JP2009186490A - 真骨魚類を使用する、活性についての薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents

真骨魚類を使用する、活性についての薬剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Abstract

【課題】動物全体における毒性活性、ならびに１以上の指定された標的組織および器官における毒性活性について、インビボおよびインビトロでの細胞において、かつ経時的に、化合物をスクリーニングする費用効果的、包括的方法を提供すること。
【解決手段】新脈管形成活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、当該方法は、真骨魚類（ｔｅｌｅｏｓｔ）に対して当該薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性を示す当該真骨魚類における応答を検出する工程を包含する、方法。
【選択図】なし

Description

本特許出願は、１９９８年２月２３日に出願の、米国特許仮出願番号６０／０
７５，７８３号、および１９９８年９月１８日に出願の、米国特許仮出願番号６
０／１００，９５０号に対する優先権を主張する。これらの出願の各々は、全て
の目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
（関連出願への相互参照）
１９９８年１２月１日出願の、同一人の同時係属米国特許出願番号６０／１１
０，４６４は、関連する主題に指向され、そして全ての目的のためにその全体が
参考として本明細書中に援用される。
（連邦政府委託研究および開発下で成された発明に対する権利に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金により援助された（助成金番号１Ｒ４３ＣＡ７９
３８−０１）。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
（発明の背景）
現在、新脈管形成活性を増強または阻害する能力、細胞死活性を増強または阻
害する能力、および／または低い毒性を示す能力を有する、標的特異的な治療的
化合物および予防的化合物の探索は、薬物の発見および開発の３つの主要な焦点
を含む。新脈管形成は、胚の血管系のさらなる発達にのみならず、多くの出生後
のプロセス（例えば、創傷治癒ならびに組織および器官の再生）においても重要
な役割を果たす。新脈管形成はまた、固形腫瘍増殖に関する重要なプロセスとし
て同定されている。さらに、制御されない血液細胞増殖および過剰な新脈管形成
は、多くの疾患（慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、網膜症
、乾癬、および水晶体後線維増殖症を含む）において、有意な病原性成分を構成
することが示されている。
新脈管形成活性を阻害または増殖する能力についての薬剤をスクリーニングする方法は、新脈管形成プロセスに関わる種々の疾患の治療的処置または予防的処置において有効であるこれらの薬剤を同定する際に有用である。例えば、新脈管形成の阻害は、癌の寛解（非特許文献１；非特許文献２）および組織虚血（例えば、糖尿病性網膜症）に関連する血管損失の回復（非特許文献３；非特許文献４）のための強力な潜在的アプローチである。抗新脈管形成治療は、後天性の薬物耐性（現在の癌治療に伴う主要な問題）を誘導しない（非特許文献５）ことが明らかである。しかし、治療的候補分子はほとんど存在しない。従って、新脈管形成を阻害し、そして癌および糖尿病のような、新脈管形成阻害から助けられる疾患に対する治療的活性を有する化合物を同定する方法を提供することが望ましい。同様に、血管形成を刺激することにより新脈管形成を増強する化合物についてスクリーニングする方法は、種々の疾患（例えば、冠状動脈疾患、うっ血性心不全、末梢動脈疾患、および末梢静脈疾患）において、循環性機能を改善するための最小の侵襲性アプローチにおける使用に有利である。不幸にも、新脈管形成についての多くの現在のアッセイは、動物モデル全体、あるいは動物モデルの複数の組織または器官において同時にかつ経時的に、化合物またはその副作用のインビボでの評価を可能にしない。さらに、新脈管形成活性についての現在の多くのアッセイは、それらの複雑性のために、迅速な、自動化された、または広範な化合物のスクリーニング（特に、多くの化合物を含む化合物ライブラリーのスクリーニング）に適切ではない。
細胞死を調節促進または阻害し得る化合物の探索もまた、極めて重要である。
壊死およびアポトーシスは、細胞死の２つの公知の型である。壊死は、組織細胞
に対する非生理学的損傷に起因する、被験体における生組織の病理学的な死を含
む。アポトーシス（プログラムされた細胞死を含む）は、多細胞生物のほとんど
の自己再生組織における細胞増殖と細胞分化との間で、平衡状態が維持されるこ
とを確証する生理学的プロセスである。細胞死活性の調節（特に、アポトーシス
）は、多くに疾患（例えば、癌および器官移植を含む）に対する治療的および予
防的アプローチにおける重要な機構を構成する。アポトーシス活性を評価するた
めの現存するモデルとしては、線虫蠕虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが挙げられる。線虫
は、モデル系として多くの利点を有するが、脊椎動物の細胞死活性の評価または
脊椎動物における強力な治療的活性についての化合物のスクリーニングの際の使
用に最適なモデルではない。
脊椎動物宿主における細胞死活性を検出するために、現在２つのアプローチが
存在する。第１のアプローチは、標準的な細胞培養技術を使用し、そして代表的
には標準的なマイクロプレートリーダーに活用して、生物から培養された細胞の
死を検出する。細胞培養アッセイ形式の主な弱点は、それが、培養されなかった
細胞型（すなわち、他の細胞型）に対する化合物に対する効果の分析が可能でな
いことである。それはまた、インビボで特定の組織または器官に対する、あるい
はインタクトな宿主全体における化合物の効果の評価を可能にしない。さらに、
このようなアッセイ形式は、生存宿主の複数の組織、器官、または系における細
胞死活性の同時のモニタリング、あるいはこのような活性の経時的な継続したモ
ニタリングを可能にしない。さらに、その細胞培養アッセイアプローチは、多く
の化合物の迅速な、または自動化された高処理能スクリーニングを可能にしない
。
細胞死活性を検出するための第２のアプローチは、組織化学的染色技術（末端
デオキシウリジンヌクレオチド末端標識（ＴＵＮＥＬ）と命名される）を利用し
て、脊椎動物胚の切片化された組織における死細胞または瀕死細胞を検出する。
不幸にも、このアプローチを用いると、宿主の生活環におけるただ単一の時点の
みが試験され得；長期間にわたる被験体の種々の組織または器官における細胞の
死は、モニターされ得ない。多くの変性疾患が段階で生じるために、化合物によ
り引き起こされる細胞死活性のパターンにおける変化、ならびに複数の組織およ
び器官に対するその化合物の直接の効果および副作用の持続時間を試験する能力
は、このような方法に全体にわたる有意な改善を意味する。さらに、ＴＵＮＥＬ
アプローチは、細胞が可視化のために固定されることが必要とされるために、生
存動物における効果はモニターされ得ない。
低毒性および／または低副作用を示す標的特異的な治療的化合物および予防的
化合物の同定はまた、薬物の発見および開発の焦点である。ヒトおよび動物の健
康状態に対する異なる化合物の潜在的影響の評価は、リスク評価の主要な構成要
素である。現在の毒性試験手順は不適切であるという懸念が増加している。細胞
ベースのインビトロでの多くの毒性スクリーニングが、開発されてきた。しかし
、有意に、これらのスクリーニングは、インタクトな動物に対する化合物の毒性
効果のインビボでの評価を可能にしない。特に、これらの細胞ベースのアッセイ
は、分子レベルおよび細胞レベルで設計され；結果として、より高いレベルの細
胞性の組織化（例えば、循環系および神経発生）に対する目的の化合物の影響を
決定することが依然として、引き続く動物全体の試験を必要とする。さらに、現
在のスクリーニングは、動物の全ての潜在的な標的細胞、組織、または器官に対
する薬物効果の評価を可能にしない。複数の標的組織および器官に対する化合物
の効果は、現在のアッセイを使用して同時にまたは経時的に研究され得ない。よ
り予測的でかつ包括的な毒性スクリーニング方法の開発についての必要性が強調
されるため、予備的な細胞ベースの試験を通過した多くの化合物は、最終的なＦ
ＤＡの承認に必要となる最後の大型動物の毒性試験で失敗に終わっている。さら
に、即時型の致死を生成しない、いくつかの潜在的な治療化合物は、特定の器官
および組織における毒性効果を誘導する。動物全体における毒性活性、ならびに
１以上の指定された標的組織および器官における毒性活性について、インビボお
よびインビトロでの細胞において、かつ経時的に、化合物をスクリーニングする
費用効果的、包括的方法の必要性が存在する。
Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９５）３３３：１７５７−１７６３ Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：３５５ Ｂｏｎｎ，Ｌａｎｃｅｔ（１９９６）３４８：６０４ Ｂｒｅｉｅｒら、Ｈａｅｍｉｓｔ．（１９９７）７８（１）６７８−６８３ Ｂｏｅｈｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：４０４−４０７
（発明の要旨）
本発明は、一般に真骨魚類において、活性についての薬剤をスクリーニングす
る方法に関する。１つの局面において、インビボまたはインビトロで新脈管形成
活性について、薬剤をスクリーニングする方法が提供される。いくつかのこのよ
うな方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、およびその真骨魚
類における応答、または新脈管形成活性を示す真骨魚類の少なくとも１つの組織
もしくは器官における応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、イン
ビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および新脈管形成活
性を示すそのような細胞における応答を検出する工程を含む。いくつかのそのよ
うな方法において、その応答は、未処置の真骨魚類と比較した血管形成における
減少である。他のそのような方法において、その応答は、未処置の真骨魚類と比
較した血管形成における増加である。
別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで細胞死活性に対す
る効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかのこのよう
な方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、およびその真骨魚類
における応答、あるいは真骨魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官またはそ
れらの細胞死活性に対する効果を示す細胞における応答を検出する工程を含む。
他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与す
る工程、および細胞死活性に対する効果を示すそのような細胞における応答を検
出する工程を含む。いくつかのそのような方法において、その応答は、細胞死活
性における増加である。他のそのような方法において、その応答は、細胞死活性
における減少である。その細胞死活性は、アポトーシス活性および壊死活性を含
み得る。いくつかのそのような方法において、死細胞または瀕死細胞を標識する
蛍光色素が投与され、細胞死活性の検出を容易にする。いくつかのそのような方
法において、蛍光色素が、薬剤の投与前にその真骨魚類に投与される。いくつか
のそのような方法において、その蛍光色素は、非対称的なシアニン色素（例えば
、キノリウム（ｑｕｉｎｏｌｉｕｍ）色素）である。
インビボまたはインビトロで毒性活性についての薬剤をスクリーニングする方
法もまた提供される。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類全体に
薬剤を投与する工程、およびその真骨魚類における応答、または毒性を示す真骨
魚類の少なくとも１つの組織もしくは器官における応答を検出する工程を含む。
他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与す
る工程、および毒性を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。いくつ
かのそのような方法において、その応答は、真骨魚類の２以上の器官において同
時に検出される。
別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで新脈管形成活性お
よび毒性についての薬剤をスクリーニングする方法を提供する。いくつかのこの
ような方法は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、および新脈管形
成活性および／または毒性を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。
他のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与す
る工程、および新脈管形成活性および／または毒性を示すその細胞における応答
を検出する工程を含む。
さらに別の局面において、本発明は、インビボまたはインビトロで新脈管形成
活性および細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を含
む。いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類に薬剤を投与する工程、
および新脈管形成活性および／または細胞死活性に対する効果を示す真骨魚類に
おける応答を検出する工程を含む。他のそのような方法は、インビトロで真骨魚
類の細胞に対してその薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性および／また
は細胞死活性に対する効果を示すその細胞における応答を検出する工程を含む。
本発明はまた、インビボまたはインビトロで細胞死活性および毒性活性に対す
る効果ついて薬剤をスクリーニングする方法を含む。いくつかのこのような方法
は、インビボで真骨魚類全体に薬剤を投与する工程、および細胞死活性および／
または毒性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む。他
のそのような方法は、インビトロで真骨魚類の細胞に対してその薬剤を投与する
工程、および細胞死活性および／または毒性に対する効果を示すその細胞におけ
る応答を検出する工程を含む。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 新脈管形成活性について薬剤（ａｇｅｎｔ）をスクリーニングする方法であって、当該方法は、真骨魚類（ｔｅｌｅｏｓｔ）に対して当該薬剤を投与する工程、および新脈管形成活性を示す当該真骨魚類における応答を検出する工程を包含する、方法。
・（項目２） 上記新脈管形成活性が減少する、項目１に記載の方法。
・（項目３） 上記新脈管形成活性が増加する、項目１に記載の方法。
・（項目４） 上記応答が、正常な血管形成における減少である、項目２に記載の方法。
・（項目５） 上記応答が、正常な血管形成における増加である、項目３に記載の方法。
・（項目６） 上記応答が、既存の血管の損失である、項目２に記載の方法。
・（項目７） 上記真骨魚類が、胚、幼生、または成体である、項目１に記載の方法。
・（項目８） 上記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、メダカ（ｍｅｄａｋａ）、ジャイアントレリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅｒｉｏ）、またはフグ（ｐｕｆｆｅｒ ｆｉｓｈ）である、項目１に記載の方法。
・（項目９） 上記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ胚である、項目８に記載の方法。
・（項目１０） 上記真骨魚類が、野生型系統である、項目１に記載の方法。
・（項目１１） 上記真骨魚類が、選択された遺伝子において変異を含む、項目１に記載の方法。
・（項目１２） 上記真骨魚類が、トランスジェニックである、項目１に記載の方法。
・（項目１３） 項目１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、上記真骨魚類を含む培地中に当該薬剤を溶解することにより、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目１４） 項目１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、上記真骨魚類に当該薬剤を注射することにより、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目１５） 項目１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、キャリアと組み合わせて、上記真骨魚類に投与される、方法。
・（項目１６） 上記キャリアが、溶媒、脂質またはペプチドである、項目１５に記載の方法。
・（項目１７） 項目１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、化合物であり、そして化合物のライブラリーは、新脈管形成活性についてスクリーニングされる、方法。
・（項目１８） 上記薬剤が、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、脂質、または糖脂質である、項目１に記載の方法。
・（項目１９） 上記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１８に記載の方法。
・（項目２０） 項目５に記載の方法であって、ここで、血管が、上記真骨魚類のアルカリホスファターゼ染色の後に光学顕微鏡によって可視化される、方法。
・（項目２１） 細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、当該方法は、真骨魚類に対して当該薬剤を投与する工程、および当該真骨魚類の少なくとも１つの組織または器官において、細胞死活性に対する効果を示す当該真骨魚類における応答を検出する工程を含む、方法。
・（項目２２） 上記応答が、細胞死活性における増加である、項目２１に記載の方法。
・（項目２３） 上記応答が、細胞死活性における減少である、項目２１に記載の方法。
・（項目２４） 上記応答が、アポトーシス活性または壊死活性において増加する、項目２１に記載の方法。
・（項目２５） 上記応答が、アポトーシス活性または壊死活性において減少する、項目２１に記載の方法。
・（項目２６） 上記アポトーシス活性における増加が、上記真骨魚類の組織または器官における細胞死の増加を含む、項目２４に記載の方法。
・（項目２７） 上記アポトーシス活性における減少が、上記真骨魚類の組織または器官における細胞死の減少を含む、項目２５に記載の方法。
・（項目２８） 項目２２に記載の方法であって、ここで、当該方法は、所定の時間後に上記真骨魚類において細胞死活性における応答を検出する工程をさらに包含し、当該時間は、細胞死活性における検出可能な差異が上記薬剤の存在下で生じるのに十分である、方法。
・（項目２９） 上記アポトーシス活性のおける増加が、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡により検出される、項目２４に記載の方法。
・（項目３０） 項目２１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、上記真骨魚類を含む培地中に当該薬剤を溶解することにより、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目３１） 項目２１に記載の方法であって、ここで、死細胞または瀕死の細胞を標識する蛍光色素が、上記真骨魚類への当該薬剤の投与前に、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目３２） 項目３１に記載の方法であって、ここで、上記蛍光色素が、上記真骨魚類を含む培地中に当該蛍光色素を溶解することにより、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目３３） 項目３１に記載の方法であって、ここで、上記蛍光色素が、上記真骨魚類に当該蛍光色素を注射することにより、当該真骨魚類に投与される、方法。
・（項目３４） 項目３１に記載の方法であって、当該方法はさらに、上記真骨魚類への上記蛍光色素の投与後に、当該真骨魚類を含む培地に上記薬剤を溶解するかまたは当該真骨魚類内に上記薬剤を注射することにより、当該真骨魚類に当該薬剤を投与する工程を包含する、方法。
・（項目３５） 蛍光色素が、単量体シアニン色素である、項目３１に記載の方法。
・（項目３６） 上記蛍光色素が、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素である、項目３５に記載の方法。
・（項目３７） 上記真骨魚類が、ゼブラフィッシュである、項目２１に記載の方法。
・（項目３８） 上記細胞死活性における増加が、上記真骨魚類の複数の組織または器官において同時に検出される、項目２２に記載の方法。
・（項目３９） 項目３８に記載の方法であって、ここで、上記細胞死活性における増加が、上記真骨魚類の複数の組織または器官において、所定の間隔で経時的に同時に検出される、方法。
・（項目４０） 項目２８に記載の方法であって、ここで、当該方法は、所定の間隔で経時的に細胞死活性における増加を検出する工程をさらに包含する、方法。
・（項目４１） 項目２４に記載の方法であって、ここで、上記アポトーシス活性または壊死活性における増加が、少なくとも１つの器官または組織あるいはそれらの組み合わせにおいて検出される、方法。
・（項目４２） 項目２１に記載の方法であって、ここで、上記薬剤が、化合物であり、そして化合物のライブラリーは、細胞死活性に対する効果についてスクリーニングされる、方法。
・（項目４３） インビボで毒性活性についての薬剤をスクリーニングする方法であって、当該方法は、当該薬剤をインビボで真骨魚類に投与する工程、および当該真骨魚類の少なくとも１つの組織または器官において毒性活性を示す当該真骨魚類における応答を検出する工程を含む、方法。
・（項目４４） 毒性活性を示す上記真骨魚類における応答が、経時的に検出される、項目４３に記載の方法。
・（項目４５） 項目４３に記載の方法であって、ここで、毒性活性を示す上記真骨魚類における応答が、少なくとも２つの組織、少なくとも２つの器官、または少なくとも１つの組織および１つの器官において、同時に検出される、方法。
・（項目４６） 毒性活性を示す上記真骨魚類における応答が、所定の間隔で経時的である、項目４５に記載の方法。
・（項目４７） 項目４３に記載の方法であって、当該方法はさらに、少なくとも２つの真骨魚類に対して上記薬剤を投与する工程、および当該少なくとも２つの真骨魚類の各々における毒性活性を示す応答を、同時に検出する工程を含む、方法。
・（項目４８） 上記少なくとも２つの真骨魚類の各々が、マルチウェルのプレートのウェルに含まれる、項目４７に記載の方法。
・（項目４９） 項目１に記載の方法であって、当該方法はさらに、毒性活性を示す上記真骨魚類における応答を検出することにより、毒性活性について上記薬剤をスクリーニングする工程を包含する、方法。
・（項目５０） 項目１に記載の方法であって、当該方法はさらに、細胞死活性の増強または阻害を示す上記真骨魚類における応答を検出することにより、細胞死活性を増強または阻害する能力について薬剤をスクリーニングする工程を包含する、方法。
・（項目５１） 項目２１に記載の方法であって、当該方法はさらに、毒性活性を示す上記真骨魚類における応答を検出することにより、毒性活性について上記薬剤をスクリーニングする工程を包含する、方法。
・（項目５２） 項目１に記載の方法であって、ここで、上記真骨魚類は、アルカリホスファターゼでの染色後に漂白される、方法。
・（項目５３） 項目２１に記載の方法であって、ここで、当該方法は、インビボで真骨魚類において実施される、方法。
本明細書中の本発明の本質および利点のさらなる理解は、発明の詳細な説明お
よび添付の図面を参照することにより明らかにされ得る。
図１は、脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ）および新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のプロセスを示す概略図である。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、発生７２時間（ｈｒ）でのゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。この胚は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で染色されている。血管は、アルカリフォスファターゼ染色後、光学顕微鏡で可視化されている。０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理したコントロールの胚（図２Ａ）は、正常な形態および血管形成を有する。腸管下の血管（ＳＩＶ）（矢印）は、特徴的なパターンである。１０マイクロモル（μＭ）の濃度でフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）誘導体で処理した胚（図２Ｂ）は、発生の遅延（ひれの大きさおよび体幹（ａｘｉａｌ）の長さの減少）およびＳＩＶ（矢印）の損失の両方を示す。原腎管は、ＡＰ染色についての陽性コントロールを提供する（三角印）。１００μＭの濃度でフマギリン誘導体で処理した胚（図２Ｃ）は、死んでいる。フマギリン誘導体は、胚において発育の遅延および毒性応答を誘導する。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。 図３Ａおよび３Ｂは、発生７２時間でのゼブラフィッシュの胚の２つの側面を示す解剖顕微鏡による写真である。それぞれの胚は、アルカリフォスファターゼで染色されている。図３Ａは、コントロールを示す；図３Ｂは、ＮＣＩライブラリー由来の化合物で処理した処理胚を示す。両方の胚は、形態学的に正常であるが、処理胚は、ＳＩＶ（矢印）を全く形成することができず、そして腸管下血管の特異的な損失を示す。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。 図４は、発生７２時間でのアルカリホスファターゼ染色したゼブラフィッシュの胚の側面の解剖顕微鏡による写真である。この胚は、切断、心嚢浮腫（矢印）およびＳＩＶ形成（三角印）の減弱を誘導する化合物で処置している。ＳＩＶバスケットにおける外側血管の損失が示される。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。 図５は、脊索（ｎｏｔｏｃｏｒｄ）の小疱形成（矢印）を誘導するが、ＳＩＶ形成（三角印）には影響しない化合物で処理したゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。この胚は、ＡＰで染色されている。体幹の欠損は、通常、脈管形成に影響しない。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。 図６Ａ〜Ｄは、発生７２時間でのゼブラフィッシュの胚の側面を示す解剖顕微鏡による写真である。胚は、ＡＰで染色されている。ＶＥＧＦを、胚の卵黄に注入した場合（図６Ａおよび６Ｃ）、２つの脈管形成の表現型が観察された：１）腸管下の血管バスケットから突出する長いスパイクの出現（長い矢印）；および２）腸管下のバスケット中の血管直径の増加（三角印）。ＶＥＧＦを胚の囲卵の空隙（図６）に注入した場合、本発明者らは、大きい血管の融合、不適切な血管形成（矢印）、ならびに心臓の欠陥（長い矢印）および発生の欠陥を観察した。緩衝液が囲卵の空隙のいずれかの卵黄に注入されたコントロール胚（図６Ｂ）は正常であった。胚の眼（Ｅ）、卵黄（Ｙ）およびひれ（Ｆ）を、位置付けのために印している。スケール棒＝１００μｍ。 図７は、発生３日でのゼブラフィッシュの胚のアルカリホスファターゼ染色の複合顕微鏡（対物１０×）による写真である。未処理胚（上側）および処理胚（下側）のこれらの背面は、腸管下の静脈（矢印）に対する抗新脈管形成薬オビシリン（Ｏｖｉｃｉｌｌｉｎ）の効果を示す。腸管下の血管において減少を生じることに加えて、この薬剤は、心嚢浮腫（三角印）を生じることを含む、他の効果を有した。この図において、文字「Ｅ」は眼を示し、そして文字「Ｙ」は、卵黄球を示す。 図８は、ゼブラフィッシュの胚の１日目での実施したｆｌｋ−１での全ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示す複合顕微鏡（対物２０×）による写真である。体幹のこの側面において、体節内血管（矢印）（背面の大動脈から出芽している）（Ａ）は、プローブで標識されている。前方が左側で、そして背面が上部である。 図９は、ゼブラフィッシュの胚の発生３日目で側面プロフィールを示すマイクロアンギオグラフ（ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｇｒａｐｈ）であり、正常な血管パターンを示し、これには、頭部血管（Ｃ）、体節間血管（Ｉ）および腸管下血管（Ｓ）を含む。文字「Ｈ」は、心臓を示し、そして文字「Ｅ」は、眼を示す。マイクロアンギオグラフを作製するためのデータは、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡から得、そしてデジタル画像処理のソフトウェアを用いて処理した。 図１０Ａおよび１０Ｂは、複合顕微鏡下の複合顕微鏡写真（対物×１０）であり、それぞれ、正常なゼブラフィッシュ胚の位相画像（図１０Ａ）、およびレチノイン酸処理したゼブラフィッシュの胚の位相画像（図１０Ｂ）を示す。レチノイン酸（ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で処理した胚を、１２〜１４時間、１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）に曝露した。アポトーシスが、ＲＡ処理した胚の菱脳に生じた。これは、正常な胚と比較した場合のレチノイン酸処理した胚における菱脳の組織崩壊および耳胞と眼との間の間隔の有意な減少により証明される（図１０Ａおよび１０Ｂの矢印を比較のこと）。文字「Ｅ」は眼を示し、そして文字「ＹＢ」は、卵黄球を示し、そして文字「ＯＴ」は、耳胞を示す。 図１１は、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼで染色した５日目のゼブラフィッシュの胚の側面示す解剖顕微鏡による写真である。肝臓（矢印）および腸（Ｇ）の両方が染色されている。胚の眼（Ｅ）および耳胞（ＯＶ）を位置付けのために印している。拡大率は、図１２Ａおよび１２Ｂに匹敵する。 図１２Ａおよび１２Ｂは、特定の用量のデキサメサゾンを投与されたゼブラフィッシュ胚の用量反応を示す解剖顕微鏡による写真である。ゼブラフィッシュの胚をデキサメサゾンで５日間処理し、肝臓の発生および機能に対するデキサメサゾンの効果を決定した。胚をパラホルムアルデヒドで固定し、そしてストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとともにインキュベートし、発色色素とのインキュベート後、肝臓を検出した。矢印は、肝臓の位置を示す。図１２Ａ（上側）、６日齢の非処理の胚（コントロール胚）；図１２Ｂ（下側）、５日間１００μＭのデキサメサゾンで処理した６日齢の胚。デキサメサゾンで処理した胚は、コントロールの胚に比べて、肝臓のサイズの劇的な減少を示した。スケール棒＝１ミリメートル（ｍｍ）；眼（Ｅ）；腸（Ｇ）；尾（Ｔ）。 図１３は、種々の用量のデキサメサゾンに対するゼブラフィッシュの胚の用量反応を示すグラフの図である。ゼブラフィッシュの胚を、図１２Ａおよび１２Ｂについて記載したように、種々の濃度のデキサメサゾン（すなわち、１μＭ〜１００μＭの範囲にわたる濃度）に５日間、曝露した。処理後、この胚を可溶性の色素で染色し、特異的に肝臓の欠陥を検出した。染色後、ペルオキシダーゼにより形成される産物を４０５ナノメートル（ｎｍ）での吸光度により検出した。この値は、コントロール（すなわち非処理の胚）を１００％とした場合の、コントロールのパーセンテージ（％コントロール）として表した。標準偏差も計算し、そしてデータに加えた。デキサメサゾンにより生じる肝臓毒性は、肝臓のサイズの減少により示唆される。 図１４は、パラホルムアルデヒドで固定し、そしてアルカリホスファターゼで染色した６日齢のゼブラフィッシュの胚の写真である。矢印は、染色した胚の腎臓の位置を示す。スケール棒＝１ｍｍ；眼（Ｅ）；腸（Ｇ）；尾（Ｔ）。
