JP2009263282A

JP2009263282A - メラニン生成阻害剤

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Publication number: JP2009263282A
Application number: JP2008115835A
Authority: JP
Inventors: Susumu Maruyama; 進丸山; Yukinae Yamazaki; 幸苗山崎; Yasuhiro Kono; 泰広河野; Akiko Yamanaka; 晶子山中
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2008-04-25
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2009-11-12
Anticipated expiration: 2028-04-25
Also published as: JP5392742B2

Abstract

【課題】ヒトの皮膚の角質層を透過して、メラノサイトとまで達して美白作用を有し、かつ化学合成法による生産のみならず食用植物などからも抽出可能な安全、安価でかつ有効性の高い化合物を用いた新たなメラニン生成阻害剤、美白剤を提供する。
【解決手段】以下の式（１）で示されるN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンをメラニン生成阻害剤あるいは美白剤として使用する。
【化１】

〔式中ＲはHまたはCH₃を表わす〕
【選択図】なし

Description

本発明は、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを有効成分として含有することを特徴とするメラニン生成阻害剤又は美白剤に関する。

従来から市場にある美白化粧品の多くは、メラノサイト（表皮メラニン細胞ともいう）においてメラニンの生成に働くチロシナーゼ（またはポリフェノールオキシダーゼ）の活性を阻害するなどの働きを持つ。チロシナーゼ阻害活性のある物質としては、コウジ酸やアルブチンがよく知られている。チロシナーゼ阻害活性のある物質としては、ほかにフェルラ酸、カフェー酸、o-クマル酸、p-クマル酸、ケイ皮酸およびその誘導体、安息香酸などが古くから報告されている（非特許文献１、２、３）。この場合の試験に使用するチロシナーゼとしては、マッシュルーム由来のチロシナーゼがよく使われている。

このほかにも、トウモロコシふすまから分離されたN,N’-ジフェルロイルプトレシン、N-p-クマロイルN’-フェルロイルプトレシン、N,N’-ジクマロイルプトレシンのマッシュルームチロシナーゼ阻害活性、B16メラノーマ細胞でのメラニン生成阻害活性が報告されている（非特許文献４）。ベニバナ種子から分離されたN-フェルロイルセロトニン、N-(p-クマロイル)セロトニンのマッシュルームチロシナーゼ阻害活性、B16メラノーマ細胞でのメラニン生成阻害活性が報告されている（非特許文献５）。合成したN-カフェオイルチラミン、N-ジヒドロカフェオイルチラミン、N-ジヒドロ-p-ヒドロキシシンナモイルチラミンのヒトのメラノサイトのチロシナーゼ阻害活性が報告されている（非特許文献６）。さらには、ヒドロキシル基を有するN-ベンジルベンズアミド誘導体をいくつも合成し、それらがマッシュルームチロシナーゼ阻害活性を有することが報告されている（非特許文献７）。

また、フェルラ酸またはその配糖体を含有することを特徴とする皮膚外用剤の公開特許広報（特許文献１）があり、チロシナーゼの活性阻害のほか皮膚感作試験（パッチテスト）において刺激反応などのないことが確認されている。フェルラ酸イソステアリルを含有する化粧品組成物の公開特許広報（特許文献２）があり、紫外線対策用サンケア製品、美白用スキンケア製品が例示されている。フェルラ酸エステル（Rは炭素数１〜１２のアルキル基もしくはアミノ基で表されるフェルラ酸エステル）の公開特許広報（特許文献３）があり、チロシナーゼ阻害作用が確認されている。さらには、コーヒー果粒化粧組成物及び方法の公開特許広報（特許文献４）があり、調製物がコーヒー酸、コーヒーポリフェノール、必須単糖類、コーヒー粘液多糖類、及びトリゴネリンからなる群から選択される化合物であり、コーヒー酸のクラスがクロロゲン酸、フェルラ酸、及びカフェイン酸からなる群から選択され、紫外線保護効果、肌美白作用が言及されている。

