JP2009274985A - Hair growth promoter and nfat signal inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物又は植物抽出物を有効成分とする、育毛剤及びNFAT（nuclear factor of activated T cells）シグナル阻害剤に関する。 The present invention relates to a hair restorer and a NFAT (nuclear factor of activated T cells) signal inhibitor comprising a plant or plant extract as an active ingredient.
Nuclear factor of activated T cells （以下、NFATと略称する）は、T細胞活性化に重要なInterleukin-2（IL-2）の転写を活性化する因子として発見され、免疫抑制剤であるサイクロスポリンA（以下、CsAと略称する）やタクロリムス（以下、FK506と略称する）の標的であるセリン／スレオニン脱リン酸化酵素カルシニューリンによりその転写活性調節が行われていることが報告されている（図２参照）。すなわちCsAやFK506はNFATシグナルを阻害することによりT細胞活性化を抑制する。CsAやFK506は移植免疫抑制剤としてのみならず、免疫系の関与することが知られている関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎の治療薬としても認可されている。このようなNFATがNFAT結合配列（図２においては“NFAT site”）に結合することによって、当該NFAT結合配列より下流の遺伝子の転写が促進される系を『NFATシグナル』と称する。 Nuclear factor of activated T cells (hereinafter abbreviated as NFAT) was discovered as a factor that activates the transcription of Interleukin-2 (IL-2), which is important for T cell activation, and is an immunosuppressant cyclosporine. It has been reported that the transcriptional activity is regulated by serine / threonine phosphatase calcineurin which is a target of A (hereinafter abbreviated as CsA) and tacrolimus (hereinafter abbreviated as FK506) (FIG. 2). reference). That is, CsA and FK506 suppress T cell activation by inhibiting the NFAT signal. CsA and FK506 are approved not only as transplant immunosuppressants but also as therapeutic agents for rheumatoid arthritis, psoriasis, and atopic dermatitis, which are known to be involved in the immune system. A system in which such NFAT binds to an NFAT binding sequence (“NFAT site” in FIG. 2) to promote transcription of a gene downstream from the NFAT binding sequence is referred to as “NFAT signal”.
一方、NFATシグナルを阻害することによって育毛（発毛を含む）効果を期待できると報告されている（非特許文献１）。また、NFATシグナルを阻害するCsAの誘導体が育毛剤として使用可能であることも報告されている（特許文献１及び２）。 On the other hand, it has been reported that the effect of hair growth (including hair growth) can be expected by inhibiting the NFAT signal (Non-patent Document 1). It has also been reported that CsA derivatives that inhibit the NFAT signal can be used as hair restorers (Patent Documents 1 and 2).
また、NFATは、育毛作用や免疫系への作用に留まらず、心筋・骨格筋の分化調節による筋組織形成、脳における神経ネットワークの形成、骨芽細胞分化調節による骨代謝など、多くの臓器で発現し、重要な役割を果たす"多機能転写因子"として捉えられるようになってきた。 In addition, NFAT is not limited to hair-growth and immune system, but is also used in many organs such as muscle tissue formation by regulating myocardial / skeletal muscle differentiation, neural network formation in the brain, and bone metabolism by regulating osteoblast differentiation. It has come to be understood as a "multifunctional transcription factor" that plays an important role.
NFATシグナルが生体において及ぼす役割としては上述したとおりであるが、NFATシグナルを阻害することで、免疫抑制作用（非特許文献２）、乾癬治療（非特許文献３）、アトピー性皮膚炎治療（非特許文献４）、（心）筋肥大抑制（非特許文献５）、抗リウマチ薬としての可能性（非特許文献６）及び破骨細胞分化抑制作用（非特許文献７）などが期待できると報告されている。また、前述のようにNFATは免疫性サイトカインIL-2を産生する経路を介していることから、NFATシグナル阻害剤は自己免疫疾患を含む免疫性サイトカインが関与していると考えられる疾患の治療または予防に有用である。かかる対象疾患としては、例えば各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症などが挙げられる。したがって、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬、骨代謝疾患治療剤及び、上記に列記したような新規な医薬用途が期待される。また、新規にNFATシグナル阻害剤が同定されれば、育毛剤、発毛促進剤としての医薬部外品や化粧品用途が期待される。 The role of the NFAT signal in the living body is as described above. By inhibiting the NFAT signal, immunosuppressive action (Non-Patent Document 2), psoriasis treatment (Non-Patent Document 3), atopic dermatitis treatment (Non-Patent Document 2) Patent document 4), (heart) muscle hypertrophy suppression (non-patent document 5), possibility as an anti-rheumatic drug (non-patent document 6), osteoclast differentiation inhibitory action (non-patent document 7), etc. Has been. In addition, as described above, since NFAT is mediated by a pathway that produces the immune cytokine IL-2, NFAT signal inhibitors are used to treat diseases that are thought to involve immune cytokines including autoimmune diseases. Useful for prevention. Examples of such target diseases include various cancers, various leukemias, various hepatitis, various infections, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis, Crohn's disease), multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, digestion Ulcer, septic shock, tuberculosis, infertility, arteriosclerosis, Behcet's disease, asthma, nephritis, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, bacterial pneumonia, chronic pancreatitis, peripheral Examples include vascular disease, sepsis, interstitial liver disease, localized ileitis, and multiple sclerosis. Therefore, if a new NFAT signal inhibitor is identified, an immunosuppressive agent, a psoriasis therapeutic agent, an atopic dermatitis therapeutic agent, a (cardiac) muscle hypertrophy inhibitor, an anti-rheumatic agent, a bone metabolic disease therapeutic agent, and the above New medical uses such as those listed are expected. In addition, if a NFAT signal inhibitor is newly identified, quasi-drugs and cosmetics are expected as hair restorers and hair growth promoters.
