JP2009516645A - 抗菌デカペプチド口腔衛生処置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】成長したバイオフィルムを処置する、口腔衛生を促進するための方法は、バイオフィルムの機械的な分断の後にKSLを適用する口腔環境に、抗菌ペプチドKSLおよび界面活性剤を適用する工程を含む。KSLを含む歯垢予防チューインガムは、持続的な放出の口腔衛生処置を提供する。
【選択図】図11
Description
最近、種々の天然資源から分離された抗菌ペプチドが、その原核生物に対する選択性および微生物耐性をできるだけ抑えるという期待から、注目を集めている。その抗菌活性を改善することを目標に、これら天然ペプチドの類縁体が合成されている。合成組み合わせライブラリー技術を用いて新規の抗菌デカペプチド(KSL)が開発された。このペプチドおよびその類縁体のいくつかは、広い範囲の抗菌活性を持つとともに、虫歯の発症および歯垢の形成に関連する口腔細菌株の増殖を抑えることが本発明者によって示されている。一次構造は以下のとおりである。
歯垢防止剤用の媒体としてのチューインガムの使用は、実際的な観点およびコンプライアンスの観点から魅力的である。ガムの利点は、それが普通、すすぎ剤や歯磨き剤よりも長く口中に保持されることである。したがって、チューインガムに含まれる活性剤は、唾液中に上手く放出されれば、種々の受容部位に結合する十分な時間を有するであろう。KSLもまた5つのリシン残基を含有するカチオン性分子なので、歯の表面との、および唾液における酸性の糖タンパク質との静電気的相互作用の可能性を有すると考えられる。
以下の実施の説明および実施例によって、本発明の新規な方法、手段および化合物が当業者に明らかにされる。
A.抗菌デカペプチド(KSL)のチューインガム
1.材料および方法
1.1 材料
自動ペプチド合成機(モデル90、ケンタッキー州、ルイスビレのAdvanced Chem Tech社)により、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学反応を用いた標準の固相法によってKSL(MW=1250Da)を合成し、上述のようにその純度を決定した[7]。ガム基材(SMILY2A)は、Gum Base社(イタリア、ミラノ)から得た。d−ソルビトールおよびd−マンニトールはSigma社(ミズーリ州、セントルイス)から入手した。アセトニトリル(HPLC等級)およびジメチルスルホキシド(DMSO)は、Fisher Scientific(ニュージャージー州、フェアローン)から購入した。トリフルオロ酢酸(TFA)はピアース(イリノイ州、ロックフォード)から入手した。そのほかの化学物質はすべて分析等級であり、市販品を入手して使用した。
1.2 KSLの高速液体クロマトグラフィによる分析
プロスフェアC−18ガードカラム(4.6×7.5mm、イリノイ州、ディアフィールドのAlltech社)を有するプロスフェアC−18分析用カラム(4.6×250mm、イリノイ州、ディアフィールドのAlltech社)を用いたRP−HPLCによってKSLを分析した。移動相A(水中の0.1%TFA水溶液)および移動相B(アセトニトリル中0.1%TFA)による勾配溶出を行った。KSLは、流速1.0mL/分にて80:20〜70:30(移動相A:B)の線形勾配により8分間で溶出された。総稼動時間は16分で、注入容量は40μLだった。215nmでのUV検出によってクロマトグラムを記録した。
1.3 安定性試験
脱イオン水における10mg/mLのペプチド原液を用いてKSLの試験溶液を調製した。0.1Mの緩衝液濃度で、酢酸ナトリウム緩衝液(pH4)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)およびホウ酸ナトリウム緩衝(pH9)液中でKSLペプチドの分解を調査した。200μg/mLのKSLを含有する各緩衝溶液を温度制御したオーブンにて、それぞれ25℃、37℃および55℃でインキュベートした。所定の時間で試料を取り出し、前記のHPLC条件下で分析した。人工唾液中で37℃で3日間にわたってKSLの安定性を調査した。実際の使用条件を模倣する試みとして、試験管内の放出試験に人工唾液を使用した。人工唾液の成分は、以下のとおりである:塩化ナトリウム:0.844g、塩化カリウム:1.200g、塩化カルシウム2水和物:0.193g、塩化マグネシウム6水和物:0.111g、リン酸水素二カリウム:0.342gを水で1000mLにする。塩酸溶液によってpHをpH5.7±0.1に調整した[26]。
