CN101578104A - 抗菌十肽的口腔卫生处理 - Google Patents

Abstract

一种处理成熟生物膜从而促进口腔卫生的方法，所述方法包括以下步骤：对生物膜进行机械破坏之后，对口腔环境应用抗菌肽KSL和一种表面活性剂。一种包含KSL的抗菌斑口香糖，所述口香糖提供口腔卫生处理剂的持续释放。

Description

抗菌十肽的口腔卫生处理

技术领域

本发明涉及通过使用一种抗菌十肽、在表面活性剂或机械破坏的协助下，对形成的生物膜进行的处理。本发明还涉及含有一种抗菌十肽的口香糖作为持续抗菌斑剂的用途。更具体地说，本发明涉及KSL和表面活性剂或机械破坏在处理形成的口腔生物膜方面的用途，以及含有KSL的口香糖作为口腔卫生处理剂的用途。

计算机可读形式记录的序列表信息内容与书面纸张和光盘的序列表相同，没有新内容。

背景技术

人类的口腔生物膜是由形成于可定植(colonizable)表面上的不同且多物种的微生物群落组成的复杂三维结构(Foster等人，2004；Kolenbrander和London，1993；Kolenbrander和Palmer Jr，2004；Marsh和Bradshaw，1995)。除了对细菌积聚有着重要影响的底物的物理和化学表面性质(Quirynen等人，2000)之外，口腔生物膜的形成包括一系列事件。其包括：一调节唾液导出膜(获得的唾液分泌薄膜)在可定植表面上的原始形成；主要定植物在获得的薄膜中存在的宿主来源受体分子上的附着；随后，次要定植物与附着的之前的定植物的相互作用；接着，粘附细菌的增殖(定植)；成熟的细菌群落的形成(Kolenbrander和London，1993；Marsh和Bradshaw，1995；Quirynen等人，2000)。这些群落中某些寄宿微生物不受控制的生长可能造成口腔疾病的发生(Loesche，1999)。

龋齿和牙周病的发生与牙菌斑有着密切的联系，牙菌斑是形成于齿面的唾液分泌薄膜吸附细菌或其聚集体而形成的结果。为了预防和处理菌斑相关的口腔疾病，通过杀菌和/或抑菌机理作用的抗菌剂受到了越来越多的关注。这些药剂有洗必泰、三氯生、金属离子、季铵化合物和香精油。

唾液分泌薄膜通过唾液蛋白的选择性吸附形成。唾液蛋白中的荷电基团与牙釉质中的相反电荷相互作用，薄膜中的酸性唾液蛋白主要带负电荷。因此，齿面或酸性唾液蛋白对药物的亲和性对于抑制菌斑的形成是一个重要的因素。洗必泰是一种具有强阳离子活性的双胍。之前指出过，洗必泰同细菌或酸性唾液组分的结合以及随后在口腔表面上的滞留直接关系到洗必泰抑制菌斑生长的程度。尽管洗必泰被视为现用的最有效抗菌斑剂，然而它有着一些缺点，如苦味、对味觉的损害、牙齿和舌头的可逆着色以及同牙膏中表面活性剂的相互作用。

在申请人共同未决的申请(U.S.No.10/795,514，其内容全部作为参考)中，本发明人揭示以下发现：可以使用抗菌十肽KSL及其类似物来预防生物膜的形成，也可以抑制口腔微生物的生长。

虽然显示出KSL在预防口腔生物膜形成上的有效性，KSL却对形成的生物膜没有多大影响。此外，虽然KSL在抑制口腔微生物生长上是有效的，但还未论证显示出在口腔卫生中使用KSL的可靠递送方法以及处理。能够理解，在没有流动水和牙刷的情况下，需要控制菌斑和口腔生物膜的方法。例如，战场上的士兵可能会数日或数周不刷牙。而且，通过洗必泰的缺点可知，需要一种感知的味觉更明显而且副作用更少的抗菌斑处理剂来确保处理的实际应用。

之前着重介绍了一些关于处理形成的生物膜以及使用抗菌剂作为抗菌斑剂的问题。此外，之前也着重介绍了在可靠配方和处理形成的生物膜的方法领域中长期存在但还未解决的需求。之前还着重介绍了在可感知配方以及当无法刷牙时处理牙菌斑的方法领域中长期存在但还未解决的需求。

发明内容

本发明克服了上述实际问题，并提供了新的优点。

最近，从多种天然原料分离得到的抗菌肽由于其对原核生物的选择性以及最大程度地降低微生物抗性的前景而受到了关注。为了提高它们的抗菌活性，合成了这些天然肽的类似物。通过使用合成组合库技术产生了一种新颖的抗菌十肽(KSL)。本发明人已经揭示了这种肽及其一些类似物具有宽范围的抗菌活性，并能抑制与龋的发展和菌斑的形成有关的口腔菌株的生长。其一级结构如下：

[Lys-Lys-Val-Val-Phe-Lys-Val-Lys-Phe-Lys-NH₂](序列1)

