JP2009095650A - 人工椎体 - Google Patents

Abstract

【課題】自家骨と同等の微細構造（ナノコンポジット構造）と組成および立体構造を持ち、新生血管、骨原性細胞の侵入等の優れた特性をもつ人工椎体を提供する。
【解決手段】ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体からなるブロックにこのようなハバース管およびフォルクマン管状の穿孔を設けた構造を特徴とした人工椎体であり、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の特性とこのような構造によって、移植後に血管と骨原性細胞が人工椎体内部に侵入しやすくし、中心部に海綿骨（骨髄）、側方周囲を皮質骨（ＨＡｐ／Ｃｏｌ）が囲む本来の骨と同等の構造物が作られる。
【選択図】図１

Description

本発明は、人工椎体、特に、脊椎前方固定術に必要とされ、椎体の骨欠損部に充填された後に自己組織化するヒドロキシアパタイトとコラーゲン（ＨＡｐ／Ｃｏｌ）複合体からなる材料を用いた骨髄再生機能を有する人工椎体およびそれを椎体に固定するために好適なポリ乳酸プレートからなる支持体に関する。

従来の技術

一般に、人工素材を骨の欠損部に埋入すると、材料は繊維性の膜で取り込まれ、周囲の組織から隔離される。これは、異物から自己を守る生体防御反応の結果である。しかし、ある種の材料は繊維性の皮膜を作ることなしに周囲の骨と直接結合することができる。その典型的な材料として、水酸化アパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２やリン酸三カルシウムＣａ３（ＰＯ４）２が知られている。

そこで、このようなバイオセラミックスを基本とする有機・無機複合体からなる人工骨材が開発されつつある。例えば、特開平７−１０１７０８号公報には、結晶粒径が０．５μｍ以下のアパタイト粉体とコラーゲンなどの生体高分子有機物とを含有する組成物粉体に５〜４０重量％の水分を含有させ、２００℃以下０℃以上の温度に保って５０ＭＰａ以上の圧力を加えて成型体としたヤング率を２ＧＰａ〜１１０ＭＰａの範囲で調整できる人工骨、人工歯根などのインプラント材が記載されている。

本発明者等は、コラーゲンを含有するリン酸水溶液とカルシウム塩を含有する水溶液とを反応容器に同時に滴下してリン酸カルシウムとコラーゲンの共沈を行った後、得られた沈殿物を加圧成形するする方法によって、骨誘導および骨伝導能を有する生体骨置換型骨再建材などとして好適な曲げ強度、ヤング率、圧縮強度の優れたアパタイトとコラーゲンからなる配向性複合材料を開発した（特開平１１−１９９２０９号公報、Ｊ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，５４：４４５−４５３， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ，４ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）。

また、特開平８−３３６５８４号公報には、粒径２ｎｍ〜０．２μｍのアパタイト結晶粒を３０重量％以上とコラーゲンなどの有機物を含み、径１０μｍ〜２ｍｍの貫通孔が存在している人工骨髄用アパタイト多孔体が記載されている。また、特開平７−８８１７４号公報には、バイオセラミックス材料支持体にｒｈＢＰＭと担体からなる圧縮成形骨形成移植体を形成したものが開示されている。

さらに、従来、骨折部を固定、補助し整復するのに一般的に使用されている金属製の骨接合プレートやビスなどに代えてロッド状、プレート状、スクリュー状、ピン状などの生体内分解吸収性のポリ乳酸からなる溶融成形物や押し出し成型物が開発されている（特開平３−２９６６３号公報、特開平５−１６８６４７号公報）。

椎体の骨欠損部を充填するための移植体はこれまで、主に自家骨採取が行われてきたが、金属製またはセラミック製の人工移植体も種々開発されている。人工移植体を用いる場合は、垂直荷重を受けるため、曲げ強さ、曲げ弾性、圧縮強度などの要件を十分に満たすとともに自家骨に代わる特性を備えていなければならない。

このため、例えば、特開平４−３０３４４４号公報（文献１）には、金属製またはセラミック製の多孔体の間にポリビニールアルコールハイドロゲルからなるブロック体を合体してなる種々のブロック形状の人工椎間板が開示されている。米国特許５７０２４４９号明細書・図面（文献２）には、側壁に多数の孔を有する円筒状金属スリーブからなる荷重支持部材を用いて、その内部にヒドロキシアパタイト／三リン酸カルシウムなどのバイオセラミックを備えた人工椎体が開示されている。

特開平１０−３３６５６号公報（文献３）には、骨伝導能を有する生体吸収性材料であるβ−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）から多孔体と機械的強度を有する緻密体とを形成し、両者を複合させ、緻密体で初期強度を維持させ、多孔体で自家骨置換を進行させる種々のブロック形状の椎体固定部材が開示されている。

特表平１１−５１３５９０号公報（文献４）には、不溶性のバイオポリマー繊維（原繊維コラーゲン）、バインダーおよび固定化リン酸カルシウム無機質（ヒドロキシアパタイト）の結合されたネットワークを含む骨置換のための多孔性で生体内分解性の脊椎固定、骨欠損の補填、骨折修復、歯周欠損移植用マトリックスが開示されており、コラーゲンのリン酸カルシウム無機質に対する重量比を８：２から１：１とするとよいこと、マトリックスをグルタールアルデヒドなどで架橋するとよいこと、さらに骨髄細胞、自家性骨、骨成長因子を含むとよいことなどが記載されている。

