JP2009268478A

JP2009268478A - Ｈｍｌ−２ポリペプチド発現用ベクター

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Publication number: JP2009268478A
Application number: JP2009191360A
Authority: JP
Inventors: F Hardy Stephen; エフ．ハーディーステファン; John J Donnelly Iii; ジェイ．ドネリーザサードジョン; Megede Jan T Zur; ティー．ズールメゲデジャン
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTICS Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTICS Inc
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2009-08-20
Publication date: 2009-11-19
Also published as: AU2003276679A1; JP2013143953A; CA2489292A1; JP2005535308A; US8518694B2; AU2003276679A8; EP1532161B1; EP2302039A1; US20100086565A1; ATE545651T1; EP1532161A2; EP1532161A4

Abstract

【課題】ＨＭＬ−２ポリペプチドおよびＰＣＡＶポリペプチドのインビトロ発現またはインビボ発現のためのさらなる改善されたベクターを提供すること。
【解決手段】核酸ベクターであって、この核酸ベクターは、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）このプロモーターと作動可能に連結されているＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列；および（ｉｉｉ）選択マーカー；を含む。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）の下流にありかつ（ｉｉ）と作動可能に連結されている転写ターミネーターをさらに含む。
【選択図】なし

Description

本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願は、個々の書類各々が具体的かつ個別に参考として援用されるように示された場合と同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、ポリペプチド発現のための核酸ベクターに関する。

前立腺癌は、米国の男性において最も一般的な型の癌である。良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、良性前立腺細胞の異常な増殖であり、その前立腺は、成長して尿道および膀胱を押し、尿の正常な流れをブロックする。６０歳〜７０歳の米国男性の半数より多く、および７０歳〜９０歳の９０％程度が、ＢＰＨの症状を有する。ＢＰＨは、めったに生命を脅かさないが、症状を軽減するためには処置を必要とし得る。

特許文献１（参考文献１）および参考文献２は、ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２サブグループのヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）が、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すことを、開示する。この知見は、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療において有用であると開示される。具体的には、正常組織と比較して高いＨＭＬ−２発現産物レベルは、そのサンプルが得られた患者が癌を有することを示すと言われている。

参考文献３は、第２２番染色体中の２０．４２８メガベース（２２ｑ１１．２）に位置するＨＭＬ−２ファミリーの特定のメンバーが、前立腺腫瘍において優先的かつ特異的にアップレギュレートされることを開示する。この内因性レトロウイルス（「ＰＣＡＶ」と呼ばれる）は、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーの他のメンバーにおいては見出されないいくつかの特徴を有する：（１）これは、そのゲノム内の他のＨＥＲＶと区別する特異的なヌクレオチド配列を有する；（２）これは、タンデムな５’ＬＴＲを有する；（３）これは、断片化した３’ＬＴＲを有する；（４）そのｅｎｖ遺伝子は、ａｌｕ挿入によって中断されている；そして（５）そのｇａｇは、独特の挿入を含む。参考文献３は、これらの特徴が、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療において利用され得ることを教示する。

国際公開第０２/４６４７７号パンフレット

参考文献１〜３は、概括的な言葉で、ＨＭＬ−２ポリペプチドおよびＰＣＡＶポリペプチドの発現用ベクターを開示する。ＨＭＬ−２ポリペプチドおよびＰＣＡＶポリペプチドのインビトロ発現またはインビボ発現のためのさらなる改善されたベクターを提供することが、本発明の目的である。

本発明は、核酸ベクターを提供し、この核酸ベクターは、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）このプロモーターと作動可能に連結されているＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列；および（ｉｉｉ）選択マーカー；を含む。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）の下流にありかつ（ｉｉ）と作動可能に連結されている転写ターミネーターをさらに含む。

本発明のベクターは、インビトロ（例えば、後の精製のため）またはインビボ（例えば、核酸免疫のため）のいずれかでのＨＭＬ−２ポリペプチドの発現のために特に有用である。核酸免疫における使用のために、（ｉ）および（ｖ）は真核生物性であり、そして（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物性であることが好ましい。

（プロモーター）
本発明のベクターは、プロモーターを含む。このプロモーターは、真核生物中で機能性である（すなわち、真核生物において転写を駆動し得る）ことが好ましい。この真核生物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。このプロモーターは、好ましくは、インビボで活性である。

このプロモーターは、構成的プロモーターであってよいし、または調節されるプロモーターであってもよい。

このプロモーターは、特定の組織もしくは細胞型に特異的であってもよいし、または多くの組織において活性であってもよい。

好ましいプロモーターは、（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する）ウイルスプロモーターである。ウイルスベースの系が送達のために使用される場合、このプロモーターは、個々のウイルスに関係するプロモーターであり得る。例えば、ワクシニアプロモーターが、ワクシニアウイルス送達系とともに使用され得る。

このベクターはまた、転写調節配列（例えば、エンハンサー）を、このプロモーターに加えて含み得、この転写調節配列は、このプロモーターと機能的に相互作用する。

好ましいベクターとしては、極初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターが挙げられ、より好ましいベクターとしてはまた、ＣＭＶイントロンＡが挙げられる。これは、Ｔｏｗｎｅ株から元々単離された。これは、非常に強力である。完全なネイティブヒト極初期ＣＭＶ転写制御単位は、５’から、転写が制御される配列のＡＴＧまで、４つの領域へと模式的に分割される：Ｉ−モジュレーター領域（核因子１結合部位のクラスター）；ＩＩ−エンハンサー領域；ＩＩＩ−プロモーター領域；およびＩＶ−イントロンＡを伴う５’ ＵＴＲ。このネイティブウイルスにおいて、領域Ｉは、特化した細胞型における発現を調節する上流配列と、核因子１（ＮＦ１）結合部位のクラスターとを含む。領域Ｉは、多くの細胞株において抑制性であり得、本発明のベクターからは一般的に除去される。領域ＩＩおよび領域ＩＩＩは、一般的に本発明のベクター中に含まれる。イントロンＡ（領域ＩＶ中にある）は、多くの形質転換細胞株において発現を正に調節し、このイントロンＡを含むと、発現が増強される。

本発明のベクター中のプロモーターは、ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする下流配列と作動可能に連結されており、そのコード配列の発現は、そのプロモーターの制御下にあるようになっている。

（ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列）
本発明のベクターは、ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列を含む。このＨＭＬ−２は、好ましくはＰＣＡＶである。

ＨＭＬ−２は、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのサブグループである［４］。ＨＭＬ−２サブグループのメンバーであるＨＥＲＶ単離株としては、ＨＭＬ−２．ＨＯＭ［５］（ＥＲＶＫ６とも呼ばれる）、ＨＥＲＶ−Ｋ１０［６，７］、ＨＥＲＶ−Ｋ１０８［８］、参考文献９の図４に示される２７種のＨＭＬ−２ウイルス、ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）［１０］、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）［１１］、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）［１，２］が挙げられる。ＨＭＬ−２は十分に認識されたファミリーであるので、当業者は、任意の特定のＨＥＲＶ−ＫがＨＭＬ−２である否かを、例えば、ＨＥＲＶｄデータベース［１２］を参照することによって、何の困難性もなく決定することが可能である。

第７番染色体上に位置するＨＭＬ−２．ＨＯＭ［５，１３］またはＰＣＡＶ［３］由来の配列を使用することが、好ましい。ＰＣＡＶは、ＨＥＲＶ−ＫサブファミリーＨＭＬ２．０のメンバーであり、配列番号７５は、利用可能なヒト第２２番染色体配列［１４］に基づく、その最初の５’ＬＴＲの初めから断片化された３’ＬＴＲの最後までのＰＣＡＶの１２３６６ｂｐ配列である。これは、二本鎖ゲノムＤＮＡのセンス鎖である。この転写開始部位は、ヌクレオチド６３５＋５にあるようであり、そのポリアデニル化部位は、ヌクレオチド１１７３５にある。

このＨＭＬ−２ポリペプチドは、ｇａｇ領域、ｐｒｔ領域、ｐｏｌ領域、ｅｎｖ領域またはｃＯＲＦ領域に由来し得る。これらのポリペプチドをコードするＨＭＬ−２転写物は、内因性ウイルスゲノムの全長ｍＲＮＡコピーの選択的スプライシングによって生成される［例えば、参考文献１５の図４、参考文献１６の図１Ａ、本明細書中図９］。いくつかのＨＭＬ−２ウイルスが、５つすべてのポリペプチドをコードする（例えば、ＥＲＶＫ６［５］）が、ほとんどのコード領域は、変異しているかまたは存在しない１つ以上のコード領域を生じる変異を含む。従って、すべてのＨＭＬ−２ＨＥＲＶが、５つすべてのポリペプチドをコードする能力を有するわけではない。

ＨＭＬ−２ｇａｇポリペプチドは、完全ＨＭＬ−２ゲノム中の最初の長いＯＲＦによってコードされる［１７］。全長ｇａｇポリペプチドは、タンパク質分解切断される。ｇａｇヌクレオチド配列の例は、配列番号１（ＨＥＲＶ−Ｋ１０８）；配列番号２（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）；配列番号３（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号４（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）および配列番号７６（ＰＣＡＶ）である。ｇａｇポリペプチド配列の例は、配列番号５（ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７））；配列番号６（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ））；配列番号７および配列番号８（ＨＥＲＶ−Ｋ１０）；配列番号９（「ＥＲＶＫ６」）；配列番号６９ならび配列番号７８（ＰＣＡＶ）。

ＨＭＬ−２ｐｒｔポリペプチドは、完全ＨＭＬ−２ゲノム中の２番目の長いＯＲＦによってコードされる。これは、ｇａｇ−ｐｒｔ融合ポリペプチドとして翻訳される。この融合ポリペプチドは、タンパク質分解切断されて、プロテアーゼを生じる。ｐｒｔヌクレオチド配列の例は、配列番号１０［ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８）］；配列番号１１［ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）］；配列番号１２［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］である。ｐｒｔポリペプチド配列の例は、配列番号１３［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］；配列番号１４［「ＥＲＶＫ６」］；配列番号７１である。

ＨＭＬ−２ｐｏｌポリペプチドは、完全ＨＭＬ−２ゲノム中の３番目の長いＯＲＦによってコードされる。これは、ｇａｇ−ｐｒｔ−ｐｏｌ融合ポリペプチドとして翻訳される。この融合ポリペプチドは、タンパク質分解切断されて、３つをｐｏｌ生成物（逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、およびインテグラーゼ）を生じる［１８］。ｐｏｌヌクレオチド配列の例は、配列番号１５［ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８）］；配列番号１６［ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）；配列番号１７（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）］；配列番号１８［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］である。ｐｏｌポリペプチド配列の例は、配列番号１９［ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）］；配列番号２０［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］；配列番号２１［「ＥＲＶＫ６」］；配列番号７３である。

ＨＭＬ−２ｅｎｖポリペプチドは、完全ＨＭＬ−２ゲノム中の４番目の長いＯＲＦによってコードされる。翻訳されたポリペプチドは、タンパク質分解切断される。ｅｎｖヌクレオチド配列の例は、配列番号２２［ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８）］；配列番号２３［ＨＥ
ＲＶ−Ｋ（Ｃ７）；配列番号２４（ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）］；配列番号２５［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］である。ｅｎｖポリペプチド配列の例は、配列番号２６［ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）］；配列番号２７［ＨＥＲＶ−Ｋ１０］；配列番号２８［「ＥＲＶＫ６」］である。

ＨＭＬ−２ｃＯＲＦポリペプチドは、ｅｎｖと同じ５’領域および開始コドンを共有するＯＲＦによって、コードされる。約８７コドンの後ろで、スプライシング事象によって、ｅｎｖコード配列が除去される。このｃＯＲＦコード配列は、ｅｎｖのリーディングフレームに対して＋１のリーディングフレームで続く［１９，２０］。ｃＯＲＦはまた、Ｒｅｃとも呼ばれている［２１］。ｃＯＲＦヌクレオチド配列の例は、配列番号２９および配列番号３０［ＨＥＲＶ−Ｋ（１０８）］である。ｃＯＲＦポリペプチド配列の例は、配列番号３１である。

このＨＭＬ−２ポリペプチドは、あるいは、ＰＣＡＰオープンリーディングフレーム[２２］（例えば、ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３、ＰＣＡＰ４、ＰＣＡＰ４ａまたはＰＣＡＰ５（本明細書中の配列番号３２〜３７））に由来し得る。ＰＣＡＰ３（配列番号３４および４６）ならびにＰＣＡＰ５が、好ましい（配列番号３７）。