1.4 ヒドロキシアパタイトディスクとの相互作用
37℃の人工唾液中のHAディスク(サイズ:直径0.38インチ×厚さ0.06〜0.08インチ)とKSLとを相互作用させることによって、歯のような素材に対するKSLの親和性を評価した。歯の表面を模倣するために、ろ過したヒト唾液中で2時間HAディスクを予備処理した(HAディスク4個/ヒト唾液4mL)。朝、朝食の前に3人の健常な男性提供者からヒト全唾液を採取した。採取後、直ちに唾液を12,000rpmで20分間遠心分離し、0.45μmの膜フィルターにより浮遊物をろ過した。HAディスクは、ヒト唾液で調整した後、人口唾液ですすぎ、37℃のKSL溶液(人工唾液中、0.5mg/mL)4mLに加えた。対照として、未処理のHAディスクを直接37℃のKSL溶液に加えた。18サイクル/分の速度で垂直回転する回転ホイールに試料バイアルを搭載した。所定の時間に試料を取り出し、遠心分離し、浮遊物をRP−HPLCによって分析した。
1.5 チューインガムの調製
上述した手順[8]に従ってチューインガム組成を調製した。融解するために、ガム基材を50〜60℃の間の温度で加熱した。ガム基材が適当な流体粘度になったら、そのほかの成分とともにKSLを微粉末として加えた。温度を一定に保持する一方で、乳鉢にてガム基材と成分を混合した。混合後、均質なチューインガムを押し出し、類似の形状およびサイズの四角形に切断し、室温にて一晩置いて固くした。ガムの組成は以下のとおりであった。550mgのガム基材、420mgのソルビトール、10mgのマンニトール、10mgのサッカリン、および10mg、20mgまたは30mgのKSL(全重量:約1g)。
1.6 試験管内の放出試験
2つのモジュール(AB FIA社、スウェーデン、ルンド)(図1)からなる試験管内咀嚼放出装置を用いて、チューインガムからのKSLの試験管内放出試験を行った。各モジュールは温度自動調節された(サーモスタットの)ガラスセルからなり、その中には、上下の咀嚼板を保持する鉛直方向を向いた2つのピストンが取り付けられている。40mLの人工唾液でセルを満たし、チューインガムを下側の咀嚼板上に置いた。咀嚼処理は、上面のねじりの動きと組み合わせた下面の上下のストロークからなり、この運動が、チューインガムの咀嚼および試験培地の撹拌を提供する。試験培地の温度は37℃に制御され、咀嚼頻度は、1分当たり50±2ストロークだった。所定の時間間隔で400μLの浮遊物を取り出した。各試料採取の後、溶解培地を新鮮な人工唾液に取り換えた。KSLの放出量はRP−HPLCによって測定した。
1.7 生体内の放出試験
3人の被験者によって噛み終え試験を行った。各被験者は、所定の時間(5分、10分および20分間)1分当たり30回〜40回の咀嚼回数にて各種ガムの一片を咀嚼した。所定の時間、ガムを咀嚼した後、ガムの中に残っているKSLの量を分析した。KSLを抽出するために、ガムを50〜60℃で5分間加熱し、次いでアセトニトリルとDMSO(1:1)との混合物5mLを加えた。5分間十分に混合した後、10mLの0.1M酢酸緩衝液(pH4)を加え、室温で混合物を30分間活発に撹拌した。試料を遠心分離し、0.45μmの膜フィルターにより浮遊物をHPLCバイアルの中にろ過した。
2.結果および考察
2.1 KSLのHPLC分析
KSLの分析方法として、勾配溶出を用いた逆相のHPLC法が開発されている。HPLC条件下で、脱イオン水中のKSLのスタンダードは、保持時間7.0分で単一ピークとして検出された(図2a)。KSLの検出に関する線形性の相関係数は、ペプチド濃度20〜400μg/mLの範囲で0.999を上回り、係数変動<5%のこれらの濃度でアッセイは再現可能であった(n=3、アッセイ内およびアッセイ間)。HPLC法により、55℃で3日間、ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9)中で生成された分解化合物から無傷のKSLを分離することができた(図2b)。上述した[27]ようなペプチド結合の切断および酸化が関与する可能性が高い、分解生成物を同定し、または分解経路を決定する試みは行わなかった。
