JP2009109515A - リガンド発見のための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】結合技術を使用してリガンドを発見すること。
【解決手段】本発明は、リガンド発見のための新規の方法を開示する。本発明の方法は、「結合（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）」と称されるプロセスに依存し、ここで、潜在的なリガンドが、標的に共有結合されるか、または「結合」され、引き続き同定される。ほ１つの実施形態において、本発明は、標的−化合物結合体を提供する。１つの実施形態において、この標的は、酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、およびアロステリック酵素調節因子からなる群より選択される。
【選択図】なし

Description

（背景）
薬物発見プロセスは、通常、引き続く医化学最適化のための適度な親和性リード（ｌｅａｄ）を同定するための、化合物ライブラリーの大規模な機能的スクリーニングで開始する。しかし、目的の標的の全てがこのようなスクリーニングに耐えられるわけではない。いくつかの場合において、ハイスループットスクリーニングに耐えられるアッセイが、利用可能ではない。他の場合において、標的は、複数の結合様式を有し得、その結果、このようなスクリーニングの結果が曖昧であり、そして解釈が困難である。なお他の場合において、ハイスループットアッセイのためのアッセイ条件は、人為結果を受けやすいようなものである。その結果、必ずしも機能的スクリーニングに依存しない、リガンドの発見のための代替の方法が必要とされる。

（発明の要旨）
本発明は、結合技術を使用する、リガンド発見のための方法に関する。

１つの局面において、本発明は、以下：

からなる群より選択される、標的−化合物結合体に関する。ここで、

は、標的であり、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、非置換アリール、または置換アリールであり；
ｍは、０、１、または２であり；そして
ｎは、１または２である。

特定の実施形態において、この標的は、ポリペプチドまたタンパク質であり、これは例えば、酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、およびアロステリック酵素調節因子からなる群より選択され得る。−Ｓ−Ｓ−結合と標的化合物との間の共有結合は、可逆的であっても非可逆的であってもよい。

別の局面において、本発明は、各メンバーが以下：

からなる群より選択される式を有する、化合物のライブラリーに関し、ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、非置換アリール、または置換アリールであり；ｍは、０、１、または２であり；そしてｎは、１または２である。

このライブラリーは、好ましくは、少なくとも約５のメンバー、より好ましくは、少なくとも約１００のメンバーを有し、そしてこのライブラリーの個々のメンバーの原子質量は、好ましくは、少なくとも約５原子質量単位、より好ましくは、少なくとも約１０原子質量単位異なる。

さらなる局面において、本発明は、以下を包含する方法に関する：
ａ）標的タンパク質に結合する、式Ｒ^ＤＳＳＲ^１の第一の化合物を同定する工程；
ｂ）標的タンパク質に結合する、式Ｒ^ＥＳＳＲ^１の第二の化合物を同定する工程；および
ｃ）Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅを含む結合体化合物を形成する工程であって、ここで、Ｒ^ＤおよびＲ^１は、各々独立して、Ｃ_１〜Ｃ_２０の非置換脂肪族、Ｃ_１〜Ｃ_２０の置換脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；そしてＲ^１は、非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、非置換アリールである。この方法の特定の実施形態において、標的に結合する第二の化合物の同定は、第一の化合物の存在下で行われる。

別の実施形態において、Ｒ^ＤＳＳＲ^１およびＲ^ＥＳＳＲ^１は、各々独立して、以下：

からなる群より選択され、ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、非置換アリール、または置換アリールであり；
ｍは、０、１、または２であり；そして
ｎは、１または２である。

なおさらなる局面において、本発明は、以下を包含する方法に関する：
ａ）目的の部位またはその近くで共有結合を形成し得るか、または金属に配位し得る、アンカー基を有する標的を提供する工程；
ｂ）この標的を伸長因子と接触させて、これによって、標的−伸長因子複合体を形成する工程であって、ここで、この伸長因子は、共有結合を形成するかまたは金属に配位するかのいずれかである、第一の官能基、および共有結合を形成し得る第二の官能基を含む、工程；
ｃ）この標的−伸長因子複合体を、第二の官能基と共有結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｄ）標的伸長因子複合体と候補リガンドとの間で、共有結合を形成させる工程；ならびに
ｅ）標的−伸長因子−リガンド結合体中に存在する、候補リガンドを同定する工程。

この方法の特定の実施形態において、アンカー基は、反応性求電子基、反応性求核基、および金属配位部位からなる群より選択される。

本発明はまた、以下を包含する方法に関する：
ａ）反応性の求核基を、目的の部位またはその近くに有する標的を提供する工程；
ｂ）この標的を伸長因子と接触させて、これによって、標的−伸長因子複合体を形成する工程であって、ここで、この伸長因子は、標的における求核基と反応して共有結合を形成する、第一の官能基、およびジスルフィド結合を形成し得る、第二の官能基を含む、工程；
ｃ）この標的−伸長因子複合体を、ジスルフィド結合を形成し得るリガンド候補物と接触させる工程；
ｄ）標的−伸長因子複合体とリガンド候補物との間でジスルフィド結合を形成する工程であって、これによって、標的−伸長因子−リガンド結合体を形成する、工程；ならびに
ｅ）この標的−伸長因子−リガンド結合体中に存在する、リガンド候補物を同定する工程。

標的における反応性求核基は、例えば、チオールまたはマスクされたチオールであり得、そして伸長因子は、以下の式を有し得る：

ここで、Ｒは、非置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；Ｒ’は、Ｈ、−ＳＲ^１（ここでＲ^１は、非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、非置換アリール、および置換アリールである）であり；Ｘは、脱離基であり、そして各式におけるボックスは、結合決定基を表す。

特定の実施形態において、伸長因子は、以下の式のものである：

ここで、Ｒ’は、Ｈ、−ＳＲ^１（ここでＲ^１は、非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_１０脂肪族、非置換アリール、および置換アリールである）であり、そしてボックスは、結合決定基を表す。

異なる局面において、本発明は、タンパク質−伸長因子複合体に関し、ここで、このタンパク質は、伸長因子と共有結合を形成し、この伸長因子は、共有結合を形成し得る第一の官能基、および第二の共有結合を形成し得る第二の官能基を含む。

別の局面において、本発明は、タンパク質−伸長因子複合体に関し、ここで、このタンパク質は、伸長因子とともに金属に配位し、この伸長因子は、金属に配位し得る第一の官能基、および共有結合を形成し得る第二の官能基を含む。

これらの複合体は、第二の官能基と、ジスルフィド結合を形成し得る化合物との間に、ジスルフィド結合をさらに含み得る。
・例えば、本発明はさらに、以下を提供し得る。
（項目１）
以下：

から選択される標的−化合物結合体であって、
ここで、

が、該標的であり、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、非置換アリール、または置換アリールであり；
ｍは、０、１、または２であり；そして
ｎは、１または２である、標的−化合物結合体。
（項目２）
前記標的がポリペプチドである、項目１に記載の標的−化合物結合体。
（項目３）
前記−Ｓ−Ｓ−基と前記

標的との間の共有結合が可逆性である、項目２に記載の標的−化合物結合体。
（項目４）
前記−Ｓ−Ｓ−基と前記

標的との間の共有結合が不可逆性である、項目２に記載の標的−化合物結合体。
（項目５）
前記標的が、酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、およびアロステリック酵素調節因子からなる群より選択される、項目２に記載の標的−化合物結合体。
（項目６）
化合物のライブラリであって、ここで、各々のメンバーが、以下：

からなる群より選択される式を有し、ここでＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、非置換アリール、または置換アリールであり；
ｍは、０、１、または２であり；そして
ｎは、１または２である、ライブラリ。
（項目７）
少なくとも５つのメンバーを有する、項目６に記載のライブラリ。
（項目８）
少なくとも１００のメンバーを有する、項目６に記載のライブラリ。
（項目９）
各々のメンバーが異なる質量を有する、項目６に記載のライブラリ。
（項目１０）
各々のメンバーが、前記ライブラリ中の別のメンバーと、少なくとも５原子質量単位だけ異なる質量を有する、項目９に記載のライブラリ。
（項目１１）
各々のメンバーが、前記ライブラリ中の別のメンバーと、少なくとも１０原子質量単位だけ異なる質量を有する、項目９に記載のライブラリ。
（項目１２）
以下：
ａ）標的タンパク質に結合する式Ｒ ^Ｄ ＳＳＲ ^１ の第一の化合物を同定する工程；
ｂ）標的タンパク質に結合する式Ｒ ^Ｅ ＳＳＲ ^１ の第二の化合物を同定する工程；ならびに
ｃ）Ｒ ^Ｄ とＲ ^Ｅ とを含む結合体化合物を形成する工程であって、ここで、Ｒ ^Ｄ およびＲ ^Ｅ は、各々独立して、Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 非置換脂肪族、Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 置換脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；そしてＲ ^１ が非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、非置換アリールである、工程、
を包含する、方法。
（項目１３）
前記標的に結合する前記第二の化合物の同定が、前記第一の化合物の存在下で生じる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
Ｒ ^Ｄ ＳＳＲ ^１ およびＲ ^Ｅ ＳＳＲ ^１ が、各々独立して、以下：

からなる群より選択され、ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；
ｍが０、１、または２であり；そして、
ｎが１または２である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
以下：
ａ）共有結合を形成し得るか、または目的の部位にて、もしくは目的の部位の近傍にて金属を配位結合する能力を有するアンカー基を有する標的を提供する工程；
ｂ）該標的を、伸長因子と接触させ、それにより、標的−伸長因子複合体を形成させる工程であって、ここで、該伸長因子が、第一の官能基および第二の官能基を含み、該第一の官能基は、共有結合を形成するかまたは金属を配位結合するかのいずれかであり、そして該第二の官能基が共有結合を形成する能力を有する、工程；
ｃ）該標的−伸長因子複合体を候補リガンドと接触させる工程であって、該候補リガンドが、該第二の官能基と共有結合を形成する能力を有する、工程；
ｄ）該標的−伸長因子複合体と該候補リガンドとの間に共有結合を形成させる工程；および
ｅ）該標的−伸長因子−リガンド結合体の存在下で該候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）
前記アンカー基が、反応性求電子基、反応性求核基、および金属配位部位からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
以下：
ａ）目的の部位にて、もしくは目的の部位の近傍にて反応性求核基を有する標的を提供する工程；
ｂ）該標的を、伸長因子と接触させ、それにより、標的−伸長因子複合体を形成させる工程であって、ここで、該伸長因子が、第一の官能基および第二の官能基を含み、該第一の官能基は、該標的における該求核基と反応して共有結合を形成し、そして該第二の官能基がジスルフィド結合を形成する能力を有する、工程；
ｃ）該標的−伸長因子複合体を候補リガンドと接触させる工程であって、該候補リガンドが、ジスルフィド結合を形成する能力を有する、工程；
ｄ）該標的−伸長因子複合体と該候補リガンドとの間にジスルフィド結合を形成し、それにより、標的−伸長因子−リガンド結合体を形成させる工程；ならびに
ｅ）該標的−伸長因子−リガンド結合体の存在下で該候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記標的上の前記反応性求核基がチオールまたはマスクされたチオールである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
項目１７に記載の方法であって、前記伸長因子が、以下の式：

の伸長因子であり、ここで、Ｒが、非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _２０ 脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；Ｒ’がＨ、−ＳＲ ^１ であり、ここでＲ ^１ が非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；Ｘが脱離基であり；そして各式中の該四角が、結合決定基を表す、方法。
（項目２０）
項目１７に記載の方法であって、ここで、前記伸長因子が、以下：

の伸長因子であり、ここでＲ’がＨ、−ＳＲ ^１ であり、ここでＲ ^１ が非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ 脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；そして前記四角が、結合決定基を表す、方法。

図１Ａは、結合方法の１つの実施形態の模式図である。チオール含有タンパク質が、複数のリガンド候補物と反応される。この標的に対する固有の結合親和性を有するリガンド候補物が同定され、そしてリガンドは、ジスルフィド部分を含まない、同定された結合決定基（円によって表される）を含むようにされる。図１Ｂは、結合の背後にある理論の模式図である。チオール含有タンパク質が、少なくとも１つのジスルフィド含有リガンド候補物と平衡状態にある場合（最も好ましくは、還元剤の存在下で）、修飾タンパク質と未修飾タンパク質との間の平衡が確立される。リガンド候補物が、標的タンパク質に対する固有の結合親和性を有さない場合、この平衡は、未修飾タンパク質の方にシフトする。対照的に、リガンド候補物がタンパク質に対する固有の親和性を有さない場合、この平衡は、修飾タンパク質の方にシフトする。 図２Ａおよび図２Ｂは、結合実験の代表例である。図２Ａは、チミジル酸シンターゼ（「ＴＳ」）の、ＴＳに対する結合親和性をほとんどまたは全く有さない１０の異なるリガンド候補物のプールとの反応の、解析されたマススペクトルである。図２Ｂは、リガンド候補物のうちの１つが、この酵素に対する固有の結合親和性を有する場合の、ＴＳの、１０の異なるリガンド候補物のプールとの反応の、解析されたマススペクトルである。 図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、代表的な結合実験に対する、還元剤の濃度の影響を示す。図３Ａは、２−メルカプトエタノールなしで反応が実施された場合の、解析されたマススペクトルである。図３Ｂは、０．２ｍＭの２−メルカプトエタノールの存在下で同じ反応が実施された場合の、解析されたマススペクトルである。図３Ｃは、２０ｍＭの２−メルカプトエタノールの存在下で同じ反応が実施された場合の、解析されたマススペクトルである。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、代表的な結合実験における、ライブラリー中のリガンド候補物の数の影響を示す。図４Ａは、２０のリガンド候補物を含むライブラリープールを用いた結合実験である。図４Ｂは、５０のリガンド候補物を含むライブラリープールを用いた結合実験である。図４Ｃは、１００のリガンド候補物を含むライブラリープールを用いた結合実験である。 図５は、初めに選択された結合決定基Ｒ^Ｄを使用して、Ｒ^Ｄを含む化合物およびその改変体のライブラリーを作製した場合の、模式図である。この図は、改変されたライブラリーが、第一の結合決定基の改変体Ｒ^Ｄ’、および第二の結合決定基Ｒ^Ｅを含む化合物を含んだ場合の、結合実験を示す。示されるように、これら２つの結合決定基は、引き続いて一緒に結合されて、ジスルフィドを欠く結合体分子を形成する。 図６は、２つの結合決定基（Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅであり、これらは、引き続いて一緒に結合して、結合体分子を形成する）を同定するために使用される、２つの結合実験の模式である。 図７は、第二の結合決定基Ｒ^Ｅが、Ｒ^Ｄの結合の存在下で同定される場合の、２つの結合実験の模式である。一旦同定されると、これら２つの結合決定基は、結合して、結合体分子を形成する。 図８は、第一の官能基および第二の官能基を含む伸長因子（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を使用する場合の、結合方法の１つの実施形態の模式図である。示されるように、チオールを含む標的が、第一の官能基Ｘ（これは、反応性チオールと共有結合を形成し得る）および第二の官能基−ＳＲ^１’（これは、ジスルフィド結合を形成し得る）を含む伸長因子と接触される。結合−伸長因子複合体が形成され、これは次いで、複数のリガンド候補物と接触される。この伸長因子は、１つの結合決定基（円）を提供し、そしてこのリガンド候補物は、第二の結合決定基（正方形）を提供し、そして得られる結合決定基は、一緒に結合して、結合体化合物を形成する。

（好ましい実施形態の説明）
本発明は、目的の標的における選択された部位に結合し得るリガンドを同定するための、迅速かつ効率的な方法を提供する。本明細書中の方法によって同定されるリガンド自体が、例えば、新規治療薬剤、酵素インヒビター、標識化合物、診断剤、タンパク質精製のための親和性薬剤などの開発のための、リード化合物としての用途を見出す。

他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９２）のような参考文献は、当業者に、本願において使用される用語の多くの一般的指針を提供する。

