JP2009507818A - ビピリジン化合物「セルロマイシンa」、その誘導体および類似体の免疫抑制剤としての使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
Xは、−CH=NOR1、−COOR1、−CHO、または−CH2OR2であり;
Yは、H、またはOR3であり;
R1は、H、あるいはC1〜C16直鎖または分枝鎖アルキルであり;
R2は、H、C1〜C16直鎖または分枝鎖アルキル、あるいはC1〜C16直鎖または分枝鎖アシルであり;
R3は、H、メチル、エチル、イソプロピル、またはイソブチルである。
[a]中性の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、25〜30℃で30〜100時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス[MTCC6194]の株を振盪培養するステップと、
[b]ステップ[a]で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
[c]ステップ[b]で得られた上清から式2の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
[d]任意に、NMRスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法も提供する。
[a]pH7.0〜8.5の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、25〜30℃で30〜100時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス[MTCC6194]を振盪培養するステップと、
[b]ステップ[a]で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
[c]ステップ[b]で得られた上清から式2の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
[d]任意に、NMRスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法が提供される。
放線菌および真菌に由来する産物の体系的研究から、シクロスポリンA(CsA)、FK506(タクロリムス)およびラパマイシン(シロリムス)などの免疫抑制剤が開発されている。これらの薬物は、強力な抗真菌作用を示すだけでなく、潜在的な免疫抑制薬としても使用される。この点を考慮して、本発明者は、ヒマチャルプラデシュ州のカザおよびスピティの寒冷なヒマラヤ山脈領域の土壌サンプルおよび水サンプルから様々な微生物を単離して、抗真菌活性を有する生理活性化合物をスクリーニングする研究を開始した。インドのヒマラヤ山脈の寒冷地砂漠から分離されたRMV−1378T株の多面的な特徴付けから、その株がアクチノアロテイチャス属に属することがはっきりと確認された。生理学的および生化学的試験によって、系統発生的に最も近い種とRMV−1378T株とを遺伝子型および表現型について区別可能となった。16SrDNAの配列分析から、その分離株は、類似性99%でアクチノアロテイチャス・シアノグリセウス(Actinoalloteichus cyanogriseus)と非常に近い関係にあることが明らかとなった。しかしながら、DNA−DNAハイブリダイゼーションの結果から、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスとのゲノム類縁性は低い(51%)ことが示された。したがって、本発明者は、その分離株は、アクチノアロテイチャス属の新種として分類されることを提案し、その名前をアクチノアロテイチャス・スピティエンシス(Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.)と提案した。RMV−1378T株は、インドのMTCC(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)にアクセッション番号MTCC6194Tで寄託されており、RMV−1378T基準株はまた、日本のJCM(Japan Collection of Micro-organisms;理化学研究所微生物系統保存施設)にアクセッション番号JCM12472Tで寄託されており、ドイツのDSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)にアクセッション番号DSM44848Tで寄託されている。RMV−1378株から単離された活性成分は、核磁気共鳴(NMR)スペクトルデータ、赤外線(IR)スペクトルデータおよび質量スペクトルデータをベースとして特徴付けられた。同定された化合物は、(E)−4−メトキシ−2,2’−ビピリジン−6−カルバルデヒドオキシムであった。そのデータは、既に報告されているセルロマイシンAのデータ(Divekar et al. 1967)とよく一致した。