2.2 水溶液中での化学的安定性
図3は、55℃の種々のpHの溶液中での時間に対するKSLの残量比率の半対数プロットを示す。pHは、一次速度式に近似的に従う、観察された分解反応速度によって、KSLの分解率に影響を及ぼした。KSLの分解は25〜55℃の緩衝溶液中でも調査した。回帰分析による、時間データに対する濃度の半対数プロットの傾きから、分解率定数を得た。KSLの観察された反応一次速度定数を表1に記載する。KSLの安定性に関する最適pHは規定できなかったが、最も好ましい安定性は、pH4の酢酸緩衝液で現れた。55℃でのKSL分解の半減期は、pH4で165.0日、pH7.4で13.8日、pH9で4.7日であった。温度と速度定数との関係は、アレニウスプロットによって図4に示す。傾きに由来する活性化エネルギー(Ea)は、pH4で6.7kcal/mol、pH7.4で13.6kcal/mol、およびpH9で17.9kcal/molであった(表1)。KSLは人工唾液中でも安定であった(データは示さず)。37℃にて3日間インキュベートした後、HPLCで検出される分解ピークはなかった。
2.3 HAディスクとの相互作用
歯のような素材および唾液タンパク質に対するHAディスクを用いたKSLの親和性を図5に示す。図5aは、吸着の平衡が5分以内に生じ、およそ20%のKSLが8個のディスクに吸着したことを示す。KSLの吸着は、HAディスクの量およびディスク上のタンパク質被覆(コーティング)に依存した(図5b)。未処理のHAディスクと、ヒト唾液に浸すことによってタンパク質を被覆されたHAディスクとを比較すると、4個のHAディスクを使用した場合、結合に識別可能な差異があった。これは、限られた数の結合部位および被覆されたHAディスクに対する大きな吸着のためかもしれない。このことは、KSLが5つのリジン残基を含有するカチオン性分子なので唾液中の酸性糖タンパク質との静電気的相互作用に大きな潜在力を有するため、酸性の唾液タンパク質が働いたことを示唆している。口腔におけるクロルヘキシジンの保持は歯垢形成の抑制に直接関係することが強く示唆されている[17〜19]。BarnettらはHAに対するクロルヘキシジンの結合の生体内での歯垢予防効果との相関を報告した[28]。この研究に示されるように、HAに対するKSLの親和性は、歯垢形成に関連する口腔細菌株に対する抗菌活性を伴う歯垢予防剤としての可能性を示唆している[7]。
2.4 チューインガムからの試験管内での放出
試験管内での溶解および薬剤放出試験のための装置および方法については、固形投与形態が記載されている[23]。しかしながら、薬剤の放出には連続的な咀嚼が必要とされるので、これらの方法はチューインガムからの薬剤の放出を調査するのに容易に適合させられない。Kvist外によって開発された装置は、チューインガム組成の試験管内の薬剤放出試験に有用性を示した[24,25]。
2.5 チューインガムからの生体内での放出
生体内の噛み終え試験を行って、試験管内の結果と生体内の性能との間で薬剤放出パターンを相関させた。訓練を受けた被験者がそれぞれ5分間、10分間、20分間ガムを噛み、次いで残留するKSLをチューインガムから抽出した。抽出方法を有効にするために、それぞれ10mg、20mgおよび30mgのKSLを含有するガムを調べた。3種のガムの抽出収率は、負荷量に対して84.3〜88.6%の範囲内であった。抽出したKSLのHPLCによる分析は、標準KSLと同一の保持時間で単一ピークを示した。
3.結論
KSLは、ヒト唾液で予備処理されたHAディスクに高い親和性を示し、チューインガムに上手く調合された。咀嚼装置を用いて試験管内で、および噛み終え法によって生体内で有望な放出特性が得られた。この試験は、KSLが制御された仕方でチューインガムから放出され、口腔に効果的に保持されて歯垢の形成を抑制することを示唆している。
B.口腔バイオフィルムの制御
1.材料および方法
抗菌デカペプチド、KSLの合成
