JP2009278997A - 腫瘍関連抗原に対する免疫のための組換えポックス・ウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】TBC-CEA、PROSTVAC、rV-B7.1、rF-B7.1、rF-CEA、rV-MUC-1およびrF-PSAよりなる群から選ばれる組換えポックス・ウイルス。該組換えポックス・ウイルスの有効量と接触させる、癌胎児性抗原、または前立腺特異的抗原、またはmuc-1抗原を発現する腫瘍を有する宿主を治療する方法。
【選択図】なし
Description
癌の治療に対する免疫療法アプローチは、ヒト腫瘍細胞が、正常細胞では発現されない種々の腫瘍関連抗原(TAA)を発現するという知見に基づく。これらの抗原は、ウイルス腫瘍抗原、細胞性癌遺伝子タンパク質および腫瘍関連分化抗原を含み、宿主免疫系の標的として機能し、腫瘍の破壊につながる応答を惹起しうる。この免疫応答は、主にリンパ球により媒介され、一般にはT細胞が、特にクラスI MHC拘束性細胞傷害性Tリンパ球が、腫瘍拒絶において中心的な役割を果たす(Hellstrom, K.E.ら, (1969) Adv. Cancer Res. 12:167-223; Greenberg, P.D. (1991) Advances in Immunology, vol. 49 (Dixon, D.J.編), pp. 281-355, Academic Press, Inc., Orlando, FL)。残念ながら、集団内の高い癌発生率により示されるとおり、腫瘍細胞に対する免疫応答は腫瘍を排除しないことが多い。能動癌免疫療法の目標は、完全な腫瘍破壊を引き起こすために抗腫瘍応答(特にT細胞応答)を増強することである。
ポックス・ウイルスは、腫瘍関連抗原に対する免疫を誘導するための有効なベクターとして機能する。
免疫原性細胞がコード化している腫瘍関連抗原を発現する生きた組換えウイルスを使用して、該タンパク質を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導することができる。これらの組換えウイルスは、痘瘡ワクチン接種で通常行われた皮内乱切法、または、使用する組換えウイルスに適した他の経路により投与することができる。これらには、とりわけ、筋肉内、皮下および静脈内経路を含めることができる。生きた組換えワクシニアウイルスを宿主生物にワクチン接種した後、該ウイルスは該宿主内で増殖する。
QS21(Cambridge Biotech)、不完全フロインドアジュバントの他に多数が含まれる。
腫瘍特異的抗原に特異的な細胞傷害性T細胞は、前記のとおりに免疫した宿主から得た末梢血単核細胞(PBMC)から樹立することができる。例えば、PBMCは、既に文献記載(Boyumら, Scand J. Clin Lab Invest 21:77-80 (1968))されているリンパ球分離培地(Lymphocyte Separation Medium)勾配(Organon Teknika, Durham, NC, USA)を使用して分離することができる。洗浄したPBMCを、例えば、10%プールヒトAB血清(Pel-Freeze Clinical System, BrownDear, WI, USA)、2mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(GIBCO)で補足されたRPMI 1640(GIBCO)などの完全培地に再懸濁する。例えば100μlの容量の完全培地中約2×105細胞の濃度のPBMCを、96ウェル平底アッセイプレート(Costar, Cambridge, MA, USA)の各ウェルに加える。該抗原またはペプチドを、約50μg/mlの最終濃度で培養に加え、5%CO2を含有する湿性雰囲気中37℃で5日間インキュベートする。ペプチド含有培地を除いた後、該培養に、新鮮なヒトIL-2(10U/ml)を5日後に加え、IL-2含有培地を3日毎に補充する。16日目に、同じペプチド(50μg/ml)で一次培養を再刺激する。5×105個の照射された(4,000 rad)自己PBMCを、抗原提示細胞(APC)として、約50μl容量の完全培地中に加える。約5日後、前記のとおり、該培養にヒトIL-2含有培地を加える。細胞を、16日間隔で5日間再刺激する。
細胞傷害性T細胞を培養して、その数を増幅し、ついで種々の手段により該宿主に再注射することができる。一般には、注入1回当たり1×105個〜2×1011個の細胞傷害性T細胞を、それぞれ200〜250mlの1〜3回の注入で30〜60分間にわたり投与する。該注入の完了後、体重1kg当たり720,000 IUの用量の組換えインターロイキン-2を8時間毎に静脈内投与することにより患者を治療することができる。該薬物に対する患者の許容度に応じて、何回かの投与を省略することができる。さらに、注入後、T細胞惹起エピトープを含有する追加的抗原または断片を患者に投与して、T細胞数をさらに増加させることができる。該抗原またはエピトープはアジュバントと共に製剤化することができ、および/または、リポソーム製剤中に存在することが可能である。
ベクターの構築
ポックス・ウイルス
多数のポックス・ウイルスが、異種タンパク質の発現のための生きたウイルスベクターとして開発されている(Cepkoら, Cell 37:1053-1062 (1984); Morinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626-4630 (1987); Loweら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3896-3900 (1987); PanicaliおよびPaoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931 (1982); Machettら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982))。代表的な鶏痘および豚痘ウイルスは、それぞれ受託番号VR-229およびVR-363でATCCから入手可能である。ワクシニアのWyeth株は、受託番号VR-325でATCCから入手可能である。
親ワクシニアウイルス(クローンB-3-1)は、Flow Laboratoriesから入手したWyeth株のプラーク精製分離体である。
継代1: プラーク「B」を10-5.3希釈で拾い上げた。
継代2: プラーク「B-3」を10-1.6希釈で拾い上げた。
継代3: プラーク「B-3-1」を10-1.6希釈で拾い上げた。
継代4〜7: スクロースホスファートグルタマート(SPG)を含有する無血清培地を使用しプラークB-3-1を連続継代して、7代継代レベルの小さな種プールを調製した。
所望の癌関連抗原をコードする遺伝子をポックス・ウイルスのゲノム内に挿入して、親ウイルスタンパク質の正常な相補体の発現と共にそのウイルスによるそれらの発現が可能となるようにする。これは、まず、ポックス・ウイルスとのインビボ組換え用のDNAドナーベクターを構築することにより行なうことができる。
