JP2009153527A - ハイブリッド抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】減少した免疫原性を示し、一方で最適な結合プロフィールを維持する、起源の種由来の抗体に基づいて、非常に相同性の操作された抗体を提供すること。
【解決手段】ハイブリッド抗体および／またはハイブリッド抗体フラグメントならびにそれらを作製する方法を提供する。１つの実施形態において、ハイブリッド抗体および／またはハイブリット抗体フラグメントは、少なくとも２つの抗体に由来する２つ以上のフレームワーク領域を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【選択図】なし

Description

（背景）
（関連出願）
本願は、２００１年１２月３日に出願された、米国仮出願番号６０／３３６，５９１に
対して優先権を主張する。

（技術分野）
本明細書は、標的物に優先的に結合し、そして異なる種において低減された免疫原性を
有する、１つの種由来のハイブリッド抗体およびハイブリッド抗体フラグメントに関する
。

（関連技術の背景）
抗体は、脊椎動物において、Ｂ細胞として知られるリンパ球により、抗原による刺激に
応答して産生されるタンパク質である。抗体（免疫グロブリン（Ｉｇ）としてもまた公知
）分子の基本構造単位は、大文字の「Ｙ」の形に集まる４つのポリペプチド鎖からなる。
この４鎖のうちの２鎖は、同一の軽鎖（Ｌ鎖）であり、２鎖は同一の重鎖（Ｈ鎖）である
。５つの異なった種類（アイソタイプ）の重鎖が存在し、これらが抗体を、５つのクラス
（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に分ける。さらに、軽鎖に
は２つの異なるアイソタイプがあり、κおよびλと呼ばれる。それぞれのクラスの重鎖が
、どちらの軽鎖とも結合し得る。重鎖および軽鎖は、それぞれ、抗原との結合に関わる可
変領域（各々ＶＨおよびＶＬ）、および定常（Ｃ）領域を含む。抗原結合部位は、６つの
超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）としてもまた公知）から構成される。重鎖由来の
３つのＣＤＲおよび軽鎖由来の３つのＣＤＲは、それぞれの鎖において、４つの比較的保
存されている逆並行βシート（フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ
４）と呼ばれる）の間に、それぞれ位置している。慣習的に、番号付けの規則が、ＶＨ鎖
およびＶＨ鎖の構成部分の位置を表すために利用されてきた。Ｋａｂａｔの定義は、配列
の可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく。

Ｂ細胞によって合成されるＩｇ鎖の各型に対して、遺伝子セグメントの別個のプール（
生殖細胞系列遺伝子として公知）が存在し、このプールから、単一のポリペプチド鎖が合
成される。各プールは、異なる染色体上に位置し、そして代表的に、Ｖ領域をコードする
比較的多数の遺伝子セグメント、およびＣ領域をコードする、より少数の遺伝子セグメン
トを含む。各軽鎖Ｖ領域は、２種類の生殖細胞系列遺伝子セグメント（すなわち、長いＶ
遺伝子セグメント、短い連結（Ｊ）遺伝子セグメントおよびＣセグメント）から構築され
た核酸配列によって、コードされる。重鎖は、４種類の生殖細胞系列遺伝子セグメント（
可変領域に対して３つ、および定常領域について１つ）によってコードされる。重鎖可変
領域をコードする３つの生殖細胞系列遺伝子セグメントは、Ｖセグメント、Ｊセグメント
、およびダイバーシティ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）（Ｄ）セグメントである。ヒト生殖細胞
系列のＶ遺伝子配列、Ｄ遺伝子配列およびＪ遺伝子配列は、特徴付けられている。ヒト生
殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメント（このような「セグメント」はまた、本明細書中で、フ
ァミリーメンバーと称される）は、少なくとも８０％の配列相同性に基づいて、７つのフ
ァミリー（ＶＨ１〜ＶＨ７）に分類される。例えば、Ｍａｔｓｕｄａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．（１９９８）１８８：２１５１−２１６２を参照のこと。約５１個のＶＨセグメン
ト（ファミリーメンバー）が存在する。重鎖可変領域の最初の２つのＣＤＲおよび３つの
フレームワーク領域は、ＶＨによってコードされる。ＣＤＲ３は、ＶＨの数個のヌクレオ
チド（ＤＨの全ておよびＪＨの一部）によってコードされ、一方でＦＲ４は、ＪＨ遺伝子
セグメントの残りの部分によってコードされる。軽鎖に関しては、Ｖカッパ（Ｖκ）遺伝
子セグメントまたはＶラムダ（Ｖλ）遺伝子セグメント（ファミリーメンバー）は、Ｖ領
域の最初の２つのＣＤＲおよび３つのフレームワーク領域を、ＣＤＲ３の数個の残基と共
にコードする。Ｊカッパ（Ｊκ）セグメントおよびＪラムダ（Ｊλ）セグメントは、それ
ぞれＶκ領域またはＶλ領域におけるＣＤＲ３領域の残りの部分をコードする。κ鎖をコ
ードするＤＮＡは、配列相同性に基づいて６つのファミリー（ＶκＩ〜ＶκＶＩ）に分類
される、約４０個のＶκセグメント（ファミリーメンバー）を含む。λ鎖をコードするＤ
ＮＡは、１０のファミリーに分類される、約３１個のＶλセグメント（ファミリーメンバ
ー）を含む。図１、２、３および６を参照のこと。

抗体および抗体フラグメントは、種々のヒト疾患に関して、急性と慢性との両方の状況
において、有望な治療剤になっている。抗体を作製するために利用されるいくつかの方法
が存在し、この方法としては、ハイブリドーマ技術、細菌ディスプレイ、リボソームディ
スプレイ、酵母ディスプレイ、およびヒト抗体フラグメントの、複製可能なバクテリオフ
ァージの表面での組換え発現が挙げられる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（これは、ハ
イブリドーマによって産生され得る）は、多年にわたって、診断剤として首尾よく応用さ
れてきたが、治療剤としてのこれらの使用は、出現したばかりである。ｍＡｂの大部分は
、非ヒト（ほとんどがげっ歯類）起源であり、ヒトにおける免疫原性の問題を提起する。
げっ歯類起源の抗体がヒトに投与される場合、抗げっ歯類抗体が産生され、これらは、血
清からのげっ歯類抗体の増強したクリアランス、この抗体の治療効果の遮断、および過敏
症反応を生じる。これらの制限は、「ヒト化」として公知の操作技術の開発を促した。

最初のヒト化ストラテジーは、重鎖および軽鎖の可変ドメインは抗原との結合を担って
おり、そして定常ドメインはエフェクター機能を担っている、という知見に基づいていた
。キメラ抗体は、例えば、げっ歯類ｍＡｂの可変ドメインの、ヒト抗体の定常ドメインへ
の移植（例えば、 Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳら，Ｎａｔｕｒｅ ３１４，２６８−７０
，１９８５，および Ｔａｋｅｄａ ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４，１９８５
）により、生成された。これらのキメラ抗体は、ヒトにおいて、よりよくエフェクター機
能を誘導し、かつ免疫原性の減少を示すが、げっ歯類可変領域は、なお免疫応答の誘導の
危険を与える。可変ドメインが、抗原結合ループ（相補性決定領域またはＣＤＲ）を乗せ
たβシートフレームワークからなることが認識されたとき、ヒト化抗体は、ヒトフレーム
ワーク上にグラフトされたげっ歯類ＣＤＲを含むように設計された。いくつかの異なる抗
原結合部位が、しばしば、全ヒトフレームワーク領域がげっ歯類配列に最も高い相同性を
持つ抗体を使うことで、単一のヒトフレームワーク上に首尾よく移された（例えば、Ｊｏ
ｎｅｓ ＰＴ ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５，１９８６； Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎ Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２７，１９８８；およびＳａｔｏ Ｋ．
ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，３７１−８，１９９４）。あるいは、コンセンサス
ヒトフレームワークが、いくつかのヒト重鎖に基づいて構築された（例えば、Ｃａｒｔｅ
ｒ Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，４８７−９９，１９
９２）。しかし、単純なＣＤＲグラフティングは、しばしば抗原親和性の低下を引き起こ
した。βシートフレームワークとループとの間に起こり得る他の相互作用が、抗原結合部
位の改造のために考慮されるべきであった（Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１９６，９０１−９１７，１９８７）。

いくつかの抗体のヒト化に必要な必須のフレームワーク残基の比較、および抗体結晶構
造に基づいたコンピューターモデリングは、「ベルニエ領域（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ
）残基」（Ｆｏｏｔｅ Ｊ．ら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２４，４８７−９９，１９９２）
と呼ばれる、おそらく結合部位の完全性に寄与するフレームワーク残基一式を明らかにし
た。さらに、ＶＨ−ＶＬ境界区域におけるいくつかの残基は、抗原への親和性の保持に重
要であり得る（Ｓａｎｔｏｓ ＡＤ ら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６０，１６９−９４ １９９８）。最初、フレームワーク残基は、
徐々にげっ歯類配列へと戻し変異させられた（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ ら，
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎ．４，７７３−７８３，１９９１）。しかしこの変異による
手法は、非常に時間のかかるもので、かつ、重要な残基の全てを網羅することはできない
。

特定の任意の抗体に対し、小さな一連の改変は、結合を最適にするために十分であり得
るが、ベルニエおよびＶＨ／ＶＬ残基の組から選び出すことは難しい。選択技術と組み合
わせたコンビナトリアルライブラリーアプローチ（ファージディスプレイなど）は、全て
の重要なフレームワーク残基においてげっ歯類配列とヒト配列との間のどちらかを示しか
つ全てのヒト化形態の結合活性の同時決定を可能にする、ヒト化分子のライブラリーの生
成により、ヒト化技術の大改革を行った（例えば、非特許文献１および非特許文献２）。
上記アプローチは、単一の抗体の可変重鎖または可変軽鎖由来のフレームワーク領域全
体を利用して、ＣＤＲを受容する。減少した免疫原性を示し、一方で最適な結合プロフィ
ールを維持する、起源の種由来の抗体に基づいて、非常に相同性の操作された抗体を提供
することは、有利である。この抗体は、治療目的および診断目的で、標的種に投与され得
る。

Ｒｏｓｏｋ ＭＪ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１，２２６１１−８，１９９６ Ｂａｃａ Ｍ ら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１０６７８−８４，１９９７

（要旨）
１つの局面において、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを産生す
るための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：標的に対する特異性を有
する初期抗体を提供する工程；初期抗体の可変領域の少なくとも一部の配列を決定する工
程；ならびに（ｉ）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される可変
領域の第一の部分を選択する工程；第一の選択された部分の配列を、標的種由来の抗体配
列または抗体フラグメント配列の参照データベースに含まれる配列と比較する工程；なら
びにデータベース中の抗体から、第一の部分に対して高度な相同性を示す配列を選択する
工程；（ｉｉ）第一の部分とは異なる、可変領域の第二の部分を選択する工程であって、
この第二の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される、工
程；第二の部分の配列を、標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照デー
タベースに含まれる配列と比較する工程；第二の部分に対して高度な相同性を示し、そし
て工程（ｉ）において選択された抗体とは異なる抗体由来である配列を、データベースか
ら選択する工程；ならびに（ｉｉｉ）選択されたフレームワーク配列を、初期抗体の１つ
以上のＣＤＲに作動可能に連結して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメ
ントを生成する工程。上記方法は、可変領域全体が合成されるまで、可変領域の残りの部
分に対して続けられ得る。残りの部分は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）においてデータ
ベースから選択された部分と、同じ抗体由来であっても異なる抗体由来であってもよい。
上記第一の部分、第二の部分、および／または残りの部分は、１つ以上のＤＣＲを含み得
る。第一の部分、第二の部分、および／または残りの部分において、フレームワーク領域
の組み合わせは、上記工程における比較のために使用され得ることが理解されるべきであ
る。初期抗体の可変領域は、可変軽鎖または可変重鎖であり得る。上記配列は、アミノ酸
配列であっても核酸配列であってもよい。抗体は、当業者に公知である任意の公知の抗体
形態（例えば、抗体全体、キメラ抗体、二価抗体など）であり得る。上記抗体フラグメン
トは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、抗体軽鎖および抗体重鎖か
らなる群より選択され得る。標的種は、ヒトであり得る。

１つの実施形態において、初期抗体由来のＦＲ１領域配列は、高度な相同性を有する配
列のための参照データベースを検索するために、個々に使用される。別の実施形態におい
て、初期抗体由来のＦＲ２領域配列は、高度な相同性を有する配列のための参照データベ
ースを検索するために、個々に使用される。別の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ
３領域配列は、高度な相同性を有する配列のための参照データベースを検索するために、
個々に使用される。別の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ４領域配列は、高度な相
同性を有する配列のための参照データベースを検索するために、個々に使用される。この
参照データベースは、標的種の生殖細胞系列または再配列した抗体配列を含み得る。