（定義）
他に規定しない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用
語は、本発明が属する当該分野の当業者により、通常、理解されるのと同じ意味
を有する。以下の参考は、本発明において用いられる多くの用語の一般的な定義
を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９
９４年、第２版）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８
）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉ
ｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書に
おいて用いる場合、以下の用語および句は、他に特定されない限り、これらに基
づいた意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価で
ある任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが
、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語およ
び句は、それらが本明細書において用いられる場合、以下の一般的な意味を有す
ることが意図される：
本明細書において用いる場合、用語「被験体」は、動物を含む。本明細書にお
いて用いる用語「動物」は、脊椎魚（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｆｉｓｈ）のよう
な脊椎動物を含む。脊椎魚としては、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャ
イアント レリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅｒｉｏ）およびフグのような真骨魚類（ｔ
ｅｌｅｏｓｔｓ）が挙げられる。
本明細書において用いる場合、用語「真骨魚類（ｔｅｌｅｏｓｔ）」は、Ｔｅ
ｌｏｓｔｅｉまたはＴｅｌｅｏｓｔｏｍｉ（骨の骨格および放射状のひれを有す
る多くの魚からなる群）を意味するかまたはそれに属する。真骨魚類としては、
例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント レリオおよびフグが挙げら
れる。
本明細書において用いられる用語「幼生」または「幼生の」は、脊椎魚（例えば、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、メダカ（ｍｅｄａｋａ）、ジャイアント レリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅｒｉｏ）およびフグ（ｐｕｆｆｅｒ ｆｉｓｈ）のような真骨魚類を含む）のような脊椎動物を含む任意の種々の動物の、胚形成と成体との間の段階を意味する。
薬剤（ａｇｅｎｔ）に関連する「新脈管形成活性（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「脈管形成活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、本明細書において、血管またはリンパ管の形成または成長を増強、阻害または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関する新脈管形成活性または脈管形成活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における新脈管形成、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する新脈管形成と関連する活性をいう。
薬剤（ａｇｅｎｔ）に関連する「抗新脈管形成活性」または「抗脈管形成活性」は、本明細書において、血管またはリンパ管の形成または成長を阻害、防止、または大きく減弱するか、あるいは出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）または成長の間のこのような血管を破壊する薬剤の能力として定義される。被験体に関する抗新脈管形成活性または抗脈管形成活性は、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における抗脈管形成、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する新抗脈管形成と関連する活性をいう。
薬剤（ａｇｅｎｔ）に関する用語「アポトーシス性活性」または「アポトーシス活性」は、本明細書において、アポトーシスを増強、阻害、または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関するアポトーシス性活性またはアポトーシス活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における細胞の死、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する細胞の死と関連する活性をいう。
薬剤（ａｇｅｎｔ）に関する「細胞死活性」は、本明細書において、被験体または被験体の器官もしくは組織中における、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する１つ以上の細胞の死を増強、阻害または防止する薬剤の能力として定義される。被験体に関する細胞死活性とは、被験体または被験体の器官もしくは組織の中における細胞の死、あるいは被験体または被験体の器官もしくは組織中から発生する細胞の死と関連する活性をいう。
薬剤（ａｇｅｎｔ）に関する用語「壊死性活性」または「壊死活性」は、本明細書において、壊死を増強、阻害、または防止する薬剤の能力として定義される。
本明細書において用いる場合、「細胞死活性に対する効果」は、薬剤（ａｇｅｎｔ）が被験体において細胞死活性に作用するまたは影響する様式をいう。このような効果は、被験体において細胞死活性を増強または阻害する能力（例えば、被験体における細胞死において生じるか、観察されるか、関連するか、または特有の、臨床兆候、特徴、症状または事象により示されるかあるいは表されるような）を含む。
本明細書において用いる場合、「アポトーシス性活性に対する効果」は、薬剤（ａｇｅｎｔ）が被験体においてアポトーシス性活性に作用するまたは影響する様式をいう。このような効果は、被験体においてアポトーシス性活性を増強または阻害する能力を（例えば、被験体における細胞のアポトーシスにおいて生じるか、観察されるか、関連するか、またはそれに特有の、臨床兆候、特徴、症状または事象により示されるかまたは表されるような）を含む。
本明細書において用いる場合、「内因性に発生する」とは、内部から発生が生
じることを意味する。
用語「遺伝子」は、生物学的な機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを呼
ぶために広く用いられる。従って、遺伝子は、その発現に必要なコード配列およ
び／または調節配列を含む。遺伝子はまた、発現されないＤＮＡセグメント（例
えば、他のタンパク質についての認識配列を形成する）も含む。用語「核酸」ま
たは「核酸セグメント」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドおよびそれらのポリマーをいい、これらは、一本鎖または二本鎖形態のいずれ
かである。特に限定されない限り、この用語は、ヌクレオチドの公知のアナログ
（合成的におよび天然に生じる）を含む核酸を包含する。この核酸は、参照の核
酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される
。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、明白に示されるその配列と同様
にその保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列
を暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された
（または、すべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン
残基で置換される配列を作製することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋ
ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｒ
ｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８（１９
９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によりコードされるｍ
ＲＮＡと相互交換可能に用いられる。
用語「単離された核酸」または「単離された核酸セグメント」は、一本鎖また
は二本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合されたポリマー）を意味する
。これらは、天然の配列を自然に伴う他のゲノムＤＮＡ配列ならびにタンパク質
または複合体（例えば、リボソームおよびポリメラーゼ）から実質的に分離され
ている。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含
し、そして組換えＤＮＡ単離体またはクローン化ＤＮＡ単離体および化学的に合
成されたアナログまたは異種の系により生物学的に合成されたアナログを含む。
実質的に純粋な分子は、分子の単離された形態を含む。「単離されたポリペプチ
ド」またはタンパク質は、あらゆる細胞混雑物およびインビボでそのタンパク質
と自然に会合する成分から実質的に分離されているポリペプチドまたはタンパク
質という類似の意味を有する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
のポリマーをいうために本明細書において互換可能に用いられる。この用語は、
１つ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸の対応物の人工的な化学的
アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに
あてはまる。
アミノ酸は、本明細書において、その通常公知の３文字略号かまたはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎにより推奨される１文字略号のいずれかで呼ばれ得る。ヌクレオチド
は同様に、その通常受容される１文字コードで呼ばれ得る。
本明細書において用いる場合、「キメラ分子」とは、２つ以上の異なる型の分
子（例えば、脂質、糖脂質、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、
核酸、天然物質、合成化合物、有機分子、無機分子など）の結合後に得られる連
結分子をいう。
本明細書において用いる場合、用語「正常な血管形成」とは、被験体における
血管の形成または生成の代表的な、通常の、または天然のプロセスをいう。
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子発現プロフィール」または「遺伝
子発現パターン」は、そのプロフィールまたはパターンに含まれるそれぞれの遺
伝子についてのｍＲＮＡの検出に基づくプロフィールまたはパターンを意味する
。ｍＲＮＡは、特定の時間で、または特定の状況下で検出され得る。ｍＲＮＡは
、細胞、組織、器官または目的の生物体全体から抽出されそして検出される。特
定の遺伝子についてのｍＲＮＡの量またはレベルは、定量的に決定され得る。
本明細書において用いる場合、用語「タンパク質発現プロフィール」または「
タンパク質発現パターン」は、タンパク質の検出に基づくプロフィールまたはパ
ターンを意味する。タンパク質は、特定の時間で、または特定の状況下で検出さ
れ得る。タンパク質は、細胞、組織、器官または目的の生物体全体から抽出され
そして検出される。タンパク質の量またはレベルは、定量的に決定され得る。
用語「薬剤」は、例えば、薬学的な、治療的な、薬理学的な、環境的な、もし
くは農業的な汚染物質もしくは化合物、水中の汚染物質、化粧品、薬物、毒素、
天然の産物、合成化合物または化学的化合物を含むがこれに限定されない任意の
エレメント、化合物または実体を含む。
本明細書において用いられる用語「天然の化合物」は、植物、動物、酵母、細
菌または他の微生物から単離、抽出または精製された分子を含む。天然の化合物
としては、例えば、とりわけ、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、炭
水化物、脂質、脂肪、糖脂質の広い生化学的な分類に属する有機分子、ならびに
例えば、より多いこれらの基礎的な生化学的な分類のエレメントを含む、より複
雑な分子が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、用語「合成化合物」は、新規に（ｄｅ ｎ
ｏｖｏ）合成されたか、または天然の化合物を改変もしくは誘導体化することに
より作製される分子を含む。
本明細書において用いられる場合「発生欠陥」は、正常な発生に比較して動物
の組織、器官または他の身体的成分の発生における欠損、不完全または差異を意
味する。このような欠陥は、成分の正常な発生と比較して、その動物の組織、器
官または他の身体的成分の発生における完了または適切な操作のために必要かま
たは所望されるものの、変化、差異または欠失として定義される。発生欠陥とし
ては、例えば、適切に発生するための器官の不全、正常な細胞増殖に比べて過剰
なまたは減少した細胞増殖、および器官または組織の機能不全が挙げられる。
一般に、本明細書において以降用いられる命名法ならびに以下で記載される細
胞培養、分子遺伝学および核酸化学における実験手順は、周知であり、そして当
該分野において通常用いられるものである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第２版、１９８９）およびＣｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１〜
３巻（Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｂｅｎｓｏｎ Ｃｈａｎｄａ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙおよびＳｏｎｓ、１９９４〜１９９８）（これらのそれぞれは、その全体がす
べての目的のために参考として本明細書に援用されている）に記載されるような
標準的技術は、組換え核酸方法、核酸合成、細胞培養、およびトランスジーンの
組み込みのために用いられる（例えば、エレクトロポレーション、注入、摂取、
およびリポフェクション）。エレクトロポレーション技術は、目的の分子を細胞
、組織または生物体へ導入するために高い電流のパルスを利用する。リポフェク
ションは、細胞膜と強力に相互作用する脂質様陽イオン性分子を用いる。これは
細胞膜を局所的に不安定にし、これにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの細胞内への侵
入を可能にする。一般的に、オリゴヌクレオチド合成および精製工程は、本明細
書に従って実行される。この技術および手順は、一般に当該分野の従来方法およ
び本明細書を通じて提供される種々の一般的参考文献に従って実施される。それ
らにおける手順は、当該分野で周知と考えられており、そして読者の便利のため
に提供される。
生物体または動物に関する用語「トランスジェニック」は、染色体に外来遺伝
子が挿入された、受精卵から発生した生物体または動物を含む。このようなトラ
ンスジェニック生物および動物は、全ての細胞に外来遺伝子挿入物を保有する。
トランスジェニック生物および動物は、公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
、前出、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏ
ｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｄｅｖｌｉｎ編、第３版、１９９２）を参照のこと
）（これは、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されて
いる）を用いることにより作製される。トランスジェニック生物および動物は、
外来の遺伝子の異なる局面を研究するために用いられ得る。これには、ＤＮＡ調
節エレメント、分化の間のタンパク質の発現、組織特異性、ならびに成長、分化
および腫瘍形成の誘導における癌遺伝子産物の潜在的な役割の分析を含む。「ト
ランスジーン」は、元々の形態のまたは改変形態の遺伝子であり、これはこのよ
うな遺伝子を天然には有さない生物または動物に導入される。「モザイク的に発
現するトランスジーン」は、トランスジェニック生物または動物の細胞のサブセ
ットにおいて無作為に発現されるトランスジーンである。「外因性の遺伝子」は
、遺伝子が導入された種に属さない生物または動物由来の遺伝子である。「一過
性のトランスジェニック動物」は、染色体に挿入されていない導入された遺伝子
を保有するトランスジェニック動物である。
本明細書において用いられる場合、「創始魚（ｆｏｕｎｄｅｒ ｆｉｓｈ）」
とは、魚の系統が発生される魚をいう。通常、創始魚は、特有の変異を保有し、
そして子孫（これもまた変異を保有する）を発生するために用いられる個体の魚
である。
生物に関する「生理的な活性」は、本明細書において、生存する生物の任意の
正常なプロセス、機能または活性として定義される。
「予防的な活性」は、疾患の兆候もしくは症状を示さないかまたは疾患の早期
の兆候もしくは症状のみを示す被験体に投与された場合、被験体における症状の
発生の危険性を減弱、低下または予防する、例えば、薬剤、遺伝子、核酸セグメ
ント、医薬品、物質、化合物または組成物の活性である。
「治療的活性」は、病態を示している被験体に投与された場合、病理的な兆候
または症状を減弱、または排除する、例えば、薬剤、遺伝子、核酸セグメント、
医薬品、治療薬、物質、化合物または組成物の任意の活性として本明細書におい
て定義される。薬剤に関する用語「治療上有用な」は、その薬剤が、病態または
疾患の病理的兆候または症状を減弱すること、減少すること、処置することまた
は排除することにおいて有用であることを意味する。
（特定の実施態様の説明）
（Ｉ．全般）
本発明は、活性についての薬剤のスクリーニングの方法に関する。本願の第Ｉ
Ｉ節で、新脈管形成活性を増強、阻害またはブロックする薬剤の性能または能力
についてのスクリーニング方法を議論する。第ＩＩＩ節において、細胞死活性を
増強する、阻害するまたは起こす能力についての薬剤のスクリーニング方法を記
載する。第ＩＶ節において、毒性活性についての薬剤のスクリーニングの方法を
示す。
（Ａ．動物モデル）
活性（例えば、新脈管形成活性、細胞死活性および毒性活性）についての薬剤
スクリーニングに関する本発明の方法は、一般に、魚のような脊椎動物を含む種
々の動物における使用のために適用可能である。種々の種の魚が適切であり、こ
れには真骨魚類を含む。適切な真骨魚類としては、例えば、ゼブラフィッシュ（
Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、メダカ、ジャイアント レリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅ
ｒｉｏ）およびフグが挙げられる。代表的には、本発明の動物モデルは、以下の
段階の少なくとも１つにある透明または半透明（すなわち、光学的に透明）であ
る魚である：胚性段階、幼生段階または成体段階。
特定の真骨魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント レリオおよびフ
グを含む）は、本発明のスクリーニング方法での使用のために他の動物モデル系
よりも重要な利点を提供する。第１に、これらの真骨魚類は、遺伝子構造が他の
モデル（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび線虫）よりもヒトの遺伝子構造によ
り近縁関係にある脊椎動物である。ヒトの形態および器官の発生の全ての必須の
成分は、これらの真骨魚類で模倣されており、そして組織および器官の発生の形
態的および分子的基礎は、他の脊椎動物（ヒトを含む）と同一かまたは類似して
いるかのいずれかである。ＣｈｅｎおよびＦｉｓｈｍａｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ １２３：２９３〜３０２（１９９６）；ＧｒａｎｔｏおよびＮｕｓｓｅｌ
ｉｅｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ、Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．６：４６１〜４６８
（Ｗｙｌｉｅ編、１９９６）。結果として、これらの真骨魚類は、脊椎動物の発
生およびヒト疾患状態の研究のための優れたモデルとして働く。
第２に、これらの真骨魚類は、それらの胚が、非常に透明であることにより有
利な動物モデルを提供する。胚の透明性を考えると、投与された薬剤により生成
される新脈管形成活性、細胞死活性（例えば、アポトーシスおよび壊死）および
毒性活性は、不透明な動物においてよりもさらにより迅速に検出および診断され
得る。これらの活性はまた、ゼブラフィッシュのより成熟した幼生および成魚形
態において検出され得る。ただし、このような形態では次第に光学的に明瞭度が
低下するのでいくらか容易性が低下する。これらの活性はまた、３つすべての形
態でインビボで検出され得るか、またはインビトロでそれらの細胞内で検出され
得る。対照的に、動物モデル系として通常用いられるマウスは、不透明な動物で
あり、そして表現型の変化または発生的な変化の同様の迅速な評価またはインビ
ボ評価を可能にしない。これらの変化は、動物全体または器官もしくは組織の全
体において、細胞死、新脈管形成または毒性と関連する変化を含む。重大なこと
に、これらの真骨魚類の脳、眼、心臓ならびに筋肉組織の前駆組織および成分は
、他の系においてよりも透明な真骨魚類においてより容易に、そして迅速に検出
および可視化される。この他の系には、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、比色定
量、化学発光（ケミルミネセンス）、デジタル画像、マイクロプレートリーダー
技術、ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションなどを含む種々の検出技術
による他の脊椎動物系（例えば、マウス）を含む。
他の動物モデルより優れた真骨魚類の別の重要な利点は、真骨魚類は他の動物
モデルが発生するよりも迅速に発生することである。一般に、真骨魚類の体制プ
ラン、器官、組織および他の系は、他の脊椎動物モデル系（例えば、マウス）に
おけるそのような成分が発生するよりもより迅速に発生する。例えば、ゼブラフ
ィッシュの脊椎動物体制プラン全体は、代表的には、２４時間内に樹立される。
機能する心血管系は、発生の２４時間内にゼブラフィッシュ中で明らかになる。
ＳｔａｉｎｉｅｒおよびＦｉｓｈｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ
．Ｍｅｄ．４：２０７〜２１２（１９９４）。ゼブラフィッシュの残りの器官（
腸、肝臓、腎臓および血管系を含む）は、４８時間内に樹立される。孵化したゼ
ブラフィッシュの胚は、１２０時間内に形態形成をほぼ完成する。これにより、
操作および観察に非常にアクセス可能になり、そして高処理能力の自動観察およ
び検出手順に受け入れられる。
薬剤の細胞死活性、新脈管形成活性および毒性活性およびこれらの活性を示す
応答は、真骨魚類全身においておよび／またはインビボであるいはインビトロで
のその細胞中で、経時的にモニターされ得る−（子宮内で発生する他の動物の胚
（例えばマウス）を用いては、不可能かまたは容易に実施できない手順）。さら
に、真骨魚類胚全体または複数の系（例えば、心血管系、腸管系および筋系）、
器官もしくは組織に対する薬剤の効果は、透明な真骨魚類を用いて同時に検出さ
れ得る。このような効果の持続性は、単純な可視化方法を用いることにより、そ
して選択した時間間隔にわたってモニターされ得る。対照的に、子宮内で発生す
る動物において、経時的に、器官、組織および系における発生的変化および表現
型変化（例えば、薬剤による新脈管形成、細胞死、または毒性活性の阻害または
増強）を検出および評価することは非常に困難である。例えば、マウス胚は、ア
ッセイが実施され得る前には、母体から取り出さねばならない−（分娩集中的な
手順）。
真骨魚類はまた、毒性効果について評価される薬剤が発生中の真骨魚類に直接
投与され得るという利点を提供する。候補化合物の直接導入は、マウス胚のよう
な子宮内で発生する動物においては邪魔される。さらに、真骨魚類の胚は、イン
タクトな自己維持性の生物体である。例えば、それは、その母体の子宮から物理
的に離れているために自己維持性またはインタクトではないマウス胚とは異なる
；マウス胚は、「器官」培養などとしてより機能する。
別の重大な利点はコストである。マウスアッセイは高価であり、これは主に、
育種および維持のコストならびに手技的な注射および引き続く分析の必要性に起
因する。商業的なマウス腫瘍アッセイの平均コストは、約２，９００ドル（１機
関あたり１，６００ドル）である。対照的に、ゼブラフィッシュのような真骨魚
類は、作製および維持のために比較的高価でない。例えば、ゼブラフィッシュ分
析の推定コストは、１００ドル未満である。ゼブラフィッシュの単回交配により
、１００〜２００の卵が産生される。近交系が利用可能であり、そして数千のゼ
ブラフィッシュが水槽の小部屋で安価に増やされ得る。さらに、真骨魚類卵（ゼ
ブラフィッシュの卵を含む）は、外部で受精される。真骨魚類胚（例えば、ゼブ
ラフィッシュ）水からの酸素および卵黄からの栄養の拡散により生存し得、従っ
て完全な循環システムがなくても早期発生の間は十分耐えられる。Ｗｅｉｎｓｔ
ｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１１４３〜１１４７（１９９５）。
さらに、１つの真骨魚類胚の全体は、発生の最初の６日間、１００マイクロリ
ットル程度の液量で、インビボで維持され得る。インタクトな生存胚は、個々の
マイクロタイターウェルまたはマルチウェルプレートの培養物中で維持され得る
。試験化合物は、魚が浸けられている溶液に直接添加され得る。化合物は、イン
タクトな胚に直接浸透し、これは、このマルチウェル形式を、高処理能力および
自動化化合物スクリーニングに特に魅力的にさせる。薬物の治療的活性および副
作用（例えば毒性）の両方は、インビボで同時に魚においてアッセイされ得る。
本発明のスクリーニング方法を用いる真骨魚類は、代表的には、早期段階の真
骨魚類の胚である；しかし透明な幼生または成体真骨魚類もまた、用いられ得る
。真骨魚類の野生型系統が通常、用いられる。野生型系統は、代表的には、受精
能低下後も約１年間維持される。真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）の変異
系統は、例えば、治療剤と特異的遺伝子欠損との間の相互作用を評価するために
用いられ得る。この真骨魚類は、選択された遺伝子における変異を含み得る。こ
の変異は、例えば、発生欠損に関係する遺伝的変異を含む遺伝的な変異であり得
る。この真骨魚類はまた、トランスジェニックであり得る。
（Ｂ．スクリーニングされる薬剤）
種々の供給源由来の多様な薬剤が、本発明の方法を用いることによる新脈管形
成活性、細胞死活性および／または毒性活性を増強または阻害することについて
スクリーニングされ得る。スクリーニングされる薬剤は、天然に存在するかまた
は合成分子であり得る。スクリーニングされる薬剤はまた、天然の供給源（例え
ば、海洋の微生物、藻類、植物、真菌など）から得られ得る。あるいは、スクリ
ーニングされる薬剤は、薬剤のコンビナトリアルライブラリー（ペプチドもしく
は低分子を含む）に、または産業（例えば、化学工業、製薬工業、環境産業、農
業、海洋工業、化粧品産業、製薬業および生物工学産業）で合成された化学化合
物の現存のレパートリーに由来し得る。薬剤としては例えば、医薬品、治療剤、
環境的薬剤、農業的薬剤または工業的薬剤、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合
物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化
物、キメラ分子などが挙げられ得る。
コンビナトリアルライブラリーは、１段階ごとの様式で合成され得る多数の型
の化合物について作製され得る。このような化合物としては、ポリペプチド、タ
ンパク質、核酸、βターン模倣物、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグラ
ンジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリ
ゴマーのＮ置換型グリシンおよびオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大
きいコンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ，ＷＯ ９５／１２６０
８，Ａｆｆｙｍａｘ ＷＯ ９３／０６１２１，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ，ＷＯ ９４／０８０５１，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＷＯ ９５
／３５５０３およびＳｃｒｉｐｐｓ，ＷＯ ９５／３０６４２（このそれぞれは
、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用されている）に記
載のコードされた合成的ライブラリー（ＥＳＬ）法により構築され得る。ペプチ
ドライブラリーはまた、ファージディスプレイ方法により作製され得る。例えば
、Ｄｅｖｌｉｎ，ＷＯ ９１／１８９８０を参照のこと。スクリーニングされる
化合物はまた、政府からまたは私的な供給源から入手され得る。これには、例え
ば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ（ＮＣＩ）Ｎａ
ｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ
，ｔｈｅ ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＮＣＩ’ｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍなどが挙げられる。
（Ｃ．薬剤の投与）
新脈管形成活性、細胞死活性および／または毒性活性への効果についてスクリ
ーニングされる薬剤は、生きた真骨魚類を含む培地へ直接薬剤を添加することに
より真骨魚類に対して投与され得る。あるいは、この薬剤は、最初、培地に溶解
され、そして生きた真骨魚類は引き続き培地に浸され得る。このようなアプロー
チは、麻酔薬および他の化学物質を魚の胚に導入するために用いられている。例
えば、Ｍ．Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ：
Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｚｅ
ｂｒａｆｉｓｈ（第３版、１９９５）（すべての目的のためにその全体が本明細
書に援用されている）を参照のこと。薬剤はまた、その薬剤が生きた真骨魚類に
直接注射されるマイクロインジェクション技術を用いることにより真骨魚類に投
与され得る。例えば、薬剤は、真骨魚類の胚の卵黄もしくは体またはその両方の
いずれかに注射され得る。
薬剤はまた、エレクトロポレーション、リポフェクションもしくは経口摂取に
より、または微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）の細胞ローディング技術（生物学
的分子でコートされた微粒子が高圧銃を用いて目的の細胞または組織に「微粒子
銃的に（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）」打ち込まれる）により真骨魚類に投与
され得る。このような技術は、当業者にとって周知である。例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、前出、Ｃｈｏｗら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）：１６６
７〜１６７９（１９９８）を参照のこと。
薬剤は、単独で、種々の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）またはキ
ャリア（例えば、ペプチド、脂質または溶媒キャリアを含む）と組み合わせて、
あるいは他の化合物と組み合わせて投与され得る。
薬剤は、特定の活性（例えば、細胞活性、血管形成活性、毒性活性）を示す動
物における反応の検出のために用いられる色素の投与前、投与と同時に、または
投与後に真骨魚類に投与され得る。
（Ｄ．色素の投与）
活性（例えば、細胞死活性、新脈管形成活性、毒性活性）についての薬剤スク
リーニングの方法に用いられる色素は、この薬剤を生きた真骨魚類を含む培地に
直接添加することにより真骨魚類に投与され得る。あるいは、色素は、最初、培
地に溶解され、そして生きた真骨魚類が引き続き培地に浸され得る。例えば、Ｗ
ｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，前出、を参照のこと。色素はまた、その色素が生きた真
骨魚類に直接注射されるマイクロインジェクション技術を用いることにより真骨
魚類に投与され得る。色素は、真骨魚類の胚の卵黄もしくは体またはその両方の
いずれかに注射され得る。
色素は、単独で、種々の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドなど）、または
他の色素と組み合わせて投与され得る。色素は、特定の活性（例えば、細胞死活
性、新脈管形成活性、毒性活性）を示す真骨魚類における反応の検出のために用
いられる色素の投与前、投与と同時に、または投与後に真骨魚類に投与され得る
。蛍光色素（例えば、キノリウム色素のような非対称性シアニン色素）が活性（
例えば、細胞死活性）の検出のために用いられる場合、この色素は、好ましくは
、薬剤の投与の前に投与される。
（Ｅ．真骨魚類における薬剤の活性および反応の検出）
種々の技術が一緒にまたは別々に用いられ、シグナルを産生し得、そして薬剤
の細胞死活性または真脈管形成活性または毒性活性に対する薬剤の効果を検出お
よび評価し得る。シグナルは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、
特定のタンパク質の抗体染色（例えば、ＶＥＧＦならびにＡｎｇ１および２を含
む、真骨魚類における脈管形成的脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｖｅｓｓｅ
ｌ）と関連したシグナル伝達タンパク質を標識する抗体マーカー；死細胞または
瀕死細胞などを検出するための末端のデオキシウリジンヌクレオチド末端標識）
によって生成され得る。毒性活性もしくは脈管形成活性、または細胞死活性への
効果を示す反応は、例えば、視覚検査、比色定量、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、ケ
ミルミネセンス（化学発光）、デジタル画像分析、標準的マイクロプレートリー
ダー技術、蛍光定量法（時間分解蛍光定量法を含む）、視覚検査、ＣＣＤカメラ
、ビデオカメラ、写真フィルム、もしくは現在の装置（例えば、レーザー走査デ
バイス、蛍光測定器、フォトダイオード、量子計測器、プレートリーダー、エピ
蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリ、キャピラリー電
気泳動検出器）の使用によってまたはシグナル増幅のための手段（例えば光電子
増倍管など）によって検出され得る。反応は、パターン認識のソフトウェアを用
いることにより識別および／または分析され得る。試薬は、それが生成する活性
または反応に従うスクリーニング方法を用いて同定および選択される。
タンパク質の分布における空間的かつ時的的、両方の変化（タンパク質の完全
な欠如を含む）は、検出され得、そしてタンパク質発現プロフィールが作製され
得る。インタクトな真骨魚類における酵素または酵素活性のレベルの変化はまた
、動物の肝臓、腸および消化管における天然にビオチン化されたカルボキシラー
ゼ酵素を検出するための種々の手段（例えば、アルカリホスファターゼ染色およ
びストレプトアビジン（アビジン）結合体化レポーター酵素の使用を含む）によ
り検出される。
（Ｆ．自動化方法）
手動のスクリーニング方法に加えて、本発明はまた、自動手順を用いて、新脈
管形成活性、細胞死活性および毒性活性のような活性についての薬剤の迅速なス
クリーニングのための方法を提供する。この自動化方法は、市販の自動装置およ
びソフトウェアならびに公知の自動観察および検出手順を用いることにより容易
に実施され得る。マルチウェル形式は、高処理能力スクリーニングおよび自動化
合物スクリーニングのために特に魅力的である。スクリーニング方法は、例えば
、標準的マイクロプレートウェル形式を用いて、マイクロプレートのそれぞれの
ウェルにゼブラフィッシュの胚全体を用いて、実行され得る。この形式により、
スクリーニングアッセイが標準的マイクロプレート手順およびマイクロプレート
リーダーを用いて自動化され、ウェルにおけるゼブラフィッシュの胚において新
脈管形成活性の増強または阻害を検出することが可能になる。マイクロプレート
リーダーは、マイクロプレート（例えば、９６ウェルプレート）からのシグナル
を読み取り得る任意のデバイスを備え、これには、エンドポイントアッセイまた
は動的アッセイのいずれかによる蛍光測定法（標準または時間分解）、照度測定
法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｏｒｙ）、または測光法を含む。このような技術を用い
て、インビボまたはインビトロにおける多数の真骨魚類（例えば、真骨魚類の胚
）に対する特定の薬剤の効果が、迅速に確認され得る。さらに、このような配置
とともに、広範な種類の薬剤が、ウェルに含まれた真骨魚類の細胞への薬剤のそ
れぞれの効果について迅速かつ効率的にスクリーニングされ得る。
サンプルの取り扱いおよび検出手順は、色素および薬剤の迅速な再現可能な適
用、液体交換ならびに標的化合物の自動化スクリーニングのための市販の装置お
よびソフトウェアシステムを用いて自動化され得る。化合物投与の処理能力を向
上するために、現在利用可能な自動システム（例えば、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲ
ｏｂｏｔ ９６００、ＺｙｍａｒｋのＺｙｍａｔｅ、またはＢｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＢｉｏｍｅｋ）（そのほとんどはマルチウェル培養プレ
ート形式を用いる）が用いられ得る。プロセシングの手順は、所定の時点で実施
されるべき多数の液体交換を含む。自動化されていない処理能力は、代表的には
、１ウェルあたり１つの胚を有する９６ウェルプレートを用いること、および１
つの濃度あたり１０の胚を有する２つの濃度をスクリーニングすることに基づい
て、１週あたり、１研究者あたり５マイクロタイタープレート（４００の真骨魚
類の胚および２０の化合物）である。現在利用可能な液体操作ハードウェア（例
えば、Ｂｏｄｈａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｚｙｍａｒｋ）および
本発明者らの標準的サンプル操作手順を用いて、１日あたり５０〜１００プレー
ト（４８００〜９６００の真骨魚類胚および２００〜４００化合物）が処理され
得る。市販の液体操作装置の組み込みは、手動スクリーニング手順の時間枠を有
意に短縮し、そして多数の薬剤（薬剤のライブラリーを含む）の効率的な分析を
可能にする。
（ＩＩ．新脈管形成活性に対する効果についての薬剤のスクリーニングの方法
）
（Ａ．新脈管形成）
脈管供給の形成および樹立は、栄養物の細胞内流入、老廃物質の流出ならびに
ほとんどの組織および器官におけるガス交換に本質的に必要である。このような
血管発生および分化のために２つのプロセスが、同定されている。「血管新生（
ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と名付けられる血管新生の１つのプロセスは
、胚で生じ、そして間葉細胞の血管芽細胞へのインサイチュの分化からなる。血
管芽細胞は、内皮細胞および血液細胞の両方の前駆体である。「新脈管形成（ａ
ｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と名付けられた第２のプロセスは、既に存在してい
る内皮細胞に由来する新しい血液およびリンパ管の形成を含む。このプロセスに
おいて、組織および器官は、より小さい血管がより大きい血管から伸長し、そし
て特定の組織に侵入する出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）により血管新生化される。
Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。新脈管形成はまた、内皮細胞の移動および増殖、内皮
細胞の管様構造への分化、ならびに血管周囲の基底膜マトリックスの産生を含む
。Ｈｅｒｂｅｒｔら、Ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１３６５〜１３７３（
１９８８）。
新脈管形成活性の阻害または増強についての薬剤スクリーニングのための方法
は、脈管形成のプロセスを含む種々の疾患の治療的処置または予防的処置におい
て有効である薬剤の同定において有用である。
（Ｂ．血管の形成）
新しい血管は、一連の連続工程における正常な組織増殖および修復の間に形成
する：存在する小血管（毛細血管）の壁を形成する内皮細胞は、活性型になり、
細胞外マトリックス（その周辺）組織を分解する酵素を分泌し、マトリックスに
侵入し、そして分裂を開始する。結局のところ、新しい内皮細胞のストリングは
、中空の管に組織化し、組織を作製しそして修復し得る血管の新しいネットワー
クを生み出す。通常は、内皮細胞は、休眠中である。しかし、必要時には、血管
成長の短時間爆発（ｂｕｒｓｔ）が組織の局所化された部分に生じる。新しい毛
細血管成長は、内皮細胞成長を活性化または阻害する因子の間できちんと調整さ
れた平衡により厳重に制御される。約１５のタンパク質が、内皮細胞の成長およ
び運動を活性化することが公知である。これには、アンギオポイエチン（ａｎｇ
ｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、上皮増殖因子、エストロゲン、繊維芽細胞増殖因子、プ
ロスタグランジン、腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および顆粒球
刺激因子を含む（Ｚｅｔｔｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４９：４０７〜４２
４（１９９８））。ＶＥＧＦは、内皮細胞上でチロシンキナーゼレセプターｆｌ
ｔ−１およびｆｌｋ−１／ＫＤＲに結合する（Ｈａｎａｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７７（５３２２）：４８〜５０（１９９７））。ＶＥＧＦの下流の効果とし
ては、マトリックスプロテアーゼおよびグルカロノイダーゼ（ｇｌｕｃａｒｏｎ
ｉｄａｓｅ）の活性化、内皮細胞接合の弛緩、ならびに内皮細胞の増殖および移
動が挙げられる。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の下流の効果としては
、内皮細胞のマイトジェンの刺激が挙げられる（Ｒｅｌｏｕら、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｅｌｌ ５：５２５〜５３０（１９８８））。いくつかの新脈管形成の公知の
インヒビターとしては、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン
、インターロイキン１、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロ
プロテイナーゼ１および２の組織インヒビター（Ｚｅｔｔｅｒ、前出）が挙げら
れる。
（Ｃ．脈管形成阻害）
新脈管形成は、固形腫瘍の増殖に必須であるので、新脈管形成の阻害は、腫瘍
増殖を防ぐための１つのストラテジーである。新しい血管の発生をブロックする
ことにより、酸素および栄養物の腫瘍供給は、断たれ得、それにより腫瘍の持続
的な増殖および転移は、阻止され得る。いくつかのストラテジーは、以下を含む
、抗新脈管形成剤を設計することであり得る：１）血管形成を刺激する因子のブ
ロック；２）新脈管形成の天然のインヒビターの使用；３）周囲の組織へ侵入す
る血管の新しい形成を可能にするブロック分子；および４）内皮細胞の新しい分
裂の無能力化。一般に、より高密度の血管を有する腫瘍は、より転移するようで
あり、そして不幸な臨床的結果に関連する。また、原発性腫瘍からの細胞の剥落
は、腫瘍が血管の完全なネットワークを有した後にのみ始まる。さらに、新脈管
形成および転移の両方は、マトリックスメタロプロテイナーゼを必要とし、この
酵素は、血管および腫瘍浸潤中に周辺組織および細胞外マトリックスを破壊する
酵素である。腫瘍侵入を必要とする。標準的化学療法と抗新脈管形成治療との間
のいくつかの差異は、脈管形成インヒビターが腫瘍細胞よりも分裂中の内皮細胞
を標的するという事実から生じる。抗新脈管形成薬は、標準的な化学療法処置の
特徴である骨髄抑制、胃腸の症状または毛髪の損失を生じないようである。また
、抗新脈管形成薬は、腫瘍を必ずしも殺傷する必要はないがむしろ腫瘍を停止状
態に不定的に抑えるので、初期臨床試験の指標は、標準的な治療のためとは異な
り得る。腫瘍応答についてのみ探すよりも、生存の増加およびまたは疾患進行の
時間を評価することが適切であり得る。
薬物耐性は、化学療法の薬剤での主要な問題である。なぜなら、ほとんどの癌
細胞は、遺伝子的に安定でなく、従って変異しがちであるからである。脈管形成
薬物は、遺伝子的に不安定ではない正常な内皮細胞を標的するので、薬物耐性は
、発生し得ない。これまで、耐性は、可能性のある治療剤候補の長期の動物研究
または臨床試験において主要な問題ではなかった。抗脈管形成治療は、腫瘍細胞
で直接目的とされる治療と組み合わせて有用性を証明し得る。それぞれの治療は
異なる細胞標的において目的とされるので、このような組み合わせ療法は、より
有効であるはずである。癌が慢性疾患になり得るという認識が大きくなっている
。処置が長期である場合、薬物の毒性プロフィール（透明な真骨魚類（例えばゼ
ブラフィッシュ）の胚において容易に試験され得る）は、薬物のスクリーニング
および発展のためにますます重要なパラメーターとなる。
（Ｄ．新脈管形成刺激）
心臓または四肢における虚血組織はＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ（側副血管の局所
成長を刺激する）を分泌するが、虚血組織へ供給される側副血管の天然の形成は
、心血管疾患の患者における血流の完全な復旧のためにはほとんど十分ではない
。外因性の脈管形成薬剤により誘導される新しい血管の成長は、種々の心血管疾
患を有する患者における虚血組織への血流を回復し得る。刺激的な脈管形成治療
はまた、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、鬱血性心不全、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）およ
び末梢静脈疾患（ＰＡＤ）における循環機能の改善のための最小限の侵襲性アプ
ローチを提供する。刺激的な脈管形成治療はまた、移植の受け入れまたは生存を
容易にし得る。脈管形成刺激因子の不利な点としては、潜伏腫瘍の増殖の増悪、
および糖尿病性網膜症の進行が挙げられる。アテローム性動脈硬化症のプラーク
の周囲の側副動脈の成長を誘導するための理想的な脈管形成薬剤は、虚血組織の
局所でのみ機能すべきであるか、または局所的に送達されるべきである。
新脈管形成遺伝子治療は、新しい血管を成長させることにより心臓をそれ自身
のバイパス手術を行うよう策略するために用いられる実験的技術である。ＶＥＧ
Ｆのようなタンパク質（存在する血管から出芽するように新しい血管を助成する
）をコードする遺伝子は、患者の心臓に注射され、そして身体は自身の冠状動脈
バイパスを行う。これらの新しい血管は、再度閉塞される傾向はより少ない。ウ
サギでの予備的な実験において、ウサギの脚の動脈を、結塞し、そしてＶＥＧＦ
遺伝子を、カテーテルおよび小さいバルーンを用いて動脈を並べる平滑筋細胞上
に直接適用した。３〜１０日のうちに、新しい血管が出芽し、そして妨害物周囲
にそれら血管の道を見出ことが観察された。Ｒｉｖａｒｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ ９９（１）：１１１〜１２０（１９９９）。ヒトでの予備的実験におい
て、遺伝子を、左室（心臓のポンプ室）内に直接注射した。これらの研究から今
までの結果は有望である。副作用は存在せず、そして今日まで最悪の結果は生じ
ていない。新しい血管の出芽は、それが生じる場合、４〜６週間後に停止するよ
うである。Ｌｏｓｏｒｄｏら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（２５）：２８０
０〜２８０４（１９９８）。
（Ｅ．ゼブラフィッシュにおける新脈管形成）
ゼブラフィッシュにおいて、他の脊椎動物と同様に、血管は、胚の中胚葉を通
じて広範に分布している前駆細胞（血管芽細胞）から形成する。いくつかの血管
芽細胞は、長い距離を移動し、一方、他のものは、局所的に残存し、血管を形成
する（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。主要血管（大動脈、大静脈、およびいくつか
の器官に指向される血管を含む）は、血管芽細胞の管への局所集合により形成す
ると考えられる（脈管形成：ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ）。図１を参照の
こと。脈管形成に加えて、より小さい脈管は、特定の組織を貫入するように、よ
り大きな脈管から伸長する（新脈管形成：ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｆｏｕ
ｑｕｅｔら、前出）。実験は、血管形成の両経路（新脈管形成および脈管形成）
が、局所シグナルにより駆動されることを示唆する。発生３日目までに、ゼブラ
フィッシュは、主要血管および新芽を含む、インタクトな機能化血管系を発達し
た。このことは、血管位置の一貫したパターンを有する。図２Ａおよび３Ａを参
照のこと。ゼブラフィッシュ胚は、循環系を有することなく少なくとも４〜５日
間生存および発達し得るので、透明なゼブラフィッシュを用いて、インタクトな
生存動物において血管形成の全ての局面に対する種々の薬剤の効果を研究するこ
とが可能である。
（Ｆ．新脈管形成についてのスクリーニングアッセイにおいてゼブラフィッシ
ュを用いる利点）
最近、種々のアッセイは、種々の動物モデルにおける新脈管形成の過程を研究
するために使用される。これらのアッセイは、ウサギまたはマウスの皮膚におい
て透明な窓を調製する工程、腫瘍細胞もしくはキャリアマトリックスを無血管領
域（例えば、角膜）に注入する工程、および既存の血管を構築することにより虚
血を誘導する工程を包含する（Ｊａｉｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１２０３−
１２０８（１９９７））。これらおよび他のアプローチは、新脈管形成の過程に
ついて大量の情報を生成する一方、各アッセイについて要求される組織操作は、
スクリーニングツールとして使用するために不適切とする。（比較アッセイを、
さらに以下に詳述する。）真骨魚類およびゼブラフィッシュは、特に、新脈管形
成についてのインビボでのスクリーニングアッセイに関する有意な利点を提供す
る。上述のように、ゼブラフィッシュは、生成および維持するために比較的高価
でなく、かつ胚は、個々のマイクロタイターウェル中に配置され得、これは、標
準的な液体取り扱い装置を用いる自動化分析を可能にする。
さらに、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）を用いて、薬剤の副作用は、
薬剤の主要な効果と共に同時にモニタリングおよび評価され得る。これは、新脈
管形成活性について化合物をスクリーニングするための方法において有意な利点
を提供する。顕著には、抗新脈管形成剤（例えば、抗癌治療薬）として使用され
得る化合物の同定と関連するのが困難なのは、癌細胞の増殖を阻害するために使
用される化合物の多くがまた、非癌細胞における増殖において有害な効果を有す
ることである。これは、小児に罹患する癌を処置するときに特に問題である。な
ぜなら、それらの器官および組織の多くが、未だ成長中および発達中であるから
である。透明な真骨魚類の胚を用いて、新脈管形成活性に対する薬剤の効果なら
びに任意の毒性効果もしくは副効果が同時にアッセイされ得る。ゼブラフィッシ
ュ細胞および／または胚形成に対する薬剤の副効果または毒性効果は、薬剤の投
与後に、時間間隔でモニタリングされ得る。代表的には、測定は、投与された薬
剤の活性を評価するための測定と同時に実施される。
（Ｇ．新脈管形成スクリーニング方法）
本発明は、一用量の薬剤の真骨魚類への投与に応じて、真骨魚類において薬剤
が新脈管形成活性を増強するか、阻害するか、またはブロックする能力（ａｂｉ
ｌｉｔｙ）もしくは潜在能（ｃａｐａｃｉｔｙ）について薬剤をスクリーニング
する方法を提供する。新脈管形成活性は、薬剤が投与されなかった同時期のおよ
び／または歴史的なコントロール真骨魚類（またはそれらの組織、器官、もしく
は細胞）に比較して評価される。新脈管形成活性は、真骨魚類の血管系の変化で
反映される。血管の形成および発達は、薬剤が投与された真骨魚類およびコント
ロールの真骨魚類において経時的にモニタリングされ得る。正常血管形成の増大
を示す応答は、化合物が新脈管形成を増強または増大することを示唆する。正常
血管形成の減少もしくは低下または以前に確立された既存の血管の死もしくは損
失を示す応答は、化合物が、新脈管形成活性を減少させるか、妨害するか、また
は阻害する（すなわち、抗新脈管形成活性を増強または刺激する）か、あるいは
既存の血管を破壊することを示唆する。新脈管形成活性を示す応答は、真骨魚類
全体または真骨魚類の１つ以上の器官もしくは組織で、同時にまたは別個に検出
され得る。応答は、経時的におよび所定の時間間隔で検出され得る。これらの応
答はまた、真骨魚類の細胞においてインビトロで検出され得る。
本発明の方法は、新脈管形成過程を包含する種々の疾患（癌、冠動脈疾患、鬱
血性心不全、末梢動脈疾患、末梢静脈疾患、神経疾患、心肺疾患、虚血、発達疾
患、自己免疫疾患、ならびに骨および軟骨の疾患を包含する）の治療的処置また
は予防的処置で有効である薬剤を同定することにおいて有用である。一般に、こ
れらの方法は、新脈管形成活性の増大（例えば、血管の形成の増大）または新脈
管形成活性の減少（すなわち、抗新脈管形成活性、血管の形成の減少）から恩恵
を受ける疾患に対する治療的活性について、化合物をスクリーニングすることに
おいて有用である。
１つの局面では、本方法は、脈管形成または新脈管形成の始まる前に化合物が
溶解された培養培地に胚を浸すことにより、真骨魚類の胚に、スクリーニングさ
れるべき化合物を投与する工程を包含する。適切な期間（例えば、２４時間もし
くは４８時間）後に、胚は、固定化され、そして内因性血管マーカー（例えば、
アルカリホスファターゼ（ＡＰ））について染色される。血管の形成の減少また
は増大、および血管の正常パターンの摂動は、例えば、アルカリホスファターゼ
染色、タンパク質の抗体染色、インサイチュハイブリダイゼーション後に光学顕
微鏡によって視覚的に決定され得る。器官または組織機能はまた、酵素活性を測
定することにより決定され得る。
小分子を含む化合物は、代表的には、単なる拡散によって真骨魚類胚を貫入す
る。胎児表皮（外部外胚葉）を貫入しない化合物について、ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）、または他の溶媒もしくは浸透圧ショックが、胎児表皮を一過的
に貫入するために使用され得る。化合物はまた、他の周知の投与方法（摂取また
は胚嚢もしくは真骨魚類胚の心臓のいずれかへの直接的注射を含む）によっても
投与され得る。いったん胚の中に入ると、化合物は、胚内を自由に拡散する。
例えば、新脈管形成活性に対する化合物の効果についてスクリーニングするた
めに、腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）または体節間（ｉｎｔｅｒｓｏｍ
ｉｔｉｃ）の管が代表的には試験される。脈間形成活性に対する化合物の効果を
スクリーニングするために、背側の動脈および腹側の血管が試験される。これら
の血管全ては影響されなかった真骨魚類胚においてとても優勢であり、従って、
血管パターンの変化の理想的な指標として役立つ。特に、これらの血管は、以下
について試験される：１）血管の存在もしくは不在（新脈管形成の阻害を示す）
；２）過剰な分枝（新脈管形成の増強を示す）；および３）血管の形成の構造の
変化（局所的なシグナル伝達事象の変化を示す）。本発明者らの方法において、
ゼブラフィッシュ胚が、使用される。なぜなら、それは、循環系を有さずに、約
４〜５日間生存および発達し得、したがって、インタクトな胚における血管形成
の全ての局面に対する薬剤の効果は、容易に評価され得るからである。
血管パターンの変化は、血管芽細胞および血管成長因子を試験するためにＲＮ
Ａインサイチュハイブリダイゼーション分析、ならびに循環機能および心臓機能
（その全ては、血管形成において役割を有する）を試験するために細血管造影を
実施することにより研究され得る。一例として、スクリーニングされる化合物は
、培養中の胚を含有する培養培地中に化合物を溶解する（脈管形成または新脈管
形成の開始の前に）ことにより、２４時間真骨魚類胚に投与される。さらなる２
４時間後（発生４８時間で）、胚は、形態学的欠陥について事実上検査される。
胚の５０％は、血管芽細胞を同定するために、ｆｌｋ−１プローブを用いるイン
サイチュハイブリダイゼーションのために固定化される。残りの胚は、発生７２
時間で固定化され、ＡＰで染色される。内因性ＡＰの発現に影響し、それによっ
てＡＰ染色を用いることによる血管パターンをアッセイすることを困難にする化
合物が、細血管造影を用いることによりアッセイされ得る。次いで、胚は、血管
の正常パターンにおいて任意の摂動について試験される。
新脈管形成活性はまた、以前に示した標準的な技術（例えば、比色定量、蛍光
顕微鏡（例えば、時間解像フルオロメトリーを含む）、化学発光、デジタル化画
像分析、標準マイクロプレート読み取り技術、応答識別についてのパターン認識
ソフトウェアおよび分析などを含む）によって検出され得る。特定のエピトープ
の抗体染色はまた、真骨魚類組織におけるエピトープの分布および発現における
空間または時間的変化ならびに分子改変を検出するために使用され得る。
（Ｈ．新脈管形成活性および／または毒性活性および／または細胞死活性につ
いての薬剤の同時スクリーニング）
新脈管形成活性または抗新脈管形成活性についての薬剤をスクリーニングする
ための方法は、以下に記載の本発明の他の方法（細胞死活性（セクションＩＩＩ
）または毒性活性（セクションＩＶ）に対する効果について薬剤をスクリーニン
グする方法を含む）と組み合わせられ得る。これらの方法と共に使用される真骨
魚類は、透明であるので、他の活性と合わせて、新脈管形成活性または抗新脈管
形成活性を評価することが可能である。種々の活性を示す応答もまた、互いと合
わせて検出され得る（別々にまたは同時にのいずれかで）。
このような組み合わせ方法は、真骨魚類における薬剤の複数の影響を評価する
ことにおいて有用である。薬剤は、所望の応答（例えば、新脈管形成の増強）お
よび毒性（所望されない）応答の両方を引き起こし得る。薬剤の投与に起因して
、真骨魚類において複数の活性および応答を評価する能力は、可能な治療的化合
物を同定すること、およびそれらの副作用を評価することにおいて特に恩恵を受
ける。例えば、標的化癌細胞に対する抗癌治療薬として使用され得る化合物を同
定することの関連することが困難であることは、つまり、いくつかの化合物もま
た、非癌細胞に対する有害な効果を有し得るということである。例えば、抗新脈
管形成癌療法は、代表的には、このような細胞の血液供給を遮断することにより
、癌細胞においてアポトーシスを誘導しようとする。このタイプの処置レジメは
、腫瘍の血管新生を予防するかまたは減少させる手段として血管芽細胞において
アポトーシスを誘導するように設計され得る。処置の間、平衡は、無視し得る程
度のレベルの細胞死が体内の他の組織または位置で（例えば、心臓）誘導される
ように達成されなければならない。このような望ましくない異所性細胞死は毒性
活性であるとみなされ得る。薬剤の新脈管形成、細胞死、および毒性活性を評価
するための組み合わせスクリーニングが、他の場所でアポトーシスを誘導する薬
剤から心臓を防御する薬剤を同定することにおいて有用である。他を促進するこ
となく１つの活性を促進するのに有効な薬剤の用量レベルもまた確かめられ得る
。このような組み合わせスクリーンもまた、代表的には、損傷組織または移植組
織において細胞死を予防する治療目標を有する前新脈管形成療法について薬剤を
同定し、そして評価することにおいて有用である。
複数の活性／応答は、真骨魚類全体において、または真骨魚類の１つ以上の組
織もしくは器官においてモニタリングされ得る。このような活性および応答は、
経時的に、および所定の時間間隔でモニタリングされ得る。種々の技術は、一緒
にまたは別個に用いられて、複数の活性および応答を分析し得る。このような技
術としては、例えば、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、デジタル化画像解析、標準マイ