このＨＭＬ−２ポリペプチドは、あるいは、配列番号３８〜５０のうちの１つであり得る［２２］。

任意のＨＭＬ−２ポリペプチド発現生成物をコードする配列が、本発明に従って使用され得る（例えば、配列番号５、６、７、８、９、１３、１４、１９、２０、２１、２６、２７、２８、３１〜５０、６９〜７４、７８もしくは７９のうちのいずれか１つをコードする配列）。

本発明はまた、そのような野生型ＨＭＬ−２ポリペプチド配列に対して少なくともａ％同一性を有するポリペプチドをコードする配列を使用し得る。ａの値は、６５以上（例えば、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８，９９、９９．５、９９．９）であり得る。これらの配列は、上記の段落において列挙される配列番号の対立遺伝子改変体、ＳＮＰ改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体などを包含し得る。

本発明はまた、野生型ＨＭＬ−２ヌクレオチド配列に対して少なくともｂ％同一性を有する配列を使用し得る。ｂの値は、６５以上（例えば、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８，９９、９９．５、９９．９）であり得る。これらの配列は、配列番号１、２、３、４、１０、１１、１２、１５、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２５、２９および３０の対立遺伝子改変体、ＳＮＰ改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体などを包含する。

本発明はまた、このような野生型ＨＭＬ−２ヌクレオチド配列の少なくともｃヌクレオチドのフラグメントを含む配列を使用し得る。ｃの値は、７以上（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上）であり得る。このフラグメントは、好ましくは、ＨＭＬ−２ポリタンパク質のタンパク質分解切断生成物である。このフラグメントは、好ましくは、ＨＭＬ−２由来のＴ細胞エピトープまたは好ましくはＢ細胞エピトープをコードする配列を含む。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、経験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ法［２３、２４］もしくは類似する方法を使用して）同定され得るか、またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［２５］、マトリックスベースアプローチ［２６］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２７］、ニューラルネットワーク［２８］、ＯｐｔｉＭｅｒおよびＥｐｉＭｅｒ［２９，３０］、ＡＤＥＰＴ［３１］、Ｔｓｉｔｅｓ［３２］、疎水性［３３］、抗原性指数［３４］もしくは参考文献３５に開示される方法などを使用して、推定され得る。

本発明はまた、野生型ＨＭＬ−２ポリペプチド配列の少なくともｄアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列を使用し得る。ｄの値は、７以上（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００以上）であり得る。このフラグメントは、好ましくは、ＨＭＬ−２由来のＴ細胞エピトープまたは好ましくはＢ細胞エピトープを含む。

本発明はまた、（ｉ）野生型ＨＭＬ−２配列もしくは上記に開示される配列である、第１配列と、（ｉｉ）第２の非ＨＭＬ−２配列とを含む、配列を使用し得る。（ｉｉ）の例としては、シグナルペプチドをコードする配列、プロテアーゼ切断部位をコードする配列、エピトープをコードする配列、リーダー配列をコードする配列、タグをコードする配列、融合パートナーをコードする配列、Ｎ末端メチオニンをコードする配列、任意の配列などが挙げられる。配列（ｉｉ）は、一般に、（ｉ）のＮ末端および／またはＣ末端に位置し得る。

ヌクレオチド配列は、天然で見出されるＨＭＬ−２ポリペプチドをコードし得るが、そのヌクレオチド配列は、対応する天然ヌクレオチド配列とは異なり得る。例えば、そのヌクレオチド配列は、例えば、目的の宿主におけるコドン優先度を考慮するため、または制限酵素認識部位もしくはタグ配列を付加するために、変異を含み得る。

（選択マーカー）
本発明のベクターは、選択マーカーを含み得る。

このマーカーは、好ましくは、微生物宿主（例えば、原核生物、細菌、酵母）において機能する。このマーカーは、好ましくは、原核生物選択マーカーである（例えば、原核生物プロモーターの制御下で転写される）。

簡便のために、代表的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。

(本発明の核酸ベクターのさらなる特徴）
本発明のベクターは、好ましくは、自己複製するエピソームベクターまたは染色体外ベクター（例えば、プラスミド）である。

本発明のベクターは、好ましくは、複製起点を含む。この複製起点は、原核生物において活性であるが真核生物においては活性ではないことが、好ましい。

従って、好ましいベクターは、そのベクターの選択用の原核生物マーカー、原核生物複製起点を含むが、ＨＭＬ−２コード配列の転写を駆動するための真核生物プロモーターは含まない。従って、このベクターは、（ａ）ＨＭＬ−２ポリペプチドを発現することなく原核生物宿主中で増幅され選択されるが、（ｂ）増幅されることなく真核生物宿主中で発現される。これは、核酸免疫ベクターのために理想的である。

本発明のベクターは、ＨＭＬ−２コード配列の下流に真核生物転写ターミネーター配列を含み得る。これは、転写レベルを増強し得る。そのＨＭＬ−２コード配列がそれ自体を有さない場合、本発明のベクターは、好ましくは、ポリアデニル化配列を含む。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンに由来する。

本発明のベクターは、マルチクローニング部位を含み得る。

ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列およびマーカーをコードする配列に加えて、このベクターは、第２の真核生物コード配列を含み得る。このベクターはまた、ＨＭＬ−２ポリペプチドと同じ転写物に由来する第２の真核生物ポリペプチドの翻訳を可能にするために、上記の第２配列の上流にＩＲＥＳを含み得る。あるいは、ＨＭＬ−２ポリペプチドは、ＩＲＥＳの下流にあり得る。

