JP2009507506A - 核酸混合物からの二本鎖ｄｎａの選択的濃縮のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、二本鎖ＤＮＡ、特に、スーパーコイルプラスミドＤＮＡから、不要な核酸成分を除去するための方法に関する。本発明に記載の方法は、（ａ）完全におよび／または部分的に二本鎖の核酸および任意に一本鎖核酸を含む混合物の供給；（ｂ）段階（ａ）由来の混合物の、低イオン強度および低緩衝作用を有する水性低モル濃度緩衝液系を用いる再懸濁；（ｃ）段階（ｂ）由来の混合物の条件を、完全におよび／または部分的に二本鎖の核酸が変性する条件に調整；（ｄ）緩衝液およびポリマー成分の、段階（ｃ）由来の混合物へのさらなる添加；（ｅ）上相および下相のある水性二相系の形成に十分な時間の、段階（ｄ）由来の混合物のインキュベート；および（ｆ）一本鎖核酸を含む上相の除去および下相からの二本鎖核酸の回収：の段階によって特徴づけられる。
【選択図】図２

Description

本発明は、二本鎖ＤＮＡの、特にスーパーコイルプラスミドＤＮＡの、核酸混合物からの選択的濃縮のための方法に関する。本発明は、スーパーコイル（ｓｃ）プラスミドＤＮＡといった二本鎖核酸を含む調製物からの、たとえばリボ核酸（ＲＮＡ）、変性ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／または部分的に変性した開環プラスミドＤＮＡといった一本鎖核酸の回収（除去）に関する。

先行技術では、キットでおよび「ハイスループット（高処理量）」（ＨＴ）スケールでの両方で、および製造スケールで、治療用途のためにプラスミドＤＮＡを単離するための多数の方法が存在するが、それはしかし大多数の場合、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（通常の条件下では二本鎖型で存在する）および／または開環プラスミドＤＮＡ（ｏｃ ｐＤＮＡ）のｓｃプラスミドＤＮＡ（ｓｃ ｐＤＮＡ）からの分離を扱わない。

しかし、特にこの問題を扱う一連の文献がある。分析用途では、ｐＤＮＡのｏｃ／ｓｃ分離のためにはクロマトグラフィー法が主に見られるが（たとえばＴＳＫｇｅｌ、ＤＥＡＥ−ＮＰＲ および東ソー・バイオサイエンス社（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＴＳＫｇｅｌシリーズの他の製品）、しかしキャピラリーゲル電気泳動法および、配列特異的ハイブリダイゼーションに関連するさまざまな生物学的方法（たとえばいわゆる三重らせんなど）もまた使用される。

一部のクロマトグラフィー技術（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のプラスミド・セレクト樹脂および他のＨＩＣ樹脂）がパイロットスケールおよび製造スケールでのｐＤＮＡの調製的処理について記載されているが、それはしかし複雑な操作、高い投資コストおよび特に低収量効率によって特徴づけられる。

近年、プラスミドＤＮＡの調製的単離のための二相分離の使用に関する文献もある。下記の研究では、しかし、一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡから分離する問題は全く記載されていないかまたは技術的に不十分である。例．たとえばケプカ（Ｋｅｐｋａ）Ｃ，ロージン（Ｒｈｏｄｉｎ）Ｊ，レメンズ（Ｌｅｍｍｅｎｓ）Ｒ，チェルネルド（Ｔｊｅｒｎｅｌｄ）Ｆ，グスタフソン（Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ）Ｐ−Ｅ．，２００４，熱分離水性二相系における大腸菌細胞溶解物からのプラスミドＤＮＡの抽出（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ ｉｎ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）＊１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １０２４（１−２）：９５−１０４．；フレリクス（Ｆｒｅｒｉｘ），Ａ．，ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ），Ｍ．，クラ（Ｋｕｌａ）．Ｍ．−Ｒ．，およびフブーフ（Ｈｕｂｂｕｃｈ）Ｊ．水性二相分離に基づくプラスミドＤＮＡのスケール変更可能な回収（Ｓｃａｌａｂｌｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）０４２，５７−６６；リベイロ（Ｒｉｂｅｉｒｏ）Ｓ．Ｃ．，モンテイロ（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ）Ｇ．Ａ．，カブラル（Ｃａｂｒａｌ）Ｊ．Ｍ．Ｓ．，プラゼレス（Ｐｒａｚｅｒｅｓ）Ｄ．Ｍ．Ｆ．，２００２，水性二相系による細胞溶解物からのプラスミドＤＮＡの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ ｂｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７８（４）：３７６−３８４．

たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびチオフィリック・クロマトグラフィー（レメンズ（Ｌｅｍｍｅｎｓ）Ｒ．，オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ）Ｕ．，ニハマー（Ｎｙｈａｍｍａｒ）Ｔ．，スタッドラー（Ｓｔａｄｌｅｒ）Ｊ．，２００３，スーパーコイルプラスミドＤＮＡ：チオフィリック／芳香族吸着による選択的精製（Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ／ａｒｏｍａｔｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７８４（２）：２９１−３００）および向流クロマトグラフィー（ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）Ｄ．，ブース（Ｂｏｏｔｈ）Ａ．Ｊ．，レビー（Ｌｅｖｙ）Ｍ．Ｓ．，ライ（Ｌｙｅ）Ｇ．Ｊ．，２００１，液−液向流クロマトグラフィーによるスーパーコイルおよび開環プラスミドＤＮＡの分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ａｎｄ ｏｐｅｎ−ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ−ｌｉｑｕｉｄ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３（８）：６１３−６１９）のような、ｏｃ／ｓｃ分離のための記載された方法は、低容量および／または収率の不足のため、非常に時間を要し、および非常に費用がかかり、それはこれらの方法の欠点と見なされなければならない。

本発明の目的は、したがって、（部分的に）変性したｇＤＮＡおよびｏｃ ｐＤＮＡおよび他の一本鎖核酸を、ｓｃプラスミドＤＮＡのような二本鎖核酸から、公知の方法の上記の欠点を許容する必要無しに、選択的に分離することを可能にする方法を特定することである。特に、本目的は、ｐＤＮＡを他の核酸から分離することを可能にすることに見られる。

本発明はこの目的を、独立請求項１に特定される方法によって達成する。本発明に記載の方法の別の有利な実施形態は、従属請求項、説明、実施例および図面に見ることができる。

本発明は、たとえばＲＮＡ、変性したゲノムＤＮＡおよび部分的に変性した開環プラスミドＤＮＡのような一本鎖核酸の、同様にスーパーコイルプラスミドＤＮＡのような二本鎖核酸を含む調製物からの、特異的除去のための方法に関する。特定の場合には、たとえば、本発明は、ｇＤＮＡおよびｏｃ ｐＤＮＡの選択的変性、および続いての二相系での抽出によるそれらの分離を可能にする。これは、したがって、たとえばｓｃ ｐＤＮＡのような二本鎖核酸への徹底した精製を含む。本方法は、ゲノムＤＮＡ、ループを形成するＲＮＡおよび未変化二本鎖ｏｃ−ｐＤＮＡのような二本鎖核酸の部分が、完全にまたは部分的に、変性によって選択的に個別の鎖へ移行し、および続いて水性二相系において高い効率および容量でｓｃプラスミド−ＤＮＡのような二本鎖核酸から選択的に分離される事実によって特徴づけられる。変性段階は、好ましくは、強アルカリ性条件（たとえばＮａＯＨ、ＫＯＨなどの添加）または熱インキュベート（核酸のＧＣ含量に応じて、たとえば７０℃以上、特に８０℃以上への加熱）によって誘導されうる。既存の従来の（たとえばクロマトグラフィー）方法と比較して、提示される本発明の長所は、特に顕著に低いコスト、実行の著しく速い速度、および方法をより容易に自動化する能力にある。