そこで、本発明は、新規な育毛剤、NFATシグナル阻害剤及びNFATシグナル阻害方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a novel hair restorer, NFAT signal inhibitor, and NFAT signal inhibition method.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、NFATシグナル伝達に対する作用を評価する系を新規に構築し、当該系を用いて種々の植物についてNFATシグナル阻害作用を網羅的に解析した結果、NFATシグナル阻害作用を有するとともに、育毛剤としての奏効を示す植物を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention newly constructed a system for evaluating the action on NFAT signal transduction, and comprehensively exhibits NFAT signal inhibitory action on various plants using the system. As a result of the analysis, the present inventors have succeeded in identifying a plant having an NFAT signal inhibitory action and showing a response as a hair restorer, and has completed the present invention.
すなわち、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、アンソクコウノキ植物、オノスマ・ヒスピヅム植物及びチョウカシ植物から選ばれる少なくとも１種の植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする。 That is, the hair-restoring agent and NFAT signal inhibitor according to the present invention are effective at least one selected from the group consisting of at least one plant selected from an Anthony plant, Onosuma hispimu plant and butterfly plant and an extract of the plant. Ingredients.
上述したNFATシグナル阻害剤を対象の細胞又は組織に接触させることによって、当該細胞又は組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。 By contacting the above-described NFAT signal inhibitor with a target cell or tissue, the NFAT signal in the cell or tissue can be inhibited.
本発明によれば、有効性が実証された新規な育毛剤及びNFATシグナル阻害剤を提供することができる。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤によれば、NFATによって正に制御される転写を抑制することができる。さらに、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、有効成分として天然物質に由来するものを含有することから安全に使用できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel hair restorer and NFAT signal inhibitor by which effectiveness was demonstrated can be provided. Moreover, the NFAT signal inhibitor according to the present invention can suppress transcription that is positively controlled by NFAT. Furthermore, since the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention contain those derived from natural substances as active ingredients, they can be used safely.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、アンソクコウノキ植物、オノスマ・ヒスピヅム植物及びチョウカシ植物から選ばれる少なくとも１種の植物及び当該植物の抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分としている。ここでアンソクコウノキとは、学名をStyrax benzoinと称し、エゴノキ科に分類される植物である。オノスマ・ヒスピヅムとは、学名をOnosma hispidum Wall. Ex D.Donと称し、ムラサキ科に分類される植物である。チョウカシとは、学名をLitsea mollifolia Chunと称し、クスノキ科に分類される植物である。なお、これらアンソクコウノキ植物、オノスマ・ヒスピヅム植物及びチョウカシ植物は、NFATシグナル阻害作用及び育毛作用を有することが後述の実施例で新規に明らかとなった植物である。NFATシグナル阻害作用は、NFATシグナル阻害率を指標として評価することができる。 The hair-restoring agent and NFAT signal inhibitor according to the present invention comprise, as an active ingredient, at least one selected from the group consisting of at least one plant selected from an anthracnose plant, Onosuma hispimu plant and butterfly plant and an extract of the plant. Yes. Here, Ansokunoki is a plant whose scientific name is Styrax benzoin and is classified into the family Echinaceae. Onosma hispidum is a plant that has the scientific name Onosma hispidum Wall. Ex D.Don and is classified into the family Murasaceae. The butterfly is a plant that has the scientific name Litsea mollifolia Chun and is classified as a camphor family. In addition, it is newly clarified in the below-mentioned Examples that these anthony plant, Onosuma hispimu plant and butterfly plant have an NFAT signal inhibitory effect and a hair growth effect. The NFAT signal inhibitory action can be evaluated using the NFAT signal inhibition rate as an index.
特に、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、アンソクコウノキ植物の樹脂の水性アルコール抽出物、特に水性エタノール抽出物、中でも３０〜７０％エタノール抽出物であることが好ましい。また、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤としては、オノスマ・ヒスピヅム植物の根茎の水性アルコール抽出物、特に水性エタノール抽出物、中でも８０〜９９．５％エタノール抽出物であることが好ましい。さらに、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤としては、チョウカシ植物の果実の水性アルコール抽出物で、特に水性エタノール抽出物、中でも３０〜７０％エタノール抽出物あることが好ましい。 In particular, the hair-restoring agent and the NFAT signal inhibitor according to the present invention are preferably an aqueous alcohol extract of a resin of an Anthony plant, particularly an aqueous ethanol extract, especially 30-70% ethanol extract. Further, the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention is preferably an aqueous alcohol extract of rhizomes of Onosuma hispisum plants, particularly an aqueous ethanol extract, especially 80-99.5% ethanol extract. Furthermore, the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention is preferably an aqueous alcohol extract of fruit of a butterfly plant, particularly an aqueous ethanol extract, especially 30-70% ethanol extract.
NFATシグナル阻害とは、NFATに対して直接的又は間接的に作用してNFATによる転写促進活性を低減させることを意味する。NFATシグナル阻害作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば公知のNFAT結合配列と当該NFAT結合配列の下流にレポーター遺伝子と有するプラスミドを導入した宿主を用いるレポーターアッセイを挙げることができる（図１参照）。なお、NFATの活性はカルシウムイオンに依存するため、レポーターアッセイはカルシウムイオンを宿主に流入させる条件下で行う。レポーター遺伝子としては、特に限定されず、従来、生化学実験の分野で使用されている如何なるレポーター遺伝子も使用することができる。例えばレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS遺伝子）及びグリーンフルオレセントプロテイン遺伝子（GFP遺伝子）等を挙げることができる。 The inhibition of NFAT signal means that it acts directly or indirectly on NFAT to reduce the transcription promoting activity by NFAT. The method for measuring the NFAT signal inhibitory action is not particularly limited, and examples thereof include a reporter assay using a host in which a known NFAT binding sequence and a plasmid having a reporter gene downstream of the NFAT binding sequence are introduced (FIG. 1). Since the activity of NFAT depends on calcium ions, the reporter assay is performed under conditions where calcium ions are allowed to flow into the host. The reporter gene is not particularly limited, and any reporter gene conventionally used in the field of biochemical experiments can be used. For example, examples of the reporter gene include luciferase gene, β-glucuronidase gene (GUS gene), and green fluorescent protein gene (GFP gene).