本発明のベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ（例えば、２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンが隣接する、シトシンとそれに続くグアノシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列）を含み得る。その非メチル化形態で、これらのＤＮＡモチーフは、いくつかの型の免疫細胞の強力な刺激因子であることが示されている。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
核酸ベクターであって、
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２サブグループのメンバーである内因性レトロウイルスに由来するポリペプチドをコードする配列であって、当該配列は、当該プロモーターと作動可能に連結されている、配列；および
（ｉｉｉ）選択マーカー；
を含む、ベクター。
・（項目２）
項目１に記載のベクターであって、
（ｉｖ）複製起点；および
（ｖ）（ｉｉ）の下流にありかつ（ｉｉ）と作動可能に連結されている、転写ターミネーター；
をさらに含む、ベクター。
・（項目３）
項目２に記載のベクターであって、（ｉ）および（ｖ）は、真核生物性であり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物性である、ベクター。
・（項目４）
項目１〜３のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記ＨＭＬ−２は、ヒト第２２番染色体由来のＰＣＡＶである、ベクター。
・（項目５）
項目１〜４のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記プロモーターは、ヒトにおいてインビボで機能する、ベクター。
・（項目６）
項目１〜５のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記プロモーターは、ウイルスプロモーターである、ベクター。
・（項目７）
項目６に記載のベクターであって、上記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する、ベクター。
・（項目８）
項目１〜７のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記プロモーターに加えて転写調節配列を含む、ベクター。
・（項目９）
項目１〜８のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記ＨＭＬ−２ポリペプチドは、ｇａｇポリペプチド、ｐｒｔポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、ｅｎｖポリペプチド、ｃＯＲＦポリペプチド、またはＰＣＡＰポリペプチドである、ベクター。
・（項目１０）
項目９に記載のベクターであって、上記ＨＭＬ−２ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１〜５０、６９〜７４、７８および７９のうちの１つ以上に対して少なくとも６５％同一性を有し、かつ／または
（ｂ）配列番号１〜５０、６９〜７４、７８および７９のうちの１つ以上に由来する少なくとも７アミノ酸のフラグメントを含む、
ベクター。
・（項目１１）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記選択マーカーは、細菌において機能する、ベクター。
・（項目１２）
項目１〜１１のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である、ベクター。
・（項目１３）
項目１〜１２のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記ベクターは、プラスミドである、ベクター。
・（項目１４）
項目１〜１３のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記ベクターは、複製起点を含む、ベクター。
・（項目１５）
項目１４に記載のベクターであって、上記複製起点は、原核生物において活性であるが真核生物においては活性ではない、ベクター。
・（項目１６）
項目１〜１５のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、上記ＨＭＬ−２コード配列の下流に真核生物転写ターミネーター配列をさらに含む、ベクター。
・（項目１７）
項目１〜１６のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、マルチクローニング部位をさらに含む、ベクター。
・（項目１８）
項目１〜１７のうちのいずれか１項に記載のベクターであって、真核生物ポリペプチドをコードする第２配列の上流にＩＲＥＳをさらに含む、ベクター。
・（項目１９）
項目１〜１８のうちのいずれか１項に記載のベクターを含む、薬学的組成物。
・（項目２０）
医薬として使用するための項目１〜１８のうちのいずれか１項に記載のベクター。
・（項目２１）
前立腺癌、精巣癌、多発性硬化症、および／またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を処置するための医薬の製造における、項目１〜１８のうちのいずれか１項に記載のベクターの使用。
・（項目２２）
免疫応答を惹起するための方法であって、
免疫原性用量の項目１〜１８のうちのいずれか１項に記載のベクターを動物に投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２３）
前立腺腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、
項目１９に記載の薬学的組成物を、当該患者に投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２４）
ＨＭＬ−２ｇａｇポリペプチドを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
・（項目２５）
医薬として使用するための項目２４に記載のＶＬＰ。
・（項目２６）
動物を免疫するための医薬の製造における、項目２４に記載のＶＬＰの使用。
・（項目２７）
動物において免疫応答を惹起するための方法であって、
項目２４に記載のＶＬＰを、当該動物に投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２８）
前立腺腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、
項目２４に記載のＶＬＰを、当該患者に投与する工程
を包含する、方法。
・（項目２９）
患者において癌を診断するための方法であって、
（ａ）項目２４に記載のＶＬＰを、当該患者由来の抗体と接触させる工程、および／または
（ｂ）項目２４に記載のＶＬＰに対する抗体を、患者サンプルと接触させる工程
を包含する、方法。

（薬学的組成物）
本発明は、本発明のベクターを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、医薬としてのそのベクターの使用、および前立腺癌を処置するための医薬の製造におけるそのベクターの使用を提供する。本発明はまた、前立腺腫瘍を有する患者を処置するための方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物をその患者に投与する工程を包含する。その患者は、一般にヒトであり、好ましくはヒトの男性であり、より好ましくは、成人男性である。ＨＥＲＶ−Ｋが関係付けられている他の疾患としては、精巣癌[３６]、多発性硬化症[３７]、およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）[３８]が挙げられる。このベクターはまた、これらの疾患に対しても使用され得る。

本発明はまた、免疫応答を惹起するための方法を提供し、この方法は、免疫原性用量の本発明のベクターを、動物（例えば、ヒト）に投与する工程を包含する。

本発明により包含される薬学的組成物は、活性因子として、治療上有効な量で本発明のベクターを含む。「有効（な）量」とは、有益な結果または望ましい結果（臨床結果を含む）をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明のために、有効量とは、前立腺癌の症状および／または進行を、緩和、改善、安定化、逆転、減速、または遅延するために十分である量である。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって、検出され得る。治療効果としてはまた、身体的症状の減少も挙げられる。

被験体にとっての正確な有効量は、その被験体の大きさおよび健康、その状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤または治療剤の組み合わせに依存する。所定の状況についての有効量は、慣用的実験によって決定され、それは、臨床医の判断の範囲内にある。本発明の目的のために、有効用量は、一般には、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。

この組成物は、癌および原発性癌の転移を処置するために使用され得る。さらに、本薬学的組成物は、従来の癌処置方法と組み合わせて、例えば、放射線または従来の化学療法に対して腫瘍を感受性にするために使用され得る。用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、望ましい薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを一般的に指すために本明細書中で使用される。この効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防する点で予防的であり得、そして／または疾患および／もしくはその疾患が原因である有害な影響を部分的もしくは完全に安定化もしくは治癒する点で治療的であり得る。「処置」とは、本明細書中で使用される場合、哺乳動物（好ましくはヒト）における疾患のあらゆる処置を網羅し、これには、（ａ）その疾患もしくは症状に対する素因があり得るがその疾患もしくは症状を有するとは未だ診断されていない被験体において、その疾患もしくは症状が発症するのを予防すること；（ｂ）その疾患症状を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または（ｃ）その疾患症状を軽減すること（すなわち、その疾患もしくは症状の後退を引き起こすこと）が挙げられる。

薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。この用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、治療剤（例えば、抗体、もしくはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤）の投与のためのキャリアを指す。この用語は、上記組成物を受容する個体に対して有害な抗体の生成をそれ自体は誘導せず、かつ過度の毒性も伴わずに投与され得る、あらゆる薬学的キャリアを指す。適切なキャリアは、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者にとって周知である。治療組成物中の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような、液体が挙げられ得る。補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）もまた、このような媒体中に存在し得る。代表的には、この治療組成物は、液体溶液または液体懸濁物のいずれかとして、注射可能物質とて調製される。注射前に液体媒体中の溶液もしくは懸濁物になるために適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームが、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に包含される。薬学的に受容可能な塩（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）もまた、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な考察が、参考文献３９において入手可能である。

この組成物は、好ましくは、滅菌されており、かつ／または発熱物質を含まない。これは、代表的には、約ｐＨ７にて緩衝化されている。

一旦処方されると、本発明により企図される組成物は、（１）被験体に直接投与され得るか；または（２）被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得る（例えば、エキソビボ遺伝子治療として）。この組成物の直接送達は、一般的には、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、もしくは筋肉内注射、腫瘍内注射、または組織の間隙空間への注射）によって、達成される。他の投与様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、および経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。投与処置は、単回投与スケジュールであっても、または多回投与スケジュールであってもよい。

筋肉内注射が、好ましい。

被験体中への形質転換細胞のエキソビボ送達および再移植のための方法は、当該分野で公知である[例えば、参考文献４０]。エキソビボ適用において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に、造血幹細胞）、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸送達が、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中への核酸のカプセル化、および核中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられ、すべて当該分野で周知である。

（標的化送達）
本発明のベクターは、標的化様式で送達され得る。

レセプター媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献４１〜４６において記載される。核酸を含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡという範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡという濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルの間に使用され得る。作用方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強または阻害するため）、ならびに形質転換効率および発現効率のような要因が、最終的効力のために必要な投与量に影響を及ぼす考慮事項である。より多くの発現がより広い組織領域にわたって望ましい場合、より多くの量のベクター、または連続投与プロトコルにおいて再投与される同じ量、または例えば、腫瘍部位の異なる隣接もしくは近接する組織部分に数回投与することが、正の治療結果をもたらすために必要であり得る。すべての場合に、臨床試験における慣用的実験によって、最適な治療効果のための具体的範囲が決定される。

ベクターは、遺伝子送達媒体を使用して送達され得る。この遺伝子送達媒体は、ウイルス起源であっても、非ウイルス起源であってもよい（一般的には、参考文献４７〜５０を参照のこと）。

望ましい細胞における望ましい核酸の送達および発現のためのウイルスベースのベクターが、当該分野で周知である。例示的なウイルスベースのベクターとしては、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献５１〜６１）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−６７；ＡＴＣＣＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−３７３；ＡＴＣＣＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−９２３；ＡＴＣＣＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣＶＲ１２４９；ＡＴＣＣＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドもしくはキメラもまた、使用され得る）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、改変型ワクシニアＡｎｋａｒａウイルスなど）、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献６２〜６７を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与[６８]もまた、使用され得る。

非ウイルス性送達媒体および非ウイルス性送達方法もまた、使用され得、これには、死滅アデノウイルス単独に連結されているかまたは連結されていないポリカチオン性濃縮ＤＮＡ[例えば、６８]、リガンド連結ＤＮＡ[６９]、真核生物細胞送達媒体細胞[例えば、参考文献７０〜７４]、ならびに核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法が、参考文献７５および７６に記載される。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソーム（例えば、イムノリポソーム）が、参考文献７７〜８１に記載される。さらなるアプローチが、参考文献８２および８３に記載される。

使用するために適切なさらなる非ウイルス送達としては、機械的送達系（例えば、参考文献８３に記載されるアプローチ）が挙げられる。さらに、コード配列およびその発現産物が、光重合化ヒドロゲル物質の沈着または電離放射線の使用を介して、送達され得る[例えば、参考文献８４および８５]。コード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来方法としては、例えば、携帯式遺伝子転移粒子銃[８６]または転移した遺伝子を活性化するための電離放射線の使用[８４および８７]が挙げられる。

ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）｝微粒子を使用するＤＮＡの送達は、特に好ましい方法であり、これは、例えば、この微粒子への吸着による。この微粒子は、必要に応じて、負電荷表面を有するように処理される（例えば、ＳＤＳで処理される）か、または正電荷表面を有するように処理される（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤で処理される）。

（ワクチン組成物）
この薬学的組成物は、好ましくは、免疫原性組成物であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。このような組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を惹起するため、および／または細胞免疫応答（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）に関与する応答、ナチュラルキラー細胞に関与する応答、マクロファージに関与する応答など）を惹起するために、使用され得る。

本発明は、前立腺癌を予防するための医薬の製造における本発明のベクターの使用を提供する。本発明はまた、前立腺癌から患者を保護するための方法を提供し、この方法は、患者に、本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含する。