本発明は、部分的におよび完全に変性した核酸を、二本鎖核酸、特にｓｃ ｐＤＮＡから選択的に除去する方法に関する。本方法は、特に、ｓｃ ｐＤＮＡ調製物のパイロットおよび製造スケールでの製造に、たとえばヒト遺伝子ワクチン接種のためまたは遺伝子治療用途のためのｓｃプラスミドＤＮＡの製造に適するが、しかしその簡易さのために、手操作キットおよび自動化高処理量（ＨＴ）用途、たとえば診断における使用に適している。本発明に記載の方法は特に、一本鎖核酸および開環（ｏｃ）プラスミドＤＮＡの、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを含む調製物からの選択的除去によく適する。

臨床または診断用途のためにプラスミド分子を洗浄する際は、工程開発は一方では達成すべき製品品質に、およびもう一方ではこれと比例して結果として生じる調製コスト（原価）に焦点を当てる。これに関連して、標的分子（たとえばｐＤＮＡ）の必要純度に関しての目的は相当に異なりうる。たとえば、医療用途における目的のおよび必要な純度の程度は、比較すると大部分の診断用途で必要とされるよりは顕著に高い。しかし、両方の分野において、工程最適化の目的は、商業用途を可能にするために、洗浄のコストを最小限に低減することである。この目的は、高分離能の洗浄法の開発によってのみ達成が可能であり、なぜならこれらは同時に、必要な洗浄段階の数を可能な限り小さく保つことを可能にするためである。

この目的（すなわちプラスミドＤＮＡの可能な限り非常に効率的な洗浄）は、除去すべき成分が標的分子と物理化学的により類似しているほど一層困難になる。いわゆる開環（ｏｃ）プラスミドＤＮＡは、スーパーコイル（ｓｃ）プラスミドＤＮＡと、本質的にｏプラスミド分子の二重らせん構造の一方の鎖または両方の鎖の１個または数個の鎖切断だけが異なり、これはまた結果としてその二つの位相形の立体構造差に繋がる。ｏｃ ｐＤＮＡはｓｃ ｐＤＮＡから、主にｉｎ ｖｉｖｏに存在するｓｃ ｐＤＮＡの酵素的または機械的切断によって主に作製される。その実施の際に、２つの個別の鎖が閉じられて一つの二重鎖を形成する前に、二本の鎖の一方または両方の鎖がねじれ、そのため、結果として生じる歪みのために、閉じられて一つの二重鎖を形成した後にループ（「スーパーコイル」）が形成される場合にｓｃ ｐＤＮＡが生じる。

本発明は、達成すべき核酸の目的の分離を高度に選択的におよび極めて容易に、迅速におよび特に高い費用対効果で初めて可能にする。その実施の際に、二本鎖ＤＮＡ（たとえばｓｃ ｐＤＮＡ）からの（部分的に）一本鎖ＤＮＡ（たとえば変性ｏｃ ｐＤＮＡ）のほぼ定量的分離が、ＷＯ ２００４／１０６５１６ Ａ１に記載されるように、続いての二層分離での一本鎖および二本鎖核酸を与える注意深い処理後に達成される。これは、安価な添加剤によって達成され、それは何ら問題なく廃棄でき、同時に本発明の高度に特異的な能力を有する。

本発明は、したがって、たとえば１１以上のアルカリ性ｐＨ値の作用によるか、または熱による、二本鎖 核酸の特異的な完全または部分変性を記載する。そのような変性は、ＤＮＡまたは ＲＮＡのような一本鎖核酸が、ＤＮＡのような二本鎖 核酸と比較して、希釈特性の変化のために、位相系において異なる分配係数に従うという結果を有する。

ｏｃ ｐＤＮＡと対照的に、たとえば、ｓｃ ｐＤＮＡもまた変性相の間は変性するが、しかし、たとえば中性化または冷却後に、いわゆるスーパーコイルの三次元位相および結果として生じる立体安定化のために、完全に元のスーパーコイル二重らせん構造に再生する。二本鎖ＤＮＡと比較して、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡはより疎水性の表面を有し、それは遊離塩基の存在が原因でありうる。たとえばｏｃおよびｓｃ ｐＤＮＡの異なる再生および変性特性、および結果として生じる構造特性、疎水性および電荷密度のために、その二つのプラスミド位相異性体の高度に選択的な分離が、水性二相系における抽出によって達成されうる。