自動ペプチド合成機(モデル90、Advanced Chem Tech社、ケンタッキー州、ルイスビレ)で、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学反応を用いた標準の固相法によってKSL(KKVVFKVKFK−NH2)を合成し、以前記載された(Concannon et al.,2003)ようにその純度を決定した。
1.2 緩衝液および培地
以前記載された(Shellis,1978)ように人工唾液を調製した。Williamsによって記載された唾液系培地(Williams,1998)を試験管内プラークアッセイシステムに使用した。
唾液の採取および唾液細菌の分離
ヒトの唾液を採取する方法および唾液細菌を単離する方法は以前記載された(Concannon et al.,2003)。試験は、ウォルター・リード陸軍研究所の治験審査委員会によって認可され、被験者すべてからインフォームドコンセントを得た。
二重フローセルシステム
この試験で使用された二重フローセルシステムは、Herles外(Herles et al.,1994)によるケモスタットフローセルを改変し、我々の設計およびBioSurface Technologies社(モンタナ州、ボーズマン)の仕様に従って構成された(図1)。フローセルは2つの区画からなり、それぞれ、その上にバイオフィルムが形成されるGeディスク(直径10mm、厚さ1.8mm)を保持するための3つの凹部を持つポリカーボネートのフローチャンバーを有している。Geディスクには、微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いて未染色のバイオフィルムの視覚化を可能にする反射面を設けた。
口腔バイオフィルムに対するKSLの殺菌活性
二重フローセルシステムと併せて、Guggenheimら(Guggenheim et al.,2001)によって記載されたバイオフィルム形成の試験管内歯垢モデルの変形例を用いて、発達した口腔バイオフィルムに対する、試験された抗菌剤およびそのほかの作用剤の効果を判定した(詳細は付録1を参照のこと)。唾液細菌がバイオフィルムを形成するための基板としてHAディスク(Clarkson社、ペンシルベニア州、サウスウイリアムズポート)を採用した。
3.結果
二重フローセルで形成された口腔バイオフィルムとKSLとの相互作用
KSLが抗バイオフィルム活性を有するかどうかを判定するために、我々は、口腔バイオフィルムの発達に対する種々の濃度のKSLの効果を調べた。DIC顕微鏡を用いて、我々は、フローセルの接種後2時間で、フローチャンバーにおいて唾液で調整したGe表面への唾液細菌の付着を認めた(図2A、aおよびd;図2B、aおよびc)。細菌が表面に付着した後、KSLを含むまたは含まない培養培地でフローチャンバーを連続して潅流した。KSLを欠く培地で潅流したフローチャンバーでは、接種後5時間で微細コロニーが形成され(図2A、b)、発達し続けて8時間後にはフィルム状の構造になった(図2A、c)。対照的に、50□g/mLのKSLは、バイオフィルムの発達を中断させた。細菌は付着したままだったが、微細コロニーやフィルム状の構造を形成することはできなかった(図2A、d〜f)。さらに、10□g/mLのKSLは、バイオフィルム形成の抑制に部分的に有効だった。接種後8時間で微細コロニーが形成されたが(図2B、c〜d)、未処理の付着した唾液細菌はフィルム状の構造を形成した(図2B、a〜b)。
無傷の口腔バイオフィルムおよび分断された口腔バイオフィルムとKSLとの相互作用
我々のフローセル実験は、成長した口腔バイオフィルムはKSLの影響を受けにくいことを示した。対照的に、発達の早い段階で付着した唾液細菌またはバイオフィルム細胞をKSLに晒すと、成長した増殖性のバイオフィルムへのさらなる発達が抑制された。この背景において我々は、試験管内プラークアッセイを用いて、発達した口腔バイオフィルムの組織化された構造が成長した口腔バイオフィルムのKSLへの耐性に寄与するかどうかを判定することに関心を持った。図4Aに示されるように、唾液で調整したHAディスク上に形成された無傷の発生後45時間の口腔バイオフィルムをKSLに晒すことによって生菌数が少し低下した(p<0.05)。生菌数の大きな低下は0.12%のクロルヘキシジンによって処理された無傷のバイオフィルムで認められた。これらのバイオフィルムをKSL処理の前に超音波処理によって機械的に分断した場合、dH2Oで処理した対照に比べて、KSLで処理した細胞の生存率が非常に大きく低下(1.8対数)した。同じ濃度のKSLで処理した無傷のバイオフィルムに比べて、分断したバイオフィルムの生存率に、同様に有意な低下があった。
