス(10mM) 10μl
HRe6(196ng/μl) 1μl
HRe9(201ng/μl) 1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ 1μl
再蒸留H2O 76μl。
温度プログラム:
Figure 2009517361
・約1kbのサイズの断片を、アガロースゲル中で検出した。反応物を精製し、KBD-D遺伝子の増幅のために5'末端鋳型として下記で使用した。
3'末端の増幅のためのPCRを下記のように行った。
プライマーは、下記の配列を有した：
HRe7:5'-TTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT-3'(配列番号173)
HRe8:5'-CACCACCAACAAGCTGGAGACCCGGAG-3'(配列番号174)。
100μlのPCR混合物：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity: 10μl
Lambda DNA(744ng/μl) 1μl(1:10希釈)
dNTPミックス(10mM) 10μl
HRe7(201ng/μl) 1μl
HRe8(209ng/μl) 1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ 1μl
再蒸留H2O 76μl。
温度プログラム：
Figure 2009517361
・約1.2kbのサイズの断片を、アガロースゲル中で検出した。反応物を精製し、下記でKBD-D遺伝子の増幅のための3'末端鋳型として使用した。
・KBD-D遺伝子の増幅のために、5'末端鋳型および3'末端鋳型をマトリックスとして使用した。PCRを下記のように行った。
100μlのPCR混合物：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity: 10μl
dNTP-mix(10mM) 10μl
再蒸留H2O 75μl
5'末端鋳型 1μl
3'末端鋳型 1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ 1μl
H2O 76μl。
温度プログラム：
Figure 2009517361
10サイクル後に、1μlのプライマーHRe6(196μg/ml)およびHRe7(206μg/ml)および1μlのPfu Ultra High Fidelityポリメラーゼを加え、反応を伴う下記の温度プログラムを行った。
温度プログラム：
Figure 2009517361
次いで、Taqポリメラーゼ1μlを加え、混合物を72℃で10分間インキュベートした。
・得られた約2150bpのサイズのPCR産物を、アガロースゲルから切り出して精製し、下記のベクターpCR2.1-TOPO(Invitrogen社製)にクローニングした。
・次いで、得られたベクターpRee019(6112bp)を形質転換し、大腸菌中で増幅し、KBD-D遺伝子を配列決定によって検査した。
次いで、KBD-D遺伝子を発現ベクター中にクローニングした。このため、ベクターpRee019を鋳型としてPCRをさらに行った。
使用したオリゴヌクレオチド：
HRe26:5'-CTCGGTACCAACCACTCGCCGCTCAAGACCGCCTTGGCG-3'(配列番号175)
HRe27:5'-ATTAAGCTTTTAGAATCGGGAGGTGAAGTTCCTGAGGCT-3'(配列番号176)。
100μlのPCR混合物：
10×PCRバッファーPfu Ultra High Fidelity: 10μl
pRee019(25ng/μl) 1μl
dNTPミックス(10mM) 10μl
HRe26(287ng/μl) 1μl
HRe27(354ng/μl) 1μl
Pfu Ultra High Fidelityポリメラーゼ 1μl
再蒸留H2O 76μl。
温度プログラム：
Figure 2009517361
・約2.2kbのサイズの断片を、アガロースゲル中で検出した。反応物を精製し、次いで制限エンドヌクレアーゼKpnIおよびHindIIIで切断し、得られた断片を発現ベクター中にクローニングした。これによってベクターpRee024が得られ、これを次いでKBD-D発現のために使用した。
大腸菌中のpRee024によるKBD-D(配列番号167)の発現
・pRee024で形質転換された大腸菌株(例えば、TG10)をプレートまたはグリセロール培養物から前培養物に接種した。本培養物の規模に応じて、LB培地(約1:100)による接種を、試験管または小型フラスコ中で行った。
・使用する菌株に従って抗生物質を使用した(pRee024で形質転換された大腸菌TG10では、アンピシリン100μg/ml)。
・250rpm、37℃でインキュベートした。
・本培養物に前培養物を約1:100で接種した。本培養物:対応する抗生物質を含むLB培地または適切な最少培地。250rpm、37℃でインキュベーションを行った。
・OD578nmが1を超えた時点で1mMのIPTGを用いて発現誘導した。次いで、インキュベーション温度を室温(約20℃)に下げた。発現誘導の2時間後に、細胞を遠心分離した(図9を参照されたい)。
実施例12：細胞破壊および細胞内封入体精製(pRee024)
不溶性発現した(例えば封入体中の)KBD-D(配列番号168)を、下記のように精製した。
実施例2からの細胞沈殿物を、100mM NaCl(pH=7.5)を含む20mMのリン酸バッファー中で再懸濁させ、超音波処理によって破壊した。
破壊した細胞を、再び遠心分離した(4℃、12000g、20分)。上清を廃棄した。沈殿物をバッファーA(10mM NaH2PO4、2mM KH2PO4、100mM NaCl、8M尿素、5mM DTT)に再溶解した。次いで、混合物を再び遠心分離し、上清をNiキレートセファロースに加えた。添加の後に、バッファーA 20mMイミダゾールで洗浄を行った。バッファーB(10mM NaH2PO4、2mM KH2PO4、100mM NaCl、8M尿素、5mM DTT、500mMイミダゾール)で、カラムからの溶出を行った。溶出液を画分として回収し、SDS-PAGEにより分析した。精製したKBD-Dを含んだ画分を、実施例13に記載するように再生した。
実施例13：ケラチン結合ドメインD(配列番号168)の再生
(例えば、封入体からの)不溶性発現したケラチン結合ドメインDは、透析によって再生でき、したがって活性化できた。手順は下記の通りであった。
精製したKBD-Dを含む実施例12からの画分を、透析チューブ(MWCO12〜14KD)中に注いだ。
次いで、8M尿素溶液1Lに対して透析を約1時間行った。
次いで、12時間に亘って、脱イオン水2Lを、蠕動ポンプによって計量しながら連続供給した。
次いで、透析チューブの内容物を取り出した。このように活性化したKBD-Dを、下記の活性試験において使用した。
実施例14：皮膚への定性的結合
KBD-D(配列番号168)が皮膚に結合したかどうかを試験するために、視覚による定性試験を使用した。
使用する溶液：
ブロッキング溶液:ウェスタンブロッキング試薬1921673Roche(10×溶液)をTBSで希釈したもの
TBS:20mM Tris、150mM NaCl、pH7.5
TTBS:TBS+0.05％Tween20。
