CN110295121A - 一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素a中的应用 - Google Patents

一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素a中的应用 Download PDF

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CN110295121A CN201910440696.2A CN201910440696A CN110295121A CN 110295121 A CN110295121 A CN 110295121A CN 201910440696 A CN201910440696 A CN 201910440696A CN 110295121 A CN110295121 A CN 110295121A
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Abstract

本发明公开了一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用。所述的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的保藏编号为：CCTCC NO:M 2018157。本发明的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的发酵培养物能够制备如式(I)所示的浅蓝霉素A。本发明为浅蓝霉素A的生产提供了生物学制备方法，具有广阔的应用前景。

Description

一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋异壁放线菌(Actinoalloteichussp.)AHMU CJ 021及其在制备浅蓝霉素A(cerulomycin A)中的应用。
背景技术
浅蓝霉素是一类来自于微生物的生物碱，结构中大多含有1个独特的二联吡啶环母核结构，到目前为止，人们从微生物的代谢产物中分离鉴定了至少49个浅蓝霉素类化合物，包括caerulomycins A～P、caerulomycin R、4-O-methyl caerulomycin N、(Z)-caerulomycin A、cyanogrisides A～H、collismycins A～D、collismycin DA、collismycin DH、collismycin DN、collismycin DS、collismycin H、collismycins SC和SN、collismycin M4和M6、SF2738D～F、coprismycins A和B、pyrisulfoxins A和B、以及caerulomycinamide和caerulomycinonitrile。浅蓝霉素A(cerulomycin A)是该家族首个被鉴定化合物，由Funk和Divekar于1959年分离自青蓝链霉菌Streptomyces caereleusPRL 1687的次生代谢产物。
浅蓝霉素类化合物的活性多样，包括抗菌、细胞毒、免疫调节、抗痢疾变形虫、神经保护、受体结合活性以及植物毒性作用等。其化学结构中共有的2,2’-联吡啶母核和醛肟基团在其活性方面发挥着重要作用。浅蓝霉素A的活性包括抗细菌、抗真菌、细胞毒和免疫抑制等方面。其中，针对其免疫调节活性方面的研究尤为重要，奠定了浅蓝霉素A被开发成为免疫抑制药物的基础。起初，Singla等研究发现浅蓝霉素A的作用靶点尤其针对于淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞以及IL4、IFNγ和抗体的产生；对应的机制是经由下调活化标记物CD28和上调免疫标记物CTLA-4的表达完成[Singla A K,Agrewala J N,Vohra RM,et al.Use of bipyridine compound Caerulomycin A,and derivatives and analogsthereof,as immunosuppressive agents[P].PCT Int.Appl,2007,WO 2007031832 A2[P].200703 22]。随后发现，浅蓝霉素A可以通过抑制IFN-γ-STAT1信号通路、增强TGF-β-Smad3信号，继而强化信号转导抑制因子SOCS1的表达实现[Gurram R K,Kujur W,Maurya SK,et al.Caerulomycin A enhances transforming growth factor-β(TGF-β)-Smad3protein signaling by suppressing interferon-γ(IFN-γ)-signal transducerand activator of tanscription 1(STAT1)protein signaling to expand regulatoryT Cells(Tregs)[J].J Biol Chem,2014,289(25):17515-17528]。接着，该小组还发现，浅蓝霉素A可以通过将T细胞阻留在G1期，从而影响在移植排斥反应中起着重要作用的T细胞核B细胞的抗原反应[Singla A K,Gurram R K,Chauhan A,et al.Caerulomycin Asuppresses immunity by inhibiting T cell activity[J].PLoS One,2014,9(10):e107051.]。值得一提的是，浅蓝霉素A的免疫抑制活性10倍优于现有临床药物环孢菌素A；鉴于此，美国Nostrum制药公司正致力于将其开发成为新型免疫抑制剂药物。
微生物体内浅蓝霉素家族化合物的产生通过聚酮/非核糖体肽杂合途径合成，即在合成模块中既有PKS模块，又有NRPS模块。距今，国内外已有很多关于浅蓝霉素的生物合成相关研究的报道，包括浅蓝霉素生物合成途径推导、关键酶的功能及催化机制阐明等。微生物发酵获取浅蓝霉素A有效地避开了化学全合成收率低、环节不友好等问题。相应产生菌的获得可为后续基因工程菌株的构建奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够产生浅蓝霉素A(cerulomycin A)的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021，该菌于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2018157。
本发明人所在研究团队在对海洋环境样品进行放线菌分离时得到了一株放线菌Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 02，后续经核糖体抗性诱变选育得到Actinoalloteichussp.AHMU CJ 021菌株。对新菌株Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 021进行发酵并运用活性追踪进行分离获得1个单体化合物。通过1H-NMR，13C-NMR、MS等波谱分析以及理化数据对照，将其结构鉴定为浅蓝霉素A，结构式见式(I)：
选育得到的新菌株Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 021与直接分离得到的Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 02菌株在菌落形态上没有明显差别，但后者(Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 02)不能产生浅蓝霉素A，具体如图2所示。
本发明的目的之二是提供海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ021在制备浅蓝霉素A中的应用。