別の局面において、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する
ための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：標的に対する特異性を有す
る、初期抗体を提供する工程；初期抗体の可変フレームワーク領域の少なくとも一部の配
列を決定する工程；ならびに（ｉ）ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からなる群より選択され
る可変領域の第一の部分を選択する工程；可変領域の第一の部分の配列を、標的種由来の
抗体配列または抗体フラグメント配列の参照データベースに含まれる配列と比較する工程
；ならびに第一の部分に対して高度な相同性を示す配列を、データベースから選択する工
程；ならびにこの配列が由来する生殖細胞系列遺伝子ファミリーを決定する工程；（ｉｉ
）第一の部分とは異なる、可変領域の第二の部分を選択する工程であって、この第二の部
分は、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からなる群より選択される、工程；第二の部分の配列
を、標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照データベースに含まれる配
列と比較する工程；第二の部分に対して高度な相同性を示し、そしてこの段落の工程（ｉ
）において選択された第一の配列と同じ生殖細胞系列遺伝子ファミリーに対応する配列を
、データベースから選択する工程；ならびに（ｉｉｉ）選択されたフレームワーク配列を
、初期抗体の１つ以上のＣＤＲに作動可能に連結して、ハイブリッド抗体またはハイブリ
ッド抗体フラグメントを生成する工程。この局面において記載される方法は、フレームワ
ーク領域の第三の部分に関して、続けられ得る。１つの実施形態において、ＦＲ４が添加
され、そしてこの段落の工程（ｉｉｉ）の生成物に作動可能に連結され、そして可変領域
全体が合成される。この方法は、ハイブリッド抗体全体が生成されるまで、拡張され得る
。初期抗体の可変フレームワーク領域は、軽鎖であっても重鎖であってもよい。この段落
の第一の部分、第二の部分、および／または第三の部分は、１つ以上のＤＣＲを含み得る
。第一の部分、第二の部分、および／または第三の部分において、フレームワーク領域の
組み合わせは、この段落に示される工程における比較のために使用され得ることが理解さ
れるべきである。

１つの実施形態において、参照データベースから選択される配列の２つ以上は、異なる
抗体由来である。上記配列は、アミノ酸配列であっても核酸配列であってもよい。抗体は
、当業者に公知である任意の公知の抗体形態（例えば、抗体全体、キメラ抗体、二価抗体
など）であり得る。上記抗体フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’
）_２、Ｆｄ、抗体軽鎖および抗体重鎖からなる群より選択され得る。標的種は、ヒトであ
り得る。

１つの実施形態において、初期抗体由来のＦＲ１領域配列は、高度な相同性を有し、そ
してそれが属する生殖細胞系列遺伝子ファミリーが、他の選択された配列が対応するファ
ミリーとして使用される配列のための参照データベースを検索するために、個々に使用さ
れる。別の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ２領域配列は、高度な相同性を有し、
そしてそれが属する生殖細胞系列遺伝子ファミリーが、他の選択された配列が対応するフ
ァミリーとして使用される配列のための参照データベースを検索するために、個々に使用
される。別の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ３領域配列は、高度な相同性を有し
、そしてそれが属する生殖細胞系列遺伝子ファミリーが、他の選択された配列が対応する
ファミリーとして使用される配列のための参照データベースを検索するために、個々に使
用される。別の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ４領域配列は、高度な相同性を有
する配列のための参照データベースを検索するために、個々に使用される。この参照デー
タベースは、標的種の生殖細胞系列または再配列した配列を含み得る。１つの実施形態に
おいて、選択される配列の少なくとも２つは、生殖細胞系列遺伝子ファミリーにおいて、
同じファミリーメンバーに対応する。

別の局面において、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは、第一の
抗体由来の第一の重鎖フレームワーク領域、および第二の抗体由来の第二の重鎖フレーム
ワーク領域を含む。１つの実施形態において、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体
フラグメントは、第一の抗体、第二の抗体、および第一の抗体でも第二の抗体でもない第
三の抗体からなる群より選択される抗体を起源とする、第三の重鎖フレームワーク領域を
含む。別の実施形態において、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは
、第一の抗体、第二の抗体、第三の抗体、および第一の抗体でも第二の抗体でも第三の抗
体でもない第四の抗体からなる群より選択される抗体由来の、第四の重鎖フレームワーク
領域を含む。１つの実施形態において、フレームワーク領域は、ヒト起源であり、そして
ＣＤＲは、非ヒト起源である。

別の局面において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体由来の第一の軽鎖フレームワーク
領域、および第二の抗体由来の第二の軽鎖フレームワーク領域を含む。１つの実施形態に
おいて、ハイブリッド抗体は、第一の抗体、第二の抗体、および第一の抗体でも第二の抗
体でもない第三の抗体からなる群より選択される抗体を起源とする、第三の軽鎖フレーム
ワーク領域を含む。別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体、第二の抗
体、第三の抗体、および第一の抗体でも第二の抗体でも第三の抗体でもない第四の抗体か
らなる群より選択される抗体を起源とする、第四の軽鎖フレームワーク領域を含む。１つ
の実施形態において、フレームワーク領域は、ヒト起源であり、そしてＣＤＲは、非ヒト
起源である。

別の局面において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体由来の第一の重鎖フレームワーク
領域（この第一の重鎖フレームワーク領域は、特定のＶＨファミリーに対応する）、およ
び第二の抗体由来の第二の重鎖フレームワーク領域（この第二の重鎖フレームワーク領域
は、第一の重鎖フレームワーク領域と同じＶＨファミリーに対応する）を含む。１つの実
施形態において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体、第二の抗体、および第一の抗体でも
第二の抗体でもない第三の抗体からなる群より選択される抗体を起源とする、第三の重鎖
フレームワーク領域を含む。この第三の重鎖フレームワーク領域は、第一の重鎖フレーム
ワーク領域と同じＶＨファミリーに対応する。別の実施形態において、ハイブリッド抗体
は、第一の抗体、第二の抗体、第三の抗体、および第一の抗体でも第二の抗体でも第三の
抗体でもない第四の抗体からなる群より選択される抗体由来の、第四の重鎖フレームワー
ク領域を含む。なお別の実施形態において、第二の重鎖フレームワーク領域および第三の
重鎖フレームワーク領域のいずれかまたは両方は、第一の重鎖フレームワーク領域と同じ
ＶＨファミリーのメンバーに対応する。１つの実施形態において、フレームワーク領域は
、ヒト起源であり、そしてＣＤＲは、非ヒト起源である。

別の局面において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体由来の第一の軽鎖フレームワーク
領域（この第一の軽鎖フレームワーク領域は、特定のＶκファミリーに対応する）、およ
び第二の抗体由来の第二の軽鎖フレームワーク領域（この第二の軽鎖フレームワーク領域
は、第一の軽鎖フレームワーク領域と同じＶκファミリーに対応する）を含む。１つの実
施形態において、ハイブリッド抗体は、第一の抗体、第二の抗体、および第一の抗体でも
第二の抗体でもない第三の抗体からなる群より選択される抗体を起源とする、第三の軽鎖
フレームワーク領域を含む。この第三のフレームワーク領域は、第一の軽鎖フレームワー
ク領域と同じＶκファミリーに対応する。別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、
第一の抗体、第二の抗体、第三の抗体、および第一の抗体でも第二の抗体でも第三の抗体
でもない第四の抗体からなる群より選択される抗体を起源とする、第四の軽鎖フレームワ
ーク領域を含む。なお別の実施形態において、第二の軽鎖フレームワーク領域および第三
の軽鎖フレームワーク領域のいずれかまたは両方は、第一の軽鎖フレームワーク領域と同
じＶκファミリーのメンバーに対応する。１つの実施形態において、フレームワーク領域
は、ヒト起源であり、そしてＣＤＲは、非ヒト起源である。
別の局面において、ハイブリッド抗体は、第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク
領域および第２の抗体由来の第２の軽鎖フレームワーク領域を含み、この第１の軽鎖フレ
ームワーク領域は、特定のＶλファミリーに対応し、この第２の軽鎖フレームワーク領域
は、第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶλファミリーに対応する。１つの実施形態に
おいて、ハイブリッド抗体は、第１の抗体、第２の抗体および、第１の抗体でも第２の抗
体でもない第３の抗体からなる群から選択される抗体から生じる第３の軽鎖フレームワー
ク領域を含む。第３のフレームワーク領域は、第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶλ
ファミリーに対応する。別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、第４の軽鎖フレー
ムワーク領域を含み、この第４の軽鎖フレームワーク領域は、第１の抗体、第２の抗体、
第３の抗体および、第１の抗体でも第２の抗体でも第３の抗体でもない第４の抗体からな
る群から選択される抗体から生じる。さらに別の実施形態において、第２の軽鎖フレーム
ワーク領域および第３の軽鎖フレームワーク領域のいずれかまたは両方は、第１の軽鎖フ
レームワーク領域と同じＶλファミリーのメンバーに対応する。１つの実施形態において
、フレームワーク領域は、ヒト起源であり、ＣＤＲは、非ヒト起源である。