第1のステップは、皮膚の外側角質層を安定的な支持材に移すことである。この目的で、透明な接着テープを、脱毛済みのヒト皮膚にしっかりと貼り、そして剥がす。試験は、透明な接着ストリップ上で直接行うことができ、または接着した角質層をスライドガラスに再度接着させて移すことができる。下記のように結合を実証した。
・様々な試薬とのインキュベーションのために、ファルコン容器に移す。
・適切な場合、脱脂のためにエタノールを加え、エタノールを除去し、スライドを乾燥させる。
・ブロッキングバッファーと室温で1時間インキュベートする。
・TTBSで5分間、2回洗浄する。
・TBSで5分間、1回洗浄する。
・試験対象のKBD(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリングされている)と共に、TBS/0.05％Tween20中、室温で2〜4時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・TBSで3回洗浄する。
・モノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(TBS+0.01％ブロッキング中で、1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]と共に、室温で1時間インキュベートする。
・TTBSで5分間、2回洗浄する。
・TBSで5分間、1回洗浄する。
・ホスファターゼ基質を添加する(NBT-BCIP;Boehringer MA1錠/水40ml、2.5分;水で停止)。
・肉眼でまたは顕微鏡を使用して、有色沈殿物を光学的に検出する。
KBD-Dと相互作用する抗ポリヒスチジン-APコンジュゲートの反応である青色の沈殿物が、KBD-Dで処理した透明の接着テープ上に見られた。陰性対照として、透明の接着テープをバッファーのみで処理した。明らかな青色呈色はここでは見られなかった。これらの結果は、KBD-Dが透明の接着テープ上の皮膚ケラチンに結合したことを示す。
実施例15：皮膚および毛髪への定量的結合
KBD-B(配列番号166)と比較しての皮膚および毛髪へのKBD-D(配列番号168)の結合強度を調査するために、定量試験を行った。この試験において、まず毛髪を、KBD-BまたはKBD-Dと共にインキュベートし、過剰なKBD-Bまたは-Dを洗い落とした。次いで、抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを、KBD-Bまたは-DのHis/タグを介してカップリングした。結合していない抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートを再び洗い落とした。結合している抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートは、無色の基質(TMB)を有色生成物に変換することができ、これを405nmでの光度測定によって測定した。吸収強度は、結合しているKBD-Bまたは-Dの量を示す。
皮膚への結合の試験を、下記のようにマイクロタイタープレート中においてヒトケラチン生成細胞で行った。
・PBS/0.05％Tween20で2回洗浄する。
・PBS中の1％BSA1mlを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で1時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・PBS(0.05％Tween20)中のKBD100μgを加え、穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、室温で2時間インキュベートする。
・上清を除去する。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・穏やかに回旋運動(900rpm)させながら、モノクローナルマウス抗タグHis6抗体1mlと室温で2〜4時間インキュベートする。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・ペルオキシダーゼ基質を加える(1ml/エッペンドルフ容器、組成は下記を参照されたい)。
・青色に呈色するまで反応させる(約90秒)。
・2M H2SO4100μlで反応を停止した。
・405nmでの吸収を測定した。
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中の42mM TMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウム、pH4.9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)。
KBD-Bと比較したKBD-Dの毛髪結合を特徴付けるために、下記の結合アッセイを行った：
毛髪(ヒト)5mgを、5mmの長さの断片に切断し、エッペンドルフ容器(タンパク質低結合性)に移した。
・脱脂のためにエタノール1mlを加える。
・遠心分離し、エタノールを除去し、毛髪をH2Oで洗浄する。
・遠心分離し、上清を除去する。
・PBS/0.05％Tween20 1ml中に試験対象のケラチン結合ドメイン(タグ(例えば、His6、HAなど)にカップリング)を加え、室温にて2時間穏やかに回旋運動させながら、インキュベートする。
・遠心分離し、上清を除去する。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・モノクローナルマウス抗タグ(His6またはHA)抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートを有する)(PBS/0.05％Tween20中で1:2000)[モノクローナル抗ポリヒスチジンペルオキシダーゼコンジュゲート、マウスで産生、凍結乾燥粉末、Sigma社製]1mlと共に、穏やかに回旋運動させながら、室温で2〜4時間インキュベートする。
・PBS/0.05％Tween20で3回洗浄する。
・ペルオキシダーゼ基質を加える(1ml/エッペンドルフ容器)。
・青色に呈色するまで反応を進める(90秒)。
・2M H2SO4100μlで反応を停止させる。
405nmでの吸収を測定した。
ペルオキシダーゼ基質(直前に調製)：
TMB溶液0.1ml(DMSO中42mM TMB)
+基質バッファー10ml(0.1M酢酸ナトリウム、pH4,9)
+14.7μlのH2O2(3％濃度)。
BSA=ウシ血清アルブミン
PBS=リン酸緩衝食塩水
Tween20=モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、nは約20
TMB=3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン。
Figure 2009517361
Figure 2009517361
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これらの結果は、タンパク質KBD-Dが、毛髪に結合することができ、皮膚にさらに強く結合することができることを示す(表10を参照されたい)。KBD-B(配列番号166)と比較して、KBD-D(配列番号168)の結合は、10％濃度までのSDS溶液による洗浄による影響はより弱い(表10aを参照されたい)。