a)アクチノバクテリアRMV−1378T株は、枝分れした非断片栄養菌糸(non-fragmenting vegetative hyphae)を形成し、拡散性色素を生成しない。気生菌糸も胞子形成も認められない。
b)DNAのG+C含有量は、72.0モル%であった。
c)その株は、アクチノアロテイチャス属に特有の化学分類学的特徴を有し、正式発表された学名を有する現在唯一のアクチノアロテイチャス属の種、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスに近い関係にある(16S rRNA遺伝子配列類似性99.3%)。しかしながら、DNA−DNAハイブリダイゼーション実験の結果から、アクチノアロテイチャス・シアノグリセウスの基準株との類縁性は51.9%であることが示された。
d)RMV−1378T株(=MTCC6194T=JCM12472T=DSM44848T)の上記のデータおよび生理学的および生化学的特殊性に基づいて、この株は、アクチノアロテイチャス属の新種の基準株として分類され、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス(Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.)という学名が与えられた。
セルロマイシンAは、本発明において微生物の制御発酵によって産生される。この微生物を、好ましくは水性栄養培地中、好気および中温条件下にて、好ましくは25〜35℃、pH約6.0〜8.0で成長させる。発酵時間の長さは、一般的には24〜168時間、好ましくは24〜96時間の範囲内である。30℃、pH7.0〜8.5にて良好に産生する。使用される栄養培地は、好ましくはタンパク質加水分解産物やタンパク質および/または単離アミノ酸、アンモニウムおよび/または硝酸塩供給源などの適切な窒素供給源;炭素の供給源としての同化可能な炭水化物および/または脂肪で構成され、かつ塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどの塩も含有し得る。
発酵により産生されたセルロマイシンAの単離および精製は、一般的に抽出とクロマトグラフ技術の組み合わせを使用して行われる。各ステップの好ましい順序は以下のとおりである。
[セルロマイシンAは、混合リンパ球反応(MLR)の免疫抑制を誘導する]
4×105個のBALB/c脾細胞(反応細胞)および4×105個のγ線照射(3000R)C57BL/6J脾細胞(刺激細胞)をRPMI/FCS10%培地200μl中に含有する各ウェルと、様々な濃度のセルロマイシンA(1〜0.0125μg/ml)、シクロスポリンA(0.0125〜10μg/ml)とを使用して、96ウェル組織培養プレートでMLRを行った。培地単体にBALB/c脾細胞のみ、γ線照射C57BL/6J脾細胞のみ、およびBALB/c脾細胞+γ線照射C57BL/6J脾細胞のみを含む対照培養物も用意した。4日後、培養物を[3H]−チミジン1μCiでパルスし、16時間後にスカトロン(Skatron)セルハーベスターを用いて回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント/分(cpm)として示した。
BALB/cマウスの脾細胞をRPMI/FCS10%培地200μl中で培養し(5×104細胞/ウェル)、異なる濃度のConA(1μg/ml,2μg/ml)またはLPS(5μg/ml,10μg/ml)、およびセルロマイシンA(0.0003〜0.1μg/ml)で刺激した。脾細胞からなる対照培養物を培地、ConAおよびDMSOのみと共にインキュベートした。48時間後、培養物を[3H]−チミジン0.5μCiでパルスし、14時間後に自動セルハーベスター(スカトロン社,ノルウェイ,トランビー)を用いて回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント/分(cpm)として示した。