从实用性和顺应性角度考虑，口香糖作为一种抗菌斑剂的媒介的用途是很吸引人的。口香糖的优势在于它在口中的保留时间一般比嗽洗剂和牙膏的保留时间长。如果口香糖中的活性剂成功地释放到唾液中，活性剂便具有充足的时间来结合至多种接受位置。由于KSL同样是一种包含五个赖氨酸残基的阳离子分子，它同齿面和唾液中的酸性糖蛋白可能存在潜在的静电相互作用。

之前已经显示了KSL可有效阻碍生物膜的产生，而在成熟的生物膜上的有效性仍比较低。本发明人发现了意料之外的结果，当存在表面活性剂时使用KSL时，或当生物膜被机械破坏后使用KSL时，KSL对于成熟生物膜的生存能力有着重要的影响。因此，本发明揭示出KSL可以是预防菌斑引起的牙病的现有口腔卫生学的一种有益添加剂。

本发明人还发现KSL在口香糖配方中的用途不会遭受现有技术抗菌斑口香糖的缺点的影响，这些缺点例如是味道差、牙齿着色以及不能确保持续释放。

通过以下可行的说明和实施例，对于本领域技术人员而言，本发明的新颖方法、方式和化合物将是显而易见的。

附图说明

本发明将结合下面的附图加以描述：

图1示出一咀嚼设备和恒温测试单元。口香糖被置于上表面和下表面之间。咀嚼进程由下表面的上下击打以及上表面的剪切(扭转)动作组成。

图2示出KSL标准在水中的RP-HPLC色谱(a)和在55℃下于0.1M硼酸缓冲剂(pH9)中培养3天的色谱(b)。

图3示出55℃下在不同pH条件下的KSL降解动力学。

图4示出在不同pH缓冲剂中KSL降解的阿列纽斯图。

图5示出37℃下在人造唾液中KSL对HA盘的吸附关系图，其中(a)是KSL((0.5mg/ml)对于8个未处理HA盘的吸附曲线，(b)是KSL对于未处理和预处理HA盘20分钟的吸附曲线。预处理HA盘在37℃下在人唾液中浸渍2小时，然后用人造唾液洗涤，干燥并添加到KSL溶液中。

图6示出37℃下在人造唾液中KSL从口香糖制剂的体外释放。使用一咀嚼设备研究含有不同KSL加载量(5、10、20mg)的口香糖。

图7示出通过一咀嚼研究获得的KSL从口香糖制剂的体外释放。志愿者以预定次数咀嚼分别含有5、10、20mgKSL的口香糖，提取余量，并通过RP-HPLC分析。

图8A为双流动单元模型的原理图。(A)流动系统。箭头记号指出流动的方向。系统由14个标准Masterflex管(Cole-Palmer，Vernon Hills，IL)连接。对于带有KSL的生物膜的脉冲处理，带有两个包含各自处理和控制溶液的可注射注射器的注射泵(KD Scientific，Holliston，MA)直接通过一三向阀与各个流动室连接。

图8B示出一双流动单元。该流动单元由两个平行流动室组成，每个流动室包含三个凹陷用来放置Ge盘。每个隐室的内径和深度分别为10.25mm和2.0mm。在每个流动室的末端钻有用于流体进口和出口的2.0mm直径的孔。该流动室的一侧由聚碳酸酯底板，另一侧由一包括两平行60mm×24mm二号盖板玻璃的铝盖板所形成。

图8C是该流动室的横截面图，显示了该流动槽的尺寸(0.4mm深，13mm宽，25mm长)。

图9A和B示出通过DIC显微镜显示的在双流动单元中KSL对口腔生物膜产生的影响。(A)含有KSL(50□g/ml)媒介的生物膜流动单元的连续灌注防止生物膜的形成。显示在灌注不含KSL媒介的流动室中由粘附于经唾液调节的Ge表面的唾液细菌产生的生物膜的未处理生物膜细胞(a-c，阴性对照)的图像。经KSL(50□g/ml)处理的生物膜细胞(d-f)的图像。处理过的与未处理的并排图像由双流动单元平行室的接种之后2小时间隔(a，d)，5小时间隔(b，e)，和8小时间隔(c，f)获得。(B)以低浓度含KSL媒介(10□g/ml)灌注平行室在预防生物膜的形成上效果不佳。未处理的(a-b)和处理的(c-d)。图像由接种之后2小时间隔(a，c)和8小时间隔(b，d)获得。结果表示这三个实验之一。放大倍率，200X。标杆表示50□m。

图10示出在用不含KSL(a-c)和含KSL(50□g/ml)媒介(d-f)脉冲处理的Ge表面上口腔生物膜细胞的DIC图像。脉冲处理(在2小时的间隔中以0.2ml/min的速度进行30分钟)在接种后4小时(A)或6小时(B)开始。在接种后用KSL脉冲处理4小时而非6小时的流动室中，生物膜的生长被大大抑制。处理的与未处理的生物膜细胞图像由唾液细菌接种入双流动单元的平行室之后2小时间隔(a，d)，6小时间隔(b，e)和10小时间隔(c，f)来获得。该数据表示这三个单独实验之一的结果。放大倍率，200X。标杆表示50□m。