別の局面において、本発明の開示に従うハイブリッド抗体および／またはハイブリッド
抗体フラグメントを含む抗体または抗体フラグメントのライブラリーが、提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法であって、以下：
標的に対して特異性を有する初期抗体を提供する工程；
該初期抗体の可変領域の配列を決定する工程；ならびに
（ｉ）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される該可変領域の
第１の部分を選択する工程；
該第１の部分の配列と、標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照デ
ータベース中に含まれる配列とを比較する工程；
該第１の部分に対して高度の相同性を示す配列を該データベース中の抗体から選択す
る工程；
（ｉｉ）該第１の部分とは異なる該可変領域の第２の部分を選択する工程であって、
該第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される、工程
；
該第２の部分の配列と、該標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベースに含まれる配列とを比較する工程；
該第２の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）において選択される該抗
体とは異なる抗体に由来する配列を該データベースから選択する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作
動可能に連結して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工
程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するため
の方法であって、以下：
前記第１および第２の部分とは異なる前記可変領域の第３の部分を選択する工程であっ
て、該第３の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される、
工程；
該第３の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
該第３の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）および（ｉｉ）における選
択のために使用される該参照データベース中の抗体と同じか、または異なる抗体に由来す
る配列を該データベースから選択する工程；ならびに
該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目３）
項目２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するため
の方法であって、以下：
前記第１、第２および第３の部分とは異なる前記可変領域の第４の部分を選択する工程
であって、該第４の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択さ
れる、工程；
該第４の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
該第４の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）、（ｉｉ）および項目２
における選択のために使用される該参照データベース中の抗体と同じか、または異なる抗
体に由来する配列を該データベースから選択する工程；ならびに
該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目４）
前記第１の部分が、ＣＤＲを含む、項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目５）
前記第２の部分が、ＣＤＲを含む、項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目６）
前記第１の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群の２つまたは３つの
メンバーの組み合わせである、項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗
体フラグメントを生成するための方法。
（項目７）
前記第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群の２つまたは３つの
メンバーの組み合わせである、項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗
体フラグメントを生成するための方法。
（項目８）
前記初期抗体の可変領域が、可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される、項目
１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法
。
（項目９）
可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される抗体フラグメントが生成される、請求
項３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方
法。
（項目１０）
前記配列が、アミノ酸配列または核酸配列である、項目１に記載のハイブリッド抗体ま
たはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目１１）
前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、Ｆｄ、ダイア
ボディ、抗体軽鎖および抗体重鎖からなる群より選択される、項目１に記載のハイブリ
ッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目１２）
前記標的種が、ヒトである、項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体
フラグメントを生成するための方法。
（項目１３）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
であって、前記初期抗体由来のＦＲ１領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
（項目１４）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
であって、前記初期抗体由来のＦＲ２領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
（項目１５）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
であって、前記初期抗体由来のＦＲ３領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
（項目１６）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
であって、前記初期抗体由来のＦＲ４領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
（項目１７）
項目１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
であって、前記参照データベースが、前記標的種の生殖細胞系列配列または再配列された
配列を含む、方法。
（項目１８）
ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法であって、以下：
標的に対して特異性を有する初期抗体を提供する工程；
該初期抗体の可変領域の配列を決定する工程；ならびに
（ｉ）ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からなる群より選択される該可変領域の第１の部
分を選択する工程；
該可変領域の第１の部分の配列と、標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配
列の参照データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
該第１の部分に対して高度の相同性を示す配列を該データベースから選択する工程；
該配列が、生殖細胞系列遺伝子ファミリー由来か否かを決定する工程；
（ｉｉ）該第１の部分とは異なる該可変領域の第２の部分を選択する工程であって、
該第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からなる群より選択される、工程；
該第２の部分の配列と、該標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベースに含まれる配列とを比較する工程；
該第２の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）におけるデータベースか
ら選択される該第１の配列と同じ生殖細胞系列遺伝子ファミリーに対応する配列を該デー
タベースから選択する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作
動可能に連結して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工
程、
を包含する、方法。
（項目１９）
項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するた
めの方法であって、以下：
前記第１および第２の部分とは異なる前記可変領域の第３の部分を選択する工程であっ
て、該第３の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からなる群より選択される、工程；
該第３の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
該第３の部分に対して高度の相同性を示し、かつ該データベースからの該第１の配列と
同じ生殖細胞系列遺伝子ファミリーに対応する配列を該データベースから選択する工程；
該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２０）
項目１９に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するた
めの方法であって、以下：
ＦＲ４である可変領域の第４の部分を選択する工程；
該第４の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
データベースに含まれる配列とを比較する工程；
該第４の部分と高度の相同性を示す配列を該データベースから選択する工程；ならびに
該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目２１）
前記第１の部分が、ＣＤＲを含む、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリ
ッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目２２）
前記第２の部分が、ＣＤＲを含む、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリ
ッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目２３）
前記第１の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２またはＦＲ３からなる群のメンバーの任意の組み合わ
せである、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを
生成するための方法。
（項目２４）
前記第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２またはＦＲ３からなる群のメンバーの任意の組み合わ
せである、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを
生成するための方法。
（項目２５）
前記初期抗体の可変領域が、可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される、項目
１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方
法。
（項目２６）
可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される抗体フラグメントが生成される、請求
項２０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための
方法。
（項目２７）
前記参照データベースから選択される配列が、異なる抗体由来である、項目１８に記載
のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目２８）
前記参照データベースから選択される配列の２つ以上が、異なる抗体由来である、項目
１９に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方
法。
（項目２９）
前記参照データベースから選択される配列の２つ以上が、異なる抗体由来である、項目
２０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方
法。
（項目３０）
前記配列が、アミノ酸配列または核酸配列である、項目１８に記載のハイブリッド抗体
またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目３１）
前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、Ｆｄ、ダイア
ボディ、抗体軽鎖および抗体重鎖からなる群より選択される、項目１８に記載のハイブ
リッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目３２）
前記標的種が、ヒトである、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗
体フラグメントを生成するための方法。
（項目３３）
前記初期抗体由来のＦＲ１領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する配列につい
て前記参照データベースを検索し、そして該配列が属する生殖細胞系列遺伝子ファミリー
が、他の選択された配列が対応するファミリーとして使用される、項目１８に記載のハ
イブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目３４）
前記初期抗体由来のＦＲ２領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する配列につい
て前記参照データベースを検索し、そして該配列が属する生殖細胞系列遺伝子ファミリー
が、他の選択された配列が対応するファミリーとして使用される、項目１８に記載のハ
イブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目３５）
前記初期抗体由来のＦＲ３領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する配列につい
て前記参照データベースを検索し、そして該配列が属する生殖細胞系列遺伝子ファミリー
が、他方の選択された配列が対応するファミリーとして使用される、項目１８に記載の
ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
（項目３６）
前記参照データベースが、前記標的種の生殖細胞系列配列または再配列された配列を含む
、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する
ための方法。
（項目３７）
前記選択された配列が、前記生殖細胞系列遺伝子ファミリー中の同じファミリーメンバー
に対応する、項目１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント
を生成するための方法。
（項目３８）
前記選択された配列の２つ以上が、前記生殖細胞系列遺伝子ファミリー中の同じファミリ
ーメンバーに対応する、項目１９に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フ
ラグメントを生成するための方法。
（項目３９）
前記選択された配列の２つ以上が、前記生殖細胞系列遺伝子ファミリー中の同じファミリ
ーメンバーに対応する、項目２０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フ
ラグメントを生成するための方法。
（項目４０）
第１の抗体由来の第１の重鎖フレームワーク領域、および第２の抗体由来の第２の重鎖フ
レームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４１）
前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
体からなる群より選択される抗体由来の第３の重鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
求項４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４２）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の重鎖フ
レームワーク領域をさらに含む、項目４１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメント。
（項目４３）
前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
項目４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４４）
第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域、および第２の抗体由来の第２の軽鎖フ
レームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４５）
前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
求項４４に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４６）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
レームワーク領域をさらに含む、項目４５に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメント。
（項目４７）
前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
項目４４に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目４８）
項目４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
または抗体フラグメントのライブラリー。
（項目４９）
項目４４に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
または抗体フラグメントのライブラリー。
（項目５０）
第１の抗体由来の第１の重鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の重鎖フレ
ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
、該第１の重鎖フレームワーク領域が、特定のＶＨファミリーに対応し、該第２の重鎖フ
レームワーク領域が、該第１の重鎖フレームワーク領域と同じＶＨファミリーに対応する
、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
（項目５１）
前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
体からなる群より選択される抗体由来の第３の重鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
求項５０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該第
３の重鎖フレームワーク領域が、前記第１の重鎖フレームワーク領域と同じＶＨファミリ
ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目５２）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の重鎖フ
レームワーク領域をさらに含む、項目５１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメント。
（項目５３）
前記第２の重鎖フレームワーク領域および前記第３の重鎖フレームワーク領域のいずれか
、またはその両方が、前記第１の重鎖フレームワーク領域と同じ前記ＶＨファミリーのメ
ンバーに対応する、項目５２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
メント。
（項目５４）
前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
項目５０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目５５）
第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の軽鎖フレ
ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
、該第１の軽鎖フレームワーク領域が、特定のＶＫファミリーに対応し、該第２の軽鎖フ
レームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＫファミリーに対応する
、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
（項目５６）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の
抗体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、
項目５５に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該
第３の軽鎖フレームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＫファミリ
ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目５７）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
レームワーク領域をさらに含む、項目５６に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメント。
（項目５８）
前記第２の軽鎖フレームワーク領域および前記第３の軽鎖フレームワーク領域のいずれか
、またはその両方が、前記第１の軽鎖フレームワーク領域と前記ＶＫファミリーのメンバ
ーに対応する、項目５７に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメン
ト。
（項目５９）
前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
項目５５に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目６０）
項目５０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
または抗体フラグメントのライブラリー。
（項目６１）
項目５５に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
または抗体フラグメントのライブラリー。
（項目６２）
第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の軽鎖フレ
ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
、該第１の軽鎖フレームワーク領域が、特定のＶＬファミリーに対応し、該第２の軽鎖フ
レームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＬファミリーに対応する
、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
（項目６３）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の
抗体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、
項目６２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該
第３の軽鎖フレームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＬファミリ
ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目６４）
前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
レームワーク領域をさらに含む、項目６３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
ド抗体フラグメント。
（項目６５）
前記第２の軽鎖フレームワーク領域および前記第３の軽鎖フレームワーク領域のいずれか
、またはその両方が、前記第１の軽鎖フレームワーク領域と同じ前記ＶＬファミリーのメ
ンバーに対応する、項目６４に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
メント。
（項目６６）
前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
項目６２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
（項目６７）
項目６２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
または抗体フラグメントのライブラリー。

図１Ａは、Ｖｋ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。Ｖｋエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図１Ｂは、Ｖｋ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。Ｖｋエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図２Ａは、ＶＨ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。ＶＨエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図２Ｂは、ＶＨ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。ＶＨエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図３Ａは、Ｖλ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。Ｖλエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図３Ｂは、Ｖλ遺伝子座の生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。Ｖλエキソンアミノ酸配列アライメントを示す。アライメント、番号付けおよびループ領域は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された構造的基準に従う。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従う。 図４Ａは、ヒトマンノース結合レクチンに対して指向されるマウス抗体可変軽鎖（すなわち初期抗体の軽鎖）のアミノ酸配列（配列番号１２３）を、配列をフレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示す。 図４Ｂは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号３７４７０１６のアミノ酸配列（配列番号１２４）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図４Ｃは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号５８３３８２７のアミノ酸配列（配列番号１２５）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図４Ｄは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号７２２６１４のアミノ酸配列（配列番号１２６）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図４Ｅは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号１７８５８７０のアミノ酸配列（配列番号１２７）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図４Ｆは、ハイブリッドヒト化抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１２８）を、配列をフレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示す。各フレームワーク領域の図４Ａの初期マウスモノクローナル抗体軽鎖に対するパーセント相同性を、提供する。 図４Ｇは、マウスモノクローナル抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図４Ｆを参照のこと）と初期マウスモノクローナル抗体軽鎖（図４Ａを参照のこと）との間の、フレームワーク領域単独、ＣＤＲ単独および全Ｖｋ鎖に関する相同性の程度を示すチャートである。マウスモノクローナル抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョンと最も類似するヒト生殖細胞系列配列ＶｋＶＩ（Ａ１０／Ａ２６）との間の相同性の程度も示される。先行技術の方法によって得られた最も類似するヒト再配列ＣＤＲ接合可変軽鎖と初期マウスモノクローナル抗体軽鎖との間の相同性の程度も示される。最も類似するヒト再配列ＣＤＲ接合ＶＬ対最も類似するヒト生殖細胞系列配列ＶｋＶＩ（Ａ１４）もまた示される。 図４Ｈは、図４ａに示される初期マウスモノクローナル抗体の全可変軽鎖を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ中のＢＬＡＳＴクエリから得られるアミノ酸配列（配列番号１２９）を示す。 図４Ｉは、図４ａに示される初期マウスモノクローナル抗体の可変軽鎖の結合フレームワーク領域のみを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ中のＢＬＡＳＴクエリから得られるアミノ酸配列（配列番号１３０）を示す。 図５Ａは、ヒトマンノース結合レクチンに対して指向されるマウス抗体可変重鎖（すなわち初期抗体の重鎖）のアミノ酸配列（配列番号１３１）を、配列をフレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示す。 図５Ｂは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号５６３６４９のアミノ酸配列（配列番号１３２）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図５Ｃは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号９５１２６３のアミノ酸配列（配列番号１３３）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図５Ｄは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号４８４８５２のアミノ酸配列（配列番号１３４）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図５Ｅは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号２３６７５３１のアミノ酸配列（配列番号１３５）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。 図５Ｆは、ハイブリッドヒト化抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号１３６）を、配列をフレームワーク構成部分とＣＤＲ構成部分とに分けて示す。各フレームワーク領域の図５ａの初期マウスモノクローナル抗体重鎖に対するパーセント相同性を、提供する。 図５Ｇは、マウスモノクローナル抗体重鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図５Ｆを参照のこと）と初期マウスモノクローナル抗体重鎖（図５Ａを参照のこと）との間の、フレームワーク領域単独、ＣＤＲ単独および全ＶＨ鎖に関する相同性の程度を示すチャートである。マウスモノクローナル抗体重鎖のハイブリッドヒト化バージョンと最も類似するヒト生殖細胞系列配列ＶＨ４−３１との間の相同性の程度も示される。先行技術の方法によって得られた最も類似するヒト再配列ＣＤＲ接合可変重鎖と初期マウスモノクローナル抗体重鎖との間の相同性の程度も示される。最も類似するヒト再配列ＣＤＲ接合ＶＨ対最も類似するヒト生殖細胞系列配列ＶＨ４−３１もまた示される。 図５Ｈは、図５Ａに示されるマウス抗体の全可変重鎖を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ中のＢＬＡＳＴクエリから得られるアミノ酸配列（配列番号１３７）を示す。 図５Ｉは、図５Ａに示されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖の結合フレームワーク領域のみを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ中のＢＬＡＳＴクエリから得られるアミノ酸配列（配列番号１３８）を示す。 図６は、アミノ酸配列アライメントに関してＪＨ、ＪＫおよびＪＬ遺伝子座の翻訳された生殖細胞系列遺伝子を示すチャートである。 図７は、ハイブリッドヒト化可変軽鎖の核酸配列（配列番号１５４）およびアミノ酸配列（配列番号１５５）ならびにハイブリッドヒト化可変重鎖の核酸配列（配列番号１５６）およびアミノ酸配列（配列番号１５７）を示し、そして初期マウス抗体配列と比べて変更された特定のヌクレオチドおよびアミノ酸の位置を示す。フレームワーク領域には下線を付し、そして変更されたアミノ酸は太字にする。 図８は、初期マウス抗体可変軽鎖および可変重鎖の部位特異的突然変異誘発に対して使用されたオリゴヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列を示す。鎖は、以下のように指定される：ＶＬについて、オリゴ１（配列番号１５８）、オリゴ２（配列番号１５９）、オリゴ３（配列番号１６０）、オリゴ４（配列番号１６１）、オリゴ５（配列番号１６２）、オリゴ６（配列番号１６３）、オリゴ７（配列番号１６４）；ＶＨについて、オリゴ８（配列番号１６５）、オリゴ９（配列番号１６６）、オリゴ１０（配列番号１６７）、オリゴ１１（配列番号１６８）、オリゴ１２（配列番号１６９）、オリゴ１３（配列番号１７０）、オリゴ１４（配列番号１７１）。 図９Ａは、ｈ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃに対するマウス抗体の可変軽鎖（すなわち、この初期抗体の軽鎖）のアミノ酸配列（配列番号１７２）を示し、この配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図９Ｂは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号４４１３３３および５５７８７８０のアミノ酸配列（配列番号１７３および１７４）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図９Ｃは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号４３２４０１８および１８０４１７６６のアミノ酸配列（配列番号１７５および１７６）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図９Ｄは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号５５３４７６および３３２５１のアミノ酸配列（配列番号１７７）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。 図９Ｅは、ヒト抗体可変軽鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号４４６２４５のアミノ酸配列（配列番号１７８）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図９Ｆは、ハイブリッドヒト化抗体可変軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７９、１８０および１８１）を示し、これは、フレームワーク中の配列とＣＤＲ構成要素部分とを分離する。図９Ａの初期マウスモノクローナル抗体軽鎖の各フレームワーク領域の％相同性が提供される。図９Ｈは、図９Ａに示される初期マウスモノクローナル抗体（ＣＤＲを除く）の可変軽鎖全体を使用してＧｅｎｂａｎｋにおいてＢＬＡＳＴ照会から生じるアミノ酸配列（配列番号１８２）を示す。 図９Ｇは、フレームワーク領域のみ、ＣＤＲのみおよびＶ_Ｋ鎖全体について、マウスモノクローナル抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図９Ｆを参照のこと）と初期マウスモノクローナル抗体軽鎖（図９Ａを参照のこと）との間の相同性の程度を示す表である。また、マウスモノクローナル抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョンと、最も似ているヒト生殖細胞系列配列との間の相同性の程度も示される。また、先行技術の方法によって得られる、最も似ているヒト再配列ＣＤＲ連結可変軽鎖と初期マウスモノクローナル抗体軽鎖との間の相同性の程度も示される。また、最も似ているヒト再配列ＣＤＲ連結ＶＬ 対 最も似ているヒト生殖細胞系列配列も示される。 図１０Ａは、ｈ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃに対するマウス抗体の可変重鎖（すなわち、この初期抗体の重鎖）のアミノ酸配列（配列番号１８３）を示し、この配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図１０Ｂは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号１８６９８３７３および３９２６７７のアミノ酸配列（配列番号１８４および１８５）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図１０Ｃは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号８８６２８８および９９９１０６のアミノ酸配列（配列番号１８６および１８７）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。 図１０Ｄは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号５５４２５３８のアミノ酸配列（配列番号１８８）を示し、ここれらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図１０Ｅは、ヒト抗体可変重鎖配列遺伝子識別（ＧＩ）番号４５３０５５９、５８３４１２２および１０６７０９のアミノ酸配列（配列番号１８９、１９０および１９１）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図１０Ｆは、ハイブリッドヒト化抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９２および１９３）を示し、これらの配列を、フレームワーク部分とＣＤＲ部分とに分けて示している。図１０Ａの初期マウスモノクローナル抗体重鎖に対する各フレームワーク領域の％相同性が提供される。図１０Ｇは、図１０Ａに示されるマウス抗体の可変重鎖全体を使用してＧｅｎｂａｎｋにおいてＢＬＡＳＴ照会から生じるアミノ酸配列（配列番号１９４および１９５）を示す。 図１０Ｈは、フレームワーク領域のみ、ＣＤＲのみおよびＶＨ鎖全体について、マウスモノクローナル抗体重鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図１０Ｆを参照のこと）と初期マウスモノクローナル抗体重鎖（図１０Ａを参照のこと）との間の相同性の程度を示す表である。また、マウスモノクローナル抗体重鎖のハイブリッドヒト化バージョンと、最も似ているヒト生殖細胞系列配列との間の相同性の程度も示される。また、先行技術の方法によって得られる、最も似ているヒト再配列ＣＤＲ連結可変重鎖と初期マウスモノクローナル抗体重鎖との間の相同性の程度も示される。また、最も似ているヒト再配列ＣＤＲ連結ＶＨ 対 最も似ている生殖細胞系列配列も示される。 図１１は、本開示に従う抗体および比較の抗体を含む競合ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。 図１２は、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）に対する初期抗体およびハイブリッド抗体の結合親和性試験の結果を示す。 図１３は、ｈ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃに対する初期抗体およびハイブリッド抗体の結合親和性試験の結果を示す。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中に記載される技術は、標的種に投与される場合、標的対象に対して活性であ
り、かつ免疫原性の危険性を低下させるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
メント（本明細書中で「ハイブリッド」と集合的に称される）を提供する。本開示は、起
源する種から得られる抗体または抗体フラグメントのフレームワーク領域と標的種の抗体
または抗体フラグメントのフレームワーク領域との間の相同性を最大にする技術を提供す
る。標的種の２つ以上の抗体から相同性の高いフレームワーク領域の取りこみによって構
築され、かつ本開示に従って操作されるハイブリッドは、標的対象に対して高度の親和性
を維持し、一方、標的種に投与される場合、有害免疫反応の危険性を低下させる。さらに
、生殖細胞系列遺伝子配列の同じファミリーに対応する標的種の１つ以上の抗体から相同
性の高いフレームワーク領域の取りこみによって構築され、かつ本発明の開示に従って操
作されるハイブリッドはまた、標的対象に対して高度の親和性を維持し、一方、標的種に
投与される場合、有害免疫反応の危険性を低下させる。１つの実施形態において、標的種
はヒトであり、そして操作される抗体は、ヒト化される。