OVA−CFA感作マウスから、マウス脾細胞の単細胞浮遊液を得た。溶血性ゲイ溶液で処理して赤血球を除去した。7%CO2雰囲気下、37℃で2時間プラスチック製のペトリ皿にプレーティングして付着細胞を除去した。非付着細胞をナイロンウールカラムに充填し(1×106細胞/ml)、37℃で90分間インキュベートした。インキュベーション時間後、温かいRPMI培地をカラムに通し、Tリンパ球を溶出した。T細胞をRPMI培地で洗浄し、抗Mac3抗体(TIB−168)、抗IAd抗体(MKD6)、抗樹状細胞抗体(TIB−227)、抗IgM抗体、抗CD8抗体と共に4℃で45分間インキュベートした。細胞をRPMI培地で洗浄し、仔ウサギ補体と共に37℃で30分間インキュベートした。細胞をRPMI培地で3回洗浄し、増殖アッセイに使用した。抗CD3抗体およびCD4抗体で染色した細胞のフローサイトメトリーによって細胞の純度を分析した。
抗原パルス脾細胞で刺激して7〜9日後に回収された細胞を使用して、Th2クローンの増殖を測定した。死細胞をフィコール−ヒストパックによって除去した。Th2クローン(5×104細胞/ウェル)を様々な濃度のセルロマイシンA(0.00625〜0.1μg/ml)存在下で、抗CD3抗体(0.1μg/ml,0.5μg/ml)で刺激するか、またはRPMI/FCS10%培地200μl中においてγ線照射(3000R)同系脾細胞(5×105細胞/ウェル)、コンアルブミン(100μg/ml)と共にインキュベートした。コンアルブミンのみと共にインキュベートされたTh2細胞からなる対照培養物、およびγ線照射同系脾細胞(抗原なし)と共にインキュベートされたTh2細胞からなる対照培養物も用意した。培養物を平底96ウェルマイクロタイタープレートに入れ、7%CO2雰囲気下、37℃で細胞をインキュベートした。48時間後、培養物を[3H]−チミジン0.5μCiでパルスし、16時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント/分(cpm)として示した。
Th1細胞(1×104細胞/ウェル)を抗CD3抗体(10μg/ml)および異なる用量のセルロマイシンAで刺激した。24時間後、[3H]−チミジンを添加し、その取り込みを8時間後に測定した。
OVA(2mg/ml)をPBS(0.01M,pH7.2)に溶解し、フロイント完全アジュバント(FCA)中で乳化させた。次いで、5匹のBALB/cマウスからなる群においてエマルジョン(100μl)を腹腔内に注射した。対照群にはPBSのみを注射した。7日後、マウスを屠殺し、脾細胞をプールし、増殖アッセイおよびサイトカインアッセイに使用した。脾細胞(5×105細胞/ウェル)をRPMI/FCS10%培地200μl中のOVA(200μg/ml)、および様々な濃度のセルロマイシンA(0.0003〜0.1μg/ml)と共に培養した。異なる濃度のセルロマイシンA(OVAなし)と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物、OVAおよび培地からなる対照培養物も用意した。その培養上清を48時間後に回収し、ELISAによってサイトカインを測定した。
OVA(2mg/ml)をPBS(0.01M,pH7.2)に溶解し、フロイント完全アジュバント(FCA)中で乳化させた。次いで、それぞれ5匹のBALB/cマウスからなる7つの群において、エマルジョン(100μl)を腹腔内(i.p.)に注射した。4つの動物群において、セルロマイシンA(25,50,75,100μg/100μl/マウス)を腹腔内に毎日注射した。PBSおよびエタノール−PBSをそれぞれ100μl腹腔内注射して、対照群を免疫した。7日後、マウスを屠殺し、脾細胞を単離し、生体外(in vitro)での増殖のためにプールした。
Th2クローン(5×104細胞/ウェル)を抗CD3抗体(0.5μg/ml)で刺激した。培養の開始時(時間0)または様々な時点(4〜48時間)でセルロマイシンA(0.05μg/ml)を添加した。培養から48時間後に、[3H]−チミジンを添加し、その取り込みを12時間後に測定した。
平底96ウェルプレートに5×104細胞/ウェルで細胞を播種した。培養の開始時に様々な刺激およびセルロマイシンAを加えた。48時間後、[3H]−チミジン(1μCi/ウェル)を添加し、その取り込みを12時間後に測定した。セルロマイシンAは、カルシウム依存性経路による増殖を有意に抑制することが確認された。
