JP2009225714A - ハイブリダイゼーション器具、ハイブリダイゼーション装置、およびハイブリダイゼーション促進方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 プローブ核酸を固定した支持体を挟持した状態でチューブに嵌着可能であって、略円柱形状の基体11と、この基体の一端部に設けられたメンブレン3を挟持する挟持部12と、基体11を長手方向に貫通してチューブ内圧を調整する貫通孔13とを有することを特徴とするハイブリダイゼーション器具1。
【選択図】 図4
Description
(i)プローブ核酸を固定したメンブレン3を挟持したハイブリダイゼーション器具1を、ターゲット核酸を含有する溶液を収容したマイクロチューブ4に嵌着する嵌着ステップS1。
(ii)ハイブリダイゼーション器具1を嵌着したマイクロチューブ4を起立させた状態でアルミブロック恒温槽5を用いて加温する加温ステップS2。
(iii)加温によりマイクロチューブ4に収容された溶液を熱対流させる熱対流励起ステップS3。
以上(i)〜(iii)のステップを有している。
ボトル式容器とともにハイブリダイゼーションオーブンを用いた場合との検出度合いの比較を行った。キュウリモザイクウイルス(CMV)、ユリモットルウイルス(LMoV)、ユリ潜在ウイルス(LSV)の各プラスミドクローンを鋳型として増幅して得たPCR産物をDNAプローブ(プローブ核酸)として、各々25ng/μL濃度に調製した。当該調製したcDNAプローブはHYDRA-HTS(Robbins)により、ナイロンメンブレン(Biodine plus;Pall)3に0.2μLずつ、各ウイルスにつき2スポットずつ分注した。スポット17のレイアウトは、上段からCMV、LMoV、LSVの順であった。cDNAプローブをメンブレン3に固定するため、cDNAをスポットした後のメンブレン3は濾紙に挟んだ状態で、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて120℃の条件下で30分間処理した後、UVcross-linker(UVP)にて120mJ/cm2のUV照射を行った。ボトル式容器にハイブリダイゼーションバッファー(Perfect Hyb;東洋紡績)5ml、マイクロチューブ4に1.8mL入れ、メンブレン3をセットした後、各々ハイブリダイゼーションオーブンとアルミブロック恒温槽5を用いて、69℃の条件下で1時間インキュベートすることでプレハイブリダイゼーションを行った。In vitro transcription法を利用して市販のユリから抽出したtotal RNAのうち、ウイルスRNAのみを増幅して得られたビオチン標識cRNAを、ターゲット核酸としてハイブリダイゼーションバッファーに加え、69℃で14時間ハイブリダイゼーションを行った。2×SSC、0.1%SDS洗浄液で69℃10分間の洗浄を3回行い、さらに、0.1×SSC、0.1%SDS洗浄液で69℃5分間の洗浄を3回行った後、Phototope-Star detection kit(New England Biolabs)と、基質としてNBT/BCIP(Roche)とを用いて、化学発色により検出した。
バッグ式容器とともにハイブリダイゼーションオーブンを用いた場合との検出度合いの比較を行った。4×4個のスポットからなるスポット群が縦方向に2段と、4×2個のスポットからなるスポット群が縦方向に1段との計3群で形成されたメンブレン3(Biodyne Plus;PALL)に、λファージDNA(タカラバイオ)をcDNAプローブ(プローブ核酸)として25ng/μLの濃度に調製し、常法にてメンブレン3に固定したものと、3×1個のスポットからなるスポット群が縦方向に2段(計2群)形成されたメンブレン3(Biodyne Plus;PALL)に、キュウリモザイクウイルス(CMV)、ユリモットルウイルス(LMoV)、ユリ潜在ウイルス(LSV)の各プラスミドクローンを鋳型として増幅して得たPCR産物をDNAプローブ(プローブ核酸)として、各々25ng/μL濃度に調製し、常法にてメンブレン3に固定したものとを用意した。