图11示出KSL对完整的和被破坏的生物膜的作用，以及KSL与表面活性剂的组合对生物膜的作用。(A)KSL对于通过唾液细菌在包覆有唾液的HA盘上形成的完整的生物膜以及使用体外菌斑化验被破坏45小时的生物膜的作用。使用Mann-Whitney试验对实验组(KSL处理的完整或被破坏的生物膜)与对照组(d水-处理的完整或被破坏的生物膜)之间CFU的log减少进行比较。单颗星表示KSL和d水-处理的完整生物膜(p＜0.05)之间存在统计学显著性差异。同样地，双颗星表示KSL和d水-处理的被破坏生物膜(p＜0.01)之间存在统计学显著性差异。虽然KSL导致处理的完整生物膜的CFU略有减少，但是洗必泰(CHX)导致完整生物膜的生存能力更多地降低。(B)对于采用体外菌斑系统在包覆有唾液的HA盘上形成的66小时寿命的完整口腔生物膜，杀藻胺在促进KSL杀菌活性方面的影响。用Kruskal-Wallis试验在包括对照组(d水-处理的)的不同处理组中比较CFU的log减少。单颗星表示KSL与杀藻胺(Bzl)组合处理和d水(p＜0.001)、KSL(p＜0.01)或Bzl(p＜0.01)处理的完整生物膜之间的统计学显著性差异。双颗星表示CHX和d水(p＜0.001)或Bzl(p＜0.05)处理的完整生物膜之间的统计学显著性差异。与d水处理的组比较，虽然单独使用KSL或Bzl时不会显著降低完整生物膜的生存能力，但是KSL和Bzl的组合使用对这些66小时寿命的口腔生物膜的生存能力具有显著影响(超过1个单位的log存活数量减少)。在经CHX处理的情况和KSL与Bzl组合使用的情况之间没有发现生存能力数有显著性差异。对于(A)和(B)，数据体现了三个独立试验之一的结果，每一个试验进行一式四份复样。标杆表示标准偏差。(C)在包覆有唾液的HA表面上生长的对照和经处理的生物膜的共焦成像。使用存活/死亡BacLight^TM生存能力试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)来评估不同处理下的生物膜细胞的生存能力。如厂商所述准备BacLight化验溶液，样本在黑暗中室温下着色15分钟。用水洗涤3次后，用装有Ar-Kr激光器(Zeiss LSM 510Meta)和水浸(长焦距)物镜的Axioplan光学显微镜观察样品。使用488nm的激发波长，发出的荧光通过500-530nm(SYTO 9，活的)和650-710nm(碘化丙啶，死的)两个独立发射滤波器来收集。与对照(1a和b)比较，对照显示大多数是绿色着色生物膜细胞(表示活的)，CHX(2a和b)或KSL与Bzl组合使用(5a和b)显著降低了生物膜的生存能力，表现为大多数是红色着色生物膜细胞(表示死的)。在所示浓度下单独使用KSL(3a和b)或Bzl(4a和b)对生物膜细胞的生存能力的影响较小。图片1a-5a代表通过生物膜的水平截面(xy)，而图片1b-5b是用不同试剂处理的生物膜(通过水平xy截面上的线条表示)的矢状(xz)图像。标杆代表50μm。

具体实施方式

本发明部分建立在以下发现之上：KSL及其类似物在与表面活性剂联合使用时对处理成熟生物膜具有协同效应。这些意料之外的惊奇结果在下面的实施例中阐述。根据本发明的这一方面，结合有表面活性剂的KSL可以是预防和处理口腔微生物即成熟生物膜生长的一种方法，特别是龋齿和菌斑。本发明的这一方面可以证明其适合于在不能刷牙的情况下在用于口腔卫生和处理的口腔卫生制剂中使用。

本发明还部分建立在以下发现之上：KSL及其类似物在与机械破坏生物膜联合使用时可以用于处理成熟生物膜。这些意料之外的惊奇结果同样在下面的实施例中阐述。根据本发明的这一方面，KSL结合刷牙之类的机械破坏，可以是预防和处理口腔微生物即成熟生物膜生长的一种方法，特别是龋齿和菌斑。本发明的这一方面可以证明其作为整个口腔卫生处理计划的一个部分的有效性。

本发明还部分建立在以下发现之上：KSL及其类似物可以用于口香糖配方中来提供一种持续抗菌斑剂。KSL口香糖配方的意料之外的惊奇结果在下面的实施例中阐述。根据本发明的这一方面，KSL及其衍生物可以作为口香糖配方的一部分来阻碍并预防菌斑的形成以及促进更好的口腔卫生。本发明的这一特性对于促进野外战士之类那些不能或不刷牙的人们更好的口腔卫生有着显著的优点。