NFAT結合配列とは、NFATが結合する配列からなるオリゴヌクレオチド、例えば、GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（pNFAT-Luc、Stratagene、配列番号１）といった塩基配列を例示することができる。なお、上述したプラスミドにおいては、このようなNFAT結合配列を１セットとして複数セットを連結して導入してもよい。複数のNFAT結合配列を連結して使用することによって、NFATによる転写促進活性をより高感度に測定することができる。なお、NFATシグナル阻害率とは、要するに、抽出物を作用させないときのNFATによる転写活性に対して、抽出物を作用させたときの当該転写活性の低下率を意味している。 Examples of the NFAT binding sequence include oligonucleotides composed of sequences to which NFAT binds, for example, a base sequence such as GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (pNFAT-Luc, Stratagene, SEQ ID NO: 1). In the above-described plasmid, a plurality of sets of such NFAT binding sequences may be linked and introduced. By linking and using a plurality of NFAT binding sequences, the transcription promoting activity by NFAT can be measured with higher sensitivity. In addition, the NFAT signal inhibition rate means the rate of decrease of the transcriptional activity when the extract is applied to the transcriptional activity by NFAT when the extract is not allowed to act.
また、育毛作用は、毛伸長速度を指標として評価することができる。アンソクコウノキ抽出物においては、毛伸長促進率が111.6％である。オノスマ・ヒスピズム抽出物においては、毛伸長促進率が112.1％である。チョウカシ抽出物においては、毛伸長促進率が109.7％である。ここで、毛伸長促進率とは、要するに、抽出物を作用させないときの毛伸長率に対して、抽出物を作用させたときの当該毛伸長率の促進率を意味している。 The hair growth action can be evaluated using the hair elongation rate as an index. In the anthracnose extract, the hair elongation promoting rate is 111.6%. In the Onosuma hispism extract, the hair elongation promotion rate is 112.1%. In the butterfly extract, the hair elongation promoting rate is 109.7%. Here, the hair elongation acceleration rate means the acceleration rate of the hair elongation rate when the extract is applied to the hair elongation rate when the extract is not operated.
育毛作用とは、毛包に作用し、毛の伸長の促進、太さの増大、毛周期の休止期から成長期への移行促進、成長期から退行期への移行阻害を行なうことにより毛の量を増加させることを意味する。従って、育毛には、発毛、養毛及び脱毛予防の概念が包含されるものとする。育毛作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば単離毛包を器官培養し、培養期間中の毛の伸長量を測定する方法が挙げられる。 Hair growth action refers to the action of hair follicles by promoting hair elongation, increasing thickness, promoting the transition from the resting phase of the hair cycle to the growth phase, and inhibiting the transition from the growth phase to the regression phase. Means to increase the amount. Therefore, the concept of hair growth, hair restoration, and hair loss prevention is included in hair growth. The method for measuring the hair-growth effect is not particularly limited, and examples thereof include a method of organ-culturing an isolated hair follicle and measuring the amount of hair elongation during the culture period.
特に、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、アンソクコウノキ植物、オノスマ・ヒスピヅム植物及びチョウカシ植物における全草、葉、茎、花、果実、種子、根茎、根又は樹脂等をそのまま含むものとすることができる。あるいは本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、当該植物の全草、葉、茎、果実、種子、根茎又は根等を粉砕して用いたものを含むことが好ましい。 In particular, the hair-restoring agent and NFAT signal inhibitor according to the present invention should include whole plants, leaves, stems, flowers, fruits, seeds, rhizomes, roots, resins, etc. in anthracnose plants, onosuma / hispicum plants and butterfly plants. Can do. Alternatively, the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention preferably include those obtained by pulverizing whole plants, leaves, stems, fruits, seeds, rhizomes or roots of the plant.
また、本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、アンソクコウノキ植物の樹脂を使用することが好ましい。本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、オノスマ・ヒスピヅム植物の根茎を使用することが好ましい。本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤は、チョウカシ植物の果実を使用することが好ましい。本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、植物抽出物は、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。本発明において、植物の抽出物とは、上記抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を意味する。 Moreover, it is preferable that the hair-restoring agent and NFAT signal inhibitor which concerns on this invention use the resin of an Anonymous cypress plant. The hair growth agent and NFAT signal inhibitor according to the present invention preferably uses rhizomes of Onosuma hispidum plants. It is preferable to use the fruit of a butterfly plant as the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention. When a plant extract is used as an active ingredient as the hair restorer and NFAT signal inhibitor according to the present invention, the plant extract is extracted at room temperature or under heating, or using an extractor such as a Soxhlet extractor. Obtained by extraction. In the present invention, the plant extract means various solvent extracts obtained by the above extraction method, diluted solutions thereof, concentrated solutions thereof or dried powders thereof.
植物の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤又は非極性溶剤のいずれをも使用することができる。抽出溶剤としては、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び二酸化炭素等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の2種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。 As an extraction solvent used for obtaining a plant extract, either a polar solvent or a nonpolar solvent can be used. Examples of the extraction solvent include water; alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol; polyhydric alcohols such as propylene glycol and butylene glycol; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; Chain and cyclic ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether; Polyethers such as polyethylene glycol; Hydrocarbons such as squalane, hexane, cyclohexane and petroleum ether; Aromatic hydrocarbons such as toluene; Dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc. And halogenated hydrocarbons; and carbon dioxide. Alternatively, a mixture obtained by combining two or more of the above solvents can be used as the extraction solvent.
本発明に係る育毛剤及びNFATシグナル阻害剤として植物抽出物を有効成分とする場合、抽出溶剤としては、水性アルコールが好ましく、アンソクコウノキ植物及びチョウカシ植物については特に５０％エタノールを使用することが好ましく、オノスマ・ヒスピヅム植物については特に９５％エタノールを使用することが好ましい。本発明に係るNFATシグナル阻害剤としては、上記植物の抽出物を、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、上記植物等の抽出物をクロマトグラフィー液々分配等の分離技術に供し、当該抽出物から不活性な夾雑物を除去したものを用いることもできる。 When a plant extract is used as an active ingredient as the hair-restoring agent and NFAT signal inhibitor according to the present invention, the extraction solvent is preferably an aqueous alcohol. For Onosuma hispidum plants, it is particularly preferred to use 95% ethanol. As the NFAT signal inhibitor according to the present invention, the above plant extract can be used as it is, but the extract can be used after being diluted, concentrated or lyophilized and then prepared into a powder or paste. . In addition, an extract obtained by removing the inert impurities from the extract by subjecting the extract of the plant or the like to a separation technique such as chromatographic liquid-liquid distribution can also be used.