実施例16：マレイミドカプロン酸の調製
Rich, D.H et al. (Rich, D.H et al. J. Med. Chem- 1975, 18 (10), 1004-1010)に記載されている方法に従って、マレイミドカプロン酸およびその類似体(N=1〜4、7、10および11)の合成を行った。
実施例17：カルボジイミドによって媒介されるパンテノールとのマレイミドカプロン酸のカップリング-方法A
マレイミドヘキサン酸1.11gおよびDMAP0.03gを、塩化メチレン30ml中のD-パンテノール3.14gに加えた。室温で、塩化メチレン25ml中のEDC1.05gを、1時間に亘って1滴ずつ加え、その後混合物を室温で2.5時間撹拌した。得られた溶液を、2N HCl25mlで2回洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーターで40℃/4ミリバールにて蒸発によって濃縮し、僅かに黄色い粘性残渣1.5gを得た。
反応生成物を、下記の方法に従ってHPLCにより分析した。
カラム:Waters Symmetry C18、5μm、250*4.6mm
溶離液A:水中0.1容量％のH3PO4、溶離液B:CH3CN中0.1容量％のH3PO4
グラジエント(溶離液Bに基づいて):0分(10％)、10分(100％)、20分(100％)、22分(10％)
流量:1ml/分、温度20℃、注入量5μl
検出:紫外吸光検出器(205nm)、BW=4nm。
この方法で、3種類のモノアシル化パンテノールは、7.0分、7.5分および7.6分で、ジアシル化パンテノールは9.0分、9.2分および9.6分で、およびトリアシル化パンテノールは10.7分で溶出する。
得られた生成物には、(HPLCピークの領域％に基づいて)22.2％、23.1％および24.7％までのモノ異性体、4.4％、8.5％および5.7％までのジアシル化異性体、0.9％までのトリアシル化化合物が含まれた(残りの成分は含めない)。
実施例18：酸塩化物としての活性化後のマレイミド-N-ヘキサン酸のパンテノールとのカップリング-方法B
塩化チオニル13.4gを、トルエン100ml中のマレイミドヘキサン酸8.0gに加え、混合物を80℃で3時間加熱する。溶液をロータリーエバポレーターで70℃/3ミリバールにて蒸発によって濃縮し、黄色の液体8.7gを得た。これを一晩静置すると凝固し、薄黄色の結晶となった(13C NMR(500MHz、CDCl3):173.4、170.7(2C)、134.1(2C)、46.8、37.3、28.0、25.5、24.5ppm)。
塩化マレイミドカプロイル8.5gの塩化メチレン100ml溶液を、塩化メチレン250ml中のD-パンテノール36.9gおよびトリエチルアミン4.32gに1時間に亘って室温で一滴ずつ加え、混合物を室温で2時間撹拌した。溶液を2N HCl60mlで3回および水60mlで2回洗浄し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエバポレーターで40℃/2ミリバールにて蒸発によって濃縮させた。オレンジ色〜茶色の油14gを得た。
下記の生成物の分布を、実施例17に記載したHPLC方法に従って決定した(HPLCピークの領域％に基づく)。1.3％、39.5％および32.8％までのモノ異性体、0.5％、0.7％および9.9％のジアシル化異性体、0.1％のトリアシル化化合物(残りの成分は含めない)。
実施例19：マレイミドカプロン酸のトコフェロールとのカップリング
実施例17と同様に、α-トコフェロール2.2gおよびトリエチルアミン1gを、MIC-Cl1.5gと反応させ、α-トコフェロールマレイミドカプロイラート(α-tocopherol maleimidocaproylate)2gを得た。
実施例20：マレイミドカプロン酸のアスコルビン酸とのカップリング
実施例18と同様に、α-トコフェロール0.9gおよびNEt31gを、MIC-Cl1.3gと反応させて、アスコルビン酸マレイミドカプロイラート1.6gを異性体混合物として得た。
実施例21：マレイミドカプロン酸のアスタキサンチンとのカップリング
実施例18と同様に、EDC0.3gおよびDMAP0.01gを有するアスタキサンチン0.2gをマレイミドカプロン酸0.35gと反応させ、マレイミドカプロイル-アスタキサンチン0.2gを異性体混合物として得た。
下記の表11に一覧表示されているエフェクターリンカー分子は、実施例17〜21に従って調製することができ、また調製することができた。表11に一覧表示されているエフェクター分子の全ては、一般式1、1b、1c、2、4または5に記載のリンカー分子と同様の方法で好ましくはカップリングすることができる。
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
Figure 2009517361
実施例22：パンテノールのKBD-B(配列番号166)へのエフェクターカップリング
マレイミドカプロン酸リンカー(MICリンカー)を介してパンテノールをカップリングするために、KBD-B(配列番号166)のシステインを使用した。したがって、KBD-B(配列番号166)は、4個のシステインを有した。これらのうち、2個のシステインは、構造の内側にあり、エフェクターのカップリングのために利用可能ではない(結晶構造から認識できる)。N末端(アミノ酸位置14および83、配列KBD-B(配列番号166)を参照されたい)に近い残りの2個のシステインは、エフェクターカップリングのために利用可能である。
カップリングすることのできるパンテノール-MICを、システインの2個の遊離SH基の少なくとも1個を介して、KBD-B(配列番号166)にカップリングした。これによってマレイン酸ジイミド(maleic diimide)の二重結合上のシステインの求核攻撃がもたらされた(図5)。
様々な試験バッチ(実施例24を参照されたい)の後、効率的なカップリング方法を確立し、これをカップリング混合物5gのために使用した。このために、10％濃度MIC-パンテノールのエタノール溶液1mlを、20mg/mlのKBD-Bのリン酸バッファー溶液250ml(pH7.5)に加え(約1mg/mlのより低い濃度を使用することも可能である)(KBD-B:MIC-パンテノールの比=1:2)、混合物を室温にて1時間注意深く振盪した。
実施例23：パンテノールのKBD-D(配列番号168)へのエフェクターカップリング
マレイミドカプロン酸リンカー(MICリンカー)を介してパンテノールをカップリングするために、システインをKBD-Bと同様にKBD-D(配列番号168)において使用することもできる。したがって、KBD-D(配列番号168)は、24個のシステインを有する。さらに、カップリングすることができるシステイン基は、部位特異的突然変異誘発によって部位特異的な様式で導入することができる。
したがって、カップリングすることのできるパンテノール-MICを、システインの少なくとも1個の遊離SH基を介してKBD-D(配列番号168)にカップリングすることができた。このようにして得たKDB-D-パンテノールエフェクター分子を、実施例58〜75に記載するように化粧用配合物中に使用することができた。