本発明では、この機構は、ｓｃ ｐＤＮＡおよびｏｃ ｐＤＮＡおよびｇＤＮＡの表面特性間の通常は極めて小さい差を、意図的な選択的変性によって相当に増幅するために意図的に用いられ、その結果として後の分離が高度に効率的に実施されうる。

本発明のために、緩衝液が段階（ｄ）で添加される。リン酸カリウム緩衝液が好ましくはここでは用いられる。この場合、緩衝液は特に好ましくはＫ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄の混合物を含む。本発明に記載の緩衝液は、好ましくはｐＨ５．８ないしｐＨ８．５の範囲のｐＨ値で、および特に好ましくはｐＨ６．５ないしｐＨ８の範囲のｐＨ値で用いられる。たとえば、３．８３Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₄および２．４５ Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄およびＰＥＧ８００濃度７５％ｗ／ｗ（ｐＨ値約７を結果として生じる）のストック溶液の混合物が、特に好ましくは本発明に記載の方法に使用されうる。この場合、Ｋ₂ＨＰＯ₄およびＫＨ₂ＰＯ₄は、たとえば二相系について総濃度５〜３０％（ｗ／ｗ）で、好ましくは総濃度１０〜２５％（ｗ／ｗ）で、および特に好ましくは総濃度２０％（ｗ／ｗ）で使用される。リン酸カリウムは通常は、氷冷ないし室温の温度範囲で添加される。本発明によって定義される室温は、１８から２５℃の温度範囲を示す。好ましくは、氷冷リン酸緩衝液が、本発明に記載の方法に用いられる。有利なことに、リン酸カリウムの添加後にインキュベートは必要ない；緩衝液添加後の溶液の可能な限り完全なおよび均一な混合が決定因である。インキュベートが実施されるべき場合は、しかし、インキュベート期間は通常は約１から１５分間である。好ましくは、上述の通り、調製物は塩成分の添加中および／または後に、撹拌、たとえば強く振とう、撹拌などする。

本発明に記載の使用されるポリマー成分は、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは、好ましくは分子量の相加平均６００から１０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは相加平均７００〜９００ｇ／ｍｏｌおよび特に好ましくは相加平均７５０〜８８０ｇ／ｍｏｌであるものが、二相系の二つの成分の一方として用いられる。本発明で使用されるＰＥＧは、好ましくは、平均分子量６００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６００）および平均分子量１０００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０００）の混合物から成る。両方のポリエチレングリコールは市販されている（たとえばフルカ社（Ｆｌｕｋａ）、スイス、ブーフス（Ｂｕｃｈｓ））。この場合、既製のＰＥＧ混合物は、たとえば、３０〜５０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６００および５０〜７０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ１０００から、好ましくは３３〜４５％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６００および５５〜６７％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ１０００、特に好ましくは３６〜４０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６００および６０〜６４％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ１０００から、および非常に特に好ましくは３８％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６００および６２％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ１０００から成る。

本発明に記載の水性二相系におけるＰＥＧの濃度は、塩成分と共に二相が形成するように選択され、ここでしかし、たとえばより低濃度では下相に見られるプラスミドＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡが、下相から上相へ移るＰＥＧ濃度を超えない。好ましくは、混合物全体中のＰＥＧ含量は、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）であり、および、より低濃度では下相に見られる二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）が、下相から上相へ移るＰＥＧ濃度によって上側が限定される。ＰＥＧの添加後、溶液は好ましくは温度約１０から５０℃、特に好ましくは温度約１５から４０℃とすべきである。調製物の体積に応じて数分から数時間を要しうるが、相の形成後、二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）は塩水下相に見られる。選択肢として、相の形成は調製物を遠心分離することによって加速でき、その結果として、有利なことに、本発明に記載の方法に必要な時間がさらに低減される。そのような遠心分離段階が実施される条件は当業者が詳しい。