本発明の１つの局面において、化合物が提供される。明白にかまたは暗示的に他のように示されない限り、これらの化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、またはこれらの混合物の形態であり得る。これらの化合物が二重結合を含む場合、これらの二重結合は、他のように示されない限り、ＺまたはＥのいずれか、あるいはその混合物であり得る。

（定義）
本明細書中で使用される用語の定義としては、以下が挙げられる：
用語「脂肪族」または「非置換脂肪族」とは、直鎖、分枝鎖、環状、または多環式の炭化水素をいい、そしてアルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分が挙げられる。

用語「アルキル」または「非置換アルキル」とは、飽和炭化水素をいう。

用語「アルケニル」または「非置換アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素をいう。

用語「アルキニル」、または「非置換アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素をいう。

用語「アリール」または「非置換アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環を有する、単環式または多環式の不飽和部分をいう。この用語は、１つ以上のヘテロ原子をその少なくとも１つの芳香族環内に含む、ヘテロアリールを包含する。アリールの代表的な例としては、以下が挙げられる：フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど。

用語「置換（された）」とは、部分を修飾するように使用される場合、少なくとも１つの水素原子が他の基で置換されている、その部分の置換されたバージョンをいい、この別の基としては、以下：脂肪族；アリール、アルキルアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、−ＯＨ；−ＮＯ_２；−ＣＮ；−ＣＦ_３；−ＣＨ_２ＣＦ_３；−ＣＨ_２Ｃｌ；−ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ；−ＣＨ_２ＮＨ_２；−ＣＨ_２ＳＯ_２ＣＨ_３；−ＯＲ^Ｘ；−Ｃ（Ｏ）Ｒ^Ｘ；−ＣＯＯＲ^Ｘ；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｘ）_２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ^Ｘ；−ＯＣＯＯＲ^Ｘ；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^Ｘ）_２；−Ｎ（Ｒ^Ｘ）_２；−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^Ｘ；および−ＮＲ^ＸＣ（Ｏ）Ｒ^Ｘが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、各場合のＲ^Ｘは、独立して、水素、置換脂肪族、非置換脂肪族、置換アリール、または非置換アリールである。さらに、部分における隣接する基の置換は、一緒になって、環式基を形成し得る。

用語「アンタゴニスト」は、その最も広い意味で使用され、そして標的（例えばＴＢＭ）によって示される生物学的活性を、部分的にかまたは完全に、遮断するか、阻害するか、または中和する、任意のリガンドを包含する。類似の様式で、用語「アゴニスト」は、その最も広い意味で使用され、そして標的（例えば、ＴＢＭ）によって示される生物学的活性を、例えば、このようなＴＢＭの機能もしくは発現、またはこのようなＴＢＭを介するシグナル伝達の効率を特異的に変化させ、これにより、すでに存在する生物学的活性を変化させる（増加もしくは阻害する）か、または新たな生物学的活性を誘発することによって模倣する、任意のリガンドを包含する。

用語「伸長因子」とは、約３０〜約１，５００ダルトンの分子量を有し、そして標的上の基と反応し得る第一の官能基、およびリガンド候補物またはリガンド候補物のライブラリーのメンバーと反応してジスルフィド結合を形成し得る第二の官能基を有する、分子をいう。

用語「リガンド」とは、標的に対する測定可能な結合親和性を有する実体をいう。一般に、リガンドとは、約１００ｍＭ以下、好ましくは約１０ｍＭ以下、そしてより好ましくは約１ｍＭ以下のＫ_ｄまたはＫ_ｉで標的に結合する場合に、測定可能な親和性を有するといわれる。好ましい実施形態において、リガンドはペプチドではなく、そして低分子である。リガンドは、大きさが約２０００ダルトン未満である場合、通常は大きさが約１５００ダルトン未満である場合に、低分子である。より好ましい実施形態において、低分子リガンドは、大きさが約１０００ダルトン未満、通常は大きさが約７５０ダルトン未満、そしてより通常には大きさが約５００ダルトン未満である。

伸長因子に関して、用語「結合決定基」とは、伸長因子の、標的（例えば、標的ポリペプチド）への結合に関与する部分に関する。

用語「リガンド候補物」とは、標的上の相補的な基または適合性の反応性基と共有結合を形成し得る反応性基を有するか、またはこの反応性基を有するように修飾された化合物をいう。リガンド候補物または標的のいずれかにおける反応性基は、例えば、保護基でマスクされ得る。

用語「ポリヌクレオチド」とは、単数形または複数形で使用される場合、一般に、未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例として、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドとしては、限定されないが、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（これは、一本鎖であっても、より代表的には二本鎖であっても、一本鎖領域および二本鎖領域を含んでもよい）が挙げられる。さらに、用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中において使用される場合、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む、三重鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子由来であっても、異なる分子由来であってもよい。これらの領域は、その分子の１つ以上の全てを含み得るが、より代表的には、その分子のいくらかの領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」とは具体的には、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）、あるいは修飾塩基（例えば、トリチル化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義されるような用語「ポリヌクレオチド」の範囲に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、および／または代謝的に修飾された形態の、全ての未修飾ポリヌクレオチド、ならびに種々のウイルスおよび細胞（単純な細胞および複雑な細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

語句「保護（された）チオール」とは、本明細書中において使用される場合、基または分子と反応して、チオールの反応性を低くし、そして脱保護されて遊離チオールを再生し得る共有結合を形成した、チオールをいう。

語句「可逆的共有結合」とは、本明細書中において使用される場合、好ましくは標的を変性しない条件下で破壊され得る、共有結合をいう。例としては、限定されないが、ジスルフィド、シッフ塩基、チオエステル、配位錯体、ボロネートエステルなどが挙げられる。

語句「反応性基」とは、適合性の反応性基もしくは相補的な反応性基を提供される場合に共有結合が形成され得る部位を提供する、化学基または部分である。代表的な例は、他の−ＳＨまたは−ＳＳ−と反応してジスルフィドを形成し得る−ＳＨ；活性化−ＣＯＯＨと反応してアミドを形成し得る−ＮＨ_２；アルデヒドまたはケトンと反応してシッフ塩基を形成し得る−ＮＨ_２などである。

語句「反応性求核基」とは、本明細書中において使用される場合、標的を変性も損傷もしない条件下で、別の分子上の適合性の官能基と共有結合を形成し得る求核基をいう。最も適切な求核基は、チオール、アルコール、およびアミンである。同様に、語句「反応性求電子基」とは、本明細書中において使用される場合、好ましくは、標的を変性も他に損傷もしない条件下で、別の分子上の適合性の官能基と共有結合を形成し得る求電子基をいう。最も適切な求電子基は、イミン、カルボニル、エポキシド、アジリジン（ａｚｉｒｉｄｉｅ）、スルホネート、ジスルフィド、活性化エステル、活性化カルボニル、およびヘミアセタールである。

語句「目的の部位」とは、リガンドが結合し得る標的上の任意の部位をいう。例えば、標的が酵素である場合、目的の部位としては、この酵素の結合基質、インヒビター、アクチベーター、補因子、またはアロステリックモジュレーターと接触するか、または約１０オングストローム以内（より好ましくは、約５オングストローム以内）の位置にある、アミノ酸が挙げられ得る。酵素がプロテアーゼである場合、目的の部位としては、Ｐ６からＰ６’の基質結合チャネル、触媒機能に関与する残基（例えば、触媒性三つ組およびオキシアニオンホール）、ならびに任意の補因子（例えば、Ｚｎのような金属）結合部位が挙げられる。酵素がプロテインキナーゼである場合、目的の部位としては、ＡＴＰ結合部位に加えて、基質結合チャネルが挙げられる。酵素がデヒドロゲナーゼである場合、目的の部位としては、基質結合領域およびＮＡＤ／ＮＡＤＨによって占められる部位が挙げられる。酵素がＰＤＥ４のような加水分解酵素（ｈｙｄｒａｌａｓｅ）である場合、目的の部位としては、ｃＡＭＰと接触する残基、および触媒性二価陽イオンの結合に関与する残基が挙げられる。

用語「標的」、「標的分子」および「ＴＭ」は、交換可能に、最も広い意味で使用され、そしてリガンドの結合がその標的の機能に対する影響を有する、化学実体または生物学的実体をいう。標的は、分子、分子の一部、または分子の凝集物であり得る。リガンドの結合は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。標的分子の特定の例としては、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素（システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびアスパルチルプロテアーゼのようなプロテアーゼが挙げられる））、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、アロステリック酵素調節因子など、ポリヌクレオチド、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、および他の高分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチンまたはリボソーム、脂質二重層含有構造体（例えば、膜）、または膜由来の構造物（例えば、小胞））が挙げられる。この定義は、具体的に、以下に定義されるように、標的生物学的分子（「ＴＢＭ」）を包含する。

「標的生物学的分子」または「ＴＢＭ」とは、本明細書中において使用される場合、単一の生物学的分子、または互いと生物学的に関連する複合体（これに対して、低分子のアゴニストまたはアンタゴニストが、ＴＢＭの機能に対する影響を有する）を形成し得る複数の生物学的分子をいう。好ましい実施形態において、ＴＢＭは、タンパク質またはその一部、あるいは２つ以上のアミノ酸を含み、そして相補的な反応性基を有する化合物と共有結合を形成し得る反応性基を有するかまたはこの反応性基を有するように改変され得るものである。ＴＢＭの代表的な例としては、以下が挙げられる：酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、糖タンパク質、糖脂質、および他の高分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチンまたはリボソーム）、脂質二重層含有構造体（例えば、膜）、あるいは膜由来の構造体（例えば、小胞）。標的は、種々の様式で得られ得、この様式としては、天然の供給源からの単離および精製、化学合成、組換え産生、ならびにこれらおよび類似の方法の任意の組み合わせが挙げられる。

好ましいタンパク質標的としては、以下が挙げられる：細胞表面タンパク質および可溶性レセプタータンパク質（例えば、リンパ球細胞表面レセプター；酵素；プロテアーゼ（例えば、アルパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼ）；ステロイドレセプター；核タンパク質；アロステリック酵素；凝固因子；キナーゼ（セリン／スレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼ）；ホスファターゼ（セリン／スレオニンホスファターゼ、チロシンホスファターゼ、および二重特異性ホスファターゼ、特に、ＰＴＰ−１Ｂ、ＴＣ−ＰＴＰおよびＬＡＲ）；チミジル酸シンターゼ；細菌酵素、真菌酵素およびウイルス酵素（特に、ＨＩＶ、インフルエンザ、ライノウイルスおよびＲＳＶと関連した酵素）；シグナル伝達分子；転写因子；ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの合成または分解に関連するタンパク質または酵素；免疫グロブリン；ホルモン；および種々のサイトカインに対するレセプター。レセプターの例示的な例としては、例えば以下が挙げられる：エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激（Ｇ−ＣＳＦ）レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激（ＧＭ−ＣＳＦ）レセプター、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、成長ホルモン、プロラクチン、ヒト胎盤性ラクトゲン（ＬＰＬ）、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰｂ、ＩＬ−８、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒレグリン−ａおよびヒレグリン−ｂ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、組織成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）および神経成長因子（ＮＧＦ）。他の標的としては、種々のニューロトロフィンおよびこれらのリガンド、他のホルモンおよびレセプター（例えば、骨形態形成因子、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および黄体化ホルモン（ＬＨ）、ＣＤ４０リガンド、アポトーシス因子−１およびアポトーシス因子−２（ＡＰ−１およびＡＰ−２）、ｐ５３、ｂａｘ／ｂｃｌ２、ｍｄｍ２、カスパーゼ（１、３、８および９）、カテプシン、ＩＬ−１／ＩＬ−１レセプター、ＢＡＣＥ、ＨＩＶインテグラーゼ、ＰＤＥ ＩＶ、Ｃ型肝炎ヘリカーゼ、Ｃ型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、トリプターゼ、ｃＰＬＡ（細胞質ゾルホスホリパーゼＡ２）、ＣＤＫ４、ｃ−ｊｕｎキナーゼ、アダプター（例えば、Ｇｒｂ２、ＧＳＫ−３，ＡＫＴ、ＭＥＫＫ−１、ＰＡＫ−１、ｒａｆ、ＴＲＡＦ’ｓ１−６、Ｔｉｅ２、ＥｒｂＢ １および２）、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＡＲＰ、ＣＤ２、Ｃ５ａレセプター、ＣＤ４、ＣＤ２６、ＣＤ３、ＴＧＦ−α、ＮＦ−ｋＢ、ＩＫＫβ、ＳＴＡＴ ６、ニューロキニン−１、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２５Ａ、ＳＨＩＰ−２、ヒトｐ５３、ｂａｘ／ｂｃｌ２、ＩｇＥ／ＩｇＥＲ、ＺＡＰ−７０、ｌｃｋ、ｓｙｋ、ＩＴＫ／ＢＴＫ、ＴＡＣＥ、カテプシンＳ、ＫおよびＦ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ／ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、（ならびにｐ５５ ＴＮＦレセプターおよびｐ７５ ＴＮＦレセプター）、ＣＤ４０Ｌ、ｐ３８マップキナーゼ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、Ｉｌ−１３、ＩＬ−１５、Ｒａｃ ２、ＰＫＣθ、ＩＬ−８，ＴＡＫ−１、ｊｎｋ、ＩＫＫ２およびＩＬ−１８）が挙げられる。

（結合方法）
本発明は、リガンド発見のための新規の方法を提供し、この方法は、「結合」と呼ばれるプロセスによる。潜在的なリガンドは、標的に共有結合されるかまたは「結合」され、続いて同定される。前に示したように、本発明の１つの局面において、本方法は、以下の工程を包含する：
ａ）目的の部位またはその近くに化学的反応性基を含む標的を、化学的反応性基と共有結合を形成し得る化合物と接触させる工程；
ｂ）標的と化合物との間に共有結合を形成し、それによって標的化合物結合体を形成する工程；および
ｃ）標的化合物結合体を同定する工程。

１つの実施形態において、複数の化合物が使用され、その結果、本方法は、以下の工程を包含する：
ａ）目的の部位またはその近くに化学的反応性基を含む標的を得る工程；
ｂ）化学的反応性基に共有結合し得る複数の化合物と標的を合わせ、ここで少なくとも１つの化合物が、標的と共有結合を形成する工程；および
ｃ）標的−化合物結合体において共有結合を形成した化合物を同定する工程。

好ましい実施形態において、標的は、タンパク質であり、化学的反応性基は、その中のシステイン残基上のチオールである。目的の部位が、天然に存在するシステイン残基を含まない場合、標的は、目的の部位またはその近くにシステイン残基を含むように改変され得る。システインは、目的の部位から１０Å以内に位置する場合、好ましくは、目的の部位から５Å以内に位置する場合、目的の部位の近くにあるといわれる。改変のために好ましい残基は、溶媒接近可能である残基である。溶媒接近性は、標準的数値法（Ｌｅｅ，Ｂ．＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５５：３７９−４００（１９７１）；Ｓｈｒａｋｅ，Ａ．＆ Ｒｕｐｌｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））または分析法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））を使用して構造モデルから計算され得る。例えば、潜在的なシステイン改変体は、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓの方法（Ｌｅｅ，Ｂ．＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５５：３７９−４００（１９７１））によって計算される場合に、炭素β（ＣＢ）、または硫黄γ（ＳＧ）の合わせた表面積が、２１Å^２より大きい場合、溶媒接近可能であると考えられる。この値は、Ｃｒｅａｍｅｒらによって記載されるような（Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１６２４５−１６２５０（１９９５））システイン側鎖に接近可能な理論的表面積の約３３％を示す。