クロプレート読み取り技術（比色定量、蛍光光度法（例えば、時間解像蛍光光度
法を含む）、および化学発光）、インサイチュハイブリダイゼーション、特異的
タンパク質の抗体染色、動物内で時間的および空間的に分布されたタンパク質の
変化、真骨魚類全体において、または真骨魚類の組織、器官もしくは細胞におけ
る酵素活性のレベルの変化などが挙げられる。さらに、応答は、パターン認識ソ
フトウェアを用いることにより識別され、かつ／または分析され得る。
１つの局面では、本発明は、上記のように新脈管形成活性の増大または減少に
ついて薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法には、毒性活性の増
大または減少を示す、真骨魚類における応答を検出することにより毒性の増大ま
たは減少について薬剤をスクリーニングする工程をさらに包含する。このような
方法は、例えば、化合物の治療価に対する反対指標を同定することにおいて、有
用である。
別の局面では、本発明は、上記のように、新脈管形成活性の増大または減少に
ついて薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、細胞死活性の増
強または阻害を示す、真骨魚類における応答を検出することにより細胞死活性を
増強または阻害する能力について薬剤をスクリーニングする工程をさらに包含す
る。このような方法は、例えば、化合物の治療価に対する反対指標を同定するこ
とにおいて、有用である。このような組み合わせのスクリーニングはまた、他に
アポトーシスを誘導する循環剤から心臓を防御する薬剤の同定を可能にする。
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュにおける新脈管形成活性についての化合物のスクリー
ニング）
（Ａ．材料および方法）
１）胚収集
ゼブラフィッシュ胚を、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出（これは、全ての目的
のために、その全体を本明細書中に参考として援用される）に記載のように、天
然対交配によって生成した。４〜５のゼブラフィッシュ対を、各交配のために設
定した；１つの対あたり平均して１００〜１５０の胚が生成された。胚を収集し
、生存度について分別される前に、基準として形態学的および発生的の両方の期
を用いて、５ｇのＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ Ｓａｌｔと、３ｇの硫酸カルシ
ウムとを２５リットルの蒸留水中で２７℃でおよそ２０時間（２１体節期）組み
合わせることによって調製した卵培養培地に置く。次いで、健常胚を、室温で５
分間、１ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏ．）
を用いる酵素消化によって脱絨毛膜処理した。次いで、この胚を胚水（ｅｍｂｒ
ｙｏ ｗａｔｅｒ）中で５回洗浄した。魚胚は、付随の卵黄嚢から栄養を受容す
るので、さらなる維持は必要ではなかった。
２）スクリーニングされた化合物
以下の２つの供給源由来の化合物を、新脈管形成活性を増強するかまたは阻害
する能力または潜在能についてスクリーニングした：ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ、ＭａｒｙｌａｎｄおよびＴｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＩＴ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａ
ｃｈｕｓｅｔｔｓ。
ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙは、１００，０００より多くの独特の化合物構造からな
る；現在、１２，０００のみがスクリーニングのために利用可能である。
ＭＩＴから得られる化合物は、１１のフマギリン誘導体からなった。これは、
ＴＮＰ４７０（Ｔｕｒｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１６３−
１１６９（１９９８））およびＡＧＭ−１４７０を含む。フマギリンは、強力な
抗新脈管形成効果および毒性効果を伴う真菌から単離された天然産物である。Ａ
ＧＭ−１４７０および他のフマギリン誘導体は、新脈管形成インヒビターである
。これは、正常であるが形質転換されていない内皮細胞の細胞周期のＧ１期への
進入を、２型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ２）を結合させること
により防ぐ。この誘導体を、２０ｍＭの開始濃度で供給した。サンプルをジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で１０ｍ
Ｍのストック濃度に希釈した。
ＮＣＩからの化合物を、ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏ
ｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙから無作為に選択した。化合物
は、９６マイクロプレートアレイ中にＮＣＩから供給された。この各々には、Ｄ
ＭＳＯ中１０ｍＭの開始濃度であった。化合物供給源、活性、化学構造、または
作用機構に関する具体的な情報は得られなかった。
３）化合物の投与
魚における血管形成に対する化合物の効果を決定するために、化合物を魚胚を
含む培養培地溶液に直接的に（例えば、魚胚を含む個々のマイクロウェルに）添
加した。化合物を、魚胚の発生１２時間または２４時間の時に培地溶液に添加し
た。これは、新脈管形成血管がｆｌｋ−１インサイチュハイブリダイゼーション
プローブを用いてまず同定され得る時点以前である。Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。
６ウェル、２４ウェル、または９６ウェルのプレート中でアッセイを実施した。
このようなプレートは、化学的適用および続く分析（用量応答を含む）および続
く分析の自動化を容易にした。
４）可視スクリーニング
魚胚に化合物を投与した後、この胚を個々のマイクロウェル中に２８℃で発生
３日目まで維持した。化合物を魚胚が培養された培地に添加した２４時間および
４８時間後に、胚を、生存度、巨視的な形態学的欠陥、心拍数、および循環につ
いて可視検査した（表１を参照のこと）。循環を、各胚を通じて血管細胞の動き
に従うことによりアッセイした。
５）血管染色
発生３日目に、胚をアルカリホスファターゼ染色について収集した。詳細には
、胚を４％パラホルムアルデヒド中に固定化し、そして内因性アルカリホスファ
ターゼ活性について染色した。胚を、２時間、室温で固定化した。次いで、胚を
、２回、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ（ＰＢＴ）を有するリン酸緩衝化生理食塩水中２５％、５０％、７５％
、および１００％メタノール中に浸漬して脱水し、胚を透過処理した。次いで、
この胚を、再水和し、１００％ＰＢＴ中で洗浄した。染色のために、胚を、ＮＴ
ＭＴ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５；５０ｍＭ ＭｇＣｌ；
０．１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温で平衡化した。胚が平
衡に達した後、１ｍｌ当たり、４．５μｌの７５ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラ
ゾリウム（ＮＢＴ）および３．５μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ホスフェート（ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加することにより胚を染色した。１０分間染色した後、
魚胚中の全ての血管を標識化した（例えば、図２Ａ−２Ｃ、３Ａ〜３Ｂ、４、７
を参照のこと）。染色反応を、ＰＢＳＴを添加することにより停止した。次いで
、胚を立体解剖顕微鏡で試験した。このタイプのアッセイについてゼブラフィッ
シュを使用する１つの利点は、胚嚢の上に位置する腸管下血管は、血管形成に影
響する因子に対して感受性であり、かつこの方法により容易にアッセイされる（
例えば、図７を参照のこと）ことである。腸管下血管は、発生４８時間までゼブ
ラフィッシュ胚の胚嚢の背外側表面に通常存在する。それらは、胚嚢上の体節の
腹側縁から５０〜１００μｍ伸長する明確なバスケット形状を形成する。発生７
２時間（腸管下血管が正常に出現した２４時間後）の腸管下血管をアッセイする
ことにより、血管形成の時期における通常の変化は避けられた。染色手順は、市
販の装置を用いて容易に自動化される。
６）真骨魚類の漂白
所望であれば、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ胚）は、アルカリホスフ
ァターゼ染色の前または後に漂白され得る。漂白は、真骨魚類からメラニン色素
を除去し、１−フェニル−２−チオ尿素（ＰＴＵ）処理の有害な効果を生じさせ
ることなく真骨魚類のスクリーニングを可能にする。染色後漂白はまた、バック
グラウンド染色と関連した細胞外染色を除去する。漂白は、いくつかの細胞の色
素除去によって、処置された真骨魚類の化合物に対する応答の可視化および分析
を有効に増強する。漂白は、毒性、新脈管形成、および細胞死活性を示す応答の
可視検出を増強する。
ゼブラフィッシュを漂白するために、室温で１０分間、５％ホルムアミド、１
×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、および１０％過酸化水素中に魚を浸漬
した。
７）インサイチュハイブリダイゼーション
可視スクリーニングの実施に加えて、真骨魚類組織における特定の分子変化は
、ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションまたは特定のタンパク質の抗体
染色により検出され得る。ＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションは、ゼ
ブラフィッシュにおける慣用的な分子アプローチである（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌ
ｄ、前出）。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのジゴキシゲニン標
識化キットは、ＲＮＡプローブを標識化するために使用され得る。ホールマウン
トインサイチュハイブリダイゼーションは、以下のように実施され得る：胚をＰ
ＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定化し、プロテイナーゼＫでわずかに消化
し、そしてインサイチュハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ、５０μｇ／ｍｌヘパリン、５００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、９２μｌの
１Ｍクエン酸、ｐＨ６．０、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中１μｇのプロー
ブと６５℃でハイブリダイズさせた。アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲ
ニン抗体を用いてシグナルを検出する。内因性アルカリホスファターゼからのバ
ックグラウンド染色は、問題を提起しない。なぜなら、内因性アルカリホスファ
ターゼは、インサイチュハイブリダイゼーション手順で残存しないからである。
ＮＢＴ／Ｘ−ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で染
色した後、胚を１００％メタノール中で漂白し、４％パラホルムアルデヒド中で
固定化し、そしてＰＢＳ中に保存した。マルチプルインサイチュハイブリダイゼ
ーションは、マルチウェルディッシュ中で異なる真骨魚類において同時に実施さ
れ得る。
８）新脈管形成についてのさらなるアッセイ
血管パターンの任意の変化が血管芽細胞の阻害または刺激に起因するか否かを
決定するために、公知の血管芽細胞マーカーｆｌｋ−１、ｔｉｅ、ｔｅｋ、およ
びｆｌｉにおけるＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション分析（Ｄｕｍｏｎ
ｔら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０３：８０−９２（１９９５）；Ｌｉａｏら、Ｄｅｖ
．（補遺）１２４：３８１−３８９（１９９６）；Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）は
、上記で概要を述べた手順を使用して実施され得る。Ｆｌｋ−１（図８）、ｔｉ
ｅ、およびｔｅｋは、レセプターチロシンキナーゼであり、これは、発生初期で
血管芽細胞を標識する。ｆｌｉは、それらを後期段階で標識する転写因子である
。ｆｌｋ−１、ｔｉｅ、ｔｅｋ、およびｆｌｉは、脊椎動物における血管芽細胞
発生の間に連続して出現する（Ｄｕｍｏｎｔら、前出）ので、これらの分子の存
在または不在についてアッセイすることは、血管芽細胞が影響しているかどうか
だけでなく、それらが影響された発生期もまた決定することを可能にする。
インタクトな真骨魚類内で空間的および時間的両方のタンパク質の分布の変化
（タンパク質の完全な不在を含む）が検出され得る。例えば、血管内皮成長因子
（ＶＥＧＦ）のパターンの変化は、標準的な抗体染色手順（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅ
ｌｄ、前出）または上記のインサイチュハイブリダイゼーション技術（Ｗｅｓｔ
ｅｒｆｉｅｌｄ、前出もまた参照のこと）を使用して試験され得る。ＶＥＧＦは
、血管発達において２つの法則を有すると考えられる：１）化学誘引性または誘
導の法則；および２）維持の法則（Ｄｕｍｏｎｔら、前出）。従って、ＶＥＧＦ
発現に影響する化学物質は、特に興味深い。上記は、周知の分子マーカーの例で
ある；他の分子マーカーもまた利用され得る。
９）機能アッセイ
血管構築の変化に加えて、血管機能（循環および心拍数）は、化合物によって
影響され得る。ゼブラフィッシュに投与された化合物が血管機能（例えば、心拍
数および循環）に影響するか否かを決定するために、ゼブラフィッシュ胚の心拍
数および循環を研究する。この場合、心拍は、心拍数／分を計数することにより
評価した。循環を、心臓および主要血管を通じた血液細胞の動きについて解剖顕
微鏡下でゼブラフィッシュ胚を試験することにより評価した。ゼブラフィッシュ
胚をまた、胚嚢（心臓を通る血流の乏しい指標）および胚の体内（漏洩血管の指
標）における血液プール化について試験した。化合物が血液細胞発生に影響する
ことが観察されたいくつかの胚において、微小血管造影を、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ
ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１１４３−１１４７（１９９５）に概要を述べ
た手順を使用して実施し、血管漏洩および閉塞（これらは、血管の形成および維
持の変化を引き起こし得る）について血管系の完全性を試験した。胚をトリカイ
ンで麻酔して心臓を停止させ、マイクロピペットを心臓に挿入し、そして蛍光ビ
ーズを注入した。次いで、トリカインを洗い流し、心臓の鼓動を再開させた。次
いで、蛍光ビーズの流れを、表面蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微
鏡を用いて観察し、そしてコンピューターに取り付けた微光レベルカメラを用い
て記録した（図９）。このアプローチは、血管系の完全性の試験および心臓の状
態に対する化学物質の効果の評価を可能にする。
（Ｂ．結果）
（（１）標的組織および器官への化合物の送達のためのパラメーターの決定）
（（ａ）胚発生期）
本発明者らの最初の研究おいて、本発明者らは、アッセイのためにゼブラフィ
ッシュの１２時間の胚（６体節期）を使用し、そして発生の１２時間目でアッセ
イを始めた。この時点は、血管芽細胞形成の開始の直前であるため（Ｆｏｕｑｕ
ｅｔら、前出）好都合であるが、いくつかの不都合が存在する。これらの最も有
意な点は、１２時間の発生で、ゼブラフィッシュ胚の多くの構造（脊索、体節、
および心臓を含む）が、形成を開始する点である。これらの構造は、脈管形成お
よび新脈管形成の両方に直接影響するので、血管形成において観察された化合物
の効果が一次（血管に対する直接効果）または二次（他の組織に対する損傷に起
因する関節効果）であるか否かを決定することは困難である。
この問題を回避するために、本発明者らは、２２時間の発生（２６体節期）で
アッセイを開始した。この発生の期にて、背面大動脈および腹側静脈は前方に存
在するが、ゼブラフィッシュ胚の後方領域には存在しない。このことは、同じ胚
において独立して、脈管形成および新脈管形成の両方の実験を可能にする。脈管
形成について、本発明者らは、尾のほとんどの後方領域における背面大動脈およ
び腹側静脈の存在について、胚を実験した。新脈管形成について、本発明者らは
、新芽血管（腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）および体節内血管を含む）
の存在について、胚を実験した。腸管下血管は、３６時間の発生で形成を開始す
る；それゆえ、２２時間の時点の使用は、化合物投与と脈管形成性の血管形成と
の間の時間を減少する。このことは、培養条件下で不安定な化合物についての重
要な考察である。
（（ｂ）胚の維持）
最初の実験を、６ウェル培養ディッシュ中の３５ｍｍウェルで、１ウェルあた
り５０のゼブラフィッシュ胚を用いて、５ｍｌの胚水中で行った。このアプロー
チを行う間、多数の欠点が存在した。この欠点としては以下が挙げられる：１）
比較的多量の化合物を使用して胚に投薬しなければならない；２）同時にスクリ
ーニングし得る化合物の数は制限される；および３）ディッシュ中には複数の胚
が存在するので、死胚が生胚を汚染し得る。
これらの欠点を回避するために、本発明者らは、２つの別の形式（９６ウェル
プレートおよび２４ウェルプレート）を実験した。予備観察は、単一のゼブラフ
ィッシュ胚は、５日までに、５０〜１００μｌの胚水中で生存し得、そして正常
に発生し得ることを示した。それゆえ、本発明者らは、２２時間の胚を回収し、
脱絨毛膜化（ｄｅｃｈｏｒｉｎａｔｅ）し、そして以下のいずれかに選別した：
１）１００μｌにつき１ウェルあたり１つの胚を含む９６ウェルプレート；また
は２）５００μｌ胚水中につき５つの胚を含む２４ウェルプレート。この胚を、
実験の前に７２時間発生させた。この胚を、大きさ、形態、および運動によって
評価した。マイクロウェルプレートで増加する胚と、大きな容器で増加するコン
トロール胚との間に自明な差異は観察されなかった。この胚を固定し、そして内
在のアルカリホスファターゼについて染色して、血管形成を実験した。実験胚に
おける染色パターンは、コントロールで観察されたパターンと同一であった。手
動スクリーニングのために、本発明者らは、２４ウェル型を選択し、そして以下
に記載する全ての実験のためにそれを使用した。
（（ｃ）化合物送達）
化合物をスクリーニングするためのパラメーターを最適化するために、本発明
者らは、ＭＩＴから得た１１のフマギリン誘導体およびＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎライブラリーから得
た１０のランダムな化合物を使用して一連の実験を行った。本発明者らは、本発
明者らの予備調査から、フマギリンがゼブラフィッシュにおける脈管形成を阻害
することを知っていた；従って、本発明者らは、これらの化合物を、アッセイを
検証するためのポジティブコントロールとして使用することを決定した。本発明
者らはまた、ＮＣＩからの１０の化合物を使用して、確立したパラメーターが他
の型の化合物に適切であることを検証した。一般的には、本発明者らは、低分子
が、胚の中へ、および発生の最初の２〜３日の胚を囲む絨毛膜を介して、自由に
拡散することを予測した。しかし、潜在的な問題を回避するために、本発明者ら
は、酵素消化によって絨毛膜を取り除いた。このアプローチは十分確立されてお
り、そして適切に行われる場合、この手順は、胚に有害な影響を与えなかった。

（（ｄ）化合物濃度）
化合物の効果についての一次スクリーニングの場合、本発明者らは、３つの異
なる濃度で各化合物を試験して、どの濃度がほとんどの情報を提供するかを決定
した。試験した濃度は、１００μＭ、１０μＭ、および１μＭであった。結果を
表１に要約する。これらの実験のために、本発明者らは、５０μＭの１０ｍＭス
トック溶液を５ｍｌの胚水に添加して、１％ＤＭＳＯ中１００μＭ溶液を生成し
た。後の濃度を、胚水中１：１０および１：１００希釈で生成した；各濃度につ
いて、ＤＭＳＯを合計溶液の１％まで添加した。コントロール溶液は、胚水中１
％ＤＭＳＯからなる。１０胚／化合物／濃度を試験した。試験した２１の化合物
のうちの１５（１１／１１ ＭＩＴ、４／１０ ＮＣＩ）は、１００μＭ濃度で
致死であった。１０μＭ濃度では、フマギリン誘導体の７／１１は、新脈管形成
阻害効果を有した。しかし、１０μＭで致死であるフマギリン誘導体は存在しな
かったが、その全てが胚の増殖において有害な効果を有した（図２Ａ）。このこ
とは、フマギリン誘導体の標的がメチオニンアミノペプターゼ（２型）（これは
、真核生物細胞において細胞周期制御に、ある役割を果たす）であることを示す
、以前に公開された結果（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃ
ｏｌ．６：３９０−３９６（１９９６）；Ｋｒｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅ
ｓ．１０：９８６−９９３（１９９８））と一致する。
フマギリン誘導体とは対照的に、１０μＭで、ＮＣＩ化合物は、血管形成にお
いて観察可能な効果を有さなかった。しかし、１０のＮＣＩ化合物のうちの１つ
は、この濃度で致死であり、そして１０の化合物のうち２つは、胚において色の
変化を生じた。色の変化は、化合物の色を利用することに単に制限されなかった
；１つのＮＣＩ化合物は、メラノサイトを紫色に変える原因となった。フマギリ
ン誘導体を用いた場合、９の全ての非致死性ＮＣＩ化合物はわずかに発生遅延を
生じる。なぜなら、約１２時間までに形態学的判断基準によって明らかな胚は、
発生において遅延するからである。１μＭでは、２０／２１の化合物が発生遅延
を生じ、そして１／２１の化合物が致死であった。これらの結果は、培地に添加
した化合物が、ゼブラフィッシュ胚に入って効果を誘導し得ることを、きわめて
明確に示す。
（（ｅ）ＤＭＳＯの使用）
上記の実験条件に伴う１つの問題は、胚水中１％ＤＭＳＯに維持されるコント
ロール胚もまたわずかな発生遅延を示し、これは全ての濃度のＮＣＩ化合物およ
び１μＭ濃度のフマギリン誘導体について観察されたことと類似することであっ
た。本発明者らは、０．１％ＤＭＳＯ中それぞれ１０μＭおよび１μＭ濃度の化
合物を使用する実験を繰り返した。この結果は表１と同一であったが、１０μＭ
濃度のフマギリン誘導体を除く全ての化合物についての発生遅延が排除されたこ
とは除く。これらの実験を行った後、本発明者らは、０．１％ＤＭＳＯを含む１
０μＭ濃度を使用することを決定した。この結果は、比較的高濃度で、ＤＭＳＯ
が、発生中のゼブラフィッシュに何らかの効果を有することを示した。ＤＭＳＯ
は低濃度では発生中のゼブラフィッシュに全く効果が無いようであるが、本発明
者らは、相乗効果が生じ得ることを承知している。不運なことに、スクリーニン
グに利用可能な多くの化合物は、ＤＭＳＯまたは類似の溶媒にのみ可溶性であっ
た。任意の一次スクリーニングを用いる場合、ポジティブな結果は、さらなる検
証および精査を必要とする。
（（２）血管形成における化合物の効果の評価）
基本的なアッセイパラメーターを確立した後に、本発明者らは、ＭＩＴ（１１
の化合物）およびＮＣＩ（１９０の化合物）から受け取った化合物を、血管形成
（新脈管形成および脈管形成）における効果についてスクリーニングした。胚を
、２０時間の発生で収集し、そして脱絨毛膜化した。２２時間の発生で、この胚
を、５００μｌの胚水につき１ウェルあたり５つの胚を含むように、２４ウェル
プレートに選別した。ＭＩＴおよびＮＣＩからの化合物を、１０μＭの濃度で添
加した。各化合物について、３セットの胚（合計１５）をスクリーニングした。
便宜上、各セットを、別々のマルチウェルプレートに維持した。このことは、１
プレートあたり１セットのコントロールを含む２３の化合物／プレートの試験を
可能にした。７２時間の発生で、胚を、総形態学的欠損および心機能について、
解剖顕微鏡を用いて視覚的にスクリーニングした。視覚的スクリーニング後、血
管構築を分析するために、胚を固定し、そして内在のアルカリホスファターゼ活
性について染色した。実験結果を表２に示し、そして以下に記載する。

（（ａ）血管変化）
血管形成をアッセイするために、胚を固定し、そして染色し、そしてその血管
を上記のように計数した。腸管下血管は、胚の両側の卵黄の背側表面で、卵黄を
越えて体節の腹側縁から５０〜１００μｍ伸長するバスケットの形状で形成する
。このスクリーニングについて、抗脈管形成効果を、これらの血管の完全な不在
かまたはバスケットの外側もしくは背側腹面血管のいずれかの欠失かのいずれか
として規定した（図２Ｂ〜２Ｃ、３Ｂ、４）。脈管形成効果を、このスクリーニ
ングのために、体節から１５０μｍを超えるバスケットの拡張として規定した。
このことは、バスケット全体の大きさの増加および／またはバスケットからの投
影の両方を含む（図６Ａ、６Ｃ、６Ｄ）。全体のバスケットの大きさＳに加えて
、本発明者らはまた、血管血管の直径の増加も探索した。通常血管は直径で１０
μｍ未満である。胚もまた、大きな血管（背側肺動脈および腹側静脈を含む）に
おける総変化についてスクリーニングした。
試験した２４１の化合物のうちの２５は（ＭＩＴからの７／１１およびＮＣＩ
からの１８／１９０）は、何らかの抗脈管形成効果を生じた（表３）。これらの
うちの２３／２５は、種々の程度の発生遅延と関連した；より重篤でより劇的な
遅延は、血管形成における減少であった（図２Ａ〜２Ｂ）。血管形成における減
少または欠失を生じた２つの他の化合物のうちの１つは、胚軸の切断と関連した
（図４）。身体中心部の欠損は一般的に、腸管下血管の欠失を生じず、このこと
は、血管効果を軸線効果から区別し得ることを示唆する。試験された化合物の１
つだけが、血管形成において特定の効果を示した。この化合物を用いると、胚に
おいて観察可能な効果を伴わない、腸管下血管の欠失が存在した（図２Ｂ）。

脈管形成効果を生じた８／２５の化合物を用いて、本発明者らは、大きな血管
が尾に適切に局在し損なうようであることを観察した。本発明者らは、重篤な発
生遅延を誘導する化合物を用いて、この効果のみを観察した。大動脈および腹側
静脈が適切に局在し損なうことは二次効果であり得るようである。変わったとこ
ろでは、スクリーニングした化合物で、腸管下血管のサイズまたはこの血管の直
径のいずれかの増加によってアッセイしたような血管形成の増加を生じる化合物
はなかった。
腸管下血管の欠失が血管芽細胞の欠失に起因するか否かを決定するために、本
発明者らは、血管形成の減少を生じることが以前に示されている化合物で処理し
た胚で、インサイチュ分析を行った。本発明者らは、ｆｌｋ−１に対するプロー
ブを使用した。これは、脈管形成性の血管形成において中心的な役割を果たすこ
とが示されているレセプターチロシンキナーゼである（Ｈａｎａｈａｎ、前出）
。Ｆｌｋ−１は、ゼブラフィッシュ胚の血管芽細胞のための最初期のマーカーで
あることが示されている（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。通常は、ｆｌｋ−１は、
新規に形成される血管における発生を通じて高度に発現され、そしてその形成後
に大きな血管において低レベルで発現される。脈管形成性血管の非存在下では、
本発明者らは、体節および腸管下領域においてｆｌｋ−１の発現が見られること
を期待しない；それゆえ、本発明者らは、大きな血管におけるｆｌｋ−１発現に
焦点を合わせた。
胚を、４８時間の発生で収集した（化合物の添加後２４時間）。なぜなら、Ｆ
ｌｋ−１は、この段階にて大きな血管でさらに高度に発現されるからである。腸
管下血管において減少を生じた１８のＮＣＩ化合物の内の１７について、ｆｌｋ
−１染色のパターンは、４８時間の発生で正常であることを明らかにした。詳細
には、ｆｌｋ−１染色は、背側大動脈および腹側静脈ならびに心臓の血管に存在
した。しかし、体節間空間または卵黄の背側表面のいずれかでは染色されなかっ
た；このことは、これらの血管が形成しなかったことから予測されていた。ある
化合物は、尾の大きな血管でｆｌｋ−１染色の欠失を生じたが、頭部では生じな
かった。この化合物はまた、胚の切断、尾の菲薄化および心臓形成異常を生じた
（図５）。おそらく、ｆｌｋ−１染色の欠失は、特定の抗脈管形成効果よりもむ
しろ、より全体的な欠陥の一部である。
（（ｂ）発生遅延）
多数の欠陥は胚の大きさおよび形状の変化を含んだので、形態学的欠陥と発生
遅延との間を区別するために、本発明者らは３つの別個のパラメーターを使用し
た。通常は、ゼブラフィッシュ胚を、卵黄球上の頭部、胚の長さ、および形成中
のメラノサイトの位置によって段階付ける。本発明者らの第４の判定基準の場合
、本発明者らは、ひれの大きさおよび形状を使用して、胚の段階付けを補助する
。このスクリーニングのために、発生遅延を、同じマルチウェルプレート上のコ
ントロール胚よりも、少なくとも１２時間遅いとして規定した。以前に注記した
ように、全てのフマギリン誘導体は、少なくとも２４時間の実質的な発生遅延を
生じた（図２Ａ〜２Ｃ）。このことは、おそらく、これらの化合物の標的が細胞
周期調節タンパク質であるからである（Ｔｕｒｋら、前出）。発生遅延はまた、
ＮＣＩからの１９０の低分子化合物のうちの１６（８．５％）で観察された。発
生遅延が観察された全ての場合において、血管構築における変化は、発生遅延と
一致した（図２Ａ〜２Ｃ）。増殖および成長に影響する化合物はまた、脈管形成
性の血管形成（これは、新たな血管を形成するために細胞増殖を必要とする）に
影響するようである。これらの１６の化合物のうち８つはまた、尾の大きな血管
の組織崩壊であるようであるものを生じた。
（（ｃ）身体中心部の欠損）
３つの代表的な型の身体中心部の欠損が存在した：１）上方または下方のいず
れかの軸線の屈曲（ＮＣＩ３／６、ＭＩＴ３／３）；２）軸線の短縮（ＮＣＩ２
／６）；および３）脊索の小気泡化（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）（図５）（ＮＣＩ２／
６）。腸管下血管の減少は、身体中心部の欠損を生じる化合物の１つのみで観察
された（図４）。
（（ｄ）頭側欠損）
頭側欠損を、中枢神経系（ＣＮＳ）形態学の破壊（通常は、中脳／菱脳境界で
）またはＣＮＳの脳室における細胞片の存在のいずれかとして規定された。１９
０のＮＣＩ化合物のうちの７つは、頭側欠損を生じた；しかし、腸管下血管また
は尾の大きな血管に影響したものはなかった。
（（ｅ）毒性）
この特異的実験のために、本発明者らは、７２時間の発生による全体の胚死亡
率として毒性を規定した。以前に確立したアッセイパラメータを使用して、本発
明者らは、１０μＭ濃度の化合物が毒性を誘導しないようであることを予測した
。それゆえ、本発明者らは、試験した化合物のわずか５％（ＮＣＩの６．８％、
１３／１９０）が致死であったことには驚かなかった。１３の致死化合物のうち
の８つは、適用の２４時間以内に胚を殺傷した。残りの５つの化合物は、２４時
間以内に局在した細胞死を生じ（尾で４つおよび頭部で１つ）、そして７２時間
の発生までに全体の胚の致死を生じた。より低濃度で、これらの化合物は、毒性
を生じずに新脈管形成に影響し得る；しかし、このことは、毒性効果がきわめて