固相吸着と比較して、水性二相系は、洗浄すべき二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）の容量が、事実上、相への溶解度によってのみ限定され、顕著に高いという長所を有する。さらに、本方法は、必要なのは非常に簡易な装置のため、ほとんど任意にスケール変更されうる。しかし自動化、およびそれと独立して、たとえば調製一回当たり２ｇを大きく上回る高度に洗浄されたプラスミドの製造のための、工業スケールでの製造は、ここに記載の簡易化を用いて初めて容易に達成されうる。同様に、本発明を用いて、二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）は、有利なことに、ＲＮＡおよび変性ｇＤＮＡから非常に高度に遊離でき、それは多数の用途、特に臨床用途では、ある程度規制上の必要事項である。本発明に記載の方法を用いて精製されるプラスミドＤＮＡは、特に最初の洗浄段階後（たとえばキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ樹脂による、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））、遺伝子治療または遺伝子ワクチン接種において現在許容される承認規格内である。このように、大量の高純度のプラスミドＤＮＡが、非常に少ない費用しか要せずに、一方で無毒性物質を用いておよび比較的低コストで、有利に製造されうる。この点に関して、たとえばＣｓＣｌ密度勾配遠心分離またはフェノール抽出といった他の単離方法と比較して、本発明に記載の二相系に使用される物質は環境に無害であり、および洗浄されたプラスミドＤＮＡから完全におよび容易に除去されうることが記載されるべきである。

本発明に記載の方法では、下相は段階（ｅ）で作製されおよび二本鎖ＤＮＡを含むが、不要な核酸を含む上相から分離され、すると、目的の二本鎖ＤＮＡを濃縮された形で下相から得ることができる（段階（ｆ））。単相だけを用いる分離によって高度の除去が達成されうるが、本発明に記載の方法の効率は、段階（ｄ）から（ｆ）を１回から数回反復することによって、または向流原理を用いる抽出を実施することによって、さらに高めることができる。たとえば、方法段階（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を１回から３回反復するのが都合がよい。ｓｃプラスミドＤＮＡのような、極めて高度に濃縮された二本鎖核酸については、段階（ｄ）から（ｆ）もまた、必要な純度が達成されるまで４回以上反復されうる。二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）は、それぞれの場合で、下相に見つかることになる。この任意段階を実施することは、二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）の反復洗浄に、およびしたがってたとえばＲＮＡのような夾雑物の、二本鎖ＤＮＡ（たとえばプラスミドＤＮＡ）からのさらなる除去に繋がる。

本発明に記載の方法に続いて、下相に見つかることになる二本鎖ＤＮＡ（ｓｃプラスミドＤＮＡのような）を単離するのが都合がよい。段階（ｅ）で生じる下相由来の（プラスミド）ＤＮＡの単離および脱塩は、たとえば限外ろ過、ダイアフィルトレーション、またはゲルろ過によって実施されうる。しかし、本発明の目的のためには、当業者に公知である任意の他の方法が、下相由来の（プラスミド）ＤＮＡの単離および／または脱塩に使用されうる。

段階（ｂ）に使用される水性低モル濃度緩衝液は、好ましくは、低イオン強度しか有しない弱い緩衝液である。使用される緩衝液のモル濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、および特に１０ｍＭ以下である。

適当な水性低モル濃度緩衝液系の例は、トリス緩衝液、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）またはクエン酸緩衝液、および当業者に適切であるように見える他の緩衝液系である。

段階（ｃ）において変性条件を作るために、溶液のｐＨ値を１１以上に高めることができ、または温度を７０℃以上に高めることができる。ｐＨ値は、ＮａＯＨまたはＫＯＨのような強塩基を加えることによって通常の方法で高めることができる。温度を上昇させる際は、洗濯される温度が約７０ないし９５℃、特に約８０ないし９５℃である場合が有利である。ここでは最適温度は、存在する核酸のＧＣ含量に依存する。