界面活性剤の存在下での無傷の口腔バイオフィルムとKSLとの相互作用
バイオフィルムの組織化された構造が抗菌剤へのバイオフィルムの感受性に影響を与える場合があるので、我々は、試験管内のプラークアッセイを用いて、KSLによるバイオフィルム細胞の殺傷を促進することにおける界面活性剤、塩化ベンザルコニウムの効果を判定することに関心を持った。図4Bに示されるように、水による処理に比べて、塩化ベンザルコニウム(0.001%)存在下でのKSLは、クロルヘキシジンによって生じるのと同様の程度まで、発生後66時間の口腔バイオフィルムの生存率を有意に低下させた(1対数の低下を超えて)。KSL(200□g/mL)または塩化ベンザルコニウム(0.001%)単独では、これらバイオフィルムの生存率にあまり効果を有さなかった。これらの結果は、共焦点顕微鏡によって示される(図4C)ような処理された試料の生細胞/死細胞の染色によって確認された。
4.考察
分離された唾液細菌と一緒に取り外し可能でコロニー形成可能な表面を有する二重フローセルの使用によって、口腔バイオフィルムの形成に対する抗菌剤の効果を調べるための代替の方法が提供される。歯垢の元としてのヒト唾液細菌の使用は、これらの細菌が口腔における硬質組織および軟質組織に形成されるバイオフィルムに由来するので(Helmerhorst et al.,1999)、特に関係がある。システムによって処理群と陰性対照群との間で、非破壊的で直接的なバイオフィルムの発達の比較が可能である。
5.結論
KSLが口腔バイオフィルムの発達を妨害したという発見は、KSLが、歯垢が介在する歯科疾患を予防するための歯磨き剤に対する有益な添加剤となり得る可能性を生じる。KSLは分断された口腔バイオフィルム細胞を殺傷するのに有効だったので、これは特に関係がある。この分断は、口腔衛生処置の間の機械的な歯磨きおよび/または歯間磨き(フロス)によって生じさせることができるであろう。
Claims (17)
- 抗菌ペプチドと、界面活性剤とを含む口腔衛生処置剤。
- 前記抗菌ペプチドが、KSL(配列番号1)またはその誘導体を含む請求項1に記載の処置剤。
- 前記抗菌ペプチドが、KSL(配列番号1)である請求項2に記載の処置剤。
- 前記界面活性剤が、カチオン剤である請求項1に記載の処置剤。
- 前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項4に記載の処置剤。
- 前記界面活性剤が、塩化ベンジルおよび塩化ピリジンからなる群から選択される請求項1に記載の処置剤。
- 前記抗菌ペプチドおよび前記界面活性剤が、水性の口内洗浄液中で混合される請求項1に記載の処置剤。
- 成長したバイオフィルムを、抗菌デカペプチドおよび界面活性剤に接触させることを含む、成長した口腔バイオフィルムを処置する方法。
- 前記抗菌ペプチドが、KSL(配列番号1)を含む請求項8に記載の方法。
- 前記界面活性剤がカチオン剤である請求項9に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、塩化ベンザルコニウムである請求項10に記載の処置。
- 前記成長したバイオフィルムを接触させる前記工程が、成長したバイオフィルムを有する使用者の口内をKSLとベンザルコニウムと、を含有する溶液ですすぐことを含む請求項11に記載の方法。
- 成長したバイオフィルムを機械的に分断させることと、
前記分断されたバイオフィルムを抗菌デカペプチドに接触させることとを含む成長したバイオフィルムを処置する方法。 - 前記抗菌デカペプチドが、KSL(配列番号1)を含む請求項13に記載の方法。
- ガム基材と有効な量の抗菌デカペプチドとを含む、歯垢予防のチューインガム。
- 前記抗菌ペプチドが、KSL(配列番号1)を含む請求項15に記載のチューインガム。
- さらに界面活性剤を含む請求項16に記載のチューインガム。
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