全体的なので、見込みがありそうにない。
（（３）血管機能における効果のアッセイ）
（（ａ）循環／心臓速度欠損）
発生遅延および身体中心部の欠損を生じる多数の化合物が存在し、これはまた
、心臓において構造変化を引き起こした。一般的には、これらの効果は、心臓の
未発生（ｕｎｄｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）と一致した。機能を評価するため
に、本発明者らは、本発明者らの分析を胚に制限した。ここで、心房および心室
の存在ならびに心拍によって規定されるように、心臓は比較的正常であるようで
ある。６／１９０のＮＣＩ化合物は、心臓の心拍速度の減少を生じた。このスク
リーニングについて、減少した心拍速度を、コントロールの速度の５０％以下と
して規定した。生物学的要因および環境要因は、心拍速度において自然な変化を
引き起こすので、正常な心拍速度は、各プレートについて、コントロールウェル
中の１０の胚の平均心拍速度として得た。これを、実験ウェル中の胚の平均心拍
速度と比較した。３／６の化合物において、卵黄にわたる心膜浮腫および血液の
プール化は、減少した速度を達成した。心膜浮腫が明らかであるにも関わらず、
血球が主要な血管を通じて移動した。これらの化合物のうちの３つ全ての化合物
が、脈管形成性血管における減少と関連して発生遅延を生じた；詳細には、腸管
下血管が非存在であった。残りの３つの化合物は、減少した心拍速度以外の観察
可能な効果は有さなかった。
試験した非致死性化合物のうちで、血球の数の観察可能な減少を生じたものは
なかった；従って、血球の血管を通じる移動を観察することによって循環をアッ
セイすることが可能である。心拍速度の評価を用いる場合、構造的に正常な心臓
を有する胚のみを分析した。なぜなら、奇形の心臓または未発達の心臓は、通常
は血液をくみ上げ得ない。化合物のうちで、血流の不足、血液プール化、または
漏出性血管によって評価されるような循環に影響するようである化合物はない。
循環を、血球の胚を通じる流れを観察することによって評価した。この研究に
おいて試験した２１２の化合物のうちで、血球の形成に影響したものはなかった
；それゆえ、任意の細血管造影を行って循環をアッセイすることは必要なかった
。しかし、これは全ての化合物についての場合でなないようなので、細血管造影
技術は、代表的には、スクリーニング方法の一部として包含される。細血管造影
を、３日の発生でのゼブラフィッシュ胚における本発明者らの最初の研究の一部
として行った。細血管造影は、ゼブラフィッシュ胚の正常な血管パターン（頭側
血管、体節間血管、および腸管下血管を含む）を示す。図９を参照のこと。
（Ｃ．考察）
上記の結果は、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）は、血管形成における
効果について低分子（例えば、化学化合物）をスクリーニングするための生モデ
ルであることを実証する。このような低分子は、胚に拡散するだけでなく、血管
形成において特異的で観察可能な効果も誘導し得る。
（（１）真骨魚類胚への小化合物の拡散）
実験の前の１つの主要な関心は、異なる型の低分子が、媒体への添加後にゼブ
ラフィッシュ胚に拡散するか否かであった。本発明者らの最初の研究は、フマギ
リンおよびオビシリン（ｏｖｉｃｉｌｌｉｎ）が、ゼブラフィッシュ胚に拡散し
得ることを実証した。しかし、これらの化合物は、培養中の細胞に拡散する能力
のために同定された天然の産物である。スクリーニングした２０１の低分子化合
物のうちの８１は、ゼブラフィッシュ胚において何らかの観察可能な効果を有し
た。（ＮＣＩからの７０／１９０の化合物（色変化を生じた２３の化合物を含む
（データは示さず））および１１／１１のフマギリン誘導体）。これらの結果は
、低分子が拡散によって胚に侵入するという本発明者らの初めの仮説が正しいこ
とを示唆する。
（（２）全胚スクリーニングの利点）
アッセイのために全真骨魚類胚を使用する１つの有意な利点は、複数の標的に
おける効果を同時に同定する能力である。本発明者らの最初のセットの実験にお
いて、本発明者らは、さらなる標的を、さらなる染色を用いずに可視化し得る事
象に制限した。発生遅延は、これらのパラメーターのうちの最も有用なものであ
った。細胞培養アッセイとは異なり、全胚アッセイを用いると、本発明者らは、
１１のＭＩＴ化合物が、細胞増殖効果（これは、抗脈管形成性効果と同じであっ
ても同じでなくてもよい）を生成するようであるものを生じることを観察し得た
。このことは、２型メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ２）（Ｔｕｒｋ
ら、前出）または関連する細胞周期タンパク質の結合に起因し得る。
本発明者らはまた、他の化合物を用いて多数の他の効果を観察した。６つの化
合物を用いて、本発明者らは、目視検査による生胚の心拍速度における効果を観
察した。心臓は初期の胚において非常に顕著であるので、目視検査によって遅い
心拍速度対正常な心拍速度を観察することが可能であった。この観察された効果
についての２つの可能な機構は以下である：１）化合物が、正常な心拍に必要な
伝導機構が存在しない方法で心臓の発生に影響し得る；または２）化合物が、β
ブロッカーと類似の様式で伝導機構を直接拮抗する（ＲｅｉｔｅｒおよびＲｅｉ
ｆｆｅｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８２（４Ａ）：９−１９（１９９８））
。本発明者らはまた、７／２０１の化合物において頭側欠損、および９／２０１
の化合物において身体中心部の欠損を記録し得た。続く研究（以下に記載する）
において、本発明者らは、特異的抗体および染色技術を使用して、他の器官（肝
臓および腎臓を含む）における化合物の効果を分析して、脈管形成性化合物の有
害効果を決定した。肝臓および腎臓は、高度に血管化される；結果として、これ
らの器官は、血管形成における有害効果について化合物をスクリーニングするた
めの潜在的な標的を提示する。
（（３）抗脈管形成性効果についてのスクリーニング）
抗脈管形成性効果についての本発明者らの最初のセットのスクリーニング実験
において、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚における血管形成の際のフマギリ
ン（天然の抗新脈管形成化学物質）の効果を実験した。この化合物を、魚培養媒
体に添加することによって投与した。この化合物は、新脈管形成において減少を
生じ、このことは、腸管下および体節間血管の減少によって示された（例えば、
図７を参照のこと）。しかし、各化合物はまた、胚において深刻な合併症（心膜
浮腫、発生遅延、および身体中心の欠損を含む）を生じた。これらの実験は、薬
物スクリーニングについてのアプローチの可能性を実証したが、これらはまた、
選択的に新脈管形成に影響する化合物を同定する重要性を強調する。上記のスク
リーニングパラメーターを使用して、本発明者らは、明白に特異的な抗脈管形成
性効果を生じる２つの化合物を同定した。さらに、本発明者らは、他の効果に加
えて脈管形成性の血管形成の減少を生じる１６の他の化合物を同定した。これら
の結果は、ゼブラフィッシュ胚モデルを使用して、新脈管形成および抗脈管形成
活性に特異的に影響する化合物についてスクリーニングし得ることを示す。
（４）Ｆｌｋ−１染色を使用する血管芽細胞形成についてのスクリーニング
）
腸管下（ｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｓｓｅｌ）形成における減少を引
き起こした１８のＮＣＩ化合物のうちの１つは、ｆｌｋ−１染色パターンに対し
て効果を有した。ｆｌｋ−１は、血管芽細胞についての初期マーカーであるので
、この結果は、１８のうちの１７の化合物について、新脈管形成のブロックは血
管芽細胞の欠損に起因するのではないが、むしろ脈管形成経路のいくつかの他の
要素の干渉に起因することを示唆する。ｆｌｋ−１染色に実際に作用した１つの
化合物について、この染色の欠損が血管芽細胞の欠損に起因するのかまたはｆｌ
ｋ−１チロシンキナーゼの発現の欠損に起因するのか否かは明らかでなかった。
このことは、血管芽細胞および新脈管形成経路の両方についてマーカーを確立す
ることの重要性を示す（下記を参照のこと）。
（５）脈管形成効果）
試験された化合物は全て、脈管の形成において観察可能な増加を生じなかった
。この観察の２つの可能な説明は以下の通りである：１）試験された化合物は全
て脈管形成特性を有していなかった；および２）正常なゼブラフィッシュの胚は
、外因性脈管形成刺激に対して無反応性である。これらの２つの可能性の間を識
別するために、本発明者らは、以下に記載される実験を実施した。ここでＶＥＧ
Ｆを２４時間目の胚に注射した。これらの実験は、新脈管形成の増大が、正常な
ゼブラフィッシュ胚において誘導され得ることを示唆した（図５Ａ〜５Ｃ）。新
脈管形成を刺激する化合物を同定する可能性を増加させるために、本発明者らは
、変異ゼブラフィッシュ系統（例えば、グリッドロック（ｇｒｉｄｌｏｃｋ）変
異（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、前出）、これは新脈管形成をブロックする欠損を有
する）の使用を探索した。
（６）脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎｅｓｉｓ））
ヒトと同じくゼブラフィッシュにおいて、脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｇｅｎ
ｅｓｉｓ）は、大脈管（大動脈、大静脈、およびいくつかの器官への脈管を含む
）を、胚の中胚葉全体に分布する局所的な前駆体細胞（血管芽細胞）から形成す
るプロセスである（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）。本発明者らは、スクリーニング
された２４１の化合物のうちの８つを用いて、血管欠損を観察した。観察された
この効果は、重篤な発生遅延を伴う胚における背部大動脈および腹部脈管の解体
に限定された。血管形成が広範な細胞増殖を必要とすることは明らかでなく、そ
して大脈管において観察されたこれらの効果は、血管芽細胞に対する直接的な効
果というよりもむしろ、周辺組織の破壊に起因し得る。
（７）新脈管形成活性についての薬剤スクリーニングの迅速かつ自動化され
た方法）
本発明者らの実験は、インビボおよびインビトロで新脈管形成を阻害または増
強する化合物の検出、同定および分析における使用についてのモデルとして、真
骨魚類の汎用性および価値を実証した。本発明の方法とともに、真骨魚類（例え
ば、ゼブラフィッシュ胚）を使用して、新脈管形成に対する効果について迅速に
多数の化合物をスクリーニングし得る。例えば、液体交換について、２４ウェル
形式および手動の技術を使用して、本発明者らは複数の時点での種々の効果につ
いて２４１の化合物をスクリーニングした。これらの効果としては、形態学的欠
損、機能的欠損、および致死率が挙げられる。これらの標的効果は、非常に多量
の情報を提供するが、他の標的（例えば、心拍数、血行、および他の器官）の分
析は、新脈管形成効果についてのあらかじめスクリーニングされた化合物におい
てのみ実施されるべき二次レベルのスクリーニングを構成する。新脈管形成に作
用する化合物についての一次スクリーニングは、７２時間目の胚における染色さ
れた腸管下に集中するべきである。
本発明はまた、動物モデルにおいてインビボでおよびそれらの細胞においてイ
ンビトロで、新脈管形成活性を増強または阻害する化合物を迅速にスクリーニン
グするための自動化された方法を含む。好ましい動物モデルとしては、透明な真
骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）が挙げられる。本明細書中に記載される任
意の化合物（例えば、以下に記載される小さな化合物または大きな生物学的分子
を含む）は、先に記載された自動化された手順を用いてスクリーニングされ得る
。
上記の本発明者らの分析において、本発明者らは、ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙから
１９０の化合物をスクリーニングした。このライブラリーは、１００，０００を
超える独特の化合物構造からなるが、現在では１２，０００のみがスクリーニン
グについて利用可能である。本発明の手動のスクリーニング方法を使用して、２
年間で化合物ライブラリー全体をスクリーニングし得る。市販の液体を操作する
器具の使用を組み入れることは、この期間を３ヶ月未満まで有意に減少する。
（２．新脈管形成活性についての生物学的分子のスクリーニング）
本発明はまた、新脈管形成活性を増強または阻害する能力について、より大き
な分子（生物学的分子を含む）のスクリーニング方法を含む。これらの方法は、
真骨魚類に化合物を投与する工程、および新脈管形成活性における増強または阻
害を示す応答を検出する工程を包含する。新脈管形成活性について、大きな生物
学的分子をスクリーニングするための正確な方法は、現在存在しない。従って、
本発明の方法は、ヒトにおいて新脈管形成のプロセスに関与する種々の疾患（神
経学的疾患、心肺疾患、虚血、発生疾患、自己免疫疾患、骨および軟骨の疾患、
ならびに癌を含む）を処置するための治療剤および／または予防剤としての生物
学的化合物の使用を評価する際に、特定の価値および用途がある。
広範な生物学的化合物（ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸（例えば
、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、脂質、糖脂質など（そのような化合物の誘導体、アナ
ログ、およびキメラを含むが、それらに限定されない）を含む）が、これらの方
法によってスクリーニングされ得る。上記で議論したように、化合物のライブラ
リー（コンビナトリアルライブラリーを含む）由来の化合物がスクリーニングさ
れ得る。
近年、多くの生物学的分子が、抗脈管形成効果または脈管形成効果のいずれか
を有することが同定された（Ｈａｎａｈａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２
２）：４８−５０（１９９７）；Ｚｅｔｔｅｒ、前出）。いくつかの生物学的化
合物は特徴付けられ、そして細胞培養物およびマウスにおける新脈管形成活性に
ついて分析されており；少数のそのような化合物をヒトにおける治療的および／
または予防的処置プログラムにおいて試験している。これらの化合物および真骨
魚類のモデル、ならびに本発明のスクリーニング方法を使用した結果の比較は、
真骨魚類のモデルおよび本明細書中に記載のスクリーニング方法が、ヒトにおけ
る治療的効果について予測的であるか否かに関して、決定することを可能にし；
このような比較は、試験された化合物が、ヒトにおける新脈管形成関連障害の治
療的処置および／または予防的処置についてのプログラムにおいて有用であるか
否かを決定する際に有用である。
（Ａ．タンパク質）
真骨魚類の胚での新脈管形成におけるタンパク質およびタンパク質フラグメン
ト（ならびに、ペプチドおよびペプチドフラグメント）の効果を試験するために
、タンパク質（ならびに、タンパク質フラグメントおよびペプチドフラグメント
）を２４時間目のゼブラフィッシュ胚の循環中に直接的に注射した。胚を収集し
、そして上記のように絨毛膜除去（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅ）した。次いで、
この胚を、胚の水（ｅｍｂｒｙｏ ｗａｔｅｒ）中に１％アガロースでできたホ
ールディングランプ（ｈｏｌｄｉｎｇ ｒａｍｐ）中で選別し、そして卵黄球の
突出を上に向ける。マイクロインジェクションの注入を以下のように実施する：
タンパク質をＰＢＳ中に懸濁し、そして吸引されたガラスのマイクロピペット中
に充填する。次いで、マイクロピぺットをマイクロマニピュレーターおよび窒素
タンクに取り付けたｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖａｌｕｅ）
に取り付けた。このマイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットの
チップを胚中に挿入し、そして少量のタンパク質溶液を陽圧を使用してチップか
ら押し出した。本発明者らの動物モデルがこれらの化合物のスクリーニングに効
果的に使用され得るか否かを決定するために、本発明者らは、脈管形成において
対立する効果を有する２つの異なるタンパク質のうちの１つ、ヒトエンドスタチ
ン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ ８８（２）：２
７７−２８５（１９９７）およびヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））を胚に注
射する一連の実験を実施した。エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメ
ント）は、強力な抗脈管形成活性を有する内因性タンパク質である。ＶＥＧＦは
、内皮細胞決定ならびに脈管形成の両方において重要な役割を果たすことが示さ
れている。予備実験において、本発明者らは、卵黄球内または卵黄と胎児表皮と
の間の卵黄周囲腔内のいずれかにＶＥＧＦタンパク質を注射した。第２の位置は
静脈還流の経路にあるので、タンパク質は胚の循環中に達する。注射ピペットを
充填するために、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌ溶液のＶＥＧＦを使用した。ＶＥ
ＧＦを卵黄内に注射した場合、本発明者らは２つの脈管形成表現型を観察した：
１）腸管下バスケット（ｂａｓｋｅｔ）から突き出た長いスパイク（ｓｐｉｋｅ
）の出現（図６Ａ）；および２）腸管下バスケットにおける脈管直径の増加（図
６Ｃ）。対照的に、卵黄周囲腔内へのＶＥＧＦの注射は、脈管形成および心臓発
生の破壊（図６Ｄ）を導いた。このことは、他の脊椎動物における観察と一致す
る。Ｄｒａｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１
７）：７６５７−７６６１（１９９５）；Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出。エンドスタ
チンをＶＥＧＦと同様にゼブラフィッシュに注射した。ＶＥＧＦとは対照的に、
エンドスタチンの結果は一致せず、従って解釈不可能である。これらの実験は、
脈管パターンにおける変化が、本発明者らの動物モデルにおいて誘導され得るこ
とを実証した。さらに、ヒトタンパク質はこれらの効果を生成したので、これら
の実験は、新脈管形成についての機構がゼブラフィッシュおよびヒトにおいてお
そらく類似していることを示唆する。
（Ｂ．核酸）
真骨魚類に核酸を送達するために、本発明者らはマイクロインジェクション系
を確立した。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のマイクロインジェクションは、
単一細胞、カエル胚、マウス胚、およびゼブラフィッシュを含む、種々の生物学
的系において使用される十分に確立された手順である。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ
、前出。ゼブラフィッシュにおいて、１〜１６細胞ステージの胚の卵黄に目的の
分子を注射することによって、胚の全ての細胞を負荷することが可能である。Ｗ
ｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出を参照のこと。これらの標準的なアプローチを使用
して、数百の胚を２時間で負荷し得る。
（３．微粒子銃細胞ローディング技術の評価）
微粒子銃細胞ローディング技術は、コーティングした微粒子を使用して、動物
の組織および器官に目的の分子を導入する。この技術において、生物学的分子で
コーティングされた微粒子は、高圧銃を使用して動物の目的の細胞または組織内
に「微粒子銃で」打ち込まれる。この技術は、大きなＤＮＡプラスミド構築物を
用いて、一次培養細胞ならびにマウスの全胚を首尾よく負荷するために使用され
てきた。Ｃｈｏｗら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）：１６６７-１６
７９（１９９８）。
本発明の方法とともに、微粒子銃細胞ローディングをマイクロインジェクショ
ン技術の代替として使用して、動物内（例えば、成体、幼生、および真骨魚類の
胚のような）に化合物を注射し得る。ＤＮＡを、真骨魚類に局所的（例えば、新
脈管形成の開始前、開始後または同時に、尾または卵黄の背部表面）に投与し得
る（例えば、真骨魚類の胚の中の特異的な位置に導入される）。
（４．新脈管形成活性および内皮細胞毒性に対する化合物の効果を、定量化
および特徴付けするためのパラメーターの確立）
特定の化合物が治療的または予防的使用の可能性があるか否かを決定するため
に、多くのさらなるパラメーター（治療的ウインドウおよび有効性ウインドウを
含む）が決定され得る。
（Ａ．治療的ウインドウ）
治療的ウインドウ（ＴＷ）は、致死濃度のメジアン（ＬＣ５０）に対する有効
濃度のメジアン（ＥＣ５０）の割合である（すなわち、ＬＣ５０／ＥＣ５０）。
ＬＣ５０は、薬剤の段階希釈物を投与し、そして各希釈段階で真骨魚類の何割が
致死するかを決定することによって決定される。ＬＣ５０は、真骨魚類の５０％
の致死率を引き起こすのに必要とされる濃度である。高い治療的ウインドウ（Ｌ
Ｃ５０／ＥＣ５０）を示す薬剤（例えば、１００または１，０００）は、良好な
潜在的薬物の候補である。なぜなら、治療的濃度において毒性が低いからである
。薬剤の濃度は代表的にピコモル濃度〜ミリモル濃度の範囲である。
（Ｂ．有効性ウインドウ）
有効性ウインドウ（ＥＷ）は、新脈管形成の間で、化合物が有効である時点を
同定する。これは、血管芽細胞が最初に検出可能である１２体節ステージで開始
して、胚における血管新生が完了する７２時間目のステージを通して、新脈管形
成の種々のステージで化合物のＥＣ５０に胚を曝露することによって決定される
。
本発明者らの予備的研究において、本発明者らは種々の濃度で毒性である多く
の化合物を同定した。このような化合物は非常に強力であること、そしてわずか
低濃度（ピコモル濃度）のこのような化合物で新脈管形成に作用することが可能
である。この問題は、毒性を誘導する濃度を十分下回る濃度で脈管形成効果につ
いて化合物をスクリーニングすることによって、検討され得る。
（Ｃ．脈管増殖の定量化）
目的の化合物で処理された胚の、未処理の胚（コントロール）との可視的な比
較は、新脈管形成に関連する脈管構築における変化を同定するための手段として
有効であるが、これは定量的評価が可能でない。可視的比較の代替として、また
は可視的比較に加えて、画像解析を使用して、分析を定量化しそして標準化し得
る。多くの市販のソフトウェアパッケージが存在し（例えば、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒ
ｏ ＰｌｕｓTM、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ；ＷＳＲ Ｉｍａｇｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＷｉｎｄＳｗｏｒｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ；ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍ
ｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、これらは可視的分析について使用されるパラメーター
である脈管寸法および分布の距離ならびに面積の両方の測定を可能にする。
（Ｄ．脈管形成活性を特徴づけるためのさらなるマーカーの評価）
ゼブラフィッシュにおける脈管形成に関与するシグナリングタンパク質を標識
する抗体マーカー（ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１および２（Ｈａｎａｈａｎ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：４８−５０（１９９７）を含む）は、脈管の発
生およびパターン化を導くシグナリング分子のアゴニストまたはアンタゴニスト
のいずれかである化合物を同定する際に補助をする。多くの抗体マーカーがマウ
スにおいて同定されており、そして市販されている（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）。これらのマーカーを、標準的な抗体染
色プロトコールを使用して、真骨魚類において試験し得る。Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅ
ｌｄ、前出。ＲＮＡプローブの代わりに抗体を使用して、アッセイ手順を単純化
し得る。
簡潔には、胚を室温で２時間固定した。次いでこの胚をＴｗｅｅｎを有するリ
ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＴ）中で２度洗浄し、そして−２０℃で７分間のア
セトン処理によって透過化した。胚を再水和し、次いでブロッキング溶液（ＰＢ
Ｔ中の２％ヤギ血清、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で室温で３０分間処
理する。次いで、胚を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中に４℃で一晩浸
漬する。次いで、胚を１％ＢＳＡを有するＰＢＴ中で５回洗浄する。胚を、二次
ＨＲＰ−結合抗体を含有するブロッキング溶液中に室温で４時間浸漬する。次い
で、胚を洗浄し、そしてＤＡＢ溶液（１ｍｇのジアミノベンジジン、１ｍｌの０
．１Ｍ ＰＯ4緩衝液、１ｍｌのｄＨ2Ｏおよび２０μｌのＤＭＳＯ）中に１５分
間浸漬することによって染色する。次いで、発色のために、Ｈ2Ｏ2をこの溶液に
添加する。この反応をＰＢＴを添加することによって停止する。
（Ｅ．内皮細胞毒性を誘導する化合物のアッセイ）
新たな脈管形成をブロックするストラテジーは、抗癌治療のために重要な可能
性を有するが、代替のストラテジーは、腫瘍において既に存在する脈管を破壊す
ることである。そのようなストラテジーでは、真骨魚類に対し、脈管形成の前で
なく脈管形成後に化合物を投与する。真骨魚類の胚を含有する培地にどのくらい
の期間、化合物が持続するかは公知でない；本発明者らは、血管形成に対する効
果が、化合物の投与後に比較的すぐに生じることを仮定する。形成後の血管に対
して毒性効果を有する化合物を同定するために、本発明者らは、腸管下脈管が十
分に確立されている発生の６０時間目のゼブラフィッシュ胚に対して、化合物を
投与した。次いで、本発明者らは、発生の７２時間目および８４時間目に胚をア
ッセイした。上記のように、化合物を、腸管下脈管染色の欠損を生じた化合物に
ついてスクリーニングした。
（Ｆ．変異魚系統の使用の評価）
研究は、正常な動物系において、さらなる脈管増殖を誘導することが困難であ
り得ることを示唆する。例えば、虚血についてのマウスモデルにおいてこの証拠
が存在する（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２（６）
：１６６７−１６７９（１９９８））。この問題は、脈管の発生を損なわれた動
物においてスクリーニングを実施することによって回避され得る。脈管形成を破
壊するゼブラフィッシュにおいて、少数の遺伝的変異が存在する。このような変
異の例は：１）グリッドロック、ゼブラフィッシュにおける局在化され遺伝可能
な脈管パターン欠損（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、ＭＡ（１９９８））、ここで脈
管形成は、発生の最初の３〜４日目については頭部領域で正常および尾部で欠損
し、そして４日後から尾部において側副血管が出現し始める；２）クローシュ（
ｃｌｏｃｈｅ）（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉ
ｏｌ．１９７（２）：２４８−４９（１９９８））、ここで血管芽細胞の発生は
損なわれている；および３）尾部なしかつ固定していない（ｆｌｏａｔｉｎｇ）
頭部（Ｆｏｕｑｕｅｔら、前出）、脊索（ｎｏｔｏｃｏｒｄ）変異、ここで大脈
管の形成はブロックされている。これらおよび他の変異株の有用性は、本明細書
中に記載される脈管形成活性について化合物をスクリーニングする方法を使用す
ることによって、容易に評価される。現在、ゼブラフィッシュにおいて、脈管増
殖の増加を生じる公知の変異は存在しない。
（Ｇ．器官系に対する脈管形成／抗脈管形成化合物の効果のアッセイ）
脈管系以外の器官系（例えば、腎臓、心臓など）に対する化合物の効果を、本
明細書中に記載のスクリーニング方法を使用することによって決定し得る。その
ような決定をする能力は重要である。なぜなら、新脈管形成活性について化合物
をスクリーニングする方法を用いて同定された任意の化合物の潜在的な治療的価
値を評価する際に、不利な効果（他の器官系に対する不利な効果を含む）を同定
することはまた重要であるからである。真骨魚類モデルはこの目的のために理想
的である。なぜなら、その器官の多くが、透明な真骨魚類の胚において、光学顕
微鏡によって可視化され得るからである（例えば、心臓およびＣＮＳ）；あるい
は、真骨魚類胚の多くの器官は、単純な染色技術によって同定され得る（例えば
、肝臓、腸、心臓、および腎臓）。例えば、心臓の機能および肝臓の生存力をア
ッセイし得る。心臓は血管系と直接的に連結されること、および心臓と脈管はい
くつかの同じ細胞型を共有することの両方の理由により、心臓は新脈管形成活性
に作用する化合物の第二の標的であるように思われる。肝臓は多くの化合物（特
に、毒素）の蓄積および代謝の部位であるので、化合物および分解産物の両方の
毒性の指標である。
上記のように、本発明者らの最初の研究において、本発明者らは少数の化合物
がゼブラフィッシュ胚の心拍数に作用することを観察した。６つの化合物を用い
て、本発明者らは、正常の１秒あたり４〜５拍に代わって、ゼブラフィッシュが
１秒あたり約１〜２拍で心拍することを観察した。特定の化合物が真骨魚類の心
臓の発生に作用するか否か、または伝導機構に対してアンタゴニストとして作用
するか否かを決定するために、本発明者らは、機能的な心臓および脈管系が存在
する発生の７２時間目のゼブラフィッシュ胚に、目的の化合物を投与した。次い
で、胚を、化合物の添加後２時間、心拍数および収縮力に対する直接的な効果に
ついて評価し、そして２４時間目に新規の遺伝子またはタンパク質の発現に必要
とされ得る効果について評価した。化合物が、ゼブラフィッシュの心臓の伝導ま
たは収縮装置のいずれかに対して直接アンタゴニストとして作用する場合、ゼブ
ラフィッシュへの任意のステージでの投与が効果を示すようである。しかし、化
合物がゼブラフィッシュの心臓の発生に作用する場合、その存在は発生の後期ス
テージで全く効果を示さないはずである。
心拍数および収縮力を試験することに加えて、本発明者らはまた視覚的な検査
（Ｓｔａｉｎｉｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２３：２８５−９２（１９
９６））およびトロポミオシンおよび心臓ミオシン重鎖に対する抗体での心臓の
染色（ＳｔａｉｎｉｅｒおよびＦｉｓｈｍａｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖ
ａｓｃ．Ｍｅｄ．４：２０７−２１２（１９９４）、これは、魚類心臓の２つの
室である心房および心室の同定を可能にする）の両方によって心臓の構造を試験
した。簡潔には、胚を室温で２時間固定した。次いで、胚をＴｗｅｅｎを有する
ＰＢＴ中で２回洗浄し、そして−２０℃での７分間のアセトン処理によって透過
化した。この胚を再水和し、次いでブロッキング溶液（ＰＢＴ中の２％ヤギ血清
、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中で、室温で３０分間処理した。次いで