特表２０００−５０７４８４号公報（文献５）には、荷重支持部材がバイオセラミックスマトリックスに骨成長成分を含浸させた骨移植片を含む脊柱スペーサが開示されている。

特表２０００−５０８２２１号公報（文献６）には、細孔を有し、２〜４０容量％のヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）および９８〜６０容量％のリン酸三カルシウム（ＴＣｐ）を有する二相リン酸カルシウムセラミックを含有するマトリックス本体とその内部に捕捉された骨成長誘導因子（ＴＧＦ−β，ＢＭＰ，プロスタグランディン他）を含んでなる円柱体状インプラントが開示されており、このセラミックは約２００〜６００μｍの大きさの細孔を有し、多孔度が約６０〜８０％であることなどが記載されている。

特表２０００−５１７２２１号公報（文献７）には、最高３０容積％の気孔率を有し、その気孔が空気で充填されている孔径１００μｍ未満の慣用のセラミック材料からなる角柱又は円筒形の椎間移植体が開示され、その圧縮強さが４００〜６００ＭＰａであること、セラミックス材料がレントゲン線に対して透明であることなどが記載されている。

上記の文献１のものは、ブロックが皮質骨の中に埋め込まれるだけで、骨髄構造体を作らない。文献２のものでは、金属が残存し、本来の骨になり得ない、繰り返すストレスで骨−インプラント界面で破断を来す、ＴＣＰがすぐ吸収されてしまうため、中心部に残ったＨＡだけでは骨伝導性が弱く、インプラント自体が自己崩壊を生じる可能性がある、などの問題がある。

文献３のものは、β−リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）はほとんど強度がないためにこれに緻密体を複合化して強度を補うものにすぎない。文献４のものは、単なるコラーゲンとアパタイトの混合物であり、骨のナノコンポジット構造は持たず、自己組織化も起こらない。さらに、強度が不十分で、骨生成能も乏しい。

文献５のものは、マトリックス自体に骨髄を形成する能力がない。また、自家骨や金属を用いては採骨部の合併症、金属疲労などの従前からの問題点が解決されていない。また、同種骨移植は、エイズ、肝炎感染の危険が伴う。文献６のものは、ＴＣＰ−ＨＡｐの複合からなる多孔体であるが、自己組織化は起こさない。また、インプラント自体が直接ＢＭＰを吸着する担体ではない。文献７のものは、気孔率の大きな多孔体であるが、自家骨への置換は不十分で繰り返すストレスにより破断する恐れがあり、また、骨髄移植片を用いずに、椎体構造を生体に作らせることはできない。

上記のように、これまでに開発された人工椎体は、いずれも、骨髄形成能、自己組織化（骨組織再建）能のある生体吸収材料ではない。そこで、本発明は、自家骨と同等の微細構造（ナノコンポジット構造）と組成および立体構造を持ち、新生血管、骨原性細胞の侵入等の優れた特性をもつ人工椎体の開発を目的とする。

本発明者は、上記の特開平１１−１９９２０９号公報、Ｊ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，５４：４４５−４５３，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ， ４ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００に開示しているように、骨伝導能に優れたＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を先に開発し、この複合体について人工椎体への適用について鋭意研究開発を続け、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体からなり、骨髄再生能を有する人工椎体の立体構造を見いだすとともに、この人工椎体と組み合わせて使用するのに好適な人工椎体固定用の生体内分解吸収性支持体を開発した。

本発明の人工椎体は、術後の早期加重可能な強度を有し、かつ骨伝導能に優れ、細胞分化や増殖能が高く、骨髄形成能、自己組織化（組織再建）能のある生体吸収材料であり、自家骨と同等の優れた特性を発揮するものである。

発明１の人工椎体は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体に、ハバース管状又はフォルクマン管状の穿孔が形成されてなることを特徴とする。

発明２は、発明１の人工椎体において、前記穿孔の直径が、０．４〜０．６ｍｍであることを特徴とする。

発明３は、発明１又は２の人工椎体において、Ｃｏｌ線維方向にＨＡｐ粒子のｃ軸が配向してなることを特徴とする。

本発明の人工椎体は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体からなるブロックにこのようなハバース管およびフォルクマン管状の穿孔を設けた構造を特徴として、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の特性とこのような構造によって、移植後に血管と骨原性細胞が人工椎体内部に侵入しやすくし、中心部に海綿骨（骨髄）、側方周囲を皮質骨（ＨＡｐ／Ｃｏｌ）が囲む本来の骨と同等の構造物が作られる。

ブロックの人体の正面から見て前後方向および左右方向に穿孔された複数のフォルクマン管状の孔は、骨膜から血管が侵入し、骨原性細胞がそれに伴われて入ってくる機能をするものであり、直径は０．４〜０．６ｍｍ程度とする。０．６ｍｍより大きいと、クラックが発生しやすくなる。また、０．４ｍｍより小さいと、新生骨の形成量が少なく、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の自己骨への置換が遅れる。

ブロックの長軸方向に穿孔されたハバース管の孔は、海綿骨から血管が侵入し、骨原性細胞がそれに伴われて入ってくる機能をするものであり、直径は０．４〜０．６ｍｍ程度とする。０．６ｍｍより大きいと、クラックが発生しやすくなる。また、０．４ｍｍより小さいと、新生骨の形成量が少なく、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の自己骨への置換が遅れる。