皮膚は表皮、真皮、脂肪層（皮下組織）の3層からなり、表皮は皮膚の3層構造の最も外側にある。表皮を構成する主な細胞は、ケラチノサイト（表皮角化細胞）であり、分裂能力を持つ細胞は最下層の基底層に存在し、有棘層、顆粒層、角質層へと分化していく。表皮の外側の部分である角質層は、死んだ細胞の集まった平らな層で覆われている。この部分はケラチンという丈夫なタンパク質でできており、水をはじき、細菌やウイルス、その他の異物が体内に侵入するのを防いでいる。一方、基底層にはメラノサイトが点在する。紫外線があたるとこのメラノサイトからメラニン色素が生成される。
このように、角質層は異物が体内に侵入するのを防いでいることから、従来から美白作用を目的とした化合物の評価によく使われているチロシナーゼ阻害活性、あるいはメラノーマやメラノサイトなどの培養細胞系でメラニン生成阻害活性の確認された化合物が、実際にin vivoで、皮膚の角質層を透過し、メラノサイトまで達して美白作用を奏するとは限らない。

特開平6-256137号公報特開2005-15453号公報特開2005-350425号公報特表2007-532539号公報 Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993年，41巻，pp. 526-531 Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996年，44巻，pp. 1668-1675 Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002年，50巻，pp. 1400-1403 Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007年，55巻，pp. 3920-3925 Biological & Pharmaceutical Bulletin，2004年，27巻，pp. 1976-1978 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2006年，16巻，pp. 2252-2255 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2006年，16巻，pp. 2682-2684 Analytical Biochemistry, 2003年，318巻，pp. 260-269 Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology, 2002年，15巻，pp. 18-30 Journal of Chromatography B, 2007年，852巻，pp. 398-402 Abstract of the 1999 annual meeting of the society of investigative dermatology., J. Invest. Dermatol., 1999年, 112巻, p. 629

本発明の課題は、ヒトの皮膚の角質層を透過して、メラノサイトとまで達して美白作用を有し、かつ化学合成法による生産のみならず食用植物などからも抽出可能な安全、安価でかつ有効性の高い化合物を探索し、該化合物を用いた新たなメラニン生成阻害剤、美白剤を提供する点にある。

本発明者らはカフェー酸誘導体、フェルラ酸、プロトカテキュ酸誘導体などを多数化学合成し、そのなかからヒトの培養メラノサイトで5μM以下という低い濃度で有意にメラニン生成を阻害する化合物を12種選択した。さらに、選択した化合物の中から正常ヒト皮膚３次元モデルで美白作用のある化合物を選択することにより、有効性の高い美白剤を開発することを試みた。

正常ヒト皮膚３次元モデルはケラチノサイトとメラノサイトから構成された多層化かつ高度に分化した皮膚モデルで、ヒト皮膚に近い３次元構造を有しており、目視で黒化を観察でき、また、メラニンを抽出・定量することもできる（非特許文献8）。特に、この皮膚モデルではサンプルカップ内に被検試料を導入することで、角質層の上から浸透する被検試料の美白などの効果を判定することができる（非特許文献9）。

このような正常ヒト皮膚３次元モデルでの実験により、上記12種の合成化合物のなかから下記式（１）で示されるN-カフェオイルトリプタミン（下記式でRがH）およびN-フェルロイルトリプタミン（下記式でRがCH₃）のみが正常ヒト皮膚３次元モデルで、明瞭な美白作用を表すことを確認し、本発明を完成させた。

〔式中ＲはHまたはCH₃を表わす〕

本化合物については、チロシナーゼ阻害活性、メラノーマやメラノサイトなどの培養細胞系でのメラニン生成阻害活性はこれまで知られていない。正常ヒト皮膚３次元モデルでの美白作用も当然知られていない。本発明の化合物とは構造が異なるが、前述のようにN-カフェオイルチラミン、N-ジヒドロカフェオイルチラミン、N-ジヒドロ-p-ヒドロキシシンナモイルチラミンなどのヒトのメラノサイトのチロシナーゼ阻害活性が報告されている（非特許文献６）。しかし、いずれも正常ヒト皮膚３次元モデルでの美白作用は確認されておらず、本発明者らが独自に合成したN-カフェオイルチラミンは、ヒトの培養メラノサイトでメラニン生成阻害活性が確認できたが、正常ヒト皮膚３次元モデルでは200μMの濃度で美白作用を確認できなかった。

すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）上記式（１）で示されるN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを有効成分として含有することを特徴とする、メラニン生成阻害剤。
（２） N-カフェオイルトリプタミンを含む植物抽出物を含有することを特徴とする上記（１）に記載のメラニン生成阻害剤
（３）皮膚化粧料あるいは皮膚外用剤の形態で用いることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のメラニン生成阻害剤。
（４）上記式（１）で示されるN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを有効成分として含有することを特徴とする美白剤
（５） N-カフェオイルトリプタミンを含む植物抽出物を含有することを特徴とする上記（３）に記載の美白剤
（６）皮膚化粧料あるいは皮膚外用剤の形態で用いることを特徴とする、上記（４）又は（５）に記載の美白剤。