本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本明細書中で他の方法で規定され
ない限り、本教示が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有する。当業者に
よって公知の種々の方法に対して、本明細書中で参考がなされる。参考がなされる公知の
方法を示す刊行物および他の資料は、その全てが示されたかのように、その全体が本明細
書中に参考として援用される。本明細書中に記載される方法の実施は、他に指示されない
限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を使用し、こ
れらは、当該分野の技術の範囲内である。そのような従来技術は、文献において十分説明
される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９
）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）
；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８
４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓお
よびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）のシリーズの特に第１５４および１５
５巻（ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編）；ＰＣＲ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＱｕｉｒｋｅおよびＴａｙｌｏｒ編、１９９１）；Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、１９８９，Ｒｏｉｔｔら、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、
１９９１，Ｍａｌｅら、Ｇｒｏｗｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ．；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
第ＩおよびＩＩ巻、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，（Ｍ．Ｌ． Ｇａｉｔ編）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎ
ｓ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅ
ｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６（Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ならびにＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌ
ｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）；ＷＯ９７／０８３２０；米国特許第５，４２７，９０８号；同第５，８８
５，７９３号；同第５，９６９，１０８号；同第５，５６５，３３２号；同第５，８３７
，５００号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，６４３，
７５６号；同第５，７２３，２８７号；同第５，９５２，４７４号；Ｋｎａｐｐｉｋら、
２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６；Ｂａｒｂａｓら、１９９１，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２；Ｓｃｈａｆ
ｆｉｔｚｅｌら、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：１１９−１３５；Ｋ
ｉｔａｍｕｒａ，１９９８，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ，６７：３５１−３５９；
Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４；Ｌ
ｉｔｔｌｅら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４１：１８７−１９５；Ｃｈａｕｔｈａ
ｉｗａｌｅら、１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：５７７−５９１；Ａｒ
ｕｆｆｏ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：７３５−７４１
；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（編者）ら、１９９６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。これらの内容は、本明
細書中において参考として援用される。

当業者に公知の任意の適切な材料および／または方法は、本明細書中に記載される方法
を実行する際に利用され得る；しかし、好ましい材料および／または方法が記載される。
以下の記載および実施例において参照される材料、試薬などは、他の方法で留意されない
限り、商業的供給源から入手可能である。

ハイブリッド抗体およびハイブリッド抗体フラグメントは、全長の重鎖および軽鎖また
はその任意のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、ｓｃＦ
ｖ、抗体軽鎖および抗体重鎖）を有する完全な抗体分子を含む。本明細書中に記載される
ような可変領域および種々の由来の定常領域およびを有するキメラ抗体もまた、適する。

まず、抗体を惹起し得る所定の標的対象が選択される。標的対象に対するモノクローナ
ル抗体を作製するための技術は、当業者に周知である。このような技術の例としては、デ
ィスプレイライブラリーに関するもの、ｘｅｎｏマウスまたはｈｕｍａｂマウス、ハイブ
リドーマなどが挙げられるが、これらに限定されない。標的対象は、抗原性を提示し得る
任意の物質を含み、通常、タンパク質またはタンパク質多糖類である。例としては、レセ
プター、酵素、ホルモン、成長因子、ペプチドなどが挙げられる。天然に存在する抗体が
本発明の開示に従う使用に適するだけでなく、所定の対象に対する設計抗体および設計抗
体フラグメントもまた適することが、理解されるべきである。

本明細書中に述べられた技術に供され得る抗体（Ａｂ）としては、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメント（例えば、ファージディスプレイ技術ま
たはファージミドディスプレイ技術由来のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、ｓ
ｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体フラ
グメント）が挙げられる。まず第一に、初期抗体が起源となる種から得られる。より好ま
しくは、標的抗原への特異性を有している起源となる種の抗体の軽鎖、重鎖またはその両
方の可変部分の核酸配列またはアミノ酸配列が必要とされる。起源となる種は、抗体また
は抗体ライブラリーを産生するために使用された任意の種、例えば、ラット、マウス、ウ
サギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。モノクローナル抗体を産生するための技術およ
びクローニングするための技術は、当業者に周知である。所望の抗体が得られたら、可変
領域（ＶＨおよびＶＬ）が、ＣＤＲの可能な定義（例えば、Ｋａｂａｔ単独、Ｃｈｏｔｈ
ｉａ単独、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの併用および当業者に公知の他の任意のもの
）を使用して、構成部分（すなわち、フレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ）に分けられ
る。一旦それが得られたら、適切な標的種フレームワークの選択が、必要である。１つの
実施形態は、標的種由来の可変アミノ酸配列または可変遺伝子配列と、起源となる種の抗
体配列由来の各個別のフレームワーク領域とのアラインメントを含む。アラインメントを
検索するためのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴなど）は当該分野で周知である。例えば
、もし標的種がヒトであれば、このようなアミノ酸配列または遺伝子配列（生殖細胞系列
配列または再配列抗体配列）の供給源は、ＮＣＢＩのタンパク質データバンクであるＧｅ
ｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、ヒト
抗体遺伝子データベースであるＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃ
ａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）およびＫａｂａｔ免疫グロブリンデータベース（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）またはそれらの翻訳産物
のような、任意の適切な参照データベースにて見出し得る。アラインメントがヌクレオチ
ド配列に基づいてなされた場合、選択された遺伝子は、その部分集合のどの遺伝子が起源
となる種の抗体と最も近いアミノ酸相同性を有しているかを決定するために、分析される
べきである。データベース中の他の配列と比較して高い程度の相同性に近づくアミノ酸配
列または遺伝子配列が、利用され得、かつ、本明細書中に記載される手順に従って操作さ
れ得ることが、企図される。さらに、より低い相同性を有するアミノ酸配列または遺伝子
は、本明細書中に記載される手順に従って操作されかつ選択される場合に、所定の標的抗
原に対し特異性を示す生産物をそれらがコードする場合に、利用され得る。特定の実施形
態において、受容可能な相同性の範囲は、５０％より高い。標的種はヒト以外であり得る
ということが、理解されるべきである。

１つの局面において、標的種の参照するデータベース中の２つ以上の別個の抗体からの
最も類似する適合と、起源となる種由来の個々のフレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１
、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４）との相同性の程度を決定したら、例えば、上位１００ヒ
ットを含み得る一組の相同性配列が選択される。これは、データベース中で起源となる種
由来の抗体と最も近い相同性を有する適合を探す間に、各個別のフレームワーク領域を用
いてなされる。選択された配列の少なくとも２つが、データベース中の異なる抗体から得
られ得ることが企図される。例えば、ＦＲ１は抗体１由来であり得、ＦＲ２は抗体２由来
であり得、ＦＲ３は抗体１、抗体２、または抗体１でも抗体２でもない第３の抗体のいず
れか由来であり得、そして、ＦＲ４は、少なくとも２つのＦＲが異なる抗体由来であると
いう注意を伴って、抗体１、抗体２、抗体３、または抗体１でも抗体２でも抗体３でもな
い抗体４のいずれか由来であり得る。別の例として、ＦＲ１は抗体１由来であり得、ＦＲ
３は抗体２由来であり得、ＦＲ２は抗体１、抗体２、または抗体１でも抗体２でもない第
３の抗体のいずれか由来であり得、そしてＦＲ４は、少なくとも２つのＦＲが異なる抗体
由来であるという注意を伴って、抗体１、抗体２、抗体３、または抗体１でも抗体２でも
抗体３でもない抗体４のいずれか由来であり得る。別の例として、ＦＲ１は、抗体１由来
であり得、ＦＲ４は抗体２由来であり得、抗体２は抗体１、抗体２、または抗体１でも抗
体２でもない第３の抗体のいずれか由来であり得、そして、抗体３は、少なくとも２つの
ＦＲが異なる抗体由来であるという注意を伴って、抗体１、抗体２、抗体３、または抗体
１でも抗体２でも抗体３でもない抗体４のいずれか由来であり得る。適切なフレームワー
ク領域候補を選択した後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方が、起
源となる種由来のＣＤＲを、ハイブリッドフレームワーク領域に移植することによって、
以下にさらに議論するように産生される。