本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体はその内部にドリルなどで上記のような細い穿孔を開けることが可能な特性を有しており、このような孔を多数あけても人工椎体として必要な十分な曲げ応力、圧縮応力、ヤング率を維持できる。

本発明の人工椎体は、人工椎体が挿入されるように切削した椎骨間にブロックの上下面が椎骨に挟まれるように椎骨を上下に引っ張った状態で挿入する。これにより、上下方向の初期荷重を皮質骨の代わりにＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体だけで受けることができるだけでなく、穿孔された孔に血管、さらに骨原性細胞の侵入を誘導することができる。ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体にｒｈＢＭＰを含浸させると、早期に化骨が形成され、術後の初期強度がさらに向上する。数年経つと、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は穿孔された孔に形成される新生骨（骨髄）から周辺に向かって自家骨へと置換される。

本発明の人工椎体は、以下のような効果を奏する。
１） 移植後に骨髄（穿孔されたハバース管およびフォルクマン管状の孔にできた新生骨）と皮質骨（ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体とこれに含浸させたＢＭＰにより形成された骨）という実際の骨（椎体）と同じ構造をもたらすこと、
２） 皮質骨部分のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、骨形態調整系（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）を形成し、自家骨に置換されること、すなわち自己組織化すること、
３） 他の担体を必要とせず、直接ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体にＢＭＰを吸着させることができること。

上記のとおり、本発明のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合材からなり自己組織化する機能を持つ構造の人工椎体は、骨形態調整系（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）が観察され、同種骨と同等の骨伝導能を持つ生体材料である。また、ＢＭＰ等骨形成因子の追加により、術後より一層の早期荷重により人工椎体全周で骨が形成され、新生骨の骨改変速度が加速される。

これまで、犬、猿のように垂直加重を受ける頚椎へ人工椎体を移植して骨癒合が得られたとの報告はなく、本発明の人工椎体は自家骨に置換し得る生体吸収材料を用いてヒト頚椎固定を行うことができるものであり、椎体の骨欠損の修復手術に多大な貢献をもたらすものである。

これまで、骨形態調整系（ｂｏｎｅ−ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）が観察された人工素材はなく、本発明の人工椎体は、同種骨と同等の骨伝導能を持つ初めての生体材料である。さらに、本発明の人工椎体の固定に用いる本発明のポリ乳酸（ＰＬＬＡ）プレートは、頚椎前方固定に適した力学特性と形態を持つ。

骨は、化学的には「コラーゲンというタンパク質」と「水酸化アパタイトに類似した無機結晶」からできている。その重量比はおよそ３対７である。２つの材料がナノ領域から整列しているのが特徴である。また、大きさは、コラーゲンが３００ｎｍ、アパタイト結晶が５０ｎｍであるため、骨は典型的な有機／無機ナノコンポジットといえる。

骨は骨芽細胞によって再生され、破骨細胞によって吸収される。『細胞と局所空間』骨形成には、広く生体内のカルシウムとリンの代謝が関係している。しかし、局所的にみると骨芽細胞は、まずコラーゲンを合成しそれを細胞外に放出して有機物のスケルトンを作る。ついで、アパタイトの小さい結晶が形成され骨が作られていく。このように、骨は細胞外マトリックスであり、骨芽細胞の周りの局所空間でアパタイトとコラーゲンは自発的に複合化されていく。したがって、骨芽細胞の周囲の局所空間に似た化学環境を再現すれば、アパタイトとコラーゲンは自己組織化的に複合化すると予想される。

本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、水酸化カルシウムの懸濁液とコラーゲンを含んだリン酸水溶液を蒸留水に同時滴下し共沈させ、共沈物を加圧脱水して成形することにより合成されるものである。さらに、共沈と同時または共沈物を成形後にグルタールアルデヒド（ＧＡ）などを用いる化学架橋、その他の熱架橋、紫外線架橋などにより表面架橋することによって初期強度を向上させることができる。

この方法で合成したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、ＨＡｐ結晶がＣｏｌ線維の廻りに複合化しコラーゲン線維のｃ軸方向に配向したナノコンポジットであり、骨類似の構造を持っている。このため、このＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を生体内に移植した場合、自然界の骨と同じような経過をたどって自家骨に置換される。図４は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のＴＥＭ像および電子線回折像である。コラーゲン線維に沿って配列したＨＡｐ結晶が見られる。矢印は電子線回折でＨＡｐ結晶のｃ軸配向を示している。

本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合材は、術後の早期加重可能な圧縮強度を有し、バルク材であっても生体内で荷重下で表面から分解・吸収され、これを処理するためにマクロフアージが動員される。骨内ではマクロフアージが破骨細胞へ分化するとともに、この分解産物が破骨細胞を誘引するとともに破骨細胞が骨芽細胞を誘導し新生骨を形成する骨伝導能に優れている。このように、本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、ハイドロキシアパタイト、ＡＷガラス、乳酸系高分子（ＰＬＬＡ）などとは異なり、生体内で骨そのものに変化する。

未架橋のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体では、材料が破骨細胞様の多核巨細胞に吸収され、ハウシップ吸収窩（Ｈｏｗｓｈｉｐ’ｓ ｌａｃｕｎａｅ）に類似した構造を呈する。その周囲では骨芽細胞が積極的に骨を形成している様子が観察される。このことから、本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、骨再生吸収の代謝（リモデリングサイクル）に組み込まれることにより新生骨を形成すると推察される。