また、システインに変異されるべき残基、または他のチオール含むアミノ酸残基は、骨格原子との水素結合に関与しないか、または、せいぜい、ただ１つの水素結合によって骨格と相互作用することが好ましい。側鎖が、他の側鎖と複数の（＞１）水素結合に関与する野生型残基はまた、より好ましくない。全ての標準的な回転異性体（−６０°、６０°、または１８０°のχ１の角度）が、任意の他の残基のＮ原子、ＣＡ原子、Ｃ原子、Ｏ原子、またはＣＢ原子との不利な立体的な接触を導入し得る改変体もまた、より好ましくない。不利な接触は、関与する原子のファンデルワールス半径の合計の８０％未満である原子間距離として規定される。目的の部位が凹状の領域である特定の実施形態において、このような部位の縁（例えば、隆起領域または隣接する凸状領域）で見出される残基が、システイン残基に突然変異するためにより好ましい。凸状および凹状は、表面ベクトルに基づいて計算され得る（Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．Ｓ．＆ Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３：２１９−２２９（１９９３））か、または分子表面に沿って配置される水プローブの接近可能性を決定することによって計算され得る（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：２８１−２９６（１９９１）；Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．，Ｊｒ．＆ Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１４：３８３−４０１（２０００））。Ｌ−アミノ酸に対して名目上禁制である骨格配座（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：９５−９９（１９６３）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｈｎ，Ｖ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８））を保有する残基は、システインに対する改変のためのより好ましくない標的である。禁制の配座は、通常、正の値のφ角を特徴とする。

他の好ましい改変体は、システインへと改変されそして、−Ｃｙｓ−ＳＳＲ^１を含むように結合される場合、Ｒ^１の原子を目的の部位に指向する配座を保有する改変体である。２つの一般的な手順は、これらの好ましい改変体を同定するために使用され得る。第１の手順において、検索は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２３５−２４２（２０００））における単一の構造（Ｈｏｂｏｈｍ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：４０９−４１７（１９９２））から作られ得、位置ｊでジスルフィド結合されたシステインを含む構造フラグメントを同定し、ここで、フラグメントの残基ｊ−１、ｊ、およびｊ＋１の骨格原子は、標的分子の残基ｉ−１、ｉ、およびｉ＋１の骨格原子と、０．７５Å^２未満のＲＭＳＤで、重ね合わせされ得る。（システインに変異された場合に）残基ｉのＣβ原子よりも目的の部位の任意の原子に近い位置ｊにシステインとジスルフィド結合された配置するフラグメントが同定される場合、位置ｉは、好ましいと考えられる。代替の手順では、位置ｉの残基は、計算上、システインに「変異」され、ジスルフィド結合を介してＳ−メチル基でキャップされる。

目的の部位に１つ以上のシステインを付加することに加えて、目的の部位の外側に位置する１つ以上の天然に存在するシステインを欠失する（そして、これらを例えば、アラニンと置換する）ことが望ましくあり得る。１つ以上の天然に存在するシステインが欠失されるか、または「スクラッブ」されたこれらの変異体は、本発明の別の局面を含む。種々の組換え技術、化学技術、合成技術および／または他の技術は、標的を改変するために使用され、その結果、この標的は、結合のために利用可能な所望の数の遊離チオール基を保有する。このような技術としては、例えば、標的ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発が挙げられ、その結果、この核酸配列は、異なる数のシステイン残基を有するポリペプチドをコードする。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（例えば、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号；およびＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９１）を使用する部位特異的変異誘発は、特に好ましい。他の部位特異的変異誘発技術もまた、当該分野において周知であり、そして例えば、以下の刊行物において記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら、上述、第８章；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，ＤＮＡ ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）；Ｂｒａｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６（１９８４）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７），Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ ２：１８３（１９８３）；およびＣａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５［１９８５］）および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５［１９８６］）もまた、使用され得る。

１を超えるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列改変体は、いくつかの方法の１つにおいて生成され得る。アミノ酸が、ポリペプチド鎖において一緒に密接に位置される場合、これらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して、同時に変異され得る。しかし、アミノ酸が、互いからいくらか距離を開けて配置される（例えば、１０を超えるアミノ酸によって分離される）場合、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはより困難である。代わりに、２つの代替的な方法の一方が使用され得る。第１の方法において、別々のオリゴヌクレオチドが、置換される各アミノ酸について生成される。次いで、これらオリゴヌクレオチドが、一本鎖のテンプレートＤＮＡに同時にアニールされ、テンプレートから合成された第２のＤＮＡ鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。代替的方法は、所望の変異体を生成するために２回以上の変異誘発を包含する。

一旦標的−化合物結合体が形成されると、この結合体は、多くの方法を使用して検出され得る。１つの実施形態において、質量分析が使用される。この標的−化合物結合体は、質量分析で直接検出され得るかまたは、この標的化合物結合体は、検出前に断片化され得る。あるいは、この化合物は、質量分析器内で遊離され得、引き続いて同定され得る。以下により詳細に記載されるように、このような容易かつしっかりとした様式での、標的−化合物結合体中の化合物を同定するための質量分析の使用は、本発明の驚くべきかつ予測されなかった発見の１つである。標的−化合物結合体および標的−化合物結合体を含む質量分析器（ＭＳ）のどちらも、本発明の局面を包含する。

ＭＳは、質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づいて分子を検出し、従って、その分子のサイズに基づいて分子を分解し得る（Ｙａｔｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：５−８［２０００］に総説される）。質量分析器は、最初に分子をガス相イオンに転換し、次いで個々のイオンをｍ／ｚ比に基づいて分離し、最後に検出する。質量分析計は、質量分析器の不可欠な部分であり、物理特性（例えば、電場もしくは磁場、または飛行時間［ＴＯＦ］）を使用して、次いでイオン分析器に衝突する（ｓｔｒｉｋｅ）特定のｍ／ｚ値のイオンを分離する。質量分析器は、迅速にデータを作成し得、従って、高スループットの分析のための大きい可能性を有する。質量分析器は、単独でかまたは標的に共有結合されている化合物を検出もしくは同定するための他の手段と組み合わせて使用され得る。質量分析技術のさらなる記載としては、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＳｉｕｚｄａｋ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：７０７−７１５［１９９６］；Ｃｈｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７８２７−７８３５［１９９６］；Ｓｉｕｄｚａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１２９０−１１２９７［１９９４］；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５９９Ｒ−６５１Ｒ［１９９６］；Ｗｕら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：６５３−６５７［１９９７］；およびＬｏｏら，Ａｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：３１９−３２５［１９９６］が挙げられる。

標的−化合物結合体は、他の手段を使用して同定され得る。例えば、反応混合物の成分を分離して共有結合分子を同定する能力を増強するために、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどのような種々のクロマトグラフィー技術を使用し得る。このようなクロマトグラフィー技術は、質量分析器と組み合わせて使用され得るかまたは質量分析器から分離され得る。また上記の技術のいずれかを使用してその同定を容易にするために、遊離された化合物に、（蛍光性に、放射活性に、またはその他で）標識されたプローブをカップリングさせ得る。なお別の実施形態において、新しい結合の形成が、標識プローブを遊離し、次いで、この標識プローブはモニターされ得る。ＥＬＩＳＡまたは酵素アッセイのような単純な機能的アッセイもまた、そのアッセイが測定するのに不可欠な領域で結合が生じる場合に、結合を検出するのに使用され得る。標的分子に結合された有機化合物を同定するための使用を見出し得る他の技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、表面プラズマ共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶学など（これらの全ては、当業者に周知である）が挙げられ得る。

本発明の別の局面において、この標的は、タンパク質であり、そして共有結合もしくは結合は、ジスルフィド結合である。この方法は、以下：
ａ）ジスルフィド結合を形成し得る標的タンパク質とリガンド候補（これもまたジスルフィド結合を形成し得る）とを接触させる工程；
ｂ）標的タンパク質とリガンド候補との間にジスルフィド結合を形成し、それによって標的タンパク質−リガンド結合体を形成する工程；および
ｃ）標的タンパク質−リガンド結合体中に存在するリガンドを同定する工程、
を包含する。

必要に応じて、この標的タンパク質は、還元剤の存在下でリガンド候補と接触される。適切な還元剤の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：システイン、システアミン、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）（「ＴＣＥＰ」）のようなホスフィン、または水素化ホウ素ナトリウム。１つの実施形態において、還元剤は、２−メルカプトエタノールである。別の実施形態において、還元剤は、システアミンである。別の実施形態において、還元剤は、グルタチオンである、別の実施形態において、還元剤は、システインである。

１つの実施形態において、標的タンパク質は、天然に存在するタンパク質配列の一部であるシステイン由来の、天然に存在する−ＳＨ基を保有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、操作された−ＳＨ基を保有し、ここでは、変異原性を使用して、天然に存在するアミノ酸をシステインに変異させた。非ネイティブなシステインを有するこれらの標的タンパク質は、本発明の別の局面を包含する。

別の実施形態では、標的タンパク質は、ジスルフィドの形態にあるマスクされた−ＳＨを所有している。別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールがジスルフィドとしてマスクされているシステインを所有している。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールが別のシステインとジスルフィド結合を形成しているシステインを所有している。別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールがグルタチオンとジスルフィド結合を形成しているシステインを所有している。別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールが、式−ＳＳＲ^１のジスルフィドを形成しているシステインを所有し、ここで、Ｒ^１は、非置換Ｃ_１−Ｃ_１０脂肪族化合物、置換Ｃ_１−Ｃ_１０脂肪族化合物、非置換アリールまたは置換アリールである。別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールが、式−ＳＳＲ^２Ｒ^３のジスルフィドとしてマスクされているシステインを所有し、ここで、Ｒ^２は、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル、そしてＲ^３は、ＮＨ_２、ＯＨ、またはＣＯＯＨである。別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールが、式−ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨのジスルフィドとしてマスクされているシステインを所有している。なお別の実施形態では、標的タンパク質は、チオールが、式−ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２のジスルフィドとしてマスクされているシステインを所有している。

別の実施形態では、リガンド候補は、−ＳＨ基を所有している。別の実施形態では、リガンド候補は、マスクされたチオールを所有している。マスクされたチオール基を備えるリガンド候補は、本発明の別の局面を含む。別の実施形態では、リガンド候補は、式−ＳＳＲ^１のジスルフィドの形態にあるマスクされたチオールを所有し、ここで、Ｒ^１は、非置換Ｃ_１−Ｃ_１０脂肪族化合物、置換Ｃ_１−Ｃ_１０脂肪族化合物、非置換アリールまたは置換アリールである。別の実施形態では、リガンド候補は、式−ＳＳＲ^２Ｒ^３のジスルフィドとしてマスクされているチオールを所有し、ここで、Ｒ^２は、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル（好ましくは、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、または−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）であり、そしてＲ^３は、ＮＨ_２、ＯＨ、またはＣＯＯＨである。別の実施形態では、リガンド候補は、式−ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨのジスルフィドとしてマスクされているチオールを所有している。なお別の実施形態では、リガンド候補は、式−ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２のジスルフィドとしてマスクされたチオールを所有している。リガンド候補の例示の例は以下を含む：

ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して、非置換Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族化合物、置換Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族化合物、非置換アリール、または置換アリールであり；ｍは０、１、または２であり；そしてｎは１または２である。

複数のリガンド候補は、リガンド候補のライブラリーを含む。１つの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５のリガンド候補を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも２０のリガンド候補を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００のリガンド候補を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも５００のリガンド候補を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０００のリガンド候補を含む。別の実施形態では、ライブラリーの各メンバーは、異なる分子量を有する。別の実施形態では、ライブラリーの各メンバーは、少なくとも５原子量単位だけ、ライブラリーの別のメンバーから異なる質量を有している。別の実施形態では、ライブラリーの各メンバーは、少なくとも１０原子量単位だけ、ライブラリーの別のメンバーから異なる質量を有している。

標的がタンパク質であり、そして共有結合がジスルフィドである結合（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）法は、図１に概略的に示される。図１Ａは、チオール含有タンパク質が、複数のリガンド候補（例えば、＞５、＞２０、＞１００、＞５００、＞１０００など）と反応する結合法の１つの実施形態を示す。この実施形態では、リガンド候補は、式−ＳＳＲ^１のジスルフィドの形態にあるマスクされたチオールを所有し、ここで、Ｒ^１は、先に規定された通りである。特定の実施形態では、Ｒ^１は、可能なリガンド候補の可溶性を増大するように選択される。図示されるように、標的に対し固有の結合親和性を所有するリガンド候補が同定され、そしてジスルフィド部分を含まない対応するリガンドが、同定された結合決定基（丸によって示される）を含んで作製される。

図１Ｂは、結合の背後にある理論を概略的に示す。チオール含有タンパク質は、少なくとも１つのジスルフィド含有リガンド候補と平衡であり、そして平衡は、改変タンパク質と非改変タンパク質との間で確立されている。１つの実施形態では、チオール含有タンパク質とリガンド候補とは還元剤の存在下で接触される。別の実施形態では、このチオール含有タンパク質とリガンド候補は、準化学量論量の還元剤の存在下で接触される。リガンド候補が標的タンパク質に対する固有の結合親和性を有さない場合、この平衡は、非改変タンパク質に向かってシフトする。対照的に、リガンド候補が、タンパク質に対する固有の親和性を有する場合、平衡は、改変タンパク質に向かってシフトする。両方の状況を、図１Ｂに示す。第１に、リガンド候補のＲ^Ａ部分は、タンパク質に対する結合親和性をほとんど有さないか、有さない。従って、タンパク質−リガンド結合体の形成は、与えられたタンパク質、リガンド候補、および還元剤の濃度でジスルフィド結合を形成する確率の関数である。第２に、リガンド候補のＲ^Ｂ部分は、タンパク質に対する固有の結合親和性を所有している。結果として、一旦、タンパク質とリガンド候補との間でジスルフィド結合が形成されると、このタンパク質−リガンド結合体は安定化される。従って、この平衡は、タンパク質−リガント結合体の形成に向かってシフトする。

結合をさらに図示するために、この方法は、チミジレートシンターゼ（「ＴＳ」）（生存する実質的に全ての生物に対して必須の酵素）に適用されている。ＴＳは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）およびセリンヒドロキシメチラーゼと共に、生化学機能ユニット、シミジレートシンターゼサイクル（これは、ＲＮＡベースのｄＵＭＰからＤＮＡベースのチミジン５’−モノホスフェート（「ｄＴＭＰ」）の合成のための唯一の新規の経路を提供する）を形成する。ＴＳおよびＤＨＲＦの両方は、抗癌薬物開発のための標的である。ＴＳ遺伝子はまた、多くのウイルス中で見出されるので、抗寄生虫、抗真菌および抗ウイルス剤の開発の標的でもある。

ＴＳは、いくつかの理由から理論的な確証標的である。第１に、種々のＴＳ酵素の多数の高分解能結晶構造は、構造情報が化合物設計に取り込まれ得るように決定されている。第２に、簡単な比色アッセイは、潜在的なリガンドがＴＳに結合するか否かを測定するために存在する。このアッセイは、ｄＵＭＰの存在下で、５，１０−ＣＨ_２−Ｈ_４ホレート対Ｈ_２ホレートの転換の割合に依存する。結合についての第２のアッセイはまた、分光光度的であり、そしてピリドキサール−５’−ホスフェート（「ＰＬＰ」）との競合に依存し、独特のスペクトルサインを有するＴＳと複合体を形成する。

図示の目的のために選択されたＴＳは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＳである。全てのＴＳ酵素と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＳは、結合するために使用され得る活性部位（Ｃｙｓ１４６）中の天然に存在するシステイン残基を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＳは、４つの他のシステインを含むが、これらは、他のＴＳ酵素の間で保存されておらず、そして隠されており、従って、アクセス可能でない。しかし、これらのシステインの１つ以上がジスルフィドに関して反応性であった場合、次いで、これらの酵素の変異体バージョンが使用され得、この変異体バージョンでは、これらのシステインが、別のアミノ酸（例えば、アラニン）へと変異される。

第１の実験において、野生型ＴＳおよびＣ１４６Ｓ変異体（ここで、１４６位でのシステインが、セリンに変異されている）を、シスタミン（Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）と接触させた。野生型ＴＳ酵素は、１当量のシスタミンときれいに反応したが、変異体ＴＳは反応せず、このことは、シスタミンが、Ｃｙｓ−１４６と反応し、そしてＣｙｓ−１４６について選択的であったことを示す。