別の局面において、生殖細胞系列配列または再配列抗体配列の最も類似する適合と、起
源となる種由来の個々のフレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３または
ＦＲ４）との相同性の程度を決定したら、例えば、上位１００ヒットを含み得る一組の相
同性配列が選択される。この点で、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３に関して、その組のメン
バーが、起源の生殖細胞系列ファミリー（すなわち、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３など、Ｖ_Ｋ
Ｉ、Ｖ_ＫＩＩ、Ｖ_ＫＩＩＩなど、およびＶλ１、Ｖλ２、Ｖλ３など）に分類され、さら
に、可能な場合はファミリーメンバーに分類される。ファミリーおよびファミリーメンバ
ーのより完全な列挙については、図１、２および３を参照のこと。常なる場合ではないが
、各個別のフレームワーク領域に対して最も類似する配列適合は、代表的に異なる抗体ま
たは抗体フラグメント由来である。１つの実施形態において、２つ以上のフレームワーク
領域が、同一の可変ファミリー中の抗体由来である。別の実施形態において、２つ以上の
フレームワーク領域が、同一のファミリーメンバーからの異なる抗体由来である。別の実
施形態において、３つまでのフレームワーク領域が、同一の抗体由来であり得る。たとえ
データベース中に、高い相同性の程度を有する異なるファミリーからのフレームワーク配
列が存在し得ても、より好ましい候補配列は、実際、より低い相同性を有するが、他の選
択されたフレームワークとしての同一のファミリー由来であり得る。同様に、高い相同性
を有する同一のファミリー由来であるが同一のファミリーの異なるメンバー由来であるフ
レームワーク配列がデータベース中に存在し得る；より好ましい候補は、他の選択された
フレームワークと同一のファミリーメンバー由来であり得る。任意の選択基準は、起源と
なる種の抗体に含まれる体細胞変異にどのフレームワーク配列が最も近く似ているかを見
るための検査に関する。体細胞変異は、抗体の配列を、たとえそれらが同一のファミリー
メンバー由来であっても、異なるものにする。特定の実施形態において、起源となる種の
配列中で生じる体細胞変異に近くなるように選択することが好ましい。

ＦＲ４領域は、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３のファミリー間およびファミリーメンバー
間で適合しない。実際、ＦＲ４はＪセグメント（図６参照）によってコードされ、適切な
ＦＲ４配列の選択は、初期抗体ＦＲ４配列と、参照データベース中の最も類似するＦＲ４
配列との間の相同性に基づいて決定され得る。１つの実施形態において、ＦＲ４は、初期
抗体と、再配列抗体配列参照データベースにおいて見出されるものとの間の最大の相同性
の程度に基づいて選択される。特定の実施形態において、初期抗体由来のＦＲ４と標的種
の参照データベースから選択されたＦＲ４との間は、１００％の相同性が好ましい。初期
抗体と完全に相同である必要はないが、生殖細胞系列配列のデータベースに基づく選択も
また、適切であり得る。任意の選択基準は、起源となる種の抗体に含まれる体細胞変異に
どのフレームワーク配列が最も近く似ているかを見るための検査に関する。体細胞変異は
、抗体の配列を、たとえそれらが同一のファミリーメンバー由来であっても、異なるもの
にする。特定の実施形態において、起源となる種の配列中で生じる体細胞変異に近くなる
ように選択することが好ましい。

同じファミリーおよび／または同じファミリーメンバーから、適切なフレームワーク候
補を選択した後に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方は、元々の種
由来のＣＤＲをハイブリッドフレームワーク領域に移植することによって、生成される。
ハイブリッド抗体または上記局面のいずれかに関するハイブリッド可変鎖領域を有するハ
イブリッド抗体フラグメントのアセンブリは、当業者に公知の従来法を使用して、達成さ
れ得る。例えば、本明細書中に記載されるハイブリッド可変ドメインをコードするＤＮＡ
配列（すなわち、標的種に基づくフレームワークおよび元々の種由来のＣＤＲ）は、オリ
ゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲによって生成され得る。ＣＤＲ領域をコードす
る核酸はまた、適切な制限酵素を使用して元々の種の抗体から単離され得、そして適切な
連結酵素を使用して連結することによって、標的種のフレームワークに連結され得る。あ
るいは、元々の種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的変異誘発によって
変化され得る。

ハイブリッドは、各フレームワーク領域に対応する複数の候補の中から選択することに
よって構築されるので、本明細書中に記載される原理に従う構築を受ける、多くの配列の
組み合わせが存在する。従って、個々のフレームワーク領域の異なる組み合わせを有する
メンバーを有する、ハイブリッドのライブラリーが構築され得る。このようなライブラリ
ーは、配列の電子的データベース収集またはハイブリッドの物理的収集であり得る。

物理的抗体または抗体フラグメントのライブラリーの構築は、好ましくは、合成オリゴ
ヌクレオチドを使用して達成される。１例において、オリゴヌクレオチドは、重複する領
域を有するように設計され、その結果、これらは、アニールし得、そしてポリメラーゼ（
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって満たされ得る。複数工程の重複伸長
は、ＶＬ遺伝子挿入物およびＶＨ遺伝子挿入物を生成するために実施される。これらのフ
ラグメントは、ヒト定常領域と重複する領域を伴って設計され、その結果、これらは、重
複伸長によって融合されて、全長軽鎖およびＦｄ重鎖フラグメントを生成し得る。軽鎖Ｆ
ｄ領域および重鎖Ｆｄ領域は、重複伸長によって一緒に連結されて、ディスプレイベクタ
ー中にクローニングされるべき単鎖Ｆａｂライブラリー挿入物を生成し得る。ヒト化ライ
ブラリー遺伝子の構築のための代替的方法もまた、使用され得る。例えば、ライブラリー
は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アプローチを使用して、重複するオリゴヌクレオチドか
ら構築され得る。例えば、ＣｈａｌｍｅｒｓおよびＣｕｒｎｏｗ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ（２００１）３０−２、ｐ２４９−２５２を参照のこと。

種々の形態の抗体フラグメントが生成され得、そしてハイブリッド抗体ライブラリーま
たはハイブリッド抗体フラグメントライブラリーを生成するために、適切なベクター中に
クローニングされ得る。例えば、可変遺伝子は、必要な定常領域の残りの部分をインフレ
ームで含むベクター中にクローニングされ得る。クローニングされ得るさらなるフラグメ
ントの例としては、全長軽鎖、重鎖のＦｄ部分、または軽鎖Ｆｄコード配列および重鎖Ｆ
ｄコード配列の両方を含むフラグメントが挙げられる。あるいは、ハイブリダイゼーショ
ンに使用される抗体フラグメントは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。

任意の選択ディスプレイ系が、本開示に従うライブラリーと合わせて使用され得る。大
きいライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディス
プレイ技術に代表されるように、当該分野で公知である。多様なペプチド配列が糸状バク
テリオファージの表面上に提示されるこのような系（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９
９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６）は、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメン
トのインビトロでの選択および増幅のための、抗体フラグメント（およびこれらをコード
するヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するために有用であることが証明されてい
る。ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラ
ズム空間にこれらを指向させるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結
され、そして結果として、得られた抗体フラグメントは、バクテリオファージの表面上に
、代表的にはバクテリオファージ被膜タンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）
への融合物として、提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージまたはＴ７
キャプシド（ファージ本体（ｐｈａｇｅｂｏｄｙ））上に外部に提示される。ファージベ
ースのディスプレイ系の利点は、これらが生物学的系であるので、選択されたライブラリ
ーメンバーが、細菌細胞中で、選択されたライブラリーメンバーを含むファージを増殖さ
せることによって、簡単に増幅され得ることである。さらに、ポリペプチドライブラリー
メンバーをコードするヌクレオチド配列が、ファージまたはファージミドベクター上に含
まれるので、配列決定、発現および引き続く遺伝子操作は、比較的簡単である。バクテリ
オファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のた
めの方法は、当該分野で周知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａ
ｔｕｒｅ、３４８：５５２；Ｋａｎｇら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：４３６３を参照のこと）。

あるディスプレイアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリの使用であった（例えば
、Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０を参照のこと）。バクテリオ
ファージ被覆タンパク質に提示されるｓｃＦｖライブラリの種々の実施形態が、記載され
ている。ファージディスプレイアプローチの改良もまた、例えば、ＷＯ９６／０６２１３
およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌら）
ならびにＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）（これらは本明細書中に参考とし
て援用される）に記載されるように、公知である。Ｆａｂライブラリのディスプレイもま
た、例えば、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）およびＷＯ９１／１７２７１（Ａ
ｆｆｙｍａｘ）に記載されるように、公知である。

ディスプレイベクターにクローニングされるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体
フラグメントは、良好な結合活性を維持した改変体を同定するために、適切な抗原に対し
て選択され得る。なぜなら、この抗体または抗体フラグメントは、ファージ粒子またはフ
ァージミド粒子の表面に存在するからである。例えば、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら（２００
１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（この内容は本明細書中に参考として援用され
る）。例えば、Ｆａｂフラグメントの場合、軽鎖および重鎖のＦｄ産物は、ｌａｃプロモ
ーターの制御下にあり、そして各鎖は、このｌａｃプロモーターに融合されたリーダーシ
グナルを有し、細菌宿主の細胞膜周辺腔に指向される。この抗体フラグメントが適切に構
築し得るのは、この空間である。重鎖フラグメントは、ファージ被覆タンパク質ドメイン
との融合物として発現され、これにより構築された抗体フラグメントは、新たに作製され
たファージ粒子またはファージミド粒子の被覆に組み込まれ得る。新たなファージミド粒
子の生成は、全ての必要なファージ遺伝子を含むヘルパーファージの付加を必要とする。
一旦、抗体フラグメントのライブラリがファージ表面またはファージミド表面に提示され
ると、パニングと呼ばれるプロセスが、続く。これは、ｉ）ファージ粒子またはファージ
ミド粒子の表面に表示された抗体が、所望の抗原に結合し、ｉｉ）非バインダーが洗い流
され、ｉｉｉ）結合した粒子が抗原から溶出され、そしてｉｖ）溶出した粒子が、さらな
る回数の選別のための濃縮プールを増幅するために、新鮮な細菌宿主に曝露される、方法
である。代表的には、抗体クローンを特異的結合についてスクリーニングする前に、３回
または４回のパニングが実施される。この様式において、ファージ／ファージミド粒子は
、結合表現型（抗体）と遺伝子型（ＤＮＡ）との関連付けを可能にし、それにより抗体デ
ィスプレイ技術の使用が非常に首尾良くなる。しかし、選別および／またはスクリーニン
グのために、他のベクター様式（例えば、抗体フラグメントライブラリの溶解性ファージ
ベクター（改変Ｔ７またはλＺａｐ系）へのクローニング）が、このヒト化プロセスに使
用され得る。

所望のハイブリッド抗体および／またはハイブリッド抗体フラグメントの選別の後、こ
れらが、当業者に公知の任意の技術（例えば、原核生物細胞発現または真核生物細胞発現
など）によって多量に産生され得ることが企図される。例えば、ハイブリッド抗体または
フラグメントは、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来の技術を使用
することによって産生され得、ここで、（本明細書中に記載される技術に従って操作され
るような）元の種の抗体結合特異性を保つために必要であるＣＤＲおよび、必要な場合、
可変領域フレームワークの最小部分は、元の種の抗体由来であり、そして抗体の残りは、
本明細書中で記載されるように操作され得る標的種の免疫グロブリン由来であり、それに
よりハイブリッド抗体の重鎖の発現のためのベクターを産生する。

さらに、抗体軽鎖をコードする発現ベクターが構築され得、この抗体軽鎖では、本明細
書中で提供されるように操作され得る元の種の抗体結合特異性を保持するのに必要な１つ
以上のＣＤＲ、および必要に応じて可変領域フレームワークの最小限の部分は、元の種の
抗体に由来し、抗体の残りの部分は、本明細書中で提供されるように操作され得る標的種
免疫グロブリンに由来し、それにより、ハイブリッド抗体軽鎖の発現のためのベクターを
生じる。

この発現ベクターは、次いで、従来の技術によって適切な宿主細胞に移入され、最適に
操作された抗体または抗体フラグメントの発現のためのトランスフェクト宿主細胞を生成
し得る。このトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞は、次いで、当業者に公知
の任意の適切な技術を用いて培養され、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
メントを生成する。

特定の実施形態では、宿主細胞は、２つの発現ベクターで共トランスフェクトされ得、
第一のベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードし、そして第二のベクターは、軽鎖由
来ポリペプチドをコードする。この２つのベクターは、異なる選択マーカーを含み得るが
、重鎖コード配列および軽鎖コード配列を除いては、好ましくは同一である。この手順は
、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの同等の発現を提供する。あるいは、重鎖ポ
リペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。
重鎖および軽鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡあるいはその両方
を含み得る。

特定の実施形態では、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを発現す
るために使用される宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）、または好ましくは真核生物細胞のいずれかであり得る。好ましくは、哺乳動物細胞（
例えば、チャイニーズハブスター卵巣細胞またはＮＳＯ細胞）が使用され得る。発現ベク
ターの選択は、宿主細胞の選択に依存し、そして選択された宿主細胞において所望の発現
および調節の特徴を有するように選択され得る。

一旦生成されると、ハイブリッド抗体または抗体フラグメントは、当該分野の標準的な
手順（クロスフロー濾過、硫安沈降、アフィニティーカラムクロマトグラフィー（例えば
、プロテインＡ）、ゲル電気泳動などが挙げられる）によって精製され得る。

ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体ま
たはヒト化モノクローナル抗体のような他のタンパク質（またはそれらの部分）と共に使
用され得るか、またはこれらに接着され得る。これら他のタンパク質は、抗体が指向され
る疾患について特徴的な他のマーカー（エピトープ）に反応し得るか、または例えば、標
的種の分子または細胞（例えば、レセプター、標的タンパク質、疾患細胞など）を補充す
るように、選ばれた異なった特異性を有し得る。ハイブリッド抗体またはその抗体フラグ
メントは、このようなタンパク質（またはその部分）と共に、別々に投与される組成物と
してか、あるいは、定型的な化学的方法または分子生物学的方法により結合される２つの
因子を含む単一の組成物として、投与され得る。さらに、この抗体の診断上の価値および
治療学的な価値が、検出可能なシグナル（インビトロまたはインビボのどちらか）を産生
する標識、または治療特性を有する標識で抗体を標識することによって増強され得る。い
くつかの標識、例えば、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、検
出可能シグナルを産生し、また治療特性を有し得る。放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎ
ｕｃｌｉｄｅ）標識の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１４Ｃが挙げられる。他の検出
可能な標識の例としては、蛍光顕微鏡検査のための緑色蛍光タンパク質、フルオレセイン
、フィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）またはテトラエチルロー
ダミンのような蛍光クロモスフィア（ｃｈｒｏｍｏｓｐｈｅｒｅ）、蛍光、吸光度、可視
色によって検出するための蛍光もしくは有色産物を生成する酵素、または電子顕微鏡検査
による実証のための高い電子密度の産物を生成する凝集；あるいは直接または間接の電子
顕微鏡検査可視化のためのフェリチン、ペルオキシダーゼまたは金ビーズのような高い電
子密度の分子が挙げられる。

本明細書中のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは、代表的に、薬
学的キャリアを含む組成物において患者に投与され得る。薬学的キャリアは、モノクロー
ナル抗体を患者に送達するのに適した、適合性の、非毒性の任意の物質であり得る。滅菌
水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が、キャリアの中に含まれ得る。薬
学的に受容されたアジュバント（緩衝剤、分散剤）も、薬学的組成物に組み込まれ得る。

ハイブリッド抗体組成物またはハイブリッド抗体フラグメント組成物は、種々の様式で
患者に投与され得る。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的投与（例えば、皮下投与、
筋肉内投与、または静脈内投与）され得る。従って、非経口投与のための組成物は、受容
可能なキャリア（好ましくは水性キャリア）中に溶解された抗体、抗体フラグメント、ま
たはそのカクテルの溶液を含み得る。種々の水性キャリア（例えば、水、生理緩衝化食塩
水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）が、使用され得る。これらの溶液は、
滅菌されており、一般的に粒子物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技
術により滅菌され得る。これらの組成物は、生理的条件に近づくために必要とされる薬学
的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤など（例えば、
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど
））を含み得る。これらの処方物中の抗体または抗体フラグメントの濃度は、広範に、例
えば、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％であるか、または少なくとも約
１重量％から、１５重量％または２０重量％まで変化し得、選択される特定の投与様式に
従って、主に流体体積、粘度などに基づいて選択される。

非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法、および被験体に投与するために
必要な調整は、当業者にとって公知であるかまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）（これは、本明
細書中に参考として援用される）により詳細に記載されている。

以下の実施例は、例示目的のために提供される。以下の実施例は、本明細書中に記載さ
れる主題のうちのいずれかを限定するものとしては解釈されるべきではない。

（実施例１）
ヒトマンノース結合レクチンに対するマウスモノクローナル抗体（「初期抗体」）を、
本明細書中に記載される技術と合わせて使用した。ＶＨ領域およびＶＬ領域をクローン化
して配列決定し、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる個々のフレームワー
ク領域を、併用Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを使用してＣＤＲから区別
した。モノクローナル抗体の可変軽鎖配列について、図４Ａを参照のこと。ＮＣＢＩタン
パク質データバンクのＢＬＡＳＴサーチを、各個別の軽鎖フレームワーク領域をクエリー
として使用して、ＦＲ１で開始して行った。抗体配列遺伝子識別番号３７４７０１６を、
初期抗体軽鎖のＦＲ１と良好な相同性を有するＦＲ１を有するとして選択した。図４Ｂを
参照のこと。３７４７０１６は、ヒト生殖細胞系列Ｖｋ ＩＩＩファミリー（メンバーＬ
２またはＬ１６のいずれか）に属する（図１を参照のこと）。そのＦＲ１は、初期抗体の
ＦＲ１と７８％の相同性を有する。抗体配列遺伝子識別番号５８３３８２７を、初期抗体
のＦＲ２と良好な相同性（７３％）を有するＦＲ２を有するとして選択した。図４Ｃを参
照のこと。５８３３８２７は、Ｖｋ ＩＩＩファミリー（メンバーＬ２またはＬ１６のい
ずれか）に属する。抗体配列遺伝子識別番号７２２６１４を、初期抗体のＦＲ３と良好な
相同性（８１％）を有するＦＲ３を有するとして選択した。図４Ｄを参照のこと。７２２
６１４は、Ｖｋ ＩＩＩファミリー（メンバーＬ６）に属する。抗体配列遺伝子識別番号
１７８５８７０を、初期抗体のＦＲ４と良好な相同性（１００％）を有するＦＲ４を有す
るとして選択した。

ハイブリッドヒト化可変軽鎖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ）から市販されているＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、初期抗体可変軽鎖フレームワー
ク領域の部位特異的変異誘発によって構築した。図７は、ハイブリッドヒト化可変軽鎖の
それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。図７は、初期抗体配列と比較して変化し
た特定のヌクレオチド位置およびアミノ酸位置を示す。フレームワーク領域に下線が付さ
れている。変化したヌクレオチドおよび変化したアミノ酸は、太字である。要約すると、
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍに従って、初期抗体ＶＬをプラスミド
ｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２（これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含み、このクロラムフェニコール遺伝子は、変異鎖の選択を提供するため
にクララムフェニコール修復オリゴヌクレオチドを使用して回復され得るフレームシフト
変異を含む）と連結することによって、クローニングおよび形質転換を達成した。連結後
、ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をこのプラスミドで形質転換し、培養し、生じたプラス
ミドを単離した。単離したｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＬプラスミドを、ＮａＯＨ（アルカ
リ）を使用して変性させた。アニーリング反応および変異誘発反応は、アルカリ変性ｐＡ
ＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＬを、ホスホリル化修復オリゴヌクレオチド、ノックアウトオリゴ
ヌクレオチドおよび変異原性オリゴヌクレオチド（図８を参照のこと）＋１０×アニーリ
ング緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）と混合することを包含し
た。この混合物を７５℃まで５分間加熱し、室温まで冷却させた。Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ
４リガーゼおよび１０×合成緩衝液をこのアニーリング混合物に添加した。これらを３７
℃にて９０分間インキュベートして、変異体鎖を合成した。ＥＳ１３０１ ｍｕｔＳコン
ピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）を変異原性反応混合物
の産物で形質転換することによって、変異生成物を分析した。これらの細胞は、インビボ
ミスマッチ修復を抑制する。生じたミニプレッププラスミドを、ＪＭ１０９コンピテント
細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）中に形質転換した。生じたＪＭ
１０９から精製したプラスミドを、配列決定分析によってスクリーニングした。生じた可
変軽鎖は、図４Ｆに示されるようなＣＤＲに作動可能に連結された、選択されたフレーム
ワークを含んだ。

図４Ｇは、フレームワーク領域単独（８１％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全ＶＬ
鎖（８６％）について、初期抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図４Ｆを参照の
こと）と、初期抗体の軽鎖との間の相同性の程度を示すチャートである。フレームワーク
領域単独（７０％）、ＣＤＲ単独（７８％）およびＶｋ鎖遺伝子（７２％）について、初
期抗体軽鎖のハイブリッドヒト化バージョンと、最も近いヒト生殖細胞系列ファミリーメ
ンバーＶｋＶｌ（Ａ１０／Ａ２６）との間の相同性の程度もまた示す。初期抗体のフレー
ムワーク領域に対して最も類似のヒト再配列抗体軽鎖を同定し、そしてこの軽鎖（すなわ
ち、ヒト再配列ＣＤＲ接合ＶＬおよび初期抗体軽鎖）へと初期抗体ＣＤＲを接合すること
によって構築されたヒト化軽鎖の間の相同性の程度もまた示し、フレームワーク領域単独
（７７％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全ＶＬ鎖（８３％）について、示される。最
後に、フレームワーク領域単独（７０％）、ＣＤＲ単独（６０％）およびＶｋ鎖遺伝子（
６７％）について、このヒト再配列ＣＤＲ接合Ｖｋと最も近いヒト生殖細胞系列ファミリ
ーメンバー（Ａ１４）との間の相同性の程度。このチャートから見られ得るように、本発
明の開示に従って作製された、上で例示されるハイブリッド抗体軽鎖は、比較配列と比較
される場合、フレームワーク領域と全体の可変重鎖との両方において、より高い相同性を
示す。

図４Ｈおよび図４Ｉは、クエリーとして全体の初期抗体軽鎖またはＣＤＲを含まない結
合フレームワーク領域のいずれかを使用する間に、ＧｅｎＢａｎｋにおいて最も類似する
抗体間のフレームワーク相同性を示す。

図５Ａは、初期抗体の可変重鎖配列を示す。上記のように、ＮＣＢＩタンパク質データ
バンクのＢＬＡＳＴ検索を、各個々の可変重鎖フレームワーク領域をクエリーとして使用
して、ＦＲ１で開始して行った。抗体配列遺伝子同定番号５６３６４９を、初期抗体重鎖
のＦＲ１に対して良好な相同性（９１％）を有するＦＲ１を有するように選択した。図５
Ｂを参照のこと。５６３６４９は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ４（メンバー３１）に属する（
図２を参照のこと）。抗体配列遺伝子同定番号９５１２６３を、初期抗体重鎖のＦＲ２に
対して良好な相同性（７８．５％）を有するＦＲ２を有するように選択した。図５Ｃを参
照のこと。９５１２６３は、ヒト生殖細胞系列ファミリーＶＨ４（メンバー３１）に属す
る。抗体配列遺伝子同定番号４８４８５２を、初期抗体重鎖のＦＲ３に対して良好な相同
性（８１％）を有するＦＲ３を有するように選択した。図５Ｄを参照のこと。４８４８５
２は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ４（メンバー４またはメンバー３１）に属する。抗体配列遺
伝子同定番号２３６７５３１を、初期抗体重鎖のＦＲ４に対して良好な相同性（１００％
）を有するＦＲ４を有するように選択した。図５Ｅを参照のこと。２３６７５３１は、Ｖ
Ｈ３（メンバー２３）に属する。

ハイブリッドヒト化可変重鎖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ）から市販されているＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、初期抗体可変重鎖フレームワー
ク領域の部位特異的変異誘発によって構築した。図７は、ハイブリッドヒト化可変重鎖の
それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列を示し、そして初期抗体配列と比較した場合、変
更された特定のヌクレオチドおよびアミノ酸の位置を示す。フレームワーク領域は下線を
付され、そして変更されたヌクレオチドおよびアミノ酸は太字である。要約すると、Ａｌ
ｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍに従って、初期抗体ＶＨをプラスミドｐＡ
ＬＴＥＲ−ＥＸ２（これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐
性遺伝子を含む。このクロラムフェニコール遺伝子は、変異体鎖の選択を提供するために
クロラムフェニコール修復オリゴヌクレオチドを使用して回復され得るフレームシフト変
異を含む）と連結することによって、クローニングおよび形質転換を達成した。連結後、
ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をこのプラスミドで形質転換し、培養し、そして生じたプ
ラスミドを単離した。この単離したｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＨプラスミドを、ＮａＯＨ
（アルカリ）を使用して変性させた。アニーリング反応および変異誘発反応は、アルカリ
変性ｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＨを、ホスホリル化修復ノックアウトオリゴヌクレオチド
および変異原性オリゴヌクレオチド（図８を参照のこと）＋１０×アニーリング緩衝液（
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）と混合する工程を包含した。この混合
を７５℃まで５分間加熱し、そして室温まで冷却させた。Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ４リガー
ゼおよび１０×合成緩衝液を、このアニーリング混合物に添加し、これを３７℃にて９０
分間インキュベートして、変異体鎖を合成した。ＥＳ１３０１ ｍｕｔＳコンピテント細
胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）を変異原性反応混合物の産物で形
質転換することによって、変異生成物を分析した。これらの細胞は、インビボミスマッチ
修復を抑制する。生じたミニプレッププラスミドを、ＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販される）中に形質転換した。生じたＪＭ１０９細胞から
精製したプラスミドを、配列決定分析によってスクリーニングした。生じた可変重鎖は、
図５Ｆに示されるようなＣＤＲに作動可能に連結された、選択されたフレームワークを含
んだ。

図５Ｇは、フレームワーク領域単独（８６．４％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全
ＶＨ鎖（９０％）について、初期抗体重鎖のハイブリッドヒト化バージョン（図５Ｆを参
照のこと）と、初期抗体の重鎖との間の相同性の程度を示すチャートである。フレームワ
ーク領域単独（９２．８％）、ＣＤＲ単独（７０％）およびＶＨ鎖（８６．６％）につい
て、初期抗体のハイブリッドヒト化バージョンと、最も近いヒト生殖細胞系列ファミリー
メンバーＶＨ４−３１との間の相同性の程度をまた示す。初期抗体のフレームワーク領域
に対して最も類似のヒト再配列抗体重鎖を同定し、そしてこの重鎖（すなわち、ヒト再配
列ＣＤＲ接合ＶＨ）へと初期抗体ＣＤＲを接合することによって構築された初期抗体とヒ
ト化鎖との間の相同性の程度をまた示し、フレームワーク領域単独（８０％）、ＣＤＲ単
独（１００％）および全ＶＨ鎖（８６％）について、示される。最後に、フレームワーク
領域単独（９７％）、ＣＤＲ単独（７０％）および全ＶＨ鎖遺伝子（８９．６％）につい
て、このヒト再配列ＣＤＲ接合ＶＨと最も近いヒト生殖細胞系列ファミリーメンバー（Ｖ
Ｈ４−３１）との間の相同性の程度。チャートから見られ得るように、本発明の開示に従
って作製された上に例示されるハイブリッド抗体は、比較配列と比較される場合、フレー
ムワーク領域と全体の可変重鎖との両方において、より高い相同性を示す。