本発明に記載の方法が予備洗浄または予備分離に続いて実施される場合は特に有利であることが示されており、ここで予備洗浄／予備分離には任意の公知の方法が使用されうる。特に適する予備洗浄／予備分離は、たとえば、ＷＯ ２００４／１０６５１６ Ａ１で知られる水性二相分離である。適当な手順を用いて、非常に高い程度の洗浄が達成されうる。たとえば、この方法では、試料中のｓｃ ｐＤＮＡの含量を、存在する核酸の総量に対して全体で９０％以上に、特に９５％以上に、および９９％以上にさえ、高めることが可能である。予備洗浄／予備分離に特に適した別の方法は、試料中で匹敵するパーセンテージのｓｃ ｐＤＮＡが達成されうる陰イオン交換クロマトグラフィーである。

本発明は実施例を参照して下記でより詳細に説明される。

実施例１
この実施例は、アルカリ性条件下でのｏｃ ｐＤＮＡの変性および二相系における除去に関する。

予備洗浄されおよび濃縮された、ｏｃ ｐＤＮＡおよびｓｃ ｐＤＮＡおよび他の核酸ＲＮＡおよび部分的二本鎖ｇＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ調製物を、強アルカリ性ｐＨ値（＞１１）にてインキュベートする。これらの条件下で、ｇＤＮＡ二重らせんおよび二本鎖ＲＮＡ（たとえばｔＲＮＡ）の変性（鎖分離）が達成され、それは未変化スーパーコイルＤＮＡの限定領域でしか逆転できない。変性調製物を、ｏｃ／ｓｃ ｐＤＮＡ位相異性体の分離に最適化されている緩衝された相系へ移した後、ｓｃ ｐＤＮＡ標的分子からの、ｏｃ ｐＤＮＡ、ｇＤＮＡおよび部分的二本鎖ＲＮＡの効率的なおよび分解能の高い分離が起こる。

これは下記の通り実施された。ＮａＯＨ５ｇ（０．４ＭＮａＯＨを、プラスミドを含む開始溶液１５ｇ（３６μｇ／ｍｌ、ＨＰＬＣによって測定）に加えた。反応調製物を混合し、および室温にて５分間インキュベートした。リン酸カリウム緩衝液２０ｇ（５０％ｗ／ｗ、ｐＨ７．４）および１０ｇのＰＥＧ８００（７５％ｗ／ｗ）を次いで加えた。この組成物を次によく混合した。混合後、調製物の典型的な混濁が生じた。上相および下相の安定化は、遠心分離（たとえば２０００ｇにて５分間）によって加速されうる。分離した下相は洗浄されたｓｃ ｐＤＮＡを含み、一方、変性したＤＮＡ（ｏｃ ｐＤＮＡおよびｇＤＮＡ）は白色の「スメア」として相の境界（中間相、下相および上相の間）に見ることができる。

結果は図１に示す０．８％アガロースゲルに見ることができる。下記が図中に見られる：
試料１および２、および３および４を、同一の体積比で、洗浄前および洗浄後に加えた。図１に示すアガロースゲルから、本発明に記載の方法に供されおよび水性二相分離後に下相から除去されているレーン３および４の核酸のｏｃ ｐＤＮＡ（下から３番目のバンド）の割合が開始溶液を示すレーン１および２と比較して大幅に減少していることを、明らかに見ることができる。ｓｃ ｐＤＮＡ標的分子（下から２番目のバンド）は高度に洗浄された形で存在する。図１のレーン３および４からまた、核酸試料の本発明に記載の処理の結果として、試料の低分子ＲＮＡ残留物（一番下のバンド）が事実上定量的に除去されていることも判る。最後に、レーン５（中間相）では、ポケット混入物の形で低分子ＲＮＡ残留物（一番下のバンド）および変性したＤＮＡしか見られない。

