JP2009095401A - 再生用多孔質足場材およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】脱細胞化した細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなる再生用多孔質足場材。多孔質テンプレートに細胞を播種して培養してマトリックス化し、前記マトリックス化した細胞を脱細胞化と前記テンプレートを除去して、脱細胞化した細胞から骨格を形成する。
【選択図】図1
Description
従来用いられてきた足場材は、合成高分子材料、無機材料、金属材料、及びこれらの複合材料、動植物から抽出した材料を使用するしかなかった。何れにしても、足場材の骨格を形成する材料の種類は限られ、生体に対する影響を軽減する手法が確立されているとはいえないのが現状である。
発明2により、僅かな細胞を利用して足場材の骨格を形成することができるようになった。
このため、貴重な細胞を利用することができ、対応する生体やその再生箇所に適合しやすい材質で足場材を作ることができるようになった。
発明3、4の内、発明2では、細胞の組織化が不十分な場合でも、脱細胞化によるマトリックス化により全体を一体化させることができる。
発明4では、細胞は組織化により一体化しているのでテンプレートを除去してできた孔が脱細胞化の為の薬液の流路となって、迅速かつ効率よく脱細胞化を達成することが出来た。
また、発明5により、細胞の培養をテンプレートが阻害する問題が解決した。
2.体性幹細胞と体細胞は体の様々な部位から採取することが可能である。たとえば、間葉系幹細胞は、骨髄以外に、末梢血や脂肪組織などからも採取することができる。繊維芽細胞は皮膚や靭帯、腱などの組織から採取できる。軟骨細胞は硝子軟骨、弾性軟骨、肋軟骨と繊維軟骨から採取できる。何れの細胞も利用できるが、容易に採取でき、培養しやすく、しかも細胞外マトリックスを大量に産生する細胞が最も好ましい。
3.細胞の種類によって、使用する培地の種類が異なる。細胞の活性を維持でき、大量の細胞外マトリックスの産生を促進する培地が最も好ましい。血清培地と無血清培地の何れも用いることができる。血清培地を用いる場合、動物(たとえば、ウシ)由来の血清と患者自身の血清を利用できるが、望ましいのは患者の血清である。
4.細胞にとっての一時的な足場材料は、生体吸収性高分子を素材とするメッシュ体やスポンジ体あるいは紐状体などの多孔質体からなるものでよい。メッシュ体は、織布又は不織布等からなるものでよい。スポンジ体は、発泡剤を利用する発泡成形法、あるいは多孔質化剤除去法等、その他公知の方法により得られる。また、紐状体は繊維状や組みヒモ等からなるものでよい。メッシュ体、スポンジ体、あるいは紐状体を形成する生体吸収性高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリリンゴ酸、ポリ−ε−カプロラクトンなどのポリエステル等が挙げられる。
5.細胞を上記の一時的な足場材料に播き、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベーター中で培養を行った。細胞播種に用いた細胞液の密度と播いた細胞の数は細胞が一時的な足場材料に均一に分布でき、均一な細胞外マトリックスの産生ができればよい。培養時間は十分な細胞外マトリックスを産生できればよい。通常は30分間から2ヶ月までであり、望ましいのは3時間から4週間までである。
6.得られた細胞外マトリックスは脱細胞化や洗浄などの処理に耐え、これらの処理の後で安定な多孔質構造を保持できれば、固定化処理は必要としない。もし、これらの処理の後で安定な多孔質構造を保持することができなければ、多孔質構造を安定させる固定化が必要となる。望ましいのは固定化処理をしないほうである。
7.固定化と脱細胞化の順序はどちらでもよい。細胞を固定化した後に脱細胞化しても、脱細胞化した後に固定化してもよい。また、細胞の固定化が不要な場合もある。
8.固定化の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。細胞外マトリックスを固定化する方法として、紫外線照射による光架橋や熱架橋などの物理的架橋法、ガス状あるいは溶液状の架橋化剤を用いる化学的架橋法がある。細胞外マトリックスを損傷することがなければ、何れの固定化方法でもよい。紫外線照射による光架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、紫外線照射による光架橋により固定化する。240nm〜280nmの紫外線で10分間から24時間照射するが、望ましいのは250nm〜260nmの紫外線で30分間から10時間照射する。熱架橋は、脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、0.01Torrから1Torrまでの減圧下、100℃から140度までの高温で48時間から96時間加熱することにより行う。9.溶液状あるいはガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法の架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテルのようなグリシジルエーテル類や、ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン1、5−ジイソシアネート、4、4−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−4、4、4、−トリイソシアネートのようなイソシアネート類や、メタノールやエタノールのようなアルコール類、グルコン酸カルシウムなどがあげられる。溶液状の架橋化剤での固定化は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを上記の架橋剤の溶液に30分間から72時間まで浸漬することにより行う。固定化温度は4℃から37℃である。望ましいのは4℃で1時間から48時間、あるいは、室温で30分間から24時間固定化する。ガス状の架橋化剤を用いる化学的架橋法による固定化は、上記の架橋剤をガス状にして用いることができる。脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルを凍結し、凍結乾燥した後、一定温度で一定濃度の架橋剤水溶液で飽和した架橋剤の蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。架橋温度は通常、20℃〜40℃に設定される。架橋に要する時間は、1〜12時間である。
10.脱細胞化の方法としては、従来公知のものが何れも使用できる。凍結・解凍を繰り返す方法、超音波処理方法、界面活性剤を添加する方法、低張液に浸漬する方法などの少なくともひとつの方法を用いるか、これらの方法を組み合わせることができる。凍結・解凍を繰り返す方法は脱細胞化前のサンプル或いは脱細胞化したサンプルをMilli−Q水(超純水)かリン酸緩衝液か低張液か高張液に浸漬して、−10℃から−196℃で10分間から12時間まで凍結し、その後37℃の水浴か室温で解凍し、Milli−Q水かリン酸緩衝液か低張液か高張液で洗浄する。この凍結・解凍のサイクルを3回から20回まで繰り返す。
11.細胞の一時的な足場材料を抽出除去する水溶液としては、生体吸収性高分子の骨格のみを溶かし、細胞由来の素材を溶かさないものであれば、酸性水溶液、アルカリ性水溶液あるいは中性水溶液の何れでもよい。使用される抽出液は、塩化水素、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、炭酸などの無機酸水溶液、酢酸、シュウ酸、クエン酸、コハク酸、アミノ酸、アスコルビン酸、などの有機酸水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ水溶液、塩化アンモニウム、硫酸銅、塩化鉄、硫酸水素ナトリウム、硫酸水素カリウムなどの酸性塩水溶液、酢酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムなどのアルカリ性塩水溶液、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの中性塩水溶液があげられる。望ましくはリン酸ナトリウム、メタ珪酸ナトリウムである。水溶液のモル濃度は0.01M〜2.0Mであるが、好ましく0.1〜0.8Mである。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に4℃で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で10回洗浄した。洗浄後のサンプルを0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl、5mMEDTA)に浸漬し、シェーカーを用いて、室温で12時間低速振盪した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Cl、10mM MgCl2)を加えて37℃、3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄し脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図1に示す。