野生型ＴＳを、リガンド候補の異なるプールを用いていくつかの結合実験に供した。図２は、２つの代表的な結合実験を図示し、ここで、リガンド候補は以下の式

である。

これは、式ＲＳＳＲ^１のリガンド候補の属の特定の実施形態であり、ここで、ＲはＲ^ＣＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２−に対応し、そしてＲ^１は−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２に対応する。これはまた、式ＲＳＳＲ^２Ｒ^３のリガンド候補の属の特定の実施形態であり、ここで、ＲはＲ^ＣＣ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２−に対応し、そしてＲ^２Ｒ^３は一緒になって−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２に対応する。Ｒ^Ｃは、非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、非置換アリールまたは置換アリールであり、そしてライブラリーメンバーのこのプールの間における可変部分である。

図２Ａは、ＴＳに対する結合親和性をわずかに有するかまたは有さない１０の異なるリガンド候補のプールとＴＳとの反応の逆重畳積分マススペクトルである。いかなる結合相互作用も存在しない場合、ＴＳと個々のリガンド候補との間のジスルフィド交換反応における平衡は、未改変の酵素に向かう。これは、以下の式によって概略的に図示される。

予測されるように、非改変酵素に対応するピークは、スペクトルにおける２つの最も顕著なピークのうちの一方である。他方の顕著なピークは、Ｃｙｓ１４６のチオールがシステアミンで改変されたＴＳである。この種は、いずれの個々のライブラリーメンバーについても有意な程度まで形成されないが、そのピークは、ライブラリープールの各メンバーについての平衡反応の累積効果に起因する。その反応が、チオール含有還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）の存在下で行われる場合、活性部位のシステインはまた、その還元剤で改変され得る。システアミンおよび２−メルカプトエタノールは、類似の分子量を有するので、それらそれぞれのジスルフィド結合したＴＳ酵素は、この実験において使用される条件下では区別不能である。その右側にある小さなピークは、別の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）ライブラリーメンバーに対応する。注目すべきことに、これらピークのいずれも、顕著でない。図２Ａは、リガンド候補のいずれも、標的に対する固有の結合親和性を有さないスペクトルに特徴的である。

図２Ｂは、１０の異なるリガンド候補物のプールとのＴＳの反応の逆重畳した質量スペクトルである。ここでそのリガンド候補物のうちの１つは、酵素に対する固有の結合親和性を有する。認められ得るように、最も顕著なピークは、Ｃｙｓ１４６のチオールが、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン化合物で改変されているＴＳに対応するピークである。このピークは、非改変酵素およびＴＳ（Ｃｙｓ１４６のチオールが、システアミンで改変されている）に対応するピークを含む他の全てのピークを小さく見せる。図２Ｂは、結合が所望の部位に対する固有の強い結合親和性を有する部分を捕捉した、質量スペクトルの例である。

結合が還元剤の存在下で起こる場合、このプロセスは、より熱力学的に駆動され、平衡制御される。図３は、この現象の例示であり、漸増濃度の還元剤（２−メルカプトエタノール）の存在下で、選択された化合物Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン化合物を含む同じライブラリープールとＴＳが反応される、３つの実験を示す。

図３Ａは、２−メルカプトエタノールなしで反応が行われる場合の逆重畳した質量スペクトルである。最も顕著なピークは、システアミンで改変されたＴＳに対応する。しかし、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンに対応するピークは、それにもかかわらず、他のリガンド候補物に対して適度に選択される。図３Ｂは、その反応が、０．２ｍＭ ２−メルカプトエタノールの存在下にある場合の逆重畳した質量スペクトルである。対照的に、図３Ａのスペクトルに対して、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンに対応するピークは、最も顕著なピークであり、従って、他のリガンド候補物に対して強く選択される。最後に、図３Ｃは、その反応が、２０ｍＭ ２−メルカプトエタノールの存在下にある場合の逆重畳した質量スペクトルである。驚くべきことではないが、このような強い還元条件下の最も顕著なピークは、非改変酵素である。にもかかわらず、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンに対応するピークは、ライブラリープール中の他のリガンド候補物のピークに対してなお選択される。

図３は、標的に対して固有の親和性を有する特定のリガンド候補物による標的タンパク質中のシステイン改変の程度が、一部、還元剤濃度の関数であるという事実を強調している。一般に、標的タンパク質に対するリガンド候補物の結合親和性が高くなるほど、使用され得る還元剤の濃度は高くなり、さらにより強く選択される。結果として、結合スクリーニングにおいて使用される還元剤の濃度は、結合親和性の代理として、およびリガンド候補物が強く選択されなければならない結合親和性の下限を設定するために使用され得る。

ある局面において、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）ジスルフィド結合を形成し得る標的タンパク質と、やはりジスルフィド結合を形成し得るリガンド候補物とを接触させる工程；
ｂ）この標的タンパク質とリガンド候補物との間でジスルフィド結合を形成して、それにより、標的タンパク質−リガンド結合体を形成する工程；
ｃ）この標的タンパク質−リガンド結合体と、還元剤とを接触させる工程；および
ｄ）この標的タンパク質−リガンド結合体の量を所望の量に減少させるために還元剤の濃度を決定する工程。

次いで、標的タンパク質−リガンド結合体の量を低下させるために必要な還元剤の濃度が、標的タンパク質のリガンド候補物に対する結合親和性についての代理として使用される。

あるいは、この方法は、結合実験を較正するために使用され得る。このような較正の例示は、以下の通りである。第１の結合実験を、複数のリガンド候補物に対して行い、ここで、より強く選択されたリガンド候補物を同定する。あるいは、特定の親和性を有する既知の基質を、例えば、ジスルフィドの付加によって改変する。次いで、この同定されたリガンド候補物（または較正化合物）を使用して、特定の最小結合親和性を有するリガンド候補物のみを選択するために必要な実験条件を較正する。１つの実施形態において、この較正は、還元剤の濃度であり、較正化合物は、一連の結合試験において使用され、ここで還元剤の一定の濃度範囲が使用される。例は、以下の通りであり、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）ジスルフィド結合を形成し得る標的タンパク質と、やはりジスルフィド結合を形成し得る較正化合物とを接触させる工程；
ｂ）この標的タンパク質と較正化合物との間でジスルフィド結合を形成して、それにより、標的タンパク質−較正化合物結合体を形成する工程；
ｃ）この標的タンパク質−較正化合物結合体と、還元剤とを接触させる工程；および
ｄ）この標的タンパク質−リガンド結合体の量を所望の量に減少させるために必要な還元剤の濃度を決定する工程。

一般に、より低濃度の還元剤は、より高い割合の標的が、較正化合物で改変されるという結果を生じ、逆もまた同様である。１つの実施形態において、その所望の量は５０％である。言い換えると、標的タンパク質の約５０％が、非改変形態であり、残りの約５０％が標的タンパク質−較正化合物結合体として存在する。従って、所望の量（この場合は、約５０％）と関連する還元剤の濃度は、リガンド候補物が、選択される結合親和性のいくらか低いレベルを有することが必要な、引き続く結合実験において使用される。結合親和性の所望のより低いレベルに依存して使用され得る他の所望の量の例示としては、約２０％、２５％、３０％、４０％、６０％、７５％などが挙げられる。

以前に述べたように、結合法は、単一のリガンド候補物または複数のリガンド候補物とともに使用され得る。好ましい実施形態において、この結合法は、複数のリガンド候補物（例えば、５、２０、１００、５００、１０００、および＞１０００ですら）をスクリーニングして、スループットおよび効率を最大にするために使用される。図４は、ライブラリープール中のリガンド候補物の数を変化させた実験結果を示す。この実験は、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンが、そのプールが１００のリガンド候補物を含む場合ですら強く選択されることを示すが、より大きな数のリガンド候補物（例えば、約＞５００、＞７５０、＞１０００）を含むライブラリーが、現在慣用的に使用される。

構造−活性関係（「ＳＡＲ」）は、ＳＡＲが、伝統的なアッセイを用いて展開されたのと、まさしく同じ方法にて結合実験からの情報を使用して展開され得る。例えば、以下の模式図の左側にあるＲ^Ｃを有するリガンド候補物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＳに対して強く選択されたが、右側にあるＲ^Ｃを有するリガンド候補物は、選択されなかった。

約１２００の化合物のスクリーニングからのデータに基づいて、フェニル−スルホンアミドコアおよびプロリン環が、必須であることが決定された。例えば、ＴＳが、フェニル環（このフェニル環は、置換されていなくても、メチル、ｔ−ブチル、およびハロゲンを含む一定の群の範囲で置換されてもよい）の周りの可撓性にかなり適応するようであるが、その存在は、選択に必要である。フェニルアラニン、フェニルグリシンまたはピロールで置換された化合物が選択されなかったので、同様に、プロリン環は、必須であるようである。

上記に加えて、さらなる実験を、結合から選択された化合物が、標的に対する結合親和性を有する化合物に対応することを確証するために行った。１つの例示において、結合実験を、既知の基質の存在下で行う。選択されたリガンド候補物が、標的に対して固有の結合親和性を有する場合、基質による置換に抵抗性である。対照的に、固有の結合親和性またはシステアミンを欠くリガンド候補物は、基質によって容易に置換される。別の例示は、結合なしのアナログに対する伝統的酵素アッセイである。例えば、リガンドフラグメントのＲ^Ｃ部分が以下：

の親和性を、ミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｉｏｎ）動力学を使用して決定した。遊離酸１のＫ_ｉは、１．１±０．２５ｍＭであった。注意すべきは、遊離酸が、天然基質ｄＵＭＰと競合したことである。従って、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン１は、ＴＳの弱いが、競合的インヒビターである。

別の実施形態において、活性部位中に天然に存在するシステイン残基を、セリンに変異させ（Ｃ１４６Ｓ）、別のシステインを導入した（Ｌ１４３ＣまたはＨ１４７Ｃ）。Ｃ１４６Ｓ／Ｌ１４３Ｃ変異体を使用した結合は、野生型酵素と類似の結果を生じた。注意すべきは、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンアナログが、強く選択されたことである。対照的に、Ｃ１４６Ｓ／Ｈ１４７Ｃは、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンアナログを選択しなかったが、いくつかの他の分子を選択した。これらの結果は、反応性のシステインを取り囲む局所的な結合環境における差異およびジスルフィドリンカーの幾何的制約を反映すると考えられる。

Ｘ線結晶学を使用して、ネイティブ酵素およびいくつかの複合体の三次元構造を解明して、結合から得られた情報が、標的に対する豊富な結合と相関され得ることを確認した。表１は、結晶学的データおよび細分（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）パラメーターを詳細に示す。１つの複合体は、ＴＳに結合したＮ−トシル−Ｄ−プロリンの遊離酸の複合体である（表１の４番目の記載）。別の複合体は、活性部位のシステイン（Ｃｙｓ−１４６）に結合したＮ−トシル−Ｄ−プロリン誘導体の複合体である（表１の２番目の記載）。なお別の複合体は、Ｃ１４６Ｓ／Ｌ１４３Ｃ変異体に結合したＮ−トシル−Ｄ−プロリン誘導体の複合体である（表１の３番目の記載）。

これは、出発モデルが完全に改良された（ｒｅｆｉｎｅｄ）構造であったので、「真の」遊離Ｒ因子ではない。しかし、反射の遊離Ｒ因子のセットを、上記細分の各々について一定に維持した。
＊１２_１３結晶は、１非対称単位につき１つのモノマーを含む。Ｐ６_３形態は、生物学的に関連したホモダイマーを含む。
^†括弧中の値は、最高の分解能ビン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｉｎ）である。
^＄Ｒ_ｓｙｍ（ｌ）＝Σ_ｈｋｉ｜ｌ_ｈｋｉ（ｌ_ｈｋｉ）｜／Σ_ｈｋｉｌ_ｈｋｉ（ここでｌ_ｈｋｉは、反射_ｈｋｉの強度である）
^§Ｒ_{ｃｒｙｓｔ}＝Σ_ｈｋｉ｜｜Ｆ_ｏｂｓ｜−｜Ｆ_ｃａｌｃ｜｜／｜Ｆ_ｏｂｓ｜（ここでＦ_ｏｂｓおよびＦ_ｃａｌｃは、それぞれ、細分に使用されるデータについての観察および計算された構造因子である）
^¶Ｒ_ｔｒｅｅ＝は、Σ_ｈｋｉ｜｜Ｆ_ｏｂｓ｜−｜Ｆ_ｃａｌｃ｜｜／｜Ｆ_ｏｂｓ｜（ここでＦ_ｏｂｓおよびＦ_ｃａｌｃは、それぞれ、細分から省略されたデータの１０％についての観察および計算された構造因子である）
重大なことには、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン部分の位置は、３つの場合全てにおいて非常に類似している（タンパク質中の全てのＣα炭素について０．１１〜０．５６Åと比較して、０．５５〜１．８８ÅのＲＭＳＤ）。Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン置換基が、きっちりと重複している一方で、アルキル−ジスルフィド結合が異なるシステイン残基に由来するこの部分に集中するという事実は、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン部分（結合ではなく）が、結合決定因子であるという概念を支持する。

見られ得るように、結合は、標的中の目的の部位に結合するリガンドを同定し得る強力な方法である。結合は、単独または他の医薬品化学法と組み合わせて使用され、薬物候補を同定および最適化し得る。

本発明の１局面において、結合は、結合決定因子（例えば、Ｒ^Ｃ）を同定するために使用され、次いで、伝統的な医薬品化学が、その同定された結合決定因子またはそのバリエーションを含むより高い親和性化合物を作製するために使用される。１つの実施形態において、結合は、結合決定因子を同定すること、および化合物がより高い親和性で標的に結合するか否かを評価することの両方のために使用され得る。例えば、結合は、機能的アッセイが利用可能でないか、または人工物の影響を受けやすいかのいずれかである伝統的な結合実験の代わりである。このアプローチは、図５に模式的に例示される。見られ得るように、結合は、結合決定因子Ｒ^Ｄを同定するために使用される。一旦このような結合因子が同定されると、伝統的医薬品化学アプローチが使用されて、改変ライブラリー中のＲ^Ｄの改変体が合成される。リガンド候補物の改変ライブラリーは、Ｒ^Ｄの改変体（例えば、そのアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）およびホモログ）を含む。改変ライブラリーはまた、Ｒ^Ｄまたはその改変体、ならびに隣接する結合領域を利用し得る他の結合決定因子を含む「拡大された」化合物を含み得る。図５は、改変ライブラリーからの選択された化合物を例示し、ここで本来の結合決定因子Ｒ^Ｄは、Ｒ^Ｄ’に改変され、選択された化合物は、第２の結合決定因子Ｒ^Ｅを含む。実施例６は、低μＭ化合物である化合物１の最適化から同定されたＴＳの低μＭ親和性化合物（２および３）の最適化の試みに関するこの方法をさらに例示する。

本発明の別の局面において、実質的にともに結合された２つの結合決定因子を同定するための方法が提供される。一般に、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）標的タンパク質に結合する第１の化合物を同定する工程；
ｂ）この標的タンパク質に結合する第２の化合物を同定する工程；ならびに
ｃ）第１の化合物および第２の化合物を、リンカーエレメントを介して結合して、標的タンパク質に結合する結合体分子を形成する工程。好ましい実施形態において、この結合体分子は、第１の化合物または第２の化合物いずれか単独よりも高い結合親和性で標的タンパク質に結合する。

１つの実施形態において、第１の化合物は、式Ｒ^ＤＳＳＲ^１の化合物であり、第２の化合物は、式Ｒ^ＥＳＳＲ^１の化合物（ここでＲおよびＲ^１は、先に記載された通りであり、Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅは、それぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_２０非置換脂肪族、Ｃ_１〜Ｃ_２０置換脂肪族、非置換アリール、または置換アリールである）であり、第１および第２の化合物は、ジスルフィド結合を介して標的タンパク質に結合する。図６は、この方法の模式的例示であり、ここで２つの別個の結合実験を使用して、結合決定因子Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅを同定する。これらの結合決定因子は、その後、一緒に結合されて、標的タンパク質に結合する結合体分子を形成する。