図５Ｈおよび図５Ｉは、クエリーとして全体の初期抗体軽鎖か、またはＣＤＲを含まな
い結合フレームワーク領域のいずれかを使用する間に、ＧｅｎＢａｎｋにおいて最も類似
する抗体間のフレームワーク相同性を示す。

結合親和性、会合速度定数および解離速度定数を、ＢｌＡｃｏｒｅ ３０００システム
（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、抗原とし
てマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）を使用して、そして製造者の指示書に従って、本開示
に従って調製された初期抗体およびハイブリッド抗体（ｈ３Ｆ８）について測定する。結
果を、図１２に示す。同じハイブリッド抗体およびその平均を使用する２つの試験を示す
。

（実施例２）
ｈ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ（「初期抗体」）に対するマウスモノクローナル抗体を、本
明細書中に記載される技術と組み合せて使用した。ＶＨ領域およびＶＬ領域を、クローン
化し、そして配列決定し、そしてＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と呼ばれる個々の
フレームワーク領域を、混合Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを使用してＣ
ＤＲから区別した。モノクローナル抗体の可変軽鎖配列について、図９Ａを参照のこと。
ＮＣＢＩタンパク質データバンクのＢＬＡＳＴ検索を、各個々の可変軽鎖フレームワーク
領域をクエリーとして使用して、ＦＲ１で開始して行った。

（ＦＲ１）
抗体配列遺伝子同定番号４４１３３３を、初期抗体軽鎖のＦＲ１に対して良好な相同性
を有するＦＲ１を有するとして選択した。図９Ｂを参照のこと。４４１３３３は、ヒト生
殖細胞系列Ｖ_ＫＩＩ（図１を参照のこと）、メンバーＡ１７に属し、そしてそのＦＲ１は
、初期抗体のＦＲ１に対して８２％の相同性を有する。抗体配列遺伝子同定番号５５７８
７８０を、初期抗体軽鎖のＦＲ１に対して良好な相同性を有するＦＲ１を有する二次抗体
として選択した。図９Ｂを参照のこと。５５７８７８０は、ヒト生殖細胞系列ファミリー
Ｖ_ＫＩＩ（図１を参照のこと）、メンバーＡ３またはＡ９に属し、そしてそのＦＲ１は、
初期抗体のＦＲ１に対して７８％の相同性を有する。

（ＦＲ２）
抗体配列遺伝子同定番号４３２４０１８を、初期抗体のＦＲ２に対して良好な相同性（
８６％）を有するＦＲ２を有するとして選択した。図９Ｃを参照のこと。４３２４０１８
は、ファミリーＶ_ＫＩＩ、メンバーＡ３に属する。抗体配列遺伝子同定番号１８０４１７
６６は、初期抗体軽鎖のＦＲ２に対して良好な相同性を有するＦＲ２を有する二次抗体と
して選択した。図９Ｂを参照のこと。１８０４１７６６は、ヒト生殖細胞系列ファミリー
Ｖ_ＫＩＩ（図１を参照のこと）、メンバーＡ３に属し、そしてそのＦＲ１は、初期抗体の
ＦＲ１に対して８６％の相同性を有する。

（ＦＲ３）
抗体配列遺伝子同定番号５５３４７６および３３２５１を、初期抗体のＦＲ３に対して
良好な相同性（９３％）を有するＦＲ３を有するとして選択した。図９Ｄを参照のこと。
７２２６１４は、ファミリーＶ_ＫＩＩ、メンバーＡ３に属する。

（ＦＲ４）
抗体配列遺伝子同定番号４４６２４５を、初期抗体のＦＲ４に対して良好な相同性（１
００％）を有するＦＲ４を有するとして選択した。図９Ｅを参照のこと。

ハイブリッドヒト化可変軽鎖を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ）から市販されているＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、初期抗体可変軽鎖フレームワー
ク領域の部位特異的変異誘発によって構築した。図９Ｆは、ハイブリッドヒト化可変軽鎖
のアミノ酸配列を示し、そして初期抗体配列と比較した場合、変更された特定のアミノ酸
の位置を示す。フレームワーク領域は太字であり、そして変更したアミノ酸は下線が付さ
れる。要約すると、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍに従って、初期抗
体ＶＬをプラスミドｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２（これは、クロラムフェニコール耐性遺伝子お
よびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、このクロラムフェニコール遺伝子は、変異体鎖
の選択を提供するためにクロラムフェニコール修復オリゴヌクレオチドを使用して回復さ
れ得るフレームシフト変異を含む）と連結することによって、クローニングおよび形質転
換を達成した。連結後、ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をこのプラスミドで形質転換し、
培養し、生じたプラスミドを単離した。単離したｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＬプラスミド
を、ＮａＯＨ（アルカリ）を使用して変性させた。アニーリング反応および変異誘発反応
は、アルカリ変性ｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＬを、ホスホリル化修復オリゴヌクレオチド
、ノックアウトオリゴヌクレオチドおよび変異原性オリゴヌクレオチド（図８を参照のこ
と）＋１０×アニーリング緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）と
混合する工程を包含した。この混合を７５℃まで５分間加熱し、そして室温まで冷却させ
た。Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ４リガーゼおよび１０×合成緩衝液を、このアニーリング混合
物に添加し、これを３７℃にて９０分間インキュベートして、変異体鎖を合成した。ＥＳ
１３０１ ｍｕｔＳコンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている
）を変異原性反応混合物の産物で形質転換することによって、変異生成物を分析した。こ
れらの細胞は、インビボミスマッチ修復を抑制する。生じたミニプレッププラスミドを、
ＪＭ１０９コンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販される）中に形質転
換した。生じたＪＭ１０９細胞から精製したプラスミドを、配列決定分析によってスクリ
ーニングした。生じた可変軽鎖は、図９Ｆに示されるようなＣＤＲに作動可能に連結され
た、選択されたフレームワークを含んだ。

図９Ｇは、フレームワーク領域単独（９０％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全ＶＬ
鎖（９３％）に関する、初期抗体軽鎖のハイブリッドヒト化型（図９Ｆを参照のこと）と
初期抗体の軽鎖との間の相同性の程度を示すチャートである。フレームワーク領域単独（
９３％）、ＣＤＲ単独（７０％）およびＶｋ鎖遺伝子（８７％）に関する、初期抗体軽鎖
のハイブリッドヒト化型と、最も近縁な生殖細胞系列ファミリーメンバーＶｋＩＩ（Ａ１
７）との間の相同性の程度もまた示される。初期抗体フレームワーク領域に最も類似のヒ
ト再配列抗体軽鎖を同定すること、およびこの軽鎖中に初期抗体ＣＤＲをグラフトするこ
とにより構築されたヒト化軽鎖（すなわち、ヒト再配列ＣＤＲグラフト化ＶＬ）と、初期
抗体軽鎖との間の相同性の程度もまた、フレームワーク領域単独（８５％）、ＣＤＲ単独
（１００％）および全ＶＬ鎖（８９％）に関して示されている。最後は、フレームワーク
領域単独（８８％）、ＣＤＲ単独（７０％）およびＶｋ鎖遺伝子（８４％）に関する、こ
のヒト再配列ＣＤＲグラフト化Ｖｋと、最も近縁の生殖細胞系列ファミリーメンバーＶｋ
ＩＩ（Ａ１７）との間の相同性の程度である。このチャートから見られるように、本開示
に従って作製された上記に例示したハイブリッド抗体軽鎖は、匹敵し得る配列と比較した
とき、フレームワーク領域および全体の可変重鎖の両方で、より大きな相同性を示してい
る。

図９Ｈは、クエリーとしてＣＤＲなしに組み合わせたフレーム領域を用いて、ＧｅｎＢ
ａｎｋ中の最も類似の抗体間のフレームワーク相同性を示す。

図１０Ａは、初期抗体の可変重鎖配列を示す。上記のように、ＮＣＢＩタンパク質デー
タバンクのＢＬＡＳＴ検索は、ＦＲ１で開始するクエリーとして、各個々の可変重鎖フレ
ームワーク領域を用いて実施された。

（ＦＲ１）
抗体配列遺伝子識別番号１８６９８３７３を、初期抗体重鎖のＦＲ１に良好な相同性（
８０％）を有するＦＲ１を有するとして選択した。図１０Ｂを参照のこと。１８６９８３
７３は、ヒト生殖細胞系列ファミリーＶＨ７、メンバー８１に属する（図２を参照のこと
）。抗体配列遺伝子識別番号３９２６７７を、初期抗体重鎖のＦＲ１に良好な相同性をも
つＦＲ１を有する第２の抗体として選択した。図９Ｂを参照のこと。３９２６７７は、ヒ
ト生殖細胞系列ファミリーＶＨ１、メンバー２に属し（図２を参照のこと）、そしてその
ＦＲ１は、初期抗体のＦＲ１に対して７６％の相同性をもつ。

（ＦＲ２）
抗体配列遺伝子識別番号８８６２８８を、初期抗体重鎖のＦＲ２に良好な相同性（１０
０％）を有するＦＲ２を有するとして選択した。図１０Ｃを参照のこと。８８６２８８は
、ヒト生殖細胞系列ファミリーＶＨ１、メンバー２に属する。抗体配列遺伝子識別番号９
９９１０６を、初期抗体重鎖のＦＲ２に良好な相同性をもつＦＲ２を有する第２の抗体と
して選択した。図１０Ｂを参照のこと。９９９１０６は、ヒト生殖細胞系列ファミリーＶ
Ｈ１、メンバー４６に属し（図２を参照のこと）、そしてそのＦＲ２は、初期抗体のＦＲ
２に対して１００％の相同性をもつ。

（ＦＲ３）
抗体配列遺伝子識別番号５５４２５３８を、初期抗体重鎖のＦＲ３に良好な相同性（８
１％）を有するＦＲ３を有するとして選択した。図１０Ｄを参照のこと。５５４２５３８
は、ヒト生殖細胞系列ファミリーＶＨ１、メンバー２に属する。

（ＦＲ４）
抗体配列遺伝子識別番号４５３０５５９を、初期抗体重鎖のＦＲ４に良好な相同性（１
００％）を有するＦＲ４を有するとして選択した。図１０Ｅを参照のこと。４５３０５５
９は、（ヒト生殖細胞系列ファミリー）ＶＨ１、メンバー２に属する。

ハイブリッドヒト化可変重鎖は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ）から市販されているＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、初期抗体可変重鎖フレームワーク
領域の部位特異的変異誘発により構築された。図１０Ｆは、ハイブリッドヒト化可変重鎖
のアミノ酸配列を示し、そして初期抗体配列と比較したとき、改変された特定のヌクレオ
チドおよびアミノ酸の位置を示している。フレームワーク領域は太字で、そして改変され
たアミノ酸には下線を引いてある。要約すれば、上記Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ
ｓｙｓｔｅｍに従って、クローニングと形質転換を、初期抗体ＶＨをプラスミドｐＡＬ
ＴＥＲ−ＥＸ２（これは、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を
含み、このクロラムフェニコール遺伝子は、変異体鎖の選択を提供するためのクロラムフ
ェニコール修復オリゴヌクレオチドを用いて回復され得るフレームシフト変異を含む）と
連結することより達成した。連結後、ＪＭ１０９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をこのプラスミドで
形質転換し、培養し、そして得られたプラスミドを単離した。単離されたｐＡＬＴＥＲ−
ＥＸ２−ＶＨプラスミドは、ＮａＯＨ（アルカリ）を用いて変性した。アニーリングおよ
び変異誘発反応は、アルカリ−変性ｐＡＬＴＥＲ−ＥＸ２−ＶＨを、リン酸化修復、ノッ
クアウトおよび変異誘発オリゴヌクレオチド（図８を参照のこと）、プラス１０×アニー
リング緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）と混合することを包含
した。混合物を７５℃まで５分間加熱し、そして室温まで冷却させた。Ｔ４ポリメラーゼ
、Ｔ４リガーゼおよび１０×合成緩衝液を、アニーリング混合物に添加し、これを、３７
℃で９０分間インキュベートし、変異体鎖を合成した。変異した産物は、ＥＳ１３０１
ｍｕｔＳコンピテント細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）を、変異
誘発反応混合物の産物で形質転換することにより分析した。これらの細胞は、インビボミ
スマッチ修復を抑制する。得られるミニプレッププラスミドを、ＪＭ１０９コンピテント
細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販されている）中に形質転換した。得られるＪ
Ｍ１０９細胞から精製されたプラスミドを、配列決定分析によりスクリーニングした。得
られる可変重鎖は、図１０Ｆに示されるような、ＣＤＲに作動可能に連結された選択フレ
ームワークを含んでいた。