本発明のN-カフェオイルトリプタミンおよびN-フェルロイルトリプタミンはB16マウスメラノーマ細胞、ヒトの培養メラノサイト、およびヒト皮膚３次元モデルでメラニン生成阻害作用を示す。このうちN-カフェオイルトリプタミンは有機化学的な合成方法により製造できるほか、コーヒー（Coffea canephora）などから抽出、精製することにより製造することができる。したがって、本発明によれば、食用植物にも存在する安全かつ活性が高く有用なメラニン生成阻害剤、美白剤が提供できる。

以下、上記発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜実施し得る。

本発明は、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを含有するメラニン生成阻害剤及び美白剤に関する。
本発明のメラニン生成阻害剤及び美白剤の構成成分のうち、N-カフェオイルトリプタミンは植物中に含まれており、本発明のメラニン生成阻害剤及び美白剤はN-カフェオイルトリプタミンを含む植物抽出物を含有するものであっても良い。これらは皮膚化粧料、医薬、及び機能性食品において特に有用なものとして用いられ得る。

N-カフェオイルトリプタミンはSafflomideとも呼ばれ、植物に見出されるフェニルプロパノイドアミドの一種である。N-カフェオイルトリプタミンあるいはそのアナログはコーヒー（Coffea canephora）、カカオ（Theobroma cacao）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）などに見出され、抗炎症、抗アテローマ性動脈硬化症作用などが知られている。一方、N-カフェオイルトリプタミンの簡便な化学合成法も開発されており、これらによってもN-カフェオイルトリプタミンを得ることができる。

すなわち、カフェー酸（コーヒー酸とも言う）をジクロロメタンに溶解し、1,3-ジイソプロピルカルボジイミドで対称無水物とし、トリプタミンを加えることにより合成することができる（非特許文献10）。

また、N-カフェオイルトリプタミンは、カフェー酸の水酸基をアセチル基などのアシル基で保護してから塩化チオニル等で酸塩化物とし、これをトリプタミンにカップリングさせた後、保護基をヒドラジン処理等で除去することによっても合成さできる。
N-フェルロイルトリプタミンについても同様に、フェルラ酸の水酸基をアセチル基などのアシル基で保護してから塩化チオニル等で酸塩化物とし、これをトリプタミンにカップリングさせた後、保護基をヒドラジン処理等で除去することによって合成できる。

一方、N-カフェオイルトリプタミンはまたコーヒー（Coffea canephora）などN-カフェオイルトリプタミンを含有する植物を原料に、例えば焙煎前のコーヒー豆を2-プロパノール等の溶媒で抽出し、逆相C18カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーなどの常套的手段により精製することでも製造することができる。

なお、上記溶媒抽出物は、特にクロマトグラフィー等により精製しなくとも、メラニン生成阻害剤あるいは美白剤として用いることができる。

本発明で用いるN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンは、ヒトの皮膚の角質層を透過してメラノサイトまで到達し、メラノサイトにおけるメラニン生成を阻害する効果を奏する。したがって、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンは、メラノサイトに有効に作用し、メラノサイトにおけるメラニンの生成阻害により、メラニン生成に起因して生ずる被検体の改善すべき状態、症状または疾患を改善、予防または治療することができる。このような状態、症状または疾患としては、例えば、皮膚の黒色化、シミ、ソバカス等が挙げられる。

また、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンは、メラニン生成阻害剤あるいは美白剤として、化粧料、医薬又は機能性食品等の製品形態で用いることができる。

上記したように、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンは、角質層を透過するから、これら化合物を有効成分とする本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤は、直接皮膚に塗布する形態で用いる場合に特にその有効性を発揮する。このような形態としては、例えば皮膚化粧料の形態を挙げることができる。

本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤は、例えば、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状にして、化粧水、乳液、クリーム、パック、あるいは軟膏等とし、皮膚化粧料の形態で皮膚に適用することができる。

また、本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤を、皮膚化粧料として使用する場合には、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ＰＨ調整剤等を加えることができる。
皮膚化粧料（全重量）中のN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンの含有量は、0.002重量％〜0.2重量％が好ましく、より好ましくは0.03重量％〜0.07重量％である。