架橋処理は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の生体親和性に負の影響を及ぼさない。架橋処理によりＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の生体吸収時間が延長する。また、架橋の程度が増大することにより細胞活性の減少が認められる。穿孔した孔への組織の侵入に関して、架橋処理は影響することなく良好な骨伝導性を示す。細胞活性の減少は、架橋によりコラゲナーゼ（コラーゲン分解酵素）による分解が進展せず、その結果、細胞による吸収が遅延するためであると考えられる。

また、コラーゲンとハイドロキシアパタイトは、ともにタンパクとの親和性が高く、かつ、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のハイドロキシアパタイトが微結晶であるため、タンパク吸着に有効な面積が、これまでのハイドロキシアパタイトを使用した材料と比較にならないほど大きく、本発明の人工椎体に用いるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、ｒｈＢＰＭ等骨形成因子の担体としても優れている。ｒｈＢＭＰ等骨形成因子の含浸によって人工椎体全周で骨が形成されることにより術後一層の早期荷重が可能であり、生体と早期に一体化するため、本発明の人工椎体を用いれば、治療期間を短縮できる。

本発明のポリ乳酸（ＰＬＬＡ）プレートからなる人工椎体固定用支持体は、ポリ乳酸を溶融し、射出成型により平板を作製し、さらに、この平板を押し出し容器にセットし、容器を加熱し、圧力を掛けることでダイスから押し出すことにより製造することができる。

本発明の人工椎体の支持固定に使用する本発明のＰＬＬＡプレートは、生体内に埋め込み後少なくとも２４週までそのままの形で残存する。ＰＬＬＡプレートが生体内で分解、吸収されるときに周囲のｐＨが酸性に傾いて細胞を傷害することを避けるには、プレートが徐々に分解される必要があるが、本発明のＰＬＬＡプレートはこの観点からも好ましい材料である。

また、本発明のＰＬＬＡプレートは移植後に生じ得る人工椎体の脱転を予防するために十分な強度を持ち、人工椎体を移植床の骨へ強固に接合する。特に、ヒトのように垂直加重を受ける頚椎の前方固定では、頚椎へ移植された人工椎体を支持するために使用するプレートは高強度を要求されるが、本発明のＰＬＬＡプレートはそれに十分耐え得るものであり、同時に吸収期間を製造条件によってコントロールできる点で金属プレートよりも優れている。

本発明の人工椎体を皮下に移植すると、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の表面は貪食細胞の浸潤により分節化し、これは、移植後２４週を経過しても続いている。このような貪食細胞の浸潤はコラーゲンスポンジやコラーゲン膜（ｃｏｌｌａｇｅｎｓｐｏｎｇｅ，ｍｅｍｂｒａｎｅ）移植後に生じる反応と同じものと考えられる。この反応は、顆粒球が動員されず、リンパ球も出現しない点で拒絶反応とは異なっている。

犬橈・尺骨に穿孔した骨孔へペグ（ｐｅｇ）を挿入した実験によれば、骨孔に移植したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のＨＥ標本は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体が骨と直接結合し得ることを示唆している。また、ビラヌーバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）染色標本でＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体と新生骨の境界部に観察された移行帯は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の表面にＨＡｐが沈着した部位と考えられる。

さらに、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の表面に形成されたハウシップ吸収窩（Ｈｏｗｓｈｉｐ’ｓ ｌａｃｕｎａｅ）様構造内に破骨細胞が出現し、また、新生骨との境界領域に骨芽細胞が配列することを酵素組織化学で示すことができたことから、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は骨原性細胞を誘導し、骨形態調整系（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）を形成する、優れた生体材料であることが示唆される。

本発明の人工椎体の材料であるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、水酸化カルシウムの懸濁液とコラーゲンを含んだリン酸水溶液を用意し、この二つの溶液を、蒸留水の入った反応容器中にチューブポンプで同時に滴下し共沈させることにより合成する。次に、共沈物をフィルターで濾過・洗浄する。この段階で、含水率は５％〜５０％程度であり、これを冷間静水圧成形（ＣＩＰ）法により好ましくはｐＨ８，温度４０℃の温度範囲で２００ＭＰａにて加圧脱水する。これによりサブミクロンのオーダーの気孔径を有し、含水率に応じて気孔率１０％〜６８％程度のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体が得られる。

得られるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のＨＡｐの一次粒子径（結晶子サイズに略等しい）は約５０ｎｍであり、また、二次次粒子径（複合体になった状態で、繊維状になったもの）の平均サイズは最大２０μｍ程度の長さと０．５〜１μｍ程度の幅を持っている。複合体の三点曲げ強度は３８〜４５ＭＰａ程度、ヤング率は２〜３ＧＰａ程度とすることができる。生体骨のヤング率は部位によって異なり４〜３０ＧＰａの範囲で分布している。ヤング率は理想的には骨に近似すべきである。他のセラミックスはヤング率が非常に大きいため脆くて破断をきたすが、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は軟らかい生体骨から硬い生体骨と同程度のヤング率のものまで容易に製作することができる。ヤング率が大きいと脆く、小さいと軟らかくなる。

ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の合成の際、共沈と同時にコラーゲンに架橋を導入する方法として化学架橋を行う場合は、次の方法が好ましい。なお、架橋方法は、化学架橋に限らず、熱架橋、紫外線架橋などでもよい。グルタールアルデヒド（ＧＡ）による架橋の場合は、まず、予め、Ｃａ（ＯＨ）２懸濁液側にＧＡを添加する（コラーゲンに対して１ｗｔ％濃度）。ＧＡを加えることにより試料は黄色化する。同時滴下法においては、コラーゲンとアパタイトとの自己組織化の安定構造が成立する以前に、コラーゲンに対してＧＡによる架橋反応が生じる。

すなわち、架橋点であるコラーゲン中のリジン残基とＧＡとの反応が優先されることにより、自己組織化構造の形成が阻害されると推察される。ＧＡを添加しない場合は、脱灰処理したコラーゲンがリン酸水溶液中で分散する現象が認められる。ＧＡを添加した場合は、脱灰後のコラーゲンはリン酸および塩酸水溶液中でも分散せず凝集状態を呈する。このことから、ＧＡの添加により複合体中のコラーゲンに架橋が導入され、これが試料の着色を惹起する要因であると推察される。

ＧＡを添加して合成したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のナノ構造の透過型電子顕微鏡像によると、巨視的には繊維状構造が確認されるが、微視的にはアパタイトとコラーゲンの複合化した短繊維がランダムに繋がり膜状構造を形成している。このことから、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の自己組織化が生じ易い条件においても、架橋処理はコラーゲン線維上へのアパタイト結晶の自己組織化構造の形成を抑制することが明らかである。

ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体中の水とコラーゲンの量は熱分析により求める。架橋処理したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の曲げ強度は最大６０ＭＰａであり、架橋処理によって曲げ強度が向上する。ＧＡによる架橋処理により、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の完全乾燥による強度劣化、および水中におけるＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体表面の短時間での膨潤といった材料としての欠点が改善されることから、材料の安定性が高まり、手術時の人工椎体の操作性が向上する。

また、荷重部位に人工椎体を移植するため、早期の骨形成が要求される場合は、ｒｈＢＰＭ−２を含浸する方法が有効であり、その場合は、４００μｇ／ｍｌ以上の濃度が好ましい。

ヒト用人工椎体の形態は、例えば、人体の正面から見て長軸と直交方向断面が馬蹄形で、前方が彎曲したブロックの形態とする。錐体内に挿入される部分は骨との接触面積を増加させるために角柱状の平面とする事が望ましい。そのためには、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体をコンピュータ制御ボール盤を用いて図１に示すように、成型加工すればよい。幅Ｗ１は１５ｍｍ程度、奥行きＤは１０ｍｍ程度とし、長さＬ１は１０〜４０ｍｍの範囲で５ｍｍおきのものを製作する。

次に、長軸方向に直径０．５ｍｍ程度のハバース管状の穿孔された孔をドリルなどで開ける。断面で等間隔の孔を図１に示すように複数配列する。また、ブロックの前後方向および左右方向にも直径０．５ｍｍ程度のフォルクマン管状の穿孔された孔をドリルなどで開ける。複合体の強度に応じて孔の個数は多いほど望ましい。

ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）を射出成型しただけの平板の機械的特性は、通常、曲げ強度７７ＭＰａ、曲げ弾性率３．３Ｇｐａ、引張強度６７ＭＰａ程度である。公表されている皮質骨の曲げ強度は１００〜２００ＭＰａであり、生体内での加水分解による強度低下を考えると射出成型したＰＬＬＡプレートは人工椎体固定用の支持体としての機械的強度は十分でない。

射出成形した成型品を圧延により延伸加工することにより強度改善が見られるが、延伸倍率を上げることで成型品の径が細くなり、最終製品の加工が困難となる。射出成型した平板を、さらに押し出し成型し分子を一軸方向に配向結晶化させることにより、曲げ強度１８０ＭＰａ、曲げ弾性率６Ｇｐａ程度となり、約２倍に向上させることができる。なお、曲げ強度の試験はＪＩＳＫ−７１７１７による。ＰＬＬＡプレートには、椎体にねじ込むスクリューが緩んで抜けてこないように、４隅に穿孔するスクリュー挿入穴の方向を斜め向きに開けることが好ましい。

実験例１ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の製造例１９９．１ｍｍｏｌの水酸化カルシウムを２ｄｍ３ の蒸留水に加えて攪拌し、均一な懸濁液を維持した。また、豚皮膚由来のアテロコラーゲン５ｇを含んだ５９．７ｍＭのリン酸水溶液を作製した。この二つの溶液を、蒸留水１ｄｍ３ の入った反応容器中にチューブポンプで同時に滴下した。この時、反応容器内をｐＨコントローラーでｐＨ８に制御した。また、反応容器をウオーターバス中に入れ温度を４０℃に制御した。沈澱物をガラスフィルターで濾過・洗浄後、ＣＩＰ法により２００ＭＰａで１５時間加圧脱水することによりＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロックを作製した。

ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロックは、水分約１０％、気孔率約２０％で、ＨＡｐとコラーゲンの重量比は、８０／２０（ｗｔ％）であった。これを蒸留水に拡散後、コロジオン膜を張ったマイクログリッド上にすくいとり、透過型電顕（ＴＥＭ）標本を作製した。電顕観察後、電子線回折を行った。合成時のｐＨと温度を制御することで、ＨＡｐがコラーゲン線維の廻りに、数μｍから１０μｍの長さまでコラーゲン線維方向にｃ軸が配向した、骨とよく似たナノコンポジットとなっていた。

ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を２０×５×３ｍｍ３のブロック に切り出し、クロスヘッドスピード０．５ｍｍ／ｍｉｎ、スパン１５ｍｍで三点曲げ試験を行った。この結果、三点曲げ強度：３９．５±０．８８ＭＰａ、ヤング率：２．５±０．３８ＧＰａであった。

実験例１（ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の生体適合性試験）
上記の製造例によって作製したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を４×４×１ｍｍ３ のブロックに採型し、１５匹のウイスターラット背部に移植した。移植後２，４，８，１２，２４週でブロックを採取した。各試料は中央で半割し、一方をトルイジンブルー光顕標本とＴＥＭ標本に、他方を走査型電顕（ＳＥＭ）標本にした。移植後２〜４週のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロック周囲には、多数の丸い核を持った細胞が浸潤していた。

４週後、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロック表面は分節化し、生じたクラックには線維組織が侵入していた。ＴＥＭ観察により、これらの細胞はＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロックのｄｅｂｒｉｓを貪食している貪食細胞であることが確認された。ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロック周囲の線維芽細胞は少数であった。１２週後にはＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロック周囲に多数の新生血管が形成されていた。ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体ブロックは２４週後もブロックとして残存し、貪食細胞数は移植後早期に比して減少したものの、依然として観察された。

実験２（ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の骨伝導能評価）
ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体からなるペグ（ｐｅｇ）と呼ばれる弾丸状ブロック（５×５×１０ｍｍ３ ）の各面にφ０．５ｍｍのドリル孔を４個ずつ穿ち、０μｇ／ｍｌ，２００μｇ／ｍｌ，４００μｇ／ｍｌの−２溶液に浸漬し、１５分間、陰圧ポンプで脱気して、溶液を完全に含浸させた。これらｒｈＢＭＰの含浸量の異なる３種類のブロックを、５頭のビーグル犬を用いて両側の橈骨、あるいは尺骨に移植した。橈骨、尺骨にはφ６ｍｍの骨孔を３個等間隔でドリルで穿った。もう１頭の橈骨、尺骨には３個のドリル孔のみを穿ち比較例とした。

比較例を含む３頭は、術後１２週まで１週毎にレントゲン撮影を行い、ブロックが骨と癒合するのに要する期間を比較した。また、移植後８週で２頭から、１２週で比較例を含む４頭からブロックを採取し、１）脱灰ＨＥ標本、２）ＡＬＰ，ＴＲＡＰ酵素組織化学、３）非脱灰ビラヌーバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）標本を作製した。さらに、１２週で作製したＨＥ標本の光顕写真を撮影し、マッキントッシュ用コンピュータソフト（ＮＩＨ ｉｍａｇｅ）によりドリル孔内に形成された新生骨の占有率（％ｂｏｎｅ ａｒｅａ）を計測した。また、複合体表面に形成された新生骨の厚さを３点で計測し、平均値を求めた。

ｒｈＢＭＰを使用した群では、移植後２週までに全例で仮骨が形成された。ｒｈＢＭＰを用いない群では仮骨形成に乏しかったが、移植後４週には全ての群で仮骨形成が観察された。ペグ−骨境界部の透亮像が消失し、陰影が均質化した時点でＸ−Ｐ上骨癒合が得られたと判定した。４００μｇ／ｍｌ群が０μｇ／ｍｌ群より有意に早く骨癒合が得られた。移植後８週で複合体は第２次骨単位（Ｈａｖｅｒｓｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ）を持つ新生骨と直接結合しており、未石灰化領域が散在していた。

複合体の表面には吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）様の構造が形成され、複合体上に多核巨細胞が観察された。複合体−骨境界部には紡錘形の細胞が配列していた。ビラヌーバ染色により、新生骨−複合体間に移行帯の存在が示された。この移行帯の新生骨側に細胞が多数存在した。

ＡＬＰ染色で紡錘形細胞が陽性に染まり、これらの細胞は骨芽細胞であることが示唆された。また、ＴＲＡＰ染色で第２次骨単位（Ｈａｖｅｒｓｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ）に存在する吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）中の巨細胞だけでなく、移行帯に形成された吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）様構造中の巨細胞も陽性に染まり、これらの細胞は破骨細胞であることが示唆された。％骨占有率（ｂｏｎｅ ａｒｅａ）は有意差がなかった。しかし、複合体表面には、ＢＭＰ：４００μｇ／ｍｌ群がＢＭＰ：０μｇ／ｍｌ群よりも有意に厚く新生骨が形成されていた。

ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、ＨＡｐ結晶がコラーゲン線維のｃ軸方向に配向し、骨類似の構造を持っていた。皮下に移植されたＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は、分節化し、これを貪食するためマクロファージが浸潤した。一方、骨孔に移植したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体のＨＥ標本は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体が骨と直接結合し得ることを示唆している。ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体の表面に形成されたハウシップ吸収窩（Ｈｏｗｓｈｉｐ’ｓ ｌａｃｕｎａｅ）様構造内に破骨細胞が出現し、また、新生骨との境界領域に骨芽細胞が配列することを酵素組織化学で示すことができた。