図１０Ｈは、フレームワーク領域単独（８７％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全Ｖ
Ｈ鎖（９１％）に関する、初期抗体重鎖のハイブリッドヒト化型（図１０Ｆを参照のこと
）と初期抗体の重鎖との間の相同性の程度を示すチャートである。フレームワーク領域単
独（７２％）、ＣＤＲ単独（４４％）およびＶＨ鎖（６４％）に関する、初期抗体のハイ
ブリッドヒト化型と、最も近縁な生殖細胞系列ファミリーメンバーＶＨ４−３１との間の
相同性の程度もまた示される。初期抗体と、初期抗体フレームワーク領域に最も類似のヒ
ト再配列抗体重鎖を同定すること、およびこの重鎖中に初期抗体ＣＤＲをグラフトするこ
とにより構築されたヒト化（すなわち、ヒト再配列ＣＤＲグラフト化ＶＨ）との間の相同
性の程度もまた、フレームワーク領域単独（８０％）、ＣＤＲ単独（１００％）および全
ＶＨ鎖（８７％）に関して示されている。最後は、フレームワーク領域単独（６９％）、
ＣＤＲ単独（４４％）および全ＶＨ鎖遺伝子（６２％）に関する、このヒト再配列ＣＤＲ
グラフト化ＶＨと、最も近縁の生殖細胞系列ファミリーメンバー（ＶＨ１−４６）との間
の相同性の程度である。このチャートから見られ得るように、本開示に従って作製された
上記に例示したハイブリッド抗体は、匹敵し得る配列と比較したとき、フレームワーク領
域および全体の可変重鎖の両方で、より大きな相同性を示している。

図１０Ｇは、クエリーとしてＣＤＲなしに組み合わせたフレームワーク領域を用いたと
きの、ＢｅｎＢａｎｋ中の最も類似の抗体間のフレームワーク相同性を示す。

（競合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸塩コーティング緩衝液中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇ
Ｇでコートし、洗浄緩衝液で２回洗浄した。３７℃におけるブロッキング緩衝液でのブロ
ッキングの後、このウェルを洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして次に、０．２５μｇ／ｍｌ
のｈＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ（ブロッキング緩衝液中）とともに３７℃で１時間インキュベ
ートし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。

競合アッセイには、４μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌいずれかのビオチン結合ＡＺＮ−
Ｄ１を、ブロッキング緩衝液中の異なる濃度のＡＺＮ−Ｄ１または本開示に従うハイブリ
ッド抗体（ｈＤ１Ｖ１）または５Ｇ１．１抗体（米国特許第６，３５５，２４５号に記載
の抗体、その開示は、この参考として本明細書中に援用される）と混合し、そしてＲＴ（
室温）で２時間インキュベートし、次いで、ウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＲＴで４
５分間、ブロッキング緩衝液中で、１：１０００ ＳＡ−ＨＲＰ（ストレプトアビジン−
西洋ワサビペルオキシダーゼ）とインキュベートした。洗浄緩衝液で８回洗浄した後、ウ
ェルを、０．０３％過酸化水素を含むｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液中で
ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）により発色し、４９２ｎｍで読み取った。

（抗ｈＤＣ−ＳＩＧＮ ＥＬＩＳＡ ＲＥＡＧＥＮＴＳ）
（炭酸塩コーティング緩衝液、ｐＨ９．６）
Ｎａ_２ＣＯ_３ １．６ｇ＋ＮａＨＣＯ_３ ２．９ｇ
８００ｍＬのＨ_２Ｏを加え、ｐＨ９．６にし、次いでＨ_２Ｏで１Ｌにする。

（ブロッキング緩衝液）
ＢＳＡ １ｇ＋ＰＢＳ １００ｍＬ
ＢＳＡをＰＢＳに加え、そして使用の前に完全に溶解させる。４℃で貯蔵する。

（洗浄緩衝液）
（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ）：Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．５ｇ＋ＰＢＳ １Ｌ
ＴｗｅｅｎをＰＢＳに添加し、そして使用間前に完全に混合する。

（クエン酸緩衝液）
クエン酸。５０ｍＬ中２．１ｇ。

クエン酸ナトリウム（２水和物）。５０ｍＬ中１．４７ｇ。

一緒に溶液を加え、そしてｐＨを４．０〜４．２に調節する。
すべてのインキュベーションは、４℃で一晩、または室温で２時間、または３７℃で１時
間実施し得る。

競合ＥＬＩＳＡ実験の結果を図１１に示す。

結合親和性、会合速度定数および解離速度定数は、初期抗体、および抗原としてｈ−Ｄ
ｃ−ＳＩＧＮ−Ｆｃを用い、それらの開示および以下の製造業者の指示書に従って調製さ
れた２つのハイブリッド抗体（Ｄ１Ｖ１およびＤ１Ｖ２）について決定される。これら結
果を図１３に示す。

種々の改変が本明細書に開示の実施形態になされ得ることが理解される。従って、上記
の説明は、制限として解釈されるべきではなく、好ましい実施形態の単なる例示として解
釈されるべきである。当業者は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲および精神内で
その他の改変を想定する。

Claims (46)

1. ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法であって、以下：
   標的に対して特異性を有する初期抗体を提供する工程；
   該初期抗体の可変領域の配列を決定する工程；ならびに
   （ｉ）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される該可変領域の
   第１の部分を選択する工程；
   該第１の部分の配列と、標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照デ
   ータベース中に含まれる配列とを比較する工程；
   該第１の部分に対して高度の相同性を示す配列を該データベース中の抗体から選択す
   る工程；
   （ｉｉ）該第１の部分とは異なる該可変領域の第２の部分を選択する工程であって、
   該第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される、工程
   ；
   該第２の部分の配列と、該標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
   データベースに含まれる配列とを比較する工程；
   該第２の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）において選択される該抗
   体とは異なる抗体に由来する配列を該データベースから選択する工程；ならびに
   （ｉｉｉ）該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作
   動可能に連結して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工
   程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するため
   の方法であって、以下：
   前記第１および第２の部分とは異なる前記可変領域の第３の部分を選択する工程であっ
   て、該第３の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択される、
   工程；
   該第３の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
   データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
   該第３の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）および（ｉｉ）における選
   択のために使用される該参照データベース中の抗体と同じか、または異なる抗体に由来す
   る配列を該データベースから選択する工程；ならびに
   該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
   して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
   をさらに包含する、方法。
3. 請求項２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するため
   の方法であって、以下：
   前記第１、第２および第３の部分とは異なる前記可変領域の第４の部分を選択する工程
   であって、該第４の部分は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群より選択さ
   れる、工程；
   該第４の部分の配列と、前記標的種由来の抗体配列または抗体フラグメント配列の参照
   データベース中に含まれる配列とを比較する工程；
   該第４の部分に対して高度の相同性を示し、かつ工程（ｉ）、（ｉｉ）および請求項２
   における選択のために使用される該参照データベース中の抗体と同じか、または異なる抗
   体に由来する配列を該データベースから選択する工程；ならびに
   該選択されたフレームワーク配列と該初期抗体の１つ以上のＣＤＲとを作動可能に連結
   して、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する工程、
   をさらに包含する、方法。
4. 前記第１の部分が、ＣＤＲを含む、請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
   ド抗体フラグメントを生成するための方法。
5. 前記第２の部分が、ＣＤＲを含む、請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
   ド抗体フラグメントを生成するための方法。
6. 前記第１の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群の２つまたは３つの
   メンバーの組み合わせである、請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗
   体フラグメントを生成するための方法。
7. 前記第２の部分が、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群の２つまたは３つの
   メンバーの組み合わせである、請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗
   体フラグメントを生成するための方法。
8. 前記初期抗体の可変領域が、可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される、請求項
   １に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法
   。
9. 可変重鎖および可変軽鎖からなる群より選択される抗体フラグメントが生成される、請求
   項３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方
   法。
10. 前記配列が、アミノ酸配列または核酸配列である、請求項１に記載のハイブリッド抗体ま
    たはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
11. 前記抗体フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、Ｆｄ、ダイア
    ボディ、抗体軽鎖および抗体重鎖からなる群より選択される、請求項１に記載のハイブリ
    ッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成するための方法。
12. 前記標的種が、ヒトである、請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体
    フラグメントを生成するための方法。
13. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
    であって、前記初期抗体由来のＦＲ１領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
    配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
14. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
    であって、前記初期抗体由来のＦＲ２領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
    配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
15. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
    であって、前記初期抗体由来のＦＲ３領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
    配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
16. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
    であって、前記初期抗体由来のＦＲ４領域配列を個々に使用して、高度の相同性を有する
    配列についての前記参照データベースを検索する、方法。
17. 請求項１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを生成する方法
    であって、前記参照データベースが、前記標的種の生殖細胞系列配列または再配列された
    配列を含む、方法。
18. 第１の抗体由来の第１の重鎖フレームワーク領域、および第２の抗体由来の第２の重鎖フ
    レームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
19. 前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
    体からなる群より選択される抗体由来の第３の重鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
    求項１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
20. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
    でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の重鎖フ
    レームワーク領域をさらに含む、請求項１９に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
    ド抗体フラグメント。
21. 前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
    請求項１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
22. 第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域、および第２の抗体由来の第２の軽鎖フ
    レームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
23. 前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
    体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
    求項２２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
24. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
    でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
    レームワーク領域をさらに含む、請求項２３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
    ド抗体フラグメント。
25. 前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
    請求項２２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
26. 請求項１８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
    または抗体フラグメントのライブラリー。
27. 請求項２２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
    または抗体フラグメントのライブラリー。
28. 第１の抗体由来の第１の重鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の重鎖フレ
    ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
    、該第１の重鎖フレームワーク領域が、特定のＶＨファミリーに対応し、該第２の重鎖フ
    レームワーク領域が、該第１の重鎖フレームワーク領域と同じＶＨファミリーに対応する
    、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
29. 前記第１の抗体、前記第２の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の抗
    体からなる群より選択される抗体由来の第３の重鎖フレームワーク領域をさらに含む、請
    求項２８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該第
    ３の重鎖フレームワーク領域が、前記第１の重鎖フレームワーク領域と同じＶＨファミリ
    ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
30. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
    でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の重鎖フ
    レームワーク領域をさらに含む、請求項２９に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
    ド抗体フラグメント。
31. 前記第２の重鎖フレームワーク領域および前記第３の重鎖フレームワーク領域のいずれか
    、またはその両方が、前記第１の重鎖フレームワーク領域と同じ前記ＶＨファミリーのメ
    ンバーに対応する、請求項３０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
    メント。
32. 前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
    請求項２８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
33. 第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の軽鎖フレ
    ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
    、該第１の軽鎖フレームワーク領域が、特定のＶＫファミリーに対応し、該第２の軽鎖フ
    レームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＫファミリーに対応する
    、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
34. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の
    抗体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、
    請求項３３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該
    第３の軽鎖フレームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＫファミリ
    ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
35. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
    でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
    レームワーク領域をさらに含む、請求項３４に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
    ド抗体フラグメント。
36. 前記第２の軽鎖フレームワーク領域および前記第３の軽鎖フレームワーク領域のいずれか
    、またはその両方が、前記第１の軽鎖フレームワーク領域と前記ＶＫファミリーのメンバ
    ーに対応する、請求項３５に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメン
    ト。
37. 前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
    請求項３３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
38. 請求項２８に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
    または抗体フラグメントのライブラリー。
39. 請求項３３に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
    または抗体フラグメントのライブラリー。
40. 第１の抗体由来の第１の軽鎖フレームワーク領域および第２の抗体由来の第２の軽鎖フレ
    ームワーク領域を含む、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメントであって
    、該第１の軽鎖フレームワーク領域が、特定のＶＬファミリーに対応し、該第２の軽鎖フ
    レームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＬファミリーに対応する
    、ハイブリッド抗体またはハリブリッド抗体フラグメント。
41. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、および該第１の抗体でも該第２の抗体でもない第３の
    抗体からなる群より選択される抗体由来の第３の軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、
    請求項４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントであって、該
    第３の軽鎖フレームワーク領域が、該第１の軽鎖フレームワーク領域と同じＶＬファミリ
    ーに対応する、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
42. 前記第１の抗体、前記第２の抗体、前記第３の抗体および該第１の抗体でも該第２の抗体
    でも該第３の抗体でもない第４の抗体からなる群より選択される抗体由来の第４の軽鎖フ
    レームワーク領域をさらに含む、請求項４１に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッ
    ド抗体フラグメント。
43. 前記第２の軽鎖フレームワーク領域および前記第３の軽鎖フレームワーク領域のいずれか
    、またはその両方が、前記第１の軽鎖フレームワーク領域と同じ前記ＶＬファミリーのメ
    ンバーに対応する、請求項４２に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグ
    メント。
44. 前記フレームワーク領域が、ヒト起源であり、かつ、前記ＣＤＲが、非ヒト起源である、
    請求項４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメント。
45. 請求項４０に記載のハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントを含む、抗体
    または抗体フラグメントのライブラリー。
46. 本明細書中に記載の方法。
    

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