また、本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤を、皮膚化粧料として皮膚に直接塗布して使用する場合、その投与量については特に制限はないが、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを0.03重量％〜0.07重量％含有する皮膚化粧料100mgを1日あたり１〜4回塗布する。

また、本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤を医薬として使用する場合は、本公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、上記したように、本発明で使用する薬剤成分の角質層の透過性からみて、軟膏剤、貼付剤等の皮膚外用剤の形態が基もその有効性を発揮する。しかし、こればかりでなく、坐剤、吸入剤等の経粘膜吸収剤として、あるいは注射剤、点滴剤等の非経口剤として、さらに、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤の形態でも用いることができる。皮膚外用剤は、例えば外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ＰＨ調整剤等を加えることができ、また、必要に応じて経皮吸収促進剤も用いることができる。また、経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。

このような医薬製剤（全重量）中のN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンの含有量は、製剤中の添加成分の種類、投与経路、剤形等の諸条件によって異なるが、例えば、医薬製剤（全重量）中に0.03重量％〜1重量％である。

また、本発明のメラニン生成阻害剤あるいは美白剤を医薬の形態で使用する場合、その投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚の黒色化、シミ、ソバカス等の程度、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。例えば、皮膚外用剤として経皮吸収投与する場合には、N-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを0.03重量％〜1重量％含有する皮膚外用剤100mgを1日あたり１〜4回塗布する。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
合成例１
（N-カフェオイルトリプタミンの化学合成）
１ｇのカフェー酸（シグマ社製）を２mlのピリジンと２mlの無水酢酸の混合物に溶かし室温に2日放置した。減圧で濃縮した残渣を３mlのトルエンと混和・氷冷して1.07ｇのジアセチル体を白色結晶として得た。収率73％、融点198-199℃。このジアセチル体の１ｇを２mlのベンゼンと混合し、２mlの塩化チオニルと沸騰石を加えおだやかに2時間還流加熱した。冷却後、溶媒と残存する塩化チオニルを減圧で除去し、残った油状物に３mlのトルエンを加えて再度減圧濃縮した。このようにして油状物として得られた酸塩化物（3-(3,4-ジアセトキシフェニル)-2-トランス-プロペノイルクロライド）の全量を５mlのトルエンに溶かし、その5分の１量を50mgのトリプタミン（シグマ社製）と0.5mlのピリジンを含む2mlのクロロホルム溶液に氷冷、撹拌下添加した。この反応液を室温で2時間撹拌後、３mlの水と20mlの酢酸エチルと混合し、分液漏斗に移した。上層を５mlの１０％クエン酸水溶液、５mlの10％重炭酸ナトリウム水溶液、及び１０mlの飽和食塩水で順次洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧で除いた残渣を分取の薄層クロマトグラフィー（シリカゲルF₂₅₄、厚さ1mm、20ｘ20 cm、50％酢酸エチル/ベンゼンで展開）にかけ、UV吸収のあるゾーンを掻き取り、主生成物（3-(3,4-ジアセトキシフェニル)-N-[2-(3-インドリル)エチル]-2-プロペナミド）を酢酸エチルで溶出させた。この溶液を濃縮した残渣を６mlのエタノールに溶かし、0.2mlのヒドラジン１水和物を加え室温に1時間放置した。次いで０．２mlの酢酸を加えてから、減圧で濃縮し、残渣を２mlの水と６mlの酢酸エチルと混合し、分液漏斗に移し、上層を先に述べたところと同様にクエン酸、重炭酸ナトリウム、及び食塩の水溶液で順次洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。この溶液を減圧濃縮した残渣をアセトン/酢酸エチル/ベンゼンの混合液から結晶化させ、目的物であるN-カフェオイルトリプタミンの微細針状晶を26 mg得た。収率11％（ジアセチルカフェー酸の200 mgからの収率として計算）。融点186−187℃。元素分析と¹H-NMRの測定は次の結果を与え、これから目的のN-カフェオイルトリプタミンであることを確認した。元素分析値: C, 70.83; H, 5.63; N, 8.17, C₁₉H₁₈N₂O₃に対する計算値: C, 70.79, H, 5.63, N, 8.69 %, ¹H-NMR (アセトン-d₆) δ: 2.991 (2H, t, J = 7 Hz, CH₂), 3.623 (2H, dt, J = 7 and 6 Hz, CH₂), 6.435 (1H, d, J = 15 Hz, CH=CH), 6.825 (1H, d, J = 8 Hz, H-5), 6.929 (1H, dd, J = 8 and 2 Hz, H-6), 7.007 (1H, ddd, J = 8, 8, 1 Hz, H-6”), 7.058 (1H, d, J = 2 Hz, H-2), 7.094 (1H, ddd, J = 8, 8, 1 Hz, H-5”), 7.180 (2H, br.s, NH and H-2”), 7.374 (1H, d, J = 8 Hz, H-4”), 7.416 (1H, d, J = 15 Hz, CH=CH), 7.628 (1H, d, J = 8 Hz, H-7”), 8.184 (2H, br.s, OH x 2), 及び9.999 (1H, br.s, H-1”)。