本发明不同的优点和意料之外的结果将通过以下实施例进一步阐述。

A.抗菌十肽(KSL)口香糖

1.材料和方法

1.1.材料

在一个肽自动合成器(Model 90，Advanced ChemTech，Louisville，KY)中用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)化学方法通过标准固相步骤合成KSL(MW＝1250Da)，其纯度由之前所描述的[7]确定。口香糖基质(SMILY 2A)从Gum Base公司(Milano，意大利)获得。d-山梨糖醇和d-甘露醇从Sigma(St.Louis，MO)获得。乙腈(HPLC等级)和二甲亚砜(DMSO)从FisherScientific(Fair Lawn，NJ)购买。三氟醋酸(TFA)从Pierce(Rockford，IL)获得。所有其他化学药品均为分析纯并均为市售。

1.2.KSL的高效液相色谱分析

通过RP-HPLC，用带有Prosphere C-18保护柱(4.6x7.5mm，Alltech，Deerfield，IL)的Prosphere C-18分析柱(4.6x250mm，Alltech，Deerfield，IL)分析KSL。用流动相A(水中0.1％TFA)和流动相B(乙腈中0.1％TFA)执行梯度洗脱。在1.0ml/min流速下，KSL以80∶20至70∶30(流动相A∶B)的线性梯度洗脱。总运行时间为16min，注射量为40μl。色谱由215nm的紫外检测记录。

1.3.稳定性研究

采用去离子水中10mg/ml的肽储备溶液，制备KSL的测试溶液。在缓冲液浓度为0.1M的乙酸钠(pH4)、磷酸钠(pH7.4)和硼酸钠(pH9)缓冲液中测得KSL肽的降解。每个含有200μg/ml KSL的缓冲溶液在温控炉内分别于25℃、37℃和55℃培养。在预定时间取样并在上述HPLC条件下分析。在37℃的人造唾液中对KSL的稳定性进行超过三天的研究。在体外释放的研究中使用人造唾液，从而模拟真实的使用条件。人造唾液的成分如下：氯化钠0.844g；氯化钾1.200g；二水合氯化钙0.193g；六水合氯化镁0.111g；磷酸氢二钾0.342g；总计1000ml，余量为水。用盐酸溶液将pH调节至5.7±0.1[26]。

1.4.与羟基磷灰石盘的相互作用

KSL对于类齿材料的亲和性通过在37℃的人造唾液中使KSL与HA盘(尺寸：0.38”直径x0.06-0.08”厚)进行相互作用来评估。为了模拟齿面，HA盘在过滤的人类唾液中预处理2小时(每4ml人类唾液中4个HA盘)。所有人类唾液收集自早晨早餐前三个健康男性捐赠者。收集后，立即以12000rpm的速度离心唾液20min，上层物质通过一个0.45μm的滤膜过滤出来。在用人类唾液预先处理之后，HA盘用人造唾液冲洗，并在37℃下加入至4ml KSL溶液中(人造唾液中0.5mg/ml)。作为对照，未处理HA盘直接在37℃下加入至KSL溶液中。将样品瓶置于以18周/分钟速度垂直旋转的转轮上。在预定时间取出样品，离心，用RP-HPLC分析上层物质。

1.5.口香糖的制备

口香糖配方通过上述步骤[8]制备。口香糖基质在50-60℃下加热至融化。当口香糖基质达到适当的流体稠度时，加入细粉形式的KSL和其他组分。在研钵中混合这些组分和口香糖基质同时温度保持恒定。混合后，挤出均匀的口香糖混合物，切割成合适形状和尺寸的块状体，在室温下硬化过夜。口香糖成分如下：550mg口香糖基质，420mg山梨糖醇，10mg甘露醇，10mg糖精和10、20或30mgKSL(总重约1g)。

1.6.体外释放研究

KSL从口香糖体外释放的研究采用由两个模块组成的体外咀嚼释放设备(AB FIA，Lund，Sweden)(图1)实现。每个模块包含一个恒温玻璃单元，每个单元装有两个固定了上和下咀嚼板的垂直导向活塞。这些单元充满40ml人造唾液，口香糖置于下咀嚼表面上。咀嚼步骤包括：下表面的上下击打，伴随上表面的扭曲运动；这个动作提供口香糖的咀嚼和测试媒介的搅拌。测试媒介的温度控制在37℃，咀嚼频率为每分钟50±2次击打。在预定的时间间隔，取出400μl上层物质。每次取样后，用新鲜人造唾液代替分解的媒介。通过RP-HPLC确定KSL的释放量。

1.7.体内释放研究

嚼出研究由三个志愿者执行。每个志愿者在给定时间内(5、10和20分钟)以30-40咀嚼/分钟的速度咀嚼每种口香糖。在预定时间咀嚼口香糖后，分析口香糖中KSL的余量。为了萃取KSL，加热口香糖至50-60℃保持5分钟，然后加入5ml乙腈和DMSO(1∶1)混合物。充分混合5min后，加入10ml 0.1M的醋酸缓冲液(pH4)，在室温下剧烈摇晃混合物30min。离心样品，上层物质用0.45μm滤膜过滤入HPLC瓶中。