別の実施形態において、結合決定因子Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅを同定するためのこの結合実験は、同時に起こる。このようにして、この２つの同定された結合決定因子は、重複しない部位において標的タンパク質に結合することが確認される。従って、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）標的タンパク質に結合する第１の化合物を同定する工程；
ｂ）この標的タンパク質に結合した第１の化合物の存在下で、この標的タンパク質に結合する第２の化合物を同定する工程；ならびに
ｃ）この第１の化合物および第２の化合物を、リンカーエレメントを介して結合して、この標的タンパク質に結合する結合体分子を形成する工程。図７は、この方法の模式的例示である。第１の結合実験において、その結合決定因子Ｒ^Ｄが同定される。一旦Ｒ^Ｄが同定されると、第２の反応性システインが導入されるかまたはマスクが外されるかのいずれかであり、結合決定因子Ｒ^Ｅを同定するための結合実験は、結合決定因子Ｒ^Ｄの存在下で起こる。これら２つの結合決定因子Ｒ^ＤおよびＲ^Ｅは、その後結合されて、その標的タンパク質に結合する結合体分子を形成する。

別の実施形態において、第１の化合物は、結合を使用して同定され、第２の化合物は、非結合方法を通じて同定される。１つの実施形態において、この非結合方法は、合理的薬物設計および伝統的な医薬品化学を包含する。ＴＳに結合したＮ−トシル−Ｄ−プロリンの結晶構造により、そのトシル基が、メチレンテトラヒドロ葉酸（ＴＳ酵素の天然の補因子）のベンズアミド部分とほぼ同じ位置および配向にあることが明らかになった。結論として、メチレンテトラヒドロ葉酸のグルタミン酸部分は、化合物１にグラフト化された。表２は、選択された数のこれらの化合物を示す。

Ｌ−エナンチオマー（化合物４）を超えるプロリンのＤ−エナンチオマー（化合物５）についての顕著な選択性が存在し、グルタミン酸残基のα−カルボキシレートは、重要である。なぜなら、αカルボキシレートを除去すること（化合物１２）またはこれを一級アミドに変化させること（化合物１０）は、結合親和性の有意な損失と相関するからである。

本発明の別の局面において、結合方法に対するバリエーションが、化合物を作製し、最適化することにおいて使用するために提供される。一般に、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）共有結合を形成し得る固定基（アンカー基；ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）を有する標的を提供するか、または目的の部位もしくはその部位の近くにある金属を配位結合する工程；
ｂ）この標的と、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）とを接触させ、それにより標的−エクステンダー錯体を形成する工程であって、ここでこのエクステンダーは、共有結合を形成するかまたは金属を配位結合させるかのいずれかである第１の官能基、および共有結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
ｃ）この標的−エクステンダー錯体と、第２の官能基と共有結合を形成し得る基を含む候補配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）とを接触させる工程；
ｄ）この標的−エクステンダー錯体とこの候補配位子との間で共有結合を形成する工程；ならびに
ｅ）この標的−エクステンダー−配位子結合体中に存在する候補配位子を同定する工程。

１つの実施形態において、この標的中の固定基（アンカー基；ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）は、反応性求核基または求電子基であり、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）の第１の官能基と不可逆的な共有結合を形成する。別の実施形態において、標的中の固定基は、反応性求核基または求電子基であり、エクステンダーの第１の官能基と不可逆的な共有結合を形成する。別の実施形態において、標的中の固定基は、金属配位部位であり、固定基は、第１の官能基と一緒になって、金属配位部位を形成する。このような部位に結合し得る適切な金属の例としては、Ｃｄ、Ｈｇ、Ａｓ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｎｉ、ＣｏおよびＣａが挙げられる。別の実施形態において、第２の官能基は、反応性求核基または反応性求電子基である。

好ましい実施形態において、そのエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）は、上記の第１および第２の官能基を含み、そして標的に対する固有の結合親和性を有する結合決定因子を含む。結合決定因子が、既に、第１および第２の官能基を含まない場合、これらを含むように改変され得る。１つの方法において、結合は、結合決定因子Ｒ^Ｃを同定するために使用され、次いで、このＲ^Ｃは、第１および第２の官能基を含むように改変される。別の方法において、この結合決定因子は、標的の既知の基質またはそのフラグメントから得られる。

別の実施形態において、標的中の固定基（アンカー基；ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）は、反応性求核基であり、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）は、求核基と共有結合を形成し得る第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）目的の部位にまたはその近くに反応性求核基を有する標的を提供する工程；および
ｂ）この標的と、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）とを接触させる工程であって、それによって、標的−エクステンダー錯体を形成する工程であって、ここでこのエクステンダーは、標的中の求核基と反応して共有結合を形成する第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
ｃ）この標的−エクステンダー錯体を、ジスルフィド結合を形成し得る配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）候補物と接触させる工程；
ｄ）この標的−エクステンダー錯体とこの配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）候補物との間でジスルフィド結合を形成し、それによって、標的−エクステンダー−配位子結合体を形成する工程；ならびに
ｅ）この標的−エクステンダー−配位子結合体中に存在する配位子候補物を同定する工程。必要に応じて、この標的を、還元剤の存在下で配位子候補物と接触させる。

適切な還元剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：システイン、システアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、ホスフィン（例えば、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）（「ＴＣＥＰ」）、または水素化ホウ素ナトリウム。１つの実施形態において、この還元剤は、２−メルカプトエタノールである。別の実施形態において、この還元剤は、システアミンである。別の実施形態において、この還元剤は、グルタチオンである。別の実施形態において、この還元剤は、システインである。

１つの実施形態において、この標的は、反応性求核基としての−ＯＨを含み、そのエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）は、その標的上の反応性求核基と共有結合を形成し得る第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む。別の実施形態において、この標的上の反応性求核基は、天然に存在するタンパク質配列の一部であるセリン、スレオニン、またはチロシンに由来する−ＯＨである。別の実施形態において、この標的上の反応性求核基は、操作された−ＯＨ基である。ここで、天然に存在するアミノ酸を、セリン、スレオニン、またはチロシンに変異させるために変異誘発を使用する。別の実施形態において、エクステンダーの第１の官能基は、ボロン酸であり、その第２の官能基は、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。マスクされた−ＳＨの例は、式−ＳＳＲ^１（ここでＲ^１は、上記の通りである）のジスルフィドである。

別の実施形態において、この標的は、反応性求核基としての−ＳＨを含み、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）は、この標的上の反応性求核基と共有結合を形成し得る第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む。１つの実施形態において、この標的上の反応性求核基は、天然に存在するタンパク質配列の一部であるシステインに由来する、天然に存在する−ＳＨである。別の実施形態において、この標的上の反応性求核基は、操作された−ＳＨ基である。ここで、天然に存在するアミノ酸をシステインに変異させるために、変異誘発を使用した。

別の実施形態において、この標的タンパク質は、反応性求核基として、ジスルフィドの形態でマスクされた−ＳＨを有する。別の実施形態において、この標的タンパク質は、システインを含み、ここでそのチオールは、ジスルフィドとしてマスクされている。別の実施形態において、この標的タンパク質は、システインを含み、ここで、そのチオールは、別のシステインとのジスルフィド結合としてマスクされる。別の実施形態において、この標的タンパク質は、システインを含み、ここでそのチオールは、グルタチオンとのジスルフィド結合としてマスクされている。別の実施形態において、この標的タンパク質は、システインを含み、ここでそのチオールは、式−ＳＳＲ^１（ここでＲ^１は、上記の通りである）のジスルフィドとしてマスクされている。

１つの実施形態において、エクステンダーの第１および第２の官能基は、各々独立して、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。マスクされたチオールの例は、式−ＳＳＲ^１（ここでＲ^１は、上記の通りである）のジスルフィドである。この実施形態において、標的とエクステンダーとの間で形成される共有結合は、ジスルフィド結合であり、従って、可逆性の共有結合である。この方法の１つのバリエーションにおいて、この標的を、エクステンダーと接触させ、その後に、標的−エクステンダー複合体を、１つ以上の配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）候補物と接触させる。別のバリエーションにおいて、この標的を、エクステンダーおよび１つ以上の配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）候補物を含むプールと接触させる。

別の実施形態において、第１の官能基は、標的を変性させない条件下で、標的の反応性求核基と不可逆性の共有結合を形成し得る基であり、第２の官能基は、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。第１の実施形態において、第１の官能基は、ＳＮ２様付加を受け得る基である。このようなエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）の例としては、（ｉ）例えば、以下のようなα−ハロ酸：

（ｉｉ）例えば、以下のようなフルオロホスホネート：

（ｉｉｉ）例えば、以下のようなエポキシド：

（ｉｖ）例えば、以下のようなアジリジン：

（ｖ）例えば、以下のようなチイラン：

（ｖｉ）例えば、以下のようなハロメチルケトン／アミド：

ここでＲは、非置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、置換Ｃ_１〜Ｃ_２０脂肪族、非置換アリール、および置換アリールであり；Ｒ^’は、Ｈ、−ＳＲ^１であり、ここでＲ^１は、上記に規定されたとおりであり；そしてＸは、脱離基である。例としては、ハロゲン、Ｎ_２、ＯＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ａｒ２、−ＮＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、−ＳＲおよびビニルスルホンが挙げられる。以下に例示されるこれらおよび他の構造において、ボックスは、低分子エクステンダー（ＳＭＥ）内の結合決定因子を示し、すなわち、標的に対する結合親和性を有するＳＭＥの一部を示す。

別の実施形態において、第１の官能基は、ＳＮアリール様付加を受け得る基である。適切な基の例としては、７−ハロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚａｏｌｅ）、および例えば、以下のようなオルト／パラニトロ置換ハロベンゼン：

（ここでＲ^’およびＸは、上記で規定されるとおりである）が挙げられる。

別の実施形態において、第１の官能基は、Ｍｉｃｈａｅｌ型の付加を受け得る基である。適切な基の例としては、電子除去系（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（例えば、カルボニル、イミン、キニン、ＣＮ、ＮＯ_２、および−Ｓ（＝Ｏ）−）に隣接した二重結合または三重結合を含む任意の部分が挙げられる。このようなエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）の例としては、以下が挙げられる：

ここでＲ^’は、上記で規定されたとおりである。

エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ；伸長因子）は、しばしば、特定の標的または標的のファミリーに合わせて作られる。キナーゼ特異的エクステンダーの例としては、以下が挙げられる：

ここでＲ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、およびＲ^ｆは、各々独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキルアミン、およびアリール（ただし、エクステンダー上の少なくとも１つのＲ基は、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプターであり、別のＲ基は、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’から選択される）；およびチオール保護基からなる群より選択され、ここでＲ’は、上記で記載されたとおりである。適切なＭｉｃｈａｅｌアクセプターの例としては、以下が挙げられる：

プロテアーゼ特異的エクステンダーの例としては、以下が挙げられる：

これらのエクステンダー中の第１の官能基は、金属配位部位であり、第２の官能基は、−ＳＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２の形態でマスクされたチオールであるが、−ＳＳＲ^１の形態であり得、ここでＲ^１は、上記で記載されたとおりである。これらのエクステンダーは、亜鉛の存在下でのみセリンプロテアーゼに結合する（Ｋａｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：６０８−１２（１９９８）；ＫａｔｚおよびＬｕｏｎｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：６６９−８４（１９９９）；Ｊａｎｃら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：４７９２−８００（２０００）を参照のこと）。第２の官能基を欠くこの化合物のバージョンは、以下に示されるように、活性部位のヒスチジンおよびセリンを通じて、セリンプロテアーゼの活性部位に結合する。

図８は、エクステンダーを使用する結合方法の１つの実施形態を示す。示されるように、反応性求核基−ＳＨを含む標的は、この反応性求核基と共有結合を形成し得る第１の官能基Ｘおよびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基−ＳＲ^１’（ここでＲ^１’は、上記で規定されるＲ^１と同じである）を含むエクステンダーと接触される。結合−エクステンダー錯体が形成され、次いで、これは、複数の配位子（ｌｉｇａｎｄ；リガンド）候補物と接触される。このエクステンダーは、１つの結合決定因子（丸）を提供し、配位子候補物は、第２の結合決定因子（四角）を提供し、得られた結合決定因子は、一緒に結合して、結合体化合物を形成する。

標的上の反応性基とリガンドとの間、標的と伸長因子との間、標的−伸長因子複合体とリガンドとの間、または２つのリガンド間に、可逆的または非可逆的な共有結合を形成するための合成方法は、当該分野において周知であり、そして基本的な教科書（例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第４版，１９９２）に記載されている。アルデヒドとケトンとアミンとの間の還元的アミノ化は、例えば、Ｍａｒｃｈら（前出），８９８−９００頁に；アミンを調製するための代替の方法は、１２７６頁に；ヒドラゾンおよびヒドラゾン誘導体（例えば、セミカルバゾン）を得るための、アルデヒドとケトンとヒドラジン誘導体との間の反応は、９０４−９０６頁に；アミド結合の形成は、１２７５頁に；尿素の形成は、１２９９頁に；チオカルバメートの形成は、８９２頁に；カルバメートの形成は、１２８０頁に；スルホンアミドの形成は、１２９６頁に；チオエーテルの形成は、１２９７頁に；ジスルフィドの形成は、１２８４頁に；エーテルの形成は、１２８５頁に；エステルの形成は、１２８１頁に；エポキシドの付加は、３６８頁に；アジリジンの付加は、３６８頁に；アセタールおよびケタールの形成は、１２６９頁に；カーボネートの形成は、３９２頁に；デナミン（ｄｅｎａｍｉｎｅ）の形成は、１２６４頁に；アルケンの複分解は、１１４６−１１４８頁に（Ｇｒｕｂｂｓら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：４４６−４５３［１９９５］もまた参照のこと）；アルカンおよびアセチレンとの、アリールハライドおよびスルホネートの、遷移金属で触媒されるカップリング（例えば、Ｈｅｃｋ反応）は、７１７−１７８頁に；アリールハライドおよびスルホネートの、有機金属試薬（例えば、有機ホウ素試薬）との反応は、６６２頁に（Ｍｉｙａｕｒａら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２４５７［１９９５］もまた参照のこと）；有機スズ試薬および有機亜鉛試薬、オキサゾリジンの形成（Ｅｄｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２８：７１１９−７１２２［１９９７］）；チアゾリジンの形成（Ｐａｔｅｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．３６：２２２７−２２３０［１９９５［）；イミドエステルを介するアミンのカップリングによる、アミジン基を介して結合したアミン（Ｄａｖｉｅｓら，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｃ５０：４１６−４２２［１９７２］）などが記載されている。

伸長因子を使用する結合方法をさらに説明するために、この方法を、抗アポトーシス標的カスパーゼ−３（システインアスパルチルプロテアーゼファミリーのメンバー）に適用した。現在、カスパーゼファミリーの約１ダースのメンバーが公知であり、これらの多くが、アポトーシスカスケードの阻害または伝播に関与する。カスパーゼは、過剰または異常なレベルのプログラムされた細胞死を含む、種々の治療適応症（例えば、発作、外傷性脳傷害、脊椎損傷、アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、心臓血管病、肝不全、および敗血症）に対する潜在的な薬物標的である。さらに、カスパーゼ−３は、天然に存在するシステイン残基を、活性部位において含み、そして機能的にと結晶学的にとの両方で、十分に特徴付けられている。

カスパーゼ−３活性部位において使用するために適切な伸長因子を、小さいアスパルチルベースのアリールアシルオキシメチルケトンが、活性部位のシステインと不可逆的に反応することが公知であるという事実を使用して設計した。実施例７〜１０および１４は、５つの代表的な伸長因子の合成を記載する。これらの伸長因子はまた、他のカスパーゼ標的（例えば、カスパーゼ−１およびカスパーゼ−７）との結合実験において使用され得る。より詳細に記載される２つの伸長因子は、化合物１３および１４である。