熱対流の作用効果を確認するため、アルミブロック恒温槽5を真横にして用いた場合との検出度合いの比較を行った。図10に示すように、アルミブロック恒温槽5を真横にしてインキュベートしたことを除いては、実施例2の本実施形態のλファージDNAを用いた場合と同様の手法で行った。なお、アルミブロック恒温槽5を真横にしてインキュベートした場合、貫通孔13から溶液が流出してしまうため、前記貫通孔13に細いチューブを差し込んで対処した。
1.ターゲット核酸を含有する少量の溶液が少量でハイブリダイゼーションさせることができる。
2.振盪をすることなく加温のみでターゲット核酸とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせることができる。
3.溶液の交換が簡便であってその漏れやこぼれを防止することができる。
4.溶液の温度を維持することができ、かつ操作が簡単で安価に提供することができる。
2 ハイブリダイゼーション装置
3 メンブレン
4 マイクロチューブ
5 アルミブロック恒温槽
11 基体
12 挟持部
13 貫通孔
14 内圧調整部
15 過膨張抑制部
16 切れ込み
17 スポット
Claims (9)
- プローブ核酸を固定した支持体を挟持した状態でチューブに嵌着可能なハイブリダイゼーション器具であって、
略円柱形状の基体と、この基体の一端部に設けられた前記支持体を挟持する挟持部と、前記基体を長手方向に貫通してチューブ内圧を調整する貫通孔とを有することを特徴とするハイブリダイゼーション器具。 - 請求項1において、前記貫通孔が、チューブ内圧を調整する内圧調整部と、これよりも大容量を有し、かつターゲット核酸を含有する溶液の加温による過膨張を抑制する過膨張抑制部とを有することを特徴とするハイブリダイゼーション器具。
- 請求項2において、前記貫通孔は、長手方向に縦断面形状が略凸字状に、または長手方向に略円錐形状に形成されていることを特徴とするハイブリダイゼーション器具。
- 請求項1から請求項3のいずれかにおいて、前記挟持部が、前記基体を長手方向へ横断面略V字状、横断面略I字状、または横断面略U字状の切れ込みとして形成されていることを特徴とするハイブリダイゼーション器具。
- 支持体に固定されたプローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーションさせることを目的とするハイブリダイゼーション装置であって、
前記ターゲット核酸を含有する溶液を収容するチューブと、
前記プローブ核酸を固定した支持体を挟持した状態で前記チューブに嵌着可能な基体を備え、かつこの基体の一端部に前記支持体を挟持する挟持部を有するとともに、前記基体を長手方向に貫通してチューブ内圧を調整する貫通孔を有する略円柱形状の支持体挟持部材と、
前記チューブ内の溶液を加温する加温部とを有しており、
前記支持体挟持部材を嵌着した前記チューブを起立させた状態で加温して前記チューブ内の溶液を熱対流させることを特徴とするハイブリダイゼーション装置。 - 請求項5において、前記貫通孔が、チューブ内圧を調整する内圧調整部と、これよりも大容量を有し、かつ前記ターゲット核酸を含有する溶液の加温による過膨張を抑制する過膨張抑制部とを有することを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
- 請求項6において、前記貫通孔は、長手方向に縦断面形状が略凸字状に、または長手方向に略円錐形状に形成されていることを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
- 請求項5から請求項7のいずれかにおいて、前記支持体狭持部材の挟持部が、前記基体を長手方向へ横断面略V字状、横断面略I字状、または横断面略U字状の切れ込みとして形成されていることを有することを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
- プローブ核酸を固定した支持体を挟持した支持体挟持部材を、ターゲット核酸を含有する溶液を収容したチューブに嵌着して加温することにより前記プローブ核酸と前記ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションを促進させる方法であって、
前記支持体挟持部材を嵌着した前記チューブを起立させた状態で加温して前記チューブ内の溶液を熱対流させることを特徴とするハイブリダイゼーション促進方法。
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