2.结果和讨论

2.1.KSL的HPLC分析

建立了采用梯度洗脱的反相HPLC法作为分析KSL的一种方法。在HPLC条件下，去离子水中KSL的标准在7min保留时间中以单峰形式检测出(图2a)。肽浓度范围在20-400μg/ml时，KSL检测的线性相关系数大于0.999，而且该化验在这些浓度时具有重现性，变异系数＜5％(n＝3、化验内和化验间)。HPLC法可以从在55℃、3天、硼酸钠缓冲液(pH9)条件下产生的降解化合物中分辨完整的KSL(图2b)。没有试图鉴别降解产物或确定降解途径，它可能涉及上述的肽键的破坏和氧化[27]。

2.2.水溶液中的化学稳定性

图3显示出55℃下在不同pH溶液中KSL百分比余量对时间的半对数图。pH对KSL降解速度有影响，观察到的降解反应速度基本遵循一级动力学。还研究了25至55℃缓冲溶液中KSL的降解。通过回归分析从浓度对时间数据半对数图的斜率获得降解速度常数。观察到的KSL的反应一级速度常数列于表1。虽然没有说明对于KSL稳定性的最佳pH，但是看来最有利的稳定性出现在醋酸缓冲液中，即pH4。55℃条件下，pH4时KSL降解的半衰期为165.0天。pH7.4时为13.8天，pH9时为4.7天。温度和速度常数之间的关系显示于图4的Arrhenius图中。pH4条件下由斜率得出的活化能(E_a)为6.7kcal/mol，pH7.4条件下为13.6kcal/mol，pH9条件下为17.9kcal/mol(表1)。KSL在人造唾液中也是稳定的(没有显示数据)。在37℃下培养3天后，通过HPLC没有检测到降解峰。

2.3.与HA盘的相互作用

使用HA盘时，KSL对类齿材料以及唾液蛋白的亲和性显示于图5中。图5a示出吸附平衡在5分钟内出现，大约20％的KSL吸附至8个盘。KSL的吸附取决于HA盘的数量和包覆于盘上的蛋白(图5b)。通过浸渍于人类唾液中对未处理的和蛋白包覆的HA盘进行比较，使用4个HA盘时在结合方面表现出可辨别的差异。这可能是由于结合位置的数量限制以及对包覆HA盘的更多吸附所致。可见，由于KSL是含有5个赖氨酸残基的阳离子分子，而与唾液中酸性糖蛋白具有潜在静电作用，所以酸性唾液蛋白可能会起作用。已经有人强烈建议，洗必泰在口腔中的保留直接关系到菌斑形成的抑制[17-19]。Barnett等人报道了与HA结合的洗必泰和体内抗菌斑疗效的相互关系[28]。正如该研究所示，KSL对HA的亲和性显示其作为一种抗菌斑剂的潜力，以及在与菌斑形成有关的口腔菌株上的抗菌活性[7]。

2.4.从口香糖的体外释放

已经对固体剂型描述了体外分解和药剂释放测试的设备和方法[23]。然而，这些方法并不简单适用于研究药剂从口香糖的释放，因为持续的咀嚼对于药剂的释放是必要的。Kvist等人开发的设备显示出对口香糖配方的体外药剂释放测试的有效性[24，25]。

图6示出KSL从含有不同肽量(每个口香糖5、10和20mg)的口香糖配方的体外释放曲线。这三个口香糖配方的KSL释放显示10分钟48-55％，20分钟65-72％，30分钟71-82％。含有20mg KSL的口香糖配方显示释放比例略高于含有5和10mg KSL的口香糖。总之，60分钟有78-88％ KSL释放。KSL释放的量与口香糖制剂的加载水平成正比。

体外释放测试对于评估50-60℃下生产的口香糖制剂中的KSL稳定性是有效的。口香糖释放的KSL的HPLC分析显示只有一个完整KSL峰，这表明肽在生产过程中保持稳定(未显示数据)。

2.5.从口香糖的体内释放

通过执行体内嚼出研究来关联体外结果和体内性能之间的药剂释放模式。受过训练的志愿者分别咀嚼口香糖5、10、20分钟，然后从咀嚼过的口香糖中萃取剩余的KSL。为了验证萃取方法，测试含有10、20、30mg KSL的口香糖。三种口香糖的萃取量为加载量的84.3-88.6％。萃取的KSL的HPLC分析显示在与标准KSL相同的保留时间处具有单峰。