下記の表12および表12aに一覧表示するケラチン結合エフェクター分子は、実施例17〜23により調製し、また調製することができる。そこに一覧表示したエフェクターリンカー分子の全ては、配列番号2、4、6、8、10、12、14、40、42、44、46、48、146、150、153、156、157、158、160、162または164によるケラチン結合タンパク質に、特に好ましくは配列番号168により示されるKBD-Dタンパク質に、類似の方法で、好ましくはカップリングすることができる。
Figure 2009517361
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実施例24：カップリング成功の試験(エルマン試験)
エフェクターカップリングの成功を、2種類の異なる試験によってモニターした。
(iii)エフェクターカップリングの前および後の、タンパク質中の遊離Cys-SH基の数を決定することができるエルマン試験。ここで、カップリング後の遊離SH基の顕著な減少は、良好な反応進行を示す。
(iv)カップリングしているパンテノールの有無にかかわらず、毛髪へのKBD-Bの結合を測定することができる活性試験。良好な反応手順では、カップリングしていないKBDと比較してKBD-パンテノールの活性を減少させるべきではない(実施例22を参照されたい)。
効率的なカップリングを確実にするために、様々な試験バッチを行い、異なる温度およびKBD-B/パンテノール-MIC混合比を試験した。
次いでこれらのバッチを、エルマン試験を使用して下記のように試験した。
必要な材料：
・エルマン試薬:0.1Mリン酸ナトリウムバッファー中の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)4mg/1ml
・0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)
・システイン溶液(システイン塩酸塩一水和物26.3mg/リン酸ナトリウムバッファー100ml)
溶液は使用の直前に調製し、また調製しなければならない。
1. いずれの場合にも、25μl、50μl、100μl、150μl、200μlおよび250μlシステイン溶液を、較正曲線のために試験管(13×100mm)にピペットで移した。測定予定のタンパク質試料を、別々の試験管(容量<=250μl)に注いだ。試験予定のKBDのうち、反応混合物当たり少なくとも1mgの量を分注した。試験管の場合、次いで全容量をいずれの場合にもリン酸ナトリウムバッファーで250μlに調節した。(必要なKBD1mgのために)250μlの試料の容量を超えた場合は、2においてリン酸ナトリウムバッファー2.5mlを注ぎ足すときにこれを考慮した。
2. いずれの場合にも、エルマン試薬50μlおよびリン酸ナトリウムバッファー2.5mlを添加する。短時間混合し、RTで15分間インキュベートする。
3. 412nmでの吸収を測定する。
4. 較正曲線を作成し、プロットし、測定対象のタンパク質試料の値を読み取る。
エルマン試験の評価(表13)は、KBD-B:MIC-パンテノールの混合比が1:2の場合、遊離チオール基の2/3がMIC-パンテノールにカップリングできることを示す。温度は、反応の過程にあまり影響を与えないようである。
Figure 2009517361
実施例24a：KBD-B-パンテノールの毛髪結合活性
KBD-Bがまた、カップリングしているパンテノールと共にでも毛髪に結合するかどうかを確認するために、定量的結合アッセイを行った(図6を参照されたい)。この試験において、毛髪をまずKBD-B-パンテノールと共にインキュベートし、結合していないKBD-B-パンテノールを洗い落とした。次いでペルオキシダーゼを、KBD-BのHisタグを介して結合させた。結合していないペルオキシダーゼを、再び洗い落とした。結合しているペルオキシダーゼは、無色の基質(TMB)を着色した生成物に変換させることができ、これを測光法によって405nmで測定した。吸収強度は、結合しているKBD-B-パンテノールの量を示す。比較試料として、パンテノールを伴わないKBD-Bを選択した。試験の結果を図7において示す。
図7は、反応温度も、パンテノールがカップリングしたKBD-Bの活性に決定的な影響を与えないことを示す。1:2までのKBD-B:パンテノール混合比で、カップリングしたタンパク質の活性は、事実上一定のままである。1:4を上回る混合比の場合のみ、毛髪結合活性は減少する。もはや選択的ではないタンパク質構造中にあるリジンまたはシステインへのカップリングが、これに関与している可能性があり、それはタンパク質のアンフォールディング、したがってより乏しい毛髪カップリングをもたらしている可能性がある。
全体的に、活性試験およびエルマン試験のデータは、KBD-B-パンテノールカップリングは、室温にて1:2のKBD-B:MIC-パンテノールの反応比で非常に容易に進行し、KBD-B-パンテノールを大量に生成することができることを示す。
本発明による皮膚化粧用調製物
マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例22に従い生成されるケラチン結合エフェクター分子(配列番号166により示されるケラチン結合ドメイン)を含む、本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する。下記の実施例において、前記ケラチン結合エフェクター分子は、ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールと称される。ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールは、上記の他のケラチン結合エフェクター分子の全ての代表として、下記の実施例において特定されている。当業者であれば、実施例22による全ての他の特異的ケラチン結合エフェクター分子はまた、生成され下記で示した調製物中で使用できることを理解するであろう。
実施例25：デイケア用エマルジョンにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびB中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズし、撹拌しながら室温まで冷却する。
注記:配合物は、保護ガスなしで調製する。ボトリングは、酸素不透過性の容器、例えば、アルミニウム管へ行わなければならない。
実施例26：保護用デイクリームにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびBに組み込み、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却する。相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
実施例27：顔用クレンジングローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを溶解する。相Bを相A中に撹拌導入する。相Cを混合した相AおよびBに組み込む。相Dを溶解し、混合した相A、BおよびC中に撹拌導入し、ホモジナイズする。その後15分間撹拌する。
実施例27a：デイリーケアボディースプレーにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら加え、透明になるまで溶解する。
実施例28：スキンケアゲルにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:透明となるまで相Aを溶解する。相Bを膨潤させ、相Cで中和する。相Aをホモジナイズした相B中に撹拌導入し、ホモジナイズする。
実施例29：アフターシェーブローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bを溶解し、相A中に組み込み、ホモジナイズする。
実施例30：アフターサンローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。相Cで中和し、再びホモジナイズする。
実施例31：日焼け止めローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを約80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、再びホモジナイズする。
実施例32：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
実施例33：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
実施例34：フットバルサムにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、その後短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
実施例35：ビサボロール含有W/OエマルジョンにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約85℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
本発明のケラチン結合ドメインの配合物リスト-ヘアケア
実施例36：セッティング剤含有フォームコンディショナー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解するまで撹拌し、ボトリングする。
実施例37：フォームコンディショナー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、ボトリングする。
実施例38：フォームコンディショナー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら併せ、全てが溶解して透明な溶液が得られるまで撹拌し、ボトリングする。
実施例39：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
実施例40：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
実施例41：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。透明となるまで相Bの成分を溶解し、次いで相Bを相Aに撹拌導入する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
実施例42：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相CをAおよびBの混合物中で溶解し、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
実施例43：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相CをAおよびBの混合物中で溶解し、次いでpHを6〜7に調節する。相Dと共にボトリングする。
実施例44：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
スタイリングフォーム
Figure 2009517361
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
実施例45：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
実施例46：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを溶解させる。相Bを相Aに計量しながら加え、透明になるまで溶解する。pHを6〜7に調節し、相Cと共にボトリングする。
実施例47：スタイリングフォーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bの成分を1つずつ加え、溶解する。相Cと共にボトリングする。
実施例48：ケアシャンプー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例49：シャワー用ゲル
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例50：シャンプー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合し、溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例51：シャンプー
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら加え、溶解する。pHを6〜7に調節する。相Bを加え、約50℃に加熱する。撹拌しながら室温まで冷却する。
実施例52：保湿ボディーケアクリーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。短時間相Bをプレホモジナイズし、次いで相Bを相A中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び完全にホモジナイズする。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例53：保湿ボディーケアクリーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再びホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
実施例54：液体メーキャップ-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、再び完全にホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
実施例55
マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例23に従い生成されるケラチン結合エフェクター分子(配列番号166により示されるケラチン結合ドメイン)を含む、本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する。特異的ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメインMIC-パンテノールと称する。