(i)該ベクターが原核生物宿主内で増幅されるのを可能にする原核性複製起点、
(ii)該ベクターを含有する原核生物宿主細胞の選択を可能にするマーカーをコードする遺伝子(例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子)、
(iii)所望のタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子(これは、該遺伝子の発現を指令しうる転写プロモーターに隣接して位置する)、および
(iv)要素(iii)の構築物に隣接し、外来遺伝子の挿入部位に位置する親ウイルスゲノムの領域と相同なDNA配列。
感染細胞内でのドナープラスミドDNAとウイルスDNAとの相同組換えにより、所望の要素を含む組換えウイルスが生成する。インビボ組換えのための適当な宿主細胞は、一般には、ウイルスに感染し該プラスミドベクターをトランスフェクトすることが可能な真核生物細胞である。ポックス・ウイルスと共に使用するのに適したそのような細胞の例としては、ニワトリ胚真皮(CED)細胞、HuTK143(ヒト)細胞、およびCV-1およびBSC-40(共にサル腎)細胞が挙げられる。細胞に対するポックス・ウイルスの感染およびこれらの細胞に対するプラスミドベクターのトランスフェクションは、当該技術分野における標準的な技術により行なう(PanicaliおよびPaoletti, 米国特許第4,603,112号、WO89/03429)。
組換えウイルスを同定したら、種々の方法を用いて、挿入遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現をアッセイすることができる。これらの方法には、ブラックプラークアッセイ(ウイルスプラーク上で行なうin situエンザイムイムノアッセイ)、ウエスタンブロット分析、放射線免疫沈降法(RIPA)およびエンザイムイムノアッセイ(EIA)が含まれる。
組換えワクシニアウイルス(PROSTVAC)の構築
ヒト前立腺特異的抗原の全オープンリーディングフレームをコードする786bpのDNA断片を、ヒト転移性前立腺腺癌細胞系LnCaP.FGC(CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD)から抽出した全RNAから逆転写PCR(GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elmer, Norwalk, CT)により増幅した。PSAコード配列から導き出した推定アミノ酸配列は、公開されている配列(Lundwallら, FEBS Letters, 214:317-322, (1987))とほとんど同一であり、220位のアスパラギンがチロシンに変化している点で異なるにすぎないことが示された。PSAの全コード配列、5’非翻訳領域の41ヌクレオチドおよび3’非翻訳領域の520ヌクレオチドを含有するPSA DNA断片を、ワクシニアウイルス導入ベクターpT116のXbaI制限エンドヌクレアーゼ切断部位中へ挿入した。pT1001と称される得られたプラスミドは、ワクシニアウイルス40Kプロモーター(Gritzら, J. Virol. 64:5948-5957, (1990))の制御下のPSA遺伝子および鶏痘ウイルスC1プロモーター(Jenkinsら, AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998, (1991))の制御下の大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子を含有する。これらの外来遺伝子は、ワクシニアゲノムのHindIII M領域からのDNA配列に隣接する。図1は、PT1001のプラスミド地図である。
組換え鶏痘ウイルス(rF-CEA)の構築
組換え鶏痘ウイルスの作製は、挿入する異種配列を保持するプラスミドベクターと鶏痘DNAとのインビボでの相同組換えにより行なう。該プラスミドベクターは、鶏痘ウイルスゲノムの非必須領域からのウイルス配列に隣接したタンパク質コード配列に結合したポックスウイルスプロモーターをそれぞれが含む1以上のキメラ遺伝子を含有する。該プラスミドを、親鶏痘ウイルスに感染した細胞内にトランスフェクトする。プラスミド上の鶏痘配列とウイルスゲノム内の対応DNAとの組換えにより、該ウイルスゲノム内への該プラスミド上のキメラ遺伝子の挿入が生じる。
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多数の均等物を認識し、あるいは単なる通常の実験によりそれを確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲に含まれると意図される。
Claims (12)
- TBC-CEA、PROSTVAC、rV-B7.1、rF-B7.1、rF-CEA、rV-MUC-1およびrF-PSAよりなる群から選ばれる組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがTBC-CEAである、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがPROSTVACである、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがrV-B7.1である、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがrF-B7.1である、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがrF-CEAである、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがrV-muc-1である、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 該ポックス・ウイルスがrF-PSAである、請求項1に記載の組換えポックス・ウイルス。
- 癌胎児性抗原を発現する腫瘍を有する宿主を治療する方法であって、該宿主を組換えポックス・ウイルスTBC-CEAまたはrF-CEAの有効量と接触させることを含んでなる方法。
- 前立腺特異的抗原を発現する腫瘍を有する宿主を治療する方法であって、該宿主を組換えポックス・ウイルスPROSTVACまたはrF-PSAの有効量と接触させることを含んでなる方法。
- muc-1抗原を発現する腫瘍を有する宿主を治療する方法であって、該宿主を組換えポックス・ウイルスrV-muc-1またはrF-muc-1の有効量と接触させることを含んでなる方法。
- 腫瘍を有する宿主を治療する方法であって、該宿主の腫瘍細胞を組換えポックス・ウイルスrV-B7.1またはrF-B7.1の有効量と接触させることを含んでなる方法。
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