、この胚を、一次抗体を含有するブロッキング溶液中に４℃で一晩浸漬した。次
に、この胚を１％ＢＳＡを含有するＰＢＴ中で５回洗浄した。引き続いて、この
胚を検出について適切な蛍光結合二次抗体に曝露した。この胚をエピ蛍光顕微鏡
（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）を用いて分析す
る。この方法は、検出の特定の手段を使用する；例えば、色素形成、放射線写真
または他の方法を含む、代替二次抗体または可視化（すなわち、検出）方法を使
用し得る。
（ＩＩＩ．細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法
）
（Ａ．細胞死）
多細胞生物体の細胞の死は、天然のプロセスまたは外因的な非生理学的原因か
ら生じ得る。２つの細胞死の型が公知である：壊死およびアポトーシスである。
壊死は、細胞への急性の非生理学的損傷から生じる、生細胞の病理的な死である
。Ｈｅｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９（４）：３００−０
７（１９９８）。壊死は、多くの異なる条件（毒素、重篤な低酸素症、大量の傷
害もしくは物理的損傷、またはアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）枯渇の状態
を含む）に、細胞を曝露することから生じ得る。同上。壊死は、例えば、虚血発
作での梗塞組織の中心、または毒素作用の中心で生じる。同上。壊死細胞は膨張
および溶解し、それによってそれらの核内容物を細胞間領域周囲に放出して、そ
して炎症性応答を生じる。同上。しかし、重要なことに壊死は単に細胞がそれに
よって死ぬだけの機構ではない。
アポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）は、発生の間に組織を形
作る際に重要な役割を果たす、天然に生じる生理学的なプロセスである。Ｋｅｒ
ｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６：２３９−２５７（１９７２）；Ｃｌａｒ
ｋｅ、Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．１８１：１９５−２１３（１９９０）。アポ
トーシスは、多細胞生物の自己再生組織のほぼ全てにおいて、細胞増殖と細胞分
化との間でバランスを維持することを保証する。アポトーシスは、例えば、もは
や必要でない細胞、過剰に産生された細胞、損傷を受けた細胞、または不適切に
発生した細胞の排除を可能にする。多くの細胞型が、アポトーシスプロセスを通
した細胞死を受ける。Ｈｅｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９
（４）：３００−３０７（１９９８）。アポトーシスの細胞は、多くの特徴的な
変化（クロマチン縮合、核のフラグメント化、および細胞質の小疱形成を含む）
を受ける。ＬｉｅｐｉｎｓおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ、Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍ
ｉｃｒｏｓｃ．８：６３１−６４１（１９９４）。このプログラムされた細胞死
機構は正確かつ予測可能であり、そして細胞死を支配するステージおよび遺伝子
は、多細胞動物の間で高度に保存されている。
アポトーシスは、自身の細胞を死滅させることにより方向付けられるように思
われ、そして発生の間、所定の器官または組織における適切な細胞数および細胞
型を維持することに関与する。いくつかのアポトーシスの事象は、増殖因子また
は生存因子の量を制限することによって調節されると考えられる。これはまた、
外因性刺激（例えば、照射、高体温、ホルモン離脱、免疫応答、照射、化学毒素
、極度な温度、増殖因子の誘導、およびいくつかのウイルスによる感染を含む）
に対する応答でもまた誘発され得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
７：１４５６−１４６２（１９９５）。
異常なアポトーシスの調節は、不適切な細胞死または細胞死の阻害から生じる
広範な疾患の発症および進行に関与している。アポトーシスの調節不全は、例え
ば、対応する正常な細胞の生存よりも長い期間生存するいくつかの型の癌細胞に
関与する。アポトーシス機構の抑制または不全は、形質転換された状態または癌
性状態へと導くさらなる変異を、特定の癌細胞が受けることを可能にする。Ｈｅ
ｔｔｓ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２７９（４）：３００−３０７（
１９９８）。制御不能のアポトーシスはまた、神経変性性障害、リンパ球増殖、
自己免疫疾患、ならびに心臓疾患および腎疾患を含む他の障害に関与する。同上
。
さらに、疾患（例えば、癌、心臓疾患、および神経変性性疾患）についての多
くの治療的アプローチ（種々の化学療法、および臓器移植を含む）が、正常な細
胞においてアポトーシスを誘導することが示されている。同上。
アポトーシスの無差別的な阻害は、広範な過形成を導き得、そしてアポトーシ
スの不適切な促進は、所望されない組織の変性を導き得、細胞死の研究に対して
より正確なアッセイについての必要性を強調する。アポトーシスに対する複数の
経路は、異常なアポトーシス調節を処置するために異なる治療的アプローチが可
能であることを意味し、このことは細胞死を生じるかまたは抑制するそれらの能
力について化合物をスクリーニングするためのアッセイについての必要性を実証
する。
アポトーシスを含む細胞死活性の機構の理解は、細胞死を刺激するか、誘発す
るか、または開始するか、あるいは択一的には、細胞死を抑制するか、阻害する
か、またはブロックするのいずれかの、治療的化合物の開発を容易にする。例え
ば、シグナル伝達タンパク質およびそれらの対応するレセプターの発見は、アポ
トーシスの細胞機械が間違った場合、または細胞の殺傷のためのその潜在能力を
活用する場合に、アポトーシスの細胞機械を修正するための道具の開発のための
機会を提供する。アポトーシスの異常な調節は、広範な疾患の発症および進行に
関与しているので、現在、それらが多すぎるアポトーシスまたは少なすぎるアポ
トーシスと関連があるかどうかに基づいて、多数の障害が分類され得る。特に、
多くのガン治療に向けたアプローチが現在研究中である。なぜなら、アポトーシ
スエンジンが操作し損なう場合に、腫瘍細胞が増殖することが公知であるからで
ある。潜在的な修復方法としては、腫瘍細胞におけるアポトーシス機能を回復す
るためのレセプターを標的とする化学物質を見い出す工程、および腫瘍を発症し
た血管においてアポトーシスを誘導する工程が挙げられる。
分子的なアポトーシス経路の理解の改善はまた、新規な非薬学的治療の開発を
刺激し得る。例えば、１つのアデノウイルス（ｐ５３欠損細胞中でのみ複製可能
であり、そしてその細胞を殺すアデノウイルス）は、ｐ５３欠損腫瘍細胞のみを
殺し、影響されていない正常細胞を残存させる可能性のある抗腫瘍剤として、フ
ェーズ１の臨床試験中である。心臓発作後に注射した場合に冠状動脈の損傷を制
限する化合物もまた、現在研究中である。これは、アポトーシスの選択的な阻害
および誘導の両方を行う低分子を使用する分子的アプローチの開発の可能性を強
調する。分子レベルでのアポトーシスの生理学的プロセス理解の改善は、疾患の
病因論についての洞察を提供し、そして診断の、予後の、および治療の道具を開
発するための新しい道を開く。
アポトーシスの遺伝的および分子的機構は、１９８０年代後期および１９９０
年代初期に線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを用いる研究において特徴付けられた。線虫
は、モデル系として多くの利点（アポトーシスに関与するシグナル伝達経路の多
くの進化的な保存を含む）を持つけれども（例えば、Ｓｔｅｌｌｅｒ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６７：１４４５〜４９（１９９５）を参照のこと）、脊椎動物の細胞
死活性および疾患状態の理解のための最適なモデルではない。脊椎動物は、非常
により複雑であり、そしてより多くのシグナル伝達分子からなる多数のアポトー
シス経路を有する。現在、脊椎動物の系においてインビボで、細胞死活性（例え
ば、アポトーシス）に対する影響について化合物をスクリーニングする迅速なイ
ンビボアッセイは存在しない。それゆえに、脊椎動物の系において、細胞死活性
（アポトーシスおよびネクローシスを含む）に対する影響について化合物をスク
リーニングする迅速なインビボ方法を提供することが望まれる。
現在、脊椎動物宿主において細胞死活性を検出するための２つの主要なアプロ
ーチが存在する。第１のアプローチは、標準的な細胞培養技術を使用し、そして
代表的には生物から培養された細胞の死を検出するための標準的なマイクロプレ
ートリーダーによる。細胞培養アッセイ様式の主な欠点は、培養されていない細
胞型（すなわち、他の細胞型）、またはインビボで１つ以上の組織または器官、
またはインタクトな宿主全体に対する化合物の効果の分析が不可能であることで
ある。さらに、このようなアッセイ様式は、生きている宿主の複数の組織、器官
、または系における細胞死活性の同時モニタリング、あるいは経時的モニタリン
グが不可能である。
細胞死活性を検出するための第２のアプローチは、脊椎動物胚の切片組織中の
死んでいる（ｄｅａｄ）か、または瀕死の（ｄｙｉｎｇ）細胞（例えば、アポト
ーシス性の細胞）を検出するために、末端デオキシウリジンヌクレオチドエンド
標識（ＴＵＮＥＬ）と呼ばれる、組織学的染色技術を利用する。Ｇａｖｒｉｅｌ
ｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：４９３〜５０１（１９９２）。不運に
も、このアプローチでは、宿主の生活環における、ただ１つの時点のみが試験さ
れ得る；種々の組織または器官の細胞の死は、経時的にはモニターされ得ない。
投与された化合物に起因する副作用も、同時または経時的にモニターされ得ない
。多くの疾患が複数の段階において起こるので、化合物、複数の組織の化合物の
直接的作用および副作用の持続によって起こる細胞死活性のパターンの変化を試
験する能力は、現在の方法よりも有意な改善を示す。
細胞死活性（アポトーシスを含む）を調節する遺伝子産物は、多くの疾患プロ
セスを緩和するうえでの治療的介入のための優秀な標的である。このような治療
的遺伝子産物は現在ほとんど存在しない。細胞死活性に対する強力な治療的効果
について化合物をスクリーニングする方法を提供することもまた、望まれる。こ
のような方法は、異常な細胞死プロセス（不適切な細胞死または細胞死の阻害（
例えば、アポトーシスの調節不全）から生じたものを含む）から生じた疾患を緩
和する上で利点を有する。
（Ｂ．細胞死活性について薬剤をスクリーニングする方法）
本発明は、動物の細胞において、インビボまたはインビトロで、脊椎動物（例
えば、真骨魚類）における細胞死活性に対する効果のための薬剤をスクリーニン
グする方法を提供する。細胞死活性は、薬剤の投与に応答して、動物、組織、器
官、または細胞における細胞死を増強、刺激、阻害、またはブロックする薬剤の
能力（ａｂｉｌｉｔｙ ｏｒ ｃａｐａｃｉｔｙ）である。細胞死活性は、薬剤
が投与されていない、同時発生的および／または履歴されたコントロール真骨魚
類（またはその組織、器官、もしくは細胞）と比較して評価される。このような
方法は、アポトーシスまたはネクローシスのプロセスを誘発するか、増強するか
、抑制するか、または除去する能力について、薬剤をスクリーニングするために
有用である。同定された薬剤は、異常な細胞死プロセスから生じる疾患、あるい
は標的化された細胞もしくは組織の除去または制御された死から利益を得る疾患
の治療的または予防的処置において強力に使用され得る。
いくつかのこのような方法は、インビボで真骨魚類の全身に薬剤を投与する工
程、および細胞死活性に対する効果を示す真骨魚類における応答を検出する工程
を含む。他のこのような方法は、真骨魚類の細胞の培養物にインビトロで薬剤を
投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示す細胞における応答を検出す
る工程を含む。このようないくつかの方法において、検出される応答は、細胞死
活性の増加または開始である。他の方法において、検出される応答は、細胞死活
性の減少または抑制である。いくつかの方法において、応答は、アポトーシス活
性の増加または減少である。アポトーシス活性における効果は、このような効果
を示す応答を検出することによって測定され得る；その応答は、例えば、アポト
ーシスの増大もしくは誘発すること、またはアポトーシスの減少もしくは抑制で
あり得る。アポトーシス活性の増大は、一般的に、動物の組織または器官の細胞
の死の増大を含む。
代表的には、その動物は真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）である。通常
、その真骨魚類は透明である。その真骨魚類は、胚性、幼生、または成体の形態
であり得る。
あるいは、薬剤は、インビボで真骨魚類にその薬剤を投与すること、および真
骨魚類におけるネクローシス活性に対する効果を示す応答を検出することによっ
て、インビボでのネクローシス活性に対する効果についてスクリーニングされ得
る。薬剤はまた、インビトロで真骨魚類の培養細胞にその薬剤を投与すること、
およびネクローシス活性に対する効果を示す細胞において検出することによって
、インビトロでのネクローシス活性に対する効果についてスクリーニングされ得
る。このような両方の方法において、応答はネクローシス活性の増大または減少
であり得る。
全身の、インタクトな真骨魚類および／または真骨魚類の１つ以上の器官、組
織、もしくは系（例えば、心血管系、内臓系、および筋系）への特定の薬剤の効
果は、真骨魚類の細胞において（そして所望の場合、経時的におよび／または選
択された時間間隔で）、インビボまたはインビトロで測定され得る。器官および
／または組織の組み合わせにおける応答は、同時に、または別々に検出され得る
；そのような分析は、あらかじめ決定された時間間隔で、経時的に行われ得る。
これらの方法はまた、単離された細胞または細胞溶解物とともに使用され得る。
細胞死活性は、種々の技術のうちの少なくとも１つの（例えば、蛍光顕微鏡技
術、光学顕微鏡技術、デジタル画像分析技術、または標準的なマイクロプレート
リーダー技術（比色定量、時間分解フルオロメトリーを含むフルオロメトリー、
および化学発光）、タンパク質の抗体染色、真骨魚類の全身または真骨魚類の組
織、器官、もしくは細胞における酵素レベルあるいは酵素活性の変化、ならびに
動物中の時間的および空間的なタンパク質分布の変化を含む）を使用することに
より、インビボまたはインビトロで検出され得る。応答はまた、パターン認識ソ
フトウェアを使用することによって、識別および／または分析され得る。従って
、例えば、アポトーシスまたはネクローシス組織の増加は、このような技術を使
用することによって、ゼブラフィッシュにおいて分析され得る。
蛍光に基づく検出技術および蛍光顕微鏡検査はまた、動物（例えば、真骨魚類
）における細胞死活性に対する薬剤の効果を検出するために使用され得る。例え
ば、真骨魚類は、細胞死活性（例えば、アポトーシスまたはネクローシス）の検
出を可能にする、膜不浸透性の核染色蛍光色素を用いて染色され得る。種々の蛍
光色素が使用され得る。好ましい色素は、非対称的なシアニン色素ファミリー（
例えば、キノリウム色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）））の色素（その誘導体、アナログ、およ
び置換形態または非置換形態を含む）を含む。このような色素は、一般的に米国
特許第５，６５８，７５１号において議論され、これは、すべての目的のために
その全体が本明細書中で参考として援用される。多くのこれらの色素は市販され
ている。
モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム）を
含むこれらの色素は、生きている胚の細胞のインタクトな膜を通過し得ない。し
かし、これらの色素は、膜が不連続になっているか、または破壊された（細胞死
を受けている細胞に特徴的、ＬｉｅｐｉｎｓおよびＢｕｓｔａｍａｎｔｅ、Ｓｃ
ａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃ．８：６３１〜４１（１９９４））、死んでいる
細胞あるいは瀕死の細胞には入り得る。顕著には、死んでいる細胞、瀕死の細胞
、またはアポトーシス細胞に特徴的な膜の細胞質の小疱形成および他の特性は、
このような色素を細胞に入れることを可能にする。
細胞膜の通過に際して、モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウ
ム−４−キノリウム）は、死んでいる細胞または瀕死の細胞のＤＮＡに挿入され
る。高密度のクロマチンおよび核のフラグメント化は、色素挿入およびシグナル
増幅のための理想的な環境を提供する。Ｓｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
Ｉｎｔｌ．１：２６７〜２７６（１９９７）。ＤＮＡへの挿入に際して、色素は
、強い蛍光性となり、単純な蛍光顕微鏡検査を使用して標識された細胞の迅速な
検出を可能にする。顕著には、ＤＮＡ中で濃縮された場合、ベンゾチアゾリウム
−４−キノリウム色素の蛍光シグナルは、４００倍まで増幅される。Ｓｅｒｂｅ
ｄｚｉｊａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３１（３）：２７５〜２８２（１９９
６）。シグナルの強度は、アポトーシス細胞数またはネクローシス細胞数の測定
手段として使用する。
顕著には、本発明の細胞死活性のための薬剤をスクリーニングするインビボの
方法は、既存のアプローチによって可能にされたものよりも、インビボでの胚全
体における細胞死の、より感度が高くかつ正確な検出および測定を提供する。細
胞死の他の蛍光マーカー（例えば、アクリジンオレンジ）は、種々の条件下で、
モノマー性のシアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素
）よりもずっとより容易に生きている胚の細胞の膜を通過し、そして蛍光を発す
る。例えば、アクリジンオレンジは、核酸と結合した場合、およびリソソーム（
ｌｙｓｏｚｙｍｅ）のような細胞下区画に局在された場合に蛍光を発する。アク
リジンオレンジは、時としてアポトーシスと関連するクロマチンの密集化を含む
、いくつかの状況下ではＤＮＡと効果的には結合しないこともまた、報告されて
いる。従って、アクリジンオレンジおよび類似のこのような色素は、ベンゾチア
ゾリウム−４−キノリウム色素と同程度の細胞死の特異的なマーカーを提供しな
い。
モノマー性シアニン色素（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素
）はまた、核酸に結合した場合、細胞死の他の蛍光マーカー（例えば、アクリジ
ンオレンジ）よりも、より高いシグナル対バックグラウンド比を提供する。さら
に、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素の蛍光放射スペクトルは、他の蛍
光標識の放射スペクトル（例えば、非常に広い蛍光放射スペクトルを有するアク
リジンオレンジ）よりも、代表的にはより狭い（すなわち、狭い波長の放射バン
ドにわたって放射が起こる）。モノマー性のシアニン色素の特徴的な放射スペク
トルは、キノリウム色素と組み合わせて、同時に２つ以上のさらなる蛍光標識の
使用を可能にし、それによって同じもしくは異なる器官または組織中の生理学的
事象の多数の型の特徴付けを可能にする。広い放射スペクトル（例えば、アクリ
ジンオレンジ）は、標識の蛍光放射スペクトル放射の間の重複に起因して、本明
細書中に記載されるスクリーニング方法のための複数の蛍光標識を使用する能力
を厳しく制限する。従って、本明細書中に記載される本発明の方法を用いて、１
より多い蛍光色素が、同時に経時的にインビボで動物に投与された薬剤に対して
応答する、複数の細胞的現象および／または分子的現象をモニタリングするため
に、ともに用いられ得る。市販のフィルターセット（例えば、フルオレセインの
ためのフィルター、またはいくつかの励起バンドおよび放射バンドを有する複数
の発蛍光団を検出するためのフィルターセット）と一致する放射バンドを有する
ように色素が選択され得る。
さらに、細胞死の他の蛍光マーカーとは対照的に、ベンゾチアゾリウム−４−
キノリウム色素は毒性ではない；従って、色素が投与された生きている真骨魚類
におけるアポトーシス性およびネクローシス性効果は、その真骨魚類が色素によ
る副作用に影響される危険性なしに、かなりの期間にわたってモニターされ得る
。対照的に、細胞死の他の型のマーカーを使用するアッセイは、宿主が屠殺され
、そして固定されることが必要とされる（例えば、ＴＵＮＥＬ標識）。
蛍光色素は、代表的には、真骨魚類を含む培地に色素を添加することによって
真骨魚類に投与される。あるいは、色素は真骨魚類へ直接的に注入され得る。色
素は、代表的には、細胞死活性についてスクリーニングされるべき薬剤の投与に
先立って投与される。この手順は、既存のアプローチを超える優れた結果を提供
する。なぜなら、本発明者らは、色素がアポトーシスが誘導された後に添加され
た場合、その色素は、標識された死んでいる細胞または標識された瀕死の細胞に
おいてより効果が少ないことを見い出したからである。アポトーシス機構の１つ
（例えば、細胞内膜および原形質膜の成分の重合）は、色素が細胞に入ることを
困難にまたは不可能にし得る。結果として、アポトーシスを起こしている細胞は
標識されないかもしれない。薬剤の適用に先立つ色素の適用によって、この問題
は避けられる。色素の蛍光放射は、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写
真フィルムを含む標準的な蛍光測定技術を使用すること、または現在の機器（例
えば、レーザースキャニング装置、蛍光メーター、フォトダイオード、量子カウ
ンター、光子カウンター、プレートリーダー、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ）顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはシグナルを増幅する
ための手段（例えば、光電子増倍管）によって）の使用によってモニターされる
。
困難な標識手順（例えば、ＴＵＮＥＬ標識）を含む他の公知の色素とは違って
、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素は、高処理能力の、自動化されたス
クリーニング方法のために特に適切である。これらの色素において固有なより高
いシグナル対ノイズ比、そしてアポトーシスについてスクリーニングされる薬剤
の投与に先立つ本発明者らの優れた色素の投与方法は、自動化されたデータの獲
得、収集されたデータ（例えば、デジタル画像）のより正確な定量、および獲得
されたデータの特徴の抽出／画像セグメント化の可能性を可能にする。これらの
特徴は、特異的な真骨魚類の運命のマップと同調する運命マップと相関し得る空
間的／時間的次元におけるアポトーシスシグナルのマッピングを可能にする。こ
のような情報は、スクリーニングされた薬剤のさらなる特徴付けを可能にする。
上記のように、細胞死活性（例えば、アポトーシスおよびネクローシス）はま
た、デジタル画像化によって検出され得る。デジタル画像化は、人の目と比較し
た場合に、いくつかの利点のため、生物学的調査のための欠くことのできない道
具である。デジタル画像化は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を使用する画像の収
集を含む。より高い感度の画像化検出器は、補助されない人の目によっては検出
不可能な非常に低い光の対象物を可視化することを可能にする。人の目の感受性
のスペクトルは、４００〜７００ｎｍに限られている。対照的に、画像化検出器
の感度範囲スペクトルはより広く、ｘ線からまでの赤外線の範囲からシグナルが
検出され得る。デジタルマッピングおよびパターン認識ソフトウェアの組み合わ
せは、複数のデータセットの定量および比較を可能にし、そして実験的な真骨魚
類動物を用いる同時発生的および履歴されたコントロールの比較を容易にする。
本発明はまた、真骨魚類におけるインビボの細胞死活性、または経時的に真骨
魚類の細胞におけるインビトロの細胞死活性に対する効果について化合物をスク
リーニングする方法を提供する。このような方法は、インビボで真骨魚類に、ま
たはその細胞にインビトロで化合物を投与する工程、細胞死活性に対する効果を
示す真骨魚類における応答を検出する工程、およびさらに、あらかじめ決められ
た期間、または時間間隔の後に、真骨魚類における細胞死活性の応答を検出する
工程を含む。実施者によって選択される期間は、代表的には、化合物の存在下で
検出可能な細胞死が生じるのに十分な時間である。さらに、複数の時点が、任意
の適切な生理学的活性を検出するために試験され得る。いくつかのこのような方
法は、本明細書中で記載される検出技術を使用して、第２のあらかじめ決定され
た時間間隔後に、細胞死活性（例えば、アポトーシス）における応答を検出する
工程をさらに含む。このような方法は、インタクトな、生きている真骨魚類にお
いて経時的に組織および器官に対する薬剤（例えば、化学化合物、薬物、環境的
薬剤、農業的化合物、毒素、医薬、化粧品など）の効果を評価するうえで有用で
ある。
なお別の局面において、本発明は、上記のように、インビボまたはインビトロ
で細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
この方法はさらに、真骨魚類の１つ以上の組織または器官における細胞死活性の
増加または減少を同時に検出する工程を含む。このようないくつかの方法におい
て、細胞死活性の増加または減少は、あらかじめ決められた時間間隔において１
つ以上の組織または器官中で同時に検出される。種々の細胞、組織、および胚の
器官に対する特定の化合物の効果は、経時的にモニターされ、そして評価され得
る。複数の組織または器官の細胞死活性は、本明細書を通して記載される検出技
術を使用することによって検出され得る。
本発明はまた、インビトロまたはインビボでの細胞死活性に対する効果につい
て化合物をスクリーニングする自動化方法を提供する。本発明の方法は、マイク
ロプレートのウェルあたり１つ以上の真骨魚類の全身を用いる標準的なマイクロ
プレートウェル様式を使用して行われ得る。この様式は、標準的なマイクロプレ
ート手順およびウェル中のゼブラフィッシュの細胞死を検出するためのプレート
リーダーを使用して、自動化されるスクリーニングアッセイを可能にする。この
設定を用いて、多数の真骨魚類に対する特定の化合物の効果が、迅速に確認され
得る。さらに、このような様式を用いて、広範な種々の化合物が、ウェル中に含
まれる真骨魚類（例えば、真骨魚類の胚）の細胞に対するそれぞれの効果につい
て、迅速かつ効率的にスクリーニングされ得る。サンプルの取り扱いおよび検出
手順の両方は、色素および化合物の迅速な再現可能な適用、ならびに標的化合物
の自動化スクリーニングのために、市販の機器およびソフトウェアシステムを使
用して、自動化され得る。
これらの方法とともに使用される同時発生的および／または履歴されたコント
ロール真骨魚類（真骨魚類の組織、器官または細胞を含む）は、アポトーシスの
分子機構の少なくとも１つのインヒビター（例えば、公知のまたは特定のアポト
ーシスの分子機構のインヒビターを含む）が、発生の特定の段階において真骨魚
類（または、その組織、器官、もしくは細胞）に投与されたものを含み得、それ
によって、組織の奇形（例えば、中枢神経系の増大；排泄腔／肛門腔領域の奇形
；任意の組織における細胞の過剰増殖）のような特定の表現型を生成する。次い
で、薬剤は、同一のまたは同様の表現型を誘導する能力（すなわち、表現系応答
）についてスクリーニングされ得る。このような方法を用いて、薬剤は、上記の
ように真骨魚類に投与される；真骨魚類における表現型応答は、光学顕微鏡によ
って、上記で議論したように非対称的なシアニン色素を用いる蛍光標識によって
、または選択された細胞型についてのインサイチュハイブリダイゼーションもし
くは抗体染色を用いる標識化によって、視覚的に検出され得る。これらの型のコ
ントロールを使用して、薬剤は、アポトーシスインヒビターによって誘導される
分子機能または分子機構の損失の効果を「表現型複写」する能力についてスクリ
ーニングされ得る。実験的な真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）
における表現型複写は、コントロールにおいて観察される同一のもしくは類似の
表現型の複製または模倣に関する。
本発明は、アポトーシスと関連する酵素活性を検出することに依存するスクリ
ーニング方法を含む。１つの局面において、本発明は、薬剤を真骨魚類に投与す
る工程、および酵素の活性（例えば、カスパーゼ基質の切断）を検出することに
よってアポトーシス活性を示す真骨魚類における応答を検出する工程を含む、ア
ポトーシス活性についての薬剤のスクリーニング方法を提供する。
例えば、カスパーゼ酵素は、多数のアポトーシスの経路においてトリガー、エ
フェクター、またはメディエーターとして機能する、十分に特徴付けられている
プロテアーゼである。蛍光原性のカスパーゼ基質は、種々の方法（例えば、真骨
魚類への注入による方法、真骨魚類を含む培地への基質の溶解による方法を含む
）によって真骨魚類に導入され得る。基質の導入の様式は、レポーター基質の設
計の特定の型および性質（例えば、低分子、プラスミド）に依存する。蛍光原性
のカスパーゼ基質は、薬剤の投与の時点で、または投与後に、または通常、投与
に先立って導入され得る。カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ基質の切断）は
、例えば、市販の比色定量もしくは蛍光定量の酵素アッセイを使用することによ
って、または切断された基質を検出する抗体（例えば、Ｍ３０ ＣｙｔｏＤＥＡ
ＴＨ抗体；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用することによって
、測定され得る。胚の発育不全の特定のパターンは、発生の間に自然に起こるア
ポトーシス事象の阻害から生じる。カスパーゼ活性の阻害は、組織の奇形を含む
特定の形態学的効果を引き起こし得る。このような方法は、インビボで真骨魚類
の全身を使用して、またはインビトロで真骨魚類の細胞を使用して行われ得る。
このような方法は、種々の疾患（例えば、ガン）を処置するために潜在的な治療
的または予防的用途を有し得る、アポトーシス活性を有する薬剤を同定するため
に有用である。
（Ｃ．細胞死活性および／または新脈管形成活性および／または毒性活性につ
いて薬剤を同時にスクリーニングする工程）
細胞死活性について薬剤をスクリーニングするための方法は、本発明の他の方
法（新脈管形成活性（セクションＩＩ）または毒性活性（セクションＩＶ）につ
いて薬剤をスクリーニングする方法を含む）と組み合わせられ得る。真骨魚類は
透明であるので、薬剤に応答して真骨魚類中で細胞死活性、新脈管形成活性、お
よび／または毒性効果の効果を同時に評価することが可能である。応答は、１つ
以上の組織または器官中で、そしてあらかじめ決められた時間間隔でモニターさ
れ得る。
以前に記したように、これらの組み合わせた方法は、所望の応答および所望で
ない応答（例えば、有害な副作用）、ならびに他方を促進することなく、一方の
活性を促進するのに有効な薬剤の用量レベルを含む、薬剤の複数の効果を評価す
るうえで有用である。薬剤の投与に起因する、動物における複数の活性および応
答を評価する能力は、潜在的な治療化合物を同定すること、およびそれらの副作
用を評価することにおいて、特に有用である。例えば、アポトーシスの病理学的
な調節は、広範な種々のヒトの疾患（ガン、心臓疾患、神経変性性障害、ならび