電顕写真より、作製した間葉系幹細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に4℃で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で10回洗浄した。洗浄後のサンプルを0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl、5mMEDTA)に浸漬し、シェーカーを用いて、室温で12時間低速振盪した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Cl、10mM MgCl2)を加えて37℃、3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図2に示す。
電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
3日間培養後、培養した細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、4℃で0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、リン酸緩衝液で10回洗浄した。その後、0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl, 5mMEDTA)に漬け、室温でシェーカーで低速度で12時間振動した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Clto10mMMgCl2)で37℃で3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図3に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、低張液(10mMTris−Cl, 5mMEDTA)に漬け、室温でシェーカーで低速度で12時間振動した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGA−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を37℃で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で12時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図4に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)のスポンジ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養し、7日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAスポンジ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸(75:25)との共重合体PLGAをクロロホルムに溶かし、15(w/v)%の溶液を調製した。PLGAのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が150μm〜250μmの塩化ナトリウムの粒子(PLGA重量の9倍)を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、48時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム/PLGA円柱体を蒸留水に浸し、2時間ごとに蒸留水を交換しながら、4日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が150μm〜250μmで空隙率が90%のPLGAスポンジ体を得た。本PLGAスポンジ円柱体を空気中で24時間乾燥した後、さらに真空状態で12時間乾燥した。その後、PLGAスポンジ円柱体を切断して0.5cm×0.5cm×0.2cmの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAスポンジ体の片面に1.0×105cellsの細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAスポンジ体を裏返して、裏面にも1.0×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で7日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、4℃で0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、リン酸緩衝液で10回洗浄した。その後、0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl, 5mMEDTA)に漬け、室温でシェーカーで低速度で12時間振動した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Clto10mMMgCl2)で37℃で3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGA−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で7日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄して、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で12時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図5に示す
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)のスポンジ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養し、7日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAスポンジ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸(75:25)との共重合体PLGAをクロロホルムに溶かし、15(w/v)%の溶液を調製した。PLGAのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が150μm〜250μmの塩化ナトリウムの粒子(PLGA重量の9倍)を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、48時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム/PLGA円柱体を蒸留水に浸し、2時間ごとに蒸留水を交換しながら、4日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が150μm〜250μmで空隙率が90%のPLGAスポンジ体を得た。本PLGAスポンジ円柱体を空気中で24時間乾燥した後、さらに真空状態で12時間乾燥した。その後、PLGAスポンジ円柱体を切断して0.5cm×0.5cm×0.2cmの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAスポンジ体の片面に1.0×105cellsの細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAスポンジ体を裏返して、裏面にも1.0×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で7日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、4℃で0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、リン酸緩衝液で10回洗浄した。