見られ得るように、化合物１３および１４は、アスパラギン酸部分を、結合決定基として含む。特に、このアスパラギン酸部分のカルボニルはまた、活性部位のシステインのチオールと共有結合を形成する、第一の官能基（アリールアシルオキシメチルケトン部分）の一部でもある。伸長因子１３および１４はまた、第二の官能基（チオエステルの形態でマスクされた−ＳＨであって、これは、適切な時点で脱マスクされ得る）を含む。例えば、このチオエステルは、ヒドロキシルアミンで標的−伸長因子複合体を処理することによって、遊離チオールに転換され得る。

両方の伸長因子は、活性部位のシステインにおいて、カスパーゼ−３を選択的に修飾することを示し、そしてヒドロキシルアミンで処理すると、以下の標的−伸長因子複合体を生成した：

実施例１１は、カスパーゼ−３を伸長因子１３で修飾して、標的−伸長因子複合体１３’を生成することに関する手順を、より詳細に記載する。

標的−伸長因子複合体１３’および１４’を、それぞれ、約１０，０００のリガンド候補物のライブラリーに対する結合方法において使用した。標的−伸長因子複合体１３’を使用する、選択されたリガンド候補物の代表的な例は、以下である：

標的−伸長因子複合体１４’を使用する、選択されたリガンド候補物の代表的な例は、以下である：

特に、リガンド候補物１５は、標的−伸長因子複合体１４’によって選択されず、そしてリガンド候補物１６は、標的−伸長因子複合体１３’によって選択されなかった。選択された化合物の間での構造−活性関係もまた、明らかであった。例えば、リガンド候補物１７：

（これは、ヒドロキシル基を欠くことを除いてリガンド候補物１５と同一である）は、標的−伸長因子複合体１３’または１４’のいずれによっても、選択されなかった。

伸長因子および選択されたリガンド候補物が、どのように標的に結合するかを評価するために、標的−伸長因子リガンド複合体の２つの構造を決定した。一般的な結晶学的手順を、実施例１２にさらに記載する。第一の構造は、標的−伸長因子複合体１３’がリガンド候補物１５と接触された場合に形成される結合体であった。第二の構造は、標的−伸長因子複合体１４’がリガンド候補物１６と接触された場合に形成される結合体であった。表３は、これらの構造についての選択された結晶学的データをまとめる。

特に、両方の伸長因子のアスパラギン酸部分は、公知のテトラペプチド基質におけるアスパルチル残基と、重なり得た。リガンド候補物１５の結合決定基に関して、サリチル酸スルホンアミドは、４つの水素結合を含むタンパク質と、多数の接点を作製する。このサリチル酸部分は、カスパーゼ−３のアスパラギン酸を優先的に認識する酵素のＰ４ポケットを占有する。リガンド候補物１６の結合決定基に関して、このスルホンは、サリチル酸と同じ接点のいくつかを作製する。

伸長因子およびリガンド候補物からの結合決定基がカスパーゼ−３の活性部位との生成的な接点を作製することを考慮して、ジスルフィドがより安定な結合で置き換えられた化合物を設計した。さらに、結合決定基のＳＡＲをプローブするための誘導体を作製した。伸長因子１３およびリガンド候補物１５を含む結合体に関して、標的−伸長因子リガンド結合体は、以下を含む：

この結合体から、以下の部分を含む、強力なカスパーゼ−３インヒビターのクラスが作製された。

最適化とＳＡＲとの両方のために、結合体に基づいて作製された化合物の４つの代表的な例を、表４に記載する。

見られ得るように、２つの硫黄原子を２つのメチレン単位で置き換え、そしてアリールアシルオキシメチルケトン（第一の官能基）を単純なアルデヒドで置き換えた、保存的アプローチを行い、化合物１８（２．８μＭのＫ_ｉを有する、カスパーゼ−３の強力なインヒビター）を得た。ヒドロキシル基を除去して化合物１９を得ることにより、親和性が５分の１に減少し、このことは、結合スクリーンにおいて観察されたＳＡＲを確認した。ヒドロキシル基と酸部分との両方を除去して、化合物２０を得ることにより、結合親和性の全体を消滅させた。モデル化研究は、メチレンリンカーを剛性のアミノベンジル部分で置き換えることによって、アスパルチル基とサリチル酸との間の距離が効果的に架橋され、一方でリンカーのエントロピーコストが低下されることが示唆される。実際に、見られ得るように、化合物２１は、化合物１８より１０倍より大きいＫ_ｉを有する。

同様に、新規なクラスのカスパーゼ−３インヒビターは、伸長因子１４およびリガンド候補物１６を含む、標的−伸長因子リガンド結合体から生じた。

１つの実施形態において、この化合物は、以下の部分を含む：

別の実施形態において、この化合物は、以下の構造の化合物である：

ここで、Ｘは、ＣＨ_２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、であり、そしてＲ^５は、非置換アリールまたは置換アリールである。別の実施形態において、Ｒ^４は、非置換ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。このクラスの化合物の代表的な例は、０．３３μＭのＫ_ｉを有する化合物２２である。

実施例１３および１５〜２１は、伸長因子１３および１４を使用する結合の使用に基づいて合成された、カスパーゼ−３インヒビターのより抜きのもののさらなる詳細を記載する。

本発明のサリチル酸スルホンアミド含有化合物は、さらに価値がある。適切なＰ４結合フラグメントとしてのサリチル酸スルホンアミドの同定は、従来の医科学を使用しては見受けられない。化合物２１を例として使用して、化合物２１のサリチル酸スルホンアミドのないバージョンは、約２８μＭのＫ_ｉで、カスパーゼ−３を阻害する。このフラグメントにサリチル酸スルホンアミドを付加することにより、結合が約２００倍改善され、そして約０．１６μＭのＫ_ｉを有する化合物２１を生じる。対照的に、カスパーゼ−３のＰ１−Ｐ３部位に結合する、公知のトリペプチド（例えば、化合物Ｉ）を出発点として使用する場合、結合親和性は低下する。

見られ得るように、化合物Ｉは、０．０５１μＭのＫ_ｉを有し、そしてサリチル酸スルホンアミド部分をこの化合物に付加することによって、結合親和性の約３００倍の低下を示す化合物ＩＩを生じる。この劇的な低下に起因して、トリペプチドとのＰ４の結合を調査することは、適切なＰ４結合フラグメントとしてサリチル酸スルホンアミドの同定を生じなかった。しかし、Ｐ４への結合に利用可能なこのフラグメントを有する化合物は、強力なインヒビターである。その結果、この例は、従来の方法を使用しては見出されないかもしれない重要なフラグメントを同定するための、結合の力を強調する。カスパーゼ−３の場合において見られるように、これらのフラグメントは、一緒に結合されて、目的の標的の強力なアンタゴニストまたはアゴニストを形成し得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例によって、さらに説明される。

（実施例１）
未改変すなわち「野生型」のＥ．ｃｏｌｉ ＴＳ酵素のいくつかの変異体を作製し、（ＴＳ遺伝子が排除された）Ｅ．ｃｏｌｉ株χ２９１３において過剰発現させ、そして精製した。このχ２９１３株は、チミジン補充を必要とする。なぜなら、（欠失した）ＴＳ遺伝子は、生存のために必須であるからである。第一の変異体は、活性部位のシステインがセリンで置き換えられたものである（Ｃ１４６Ｓと略記される）。第二の変異体および第三の変異体は、Ｃ１４６Ｓ変異に加えて、活性部位に導入された非ネイティブなシステインを含む。第二の変異体は、残基１４３において、ロイシンの代わりにシステインを含み、そしてＣ１４６Ｓ／Ｌ１４３Ｃと示される。第三の変異体は、残基１４７において、ヒスチジンの代わりにシステインを含み、そしてＣ１４６Ｓ／Ｈ１４７Ｃと示される。他の変異体としては、Ｄ１６９Ｃ、Ｗ８３Ｃ、およびＩ７９Ｃが挙げられ、これらでは、活性部位のシステイン（Ｃ１４６）を維持した。

（実施例２）
ジスルフィド含有ライブラリーメンバーを、市販のカルボン酸およびモノ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−保護シスタミン（モノ−ＢＯＣ−シスタミン）から、Ｐａｒｌｏｗおよび共同研究者（Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １：２６６−２６９（１９９５））の方法を適用することによって作製した。簡単には、２６０μｍｏｌの各カルボン酸を、ポリスチレン樹脂上の１３０μｍｏ１当量の４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゾフェノン上に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中の１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（「ＤＩＣ」）を使用して固定した。室温で４時間後、この樹脂をＤＭＦ（２×）、ジクロロメタン（ＤＣＭ、３×）、およびテトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」、１×）でリンスして、未結合の酸およびＤＩＣを除去した。ＴＨＦ中６６μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ保護シスタミンでのアミド形成を介して、この酸を樹脂から切断した。周囲温度で１２時間の反応後、溶媒をエバポレートし、そしてＢＯＣ基を、ＤＣＭ中８０％のトリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を使用して、各ジスルフィドの結合していない半分から除去した。この生成物を、ＨＰＬＣ−ＭＳによって特徴付け、そして実質的に純粋な生成物を、さらなる精製なしで使用した。合計５３０の化合物を、この方法論を使用して作製した。

ライブラリーをまた、モノ−ＢＯＣ−保護シスタミンおよび種々のスルホニルクロリド、イソシアネート、およびイソチオシアネートから構築した。スルホニルクロリドの場合、１０μｍｏｌの各スルホニルクロリドを、ＴＨＦ（２％のジイソプロピルエチルアミンを含む）中１０．５μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ保護シスタミンと、１５ミリグラムのポリ（４−ビニルピリジン）の存在下でカップリングさせた。４８時間後、このポリ（４−ビニルピリジン）を、濾過によって除去し、そしてその溶媒をエバポレートした。ＢＯＣ基を、ＤＣＭ中５０％のＴＦＡを使用して除去した。イソ（チオ）シアネートの場合、１０μｍｏｌの各イソシアネートまたはイソチオシアネートを、ＴＨＦ中１０．５μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ−保護シスタミンとカップリングさせた。周囲温度で１２時間の反応の後、溶媒をエバポレートし、そしてＢＯＣ基を、ＤＣＭ中５０％のＴＦＡを使用して除去した。合計２１２の化合物を、この方法論を使用して作製した。

最後に、オキシムベースのライブラリーを、１０μｍｏｌの特定のアルデヒドまたはケトンを、１：１のメタノール：クロロホルム（２％の酢酸が添加された）中１０．５μｍｏｌのＨＯ（ＣＨ_２）_２ＳＳ（ＣＨ_２）_２ＯＮＨ_２と、周囲温度で１２時間反応させることによって構築し、オキシム生成物を得た。合計４４８の化合物を、この方法論を使用して作製した。

個々のライブラリーメンバーを、アセトニトリルまたはジメチルスルホキシドのいずれかに溶解して、５０ｍＭまたは１００ｍＭの最終濃度にした。次いで、これらの各々のアリコートを８〜１５の別個の化合物の群にプールし、このプールの各メンバーは、独特の分子量を有する。

（実施例３）
Ｎ−トシル−プロリン誘導体を、以下のように合成した。プロリンメチルエステル塩酸塩を、４−（クロロスルホニル）安息香酸および炭酸ナトリウムと、水中で反応させた。この生成物を、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルおよびピリジンと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で反応させることによって、ペンタフルオロフェニルエステルに転換し、そしてフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。次いで、この活性化エステルを、グルタメート（または試験される任意の他のアミノ酸）のメチルエステルで、トリエチルアミンおよびジクロロメタンの存在下で反応させ、この生成物を、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、そしてこのメチルエステルを水中で水酸化リチウムで加水分解した。その最終生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、そして凍結乾燥した。

あるいは、上記手順を、プロリンｔ−ブチルエステルで開始して行った。安息香酸へのアミノエステルのカップリング後、このｔ−ブチルエステルを、ＤＣＭ中５０％のＴＦＡを用いて、スカベンジャーとしてトリエチルシランを用いて除去した。次いで、この遊離酸を、上記のようにペンタフルオロフェニルエステルに転換し、そして適切なアミンと反応させた。このメチルエステルを、水中で水酸化リチウムで加水分解し、そしてその最終生成物を、逆相ＨＰＬＣで精製し、そして凍結乾燥した。

（実施例４）
ジスルフィドライブラリースクリーニングを、以下のように行った。代表的な実験において、８〜１５のジスルフィド含有化合物のライブラリーを含む１μｌのＤＭＳＯ溶液を、４９μｌのタンパク質含有緩衝液に添加した。これらの化合物を、各々が独特の分子量を有するように選択した。理想的には、これらの分子量は、解析が明瞭であるように、少なくとも１０原子量単位（ａｍｕ）異なる。８〜１５のジスルフィド含有化合物のプールを、代表的に、解析の容易さのために使用したが、より大きいプールを使用し得る。タンパク質は、約１５μＭの濃度で存在し、ジスルフィドライブラリーメンバーの各々は、約０．２ｍＭで存在し、従って、全てのジスルフィドライブラリーメンバーの合計濃度は、約２ｍＭである。スクリーニングを、２５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）および１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で行なったが、他の緩衝液および還元剤を使用し得る。これらの反応を、周囲温度で少なくとも３０分間平衡させた。これらの条件は、タンパク質が質量分析系中でイオン化されることの容易さ（以下を参照のこと）、特定のシステインの反応性などに依存して、かなり変動し得る。ＴＳの場合、上記条件で満足であることが見出された。酸素または外来の金属イオンを排除するために、特別の努力を払わなかった；これらの反応の時間スケールにおいて、ジスルフィド交換を容易にするために十分な遊離チオールが存在する。

平衡後、この反応物を、ＨＰ１１００ ＨＰＬＣに注入し、そして質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ＬＣＱ）に取り付けたＣ１８カラムでクロマトグラフィーで分離した。タンパク質から生じる複数に荷電したイオンを、利用可能なソフトウェア（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）を用いて解析し、このタンパク質の質量が現れた。次いで、このタンパク質にジスルフィド結合を介して結合した任意のライブラリーメンバーの同定を、未修飾タンパク質の既知の質量から、観察された質量を減算することによって、容易に決定した。このプロセスは、ライブラリーメンバーの付着が、そのタンパク質自体のイオン化特性を劇的に変化させないことを仮定する。これは、多くの場合において、タンパク質がいずれの所定のライブラリーメンバーよりも少なくとも２０倍大きいという事実に起因して、控えめな仮定である。この仮定を、１つのタンパク質によって選択された低分子が他のタンパク質によって選択されないことを実証することによって、確認した。

（実施例５）
結晶を、非共有結合複合体については１ｍＭの化合物を結晶化緩衝液に含めたことを例外として、Ｐｅｒｒｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：３１５−３３３（１９９０）に以前に記載されたようにして、成長させた。データ収集の前に、結晶を、７０％の飽和（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０％のグリセロール、５０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．０）を含む溶液に移した。非共有結合Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン複合体については、１０ｍＭの化合物を、浸漬溶液に添加した；他の複合体については、１ｍＭの化合物を含めた。回折データを、Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ−３Ｒ発生器およびＲ−ａｘｉｓ−ＩＶ検出器を使用して−１７０℃で収集し、そしてｄ＊ＴＲＥＫを使用して処理した。これらの結晶は、以前に記載された構造（Ｉ２ １３形態についてＰＤＢコード１ＴＪＳ、およびＰ６ ３形態について２ＴＳＣ）と同形であったので、精製を、ＲＥＦＭＡＣ（ＣＣＰ４）を使用する剛体精製によって開始した。このタンパク質モデルを、ＩＮＳＩＧＨＴ−ＩＩ（ＭＳＩ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）において構築した化合物モデルを使用して調整し、そしてＰＲＯＴＩＮ（ＣＣＰ４）辞書を、ＭＡＫＥＤＩＣ（ＣＣＰ４）を使用して作製した。位置因子および個々の等方性温度因子での精製を、示される解像範囲における全ての反射を使用して、ＲＥＦＭＡＣ（ＣＣＰ４）を用いて実施した。溶媒分子を、ＡＲＰＰ（ＣＣＰ４）を使用して自動的に配置し、そして介在する特徴がＦｏ−Ｆｃ差マップに残らなくなるまで、精製を続けた。ＰＤＢ登録番号は、ネイティブのＣ１４６結合Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン、Ｌ１４３Ｃ結合Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン、Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン遊離酸浸漬、グルタメート−Ｎ−トシル−Ｄ−プロリン浸漬、およびグルタメート−Ｎ−トシル−Ｄ−プロリンβ−アラニン結晶についてそれぞれ、１Ｆ４Ｂ、１Ｆ４Ｃ、１Ｆ４Ｄ、１Ｆ４Ｅ、１Ｆ４Ｆ、である。