実施例２
この実施例は、熱インキュベートによるｏｃ ｐＤＮＡの変性および二相系における除去に関する。ｐＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）およびｇＤＮＡ（４９μｇ／ｍｌ）を含む合計３５０μｌをＴＥで調製した。調製物を次いで７０から９５℃の温度へ加熱し（５℃段階で）、各例で５分間インキュベートし、および次いで各例で氷上にて５分間冷却した。試料３００ｍｇを次いでＴＥ３００ｍｇと混合し、およびリン酸緩衝液６００ｍｇ（５０％、ｗ／ｗ）および３００ｍｇのＰＥＧ（７５％、ｗ／ｗ）を加えおよび混合した。この後、調製物を遠心分離した。総体積は１．２ｍｌであり、うち６５０μｌを下相が占め、それが洗浄されたｓｃＤＮＡを含んだ。

結果は図２に示す０．８％アガロースゲルに見ることができる。下記が図中に見られる：
図２に示すアガロースゲルの一番下のバンドがｓｃ ｐＤＮＡを示す。与えられた条件下でおよび使用したプラスミドｐＣＭＶβについて、５分間インキュベートを伴う変性温度８０℃は、ｇＤＮＡおよびｏｃ ｐＤＮＡのｓｃ ｐＤＮＡからの事実上定量的な分離を達成するのに十分であることもまた、ゲルから見ることができる。

実施例３
この実施例は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる一次洗浄後の、アルカリ変性および水性二相系抽出による、ワクチン接種プラスミドのｏｃ ｐＤＮＡ除去（「精製」）に関する。

遺伝子治療薬および遺伝子ワクチン接種のためのプラスミドＤＮＡの製造は、厳密な規制および厳しい規格の対象である。ある種のプラスミド配列は、調製物中で「ニック」を生じる、すなわち一本鎖切断を生じ、およびしたがって高い割合のｏｃ ｐＤＮＡを形成する傾向にある。結果として生じるｏｃ ｐＤＮＡの部分は、最初の洗浄後に除去されなければならない。本例では、この除去は陰イオン交換クロマトグラフィーによって実施された。

試験は下記の通り実施された。プラスミド溶液５９．２４ｇ（４ｍｇ／ｍｌ）を、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液５４０．８ｇ（ｐＨ値８）に加えた。ＮａＯＨ２００ｇ（０．４Ｍ）を次いで加えおよび混合した。混合物を次いで５分間室温にてインキュベートした。リン酸カリウム緩衝液７００ｇ（５０％ｗ／ｗ、ｐＨ７．４）および４００ｇのＰＥＧ８００（７５％ｗ／ｗ、６０℃）を続いて混合物に加えた。これを再び混合し、および３０００ｘｇにて１０分間遠心分離した。下相（約９００ｍｌ）は洗浄されたｓｃ ｐＤＮＡを含み、それをたとえば限外ろ過またはゲルろ過によって、適当な処方溶液へ移す。

結果は図３に示す０．８％アガロースゲルに見ることができる。下記が図中に見られる：
レーン１（「精製」前）：総ｐＤＮＡ：２３６．６ｍｇ；
ポケット：４．１％主にｇＤＮＡ；
ｏｃ：２８．４％（絶対：６７．２ｍｇｏｃ ｐＤＮＡ）；
ｓｃ：６７．５％（絶対：１５９．７ｍｇｓｃ ｐＤＮＡ）；
レーン２（「精製」後） 総ｐＤＮＡ：１６８ｍｇ
ポケット：検出可能シグナル無し；
ｏｃ：１４．９％（絶対：２５ｍｇｏｃ ｐＤＮＡ）
ｓｃ：８５．１％（絶対：１４２ｍｇｓｃ ｐＤＮＡ）

図３に示すゲルの２つのレーン１および２の比較によって示される通り、洗浄段階後のｏｃ ｐＤＮＡバンド（「精製」後、レーン２参照）は、洗浄段階前（「精製」前、レーン２参照）よりも顕著に弱い。これに関係する定量結果は上の表に見ることができる。