合成例２
（N-フェルロイルトリプタミンの化学合成）
11ｇのO-アセチルフェルラ酸クロライド（築野食品工業株式会社製）を150 mlのトルエンに溶かした。この溶液を11 gのトリプタミンと20 mlのピリジンを含む100 mlのクロロホルムに氷冷下撹拌しながら滴加した。一晩室温で撹拌後、500mlの酢酸エチルと混合し、分液漏斗中で水（200 ml）、10％クエン酸水溶液（100 ml ｘ 3)、水(100 ml)、10％重炭酸ナトリウム水溶液（100 ml x ２）、及び飽和食塩水（100 ml x ２）で順次洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、残渣をクロロホルムとアセトンの混液に溶かし、ヘキサンを加えて冷却し白色沈殿（11.7 g）を得た。これを250 mlのエタノールに溶かし、4 mlの水和ヒドラジンを加え室温に1時間放置した。次いで、4.3 mlの酢酸を加えてからエバポレータで濃縮し、残渣に飽和食塩水100 mlと酢酸エチル400 mlを加え、分液漏斗中で振り混ぜた。有機層を100 mlの飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した残渣をクロロホルム/アセトンの混液から結晶化させ、9.7 gのN-フェルロイルトリプタミンを白色粉末として得た。収率６７％、融点169 − 171 ℃（エタノールから再結晶すると融点171 − 172 ℃の微細針状晶となる。）¹H-NMR (acetone-d₆) δ：3.001 (2H, t, J = 7 Hz, CH₂), 3.627 (2H, m, CH₂), 3.871 (3H, s, OMe), 6.512 (1H, d, J = 16 Hz, CH=CH), 6.832 (1H, d, J = 8 Hz, H-5), 7.008 (1H, ddd, J = 7, 7, 1 Hz, H-5''), 7.043 (1H, dd, J = 8, 2 Hz, H-6), 7.095 (1H, ddd,J = 7, 7, 1 Hz, H-6''), 7.157 (1H, d, J = 2 Hz, H-2), 7.182 (1H, s, H-2''), 7.252 (1H, br.s., CONH), 7.378 (1H, dd, J = 7,1 Hz, H-7''), 7.468 (1H, d, J = 16 Hz, CH=CH), 7.627 (1H, dd, J = 7,1 Hz, H-4''), 10.015 (1H, br.s., NH)。この分析結果から、得られた化合物の構造がN-フェルロイルトリプタミンであることを確認した。

実施例1
（N-カフェオイルトリプタミンの培養B16-F1マウスメラノーマ細胞におけるメラニン生成阻害）
B16-F1マウスメラノーマ細胞（大日本住友製薬株式会社より購入）を15％ウシ胎児血清を含むDMEM培地（ダルベッコ変法イーグル培地）に7.5 x 10⁴ cells/mlになるように分散させ、24穴（１穴2cm²）のプレートの各穴に1 mlずつ分注した。5％ CO₂存在下、37℃で培養を開始し、１日後に培地の交換を行い、試験試料溶液6.6μlを添加し、さらに２日間培養を行った。なお、試験試料溶液は0.38から3.03 mMのN-カフェオイルトリプタミンのエタノール溶液、15から45 mMのアルブチンのエタノール溶液、対照としてエタノールを用いた。その後、培地中のメラニン量を測定する目的で、培養上清200μlを回収して、96穴のプレートに入れ、直ちにマイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。次に、各穴の残りの培養上清を吸引除去し、PBS(-)溶液1 mlで各穴を洗浄した。PBS(-)溶液をよく除去した後、細胞内のメラニン量を測定する目的で、1 N水酸化ナトリウム水溶液200μlを各穴に添加し、18時間静置した。このプレートを10分間ほど軽く浸透した後、各穴の水酸化ナトリウム水溶液180μlを96穴のプレートの各穴に移し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。
細胞内メラニン量、培地中メラニン量の変化について、それぞれの対照区のメラニン量を100％とした数値の比較を表１に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。