（実施例６）
選択されたＮ−トシル−Ｄ−プロリン化合物を、結合を使用して、一連のリガンド候補物として最適化および試験した。ＴＳに結合したＮ−トシル−Ｄ−プロリンの結晶構造に基づいて、フェニル環から離れたメチル基は、誘導体化点として使用するための有望な位置にあった。スキーム１は、８８の異なるアルデヒド（ここで、Ｒ^５は、非置換アリールまたは置換アリールから選択される）および６つの異なるリンカーを使用して、誘導体を合成するために使用された一般的方法を説明する。

選択されたリガンド候補物の、結合されていないバージョンの、阻害定数を決定した。最良の化合物のうちの２つは、以下であった：

化合物２のＫ_ｉは、約５５μＭと決定され、そして化合物３のＫ_ｉは、約４０μＭと決定された。

（実施例７）
この実施例は、化合物１３の合成のための１つの実施形態を記載する。一般的な反応スキームは、スキーム２に概説される。

（２−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−コハク酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル２４）
アセチルスルファニル−酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（１．６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）およびＨ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌの乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で混合した。次いで、１．６ｍｌのトリエチルアミン（１１．５ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの反応を、周囲温度で３．５時間進行させた。次いで、有機層を、３×１５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウムで抽出し、合わせた水性画分を、１００ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウムで酸性化し、そして３×３０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。次いで、合わせた有機画分を、３０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、３０ｍｌの５Ｍ
ＮａＣｌでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートして、１．９７ｇの２４をほぼ無色のシロップとして得、これを、さらに精製せずに使用した。ＭＷ＝３０５（実測値３０６、Ｍ＋ｌ）。

（３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−５−クロロ−４−オキソ−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル２５）
遊離酸２４を、１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、０℃に冷却し、そして０．５８ｍｌのＮ−メチル−モルホリン（５．３ｍｍｏｌ）および０．６９ｍｌのイソブチルクロロホルメートで処理した。濃厚な白色沈澱が即座に形成し、そして３０分後、この反応物を、ガラスフリットに通して濾過し、そしてさらに１０ｍｌのＴＨＦを含む新たなフラスコに移した。その一方で、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（２．３ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を、７．４ｍｌの４０％水性ＫＯＨおよび２５ｍｌのジエチルエーテルと４５分間０℃で反応させることによって、ジアゾメタンを調製した。次いで、黄色のエーテル層を、混合無水物を含有する反応物中にデカンテーションし、そして１６５分間かけて周囲温度にゆっくりと温めながら、この反応を進行させた。この反応物を、８℃に冷却し、そして１．５ｍｌのジオキサン中４Ｎ ＨＣｌ（合計６ｍｍｏｌ）を滴下した。これにより、かなりの気泡が生じ、そして黄色の溶液は無色になった。周囲温度に次第に温めながら、この反応を２時間進行させ、次いで、１ｍｌの氷酢酸でクエンチした。その溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、７５ｍｌの酢酸エチルに再溶解し、２×５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム、５０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートし、その後、９０：１０のクロロホルム：酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、０．７４７ｇの２５を淡黄色油状物（２．２ｍｍｏｌ、２３から４２％）として得た。計算値ＭＷ＝３３７．７、実測値３３８（Ｍ＋１）。

（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−オキソ−ブチルエステル２６）
クロロメチルケトン２５（０．２５ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、これに、０．１７ｇの２，６−ジクロロ安息香酸（０．８９ｍｍｏｌ）および０．１０７ｇのＫＦ（１．８４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応を、周囲温度で１９時間進行させ、この時点で、これを７５ｍｌの酢酸エチルで希釈し、２×５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム、５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下で乾燥して、黄色シロップを得、これは、ＨＰＬＣ−ＭＳによって、約７５％の生成物２６および２５％の未反応２５であることがわかった。これを、さらに精製せずに使用した。計算値ＭＷ＝４９２．３７、実測値４９３（Ｍ＋ｌ）。

（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシ−２−オキソ−ブチルエステル１３）
生成物２６を、１０ｍｌの乾燥ＤＣＭに溶解し、０℃に冷却し、そして９ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した。次いで、この反応物を氷浴から取り除き、そして１時間かけて、周囲温度に温めた。溶媒を減圧下で除去し、そしてその残渣を、ＤＣＭへの再溶解およびエバポレーションを２回行って、残留ＴＦＡを除去した。粗製生成物１３を、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製して、１０１．９ｍｇ（０．２３４ｍｍｏｌ、２５から３２％）の白色吸湿性粉末を得た。計算値ＭＷ＝４３６．３７、実測値４３７（Ｍ＋１）。これを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、５０ｍＭのストック溶液を得た。

（実施例８）
ａ．本実施例は、特定の伸長因子（化合物３２（これをカスパーゼ３についての結合実験において用いた））についての１つの実施形態を記載する。一般的なスキームをスキーム３に記載する。

ａ）１２５ｍＬの脱イオン（「ＤＩ」）水中のＫ_２ＣＯ_３（１５．６３ｇ、１１３ｍｍｏｌ）の脱気した溶液に３−メルカプトプロピオン酸（４ｇ、３７．６９ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。次いで、この溶液を０℃まで冷却し、そして無水酢酸（３．５６ｍｌ、３７．６９ｍｍｏｌ）を滴下した。この反応物を、１５分間撹拌し、２×５０ｍＬのＥｔ_２Ｏで洗浄し、そして１ＭのＨＣＬを用いてｐＨ２まで酸性化した。次いで、３×２５ｍＬの酢酸エチル（「ＥｔＯＡｃ」）を用いて水層を抽出した。合わせた有機層を、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して、化合物２７（５．１９ｇ、３５ｍｍｏｌ）、９３％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝１４８（Ｍ＋Ｈ）を得、これを、さらなる精製をせずに用いた。

ｂ）化合物２７（２．３６ｇ、１５．９４ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの無水テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）中に溶解し、そしてピリジン（１．３５ｍＬ、１６．７４ｍｍｏｌ）、引き続きペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２．７１ｍＬ、１５．７８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を、周囲温度で２時間、撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、そして残渣を７５ｍＬのＥｔＯＡｃ中に再溶解し、２×２５ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ、２５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３、２５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物２８（３．７７ｇ、１２ｍｍｏｌ、７５％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３１４（Ｍ＋Ｈ）を得、これをさらなる精製をせずに用いた。

ｃ）化合物２８（３．７７ｇ、１１．９９ｍｍｏｌ）を、Ｈ_２Ｎ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＣＯ_２Ｈ（２．２７ｇ、１１．９９ｍｍｏｌ）と混合し、そして４０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中に懸濁した。次いで、トリエチルアミン（２．９ｍｌ、２０．８ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶液を１６時間撹拌し、その時点で、それに、１００ｍＬのＥｔＯＡｃを注ぎ、２×５０ｍｌの１Ｍ ＮａＨＳＯ_４および５０ｍＬのブラインでリンスし、そして無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して生成物を得、この生成物を、９４：５：１のＣＨＣｌ_３：メタノール：酢酸を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物２９を得た（２．６２ｇ、８．２ｍｍｏｌ、６８％収率、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝２６４（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｄ）化合物２９（２．６２ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶解し、そして０℃まで冷却した。この溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（１．８８ｍＬ、１７．０６ｍｍｏｌ）と引き続くイソブチルクルロホルメート（２．１５ｍＬ、１６．５６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を、さらに２時間撹拌し、そしてこの混合物をろ過した。この溶液を、０℃で、エーテル様ジアゾメタン溶液へと注いだ。濃黄色の溶液を、一晩で室温まで温めた。この濃い橙色の溶液を通して窒素を３０分間バブリングした。この溶液の半分を０℃まで冷却し、そして４ＭのＨＣｌ（３．８ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を滴下し、そしてこの溶液を０℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残渣を５０ｍＬのＥｔＯＡｃ中に再溶解した。有機層を２×２５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３、２５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、そして濃縮し、そして９５：５のＣＨＣｌ_３：ＥｔＯＡｃを用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して化合物３０を得た（０．１９８ｇ、０．５６２ｍｍｏｌ、１４％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝２９６（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｅ）化合物３０（５０ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を１ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中に溶解し、そして２，６−ジクロロ安息香酸（３３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）およびＫＦ（２１ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）の混合物を添加した。この溶液を、周囲温度で１６時間撹拌し、次いで、２０ｍＬのＥｔＯＡｃを注ぎ、２×１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＬのブラインを用いてリンスし、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物３１を得た（４８ｍｇ、０．０９４８ｍｍｏｌ、６７％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝４５１（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｆ）化合物３１を、５ｍＬのジクロロメタン（「ＤＣＭ」）中に溶解し、０℃まで冷却し、５ｍＬのトリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を添加し、そしてこの溶液を３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして粗残渣を、逆相調製ＨＰＬＣにより精製して化合物３２を得た（０．００６ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、１４％）ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝４５０．２９（Ｍ＋１）。

（実施例９）
本実施例は、化合物１４の合成についての１つの実施形態を記載する。一般的な反応スキームを、スキーム４に概説する。

ａ）Ｚ−ＡＳＰ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用いて、実施例８の化合物３０と同様に、化合物３３を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３４４（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｂ）化合物３４を、化合物３０の代わりに化合物３３を用いて開始することを除き、実施例８ｅの手順に従い調製した（８８％）。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝４５４（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｃ）化合物３４（０．５ｇ、０．９ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのＭｅＯＨ中に溶解し、そして０℃まで冷却した。次いで、ＮａＢＨ_４（０．０７４ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を一部添加し、そして反応物を１．５時間撹拌した。この反応物に２５ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを注ぎ、そして３×１０ｍＬのＤＣＭを用いて抽出し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物３５を得た（０．２９７ｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、６０％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝４５６（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｄ）化合物３５（０．２９７ｇ、０．５７９ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＭｅＯＨ中に溶解し、次いで、この溶液を窒素と共に噴霧し、湿潤Ｐｄ／Ｃ（１０％重量／重量、Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１２３ｇ）を添加し、そしてこの溶液を水素で充填したバルーンの下で３０分間撹拌した。次いで、反応物を、セライトを通してろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物３６を得た（０．１８８ｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、８６％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝２９２（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｅ）４０ｍＬのＣＣｌ_４中のメタ−トルエンスルホニルクロリド（６．８ｇ、３５．６７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（６．３５ｇ、３５．６７ｍｍｏｌ）、およびベンゾイルペルオキシド（０．６７０ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）の溶液を、２時間、還流した。室温まで冷却した後、この混合物をろ過し、溶媒を減圧下で除去しそして生成物を９．５：０．５のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるフラッシュクロマトフラフィーにより精製して化合物３７を得た（３．４３ｇ、１２．７ｍｍｏｌ、３６％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝２１３（（Ｍ−）＋Ｈ））。

ｆ）化合物３６（０．１８８ｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そしてジイソプロピルエチルエミン（０．１７３ｍＬ、０．９９４ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、この溶液を２０ｍＬのＤＣＭ中に溶解された化合物３７（０．６７０ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）に滴下した。室温での２０分間の撹拌の後に、ＤＣＭを減圧下で除去し、そして残渣を２０ｍＬのＥｔＯＡｃ中に再溶解し、２×１０ｍＬの１Ｍ ＮａＨＳＯ_４、１０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＬのブラインでリンスし、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して生成物を得、この生成物を４：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して化合物３８を得た（０．０６８ｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、２２％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５５５（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｇ）化合物３８（０．０６８ｇ、０．１１１ｇ）を、１ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、そしてチオ酢酸カリウム（０．０１３ｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を周囲温度で１時間撹拌し、次いで、１０ｍＬのＤＣＭを注ぎ、２×５ｍＬの１Ｍ ＮａＨＳＯ_４、５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３および５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して化合物３９を得た（０．０４４ｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、６６％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５５０（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））。

ｈ）化合物３９（０．０４４ｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そしてＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（０．０４６ｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を、室温で３０分間撹拌し、そして反応物をろ過した。５ｍＬのＤＣＭを添加し、そして溶液を０℃まで冷却し、そして７ｍＬのＴＦＡを添加した。この反応物を、３０分間撹拌し、そして溶媒を、減圧下で除去した。粗残渣を、逆相調製ＨＰＬＣにより精製して化合物１４を得た（０．００５ｇ、０．００８ｍｍｏｌ、１１％）ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５４８．４１（Ｍ＋１）。

（実施例１０）
本実施例は、カスパーゼ３との結合において使用される伸長因子４０の合成についての１つの実施形態を記載し、ここで、チオールが、この酵素のプライム部位に指向される。一般的な反応スキームを、スキーム５に概説する。

Ｃｂｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（７．７７８ｇ、２４．１ｍｍｏｌ）を６５ｍｌのＴＨＦ中に溶解し、氷水浴中で冷却し、そしてＮ−メチル−モルホリン（２．６ｍｌ、２３．６ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（３．１ｍｌ、２３．９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を、氷上で２０分間撹拌し、その間に、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミンヒドロクロリド（３．５１ｇ、３６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（７ｇ、５１ｍｍｏｌ）を２４ｍｌのＴＨＦおよび１ｍｌの水の中に懸濁し、周囲温度で２０分間激しく撹拌し、次いで、ろ紙を通して直接上記のカーボネート溶液へとろ過し、２０ｍｌのＴＨＦを添加した。４０分後、この反応物に２００ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、３×７５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ、７５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、および７５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムを通して乾燥し、ろ過し、エバポレートして無色のシロップを得、このシロップを、さらなる精製をせずに用いた（９ｇ、２４．１ｍｍｏｌ、１００％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３８９（Ｍ＋Ｎａ））。

アミド（８．８ｇ、２４ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、窒素下で氷−ブラインバス中で−５℃まで冷却し、そしてＴＨＦ（１２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）中の１Ｍ水酸化アルミニウムリチウムを１０分の間に添加した。この反応物を、氷上で４０分間攪拌し、次いで７５ｍｌ飽和硫酸水素ナトリウムおよび２５０ｍｌジエチルエーテルを添加し、そして氷上で１５分間攪拌した。エーテル層を除去し、そして硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートして、アルデヒドを得、これをさらなる精製をせずに使用した（８．３ｇ、２４ｍｍｏｌ、１００％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３４８（Ｍ＋Ｎａ＋Ｈ_２Ｏ））。

アルデヒド（８．３ｇ、２４ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（１００ｍｌ）に溶解し、ドライアイス／アセトンバス中で冷却し、そしてＴＨＦ（３０ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）中の１Ｍ臭化ビニルマグネシウムを添加した。１時間後、別の２０ｍｌのグリニャールを添加し、続いて２時間後に別の２０ｍｌのグリニャールを添加した。４時間後、反応物を、周囲温度まで温め、そして９０分間続けた。９０分の時点で、氷−水バス中で冷却し、１００ｍｌの飽和硫酸水素ナトリウムを添加し、水層を排出し、そして有機層を７５ｍｌ １Ｎ ＨＣｌ、７５ｍｌ飽和炭酸水素ナトリウム、および７５ｍｌブラインでリンスし、そして硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして乾燥し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（最初、８０：２０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、次いで７０：３０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いる）を使用したシリカゲル上で精製して、生成物アルコール（２．５ｇ、７．４５ｍｍｏｌ、３１％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３５８（Ｍ＋Ｎａ））を産生した。