上述した有効成分は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。具体的には、上述した有効成分を、対象とする細胞や組織に接触させることによって、当該細胞や組織におけるNFATシグナルを阻害することができる。これにより、当該細胞や組織においては、NFATシグナルによって生ずる種々の遺伝子発現を転写レベルで抑制することができる。 Since the above-mentioned active ingredient reduces the transcription promoting activity by NFAT, it can inhibit the NFAT signal in cells and tissues. Specifically, the NFAT signal in the cell or tissue can be inhibited by bringing the active ingredient described above into contact with the target cell or tissue. Thereby, in the cells and tissues, various gene expressions caused by NFAT signals can be suppressed at the transcription level.
本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、NFATによる転写促進活性を低減させることから、育毛剤又は発毛促進剤として使用できる。また、NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患に対する治療剤、又は予防剤として使用することができる。NFATによる転写促進活性の亢進に起因する症状や疾患としては、免疫系疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、心筋を含む筋肥大症、リウマチ、骨代謝疾患、各種のガン、各種白血病、各種肝炎、各種感染症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、消化性潰瘍、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチェット病、喘息、腎炎、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、多発性硬化症等を挙げることができる。したがって、本発明に係るNFATシグナル阻害剤は、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤、抗リウマチ薬及び骨代謝疾患治療剤等として使用することができる。 The NFAT signal inhibitor according to the present invention can be used as a hair restorer or a hair growth promoter because it reduces the transcription promoting activity by NFAT. Further, it can be used as a therapeutic agent or a preventive agent for symptoms and diseases caused by enhancement of transcription promoting activity by NFAT. Symptoms and diseases resulting from the enhanced transcription promoting activity by NFAT include immune system diseases, psoriasis, atopic dermatitis, myopathy including myocardium, rheumatism, bone metabolic diseases, various cancers, various leukemias, various hepatitis, Various infections, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes, peptic ulcer, septic shock, tuberculosis, infertility, arteriosclerosis, Behcet's disease, Asthma, nephritis, acute bacterial meningitis, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, acute viral encephalitis, adult respiratory distress syndrome, bacterial pneumonia, chronic pancreatitis, peripheral vascular disease, sepsis, interstitial liver disease, localized ileitis, Examples include multiple sclerosis. Therefore, the NFAT signal inhibitor according to the present invention can be used as an immunosuppressant, a psoriasis therapeutic agent, a (cardiac) muscle hypertrophy inhibitor, an anti-rheumatic drug, a bone metabolic disease therapeutic agent, and the like.
本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬用途として使用する場合、剤形として、特に限定されないが、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、軟膏剤等が挙げられる。本発明に係るNFATシグナル阻害剤を経口投与の医薬用組成物として使用する場合、上記NFATシグナル阻害剤の他、経口投与剤の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。経口投与用医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等が挙げられる。本発明に係るNFATシグナル阻害剤を経皮投与の医薬用組成物として使用する場合、上記NFATシグナル阻害剤の他、経皮投与剤の形態に応じて一般に用いられる、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、及び天然、合成のグリセライド等の油性基剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、増粘剤等を添加し、常法に従って製造することができる。経皮投与用医薬組成物としては、免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、発毛促進剤等が挙げられる。 When the NFAT signal inhibitor according to the present invention is used for pharmaceutical purposes, the dosage form is not particularly limited, but for example, solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets, liquid preparations, suspensions, Examples thereof include liquids such as emulsions, ointments and the like. When the NFAT signal inhibitor according to the present invention is used as a pharmaceutical composition for oral administration, in addition to the NFAT signal inhibitor, generally used according to the form of the oral administration agent, an excipient, a disintegrant, and a binder , Lubricants, surfactants, alcohols, water, water-soluble polymers, sweeteners, flavoring agents, acidulants and the like, and can be produced according to conventional methods. Examples of the pharmaceutical composition for oral administration include an immunosuppressant, a psoriasis therapeutic agent, a (heart) muscle hypertrophy inhibitor and an anti-rheumatic drug. When using the NFAT signal inhibitor according to the present invention as a pharmaceutical composition for transdermal administration, in addition to the NFAT signal inhibitor, generally used according to the form of the transdermal administration agent, vegetable oil, animal oil, synthetic oil, Fatty acids and oily bases such as natural and synthetic glycerides, lubricants, surfactants, alcohols, thickeners, and the like can be added and produced according to conventional methods. Examples of the pharmaceutical composition for transdermal administration include an immunosuppressive agent, a psoriasis therapeutic agent, an atopic dermatitis therapeutic agent, and a hair growth promoter.