次に、試験試料の細胞毒性を検査する目的で、B16-F1マウスメラノーマ細胞を上記と同じ方法で被検試料を加えて培養し、細胞増殖に対する影響をロッシュ社のMTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイキットにより測定するMTT試験を行った。マイクロプレートリーダーで測定した570nmの吸光度について、対照区の吸光度を100％とした値を同じ表１に示す。
N-カフェオイルトリプタミンはアルブチンと比較して強力なメラニン生成阻害活性を示した。また、実験に使用した濃度範囲のN-カフェオイルトリプタミンに細胞毒性は認められなかった。

実施例2
（N-フェルロイルトリプタミンの培養B16-F1マウスメラノーマ細胞におけるメラニン生成阻害）
試験例３と同様にB16-F1マウスメラノーマ細胞を15％ウシ胎児血清を含むDMEM培地に7.5 x 10⁴ cells/mlになるように分散させ、24穴プレートの各穴に1 mlずつ分注した。5％ CO₂存在下、37℃で培養を開始し、１日後に培地の交換を行い、試験試料溶液6.6μlを添加し、さらに２日間培養を行った。なお、試験試料溶液は3.75から30 mMのN-フェルロイルトリプタミンのエタノール溶液、対照としてエタノールを用いた。その後、試験例３と同様の方法で培地中および細胞内のメラニン量を測定した。
細胞内メラニン量、培地中メラニン量の変化について、それぞれの対照区のメラニン量を100％とした数値の比較を表２に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。また、試験例３と同じ方法でMTT試験を行い、マイクロプレートリーダーで測定した570nmの吸光度について、対照区の吸光度を100％とした値を同じ表２に示す。
N-フェルロイルトリプタミンのメラニン生成阻害活性はN-カフェオイルトリプタミンのそれと比較すると弱いが、培地中のメラニンは25μMの濃度でも有意差が認められた。また、N-フェルロイルトリプタミンは200μMの濃度では細胞毒性が認められた。

実施例3
（N-カフェオイルトリプタミンの培養正常ヒト表皮メラニン細胞（メラノサイト）におけるメラニン生成阻害）
正常ヒト新生児包皮表皮メラニン細胞（Darkly）（凍結状態でクラボウ株式会社より購入）をMedium254 + HMGS-2培地（0.2 %v/vウシ脳下垂体抽出液、0.5 %v/vウシ胎児血清、3 ng/ml hFGF-B、5 x 10^-7 Mハイドロコーチゾン、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、3μg/mlヘパリン、10 nMエンドセリン-1を含む、クラボウ株式会社より購入）にて、75 cm²フラスコ中で、5％ CO₂存在下、37℃で、1日置きに培地を交換しつつ８日間培養を行った。定法によりトリプシン/EDTA溶液で細胞を剥がし、Medium254 + HMGS-2培地に7.5 x 10⁴ cells/mlになるように分散させ、24穴プレートの各穴に1 mlずつ分注した。これに試験試料溶液6.6μlを添加した。なお、試験試料溶液は0.19から1.52 mMのN-カフェオイルトリプタミンのエタノール溶液、15から45 mMのアルブチンのエタノール溶液、対照としてエタノールを用いた。5％ CO₂存在下、37℃で培養を開始し、3日後に培地と試験試料溶液の交換を行い、その後は１日置きに培地と試験試料溶液の交換を行いつつ、９日間培養を行った。その後、各穴の培養上清を吸引除去し、PBS(-)溶液1 mlで各穴を洗浄した。PBS(-)溶液をよく除去した後、細胞内のメラニン量を測定する目的で、1 N水酸化ナトリウム水溶液200μlを各穴に添加し、18時間静置した。このプレートを10分間ほど軽く浸透した後、各穴の水酸化ナトリウム水溶液180μlを96穴のプレートの各穴に移し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。

対照区のメラニン量を100％とした数値の比較を表３に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。
次に、試験試料の細胞毒性を検査する目的で、正常ヒト新生児包皮表皮メラニン細胞を上記と同じ方法で試験試料溶液を加えて培養し、細胞増殖に対する影響をMTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイキットにより測定するMTT試験を行った。マイクロプレートリーダーで測定した570nmの吸光度について、対照区の吸光度を100％とした値を同じ表３に示す。
N-カフェオイルトリプタミンは10μMの濃度で明らかに細胞毒性が認められたが、細胞毒性の無い濃度範囲でも強力なメラニン生成阻害活性を示した。