上記に示すことから判る通り、生物試料中のｏｃプラスミドｐＤＮＡの量は、本発明に記載の方法によって６７ｍｇより大から２５ｍｇへ低減でき、すなわち約６２％の低減が達成できる。一方、本発明に記載の方法の実施後に、最初の試料中のｓｃ ｐＤＮＡ１５９．７ｍｇのうち１４２ｍｇが回収され、それは収率約８９％に相当する。

０．８％アガロースゲルの結果。 ０．８％アガロースゲルの結果。 ０．８％アガロースゲルの結果。

Claims (18)

1. 下記の段階によって特徴づけられる、二本鎖核酸から一本鎖核酸を除去するための方法：
   （ａ）完全におよび／または部分的に二本鎖の核酸および任意に一本鎖核酸を含む混合物を供給；
   （ｂ）段階（ａ）由来の混合物を、低イオン強度および低緩衝作用を有する水性低モル濃度緩衝液系に再懸濁；
   （ｃ）段階（ｂ）由来の混合物の条件を、一種類の特定の二本鎖核酸または数種類の特定の二本鎖核酸の可逆的変性に繋がり、別の一種類の核酸または数種類の核酸は非可逆的に変性する条件に調整；
   （ｄ）段階（ｃ）由来の混合物への緩衝液およびポリマー成分のさらなる添加；
   （ｅ）上相および下相のある水性二相系の形成に十分な時間の、段階（ｄ）由来の混合物のインキュベート；および
   （ｆ）一本鎖核酸を含む上相および中間相の除去および下相からの二本鎖核酸の回収。
2. 段階（ａ）由来の混合物がスーパーコイル（ｓｃ）プラスミドＤＮＡを含む点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
3. 可逆的に変性されうる、段階（ｃ）由来の特定の二本鎖核酸が、スーパーコイル（ｓｃ）プラスミドＤＮＡである点で特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。
4. 段階（ａ）由来の混合物が開環（ｏｃ）プラスミドＤＮＡを含む点で特徴づけられる、請求項１から３のうちの一つに記載の方法。
5. 段階（ｆ）で、上相中の一本鎖ｏｃプラスミドＤＮＡが下相中の二本鎖ｓｃプラスミドＤＮＡから分離される点で特徴づけられる、請求項１から４のうちの一つに記載の方法。
6. 段階（ｂ）に記載の低イオン強度および低緩衝作用を持つ水性低モル濃度緩衝液系が最大１００ｍＭのモル濃度を有する点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
7. 段階（ｂ）に記載の水性低モル濃度緩衝液系が、トリス緩衝液、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水）、またはクエン酸緩衝液である点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
8. 段階（ｃ）に記載の変性条件が、ｐＨ値を１１以上に高め、続いての十分なインキュベートを伴うことによって作られる点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
9. 段階（ｃ）に記載の変性条件が、温度を７０℃以上へ高め、およびインキュベートの完了に際して直ちに冷却が行われることによって作られる点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
10. 段階（ｄ）に記載の添加される追加の緩衝液がリン酸カリウム緩衝液である点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
11. 段階（ｄ）に記載の添加されるポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、好ましくは、それぞれ相加平均値で６００から１０００ｇ／ｍｏｌの、より好ましくは７００から９００ｇ／ｍｏｌの、および特に７５０から８８０ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧである点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
12. 下相由来の濃縮された二本鎖核酸が限外ろ過またはゲルろ過によってさらに濃縮される点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
13. 下相中の濃縮された二本鎖核酸がｓｃプラスミドＤＮＡである点で特徴づけられる、請求項１２に記載の方法。
14. 段階（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が少なくとも１回反復される点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
15. 段階（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）が３回反復される点で特徴づけられる、請求項１４に記載の方法。
16. 段階（ｅ）で下相だけがｓｃプラスミドＤＮＡを含む点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
17. 方法が予備分離／予備洗浄に続いて実施される点で特徴づけられる、前記請求項のうちの一つに記載の方法。
18. 予備分離／予備洗浄が水性核酸二相分離または陰イオン交換クロマトグラフィーである点で特徴づけられる、請求項１７に記載の方法。