に免疫疾患、腎臓疾患、およびウイルス誘導性の疾患を含む）と関連する。本質
的には、すべての細胞は発生の最も初期の段階から自殺するように保たれている
。従って、薬物が厳しく標的化されることは避けられない。標的化されていない
組織または器官における細胞死および毒性効果が無視できるレベルのみであるよ
うなバランスがまた、薬物を用いる処理の間に、達成されなくてはならない。本
発明の組み合わせた方法は、特定の器官および組織、または動物全体中での、潜
在的な薬物の細胞死ならびに有害な効果および毒性の効果の特異性ならびに程度
を評価するうえで有用である。
種々の技術が、複数の活性／応答を分析するために、ともにまたは別個に使用
され得る。これらの技術は、例えば、蛍光顕微鏡技術、光学顕微鏡技術、デジタ
ル画像分析技術、標準的マイクロプレートリーダー技術（比色定量、フルオロメ
トリー（時間分解フルオロメトリーを含む）、および化学発光）、放射測定分析
、インサイチュハイブリダイゼーション、真骨魚類の全身または真骨魚類の組織
、器官もしくは細胞における酵素の活性およびレベルの変化、特定のタンパク質
の抗体染色、動物内での時間的および空間的なタンパク質分布の変化などを含む
。
１つの局面において、本発明は、上記のようなインビボまたはインビトロでの
細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この
方法はさらに、毒性活性の増加または減少を示す真骨魚類における応答を検出す
ることによって、毒性活性の増加または減少について薬剤をスクリーニングする
工程を含む。別の局面において、本発明は、上記のようなインビボまたはインビ
トロでの細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法を提供
し、この方法はさらに、新脈管形成活性の増加または減少を示す真骨魚類におけ
る応答を検出することによって新脈管形成活性の増加または減少について薬剤を
スクリーニングする工程を含む。
このような組み合わせ方法を用いて、細胞死活性スクリーニングのための同時
発生的および／または履歴されたコントロール真骨魚類（またはその組織、器官
、もしくは細胞）は、少なくとも１つのアポトーシス分子機構のインヒビターが
、発生の特定の段階での真骨魚類（またはその組織、器官、もしくは細胞）に投
与され、従って特定の表現型を生成する上記のものを含み得る。次いで、薬剤は
、同一のまたは類似の表現型を誘導する能力についてスクリーニングされ得る。
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュ胚への細胞死の導入）
レチノイン酸（ＲＡ、ビタミンＡ酸）でのゼブラフィッシュの処理は、多数の
発生中の組織（神経管を含む）におけるアポトーシスの増加を導く。Ｅｌｌｉｅ
ｓら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６１：２３−３６（１９９７）。レチノイン酸は、Ｈ
ｏｘ遺伝子ファミリーの発現を調節することが公知である。この遺伝子ファミリ
ーのメンバーは、発生の間に細胞に対して位置の同定を付与することが示されて
いる。Ｈｕｎｔら，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８６１−８６４（１９９１）。レチ
ノイン酸誘導性アポトーシスは、細胞の独自性の変化の結果であり得るか、また
はアポトーシス経路に対する直接的効果の結果であり得る。いずれの場合でも、
異なる段階の発生へのレチノイン酸の適用は、細胞死に独特のパターンをもたら
す（例えば、図１０Ａ〜１０Ｂを参照のこと）。
正常なアポトーシスは、７２時間の完全な形態発生期間を通してゼブラフィッ
シュ胚において生じる；しかし、高レベルのアポトーシスは、２４時間胚へのレ
チノイン酸の投与によりその胚において誘導され得る。本発明の方法では、レチ
ノイン酸を用いて、アッセイの最適化のために細胞死の再現性のあるパターンを
生じる。細胞死活性がアポトーシスを含む場合、本発明のアッセイは、ゼブラフ
ィッシュ胚においてインビボでレチノイン酸により誘導されるアポトーシスの効
果（すなわち、コントロール）と、ゼブラフィッシュ胚に対するインビボでの試
験化合物の効果の比較を含み得る。このようなアッセイの精度は、ＴＵＮＥＬア
ッセイ（上記）を同じゼブラフィッシュ胚について実施することにより確認され
得る。
脊椎動物胚におけるインビボでの細胞死活性（例えば、アポトーシスまたは壊
死）に対する効果について試験化合物をスクリーニングする方法を以下に示す：

本方法は、公知の自動化ソフトウェアおよび計器システムを用いて容易に自動
化され得る。
本方法を用いて、ゼブラフィッシュ胚を、天然の交配により最初に生成し、次
いで収集し、そして５グラム（ｇ）の即席海水塩（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ
Ｓａｌｔ）と３ｇの硫酸カルシウムとを２５リットルの蒸留水中で合わせるこ
とにより調製した卵用水（ｅｇｇ ｗａｔｅｒ）中に置いた。次いで、胚を２ｍ
ｇ／ｍｌプロナーゼ溶液で２８℃にて１分間処理し、そして卵水中で３回洗浄し
て卵殻（ｃｈｏｒｉｏｎ）を除去する。この胚を、実験を通じて卵用培地中で保
持する。なぜなら、ゼブラフィッシュ胚は、結合している卵黄球（ｙｏｌｋ ｂ
ａｌｌ）から食物を受け取り、さらなる維持管理は必要とされないからである。
発生の１２〜１４時間後、胚を、０．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中
の０．１ μＭ〜１μＭレチノイン酸で２時間処理して、ゼブラフィッシュの前
脳および菱脳において細胞死を誘導する。前脳および菱脳における細胞死を、発
生約２４時間で検出し得る（図１０Ａ〜１０Ｂを参照のこと）。次いで、胚を、
卵用水中で２回洗浄し、そして染色のために適切な発生段階に到達するまで、２
８℃にて維持する。
（２．生きたゼブラフィッシュ胚における細胞死の蛍光検出）
細胞死を受けている細胞を同定するために、胚を、膜不透性の核染色蛍光色素
（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素ファミリーの色素）で染色
する。ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素は、ＤＭＳＯ中に可溶性であり
、そして色素を直接その培地（この培地は通常ＤＭＳＯを含む）に添加すること
により、ゼブラフィッシュに投与され得る。ゼブラフィッシュは、高レベルのＤ
ＭＳＯに十分耐性である。
ゼブラフィッシュ胚を生成し、そして卵殻を上記の通りに除去する。この胚を
以下の４つの群に分ける：
１）未処理の非染色胚（自己蛍光＋細胞死）
２）処理した非染色胚（自己蛍光ｗ／誘導性細胞死）
３）未処理の染色した胚（蛍光色素＋正常細胞死）
４）処理し、染色した胚。
２群および４群からの胚を、上記の通りに発生１２時間でレチノイン酸で処理
する。発生２０時間で、各群からの個々の胚を、卵用水１００マイクロリットル
（μｌ）中でマルチウェル培養プレート（例えば、９６ウェル培養プレート）の
単一のウェルに置く。ゼブラフィッシュ胚は１００μｌの水中で正常に発生する
ので、この魚を維持する培地に試験化合物および色素を容易に直接添加し得る。
この手順では、蛍光色素を、３群および４群からの胚の培地に、１／５、１／１
０、１／５０、１／１００、および１／２００の希釈で添加する。各色素濃度に
ついて、胚を、３０分間の間隔で４時間収集する。次いで、この胚をタンク水中
で５分間、２回洗浄する。この胚を、低い光レベルの検出のためにＣＣＤカメラ
を備えた上方蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏ
ｐｅ）を用いて調べる。画像を、標準的なソフトウェア（例えば、Ｐｈｏｔｏｓ
ｈｏｐ，Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて収集し、そして比較する。１群の
胚は、正常レベルの自己蛍光を反映する。２群の胚は、アポトーシス細胞または
レチノイン酸により引き起こされた自己蛍光を反映する。３群の胚は、正常に生
じる細胞死を示す。４群の胚は、アッセイの開発のための一次ベースラインを提
供する。
細胞死（例えば、アポトーシス）の蛍光検出の精度を確認するために、従来の
ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識アッセイ（末端デオキシウリジン
ヌクレオチド末端標識または「ＴＵＮＥＬ」と称される）を同じ胚について行う
（１群〜４群、上記）。このＴＵＮＥＬアッセイは、Ｇａｖｒｉｅｌｉら，Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：４９３−５０１（１９９２）に記載される。この
アッセイは、標準的な組織病理学的手順を通じて処理された組織切片における核
におけるＤＮＡ切断のインサイチュでの標識方法である。この方法は、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、アポトーシ
ス細胞の核内でＤＮＡフラグメントを末端標識する。ＴｄＴは、３’−ＯＨ末端
のＤＮＡに特異的に結合し、ポリデオキシヌクレオチドポリマーの合成を確実に
する。組織学的切片上の核ＤＮＡをタンパク質分解処理に曝露した後、ＴｄＴを
用いて、ＤＮＡ切断部位でビオチン化デオキシウリジンを取り込む。得られるシ
グナルを、アビジン−ペルオキシダーゼにより増幅し、光学顕微鏡法による従来
の組織化学的同定を可能にする。
ゼブラフィッシュ胚は透明であるので、全体を取り付ける形式でＴＵＮＥＬ染
色を行い得る。胚全体を、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、そしてＧ
ａｖｒｉｅｌｉ（前出）により記載されたＴＵＮＥＬ手順を用いて染色する。胚
を、ｄｄＨ2０（二回蒸留水）および１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中
でリンスする。次いで、胚を、ＴｄＴ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基、１
４０ｍＭ カコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１Ｍ 塩化コバルト（ＣｏＣｌ
2））を用いて３７℃にて３時間前処理する。次いで、胚を、ｐＨ７．２にて、
０．１％ Ｔｗｅｅｎを有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）中で３０分
間３回洗浄する。次いで、ＰＢＳＴを、４０μＭビオ−１６−ｄＵＴＰ（Ｅｎｚ
ｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および０．３単位／μｌのＴｄＴ酵素（ＩＢＩ
／Ｋｏｄａｋ）を含有するＴｄＴ緩衝液の反応混合物で３７℃にて一晩置換する
。この反応を、胚を２×生理食塩水−クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）中で
洗浄することにより終結させる。次いで、胚を、ＰＢＳ中でリンスする。ビオチ
ン化ヌクレオチドを、製造業者のプロトコル（Ａ＋Ｂ試薬、Ｖｅｃｔａｓｔａｉ
ｎ）に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプ
トアビジン複合体を用いて検出する。ＨＲＰを、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４
）中の５００μｇ／ｍｌ ＤＡＢ、０．２％ ＣｏＣｌ2、０．２％ ＮｉＳＯ4
（ＮＨ4）2ＳＯ4−６Ｈ2Ｏおよび１０％ Ｈ2Ｏ2を含有する３，３’−ジアミノ
ベンジジン（ＤＡＢ）溶液中でこの切片をインキュベートすることにより検出す
る。染色した胚を、複合光学顕微鏡で可視化する。
本発明者らの細胞死検出方法のさらなる試験として、本発明者らはまた、シク
ロオキシゲナーゼインヒビターであって細胞死の特有のパターンを生じる、イブ
プロフェンで処理した胚中の細胞を色素が標識する能力を試験した。このパター
ンは、この胚の細胞における不透明性の変化の進行により示されるような細胞の
死の後ろから前への進行からなる。
発生２４時間の胚を、胚用培地中で１００ナノモル濃度の蛍光色素（例えば、
ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素）で１時間前処理した。次いで、この
胚を、この培地への添加により１００μＭのイブプロフェンに曝露し、そして光
学顕微鏡法および上方蛍光顕微鏡法により１５分間毎に２時間調べた。コントロ
ールの胚を、同じ濃度の色素で前処理したが、イブプロフェンには曝露しなかっ
た。１時間以内に、蛍光標識細胞は、実験胚の尾の後部端で検出されたが、コン
トロール胚では検出されなかった。１時間および３０分間では、標識された細胞
は、尾の先端から肛門のレベルまで広がる大きな斑状に検出された。２時間では
、蛍光標識された細胞は、胚全体を通して見られ得た。対照的に、標識細胞のこ
のようなパターンは、コントロール胚では観察されなかった。蛍光標識された細
胞のこのパターンは、胚において不透過性変化が観察されたパターンと同一であ
った。
（３．誘導された細胞死活性のレスキュー）
真骨魚類モデルを用いて細胞死活性をブロックまたは低減する化合物について
スクリーニングし得るか否かを決定するために、イブプロフェンへの曝露の前に
胚に、カスパーゼ３インヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃２６４１５５）を
マイクロインジェクションした。
具体的には、発生２４時間の胚を、卵殻除去（ｄｅｃｈｏｒｉｏｎａｔｅ）し
、そして２５μＭカスパーゼ３インヒビターまたはＰＢＳのいずれかを卵黄にマ
イクロインジェクションした。発生２６時間で、胚を、培地への添加により１０
０μＭイブプロフェンに曝露した。１時間で、不透明な細胞が、ＰＢＳを注射し
た胚において観察されたが、カスパーゼインヒビターを注射した胚においては観
察されなかた。イブプロフェンの添加の２時間後、ＰＢＳを注射した胚は完全に
不透明であった。対照的に、カスパーゼインヒビターを注射した胚は、依然とし
て透明であったが、これらの胚における尾の最後部の領域において不透明な細胞
が出現し始めた。イブプロフェンの導入の２４時間後、実験胚の全てが死滅した
。
（４．細胞死活性に対する効果についての化合物のスクリーニング）
広範な種々の化合物を、細胞死活性（例えば、アポトーシス活性または壊死活
性）に対するそれらの潜在的な効果について、本発明の方法を用いることにより
分析し得る。治療的または予防的な薬物、化学物質、毒素、および医薬は、なか
でも、細胞死活性に対するそれらの効果（アポトーシスを阻害または誘発する能
力を含む）について試験し得るものである。
スクリーニングされ得る化合物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを含む種々の供給源から入手され得る。
試験され得る化合物は、その化合物を、真骨魚類を含む溶液または培地中に溶
解することにより、真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）にインビボで投与さ
れ得る。この化合物は、真骨魚類により吸収される。あるいは、この化合物は、
真骨魚類に直接注射され得る。
アポトーシス活性に対するその効果について化合物をスクリーニングする場合
、その試験化合物が投与された真骨魚類胚を利用するアッセイを、レチノイン酸
が投与されている胚と比較することは有用である。このような比較アッセイのた
めに、真骨魚類胚を以下の４つの群に分ける：
１）レチノイン酸なし、試験化合物なし（正常コントロール）
２）レチノイン酸、試験化合物なし（誘導された細胞死のコントロール）
３）レチノイン酸なし、試験化合物
４）レチノイン酸、試験化合物
スクリーニング方法は、上記の通りに実施される。具体的には、２群および４
群に属するゼブラフィッシュ胚を、上記と同じ条件下でレチノイン酸で処理して
、同じ程度のアポトーシスを誘導する。次いで、３群および４群に属するゼブラ
フィッシュ胚を、この試験化合物に曝露する。次いで、全ての胚を、色素で染色
し、そして低い光レベルの検出のためにＣＣＤカメラを備えた上方蛍光顕微鏡（
ＮＩＫＯＮ Ｅ６００）を用いて画像を収集する。次いで、各群からのゼブラフ
ィッシュ胚を、画像および分析ソフトウェアを用いて比較する。１群胚を、（正
常）コントロール胚として役立てる。２群の胚は、レチノイン酸によって誘導さ
れるアポトーシスのレベルについてのコントロールを提供する。３群の胚は、こ
の試験化合物がアポトーシスを誘導する能力を実証する。４群の胚は、レチノイ
ン酸と比較した、この試験化合物がアポトーシスを誘導または抑制する能力を表
す。アポトーシスのシグナル面積およびアポトーシス細胞数の絶対変化を用いて
、この試験化合物がアポトーシス活性に対する効果を有したかを決定する。
特に、本発明の方法は、生きた透明な真骨魚類胚において実施される。細胞死
活性（例えば、アポトーシス活性または壊死活性）に対する試験化合物のインビ
ボでの効果を、上記のゼブラフィッシュ胚群を４日間までの期間にわたって２４
時間間隔で調べることにより、経時的に決定し得る。真骨魚類の特定の器官（例
えば、脳）または組織の細胞の死に対する化合物の効果は経時的に調べられ得る
。細胞死の器官特異的パターンおよび組織特異的パターンを同定し得る。さらに
、この化合物の効果の持続性および持続時間を、本発明の方法により決定し得る
。さらに、胚全体または特定の器官および組織系（例えば、心血管系、腸系、お
よび筋系）のいずれかまたは両方に対する化合物の効果を、インビボで同時にま
たは独立して決定し得る。真骨魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）は作製するこ
とが容易であり、そしてこのアッセイは容易に再現可能であるので、多数の試験
化合物は、アポトーシスおよび／または壊死を含む細胞死活性に対する、および
細胞死活性の調節のそれらのそれぞれの効果について容易にかつ迅速にスクリー
ニングされ得る。
ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素を利用する方法を用いて、特定の化
合物がアポトーシスのプロセスおよび壊死プロセスに対して有し得る潜在的効果
を区別し得ない。発生中の胚では、壊死細胞死は、例えば、物理的操作によって
引き起こされる非生理学的損傷によって胚が損傷を受けない限り、稀にしか生じ
ない。胚への非生理的損傷を除去するため（従って、壊死から生じる任意の細胞
死を除去するために）、卵殻除去した胚を、寒天でコーティングしたウェルにお
いて維持する。寒天でのコーティングは、胚の外胚葉への表皮剥奪を防止する。
このような表皮剥奪は、胚がプラスチックの表面と接触した場合に生じ得る。胚
へのさらなる非生理学的損傷を予防するために、一旦各胚をマルチウェル培養プ
レートのウェル中に置いたら、各胚に触らない。胚に対する染色、化合物曝露、
および観察は、胚を操作することなく、マルチウェル培養プレートにおいて全て
行われ得、それゆえ、その胚への壊死的損傷の可能性を低減する。酵素活性（例
えば、カスパーゼ酵素活性）が報告された特異的蛍光原基質を、透明な真骨魚類
胚において用い得、そしてアポトーシス活性と壊死活性との間を区別することを
補助し得る。
真骨魚類胚（例えば、ゼブラフィッシュ）は、発生の最初の４〜５日間は少な
い流体容量（例えば、１００μｌ）において維持され得るので、単一の胚を、マ
ルチウェル（例えば、９６ウェル）培養プレートの個々のウェルにおいて保持し
得る。あるいは、複数の胚（例えば、１０個の胚）を、２４ウェル培養プレート
または４８ウェル培養プレートなどの各ウェルにおいて保持し得る。このことは
、例えば、蛍光シグナル、比色シグナル、放射性シグナル、および化学発光シグ
ナルを含むシグナルを、標準的なマイクロタイタープレートリーダーを用いて検
出すること、ならびに細胞死活性に対するそれらの効果についての種々の化合物
のＡＰ染色および検出の方法を自動化することを可能にする。
検出を自動化することに加えて、サンプル操作を、色素および化合物の真骨魚
類への迅速な再現性のある適用のために、本明細書中に記載される方法を用いて
自動的に行い得る。化合物適用の処理能力を増加させるために、現在利用可能な
ロボットシステム（例えば、ＱｉａｇｅｎからのＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００、
ＺｙｍａｒｋからのＺｙｍａｔｅ、またはＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓからのＢｉｏｍｅｋ）（これらの大部分はマルチウェル培養プレート形式を
用いる）を本発明の方法について用い得る。周知でかつ市販の機器システムを用
いて、インサイチュハイブリダイゼーションおよびデータ記録、ならびに本発明
のスクリーニング方法の修正システムおよび他の局面を自動化し得る。
本発明はまた、細胞死活性に対するインビボでの効果について化合物をスクリ
ーニングする方法を提供する。この方法は、この化合物を真骨魚類にインビボで
投与する工程、および細胞死活性に対する効果を示す、真骨魚類における応答を
検出する工程を含む。ここで、化合物のライブラリーは、アポトーシス活性およ
び壊死活性を含む細胞死活性に対する効果についてスクリーニングされる。いく
つかのこのような方法において、化合物のライブラリーは、天然の化合物を含む
。本発明の他のこのような方法では、化合物のライブラリーは、合成化合物を含
む。本発明のさらに他の方法では、このライブラリーはコンビナトリアルライブ
ラリーである。本発明の方法は、化合物および化学ライブラリーを、細胞死を抑
制または誘発する（アポトーシスまたは壊死を抑制または誘発することを含む）
分子についてスクリーニングするために有用である。
（ＩＶ．毒性活性についての薬剤のスクリーニング方法）
（Ａ．動物全体での毒性試験）
毒性試験のための優れた方法は、ヒトおよび動物の健康に対する種々の化合物
の潜在的影響を評価するために細胞ベースのアッセイを用いる。哺乳動物細胞に
対する化学物質の細胞傷害性効果を、細胞生存率および予定外のＤＮＡ合成によ
って主に測定する。これらの毒性スクリーニングは、細胞標的に対する化合物の
インビトロでの効果を評価するために設計されているので、これらは、死亡率を
含む、生物レベルでの効果を予測する能力が制限される。対照的に、毒性試験の
ための動物全体の使用は、細胞ベースのアッセイの限界に取り組み、そして分子
レベルおよび細胞レベルでの同時評価を可能にする。
胚全体での試験は、無脊椎動物（ショウジョウバエおよび線虫を含む）につい
て以前に行われた（Ｅｉｓｓｅｓ，Ｔｅｒａｔｏｇ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．Ｍｕｔ
ａｇｅｎ ９：３１５−３２５（１９８９）；Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋら，Ａｒｃｈ
．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：２５２−２６０（１
９９７））。しかし、無脊椎動物はヒトには密接に関連しておらず、多くの同じ
器官および酵素を欠いているので、ヒトにおける毒性効果の予測物としてのこの
ような結果の使用は、制限される。哺乳動物における胚毒性試験は、以下の２つ
のカテゴリーに分類される：１）ラット胚またはマウス胚のいずれかを用いる培
養アッセイ、および２）化合物が妊娠したマウスまたはラットの腹膜中へ注射さ
れる、子宮内アッセイ。胚全体でのマウスおよびラット培養技術は、脊椎動物に
おける毒性試験についての確認方法である（Ｃｈａｔｏｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０７：１４７１−１４７３（１９８０）；ＣｉｒｃｕｒｅｌおよびＳｃｈｍｉ
ｄ，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ １８：６１７−６２４（１９８８））が、この方
法を用いる毒性試験は、複雑であり、そして制限された数の高価なアッセイしか
行われ得ない。胚は、発生８．５日目に、内臓卵黄嚢および栄養膜錐体（ｅｃｔ
ｏｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｏｎｅ）を用いてインタクトで、慎重に外植されなけ
ればならない。胚の培養時間はまた、４８時間までに制限される（Ｂｅｃｈｔｅ
ｒら，Ｔｅｒａｔｏｌ．４４：２９Ａ（１９９１））。さらに、培養条件の複雑
さに起因して、偽陽性および偽陰性の両方の発生率は高い（Ｇｕｅｓｔら，Ｃａ
ｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２（１）：５７−６２（１９
９４））。子宮内アプローチは、これらの問題を回避する；しかし、このアプロ
ーチは、母体の肝臓において試験されるべき化合物が代謝され得るという事実に
よって複雑になる。さらに、子宮内アプローチは出生前効果を調べるのに有用で
あるが、このアプローチは、生後の発達に対する化合物の毒性効果を評価する際
には役立たない。カエル胚系は、インビトロでの毒性試験のために通常用いられ
る別のモデルである；しかし、カエル胚は透明ではないので、特定の組織および
器官に対する毒性活性を経時的に、または同時に調べることが非常に困難である
。動物の複数の異なる器官および組織における毒性活性について、同時におよび
／または動物全体においてインビボで薬剤をスクリーニングするのを可能にする
方法が必要である。
（Ｂ．毒性活性スクリーニング方法）
本発明は、インタクトな動物全体において、ならびに動物全体の組織および器
官においてインビボで、または動物の細胞をインビトロで使用して細胞において
、毒性活性について薬物をスクリーニングする方法を提供する。このような活性
は、この薬剤が投与されていない同時および／または歴史的なコントロールの真
骨魚類（または真骨魚類の組織、器官、または細胞）に対して評価され得る。こ
のような方法は、薬剤を真骨魚類に投与する工程、および活性を示す真骨魚類に
おける応答を検出する工程を含む。このような方法は、特定の薬剤に起因する、
真骨魚類全体における発生中の器官および組織に対する有害な効果および致死的
な効果を含む毒性応答について迅速に、包括的に、そして再現可能にスクリーニ
ングし、そしてこの毒性応答を予測するために有用である。
ゼブラフィッシュは、なかでも、これらの方法のために好ましい真骨魚類であ
る。上記で詳細に概説したように、ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュが透
明であること（従って、複数の組織および器官の観察および分析を同時に容易に
すること）を含む毒性試験についての多数の利点を提供し、迅速に発生し、生成
し、そして維持するのが容易でかつ安価であり、そして高処理量毒性スクリーニ
ングに敏感に反応する。さらに、この組織および器官の発生の形態学的および分
子的な基礎は、一般に、ヒトを含む他の脊椎動物に同一であるかまたは類似する
かのいずれかであり、従って、ゼブラフィッシュにおける化合物の毒性スクリー
ニングは、ヒトにおける化合物の効果についての関連する情報を提供する。さら
に、本発明者らは、真骨魚類が毒性に対して用量依存性を示し、従って、ゼブラ
フィッシュおよび本明細書中に記載の毒性スクリーニング方法が特定の器官およ
び組織系に対する薬物の特定の用量の効果、ならびにこのような用量に対する特
定の器官および組織の感受性を決定する際に有用であることを決定した。
上記のように、スクリーニングされるべき化合物は、この化合物を、真骨魚類
を含む培地に単に添加することにより拡散によって、またはマイクロインジェク
ションもしくは当業者に公知の類似の技術によって、真骨魚類に投与され得る。
本発明は、１以上の器官（例えば、腎臓、膵臓、心血管系、中枢神経系、肝臓
など）または組織に対する毒性効果または活性について薬剤をインビボで同時に
または独立してスクリーニングするための方法を含む。薬剤が動物細胞の培養物
に投与され、そして活性を示す応答がその細胞中で検出される、インビボでの方
法もまた含まれる。全てのこのような方法を用いて、とりわけ、化学的化合物、
医薬、治療剤、環境的薬剤および農業的薬剤、工業的薬剤、汚染物質、化粧品（
ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、合成または天然の化合物、薬物、有機化合物
、脂質、糖質コルチコイド、ペプチド、抗生物質、キメラ分子、糖、炭水化物な
どを含む、広範囲の薬剤および化合物をスクリーニングし得る。これらの薬剤お
よび化合物を単独でまたは複合体混合物を含む混合物としてスクリーニングし得
る。
本発明の方法は、器官毒性についての生体マーカーとしての重要な肝臓および
腎臓の酵素を評価するための分子的方法の調査を可能にする。差し引きライブラ
リー技術および複数の酵素的アッセイは、公知の毒性の薬物と組み合わせて用い
られて、薬物応答および代謝活性化現象に関与する新規な遺伝子を同定し得、従
って、新規な生体マーカーを確立および確認することに寄与する。
動物（例えば、真骨魚類）への化合物の投与により生じる毒性効果および活性
は、その動物における種々の応答（例えば、分子的変化、遺伝子変異、発生の欠
損、発生の遅延、遺伝子毒性、生殖毒性、器官毒性、または発育不全、行動毒性
、奇形遺伝性、その動物の死などを含むがこれらに限定されない）により示され
得る。毒性活性を示す応答は、真骨魚類全体において、または真骨魚類の少なく
とも１つの組織もしくは器官において検出され得る。この応答は、複数の組織お
よび器官において同時にまたは所定の時間間隔を空けて経時的に別々に検出され
得る。例えば、この応答は、少なくとも２つの異なる組織、少なくとも２つの異
なる器官、または少なくとも１つの器官および少なくとも１つの組織において検
出され得る。インビトロでの方法では、この応答は、真骨魚類の１以上の細胞に
おいて検出される。
さらに、毒性活性を示す応答を、薬剤投与後の特定の時間におよび／または特
定のセットの条件下で細胞、組織、器官、または動物全体において発現された１
以上のｍＲＮＡのレベルを抽出および測定することにより、動物のこのような１
以上の細胞、組織、もしくは器官についての、または動物全体についての遺伝子
発現（ｍＲＮＡ）プロフィールの変化として検出し得る。このことを行うために
、差し引きライブラリー実験を実施し得る。コントロール（未処理）胚および実
験（処理）胚からのｍＲＮＡを、初期および後期の応答期間に抽出する。差し引
きライブラリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて構築する。化合物への曝露の結果として示差的
に発現される、この胚からの遺伝子を、標準的な手順を用いて選択的に単離し、
クローニングし、そして特徴付ける。このｃＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡマイクロ
アレイを構築する。
毒性活性を示す応答をまた、薬剤投与後の特定の時間におよび／または特定の
セットの条件下で細胞、組織、器官、または真骨魚類全体において発現された１
以上の異なるタンパク質のレベルを抽出および測定することにより、動物の１以
上の細胞、組織、器官についての、または動物全体についての、タンパク質発現
プロフィールの変化として検出し得る。このタンパク質ベースのアプローチでは
、翻訳後修飾または翻訳後プロセシング（例えば、切断）の差異を、２次元ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を用いて調べ得る。コントロール胚および化合物に
曝露した胚からの抽出物を、電気泳動での分離の前に各抽出物を異なる発蛍光団
でタグ化することにより、同じゲルにおいて直接比較し得る。このタグは、電気
泳動の間に標識されたタンパク質の相対移動度に対して効果を有さない。両方の
サンプルにおいて改変されないで出現するタンパク質は、両方の蛍光色素から構