图7示出KSL从用于体外释放研究的相同口香糖制剂的体内释放曲线。三种口香糖配方中的KSL释放比例在每个时间点都没有显著区别，分别为5分钟时释放39-52％，10分钟时为59-69％，20分钟时为77-83％。与体外释放类似，KSL的释放量与加载水平成正比。尽管在体内研究中KSL的释放量比体外释放略高，但是释放模式从本质上是一致的。体外和体内释放的相关系数大于0.99。之前，Kvist等人同样报道了采用相同设备获得的体外释放曲线与体内释放曲线非常类似[25]。因此，含KSL的口香糖制剂显示良好的体外/体内曲线，其在20分钟内几乎达到80％释放。据报道，20分钟的咀嚼时间是超过80％的美国口香糖咀嚼者的通常时间[29]。

3.结论

KSL显示出对由人类唾液预处理的HA盘的高亲和性，并已成功配入口香糖中。通过咀嚼设备从体外并且通过嚼出方法从体内获得有应用前景的释放曲线。该研究显示KSL会以受控方式从口香糖中释放，并有效保留于口腔中，来抑制牙菌斑的形成。

B.口腔生物膜的控制

1.材料和方法

抗菌十肽，KSL的合成

KSL(KKVVFKVKFK-NH₂)通过在一个肽自动合成器(Model 90，Advanced ChemTech，Louisville，KY)中用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)化学方法通过标准固相步骤合成，其纯度由之前所描述的方法确定(Concannon等人，2003)。

1.2.缓冲液和媒介

人造唾液缓冲液如之前描述所制备(Shellis，1978)。体外菌斑化验系统使用Williams(Williams，1998)描述的唾液基媒介。

唾液的收集和唾液细菌的分离

之前描述了人类唾液收集和唾液细菌分离的步骤(Concannon等人，2003)。研究得到了Walter Reed Army Institute of Research的InstitutionalReview Board的认可，并获得所有志愿者的同意。

双流动单元系统

本研究所用的双流动单元系统由Herles等人(Herles等人，1994)的恒化器流动单元修改而来，并根据我们的设计以及BioSurface Technologies(Bozeman，MT)的规范建立(图1)。该流动单元由两个隔间组成，每一个隔间中都包括一个聚碳酸酯流动室，该流动室具有三个凹陷，用来装载形成生物膜的Ge盘(直径10mm，厚度1.8mm)。Ge盘提供反射面，可以通过使用差示涉差(DIC)显微镜实现未着色生物膜的可视化。

为了形成生物膜，用无菌的50％人类完全唾液调整双流动单元中的Ge盘(Mindrum，Rancho Cucamonga，CA)1小时。将在50％唾液(完全的，1.5ml)调节至大约1.0×10⁷个细胞/ml的分离的唾液细菌注入至流动室内。细菌在盘表面的最初粘附进行两小时之后，以0.2ml/min的速度开始培养基(20％Todd-Hewitt broth)的流动(Foster等人，2004)。采用的流动速度在底物表面上产生一大约9.65s^-1的剪切速率，并与口腔中的液体流动相适应(Bakker等人，2003)。

为了评估KSL在控制口腔生物膜的产生和成熟方面的效果，用不含KSL或含KSL的媒介(10或50□g/ml KSL)不断灌注粘附细胞的表面(最初定植后)。或者，以0.2ml/min的速度、用50□g/ml KSL在20％THB中的溶液或对照媒介、用注射泵脉冲处理不同成熟阶段的生物膜(如接种后4或6小时)。通过DIC显微镜对经过处理和未处理的生物膜生长方面的抗菌效果进行实时的直接比较。

KSL对口腔生物膜的杀菌活性

结合双流动单元系统，使用Guggenheim等人(Guggenheim等人，2001)所述的生物膜形成的体外菌斑模型的变型，来确定测试的抗菌剂和其他试剂对形成的口腔生物膜的影响(详见附录1)。使用HA盘(Clarkson，southWilliamsport，PA)作为形成生物膜的唾液细菌的底物。

为确定KSL对形成的口腔生物膜的抑制活性，将含有45小时寿命的生物膜的盘转移至含KSL水溶液(200□g/ml；1ml/井)的井中。接着在37℃下曝露30分钟，每次用1ml盐水冲洗3次，并转移入无菌的含有1ml PBS的15ml聚丙烯试管中。用一个装有杯角的Microson超声波细胞破坏机(Misonix Inc.，Farmingdale，NY)在5瓦特下通过超声2分钟来回收粘附在表面上的生物膜细胞(处理之后)。超声所用的包括时间间隔的设置根据经验来确定，来达到粘附生物膜细胞的最大回收。

KSL对破坏生物膜的影响通过上述超声回收HA盘的生物膜细胞(45小时寿命的生物膜)的方法来评估。分离的生物膜细胞(在无菌d水中)与等体积的KSL水溶液混合，使最终肽浓度达到200□g/ml，反应混合物在37℃下培养30分钟。KSL和悬浮的生物膜细胞的相互作用通过在PBS中洗涤而终止。