また、本発明に係る育毛剤は、例えば皮膚用の医薬部外品として使用するものであり、使用形態に適した剤形として提供される。具体的に剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤、トニック剤、スプレー剤及び乳剤等が挙げられる。当該医薬部外品には、植物の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。また、育毛剤においては、上述した有効成分の他に、通常用いられる養毛薬効剤、例えば、毛包賦活剤、血行促進剤、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤、抗脂漏剤、局所刺激剤、抗男性ホルモン剤、カリウムチャンネルオープナー、抗酸化剤等を必要に応じて適宜配合し、育毛効果の向上を図ることができる。毛包賦活剤としては、フラバノノール類、N -アセチル- L -メチオニン、パントテン酸及びその誘導体、アデノシン及びその誘導体、アスパラギン酸カリウム、ペンタデカン酸グリセリド、6 -ベンジアルアミノプリン、モノニトログアヤコールナトリウム等が挙げられる。血行促進剤としては、二酸化炭素、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、センブリエキス、ニンジンエキス、塩化カルプロニウム、ビタミンE及びその誘導体等が挙げられる。抗菌剤としては、イソプロピルメチルフェノール、塩化ベンザルコニウム、オクトピロックス、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等が挙げられる。抗炎症剤としては、甘草エキス、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アズレン、グアイアズレン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス等が挙げられる。保湿剤としては、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス、グリセリン、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、プロピレングリコール、桔梗エキス、ヨクイニンエキス等が挙げられる。抗脂漏剤としては、イオウ、レシチン、カシュウエキス、チオキソロン等が挙げられる局所刺激剤としては、カンファー、トウガラシチンキ等が挙げられる。抗男性ホルモン剤としては、サイプロテロンアセテート、1 1α -ハイドロキシプロゲステロン、フルタマイド、3 -デオキシアデノシン、酢酸クロルマジノン、エチニルエストラジオール、スピロノラクトン、エピテステロン、フィナステライド、アロエ、サンショウ、チョウジエキス、クアチャララーテエキス、オタネニンジン等が挙げられる。カリウムチャンネルオープナーとしては、ミノキシジル、クロマカリム、ジアゾキシド及びその誘導体、ピナシジル等が挙げられる。抗酸化剤としては、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキス、黄杞エキス、ビタミンＣ及びその誘導体、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。 Moreover, the hair restorer which concerns on this invention is used as a quasi-drug for skin, for example, and is provided as a dosage form suitable for a use form. Specific dosage forms are not particularly limited, and examples thereof include ointments, liquids, extracts, lotions, tonics, sprays, and emulsions. In addition to plant extracts, the quasi-drug contains any combination of pharmaceutically acceptable carriers such as auxiliaries, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, absorption enhancers and surfactants. can do. In addition, in the hair restorer, in addition to the above-mentioned active ingredients, commonly used hair nourishing agents such as hair follicle activators, blood circulation promoters, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, moisturizers, antiseborrheic agents, topical A stimulant, an anti-androgen agent, a potassium channel opener, an antioxidant and the like can be appropriately blended as necessary to improve the hair-growth effect. Examples of hair follicle activators include flavonols, N-acetyl-L-methionine, pantothenic acid and its derivatives, adenosine and its derivatives, potassium aspartate, glyceride pentadecanoate, 6-benzylaminopurine, mononitroguaiacol sodium, etc. Can be mentioned. Examples of the blood circulation promoter include carbon dioxide, nicotinamide, benzyl nicotinate, assembly extract, carrot extract, carpronium chloride, vitamin E and derivatives thereof. Antibacterial agents include isopropylmethylphenol, benzalkonium chloride, octopirox, zinc pyrithione, hinokitiol and the like. Examples of anti-inflammatory agents include licorice extract, glycyrrhizic acid and its derivatives, glycyrrhetinic acid and its derivatives, azulene, guaiazulene, oxon extract, chamomile extract, kumazasa extract, birch extract, mallow extract, peach leaf extract, yarrow extract . Examples of the humectant include hypericum extract, oat extract, glycerin, tuberose polysaccharide, cordyceps extract, life-saving grass extract, barley extract, grape extract, propylene glycol, bellflower extract, and cypressin extract. Examples of anti-seborrheic agents include sulfur, lecithin, cachet extract, and thioxolone. Examples of local stimulants include camphor and chili pepper tincture. Anti-androgen drugs include cyproterone acetate, 1 1α-hydroxyprogesterone, flutamide, 3-deoxyadenosine, chlormadinone acetate, ethinyl estradiol, spironolactone, epitesterone, finasteride, aloe, salamander, clove extract, quacharalate extract, Panax ginseng. Examples of potassium channel openers include minoxidil, cromakalim, diazoxide and its derivatives, pinacidil and the like. Examples of the antioxidant include black tea extract, tea extract, age extract, jaundice extract, vitamin C and its derivatives, erythorbic acid, propyl gallate, dibutylhydroxytoluene and the like.
一方、上述した有効成分は化粧料として使用することもできる。この場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。当該化粧料には、植物の抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料及び各種皮膚栄養剤等を任意に組合せて配合することができる。具体的には、皮膚化粧料に配合される薬効成分、例えば微粒子酸化亜鉛、酸化チタン、パーソールＭＣＸ、パーソール１７８９等の紫外線吸収剤、アスコルビン酸等のビタミン類、ヒアルロン酸ナトリウム、ワセリン、グリセリン、尿素等の保湿剤、ホルモン剤、及びコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、ルシノール等の他の美白成分、ステロイド剤、アラキドン酸代謝物やヒスタミン等に代表される化学伝達物質産生・放出抑制剤（インドメタシン、イブプロフェン）、レセプター拮抗剤等の抗炎症剤、抗男性ホルモン剤、ビタミンＡ酸、ローヤルゼリーエキス、ローヤルゼリー酸等の皮脂分泌抑制剤、ニコチン酸トコフェロール、アルプロスタジル、塩酸イソクスプリン、塩酸トラゾリン等の抹消血管拡張剤及び末梢血管拡張作用のある炭酸ガス等、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、トウガラシチンキ、ビタミンE誘導体、イチョウエキス、センブリエキス等の血行促進剤、ペンタデカン酸グリセリド、ニコチン酸アミド等の細胞賦活化剤、ヒノキチオール、L-メントール、イソプロピルメチルフェノール等の殺菌剤、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、セラミド及びセラミド類似化合物等を添加配合することができる。 On the other hand, the above-mentioned active ingredient can also be used as a cosmetic. In this case, the dosage form is not particularly limited, and examples thereof include water-in-oil or oil-in-water emulsified cosmetics, creams, lotions, gels, foams, essences, foundations, packs, sticks, and the like. Powder etc. are mentioned. In addition to plant extracts, the cosmetics include oils, surfactants, ultraviolet absorbers, alcohols, chelating agents, pH adjusters, preservatives, thickeners, which are commonly used as cosmetic ingredients. Pigments, fragrances, various skin nutrients, and the like can be combined in any combination. Specifically, medicinal ingredients blended in skin cosmetics, for example, ultraviolet absorbers such as fine particle zinc oxide, titanium oxide, persole MCX, persole 1789, vitamins such as ascorbic acid, sodium hyaluronate, petrolatum, glycerin, urea Moisturizers such as humectants, hormonal agents, and other whitening ingredients such as kojic acid, arbutin, placenta extract, lucinol, steroids, arachidonic acid metabolites and histamine, and other chemical transmitter production / release inhibitors (indomethacin, Ibuprofen), anti-inflammatory agents such as receptor antagonists, anti-androgen agents, vitamin A acid, royal jelly extract, sebum secretion inhibitors such as royal jelly acid, peripheral blood vessels such as tocopherol nicotinate, alprostadil, isoxpurine hydrochloride, and trazoline hydrochloride Dilator and peripheral vasodilatory effect Certain carbon dioxide, minoxidil, carpronium chloride, red pepper tincture, vitamin E derivative, blood circulation promoters such as ginkgo biloba extract and assembly extract, cell activating agents such as pentadecanoic acid glyceride and nicotinamide, hinokitiol, L-menthol, isopropylmethyl Bactericides such as phenol, glycyrrhizic acid and its derivatives or salts thereof, ceramide and ceramide-like compounds, etc. can be added and blended.