実施例4
（N-フェルロイルトリプタミンの培養正常ヒト表皮メラニン細胞（メラノサイト）におけるメラニン生成阻害）
試験例５と同様に正常ヒト新生児包皮表皮メラニン細胞（Darkly）（凍結状態でクラボウ株式会社より購入）をMedium254 + HMGS-2培地にて、75 cm²フラスコ中で、5％ CO₂存在下、37℃で、1日置きに培地を交換しつつ８日間培養を行った。定法によりトリプシン/EDTA溶液で細胞を剥がし、Medium254 + HMGS-2培地に7.5 x 10⁴ cells/mlになるように分散させ、24穴プレートの各穴に1 mlずつ分注した。これに試験試料溶液6.6μlを添加した。なお、試験試料溶液は0.19から1.52 mMのN-フェルロイルトリプタミンのエタノール溶液、対照としてエタノールを用いた。5％ CO₂存在下、37℃で培養を開始し、3日後に培地と試験試料溶液の交換を行い、その後は１日置きに培地と試験試料溶液の交換を行いつつ、９日間培養を行った。その後、試験例５と同じ方法で細胞内のメラニン量を測定した。対照区のメラニン量を100％とした数値の比較を表４に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。
また、試験例５と同じ方法でMTT試験を行い、マイクロプレートリーダーで測定した570nmの吸光度について、対照区の吸光度を100％とした値を同じ表４に示す。
N-フェルロイルトリプタミンは10μMの濃度で僅かに細胞毒性が認められたが、細胞毒性の無い1.25μMでもメラニン生成阻害活性を示した。

実施例5
（N-カフェオイルトリプタミンの正常ヒト皮膚3次元モデルでの美白作用）
クラボウ株式会社から購入した正常ヒト皮膚３次元モデル（MEL-300-Bキット、Black donor）を用いて試験を行った。
６穴プレートの各穴に長期維持培地EPI-100LLMM（bFGF及びα-MSH含、クラボウ株式会社から購入）を0.9 mlずつ添加。この６穴プレートへ皮膚モデルカップをピンセットで移し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO₂存在下の加湿状態で、37℃で１時間培養した。次に、別の６穴プレートの各穴の中央にステンレスワッシャーを２枚重ねて置き、これに長期維持培地EPI-100LLMMを5 mlずつ入れた。このワッシャー上に、皮膚モデルカップをピンセットで移し、モデルカップ内に試験試料溶液（50から200μMのN-カフェオイルトリプタミンを0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水に溶解したもの、10 mg/mlのアルブチンを0.66%のエチルアルコールを含む水溶液に溶解したもの、対照として0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水）100μlを添加し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO₂存在下の加湿状態で、37℃で9日間培養した。培養期間中、試験試料溶液、培地は2日ごとに交換した。培養9日目に皮膚モデルカップをピンセットで24穴のプレートに移し、各カップをDulbecco-PBS溶液で３回洗浄し、洗浄液を除去した後に24穴プレートに並べたカップの写真撮影を行った。それを図1に示す。

次に、皮膚モデルカップのメラニンを非特許文献11の方法に従い、以下のとおり抽出、定量した。皮膚モデルカップを24穴のプレートに移し、各皮膚モデルカップ内に1% SDS、0.05 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 6.8)を0.45 ml添加し、これに5 mg/mlのプロテアーゼKを20μl添加し、密閉して室温で3時間反応させた。カップ中の溶液と細胞を全て1.5 mlのチューブに回収し、45℃で一晩反応させた。これに、再度5 mg/mlのプロテアーゼKを20μl添加し、45℃で4時間反応させた。次に、500 mM炭酸ナトリウムを50μl添加し、次いで30％過酸化水素水を10μl添加、80℃で30分間反応させた後、冷却した。次に、クロロホルム：メタノール（2:1）を100μl添加、10000 x gで10分間遠心した。上清100μlを回収し、96穴のプレートに移し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。対照区（0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水）のメラニン量を100％とした数値の比較を表５に示す。結果はn=3の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。
図１の写真とメラニンの抽出・定量の比較によりN-カフェオイルトリプタミンにアルブチンの100倍以上の明瞭な美白作用が認められた。