休止CD4+T細胞およびConA活性化CD4+T細胞表面のCD28およびCTLA−4発現の発現をフローサイトメトリー分析によって検出した。簡潔には、脾細胞(3×106細胞/ウェル)をOVA(200μg/ml)またはConA(1μg/ml,2μg/ml)で活性化し、異なる濃度のセルロマイシンA(0.0125〜0.45μg/ml)の存在下でインキュベートした。24、48、72および96時間後に培養物を回収し、CD4、CD28およびCTLA−4の発現を見るために細胞を染色した。さらに、培養液をセットし、培養を開始して24および48時間後にセルロマイシンAを添加し、さらに24時間インキュベートした後、細胞を染色した。細胞を回収し、PE(フィコエリスリン)標識抗CD4抗体、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)標識抗CTLA−4抗体、およびCy(Cy−クロム)標識抗CD28抗体を使用して、3色染色を行った。各浮遊液中からの細胞は、FACScan(ベクトン・ディッキンソン社、カリフォルニア州マウンテンビュー)のCELLQUESTソフトウェアで取得された。細胞浮遊液中のデブリスは、リンパ球と一致するサイズの光散乱現象(すなわち細胞)からのみデータを収集することができる適切なゲーティングによって分析から除外した。平均蛍光強度(MFI)の分析をヒストグラムで行った。横座標および縦座標は、それぞれlog蛍光強度および相対細胞数を示す。
セルロマイシンAの存在下にて、胸腺細胞表面のCD69の発現を検出した。胸腺細胞は、3〜4週齢のBALB/cマウスから得た。セルロマイシンAの存在下、非存在下で37℃にて24時間、胸腺細胞(4×106細胞/ウェル)をConA 1μg/ml,5μg/mlで刺激した。PE標識抗マウスCD69抗体で細胞を染色した。CD28/CTLA−4の場合に述べたように、染色細胞をFACScanで取得した。
異なる濃度のセルロマイシンA(0.05〜0.1μg/ml)と共にインキュベートされた腹腔マクロファージ表面のB7−1およびB7−2の発現を検出した。4日前に2〜3mlのチオグリコレートを注射したBALB/cマウスから、腹腔マクロファージを採取した。細胞をBSSで洗浄した。プラスチック製ペトリ皿上に37℃で1時間付着させ、続いて冷たいBSSで数回洗浄することによって、マクロファージを得た。セルロマイシンA(0.05〜0.lμg/ml)の存在下、非存在下にて、7%CO2雰囲気下37℃で24、48および72時間、LPS10μg/mlでマクロファージ(1×106)を刺激した。次いで、細胞を回収し、各抗体で染色した。簡潔には、細胞を遠心分離し(1200×g,4℃,5分)、上清を吸引した。1%BSA、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSで細胞を3回洗浄した。最初の段階において、ビオチン標識の抗マウスB7−1抗体、抗CD40抗体および抗I−Ad抗体(1μg/100μl)と共に細胞(1×106)を4℃で45分間インキュベートした。次の段階では、ストレプトアビジン−FITC(0.5μg/100μl)またはPE標識抗マウスB7−2抗体(0.5μg/100μl)で細胞を染色し、45分間インキュベートした。通常の洗浄段階を各段階で行った。最後に、細胞を5回洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。CD28/CTLA−4に関して述べたように、染色細胞をFACScanで取得した。抗原提示細胞は、CTLA−4およびCD28のリガンドであるB7−1およびB7−2を発現する。興味深いことに、セルロマイシンAは、B7−1の発現を高め、B7−2分子の発現を低減した。それと対照的にJ774においては、セルロマイシンAは、B7−2の発現を増加させたが、B7−1発現については主な変化は認められなかった。本発明者は、他の補助刺激分子CD40の発現に対するセルロマイシンAの役割も評価した。CD40の発現のわずかな増加が72時間後に確認された。
異なる濃度のセルロマイシンA(0.05〜0.1μg/ml)と共にインキュベートされた腹腔マクロファージ表面のIAdの発現を検出した。4日前に2〜3mlのチオグリコレートを注射したBALB/cマウスから、腹腔マクロファージを採取した。細胞をBSSで洗浄した。プラスチック製ペトリ皿上に37℃で1時間付着させ、続いて冷たいBSSで数回洗浄することによって、マクロファージを得た。セルロマイシンA(0.05〜0.1μg/ml)の存在下、非存在下にて、7%CO2雰囲気下37℃で24、48、72時間、LPS10μg/mlでマクロファージ(1×106)を刺激した。次いで、細胞を回収し、各抗体で染色した。