上述した有効成分を医薬、医薬部外品又は化粧料として使用する場合、植物の抽出物の配合量は、乾燥物として計算して、通常、医薬、医薬部外品又は化粧料の全組成の0.00001〜5重量％、特に0.0001〜0.1重量％とすることが好ましい。また、本発明に係るNFATシグナル阻害剤を医薬として用いる場合、植物の抽出物の塗布量は、通常の成人で固形分残量にして0.01mg〜1g/1日とすることが望ましい。なお、本発明に係る皮膚外用剤は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合には皮膚面1cm2当たり1〜20mg、液状製剤の場合には同じく1〜20mg使用するのが好ましい。 When the above-mentioned active ingredient is used as a medicine, quasi-drug or cosmetic, the amount of the plant extract is calculated as a dry product, and usually the total composition of the drug, quasi-drug or cosmetic. It is preferably 0.00001 to 5% by weight, particularly 0.0001 to 0.1% by weight. Moreover, when using the NFAT signal inhibitor which concerns on this invention as a pharmaceutical, it is desirable that the application quantity of a plant extract is 0.01 mg-1 g / day as a solid content residual amount in a normal adult. The external preparation for skin according to the present invention varies depending on the content of the active ingredient. For example, in the case of a cream or ointment, 1 to 20 mg per 1 cm 2 of the skin surface, and in the case of a liquid preparation, 1 to 20 mg is also used. It is preferable to do this.
また、上述した有効成分を化粧品、医薬又は医薬部外品として使用する場合、例えばチョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム、コロイドシリカナトリウムポリアクリレート等の粉体；例えば鉱油、植物油、シリコーン油等の油又は油状物質；例えばソルビタントリオレエート、ソルビタントリステアレート、グリセロールモノオレエート、高分子シリコーン界面活性剤等の乳化剤；パラ−ヒドロキシベンゾエートエステル等の防腐剤；ブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤；グリセロール、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；トリエタノールアミン又は水酸化ナトリウムのような塩基を伴う乳酸等の緩衝剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の界面活性剤；密ろう、オゾケライトワックス、パラフィンワックス等のワックス類；増粘剤；活性増強剤；着色料；香料等、を必要に応じ適宜組合せて用いることができる。 In addition, when the above-mentioned active ingredient is used as a cosmetic, pharmaceutical or quasi-drug, for example, powders such as chalk, talc, fuller's earth, kaolin, starch, rubber, colloidal silica sodium polyacrylate; for example, mineral oil, vegetable oil, silicone Oils or oily substances such as oils; for example, emulsifiers such as sorbitan trioleate, sorbitan tristearate, glycerol monooleate, polymeric silicone surfactants; preservatives such as para-hydroxybenzoate esters; antioxidants such as butylhydroxytoluene Agents; humectants such as glycerol, sorbitol, 2-pyrrolidone-5-carboxylate, dibutyl phthalate, gelatin, polyethylene glycol; buffers such as lactic acid with a base such as triethanolamine or sodium hydroxide; glycerin fatty acid Requires surfactants such as stealth, sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, alkyl glucosides; waxes such as beeswax, ozokerite wax, paraffin wax; thickeners; activity enhancers; coloring agents; Can be used in appropriate combinations.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕植物抽出物の製造
アンソクコウノキ抽出物の製造
アンソクコウノキの樹脂(産地不明)を１０ｇとり、１００ｍＬの５０％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過して抽出液１０６ｍＬを得た。蒸発残分７.８ｗ/ｖ％であった。
[Example 1] Production of plant extract
Manufacture of Anthony cypress extract 10 g of Anthony cypress resin (unknown origin) was added, 100 mL of 50% ethanol was added, and after standing at room temperature for 7 days, filtration was performed to obtain 106 mL of an extract. The evaporation residue was 7.8 w / v%.
オノスマ・ヒスピヅム抽出物の製造
オノスマ・ヒスピヅムの根茎(ネパール産)を１０ｇとり、１００ｍＬの９５％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過して抽出液７９ｍＬを得た。エバポレーターにてこの抽出液を濃縮し、エタノールを加えて２６ｍＬに溶解させた。蒸発残分０.６ｗ/ｖ％であった。
Production of Onosuma Hispid extract 10 g of Onosuma Hispid rhizome (Nepal) was taken, 100 mL of 95% ethanol was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 7 days, followed by filtration to obtain 79 mL of extract. The extract was concentrated with an evaporator, and ethanol was added to dissolve in 26 mL. The evaporation residue was 0.6 w / v%.