次に、試験試料溶液の細胞毒性を検査する目的で、上記と同じ方法で別途、皮膚モデルカップに被検試料を加えて9日間培養した。24穴プレートの各穴に300μlのMTT溶液（MTT-100キット、クラボウ株式会社から購入）を入れ、これにDulbecco-PBS溶液で3回洗浄した皮膚モデルカップをピンセットで移し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO₂存在下の加湿状態で、37℃で3時間静置した。次に、皮膚モデルカップをPBS溶液で軽く洗浄したのち、別の24穴プレートに移した。この各穴に、2mlのMTT抽出液（MTT-100キット、クラボウ株式会社から購入）を入れ、振とうしながら室温で4時間抽出した。この抽出液を96穴プレートの各穴にそれぞれ200μlずつ入れ、マイクロプレートリーダーで570nmの吸光度を測定した。対照区の570nmの吸光度を100％としたときの、200μMの濃度のN-カフェオイルトリプタミン添加区の吸光度は106±4％であり、細胞毒性は認められなかった。

実施例6
（N-フェルロイルトリプタミンの正常ヒト皮膚3次元モデルでの美白作用）
試験例７と同様にクラボウ株式会社から購入した正常ヒト皮膚３次元モデル（MEL-300-Bキット、Black donor）を用いて試験を行った。
６穴プレートの各穴に長期維持培地EPI-100LLMM（bFGF及びα-MSH含、クラボウ株式会社から購入）を0.9 mlずつ添加。この６穴プレートへ皮膚モデルカップをピンセットで移し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO₂存在下の加湿状態で、37℃で１時間培養した。次に、別の６穴プレートの各穴の中央にステンレスワッシャーを２枚重ねて置き、これに長期維持培地EPI-100LLMMを5 mlずつ入れた。このワッシャー上に、皮膚モデルカップをピンセットで移し、モデルカップ内に試験試料溶液（50から200μMのN-フェルロイルトリプタミンを0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水に溶解したもの、10 mg/mlのアルブチンを0.66%のエチルアルコールを含む水溶液に溶解したもの、対照として0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水）100μlを添加し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO₂存在下の加湿状態で、37℃で9日間培養した。培養期間中、試験試料溶液、培地は2日ごとに交換した。培養9日目に皮膚モデルカップをピンセットで24穴のプレートに移し、各カップをDulbecco-PBS溶液で３回洗浄し、洗浄液を除去した後に24穴プレートに並べたカップの写真撮影を行った。それを図２に示す。

次に、皮膚モデルカップのメラニンを試験例７と同様に非特許文献11の方法に従い、抽出、定量した。対照区（0.66%のエチルアルコールを含む蒸留水）のメラニン量を100％とした数値の比較を表６に示す。結果はn=3の平均値（平均値±標準偏差）で示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。
図２の写真とメラニンの抽出・定量の比較によりN-フェルロイルトリプタミンに明瞭な美白作用が認められた。

次に、試験試料溶液の細胞毒性を検査する目的で、ヒト皮膚３次元モデルを上記と同じ方法で皮膚モデルカップに被検試料を加えて培養した。24穴プレートの各穴に300μlのMTT溶液（MTT-100キット、クラボウ株式会社から購入）を入れ、以下試験例７の方法で細胞毒性を検査した。対照区の570nmの吸光度を100％としたときの、200μMの濃度のN-フェルロイルトリプタミン添加区の吸光度は100±1％であり、細胞毒性は認められなかった。

N-カフェオイルトリプタミンのヒト皮膚3次元モデルでの美白作用を示す図である。皮膚モデルカップを並べて写真撮影したものである。 N-フェルロイルトリプタミンのヒト皮膚3次元モデルでの美白作用を示す図である。皮膚モデルカップを並べて写真撮影したものである。

Claims

下記式（１）で示されるN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを有効成分として含有することを特徴とする、メラニン生成阻害剤。
〔式中ＲはHまたはCH₃を表わす〕
N-カフェオイルトリプタミンを含む植物抽出物を含有することを特徴とする請求項1に記載のメラニン生成阻害剤。
皮膚化粧料あるいは皮膚外用剤の形態で用いることを特徴とする、請求項1又は2に記載のメラニン生成阻害剤。
請求項1に記載のN-カフェオイルトリプタミンおよび/またはN-フェルロイルトリプタミンを有効成分として含有することを特徴とする美白剤。
N-カフェオイルトリプタミンを含む植物抽出物を含有することを特徴とする請求項３に記載の美白剤。
皮膚化粧料あるいは皮膚外用剤の形態で用いることを特徴とする、請求項４又は５に記載の美白剤。