骨孔にＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を移植した実験では、４００μｇ／ｍｌ群が０μｇ／ｍｌ群に比べて骨癒合に要する期間は有意に短く、また、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体表面に新生骨が有意に厚く形成されていた。％骨占有率（ｂｏｎｅ ａｒｅａ）も４００μｇ／ｍｌ群が他群より大きい傾向を示している。しかし、０μｇ／ｍｌ群と２００μｇ／ｍｌ群の間にはこれらいずれにおいても有意差はなかった。

実験３（荷重部位移植におけるＢＭＰ含浸の影響の評価）
ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体から採型した長管状骨の骨欠損部充填用インプラントを荷重部位に移植する場合、ＢＭＰ含浸の有無が骨界面の結合、骨伝導・誘導に及ぼす影響を比較検討した。製造例１で製作したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体にグルタールアルデヒドによる表面架橋処理を行い、脛骨用インプラントを作製した。架橋数を増やし、コラーゲンの配向性を改善して三点曲げ強度を６０ＭＰａに向上させたＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体でインプラントを作製した。

図５に示すように、直径Ｗ１＝１５ｍｍ、奥行きＤ＝１０ｍｍ、長さＬ１＝２０ｍｍの円柱状インプラントＩの長軸方向中央に直径ｄ１＝３ｍｍのドリル孔Ｈ１を１個、周囲に放射状配列する直径ｄ２＝１ｍｍのドリル孔Ｈ２を８個穿った。インプラントＩの側方にも直径ｄ３＝１ｍｍのドリル孔を１２個穿った。これをビーグル犬３頭の右脛骨に移植した。また、ＢＭＰ：４００μｇ／ｍｌを陰圧下に含浸させたインプラントをビーグル犬２項の右脛骨に移植した。インプラント周囲の骨膜は完全に切除してイリザロフ式創外固定器を用いて固定した。

１２週後ＢＭＰ（＋）群、（−）群各１頭ずつより試料を採取した。ＢＭＰ（＋）群の２頭は１２週で創外固定器を除去後に全加重させて２４週で試料を採取した。ＢＭＰ（−）群は創外固定下に加重させ、術後１８、２４週で試料を採取した。術後Ｘ−Ｐを撮影し、骨形成・癒合状態を判定した。また、移植前と採取時にＤＥＸＡ法で骨密度を計測して、インプラント周囲の骨形成量を比較した。採取した試料より脱灰ＨＥ標本と、ビラヌーバ染色標本を作製し、インプラント−骨境界部における骨との結合状態を観察するとともにインプラント内部のドリル孔内に形成された骨量を測定した。

ＢＭＤの平均値は、移植前２．５９６±０．０９９ｇ／ｃｍ２、ＢＭＰ（−）群の１２週が２．５５１ｇ／ｃｍ２、ＢＭＰ（＋）群の１２週が２．５６６ｇ／ｃｍ２、ＢＭＰ（−）群の２４週が２．３３５ｇ／ｃｍ２、ＢＭＰ（＋）群の２４週が２．１８６ｇ／ｃｍ２だった。

ＢＭＰ（−）群は、Ｘ−Ｐ上、インプラント周囲の仮骨形成に乏しかったが、１２週までにはインプラント−骨境界部で骨癒合が得られた。割断標本でも１２週でインプラント−骨境界部は完全に癒合していた。しかし、インプラント中央部ではＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体が分節化して骨形成が認められるものと、移植時の形状がほとんどそのまま残存しているものがあった。ＨＥ、ビラヌーバ染色標本でＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は新生骨と直接結合していた。インプラント内部まで吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）様構造が形成されていた。

インプラント−骨境界部に形成された吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）では多核巨細胞が複合体表面に観察され、また、紡錘型の細胞が骨表面に配列していた。これは、複合体を破骨細胞が吸収し骨芽細胞が新生骨を付加する、骨形態調整系（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）類似の骨接合形式をＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体がとることを示している。部位によっては軟骨細胞柱が形成され、内軟骨性骨化と考えられる骨形成様式も観察された。

ＢＭＰ（＋）群は、Ｘ−Ｐ上、インプラント全周を包みこむように仮骨が形成された。１２週後、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は完全に骨癒合し、骨髄腔も形成された。ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は皮質骨の外側に島状に残存した。２４週経過すると外化骨はむしろ減少し、皮質骨部分の硬化像が増強して、新生骨の成熟化が観察された。

割断標本でも、分節化したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体が皮質骨内で島状に残存し、２４週後にはインプラント全周だけでなく、内部にまで成熟骨が形成された。その中心部には骨髄腔様構造が観察された。組織標本で、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体は骨と直接結合することが確認された。軟骨細胞柱の形成は一部に認められるにすぎなかった。

実験例４（犬頚椎への移植）
製造例１で製作したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を５×５×１０ｍｍ３のブロックに採型した。未架橋の人工椎体に０μｇ／ｍｌ，４００μｇ／ｍｌ（以下、順に０μｇ／ｍｌ群、４００μｇ／ｍｌ群という）のＢＭＰを陰圧下に含浸させた。人工椎体の脱転予防に用いるＰＬＬＡプレートはチタン製スクリューで固定した。プレートの遠位と近位に１個ずつドリル孔を穿ち、スクリューを斜め方向に挿入した。０μｇ／ｍｌ群８頭、４００μｇ／ｍｌ群３頭のビーグル犬に人工椎体を移植した。