チョウカシ抽出物の製造
チョウカシの果実(中国産)を１０ｇとり、１００ｍＬの５０％エタノールを加え、室温で７日間静置抽出後、ろ過して抽出液８７ｍＬを得た。エバポレーターにてこの抽出液を濃縮し、エタノールを加えて５８ｍＬに溶解させた。蒸発残分０.７ｗ/ｖ％であった。
Manufacture of butterfly extract 10 g of butterfly fruit (made in China) was taken, 100 mL of 50% ethanol was added, and after standing at room temperature for 7 days, filtration was performed to obtain 87 mL of an extract. The extract was concentrated with an evaporator, and ethanol was added to dissolve in 58 mL. The evaporation residue was 0.7 w / v%.
〔実施例２〕NFATシグナル阻害効果
本例では、NFATシグナル阻害効果を検証するための評価システムを構築し、当該評価システムを用いて実施例１で製造した植物抽出物についてのNFATシグナル阻害効果を検証した。
[Example 2] NFAT signal inhibitory effect In this example, an evaluation system for verifying the NFAT signal inhibitory effect was constructed, and the NFAT signal inhibitory effect of the plant extract produced in Example 1 using the evaluation system was demonstrated. Verified.
（１）評価システムのための材料及び方法
細胞培養
上記評価システムには、ヒト腎（HEK293）細胞をATCC（American Type Culture Collection）より購入し、使用した。HEK293細胞は、DMEM（High glucose、10% heat-inactivated FBS）中37℃、5% CO2条件下で培養した。
(1) Materials and methods for evaluation systems
Cell culture In the above evaluation system, human kidney (HEK293) cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection) and used. HEK293 cells were cultured in DMEM (High glucose, 10% heat-inactivated FBS) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
プラスミド、トランスフェクション
上記評価システムには、NFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼが導入されたプラスミドpNFAT-Luc（Stratagene）をHEK293細胞にトランスフェクションしたものを使用した。詳細には、NFAT転写活性の評価用に4連のNFAT結合配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が導入されたpNFAT-luc（STRATAGENE）をHEK293細胞にトランスフェクションした。また、トランスフェクション効率によるばらつきをなくすことを目的として、ホタルルシフェラーゼに由来するシグナルを補正するためにCMV promoterの下流にウミシイタケルシフェラーゼが導入されたpRL-CMV（Promega）を同時にトランスフェクションした。
Plasmid and Transfection The HEK293 cells were transfected with plasmid pNFAT-Luc (Stratagene) in which firefly luciferase was introduced downstream of the NFAT binding sequence. Specifically, pNFAT-luc (STRATAGENE) in which a firefly luciferase gene was introduced downstream of a quadruple NFAT binding sequence was transfected into HEK293 cells for evaluation of NFAT transcriptional activity. In addition, in order to eliminate variation due to transfection efficiency, pRL-CMV (Promega) in which a Renilla luciferase was introduced downstream of the CMV promoter was simultaneously transfected in order to correct a signal derived from firefly luciferase.
トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000 reagent（Invitrogen）を用いて使用説明書に従って行った。トランスフェクションの8時間後に培地を交換し、一晩インキュベートした。その後、実施例１で製造した植物抽出物を添加（0.5 vol%）し、その1時間後に1μM Ionomycinを添加した。8時間後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ionomycinは、カルシウムイオンに特異的なイオノフォアであり、細胞内にカルシウムイオンを流入させる薬剤として知られている。Ionomycin添加により、カルシウムイオン依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化し、それに伴ってNFATの転写活性が上昇することから、本システムはNFATシグナル活性化阻害剤を探索するのに適していると考えられる。 Transfection was performed using LipofectAMINE 2000 reagent (Invitrogen) according to the instruction manual. The medium was changed 8 hours after transfection and incubated overnight. Thereafter, the plant extract produced in Example 1 was added (0.5 vol%), and 1 μM Ionomycin was added 1 hour later. After 8 hours, a luciferase reporter assay was performed. Ionomycin is an ionophore specific to calcium ions and is known as a drug that allows calcium ions to flow into cells. The addition of Ionomycin activates calcineurin, a calcium ion-dependent phosphatase, and the transcriptional activity of NFAT increases accordingly, indicating that this system is suitable for searching for NFAT signal activation inhibitors. Conceivable.
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega）を用い、使用説明書に従って行った。すなわち、培地を除去後、PBSにより2倍希釈したDual-Glo luciferase reagentを加え、攪拌した後、20分後にホタルルシフェラーゼ活性を測定した。その後、等量のDual-Glo Stop&Glo reagentを加え、攪拌した後にウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性測定はMiniLumat LB 9506（EG&G BERTHOLD）を用いて行い、ルシフェラーゼによる発光量を定量的に検出した。双方ともルシフェラーゼ活性の測定時間は2秒とした。
Luciferase reporter assay The luciferase reporter assay was performed using Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) according to the instruction manual. That is, after removing the medium, Dual-Glo luciferase reagent diluted 2-fold with PBS was added, stirred, and firefly luciferase activity was measured 20 minutes later. Thereafter, an equal amount of Dual-Glo Stop & Glo reagent was added and stirred, and then Renilla luciferase activity was measured. The luciferase activity was measured using MiniLumat LB 9506 (EG & G BERTHOLD), and the amount of luminescence by luciferase was quantitatively detected. In both cases, the measurement time for luciferase activity was 2 seconds.
NFATシグナル阻害率の算出
全てのNFAT転写活性（ホタルルシフェラーゼ活性）はトランスフェクション効率補正のために導入されたウミシイタケルシフェラーゼ活性にて除することで補正した。その後、NFATシグナル阻害率を以下の式にて算出した。
NFATシグナル阻害率（%）＝100−（試験サンプル及びIonomycin添加群−無刺激群）／（Ionomycinのみ添加群−無刺激群）×100
上記計算により、Ionomycin刺激によるNFATシグナル活性化をテストサンプルが何%阻害したかについて算出することができる。
Calculation of NFAT signal inhibition rate All NFAT transcriptional activity (firefly luciferase activity) was corrected by dividing by the Renilla luciferase activity introduced for transfection efficiency correction. Thereafter, the NFAT signal inhibition rate was calculated by the following formula.