为了确定表面活性剂(杀藻胺；Sigma，St.Louis，MO)在促进通过KSL杀死完整生物膜的效果，用KSL(200□g/ml)、杀藻胺(0.001％)或这两个试剂的结合来处理66小时寿命的口腔生物膜，接着进行活菌计数确定和对处理的样品施行共焦激光扫描显微术。杀藻胺的剂量根据经验来确定，选择表现最小杀菌活性的试剂浓度。

处理的盘或破坏的生物膜上生物膜细胞的活菌计数通过在血琼脂板上螺旋镀敷连续稀释的样品来确定。分别使用蒸馏水或0.12％洗必泰二葡萄糖酸盐水溶液(Sigma)作为阴性或阳性对照。将45小时寿命的生物膜曝露于洗必泰中1分钟，并在37℃下曝露于水中30分钟。

3.结果

双流动单元中KSL与形成的口腔生物膜的相互作用

为了确定KSL是否具有抗生物膜活性，我们检查了不同浓度KSL对口腔生物膜产生的影响。使用DIC显微镜，我们观察流动细胞接种2小时后(图2A，a和d；图2B，a和c)流动室中唾液细菌在经唾液调整的Ge表面上的粘附情况。细菌粘附表面后，用含KSL或不含KSL的培养基连续灌注流动室。在用无KSL媒介灌注的流动室中，接种5小时后形成微菌落(microcolonies)(图2A，b)，8小时后继续发展为类膜结构(图2A，c)。相反，50□g/ml KSL破坏了生物膜的发展。细菌仍然附着在上，但不能形成微菌落和类膜结构(图2A，d-f)。而且，10□g/ml KSL对抑制生物膜的形成部分有效。接种8小时后形成微菌落(图2B，c-d)，而未处理的粘附唾液细菌形成类膜结构(图2B，a-b)。

虽然连续灌注含KSL媒介至流动室能防止粘附的唾液细菌在经调整的Ge表面上发展成生物膜，我们同样关注确定KSL是否可以在接种后的不同时间点通过脉冲处理生物膜细胞从而破坏该发展过程。如图3A(a-c)所示，用不含KSL媒介在接种4小时后脉冲处理(每2小时间隔以0.2ml/min速度运作30分钟)生物膜细胞不能防止粘附的唾液细菌发展成生物膜。相反，用含KSL媒介(50□g/ml)在接种4小时后脉冲处理生物膜细胞抑制了生物膜的形成(图3A，d-f)。然而，与对照进行比较(图3B，a-c)，用含KSL媒介在接种6小时后脉冲处理生物膜不能抑制生物膜结构的发展或者不能改变其结构(图3B，d-f)。

KSL与完整和破坏口腔生物膜的相互作用

我们的流动单元试验显示，成熟的生物膜对KSL较不敏感。相反，将粘附的唾液细菌或生物膜细胞在其发展的较早阶段曝露于KSL中可以抑制其进一步发展成成熟生物膜。在这方面，通过体外菌斑化验，我们关注形成的口腔生物膜组织结构是否决定了成熟口腔生物膜对KSL的抵抗力。如图4A所示，通过将形成于经唾液调整的HA盘上的完整45小时寿命口腔生物膜曝露于KSL中，活菌计数的降低较少(p小于0.05)。对于用0.12％洗必泰处理过的完整生物膜，活菌计数的降低较多。当这些生物膜在KSL处理前通过超声进行了机械破坏时，与经d水处理的对照细胞相比，KSL处理细胞的生存能力大大降低了(1.8log)。与用相同浓度KSL处理的完整生物膜相比，破坏生物膜的生存能力同样显著降低。

在表面活性剂存在的情况下KSL与完整口腔生物膜的相互作用

由于生物膜的组织结构可能影响生物膜对抗菌剂的敏感性，我们关注于使用体外菌斑化验确定表面活性剂即杀藻胺在促进通过KSL杀死生物膜细胞方面的影响。如图4B所示，与水处理相比，在杀藻胺存在下(0.001％)，KSL显著降低66小时寿命口腔生物膜的生存能力(减少超过1log)，近似于洗必泰造成的程度。单独使用KSL(200□g/ml)或杀藻胺(0.001％)对这些生物膜的生存能力影响较小。这些结果通过共焦显微镜显示的处理样品的生存/死亡着色得到证实(图4C)。

4.讨论

含可去除的可定植表面的双流动单元和分离的唾液细菌的使用提供了可选的方法，来检查抗菌剂对口腔生物膜形成的影响。使用人类唾液细菌作为菌斑种子是特别合适的，因为这些细菌源自形成于口腔中的硬组织和软组织的生物膜(Helmerhorst等人，1999)。通过该系统能够对经过处理的组和阴性对照组之间的生物膜发展进行非破坏性的直接比对。