ビーグル犬の頚椎を前方より展開し、Ｃ３／４あるいはＣ４／５間にドリルで人工椎体よりやや大きめの骨溝を掘り、１椎間２椎体固定を行った。椎体前方の骨膜は完全に剥離した。移植後に実験１と同様にＸ−Ｐ写真と組織所見により術後成績を評価した。移植後１２，１６，２４週で０μｇ／ｍｌ群は４，２，２頭から、また、４００μｇ／ｍｌ群は１頭ずつから試料を採取した。術後、１ケ月毎にＸ−Ｐ撮影を行ない、人工椎体周囲の骨形成・癒合状態を評価した。採取した試料は、組織学的評価を行った。

その結果、ＢＭＰ：０μｇ／ｍｌ群では仮骨形成に乏しかったが、１２週までには人工椎体−骨境界部の骨癒合が得られた。Ｂｍｐ：４００μｇ／ｍｌ群では仮骨形成が顕著で術後２週より人工椎体前方に仮骨が出現し、移植後１２週以降では人工椎体前方に厚い新生骨が形成されていた。

割断標本では、ＢＭＰ：０μｇ／ｍｌ群の人工椎体−骨境界部は軟部組織の介在無く、複合体と新生骨が直接結合していた。ＰＬＬＡプレートは吸収されずに、そのままの形で残存した。人工椎体は１２週で吸収が進み、周囲の骨と判別困難だった。ＢＭＰ：４００μｇ／ｍｌ群は人工椎体前方に厚い皮質骨が形成されていた。

組織標本では、１２週のＨＥ標本で、人工椎体は新生骨と直接結合しており、基本的には脛骨への移植時に観察された所見と同様であった。人工椎体−骨境界部に形成された吸収窩（ｌａｃｕｎａｅ）では多核巨細胞が複合体表面に、また紡錘型の細胞が骨表面に配列し、骨形態調整系（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｎｉｔ）を形成していた。

実験例５（猿頚椎への移植）
実験例４と同様に、直径４ｍｍ×高さ５ｍｍの円柱体状人工椎体を作製し、これにｒｈＢＭＰ−２（０ｍｇ／ｍｌ，１ｍｇ／ｍｌ）を脱泡吸引させ、ニホンザル８頭の頚椎Ｃ４／５に移植して実験例４と同様のＰＬＬＡプレートで固定した。術後Ｘ−Ｐ、ＣＴ撮影を行い、３ヶ月で試料を採取して、実験例４と同様に組織学的評価を行った。その結果、画像所見、組織像など全てが犬頚椎のＢＭＰ：０μｇ／ｍｌ群、４００μｇ／ｍｌ群で得られた所見と同じだった。

実施例１製造例１で作製したＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を用いて、ヒト用人工椎体を作製した。図１は、その形態を示す平面図（ａ）、側面図（ｂ）である。図２は、図１に示す人工椎体を支持プレートで頚椎に固定した状態のヒト用人工椎体のモデルの正面像を示す平面図である。図３は、図１に示す人工椎体を支持プレートで頚椎に固定した状態のヒト用人工椎体のモデルの側面像を示す部分断面図である。

図１に示すように、奥行Ｄ＝１０ｍｍ、幅Ｗ１＝１５ｍｍ、長さＬ１＝２０ｍｍの断面が馬蹄形をしたブロックからなる頚椎用人工椎体Ｉを作製した。人工椎体Ｉには、長軸方向に直径ｄ１＝０．５ｍｍのドリル孔Ｈ１を６個、図１のように等間隔で穿った。ブロックの側方にも直径ｄ２＝０．５ｍｍ、直径ｄ３＝０．５ｍｍのドリル孔Ｈ２とＨ３を図１のように前後方向に９個、左右方向に６個穿った。

また、人工椎体の支持固定用プレートは、射出成型後押し出し成型し、配向結晶化させた長さＬ２＝２５ｍｍ、幅Ｗ２＝１０ｍｍ、厚さＴ＝２ｍｍのポリ乳酸（ＰＬＬＡ）プレートＰを用いた。ＰＬＬＡプレートＰには、図２、図３に示すように、プレートＰの４隅にスクリューＳの挿入用の直径４ｍｍの孔Ｈ４を、スクリューＳが緩み（ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ）を起こしにくいように斜め方向にあけて、この孔Ｈ４にチタン合金で作製したスクリューＳを通して、図３に示すように、椎骨Ｃ３とＣ４にねじ込んで固定した。

図１は、本発明の実施例１のヒト用の人工椎体の形態を示す平面図（ａ）、正面図（ｂ）、側面図（ｃ）である。 図２は、図１に示す人工椎体を支持プレートでヒト頚椎に固定した状態の正面図である。 図３は、図１に示す人工椎体を支持プレートでヒト頚椎に固定した状態の側面図である。 図４は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合材のＴＥＭ像（スケールバー：１μｍ）および電子線回折像を示す図面代用写真である。 図５は、実験例３の人工椎体の形態を示す平面図（ａ）、側面図（ｂ）である。

Claims (3)

1. ＨＡｐ粒子とＣｏｌ線維によるナノコンポジットのＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体からなる人工椎体であって、前記ＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体には、ハバース管状又はフォルクマン管状の穿孔が形成されてなることを特徴とする人工椎体。
2. 請求項１に記載の人工椎体において、前記穿孔の直径が、０．４〜０．６ｍｍであることを特徴とする人工椎体。
3. 請求項１又は２に記載の人工椎体において、Ｃｏｌ線維方向にＨＡｐ粒子のｃ軸が配向してなることを特徴とする人工椎体。