特異的ケラチン結合エフェクター分子を、約5重量％濃度の水溶液として使用する。下記のデータは重量部である。
Figure 2009517361
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実施例56
5重量％濃度のケラチン結合ドメインMIC-パンテノール(水で100とする)を含有する(およびプラセボとして、ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールを含有しない)、実施例19のデイケア用エマルジョン100mgを、いずれの場合にも前腕の内側に塗布した。30分後に5人の被験体のうち4人が、ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールで処置した前腕の内側の皮膚に目立ってより良好な感触を見出した。5人の被験体全てが、本発明による活性成分で処置した側がかなりよりしっとりとする、すなわち乾燥が少なくなったことを感じた。
実施例57
下記の配合物において、少なくとも1種類の無機顔料、好ましくは酸化亜鉛および/または二酸化チタン、ならびに有機UV-AおよびUV-Bフィルターの組合せを含む化粧用日焼け止め調製物を説明する。
下記で特定した配合物を、当業者には公知の従来通りの方法で調製する。
マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例23により調製したケラチン結合エフェクター分子(配列番号166により示されるケラチン結合ドメイン)の含量は、活性成分の100％を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態で、そうでなければ水溶液の形態で使用することができる。水溶液の場合は、特定の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
Figure 2009517361
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マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例23に従い生成されるケラチン結合エフェクター分子(配列番号168により示されるケラチン結合ドメイン)を含む、本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する。前記ケラチン結合エフェクター分子を、下記の実施例においてケラチン結合ドメインMIC-パンテノールと称する。ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールを、上記の他のケラチン結合エフェクター分子の全ての代表として、下記の実施例において特定する。当業者であれば、実施例23による全ての他の特異的ケラチン結合エフェクター分子もまた、下記で示した調製物中で生成され使用できることを理解するであろう。
実施例58：デイケア用エマルジョンにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
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調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびB中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズし、撹拌しながら室温まで冷却する。
注記:配合物は、保護ガスなしで調製する。ボトリングは、酸素不透過性の容器、例えば、アルミニウム管に行わなければならない。
実施例59：保護用デイクリームにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを混合した相AおよびBに組み込み、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却する。相Dを加え、相Eを使用してpHを約6.5に調節し、ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
実施例60：顔用クレンジングローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを溶解する。相Bを相A中に撹拌導入する。相Cを混合した相AおよびBに組み込む。相Dを溶解し、混合した相A、BおよびC中に撹拌導入し、ホモジナイズする。その後15分間撹拌する。
実施例60a：デイリーケアボディースプレーにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を計量しながら加え、透明になるまで溶解する。
実施例61：スキンケアゲルにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:透明となるまで相Aを溶解する。相Bを膨潤させ、相Cで中和する。相Aをホモジナイズした相B中に撹拌導入し、ホモジナイズする。
実施例62：アフターシェーブローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bを溶解し、相A中に組み込み、ホモジナイズする。
実施例63：アフターサンローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。相Cで中和し、再びホモジナイズする。
実施例64：日焼け止めローションにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。相Cを約80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Dを加え、再びホモジナイズする。
実施例65：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
実施例66：日焼け止めローションにおけるKBDの使用-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aを約80℃に加熱し、相B中に撹拌導入し、3分間ホモジナイズする。同様に相Cを80℃に加熱し、混合した相AおよびB中にホモジナイズしながら撹拌導入する。約40℃まで冷却し、相D中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。
実施例67：フットバルサムにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBの成分を約80℃に別々に加熱する。相Bを相A中にホモジナイズしながら撹拌導入する。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、その後短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
実施例68：ビサボロール含有W/OエマルジョンにおけるKBDの使用