核酸免疫は、周知である[例えば、参考文献８８〜９４など]。

この組成物は、アジュバントをさらに含み得る。例えば、この組成物は、以下のアジュバントのうちの１つ以上を含み得る：（１）水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下記を参照）もしくは細菌細胞壁成分）を含むかまたは含まない）（例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを使用してミクロン未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９^ＴＭ（５％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（ＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を必要に応じて含む）［９５；参考文献９６の第１０章］を含む）、（ｂ）１０％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（ミクロン未満のエマルジョンにマイクロフルイダイズされているか、もしくはより大きな粒子サイズのメマルジョンを生成するようにボルテックスされているかのいずれかである）、ならびに（ｃ）２％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択され、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）である）を含む、Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（２）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１もしくはＳｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）またはそれから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る[９７]）が使用され得る）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）もしくは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）[例えば、９８、９９]；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／もしくは水中油エマルジョンとの組み合わせ[例えば、１００、１０１、１０２]；（７）ＣｐＧモチーフを含む（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、必要に応じてシトシンの代わりに５−メチルシトシンが使用される）オリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルもしくはポリオキシエチレンエステル[１０３]；（９）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤[１０４]、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤[１０５]；（１０）免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）＋サポニン[１０６]；（１１）免疫刺激剤＋金属塩粒子[１０７]；（１２）サポニン＋水中油エマルジョン[１０８]；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）[１０９]；（１４）アルミニウム塩（好ましくは水酸塩もしくはリン酸塩）（しかし、他の任意の適切な塩（例えば、リン酸水素塩、酸水酸塩、オルトリン酸塩、硫酸塩など[参考文献９６の第８章および第９章]。種々のアルミニウム塩の混合物もまた、使用され得る。その塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を採り得る；（１５）キトサン；（１６）コレラ毒素もしくはＥ．ｃｏｌｉ易熱性毒素もしくはそれらの解毒化変異体[１１０]；（１７）生分解性かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど（例えば、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）など））から形成された、微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）（この微粒子は、必要に応じて、負電荷表面を有するように処理される（例えば、ＳＤＳで処理される）か、または正電荷表面を有するように処理される（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤で処理される）；（１８）モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体（例えば、ＲＣ−５２９[１１１]）；（１９）ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；（２０）生体接着物質[１１２]（例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア[１１３]、または粘膜接着物質（ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体からなる群より選択される））；（２１）二本鎖ＲＮＡ；あるいは（２２）この組成物の効力を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質。アルミニウム塩および／またはＭＦ５９^ＴＭが、好ましい。

本発明のワクチンは、予防的（すなわち、疾患を予防する）であっても、治療的（すなわち、疾患の症状を減少または除去する）であってもよい。

（本発明の具体的ベクター）
本発明の好ましいベクターは、（ｉ）真核生物プロモーター；（ｉｉ）そのプロモーターの下流にありかつそのプロモーターに作動可能に連結されている、ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列；（ｉｉｉ）原核生物選択マーカー；（ｉｖ）原核生物複製起点；および（ｖ）ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列の下流にありかつこの配列に作動可能に連結されている、真核生物転写ターミネーターを含む。

特に好ましいベクターは、図２〜８（配列番号５１〜５６および８０）に示される。

（ウイルス様粒子）
ＨＭＬ−２ｇａｇポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと集合することが見出されている。このポリペプチドのこの粒子形態は、可溶性ポリペプチドと比較した場合に増強した免疫原性を有し、そしてこれは、免疫および／または診断における使用のために好ましいポリペプチド形態である。

従って、本発明は、ＨＭＬ−２ｇａｇポリペプチドを含む、ウイルス様粒子を提供する。このｇａｇポリペプチドは、そのＮ末端においてミリストイル化され得る。

本発明はまた、免疫原として使用するため、または診断抗原として使用するための、本発明のＶＬＰを提供する。本発明はまた、動物を免疫するための医薬の製造における、本発明のＶＬＰの使用を提供する。

本発明はまた、動物において免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、本発明のＶＬＰをその動物に投与する工程を包含する。その免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞免疫応答を包含し得る。

免疫応答を惹起するために、このＶＬＰは、上記に開示されるようなアジュバントとともに、またはそのアジュバントを伴わずに、投与され得る。その免疫応答は、癌（例えば、前立腺癌）を処置し得るかまたはその癌に対して防御し得る。

本発明はまた、患者において癌（例えば、前立腺癌）を診断するための方法を提供し、この方法は、本発明のＶＬＰをその患者由来の抗体と接触させる工程を包含する。同様に、本発明は、患者において癌（例えば、前立腺癌）を診断するための方法を提供し、この方法は、患者サンプルと抗ＶＬＰ抗体とを接触させる工程を包含する。

本発明はまた、本発明のＶＬＰを調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、細胞中でｇａｇポリペプチドを発現する工程、およびその細胞からＶＬＰを収集する工程を包含する。発現は、本発明のベクターを使用して達成され得る。

本発明のＶＬＰは、パッケージされた核酸を含んでも、含まなくてもよい。

このＶＬＰが生成されるｇａｇポリペプチドは、任意の適切なＨＭＬ−２ウイルスに由来し得る（例えば、配列番号１〜９、６９および７８）。

（定義）
用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む、含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）および「からなる（ｃｏｎｓｉｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってもよいし、またはさらなる何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

数値ｘに関連する用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。

用語「新生物細胞」、「新生物形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（互換可能に使用される）とは、比較的自己増殖を示して、細胞増殖の制御の有意な喪失（すなわち、調節解除された細胞分裂）によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示すようになっている、細胞を指す。新生物形成細胞は、悪性であっても良性であってもよく、これには、前立腺癌由来の組織が包含される。

２つの核酸配列間の配列同一性パーセントに対する言及は、整列された場合に、その２つの配列を比較するとその塩基のパーセンテージが同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１１４の第７．７．１８節において記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましいアライメントプログラムは、ＧＣＧＧａｐ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＳｕｉｔｅＶｅｒｓｉｏｎ１０．１）であり、これは、好ましくは、デフォルトパラメーターを使用し、そのデフォルトパラメーターは、以下の通りである：オープンギャップ＝３；エクステンドギャップ＝１．
２つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセントに対する言及は、整列した場合に、その２つの配列を比較するとそのアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献１１４の第７．７．１８節において記載されるソフトウェアプログラム）を使用して決定され得る。好ましいアライメントプログラムは、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップエクステンションペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２を用いるアフィンギャップサーチを使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１１５において教示される。

図１は、ｐＣＭＶｋｍ２ベクターを示す。図２は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図３は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図４は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図５は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図６は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図７は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図８は、このベクター中にＨＭＬ−２ポリペプチドコード配列を挿入することによって形成されたベクターを示す。図９は、ＨＭＬ２．ＨＯＭゲノム中のコード配列の位置を示し、ヌクレオチドの番号付けは、参考文献５に従う。図１０は、トランスフェクトされた２９３細胞におけるｇａｇ発現を示すウェスタンブロットである。レーン１〜４は、（１）ｇａｇｏｐｔＨＭＬ−２；（２）ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶ；（３）ｇａｇｗｔＰＣＡＶ；（４）モックである。図１１もまた、トランスフェクトされた２９３細胞のウェスタンブロットを示す。図１１Ａにおいて、その染色抗体は、抗ＨＭＬ−２であったが、図１１Ｂにおいて、その染色抗体は、抗ＰＣＡＶであった。図１１Ａおよび図１１Ｂの両方において、レーン１〜４は、（１）モック；（２）ｇａｇｏｐｔＨＭＬ−２；（３）ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶ；（４）ｇａｇｗｔＰＣＡＶである。上側の矢印は、ｇａｇの位置を示し、下側の矢印は、β−アクチンコントロールを示す。図１２は、ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶを発現する２９３細胞の電子顕微鏡写真（図１２Ａ）またはｇａｇｏｐｔＨＭＬ−２を発現する２９３細胞の電子顕微鏡写真（図１２Ｂ）を示す。