アルコール（２．５ｇ、７．４５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（４０ｍｌ）に溶解し、氷−水バス中で冷却し、そしてメタクロロペルオキシ（ｐｅｒｘｏｙ）安息香酸（ｍＣＰＢＡ、１０ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）および別の４０ｍｌ乾燥ＤＣＭで処理した。反応を、１９時間続け、１９時間の時点で７５ｍｌ飽和炭酸水素ナトリウムを別の１００ｍｌ ＤＣＭとともに添加した。水層を排出し、有機層を７５ｍｌ飽和炭酸水素ナトリウム、２×１００ｍｌ ２０％飽和炭酸水素ナトリウム、７５ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレートして乾燥し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（最初、７０：３０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、次いで５０：５０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用する）を使用して精製し、生成物エポキシド（０．８２８ｇ、２．３６ｍｍｏｌ、３２％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３５２（Ｍ＋Ｈ））を得た。

エポキシド（０．１３２ｇ、０．３７６ｍｍｏｌ）を、乾燥メタノール（２ｍｌ）に溶解し、それにチオ尿素（５２．３ｍｇ、０．６８７ｍｍｏｌ）および３ｍｌ追加メタノールを添加する。次いで反応物を散布し、そして２日間窒素下に保つ。次に反応物に５０ｍｌ ＥｔＯＡｃを注ぎ、２×２５ｍｌ １Ｍ亜硫酸水素ナトリウム、２×２５ｍｌ炭酸水素ナトリウム、２５ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、エバポレートして乾燥し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（最初、８０：２０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、次いで７０：３０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用する）により精製し、生成物チイラン（３５ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ、２５％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３９０（Ｍ＋Ｎａ））を得た。

チイラン（３５ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（０．５ｍｌ）に溶解し、そしてＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（４３．３ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加し、続いて別の０．５ｍｌ乾燥ＤＣＭを添加する。３０分後、反応物を７ｍｌ ＤＣＭで希釈し、０．４５μフィルターを通してろ過し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（８０：２０ ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いる）により精製し、生成物（１７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、４９％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３８８（Ｍ＋Ｎａ））を産生した。

チイラン（１７ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（５ｍｌ）に溶解し、氷−水バス中で冷却し、そして５ｍｌトリフルオロ酢酸を用いて処理した。反応を、氷上で４０分間続け、４０分間の時点でエバポレートして乾燥し、そして逆相ＨＰＬＣを使用して精製し、白色固体として化合物４０（１．８ｍｇ、０．００５８ｍｍｏｌ、１３％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｚ＝３３２（Ｍ＋Ｎａ））を産生した。この物質は、ＤＭＳＯ中で安定しないが、−２０℃に維持したメタノール中の溶液としては、１ヶ月間安定である。カスパーゼの活性部位チオールに対するこの伸長因子の共役反応は、２〜５分間のみ、ｐＨ６でおよび酵素に関して低い化学量論（１〜３等量）で行われることが一般的に好ましい。

（実施例１１）
本実施例は、伸長因子１３を用いるカスパーゼ３の改変を説明する。カスパーゼ３を、クローン化し、過剰発現し、そして標準技術を用いて精製する。２ｍｌの０．２ｍｇ／ｍｌ溶液に１０μｌの５０ｍＭ化合物１３を添加し、そして反応を周囲温度で３．５時間続けた。３．５時間の時点での質量分析は、カスパーゼ３大サブユニットの完全な改変を示した（ＭＷ １６８６１、計算値１６８６０）。チオエステルを、ＰＢＳ緩衝液中で緩衝化された０．２ｍｌの０．５Ｍヒドロキシルアミンを添加することにより脱保護し、そして反応を１８時間続けた。１８時間の時点で、大サブユニットは、質量１６８１９（計算値１６８１８）を有した。タンパク質を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ５ ＭＷＣＯユニット中で濃縮し、そして緩衝液をＮａｐ−５カラムを用いて０．１ＭＴＥＳ ｐＨ７．５に交換した。

（実施例１２）
カスパーゼ３の結晶を、２０℃で懸滴拡散蒸着法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて成長させた。等量のタンパク質溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５中の５〜１０ｍｇ／ｍｌの以前に改変したタンパク質）を１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．９、４％グリセロール、１０〜２０％ＰＥＧ６０００および１０ｍＭＤＴＴを含む貯蔵溶液と混合する。小さな斜方形板は、通常１〜２週間後に現れる。斜方形板は、２か月後、約２００×２００×２０μｍの最大サイズに達する。データを集める前に、結晶を２５％グリセロールを含む貯蔵溶液に短時間浸し、次いで液体窒素中で瞬間凍結する。

２つの結合した化合物の回折データを、１００ＫでＲｉｇａｋｕ（Ｔｏｋｙｏ）ＲＵ−３Ｒ発生装置、Ｒ−軸−ＩＶ検出装置を使用して集め、そしてＤ^＊Ｔｒｅｋを用いて処理した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ エントリー１ＣＰ３の座標を使用するプログラムＡｍｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ａ、Ａ５０：１５７〜１６３（１９９４））において実行されるように、分子置換により、構造を解析する。化合物モデルを、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．Ｌ．、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）において構築し、そのモデルをプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．、Ａ４７：１１０〜１１９（１９９１））を用いて調整し、そしてプログラムＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４）を用いて精密化する。

（実施例１３）
本実施例は、化合物５０の合成についての一つの実施形態を説明する。一般的な反応スキームは、スキーム６に概説される。

ａ）５００ｍｌ ＤＩ水中で、３−（クロロスルホニル）安息香酸（１０．３８ｇ、４７．０４ｍｍｏｌ）を、Ｈ−ＡＳＰ（ＯｔＢｕ）−ＯＭｅ（１０．２５ｇ、４２．７６ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１４．０５ｇ、１３３ｍｍｏｌ）と混合し、そして反応物を室温で１６時間攪拌した。溶液をろ過し、次いで１Ｍ ＮａＨＳＯ_４を用いてｐＨ２まで酸性にした。水溶液を３×３００ｍＬ ＥｔＯＡｃで抽出する。次いで、合わせた有機層を２５０ｍＬブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して、化合物４１（７．０７ｇ、１８．２５ｍｍｏｌ、３９％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３３１（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））を産生し、これを、さらなる精製を使用せずに、使用した。

ｂ）化合物４１（７．０７ｇ、１８．２５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で９０ｍｌ乾燥ＴＨＦに懸濁し、そして０℃まで冷却する。イソブチルクロロギ酸（２．４９ｍｌ、１９．１６ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加し、続いてＮ−メチルモルフォリン（２．２１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を０℃で３０分間攪拌し、次いで、１８２ｍＬ ＴＨＦおよび６３ｍＬ ｍＬ ＭｅＯＨ中のホウ化水素ナトリウム（２．４ｇ、６３．８８ｍｍｏｌ）の−７８℃の溶液に注入いだ。反応物を−７８℃で２時間攪拌し、次いで、減圧下でＴＨＦの大部分を除去する。残渣に２００ｍＬ ＥｔＯＡｃを注ぎ、２×７５ｍＬ １Ｍ ＮａＨＳＯ_４、７５ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ_３、および７５ｍｌブラインでリンスし、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去して、白色固体として、化合物４２（６．８０ｇ、１８．２１ｍｍｏｌ、１００％）、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３１７（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））を産生し、これをさらなる精製を使用せずに、使用した。

ｃ）化合物４２（６．８０ｇ、１８．２１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で１００ｍｌ乾燥ＤＣＭに溶解し、そして溶液を０℃まで冷却する。トリエチルアミン（５．３４ｍＬ、３８．３３ｍｍｏｌ）を添加し、次にメタンスホニルクロリド（１．５５ｍＬ、２０．０８ｍｍｏｌ）を滴下する。反応物を０℃で１時間攪拌し、次いで２×３５ｍＬ １Ｍ ＮａＨＳＯ_４、４０ｍＬブラインでリンスし、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３：２ ヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用する）により精製し、化合物４３（６．６９ｇ、１４．８２ｍｍｏｌ、８３％、ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３９５（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ））を産生した。

ｄ）化合物Ａを、以下に示されるように化合物４２（９３％）の代わりにＦｍｏｃ−β−アラニノール（５．１４ｇ、１７．２９ｍｍｏｌ）から出発することを除いて、実施例１３ｃの方法により調製した。

ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３７５（Ｍ＋１）これを、さらなる精製をすることなく使用した。

ｅ）化合物Ｂを、以下に示されるように化合物３８（９１％）の代わりに化合物Ａから出発することを除いて、実施例９ｇの方法により調製した。

ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３５５（Ｍ＋１）これを、さらなる精製をすることなく使用した。

ｆ）化合物Ｂ（５．１２ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬ ＤＣＭ中に溶解し、そして５０ｍＬ ＭｅＯＨを、加えた。窒素を、１５分間、溶液を通じてバブリングし、次いでヒドロキシルアミン（水中に５０％、４．４２ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＣＥＰ（４．１３ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの反応物を、４時間、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで、溶媒を、減圧下で除去し、そして残渣を、１００ｍＬ ＥｔＯＡｃ中で溶解し、５０ｍＬ 飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、そして５０ｍＬ ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、そしてろ過した。溶媒を、減圧下で除去し、そして残渣を、４：１へキサン：ＥｔＯＡｃを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物４４（３．３２ｇ、１０．６ｍｍｏｌ、７４％）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３１３（Ｍ＋１）。

ｇ）化合物４３（２．２９ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬ ＤＭＦ中で溶解し、ヨウ化カリウム（１．６８ｇ、１０．１５ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの混合液を、１５分間、室温で撹拌した。化合物４４（１．５９ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を加え、続いて重炭酸ナトリウム（０．４２６ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、窒素でパージし、そして２０時間、周囲温度で撹拌した。次いで、この反応液に、１００ｍＬ ＥｔＯＡｃを流入し、２×５０ｍＬ １Ｍ ＮａＨＳＯ_４、５０ｍＬ 飽和ＮａＨＣＯ_３、および５０ｍＬ ブラインですすぎ、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して、生成物を得、この生成物をＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ中の２Ｍ ＮＨ_３ ９５：５を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、化合物４５（１．３８ｇ、２．０６ｍｍｏｌ、４１％収率）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝６１２（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｈ）化合物４５（１．３８ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬ ＤＣＭ中に溶解した。次いで、１０ｍＬ ジエチルアミンを、加えた。この反応液を、１６時間、周囲温度で撹拌し、溶媒を、減圧下で除去し、そして残渣を、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ中の２Ｍ ＮＨ_３ ９５：５を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物４６（０．７２３ｇ、１．６２ｍｍｏｌ、７９％収率）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３９０（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）
ｉ）化合物４７を、化合物２７（９７％）の代わりに５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸を用いて出発することを除いて、実施例８ｂの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝３７２（Ｍ＋Ｈ）。

ｊ）化合物４６（０．３２０ｇ、０．７１７ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ ＤＣＭ中に溶解し、化合物４７（０．４０１ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＩＥＡ（０．２４９ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）を加えた。残渣を、１６時間、周囲温度で撹拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。この反応液を、２０ｍＬ ＥｔＯＡｃ中で再溶解し、２×５ｍＬ １Ｍ ＮａＨＳＯ_４、５ｍＬ ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して生成物を得、この生成物をＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ ４：１を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、化合物４８（０．１２６ｇ、０．１９８ｍｍｏｌ、２８％収率）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５７８（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｋ）化合物４８（０．０６２ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を、０．５ｍＬ無水ＴＨＦ中で溶解した。この溶液に、１ｍＬエチルエーテル中のリチウムボロヒドリド（０．００３ｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液を、４５分間、室温で撹拌し、次いで１０ｍＬ ＥｔＯＡｃを流入し、５ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ_３、および５ｍＬ ブラインですすぎ、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を、減圧下で除去して、化合物４９（０．０５８ｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、９８％）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５５０（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｌ）化合物４９（０．０５８ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を、１ｍＬ ＤＭＳＯ中に溶解し、そしてＩＢＸを加えた（０．０８２ｇ、０．２９４ｍｍｏｌ）。この反応液を、５時間、周囲温度で撹拌し、次いで１０ｍＬ ＥｔＯＡｃを注ぎ、５ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ_３、および５ｍＬ ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して黄色固体を得、次いでこの黄色固体を５ｍＬ ＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。５ｍＬのＴＦＡを加え、そしてこの反応液を３０分間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、粗生成物の残渣を、逆相予備ＨＰＬＣによって精製し、化合物５０（０．００９ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１７％）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５４８．６８（Ｍ＋Ｈ）。

（実施例１４）
本実施例は、以下に示される化合物５１の合成のための一実施形態を示す。

化合物５１を、メタ−トルエンスルホニルクロライドをパラ−トルエンスルホニルクロライドで置換することを除いて、実施例９ａ〜ｈの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５４８．４１（Ｍ＋１）。

（実施例１５）
本実施例は、化合物５４の合成のための一実施形態を示す。一般的な反応スキームを、図７中で概説する。

ａ）化合物４８（０．０６３ｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ ＭｅＯＨ中に溶解し、そして過酸化水素（０．０２６ｍＬ、０．２９７ｍｍｏｌ、水中に３０％）を加えた。この反応液を、１６時間、５０℃まで熱し、そして溶媒を、減圧下で除去し、化合物５２（０．０６３ｇ、０．０９７ｍｍｏｌ、９８％）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５９４（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｂ）化合物５３を、化合物４８を化合物５２で置換することを除いて、実施例１３ｋの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５６６（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｃ）化合物５４を、化合物３９（０．００５ｇ、０．００９ｍｍｏｌ、１１％）を化合物５３で置換することを除いて、実施例９ｈの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５６４．６８（Ｍ＋１）。

（実施例１６）
本実施例は、化合物５６の合成のための一実施形態を示す。一般的な反応スキームを、図８中で概説する。

ａ）化合物４８（０．１５０ｇ、０．２３６ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ ＭｅＯＨ中に溶解し、酢酸（５ｍＬ）を加え、続いて過酸化水素（０．７７ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、水中に３５％）を加えた。この反応液を、１６時間、８０℃まで加熱し、そして溶媒を、減圧下で除去し、化合物５５（０．１５７ｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、１００％）を得た。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝６１０（（Ｍ−ｔＢｕ）＋Ｈ）。

ｂ）化合物５６を、化合物５５（０．００５ｇ、０．００８６ｍｍｏｌ、３６％）を用いて出発することを除いて、実施例１３ｋ、続いて実施例９ｈの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ ｍ／ｅ＝５８０（Ｍ＋１）。

（実施例１７）
本実施例は、以下に示される化合物５７の合成のための一実施形態を記載する。

化合物５７を、５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸を４−（メチルスルホニル）安息香酸で置換することを除いて、実施例１３ａ〜ｌの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５４３（Ｍ＋１）。

（実施例１８）
本実施例は、以下に示される化合物５８の合成のための一実施形態を記載する。

化合物５８を、５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸を４−（メチルスルホニル）安息香酸で置換することを除いて、実施例１３ａ〜ｊの手順により調製し、続いて実施例１５ａ〜ｃの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５５９（Ｍ＋１）。

（実施例１９）
本実施例は、以下に示される化合物５９の合成のための一実施形態を記載する。

化合物５９を、５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸を４５−クロロ−６−ヒドロキシニコチン酸で置換することを除いて、実施例１３ａ〜ｊの手順により調製し、続いて実施例１６ａ〜ｂの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５４８（Ｍ＋１）。

（実施例２０）
本実施例は、以下に示される化合物６０の合成のための一実施形態を記載する。

化合物６０を、５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸をベンゾチアゾール−６−カルボン酸で置換することを除いて、実施例１３ａ〜ｌの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５２２（Ｍ＋１）。

（実施例２１）
本実施例は、以下に示される化合物６１の合成のための一実施形態を記載する。

化合物６１を、５−（メタンスルホニル）チオフェン−２−カルボン酸をベンゾチアゾール−６−カルボン酸で置換することを除いて、実施例１３ａ〜ｊの手順により調製し、続いて実施例１５ａ〜ｃの手順により調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ：ｍ／ｅ＝５３８（Ｍ＋１）。

本明細書を通じて引用された全ての参考文献は、本明細書中に参考として明白に援用される。本発明が、その特定の実施形態に対する参照を用いて記載されたが、様々な変化がなされ得、そして等価物が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、置換され得ることは、当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの改変が、特定の状況、物質、物質の組成物、工程などに適合するためにされ得る。全てのこのような改変は、ここに添付の特許請求の範囲内である。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。

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