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約85℃まで加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び短時間ホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却する。
本発明のケラチン結合ドメインの配合物リスト-ヘアケア
実施例69：シャワー用ゲル
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相Aの成分を混合し溶解する。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例70：保湿ボディーケアクリーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。短時間相Bをプレホモジナイズし、次いで相Bを相A中に撹拌導入し、再びホモジナイズする。約40℃まで冷却し、相Cを加え、再び完全にホモジナイズする。クエン酸でpHを6〜7に調節する。
実施例71：保湿ボディーケアクリーム
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相Cを加え、再びホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
実施例72：液体メーキャップ-O/Wタイプ
Figure 2009517361
Figure 2009517361
調製:相AおよびBを別々に約80℃に加熱する。相Bを相A中に撹拌導入し、ホモジナイズする。撹拌しながら約40℃まで冷却し、相CおよびDを加え、再び完全にホモジナイズする。撹拌しながら室温まで冷却させる。
実施例73
マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例23に従い生成されるケラチン結合エフェクター分子(配列番号168により示されるケラチン結合ドメイン)を含む、本発明による皮膚化粧用調製物を下記に説明する。特異的ケラチン結合エフェクター分子は、下記の実施例においてケラチン結合ドメインMIC-パンテノールと称する。
特異的ケラチン結合エフェクター分子は、約5重量％濃度の水溶液として使用する。下記のデータは重量部である。
Figure 2009517361
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実施例74
5重量％濃度のケラチン結合ドメインMIC-パンテノール(水で100とする)を含有する(およびプラセボとして、ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールを含有しない)、実施例19のデイケア用エマルジョン100mgを、いずれの場合にも前腕の内側に塗布した。30分後に5人の被験体のうち4人が、ケラチン結合ドメインMIC-パンテノールで処置した前腕の内側の皮膚に目立ってより良好な感触を見出した。5人の被験体全てが、本発明による活性成分で処置した側がかなりよりしっとりとする、すなわち乾燥が少なくなったことを感じた。
実施例75
下記の配合物において、少なくとも1種類の無機顔料、好ましくは酸化亜鉛および/または二酸化チタン、ならびに有機UV-AおよびUV-Bフィルターの組合せを含む化粧用日焼け止め調製物を説明する。
下記で特定した配合物は、当業者には公知の従来通りの方法で調製する。
マレイミドカプロン酸リンカーを介してパンテノールにカップリングしている、実施例23に従い調製したケラチン結合エフェクター分子(配列番号168により示されるケラチン結合ドメイン)の含量は、活性成分の100％を示す。本発明による活性成分は、純粋な形態で、そうでなければ水溶液の形態で使用することができる。水溶液の場合は、特定の配合物中の脱塩水の含量を調節しなくてはならない。
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ケラチン結合ドメインBを発現するためのpQE30-KBD-Bのベクターマップである。 ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib15のベクターマップである。 ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib16のベクターマップである。 ケラチン結合ドメインBを発現するためのpLib19のベクターマップである。 活性化パンテノールのKBD-Bのシステインへのカップリング反応(表11によるエフェクターリンカー分子137)を示す。 定量的KBD活性試験を示す模式図である。Hisタグ抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートが、Hisタグを介して、皮膚または毛髪に結合しているKBDにカップリングする。ペルオキシダーゼは呈色反応を触媒し、その最終生成物は黄色であり、これは測光法で測定することができる。 22℃および4℃の反応温度での、様々なKBD-B:パンテノール混合比の定量的毛髪活性試験の測光値を示すグラフである。 大腸菌におけるタンパク質生成のためのKBD-D発現ベクターを示す。

Claims (19)

  1. 少なくとも1つのヒドロキシ官能基またはアミノ官能基を担持しているエフェクター分子(i)をケラチン結合ポリペプチド(ii)上に、チオエステル結合、エステル結合、チオエーテル結合、エーテル結合およびアミド結合からなる群から選択される結合ができる少なくとも2つのカップリング官能基を有するリンカー分子(iii)を使用してカップリングすることによって、ケラチン結合エフェクター分子を生成する方法であって、
    (a)第1のカップリングステップにおいて、まず前記エフェクター分子(i)を、エステル結合またはアミド結合を介して、前記リンカー分子(iii)に結合させ、
    (b)さらなるカップリングステップにおいて、(a)からの反応生成物を、前記リンカー分子(iii)のまだ遊離のカップリング官能基を介して、前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)と結合させる、上記方法。
  2. 前記リンカー分子(iii)と(a)に記載した前記エフェクター分子(i)とのカップリングが、カルボジイミド、無水物または酸塩化物によって媒介されるエステル化反応である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記エフェクター分子(i)が、色素、光防護剤、ビタミン、プロビタミン、カロテノイド、抗酸化剤および過酸化物分解剤からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、ヒトの皮膚、毛髪または爪のケラチンに対して結合親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 使用される前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、
    (a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つを含み、または