オボアルブミン(3mg/ml)をPBS(pH7.2)に溶解し、フロイント完全アジュバント(FCA)中で乳化させた。次いで、それぞれ5匹のBALB/cマウスからなる各群の腹腔内(i.p.)にエマルジョン(100μl)を注射した。4つの動物群にセルロマイシンA(25、50、75、100μg/100μl/マウス)を腹腔内に毎日注射した。エタノール−PBSを腹腔内注射して対照群を免疫した。
7日後、マウスを屠殺し、脾細胞をプールし、増殖アッセイに使用した。OVA(100μg/ml)を含む200μlのRPMI/FCS10%培地中で、様々な濃度のセルロマイシンA(0.1〜0.0003μg/ml)と共に脾細胞(2×105細胞/ウェル)を培養した。様々な濃度のセルロマイシンA(OVAなし)と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物、ならびにOVAおよび培地と共にインキュベートされた脾細胞からなる対照培養物も用意した。72時間後、培養液を[3H]−チミジン1μCiでパルスし、14時間後に回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定し、データを平均カウント/分(cpm)として示した。
様々な用量のセルロマイシンAをマウスに7日間投与した(図1.1)。動物を屠殺し、抗原および様々な濃度のセルロマイシンA(0.00625〜0.10μg/ml)と共に生体外(in vitro)で脾細胞を培養した。興味深いことに、4通りすべての濃度のセルロマイシンA(25〜100μg/マウス/日)を注射した動物から単離された細胞は、薬物を投与していない動物と比較して、増殖を顕著に抑制した。増殖の減少は、用量依存的な様式で確認された。0.10μg/mlのセルロマイシンAと共に細胞をインキュベートした場合に、ほぼ完全な抑制が認められた。他のセットの実験において、抗原で感作された後、PBS−エタノールまたはセルロマイシンA(25μg/マウス/日)のいずれかを7日間投与された動物から、細胞を単離した(図1.2)。セルロマイシンAを注射したマウスから単離された細胞は、PBS−エタノールで免疫化した動物から単離された細胞と比較して、有意なレベルの増殖の遅延を示した(図1.2)。
それぞれ動物5匹を含む別々の群をOVAで免疫し、マウスを屠殺する前に7日間セルロマイシンAを投与した。脾細胞(2×105細胞/ウェル)を単離し、生体外(in vitro)でOVA100μg/mlおよび様々な用量のセルロマイシンAと共に培養した。72時間後、[3H]−チミジンを添加し、その取り込みを16時間後に測定した。培地のみで培養された細胞からなる対照培養物は、3789±359cpmを示し、細胞+OVAは、16387±431cpmを示し、PBS−エタノールで免疫し、OVAと共に生体外で培養した動物から得られた細胞は、13801±587cpmを示した(1.1)。他のセットの実験では、3つの別々の群をOVAで免疫し、続いて、マウスを屠殺する前に、群の1つでセルロマイシンA(25μg/マウス)を、もう1つの群でアルコール(賦形剤対照)を毎日7日間投与した。脾細胞(2×105細胞/ウェル)を単離し、単独で、またはOVA100μg/mlおよび200μg/mlと共に生体外で培養した(1.2)。各ポイントは、3つの代表実験のうちの1つから、3回繰り返した測定の平均±標準誤差に相当する。
A.接種材料の調整
試験管内の培地5mlに接種して種培養物を調製する。培地の組成は、1リットルの蒸留水に対して、グルコース5.4g、酵母抽出物4.8g、麦芽エキス8.5g、CaCO33.0gである。pHを7.2に調整した培養液を滅菌し、冷却した後、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス(Actinoalloteichus spitiensis sp. nov.)の凍結培養物を添加する。200rpmで回転攪拌しながら、28℃で30時間、細菌を培養する。容量1000mlの振盪フラスコ内の無菌培地100mlに上記の培養物7.5mlを無菌接種する。無菌培地の組成は、1リットルの蒸留水に対して、グルコース5.4g、酵母抽出物4.8g、麦芽エキス8.5g、CaCO33.0gである。アルカリ溶液でpHを7.0に調整する。200rpmでオービタル攪拌しながら、28℃で30時間、細菌を培養する。
5リットルの産生培地を含む発酵槽(容量7リットル)を122℃で30分間滅菌する。産生培地の組成は、1リットルの蒸留水に対して、グルコース5.4g、酵母抽出物4.8g、麦芽エキス8.5g、CaCO33.0gである。発酵槽に第二期接種材料500mlを接種する。220rpmで攪拌し、1vvmで通気しながら、発酵培養物を28℃でインキュベートする。