その後、0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl, 5mMEDTA)に漬け、室温でシェーカーで低速度で12時間振動した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Clto10mMMgCl2)で37℃で3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGA−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で7日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄して、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で12時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、繊維芽細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図6に示す。
電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)のスポンジ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、7日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAスポンジ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
乳酸とグリコール酸(75:25)との共重合体PLGAをクロロホルムに溶かし、15(w/v)%の溶液を調製した。PLGAのクロロホルム溶液をアルミニウム製の円筒容器に注ぎ入れ、直径が150μm〜250μmの塩化ナトリウムの粒子(PLGA重量の9倍)を本溶液に加え、よくかき混ぜた後、48時間風乾した。乾燥後、塩化ナトリウム/PLGA円柱体を蒸留水に浸し、2時間ごとに蒸留水を交換しながら、4日間洗浄を行った。
このようにして、孔径が150μm〜250μmで空隙率が90%のPLGAスポンジ体を得た。本PLGAスポンジ円柱体を空気中で24時間乾燥した後、さらに真空状態で12時間乾燥した。その後、PLGAスポンジ円柱体を切断して0.5cm×0.5cm×0.2cmの立方体とした後、酸化エチレンガスで滅菌した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAスポンジ体の片面に1.0×105cellsの細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAスポンジ体を裏返して、裏面にも1.0×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で7日間培養した。
培養した細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、4℃で0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間付けることにより、細胞を固定化した。
リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、リン酸緩衝液で10回洗浄した。その後、0.1%のトリトンX−100を含有する低張液(10mMTris−Cl, 5mMEDTA)に漬け、室温でシェーカーで低速度で12時間振動した。リン酸緩衝液で3回洗浄した後、50μg/mLのDNaseと10μg/mLのRNaseを含む緩衝液(10mMTris−Clto10mMMgCl2)で37℃で3時間処理した。その後、リン酸緩衝液で10回洗浄して、脱細胞化した。
PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGA−コラーゲン構造体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で7日間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄して、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で12時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、繊維芽細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた繊維芽細胞由来材料の多孔質体の外観を図7に示す。繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図8に示す。電顕写真より、作製した繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化し、細胞の固定化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に4℃で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で10回洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥した。得られた間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図9に示す。
電顕写真より、作製した間葉系幹細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化し、細胞の固定化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、20mM水溶性カルボジイミドと10mMハイドロキシスクシンイミドを含有する20mMHEPES緩衝液(pH6.5)に室温で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。100mMNa2HPO4で洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に4℃で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で10回洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥した。得られた皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図10に示す。
電顕写真より、作製した皮膚繊維芽細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、細胞の固定化、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、20mM水溶性カルボジイミドと10mMハイドロキシスクシンイミドを含有する20mMHEPES緩衝液(pH6.5)に室温で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。100mMNa2HPO4で洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを0.1%のグルタルアルデヒド水溶液に4℃で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。リン酸緩衝液で10回洗浄した後、0.1Mのグリシン水溶液に3時間浸漬した後、再びリン酸緩衝液で10回洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図11に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
脱細胞化したサンプルを、20mM水溶性カルボジイミドと10mMハイドロキシスクシンイミドを含有する20mMHEPES緩衝液(pH6.5)に室温で24時間浸漬することにより、細胞を固定化した。100mMNa2HPO4で洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、Milli Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Milli Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図12に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸の共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、間葉系幹細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