    (b)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、186または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドに相当する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 使用される前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)が、
    (a)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
    (b)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169に示される配列の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む核酸分子、
    (c)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170の配列により示されるポリペプチドをコードする核酸分子、
    (d)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、145、149、152、159、161、163、165、167または169により示される配列の少なくとも1つに相当する核酸配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子から置換、欠失または挿入によって誘導される、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の少なくとも1つと少なくとも40％同一でありかつケラチンに結合することができるポリペプチドをコードする核酸分子、
    (e)(a)〜(c)に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体によって認識されるポリペプチドをコードする核酸分子、
    (f)ストリンジェントな条件下で(a)〜(c)に記載の核酸分子とハイブリダイズする、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
    (g)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも15ヌクレオチドを含む(a)〜(c)に記載の核酸分子またはその部分断片をプローブとして使用してDNAバンクから単離することができる、ケラチン結合タンパク質をコードする核酸分子、
    (h)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170に示されるアミノ酸配列の1つを逆翻訳することによって生成することができる核酸分子
    からなる群から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む核酸分子によりコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記リンカー分子(iii)が、少なくとも2つの異なるカップリング官能基を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記リンカー分子(iii)が、マレイミド基を有する、請求項７に記載の方法。
  9. 使用されるリンカー分子(iii)が、式1：
    Figure 2009517361
     (式中、「n」は0〜40の整数に相当する)のカルボン酸担持マレイミドである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記リンカー分子(iii)がマレイミドカプロン酸である、請求項９に記載の方法。
  11. (h)使用される前記ケラチン結合ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、146、150、153、156、157、158、160、162、164、166、168または170により示される配列の1つを含み、
    (i)使用される前記リンカー分子(iii)が、マレイミドカプロン酸であり、かつ
    (j)前記エフェクター分子(i)が、パントテン酸、パンテノール、パンテノールのエステル、パンテノールのエーテル、およびカチオン誘導化パンテノールからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記エフェクター分子(i)が、リンカー分子(iii)を介して前記ケラチン結合ポリペプチド(ii)と間接的にカップリングしており、ただし、前記ケラチン結合エフェクター分子の生成の間に、マレイミドがリンカー分子(iii)として使用されておらず、配列番号166により示されるポリペプチドがケラチン結合ポリペプチド(ii)として使用されておらず、かつ蛍光色素がエフェクター分子(ii)として使用されていない、ケラチン結合エフェクター分子。
  13. 請求項１１により生成されたケラチン結合エフェクター分子。
  14. 皮膚化粧料における、請求項１２および１３に記載の前記ケラチン結合エフェクター分子、または請求項１〜１１により生成された前記ケラチン結合エフェクター分子の使用。
  15. 前記皮膚化粧料が、皮膚保護組成物、スキンケア組成物、皮膚洗浄組成物、毛髪保護組成物、ヘアケア組成物、毛髪洗浄組成物、毛髪着色剤または装飾用化粧品である、請求項１４に記載の使用。
  16. 皮膚化粧用活性エフェクター分子を、皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪に塗布する方法であって、
    (k)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、かつ
    (l)(k)によるケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として皮膚、毛髪、ならびに/または指の爪および足指の爪に塗布する、
    上記方法。
  17. 皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪上で皮膚化粧用活性成分の滞留時間を増加させる方法であって、
    (m)皮膚化粧用活性成分を、ケラチン結合ポリペプチドにカップリングさせ、
    (n)(m)による前記ケラチン結合エフェクター分子を、皮膚化粧用調製物の成分として皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に塗布し、かつ
    (o)前記活性成分が、ケラチン結合ドメインを介して、皮膚、毛髪、および/または指の爪もしくは足指の爪に間接的に結合する、
    上記方法。
  18. 式2：
    Figure 2009517361
     (式中、「n」は0〜40の整数である)の化合物。
  19. 請求項１２および１３に記載の前記ケラチン結合エフェクター分子、または請求項１〜１１により生成された前記ケラチン結合エフェクター分子を含む皮膚化粧料。
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