本发明的目的之三是提供浅蓝霉素A的制备方法，所述的浅蓝霉素A是从海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括以下步骤：
(a)制备海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏B；
(b)将浸膏A和浸膏B合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，用体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96:4，94:6洗脱的馏分Fr.3和Fr.4，经纯化获得浅蓝霉素A。
所述的纯化是将Fr.3和Fr.4过中压反相柱层析，以流动相甲醇/H2O 0％～100％v/v梯度洗脱60min，流速10mL/min，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12，经HPLC追踪检测，对Fr.5-Fr.8进行常压正相柱层析，使用石油醚-乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有浅蓝霉素A的馏分用半制备高效液相色谱仪纯化获得浅蓝霉素A。
所述的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的发酵培养物是通过以下方法制备：将海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021接入种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基中，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：麦芽提取粉10g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖4g/L，海盐30g/L，余量为水，pH＝7.2～7.4。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种能够产生浅蓝霉素A的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021，利用该菌可以制备浅蓝霉素A，从而为浅蓝霉素A的生产制备提供了生物制备方法，具有广阔的应用前景。
本发明的海洋异壁放线菌Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 021于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2018157。
附图说明
图1是海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的系统进化树。
图2是不同菌株发酵提取物的HPLC图谱：其中i指海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021发酵生产浅蓝霉素A(cerulomycin A)；ii指菌株(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 02在与海洋异壁放线菌AHMU CJ 021相同的发酵条件下发酵不能生产浅蓝霉素A(cerulomycin A)。
图3是化合物1(浅蓝霉素A)的高分辨质谱结果。HR-ESI-MS[M+H]+：230.0932；HR-ESI-MS[M+Na]+：252.0757，MF：C12H11N3O2。
图4是化合物1(浅蓝霉素A)的核磁共振氢谱(1H-NMR)。
图5是化合物1(浅蓝霉素A)的核磁共振碳谱(13C-NMR)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的分离与鉴定
本发明的海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 02是从我国东海海域的沉积物样品中分离得到的。
该菌株的分类学特征是：
1、形态学特征：
菌落干燥，单菌落一般呈圆形，较小，较紧密，易扩散，中间凸起，基内菌丝与气生菌丝易挑起，末期产孢子后，孢子易刮取。在ISP2培养基上形成灰色的气生菌丝和黑色的基质菌丝。
2、分子生物学分离特征：
提取上述Actinoalloteichus sp.AHMU CJ 02菌株的基因组DNA，通过常规方法PCR扩增其16S rDNA序列，并测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，构建基于16SrDNA序列的系统进化树(如图1所示)，显示菌株AHMU CJ 02与异壁放线菌属序列相似性度为99％，表明菌株AHMU CJ 02为海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)，后菌株AHMUCJ 02经核糖体抗性诱变选育得到菌株AHMU CJ 021，菌株AHMU CJ 021命名为海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021，该菌于2018年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2018157。
实施例2：浅蓝霉素A(cerulomycin A)的分离鉴定
1、制备海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021的发酵培养物：
(1)种子培养基和发酵培养基的配制：
a)种子培养基的配制：每升种子培养基中含有麦芽提取粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海盐30g，余量为水，pH＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调pH值，配制1L种子培养基，然后平均分装于20个250mL锥形瓶中，每个装有50mL种子培养基，115℃灭菌30min，冷却后备用。
b)发酵培养基的配制：每升发酵培养基中含有麦芽提取粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，海盐30g，余量为水，pH＝7.2～7.4，将各组分按其含量混合均匀，调pH值，配制4L发酵培养基，然后平均分装于20个1L锥形瓶中，每个装有200mL发酵培养基，115℃灭菌30min，冷却后备用。
(2)种子的培养：
将活化的海洋异壁放线菌AHMU CJ021接入到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，于28℃、200rpm的振荡培养24～48h，得到种子培养液。
(3)规模发酵培养：
将上述锥形瓶中的50mL种子培养液转接到装有200mL发酵培养基的1L锥形瓶中，于28℃、200rpm的摇床上培养7-9天，获得海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的发酵培养物。
2、海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021所产浅蓝霉素A(cerulomycin A)的分离
(1)发酵培养物的萃取
将海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的发酵培养物进行离心分离(3800～4000r/min，10～15min)使发酵上清液与菌丝体分开；发酵上清液使用等体积丁酮萃取3次，丁酮相经旋蒸冷凝浓缩之后得到浸膏A；菌丝体使用丙酮(1.5L)浸泡萃取，超声处理得到丙酮浸提液，丙酮浸提液经旋蒸冷凝浓缩后得到浸膏B。
(2)浅蓝霉素A(cerulomycin A)的提取