（発明を実行するための様式）
本発明の特定の局面は、以下の非限定的実施例においてより詳細に記載される。これらの実施例は、本発明を生成する方法および使用する方法の開示および説明を当業者に提供するために示され、そしてこれらの実施例は、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することは意図されず、下記の実験が、実施されたすべてかつ唯一の実験であることを示すこともまた、意図されない。使用する数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確保するための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が、考慮されなければならない。他のように示されない限り、部とは、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏度であり、圧力は、大気圧であるかまたはほぼ大気圧である。

（ＨＭＬ−２ポリペプチドを発現するためのベクター）
基本的ｐＣＭＶｋｍ２ベクターが、図１に示される。このベクターは、極初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびウシ成長ホルモン転写ターミネーターと、その間に位置するマルチクローニング部位とを有する。このベクターは、カナマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点も有する。

ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする配列が、そのマルチクローニング部位においてＳａｌＩとＥｃｏＲＩとの間に挿入される。

図４（配列番号５３）において示されるベクター以外は、この挿入される配列は、最適な終止コドンの付加を含めて、コドン優先度のために操作された：
（ｃＯＲＦ操作）
配列番号５７（配列番号４３）で開始する；配列番号５８（配列番号６７）へと操作する：

（ＰＣＡＰ５操作）
配列番号５９（配列番号３７）で開始する；配列番号６０（配列番号６８）へと操作する：

（ｇａｇ操作）
配列番号６１（配列番号６９）で開始する；配列番号６２（配列番号７０）へと操作する：

（ｐｒｔ操作）
配列番号６３（配列番号７１）で開始する；配列番号６４（配列番号７２）へと操作する：

（ｐｏｌ操作）
配列番号６５（配列番号７３）で開始する；配列番号６６（配列番号７４）へと操作する：

（ｅｎｖ操作）
配列番号８１（配列番号８３）で開始する；配列番号８２へと操作する：

（ｇａｇ配列のインビトロ発現）
３つの異なるｇａｇコード配列を、ｐＣＭＶＫｍ２ベクター中にクローニングした：
（１）ｇａｇｏｐｔＨＭＬ−２（配列番号５４（配列番号６２を含み、配列番号７０をコードする）−図５）
（２）ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶ（配列番号８０（配列番号７７を含み、配列番号７９をコードする）−図８）
（３）ｇａｇｗｔＰＣＡＶ（配列番号５３（配列番号７６を含み、配列番号７８をコードする）−図４）。

これらのベクターを使用して、ポリアミン試薬ＴｒａｎｓＩｔ^ＴＭＬＴ−１（ＰａｎＶｅｒａＣｏｒｐ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）および２μｇＤＮＡを使用して、６ウェルプレート中において二連で２９３細胞をトランスフェクトした。

細胞を、４８時間後に溶解し、プールした抗ＨＭＬ２−ｇａｇマウス抗体を一次抗体（１：４００）として使用し、そしてヤギ抗マウスＨＲＰを二次抗体（１：２００００）として使用して、ウェスタンブロットによって分析した。図１０は、「ｇａｇｗｔＰＣＡＶ」（レーン３）よりもかなり効率的に発現された「ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶ」（レーン２）を示す。レーン１（「ｇａｇｏｐｔＨＭＬ−２」）は、レーン２（「ｇａｇｏｐｔＰＣＡＶ」）よりも強く染色されるが、これは、一次抗体が相同なＨＭＬ−２タンパク質に対して惹起された事実に起因したものであり得、発現効率の差を反映するものではない。この疑問に取り組むために、ＰＣＡＶ生成物に対しても抗体を惹起し、これをウェスタンブロッティングに使用した。図１１Ａは、抗ＨＭＬ２を一次抗体（１：５００）として使用する結果を示し、図１１Ｂは、抗ＰＣＡＶ（１：５００）を用いる結果を示す。各抗体は、上記異種タンパク質よりも強く、上記同種タンパク質を染色する。

（核酸免疫）
本発明のベクターは、細菌から精製され、そしてマウスを免疫するために使用される。

（ＰＣＡＶｇａｇに対するＴ細胞応答）
ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＰＣＡＶｇａｇをコードするｐＣＭＶＫｍ２ベクターで筋肉内免疫した（図４および８）。そしてｇａｇ特異的ＣＤ４＋細胞およびｇａｇ特異的ＣＤ８
＋細胞の誘導を、測定した。

マウスに、０週目、２週目、４週目および６週目に、５０μｇのプラスミドを４回注射した。これらのプラスミドは、野生型ｇａｇ配列（配列番号７６）を含んだ。その後、マウスを、さらなる作業のために２つの別個の群に分割した。

３匹のマウスの第１群には、２５週目にさらに５０μｇのプラスミドを与えたが、このプラスミドは、最適化したｇａｇ配列（配列番号７７）を含んだ。１１日間後、脾臓を採取してプールした。単細胞懸濁物を、培養のために調製した。脾細胞（１×１０^６／培養）を、ＰＣＡＶｇａｇ配列を含む組換えワクシニア（「ｒＶＶ−ｇａｇ」）（これは、クローニングベクターｐＳＣ１１の相同組換え[１１６]、およびその後の組換えｒＶＶｇａｇのプラーク精製によって生成した）１×１０^７プラーク形成単位（ｐｆｕ）の非存在下（「非刺激」）または存在下（「刺激」）において、３７℃で一晩培養した。二連の刺激培養物および非刺激培養物を調製した。翌日、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを添加して、サイトカイン分泌をブロックした。培養を２時間継続した。その後、培養物を採集し、そして細胞表面ＣＤ８についての蛍光標識モノクローナル抗体および細胞内γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）についての蛍光標識モノクローナル抗体を用いて染色した。染色したサンプルを、フローサイトメトリーによって分析した。細胞内ＩＦＮ−γについて正に染色したＣＤ８＋細胞の画分を決定した。結果は、以下の通りであった：