培養が終了した後、遠心分離によって固形分を除去する。上清部分(4.8リットル)を酢酸エチル2.5リットルで2回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下にて乾燥状態まで濃縮する。水:メタノール(1:1)80mlに粗残渣を溶解し、ヘキサン50mlで2回分配することによって脱脂した。酢酸エチル50mlで水/アルコール画分を2回抽出する。蒸発器で有機溶媒を蒸発させ、セルロマイシンAを含有する粗残渣が得られる。
アセトン5mlに粗残渣を溶解し、溶出溶媒としてトルエン/アセトン(75:25)の混合物を使用して、高性能フラッシュクロマトグラフィーシステム(Horizon HPFC system,米国バイオタージ社)によってシリカゲル(32〜63μM)上でクロマトグラフを行う。移動相としてクロロホルム/メタノール/20%アンモニア水(95:4:1)を使用したTLC分析に基づいて、同様な画分を合わせる。
・BALB/cマウスの脾細胞をConA(1μg/ml,2μg/ml)またはLPS(5μg/ml,10μg/ml)で刺激し、様々な濃度のセルロマイシンA(0.0003〜0.1μg/ml)と共に培養した。48時間後、培養物を[3H]−チミジン0.5μCiでパルスし、14時間後に自動セルハーベスターによって回収した。取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって測定した。
(i)CD4+T細胞は、免疫応答の開始および調節において重要な役割を果たすことから、その活性化の抑制によって、免疫抑制療法の強力なアプローチが得られる。これは、他の多くの免疫抑制薬および自己免疫の治療の場合における記録が非常に良く残されている(Galvin et al. 1993, Thomson 1991, Crespo-Leiro2003)。さらに、CD4+T細胞の役割は、多くの自己免疫疾患について非常に良く記録が残されている(Abbas et al. 2004, Wraith et al. 2004)。セルロマイシンAは、ナイーブCD4+T細胞および抗原特異的エフェクターCD4+T細胞による増殖およびサイトカイン(IL−4およびIFN−γ)分泌を抑制することから、自己免疫疾患に対するかなり有望な薬物であろう。さらに、セルロマイシンAは、T細胞におけるCTLA−4の発現を有意に増加し、続いて、CD28の発現をダウンレギュレートした。本発明者は、CTLA−4を発現するCD4+T細胞が増加し、かつCD28陽性細胞の数が減少することも見出した。同様な結果が、CD4+T細胞以外の細胞でも確認された。リンパ球応答が、CTLA−4仲介抑制シグナルによって抑制されるという概念の理解が高まっている(Krummel et al. 1996, Leibson 2004)。
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Claims (23)
- その投薬量が1.25〜5.0mg/kg体重の範囲内である、請求項1〜請求項3のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、免疫応答の抑制に関して、公知の免疫抑制剤であるシクロスポリンAよりも10倍有効である、請求項1〜請求項4のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物の約0.1μg/ml希釈液は、48時間以内に免疫細胞の約90〜97%を抑制する、請求項1〜請求項5のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、T細胞、B細胞、混合リンパ球反応、ナイーブCD4+T細胞、抗原特異的エフェクターCD4+T細胞、Th1細胞およびTh2細胞の生体外での増殖を抑制する、請求項1〜請求項6のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、インターフェロン−γ(IFN−γ)やインターロイキン−4(IL−4)などのサイトカインの生体外での分泌を抑制する、請求項1〜請求項7のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、T細胞において、活性化マーカーCD28の発現をダウンレギュレートし、抑制マーカーCTLA−4の発現をアップレギュレートする、請求