まず、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社より購入)を、増殖培地(Cambrex社より購入、間葉系幹細胞用基礎培地に、10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン、L−グルタミンを添加した培地)中、37℃、5%CO2雰囲気下で継代培養を2回行った。この間葉系幹細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)によって剥離・回収し、1.0×106cells/mLの骨髄細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、Milli−Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Milli−Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。その後、さらに25mMNH4OH水溶液で10分間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、皮膚繊維芽細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、、Milli−Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Milli−Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図13に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸/グリコール酸との共重合体(PLGA)のメッシュ体を用いてヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。つづいて、脱細胞化を行った後、PLGAメッシュ体を溶出し、皮膚繊維芽細胞由来の材料を作製した。詳細を以下に示す。
クラボウ社から購入した正常ヒト皮膚繊維芽細胞をクラボウ社から購入したMedium 106S (2%ウシ胎児血清を添加した)培地で37℃、5%CO2雰囲気下で1回継代培養した。1回継代培養した皮膚繊維芽細胞を0.025%トリプシンと0.01%EDTAを含有するHEPESバッファー剥離・採集し、2.0×106cells/mL繊維芽細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に、1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で2日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、Milli−Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、Milli−Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。その後、さらに25mMNH4OH水溶液で10分間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、間葉系幹細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で10回洗浄し、洗浄後のサンプルを氷で冷やした0.1%のトリトンX−100を含有する高張液(50mMTris−Cl、pH8.0、1.5MKCl)に浸漬し、シェーカーを用いて、氷で冷やした状態で3時間低速振盪した。10mMTris−Cl(pH8.0)で3時間洗浄した後、Milli−Q水で3時間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、、Milli−Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、、Milli−Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
これを−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥することにより、軟骨細胞由来材料の多孔質体を作製した。得られた軟骨細胞由来材料の多孔質体を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した。電顕写真を図14に示す。
電顕写真より、作製した軟骨細胞由来材料は多孔質であることが分かった。
生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体(PLGA)メッシュ体を用いてヒト軟骨細胞を培養し、3日間培養した後、細胞を固定化し、脱細胞処理を行い、PLGAメッシュ体を溶出し、軟骨細胞由来の材料を作製した。
Cambrex (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.)社から購入したヒト関節軟骨細胞を10%ウシ胎児血清,抗生物質、4500mg/Lグルコース、584mg/Lグルタミン、0.4mMプロリン及び50mg/Lアスコルビン酸を含有するDMEM培地で37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。2回継代培養した軟骨細胞を0.025%トリプシン/0.01%EDTA/PBS(−)で剥離・採集し、2.0×106cells/ml細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記PLGAメッシュ体に1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で6時間培養した後、PLGAメッシュ体を裏返して、裏面にも1.27×105cells/cm2の細胞を播種し、上記の培地で37℃、5%CO2雰囲気下で3日間培養した。
培養後の細胞をリン酸緩衝液で3回洗浄し、、Milli−Q水で3回洗浄した。−80℃で3時間凍結した。その後、凍結したサンプルを室温に置き、解凍した。解凍した後、、Milli−Q水で毎回10分間で3回洗浄した。この凍結−解凍を6回繰り返した。その後、さらに25mMNH4OH水溶液で10分間洗浄した。
その後、PLGAと細胞の複合体を0.5Mのリン酸三ナトリウム水溶液に浸漬し、PLGAと細胞の複合体とリン酸三ナトリウム水溶液を室温で48時間ゆっくり攪拌した。この後、蒸留水で20回洗浄し、前記PLGAを除去した。
溶出後の残留物を−80℃で4時間凍結し、真空減圧下(0.2 Torr)で24時間凍結乾燥し、軟骨細胞由来材料の多孔質体を得た。
Claims (6)
- 生体内に埋め込まれる再生用多孔質足場材であって、脱細胞化した細胞のマトリックスにより骨格が形成されてなることを特徴とする。
- 請求項1に記載の再生用多孔質足場材の製造方法であって、多孔質テンプレートに細胞を播種して培養してマトリックス化し、前記マトリックス化した細胞を脱細胞化と前記テンプレートを除去して、脱細胞化した細胞から骨格を形成することを特徴とする。
- 請求項2に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、細胞により形成したマトリックスを脱細胞化した後に、前記テンプレートを除去することを特徴とする。
- 請求項2に記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、細胞により形成したマトリックスから前記テンプレートを除去して後に、脱細胞化することを特徴とする。
- 請求項2から4のいずれかに記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、前記多孔質テンプレートは生体吸収性合成高分子よりなることを特徴とする。
- 請求項2から5の何れかに記載の再生用多孔質足場材の製造方法において、細胞外マトリックスを細胞培養にて形成してマトリックス化することを特徴とする。
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