NFAT signal inhibition rate (%) = 100− (test sample and Ionomycin added group−unstimulated group) / (Ionomycin only added group−unstimulated group) × 100
Based on the above calculation, it is possible to calculate how much the test sample inhibited NFAT signal activation by Ionomycin stimulation.
結果
実施例１で製造した３種類の植物抽出物によるNFATシグナル阻害率を表１に示した。
Results Table 1 shows the NFAT signal inhibition rates by the three plant extracts produced in Example 1.
表１に示すように、アンソクコウノキ抽出物、オノスマ・ヒスピズム抽出物及びチョウカシ抽出物は、NFATシグナルを阻害することが明らかとなった。すなわち、アンソクコウノキ抽出物、オノスマ・ヒスピズム抽出物及びチョウカシ抽出物は、NFATにより正に制御される転写を抑制することができる。したがって、実施例１で製造したアンソクコウノキ抽出物、オノスマ・ヒスピズム抽出物及びチョウカシ抽出物は、全て優れたNFATシグナル阻害剤であり、例えば免疫抑制剤、乾癬治療剤、アトピー性皮膚炎治療剤、育毛剤、発毛促進剤、（心）筋肥大抑制剤及び抗リウマチ薬等の候補物質として同定されたこととなる。 As shown in Table 1, it was revealed that the anthracnose extract, Onosuma hispismus extract and butterfly extract inhibit the NFAT signal. That is, the Anthony cypress extract, Onosuma hispismus extract, and butterfly extract can suppress transcription that is positively controlled by NFAT. Therefore, the Anthony cypress extract, Onosuma hispismus extract and butterfly extract produced in Example 1 are all excellent NFAT signal inhibitors, such as immunosuppressants, psoriasis treatment agents, atopic dermatitis treatment agents, hair growth agents. It has been identified as a candidate substance such as an agent, a hair growth promoter, a (heart) muscle hypertrophy inhibitor and an anti-rheumatic drug.
〔実施例３〕
本例では、対象物質の育毛効果を検証できるin vitroの実験系を用いて実施例１で製造した植物抽出物の育毛効果を検証した。
Example 3
In this example, the hair growth effect of the plant extract produced in Example 1 was verified using an in vitro experimental system that can verify the hair growth effect of the target substance.
ブタ毛包器官培養による毛伸長評価
食肉用豚種の臀部皮膚を適当な大きさに切り分け、余分な脂肪組織を除いた。豚皮は無菌下でヒビテン液（5%ヒビテン液（住友製薬）を水で5〜20倍に希釈）に5分〜10分浸することにより消毒を行った後にD-PBSで数回洗浄した。その後、実体顕微鏡下にて洗浄した豚皮から毛包を単離してWilliam's Medium E培地（Invitrogen）培地中に集めた。
Evaluation of hair elongation by porcine hair follicle organ culture The buttocks skin of pork for meat was cut into an appropriate size, and excess adipose tissue was removed. Porcine skin was disinfected by immersing it in Hibiten solution (5% Hibiten solution (Sumitomo Pharmaceutical) diluted 5 to 20 times with water) for 5 to 10 minutes under aseptic conditions, and then washed several times with D-PBS. . Thereafter, hair follicles were isolated from pig skin washed under a stereomicroscope and collected in William's Medium E medium (Invitrogen) medium.
単離した毛包は、1ウェルあたり400μlのWilliam's Medium E培地（1% Penicillin-Streptomycin 溶液（Invitrogen）添加）が入った24ウェル培養プレートに1本ずつ入れた。毛包は37℃、5% CO2条件下にて8日間培養し、その間、1日または2日おきに培地の交換を行った。 The isolated hair follicles were placed one by one in a 24-well culture plate containing 400 μl of William's Medium E medium (added with 1% Penicillin-Streptomycin solution (Invitrogen)) per well. The hair follicles were cultured for 8 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , during which the medium was changed every other day or two days.
上記の培地に実施例１で製造した実施例１で製造した植物抽出物を添加（固形分濃度0.0001重量%）し、溶媒コントロールであるエタノール添加群とともに8日間培養した。培養を開始日（0日目）および8日目の実体顕微鏡画像をCCDカメラ（pixera model.No.PVC 100C）で撮影し、その画像から毛球部基底部から毛幹先端までの長さを測定した。その後、溶媒コントロール群の培養前後における毛伸長量を100%として実施例１で製造した植物抽出物添加群の毛伸長率を算出した。 The plant extract produced in Example 1 produced in Example 1 was added to the above medium (solid content concentration 0.0001% by weight), and cultured for 8 days together with an ethanol addition group as a solvent control. Take a stereomicroscopic image of the start date (day 0) and 8th day with a CCD camera (pixera model.No.PVC 100C) and measure the length from the base of the hair bulb to the tip of the hair shaft. It was measured. Thereafter, the hair elongation rate of the plant extract added group produced in Example 1 was calculated by setting the amount of hair elongation before and after culturing in the solvent control group as 100%.
実施例１で製造した３種類の植物抽出物による毛伸長率を表２に示した。 Table 2 shows the hair elongation ratios of the three plant extracts produced in Example 1.
表２に示すように、実施例１で製造した植物抽出物添加群においては、溶媒コントロール群と比較して優れた毛伸長率が認められた。この結果から、アンソクコウノキ抽出物、オノスマ・ヒスピズム抽出物及びチョウカシ抽出物は、育毛効果を有することが明らかとなった。すなわち、アンソクコウノキ抽出物、オノスマ・ヒスピズム抽出物及びチョウカシ抽出物は、優れた育毛剤、育毛効果を有する外用剤として使用できることが明らかとなった。 As shown in Table 2, in the plant extract addition group produced in Example 1, an excellent hair elongation rate was recognized as compared with the solvent control group. From this result, it was clarified that the Anthony cypress extract, Onosuma hispismus extract and butterfly extract have a hair-growth effect. That is, it has been clarified that the Anthony cypress extract, Onosuma hispismus extract, and butterfly extract can be used as an excellent hair restoring agent and an external preparation having a hair restoring effect.
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