在该测试系统中，与对照相比，KSL显著预防生物膜的发展。我们认为，观察到的抑制可能是由于KSL的抗菌活性所致。我们已经揭示了KSL通过破坏目标细菌膜的稳定而展示其抗菌活性(Concannon等人，2003)。相反，将形成的口腔生物膜(45小时寿命的生物膜)曝露于KSL中不能破坏其结构，或导致生物膜细胞生存能力的任何较大降低。结果表明，一旦形成，生物膜对KSL的耐受性就更强。有趣的是，乳铁蛋白具有类似的性质，它是一种常见的表面分泌的天生抗菌成分。以次抑制浓度持续灌注乳铁蛋白能预防绿脓假单胞菌发展成生物膜。然而，与KSL类似，乳铁蛋白不能改变成熟生物膜的结构(Singh等人，2002)。

几个因素影响生物膜对抗菌剂的敏感性(Campanac等人，2002；Gilbert等人，1997；Stewart等人，2004)。我们猜测，形成的口腔生物膜对KSL敏感性的降低可能是由于三维生物膜结构和/或外聚合物质的存在使我们的抗菌剂的扩散或排斥发生延迟所致。为了对此进行测试，我们破坏了由唾液细菌形成的生长于唾液包覆的HA表面上的口腔生物膜，并确定与完整生物膜相比这些破坏了的生物膜细胞对KSL的敏感性。我们认为，生物膜结构的破坏可能提高目标生物膜细胞对我们的抗菌剂的敏感性。事实上，与完整口腔生物膜相比，破坏过程大大提高了生物膜细胞受破坏的敏感性，这说明生物膜的组织结构可能对完整生物膜对抗菌剂的敏感性起到影响的作用。然而，我们不确定就完整生物膜观察到的敏感性降低是否同样由可能和生物膜细胞有关的外聚合物所致。而且，杀藻胺，一种公知的阳离子性表面活性剂(Baker等人，1978)，它的次杀菌浓度显著提高生物膜对KSL的敏感性。尽管我们不明白其中的机理，一个可能的解释是：杀藻胺以次抑制浓度的存在可能通过影响生物膜结构，使KSL更容易达到居于完整口腔生物膜的生物膜细胞。或者，阳离子剂杀藻胺可能在杀死唾液细菌方面为KSL的杀菌活性提供协同作用。

5.结论

KSL预防口腔生物膜发展方面的发现使KSL可能作为一种用于预防菌斑媒介牙齿疾病的有价值的牙膏辅助剂。由于KSL在杀死破坏的口腔生物膜细胞方面的效果，这种应用是特别合适的。该破坏可以通过口腔卫生过程期间的机械刷洗和/或使用牙线来产生。

以上已对本发明的较佳实施例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110>卡伊·P·莱昂(Kai P.LEUNG)

<120>抗菌十肽的口腔卫生处理剂(Antimicrobial Decapeptide Oral Hygiene Treatment)

<130>WRAIR 06-22/182.0022

<140>不可用(Not Yet Available)

<141>2006-10-18

<150>US 10/795,514；US 60/455,206；US 60/727,428；US 60/735,915

<151>2004-03-09；2003-03-10；2005-10-18；2005-11-14

<160>1

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人造序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>酰胺化(amidation)

<222>C端(C-terminus)

<223>抗菌肽KSL的合成(Synthesis of Antimicrobial Peptide KSL)

<400>1

Lys Lys Val Val Phe Lys Val Lys Phe Lys-NH₂

1               5                   10

Claims (17)

1.一种口腔卫生处理剂，其特征在于，包括：

一种抗菌肽，和

一种表面活性剂。

2.如权利要求1所述的处理剂，其特征在于：所述抗菌肽包含KSL(序列1)或其衍生物。

3.如权利要求2所述的处理剂，其特征在于：所述抗菌肽为KSL(序列1)。

4.如权利要求1所述的处理剂，其特征在于：所述表面活性剂为阳离子剂。

5.如权利要求4所述的处理剂，其特征在于：所述表面活性剂为杀藻胺。

6.如权利要求1所述的处理剂，其特征在于：所述表面活性剂选自氯苄和氯吡啶。

7.如权利要求1所述的处理剂，其特征在于：所述抗菌肽和所述表面活性剂在一口腔冲洗水溶液中混合。

8.一种处理成熟口腔生物膜的方法，其特征在于，包括：

用一种抗菌十肽和一种表面活性剂接触所述成熟生物膜。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抗菌肽包含KSL(序列1)。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂为阳离子剂。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂为杀藻胺。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述接触所述成熟生物膜的步骤包括在有成熟细胞膜的人的口中用含有KSL和苄烷铵的溶液冲洗。

13.一种处理成熟生物膜的方法，其特征在于，包括：

机械破坏所述成熟生物膜，和

用一种抗菌十肽接触所述破坏了的生物膜。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述抗菌十肽包含KSL(序列1)。

15.一种抗菌斑口香糖，其特征在于，包括：

一口香糖基质，和

一种有效量的抗菌十肽。

16.如权利要求15所述的口香糖，其特征在于：所述抗菌肽包含KSL(序列1)。

17.如权利要求16所述的口香糖，其特征在于：还包括一种表面活性剂。

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