プールした脾臓ＣＤ８＋細胞のうちの平均１．２７％が、ｒＶＶ−ｇａｇでの刺激に応答してＩＦＮ−γを感作した。このことは、このＤＮＡ免疫が、ＰＣＡＶｇａｇを特異的に認識してこのＰＣＡＶｇａｇに応答する、ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導したことを示す。

４匹のマウスの第２群には、２８週間目にさらに５０μｇのプラスミドを与えたが、このプラスミドは、最適化したｇａｇ配列（配列番号７７）を含んだ。１２日間後、脾臓を採取した。特異性コントロールとして、ＨＭＬ２ｅｎｖをコードするｐＣＭＶ−ＫＭ２ベクターでワクチン接種したＣＢ６Ｆ１マウスからも、脾臓を得た。

個々の脾臓からの単細胞懸濁物を、培養のために調製した。脾細胞（１×１０^６／培養）を、刺激の非存在下または１×１０^７ｐｆｕのｒＶＶ−ｇａｇの存在下で、３７℃にて一晩培養した。特異性コントロールとして、さらなる培養物が、別の組換えワクシニアウイルスｒＶＶ−ＨＩＶｇｐ１６０ｅｎｖ．ＳＦ１６２（「ｒＶＶ−ＨＩＶｅｎｖ」−これは、ＨＩＶ−１のＳＦ１６２単離株由来の全長ｅｎｖ遺伝子を含む）を含んだ。これは、ＰＣＡＶ由来のｇａｇまたはｅｎｖのいずれとも交差反応しないことが予期された。

二連の培養物を、各条件について調製した。翌日、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを添加して、サイトカイン分泌をブロックした。抗ＣＤ２８抗体を添加して、ＣＤ４Ｔ細胞を共刺激した。培養を２時間継続した。その後、培養物を採集し、細胞表面ＣＤ８についての蛍光標識モノクローナル抗体、細胞表面ＣＤ４についての蛍光標識モノクローナル抗体、および細胞内γＩＦＮについての蛍光標識モノクローナル抗体を用いて染色した。染色したサンプルを、フローサイトメトリーによって分析し、細胞内ＩＦＮ−γについて正に染色したＣＤ８＋ＣＤ４− Ｔ細胞およびＣＤ４＋８− Ｔ細胞の画分を、決定した。結果を以下の表に示す。結果は、脾臓培養の間に刺激されなかった細胞を用いて観察された平均値を引いた後の、脾臓培養の間にＰＣＡＶｇａｇまたはＨＩＶｅｎｖのいずれかによる刺激に応答して染色された細胞の％として表した。

ＰＣＡＶｇａｇをコードするベクターでワクチン摂取された４匹のマウスについて、従って、ｒＶＶ−ｇａｇベクターは、１．３２％〜３．００％のＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して、ＩＦＮ−γを生成した。しかし、無関係のｒＶＶ−ＨＩＶｇｐ１６０ｅｎｖベクターに応答したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ほとんど存在しなかった（＜０．２３％）。このＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、従って、ＰＣＡＶｇａｇ特異的である。さらに、ＰＣＡＶｅｎｖで免疫したコントロールマウスは、ワクシニア刺激に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞を非常にわずかしか有さなかった（０．１３％）。

同様に、ＰＣＡＶｇａｇによるワクチン接種は、ＰＣＡＶｇａｇに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した（０．１７％〜０．４０％）が、ＰＣＡＶｅｎｖによるワクチン接種は、そのように誘導しなかった。

従って、ＰＣＡＶｇａｇをコードするベクターによるＤＮＡ免疫は、ＰＣＡＶｇａｇ抗原を特異的に認識してその抗原に応答する、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する。

（ウイルス様粒子）
２９３細胞を、ｐＣＭＶ−ｇａｇ（ＨＭＬ−２由来またはＰＣＡＶ由来のいずれか）で一過性トランスフェクションした４８時間後に固定し、電子顕微鏡法により視察した（図１２）。両方の場合においてＶＬＰを生成したが、これらは、ＰＣＡＶについて主に細胞内にあり、ＨＭＬ−２について主に分泌された。

ＰＣＡＶ由来の可視的ＶＬＰおよびＨＭＬ−２由来の可視的ＶＬＰの集合は、ｇａｇタンパク質は、上記の内因性ウイルスが「潜在的」である場合でさえもその本質的活性を保持し、従って、変異的不活化に供されることが予期され得ることを、示す。

本発明の好ましい実施形態の上記の説明は、明瞭さおよび理解のために例示および例として提示されている。本発明は、開示されたこの明確な形態に対して網羅的であることも、この形態に限定されることも、意図されない。本発明の趣旨から逸脱することなく多くの変化および改変が本発明に対してなされ得ることが、本発明の教示を考慮すれば、当業者にとって容易に明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって規定されることが、意図される。

（配列表索引）

以下に注意されたい：
−配列番号１〜９は、参考文献１において、配列番号８５、９１、９７、１０２、９２、９８、１０３、１０４および１４６として開示される
−配列番号１０〜１４は、参考文献１において、配列番号８６、９９、１０５、１０６および１４７として開示される
−配列番号１５〜２１は、参考文献１において、配列番号８７、９３、１００、１０７、９４、１０８、および１４８として開示される
−配列番号２２〜２８は、参考文献１において、配列番号８８、９５、１０１、１０７、９６、１０８、および１４９として開示される
−配列番号２９〜３１は、参考文献１において、配列番号８９、９０、および１０９として開示される
−配列番号３２〜３７は、参考文献１において、配列番号１０、１１、１２、７、８、および９として開示される
−配列番号３８〜５０は、参考文献１において、配列番号２８〜３７、３９、４１および
４３として開示される
−配列番号７５は、参考文献３において、配列番号１として開示される。

（参考文献（その内容は、参考として完全に本明細書中に援用される）

（配列表）

Claims

本明細書に記載されるような発明。