经HPLC分析，浸膏A和浸膏B的成分类似，将浸膏A和浸膏B合并，经正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇作为流动相，从体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，100％氯仿梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.1，氯仿-甲醇体积比为98:2梯度下洗脱下来的馏分记为Fr2，氯仿-甲醇体积比为96:4梯度下洗脱下来的馏分记为Fr3，氯仿-甲醇体积比为94:6梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.4，氯仿-甲醇体积比为92:8梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.5，氯仿-甲醇体积比为90:10梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.6，氯仿-甲醇体积比为80:20梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.7，氯仿-甲醇体积比为50:50梯度下洗脱下来的馏分记为Fr.8。
对上述馏分Fr.1～8进行高效液相分析，发现Fr.3和Fr.4馏分中含有化合物cerulomycin A(如图2中的i所示)，Fr.3和Fr.4经中压反相柱层析(流动相CH3CN/H2O 0％～100％v/v梯度洗脱60min，流速10mL/min)，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12。经HPLC追踪检测，对馏分Fr.5～8进行常压正相柱层析，使用石油醚：乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有化合物cerulomycin A的馏分用半制备高效液相色谱仪(YMC-Pack ODS-A column)进一步纯化：条件为流动相CH3CN/H2O 45％～90％v/v梯度洗脱30min，流速2.5mL/min，得到化合物1(化合物cerulomycin A，保留时间15.8min)。
(3)浅蓝霉素A(cerulomycin A)的鉴定
通过结构分析，对本发明的从海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ021的发酵培养物中制备的化合物的鉴定结果如下：
化合物1，白色粉末，HR-ESI-MS(+)给出准分子离子峰m/z 230.0932[M+H]+，252.0757[M+Na]+，预测分子式为C12H11N3O2，不饱和度为9。1H-NMR高场区有一个甲氧基的质子信号，低场区有6个耦合的芳香氢信号，根据其耦合常数可分为两组：δH 7.90(d,J＝2.0Hz)和7.32(d,J＝2.0Hz)；8.68(d,J＝7.5Hz)、8.38(d,J＝7.0Hz)、7.94(dd,J＝7.5,7.0Hz)及7.45(dd,J＝7.5,7.5Hz)，结合碳谱中的芳碳信号，以及分子中存在氮原子，提示分子中存在两个芳环体系，推测为吡啶环，占用10个芳碳；剩余的一个芳碳信号，结合1H-NMR在低场区存在一个单峰芳香质子信号δH 8.15(s)，以及一个活泼质子信号δH 11.73(1H，s)，推断分子中存在醛肟的结构单元。化合物1的高分辨质谱见图3所示，核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)分别见图4、5所示。
经与文献对比[McInnes A.,Smith D.,Wright J.et al.Caerulomycins B andC,new 2,2'-dipyridyl derivatives from Streptomyces caeruleus[J].CanadianJournal of Chemistry,1977,55(24):4159-4165]，确定化合物1为浅蓝霉素A(cerulomycin A)，其结构如式(I)所示。
化合物1的波谱数据如下表1：
表1化合物1的NMR数据(500/125MHz,TMS为内标,ppm)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽医科大学
<120> 一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素A中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 异壁放线菌AHMU CJ 021(Actinoalloteichus sp. AHMU CJ 021)
<400> 1
catgcaagtc gagcggtaag gcccttcggg gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac 60
gtgggcaacc tgccctgcac tctgggataa cctcgggaaa ccggggctaa taccggatac 120
gaccttcccc cgcatggggg tgggtggaaa gttccggcgg tgcaggatgg gcccgcggcc 180
tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag 240
ggcgaccggc cacactggga ctgagatacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgcg caatgggcga aagcctgacg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt 360
cgggttgtaa acctctttca gcgccgaaga agcgaaagtg acggtaggcg cagaagaagc 420
accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat 480
tattgggcgt aaagagctcg taggcggttt gtcgcgtcga ctgtgaaaac ctacagctta 540
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ggtgtagcgg tggaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg 660
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gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat 840
tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc 900
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gcaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttgttccat gttgccagca cgtaatggtg gggactcatg ggagactgcc 1080
ggggtcaact cggaggaagg tggggatgag gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg 1140
cttcacacat gctacaatgg ccggtacaga gggctgcgaa atcgcaaggt ggagcgaatc 1200
tcttaaagcc ggtctcagtt cggatcgggg tctgcaactc gaccccgtga agtcggagtc 1260
gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1320
cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc gaagcccgtg gcccaaccct tgtgggggga 1380
gc 1382