成される点として出現する。切断、リン酸化などの結果として２つのサンプル間
で異なるタンパク質は、元の抽出されたサンプルにおいてタグ化されたように蛍
光を発する。
当業者は、種々の技術を一緒にまたは別々に用いてシグナル（例えば、インサ
イチュハイブリダイゼーション、特定のタンパク質の抗体染色など）を生成し得
、そして応答を（例えば、比色定量、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、デジタル画
像解析、標準的なマイクロプレートリーダー技術、蛍光比色法（時間分解型蛍光
比色法を含む）、および化学発光、目視検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写
真フィルム、または最新の機器の使用（例えば、レーザー走査デバイス、蛍光測
定器、フォトダイオード、量子計数管、プレートリーダー、上方蛍光顕微鏡、走
査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメーター、キャピラリー電気泳動検出
器、またはシグナルを増幅するための手段（例えば、光電子倍増管）によって）
検出および評価し得ることを認識する。
（Ｃ．毒性活性および／または新脈管形成活性および／または細胞死活性につ
いての薬剤の同時スクリーニング）
本明細書に記載される毒性活性についての薬剤のスクリーニングのための方法
は、新脈管形成活性（第ＩＩ節）および細胞死活性（第ＩＩＩ節）について薬剤
をスクリーニングする方法を含む本発明の他の方法と組み合わせられ得る。透明
な真骨魚類について以前に記載したように、真骨魚類まるごとまたは１つ以上の
組織または器官におけるそのような複数活性およびそのような活性から生じる応
答を、同時にかつ予め設定された時間間隔で評価することは可能である。毒性ス
クリーニングを細胞死活性についてのスクリーニングと組み合わせるアッセイは
、以前に議論したように、薬剤の投与から生じる有害かつ致死的な応答、適切な
投薬量を同定するために、ならびに有効な治療薬および処置プログラムの開発に
おいて有用である。
種々の技術（蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、デジタル画像解析、標準的マイク
ロプレートリーダー技術（比色定量、蛍光定量（時間分解型蛍光定量を含む）、
および化学発光）、インサイチュハイブリダイゼーション、特異的なタンパク質
の抗体染色、酵素変化、真骨魚類における時間的および空間的なタンパク質分布
に於ける変化などを含む）が、複数の活性および応答を一緒にまたは別々に分析
するために使用され得る。
１つの局面において、本発明は、細胞死活性に対する効果（上記の通り）を示
す真骨魚類における応答を検出することにより、細胞死活性に対する効果につい
て薬剤をスクリーニングする工程をさらに含む、上記のような毒性活性について
薬剤をスクリーニングする方法を提供する。細胞死の組織および器官特異的パタ
ーンは、器官に対する毒性を分析するために種々のマーカーを検査することに加
えて、評価され得る。細胞死を経る細胞は、上記で議論したような手段を含む種
々の手段（例えば、ベンゾチアゾリウム−４−キノリウム色素ファミリーからの
膜不透過性の核染色色素、ＴＵＮＥＬアッセイ、またはカスパーゼ活性の比色定
量もしくは蛍光定量酵素アッセイを使用して）によって同定され得る。
別の局面において、本発明は、新脈管形成活性における増加または減少を示す
真骨魚類における応答を検出することによって、新脈管形成における増加または
減少について薬剤をスクリーニングする工程をさらに含む、上記のように毒性活
性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
（実施例）
（１．ゼブラフィッシュにおける肝臓および腎臓に対する毒性活性についての
化合物のスクリーニング）
（Ａ．方法）
１）胚収集
野生型ゼブラフィッシュ胚を天然の対となる交配によって生成し、生存性につ
いて選別し、そしてセクションＩＩに記載のように、新脈管形成活性についての
スクリーニング方法のために収集した。生存性について選別される前の胚。この
魚の胚は、付着している卵黄嚢から食物を受けるので、さらなる維持管理は必要
とされなかった。
２）化合物スクリーニング
上記のように、動物まるごと（例えば、真骨魚類）ならびに特定の器官および
組織に対する、毒性活性について記載の方法を使用して種々の化合物がスクリー
ニングされ得る。治療的／薬理学的化合物の発生性の毒性効果がまた研究され得
；真骨魚類を使用したときのそのような化合物での結果は、哺乳動物モデルを使
用してＮＣＩによって得られる結果と比較され得る。このような比較によって、
潜在的な治療化合物の発生性の毒性効果についての予言的アッセイのための本発
明の方法および動物モデルの使用が評価され得る。
３）胚の維持および化合物の投与
受精したゼブラフィッシュ胚を、我々の水産養殖設備における天然の放卵から
入手した。バッチ間の変動を減少させるために、３または４個の独立した交配か
らの胚の無作為化したサンプルを使用した。試験培地を、前出のＷｅｓｔｅｒｆ
ｉｅｌｄに従って、蒸留水２５リットル中、５ｇのＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ
Ｓａｌｔを３ｇのＣａＳＯ4と混合することにより調製した。実験を通して、
試験培地において胚を維持した。発生２４時間での胚（卵殻を有する）を、化学
的化合物およびコントロールの異なる濃度の化学的化合物に５日間連続的に曝露
した。一般に、濃度は、１００ナノモル濃度（ｎＭ）から１００マイクロモル濃
度（μＭ）までの範囲であった。試験を各シリーズの希釈について４回繰り返し
、そして標準偏差を、各処理について計算した（「統計学的方法」の節を参照）
。濃度あたり１０個の胚を、２４マルチウェルプレートを使用して総容量１ｍｌ
（１００μｌ／胚の一定比）に曝露した。（９６ウェルプレートのような他のサ
イズのマルチウェルプレートもまた、スクリーニングを容易にするために使用さ
れ得る）。その化合物を毎日更新した。全ての場合において、０．１％のジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、処理の間のキャリア溶媒として使用した。０．
１％ＤＭＳＯを含むコントロールおよび含まないコントロールを、全ての実験に
おいて行った。このアプローチは、麻酔薬および他の化学物質を、魚の胚に導入
するために使用されてきた（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、前出）。
光への曝露に起因する化合物の分解を防止するために、暗黒下で一定の温度（
２８〜２８．５℃）で実験を行った。死滅した胚を毎日除去し、計数し、そして
中央致死濃度（ＬＣ５０、本明細書の「統計的方法」の節を参照のこと）を計算
するために用いた。毎日、生存している胚を、解剖用双眼顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、
倍率３０〜５０×）下で視覚的に分析した。巨視的な奇形（例えば、軸方向の欠
陥、胚の死亡率、成長阻害、一般的な奇形（小頭症、大頭症、尾の切断、尾の奇
形、体節の軸の構造の欠失などを含む））を、動物まるごとに対する毒性を評価
するために、観察し、分類分けし、そして計数した。致死的な化合物、または発
生の間（例えば、発生の最初の５日間）にこれらもしくは任意の記録された奇形
もしくは破壊を誘導した化合物、器官に対する毒性効果についてさらに試験した
。この毒性化合物によって影響を受ける胚発生段階が決定され得る。器官毒性は
、インサイチュハイブリダイゼーション、酵素アッセイ、および免疫化学手順を
使用して生存している胚において評価され得る。
毒性効果についてスクリーニングされた治療薬物について、Ｍｅｄｉａｎ Ｅ
ｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＥＣ５０）（標的に対して所
望の効果を生じるために必要とされる濃度の中央値）が決定され得る。治療的ウ
インドウ（ＴＷ）（例えば、ＬＣ５０／ＥＣ５０）もまた、決定され得る；高Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｗｉｎｄｏｗ（例えば、１００または１０００）を示す
化合物は、良好な潜在的薬物候補である。なぜなら、治療濃度において毒性が低
いからである。
４）組織および器官に対する毒性試験
ａ）インサイチュハイブリダイゼーション
特定の組織および器官の変性をアッセイするために、ジゴキシゲニン（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識したＲＮＡプローブでの全マウント
インサイチュハイブリダイゼーションを使用し得る。初期胚組織を染色するプロ
ーブには、体節形成の間の沿軸中胚葉についてＭｙｏＤ；脊索について短尾奇形
が含まれる。器官を特異的に染色するプローブには、尾側の中脳および前側の菱
脳の異常発生の検出のためのｋｒｘ２０およびｐａｘ２；予定脳（ｐｒｅｓｕｍ
ｐｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ）、脊髄、および排泄系についてのｃ−ｒｅｔ（発生中
の腎臓；前腎管（ｎｅｐｈｒｉｃ ｄｕｅｔ）および前腎）；ならびに眼蓋（ｏ
ｐｔｉｃ ｔｅｃｔｕｍ）、肝臓原基、および胃についてのｐｅｓが含まれる。
インサイチュハイブリダイゼーションは、以下のように実施される：胚をＰＢＳ
中４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして６５℃でハイブリダイズする。顕
微鏡下での視覚的検査のために、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を使用して、ＮＢＴ／Ｘホ
スファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）での染色後にシグナ
ルを検出する。組織および器官の発生および機能（例えば、肝臓および腎臓）に
対する毒性効果、異なる器官および組織における免疫組織化学的位置決定による
シトクローム（Ｃｙｔ．）Ｐ−４５０の構成性アイソザイムＬＭＣ２およびダイ
オキシン誘導性アイソザイムＬＭ４Ｂの発現および誘導性は、Ｂｕｃｈｍａｎｎ
ら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：１６０−１６９
（１９９３）に記載される方法を用いて分析され得る。
自動化インサイチュハイブリダイゼーション画像化分析は、ＮＢＴ／Ｘホスフ
ァターゼでの染色後にシグナルを検出するために、アルカリホスファターゼ結合
体化抗ジゴキシゲニン抗体を使用して容易に行われる。
ｂ）染色による肝臓における毒性活性の評価
処理された動物まるごとの肝臓における毒性活性を、迅速比色定量染色手順を
使用して視覚的に評価し得る。この手順は、動物まるごと（例えば、ゼブラフィ
ッシュ胚）の肝臓、胃、および消化管における天然にビオチン化したカルボキシ
ラーゼ酵素を検出するために、ストレプトアビジン（アビジン）結合体化レポー
ター酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）の使用に基づいている。これらのビオチ
ニルリジン含有酵素（例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよび他のカル
ボキシラーゼ）は、主に、肝臓および消化管に存在する。結果として、染色は、
器官特異的である（図１１）。肝臓の定量的なビオチン化評価がなされ得る。ビ
オチン化の視覚的な検出により、肝臓のサイズおよび位置が決定され得る。
ゼブラフィッシュ胚（４、５、または６日齢）を、４％パラホルムアルデヒド
で１時間、室温で固定し、そして１００％メタノールで一晩、−２０℃で処理し
た。胚を、再水和し、そしてＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳＴで洗浄後、胚をブロ
ッキング溶液（ＰＢＳＴ中、３％ ＢＳＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で、１時
間インキュベートし、そして漂白溶液（５％ホルムアミド、０．５×ＳＳＣ、Ｈ
2Ｏ2 １０％）で２０分間、自然光照射下で処理した。漂白後、胚を同じブロッ
キング溶液で再び（２回目）１時間インキュベートし、そしてストレプトアビジ
ン結合体化ペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）（同じブロッキング溶液中で１：
１００希釈）とともに振盪させながら室温で２時間インキュベートした。次いで
、胚を２０分間３回ＰＢＳＴで洗浄し、そしてペルオキシダーゼについて２つの
異なる色素：肝臓染色を評価するためのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）（不溶性）、および比色定量方法を使用して定量的可視的シグナルを測
定するための２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−ス
ルホン酸）（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ）（可溶性）で染色した。使用したＤＡＢ
染色溶液は、以下を含んでいた：１ｍｌ ＤＡＢストック溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ
のジアミノベンジジン／ｍｌ、ｐＨ７．４）、９ｍｌのＰＢＳ、１０μｌのＨ2
Ｏ2（３０％）。通常、特異的肝臓染色は１〜５分で可視化された。ＤＡＢ溶液
についての染色は、水での何回かの洗浄によって終結させた。ＡＢＴＳ比色定量
法は、１０ｍｌのＡＢＴＳ溶液（３３ｍｌの０．１Ｍ クエン酸／ＯＨ、ｐＨ４
．３５中１０ｍｇ）および１０μｌの過酸化水素（３０％ストック）を使用し、
そして室温で１つの条件あたり少なくとも５個の胚（１ｍｌのＡＢＴＳ溶液／５
個の胚）で３０分間行った。ＡＢＴＳ染色を、２０％ＳＤＳ／５０％Ｎ’Ｎ−ジ
メチルホルムアミドで終結させた。ＡＢＴＳシグナルを、４０５ナノメータ（ｎ
ｍ）で分光光度計を使用して、その溶液の吸光度を測定することによって検出し
た。各条件について、４回繰り返し、そして下記の「統計的方法」のセクション
に示すように標準偏差「Ｓ」を計算した。
ｃ）染色による腎臓における毒性活性の評価
腎臓（前腎）での毒性活性は、処理された動物まるごと（例えば、ゼブラフィ
ッシュ）の腎臓の比色定量染色によって視覚的に評価され得る。ゼブラフィッシ
ュ前腎は、色素生産性色素を使用して容易にアッセイし得る高レベルの酵素アル
カリホスファターゼを発現する。ゼブラフィッシュ胚において腎臓を染色するた
めに、胚を２％パラホルムアルデヒドで一晩４℃で固定し、次いで、１００％メ
タノールで３０分間室温で処理した。胚を再び水和し、そしてＮＴＭＴ緩衝液（
５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
、ｐＨ９．５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で室温で平衡化し、次いで染色溶
液（同じ緩衝液中に平衡化した７５ｍｇ／ｍｌ ＮＢＴおよび５０ｍｇ／ｍｌ
Ｘホスフェート）で染色した。通常、特異的な腎臓染色を、１０〜２０分間可視
化した（図１４）。この染色法を用いて、アスピリンおよびデキサメタゾンの腎
臓に対する毒性活性を評価した（以下を参照のこと）。
ｄ）酵素活性の評価
酵素活性の評価についての方法論は、異なる時点（数時間から数日）での異な
る化合物への真骨魚類胚の曝露、および引き続く異なる酵素活性のインビトロ分
析に関与する。胚を、異なる化合物の存在下または非存在下（すなわち、コント
ロール）でマルチウェルプレートにおいてインキュベートする。曝露後、それら
を使用して細胞溶解産物調製物を得る。酵素を、終点または速度論実験において
、比色定量色素または蛍光定量色素の使用によりアッセイする。このプレートを
適切なマイクロプレートリーダーにおいて読みとる。多酵素マイクロアレイが構
築され得る。
５）アスピリンおよびデキサメタゾンの器官毒性活性の評価
実行可能性研究において、アスピリンおよびデキサメタゾンをゼブラフィッシ
ュ胚に対する毒性活性について、本明細書に記載の本発明の方法を用いてスクリ
ーニングした。アスピリン（シクロオキシゲナーゼの一般的なインヒビターであ
る）（Ｂｏｓｍａｎ，Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：３２４−３３４（１
９９４））は、哺乳動物胚における種々の器官（腎臓を含む）において毒性を生
じることが以前に示された（Ｕｎｇｖａｒｙら、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ ２７（
２）：２６１−６９（１９８３）。デキサメタゾン（免疫抑制剤（Ｉｉｄａら、
Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９：１１９１−１２０２（１９９８）））は
、肝臓毒性および胃腸毒性を産生すること、および癌治療を受けている子供にお
いて肝毒性であることが以前に示された（Ｗｏｌｆｆら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ． １８（４Ｂ）：２８９５−９９（１９９８））。
結果を表４に表す。アスピリンにおいてと同様に、デキサメタゾンについては
、ゼブラフィッシュ胚で得られたＬＣ５０は、マウスおよびラットについて以前
に記載された値と類似していた（表４）。肝臓毒性および胃腸毒性ならびに用量
応答性効果がまた、観察された（図１２Ａ〜１２Ｂ）。上記で議論した定量的な
比色定量終点法を、肝臓に対する薬物処理の効果を測定するために使用した（図
１３）。１００μＭのデキサメタゾンでの処理は、未処理の胚と比較して、比色
定量シグナルを約７０％低減させた（コントロール、０％デキサメタゾン、図１
３）。サイズの減少と十分に相関する色における変化は、色素生産性色素を使用
して肝臓において以前に観察された（図１２Ｂ、下）。これは、このアッセイの
再現性および精度を示唆する。この方法は、定量的であり（良好な信頼限界で）
、迅速であり、そして実施するのが容易であった。
この方法は、自動化毒性スクリーニングの公知の装置および技術を使用して自
動化され得る。

６）統計学的方法
ａ）ＬＣ５０の推定
これらの研究においてアスピリンおよびデキサメタゾンで試験した濃度につい
て、部分的致死性はなく、そして効果濃度のパラメータ「死亡なし」（０％）お
よび「死亡」（１００％）の幾何平均はＬＣ５０とされ、そして二項式信頼限界
をＳｔｅｐｈａｎ、「ＬＤ５０を計算する方法」、Ａｑｕａｔｉｃ Ｔｏｘｉｃ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈａｚａｒｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（Ｆ．Ｌ．Ｍａｙｃ
ｅおよびＪ．Ｌ．Ｈａｍｅｌｉｎｋ編）ＡＳＴＭ ＳＴＰ ６３４、６５〜８４
頁、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅ
ｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９７７）に従って計算した。
ｂ）標準偏差
上記の比色定量肝臓染色法を、定性的データ（すなわち、器官のサイズ、存在
、または位置の変化）を得るために使用し、そして各処理に見出される変化の有
意性を研究するために使用した。各条件について、４回繰り返し、そして統計値
を標準偏差とともに使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ９７または類
似の公知の、標準的ソフトウェア／グラフィックスプログラムを使用してグラフ
ィックスを作製した。
７）催奇効果
例えば、成長阻害および奇形発生（小頭症、大頭症、尾の切断、尾の奇形を含
む）のような、化合物の毒性活性を示すさらなる毒性応答／効果についての情報
を、解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、倍率３０〜５０×）を使用して視覚的検査によっ
て評価し得る。多数の毒性応答および効果は、透明な真骨魚類胚において迅速か
つ同時に評価され得る。
８）さらなる生体マーカーの評価
市販されている抗体は、腎臓および肝臓の異なる酵素の発現および誘導性を免
疫組織化学により検出するために使用され得る。これらの生体マーカーを用いて
、薬物および化合物（公知の毒性を有するものを含む）の毒性が、調査され得る
。差引きライブラリースクリーニングにおいて使用されるべき新たな薬物の毒性
効果もまた、本明細書に記載の方法に従って容易に評価され得る。このような抗
体の例には、例えば、抗プロトンポンプＨ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（腎臓、Ｐａｎ
ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；以前に記載されたようにシトクロームＰ
−４５０の抗ＬＭＣ２および抗ダイオキシン誘導性アイソザイムＬＭ４Ｂ（腎臓
および肝臓）（Ｂｕｃｈｍａｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．１２３：１６０−６９（１９９３））；抗グルタチオンＳトランスフェラ
ーゼ（腎臓、肝臓、Ｐａｎｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。
（２．差引きライブラリー技術を使用する化合物毒性応答に関与する器官特異
的遺伝子の同定）
薬物毒性についての予想法として、多数パラメータ毒性試験が、非常に価値が
ありかつ有用である。差引きライブラリー実験は、このようなアプローチを開発
するのに有用である。このような方法論は、化学物質／薬物への曝露の結果とし
て標的器官において差引きに発現する遺伝子の同定を可能にする。現在、薬物／
化学物質毒性応答および薬物／化学物質代謝活性化に関与する遺伝子／経路は、
主に利用可能なプローブおよび基質がないために、アッセイするのが困難である
。器官薬物毒性に関するさらなる情報は、差引きライブラリー法を使用して、動
物（例えば、真骨魚類）において新たな遺伝子を単離することによって得られ得
る。遺伝子がクローニングされ、その遺伝子の発現プロフィールが評価され、そ
して毒性についてのマーカーとしてのそれらの有意性が、哺乳動物において以前
に得られたデータと比較される。
（Ａ．差引きライブラリー技術）
薬物／化学物質への曝露の結果として標的器官において差引きに発現される遺
伝子は、以下のように、差引きライブラリー技術を使用することによって、同定
され得る。本発明者らのＬＣ５０および器官毒性法および上記の分析からの選択
された化合物を使用して、ゼブラフィッシュ胚を器官毒性を誘導するように処理
する。薬物処理の間の異なる時点において、肝臓および／または腎臓（処理およ
びコントロール）を解剖する。この材料は、処理された胚およびコントロール胚
において差引きに発現される新たな遺伝子を単離するための差引きライブラリー
を調製するために使用される。差引きライブラリー技術（例えば、Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、選択的に遺伝子を単離する。Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔシステムは、抑制ＰＣＲを使用し、そし
てｃＤＮＡを差し引きしそして均等化するのに、わずか１回の差引きハイブリダ
イゼーションを必要とするのみである。さらに、この技術は、比較している２つ
の型の組織から調製される非常に低い量のポリＡ＋ＲＮＡ（通常、０．５〜２．
０μｇ）を必要とする。最近、この技術を使用して、カフェインでアップレギュ
レートされるいくつかの遺伝子（ＩＧＦ−１Ｂを含む）を、前Ｂ細胞株１〜８か
ら、そしてナチュラルキラー細胞抗原ＮＫＲ−Ｐ１（ＨｕｂａｎｋおよびＳｃｈ
ａｔｚ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５６４０−５６４８（１
９９４））の推定ホモログを単離した。
差引きライブラリー技術によって同定された遺伝子を選択し、そして化合物／
薬物への曝露の間の胚におけるこれらの遺伝子の発現パターンを評価し得る。こ
の発現パターンを、類似の条件下で哺乳動物ホモログにおいて見出されるパター
ンと比較し得る。毒性（例えば、器官毒性）の「良好な」インジケータまたはマ
ーカーとして作用する遺伝子が、同定および選択され得る。
（Ｂ．トランスジェニック真骨魚類）
標的遺伝子から上流の、推定の毒性値応答を有する適切な調節領域を使用して
、レポーター遺伝子を有するトランスジェニック真骨魚類（例えば、ゼブラフィ
ッシュ）を構築し得る。トランスジェニックゼブラフィッシュにおけるレポータ
ー遺伝子の発現をコントロールする調節領域を使用するために、これらの遺伝子
の５’上流領域を分析する。このアプローチにおいて、差引きライブラリー技術
を使用して単離された遺伝子を使用して、５’調節領域を分析する。レポーター
遺伝子（例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））をこれらの調節領域の制
御下で保有するプラスミドを構築するために、サイズ（１または２キロベース）
および発現プロフィールにおいて適切な上流の調節領域を用いる。これらのプラ
スミドを使用して、Ｌｏｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４：４１０５−
４１１１（１９９７）に記載されるようにトランスジェニック魚を産生する。例
えば、ゼブラフィッシュは透明なので、ＧＦＰ（特定の器官および組織における
レポーター遺伝子）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの細胞は、
標準的な蛍光に基づく検出技術を使用して、インビボで検出され得る。特に、Ｇ
ＦＰを発現する細胞が青色光または紫外線（ＵＶ）光で照射される場合、明るい
緑の蛍光が観察される。光刺激ＧＦＰ蛍光技術は、コファクター、基質、または
さらなる遺伝子産物を必要としない。従って、スクリーニングがインビボで行わ
れ得、そして同じ胚を使用して、毒性効果が、例えば、蛍光プレートリーダーを
使用して経時的にモニターされ得る。このスクリーニング法を使用して、他の方
法ではアッセイするのが困難である薬物応答に関与する多くの遺伝子が容易に評
価され得る。
（Ｃ．ゼブラフィッシュｃＤＮＡマイクロアレイ）
ｃＤＮＡマイクロアレイ技術は、薬物毒性応答における遺伝子発現の複雑な組
み合わせおよび代謝活性化現象のプロフィールを作るのに使用され得る。特定の
器官毒性の遺伝子発現を、上記の差引きライブラリー技術によって単離された選
択されたゼブラフィッシュ遺伝子および他の遺伝子供給源のマイクロアレイを使
用してモニターし得る。ｃＤＮＡアレイは、単純であり、そしてハイブリダイゼ
ーション結果の直接読み取りを可能にする；従って、これらは、異なる時点で薬
物処理を経験した組織における遺伝子発現パターンを研究するための理想的な技
術を構築する（Ｈｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９４：２１５０−２１５５（１９９７））。
（Ｄ．スクリーニングの自動化）
上記の多数パラメータ方法論は、標準的な装置およびコンピューターソフトウ
ェアプログラムを使用して自動化され得、そして１週間あたり数百の化合物のス
クリーニングを可能にする。真骨魚類胚のスクリーニングを、受精胚を含む９６
マルチウェル培養プレートにおいて行い得る。上記の他のスクリーニング法に関
しては、真骨魚類胚が通常１００μｌの水において発生するので、化合物および
色素は、容易に培地に添加され得る。さらに、透明な真骨魚類胚は、それらが死
んだ場合には不透明になるので、胚の死亡率は、標準的なマイクロタイタープレ
ートリーダーを使用してＬＣ５０を計算するのは比較的簡単である。器官の毒性
について、ｃＤＮＡマイクロアレイアッセイは、良好な信頼限界を伴って定量的
（色または蛍光）であり、そしてＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュは
、経時的にモニターされ得るので、マルチウェルプレートリーダー形式（例えば
、９６ウェルまたは任意の他の数のマルチウェル）が使用され得る。
上記の発明は、明確性および理解のために、いくらか詳細に記載されているが
、本開示を読めば、形態および詳細の種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱せ
ずになされ得ることは、当業者には明らかである。上記の実施例は、本発明を例
示するために提供されるものであり、その範囲を限定するものではない。本発明
の他の改変が、当業者には容易に明らかであり、本発明の特許請求の範囲に包含
される。従って、本発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではな
く、その代わりに、添付の特許請求の範囲をその等価物の全範囲とともに参照し
て決定されるべきである。本出願において引用された全ての刊行物、参考文献、
および特許文献は、本明細書において、各々の刊行物または特許文献がそのよう
に個々に示されているのと同程度まで、全ての目的のためにその全体が参考とし
て援用される。

Claims (10)

  1. 細胞死活性に対する効果について薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
    真骨魚類と、死細胞または瀕死の細胞を標識する色素と、スクリーニングすべき薬剤とを接触させる工程、および
    該真骨魚類の少なくとも１つの組織または器官において、細胞死活性に対する効果を示す該真骨魚類における応答を検出する工程
    を含む、方法。
  2. インビボで毒性活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
    該薬剤をインビボで真骨魚類に投与する工程、および
    該真骨魚類の少なくとも１つの組織または器官における、該薬剤に対して応答性のタンパク質またはｍＲＮＡの発現の変化を検出する工程
    を含み、該真骨魚類における応答は、該真骨魚類の該少なくとも１つの組織または器官における毒性活性を示す、方法。
  3. 活性について薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、
    マルチウェルプレートのウェルにおいて溶液中で生きた真骨魚類を培養する工程；
    該溶液に該薬剤を添加し、それにより該薬剤が該真骨魚類に浸透する工程；および
    該薬剤が該真骨魚類において該活性を有するか否かを評価する工程；
    を含む、方法。
  4. 前記真骨魚類が、胚、幼生、または成体である、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオ、またはフグである、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記真骨魚類が、ゼブラフィッシュ胚である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記真骨魚類が、野生型系統またはトランスジェニックである、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法法。
  8. 前記マルチウェルプレートのウェルが、５０〜５００ｍｌの培地体積を含む、請求項３に記載の方法。
  9. 前記真骨魚類が、前記マルチウェルプレートのウェルにおいて６日間まで維持される、請求項８に記載の方法。
  10. 請求項３に記載の方法であって、前記薬剤が前記真骨魚類において前記活性を有するか否かを評価する工程が、マイクロプレートリーダーを使用して応答を検出することを包含する、方法。
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