項1〜請求項8のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、マクロファージにおいて、B7−1の発現を増加し、B7−2およびMHC分子の発現を低減する、請求項1〜請求項9のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、α−βT細胞およびγ−δT細胞、CD4+T細胞およびCD8+T細胞、Th1細胞およびTh2細胞;ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、記憶T細胞および調節性T細胞の抑制を誘導する、請求項1〜請求項10のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、B細胞、マスト細胞、内皮細胞、NK細胞、樹状細胞(骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、リンパ球様樹状細胞、間質樹状細胞)、単球、マクロファージ(脾マクロファージ、腹腔マクロファージ、肺胞マクロファージ、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、グリア細胞およびすべての種類のマクロファージ)、上皮細胞、骨芽細胞、好酸球、好塩基球、顆粒球、血小板および巨核球の抑制を誘導する、請求項1〜請求項11のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、アジソン病、自己免疫溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、悪性貧血、特発性不妊症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自然流産などの自己免疫疾患の治療に有用である、請求項1〜請求項12のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、免疫抑制を誘導し、移植片拒絶、移植片対宿主反応を防ぎ、移植に有用である、請求項1〜請求項13のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、癲癇、脳卒中、脳虚血、脳性麻痺、アルパース病、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レビー小体型認知症、レット症候群、神経障害性疼痛、脊髄外傷、または外傷性脳損傷などの神経疾患の治療に有用である、請求項1〜請求項14のいずれかに記載の化合物の使用。
- 前記化合物は、インドのヒマラヤ山脈の寒冷地砂漠から分離された新種の放線菌アクチノアロテイチャス・スピティエンシス[MTCC6194]から単離される、請求項1〜請求項15のいずれかに記載の化合物の使用。
- アクチノアロテイチャス・スピティエンシス[MTCC6194]から、免疫抑制剤として有用な請求項1〜請求項16のいずれかに記載の化合物を単離する方法であって、
[a]pH7.0〜8.5の水性栄養培地中の制御された好気発酵条件下において、25〜30℃で30〜100時間、アクチノアロテイチャス・スピティエンシス[MTCC 6194]の株を振盪培養するステップ;
[b]ステップ[a]で得られた細胞を沈降させ、細胞を含有しない上清を得るステップと、
[c]ステップ[b]で得られた上清から、式2の化合物を公知の方法によって抽出し、続いてそれを精製するステップと、
[d]任意に、NMRスペクトルデータ、赤外線スペクトルデータおよび質量スペクトルデータを用いて、精製画分を特徴付けするステップと、
を含む方法。 - 前記細胞は、好ましくは40〜70時間培養される、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞は、好ましくは28〜30℃で培養される、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞は、好ましくはpH7〜8.5で培養される、請求項17に記載の方法。
- 式2の化合物の回収量は、約150mg/L培養液である、請求項17に記載の方法。
- 得られた活性画分は、免疫抑制剤として有用である、請求項17に記載の方法。
- 薬学的に許容される希釈剤、添加剤および/または担体と共に式1の化合物1.25〜5.0mgを含有する、免疫抑制に有用な免疫抑制医薬組成物。
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