Claims (6)

1.海洋异壁放线菌(Actinoalloteichus sp.)AHMU CJ 021，其保藏编号为：CCTCC NO:M2018157。
2.权利要求1所述的海洋异壁放线菌AHMU CJ 021在制备浅蓝霉素A中的应用。
3.一种浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的浅蓝霉素A是从权利要求1所述的海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的发酵培养物中制备得到的。
4.根据权利要求3所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)制备海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵上清液和菌丝体分开，发酵上清液用丁酮萃取，丁酮相经浓缩后得到浸膏A，菌丝体用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液经浓缩后得到浸膏B；
(b)将浸膏A和浸膏B合并，采用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，用体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20，50:50进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为96:4，94:6洗脱的馏分Fr.3和Fr.4，经纯化获得浅蓝霉素A。
5.根据权利要求4所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的纯化是将Fr.3和Fr.4过中压反相柱层析，以流动相甲醇/H2O 0％～100％v/v梯度洗脱60min，流速10mL/min，每馏分50mL，顺序得到12个馏分Fr.1～12，经HPLC追踪检测，对Fr.5-Fr.8进行常压正相柱层析，使用石油醚：乙酸乙酯按7:3，6:4，5:5，4:6，3:7体积比梯度洗脱，以HPLC追踪，将含有浅蓝霉素A的馏分用半制备高效液相色谱仪纯化获得浅蓝霉素A。
6.根据权利要求4所述的浅蓝霉素A的制备方法，其特征在于，所述的海洋异壁放线菌AHMU CJ 021的发酵培养物是通过以下方法制备：将海洋异壁放线菌AHMU CJ 021接入到种子培养基中，发酵得种子培养液，将种子培养液接入到发酵培养基中，发酵得到发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方均为：麦芽提取粉10g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖4g/L，海盐30g/L，余量为水，pH＝7.2～7.4。
CN201910440696.2A 2019-05-24 2019-05-24 一种海洋异壁放线菌及其在制备浅蓝霉素a中的应用 Pending CN110295121A (zh)

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WO2007031832A2 (en) * 2005-09-12 2007-03-22 Council Of Scientific And Industrial Research Use of bipyridine compound 'caerulomycin a' derivatives and analogs thereof as immunosuppressive agents

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纪昌涛 等: "2株海洋来源产浅蓝霉素A的异壁放线菌的分离和鉴定", 《微生物学杂志》 *

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