JP2009057321A - 遺伝子導入剤、核酸複合体及び遺伝子導入材料 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子導入活性が高く、また細胞外へ排出され易い遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックとアニオン性ポリマーブロックとを有しており、該カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されていることを特徴とする遺伝子導入剤。好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるホモポリマーに対し、４−ビニル安息香酸などの酸性官能基を有したアニオン性モノマーをブロック重合させ、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンで架橋させたものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体及び遺伝子導入材料とに関する。

近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。

ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、カチオン性のスター型ポリマーがＷＯ２００４／０９２３８８及び特開２００７−７０５７９に記載されている。
ＷＯ２００４／０９２３８８ 特開２００７−７０５７９

遺伝子治療を目指す場合には、生体内へのベクターの蓄積を防ぐ必要がある。なお、蓄積したベクターは補体Ｃ３ａを活性化させ、免疫活性化、毒性、発ガンなどの要因になる可能性がある。また、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでも細胞内への残留は細胞機能に変化をきたす可能性がある。

上記のスター型ポリマーは、分子量が大きいため、細胞内への蓄積や、代謝性が低いことが懸念される。

本発明は、遺伝子導入活性が高く、また細胞外へ排除され易い遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体及び遺伝子導入材料を提供することを目的とする。

本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックとアニオン性ポリマーブロックとを有しており、該カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されていることを特徴とするものである。

なお、本発明でいうポリマーとは、モノマーの２量体などのオリゴマーも包含するものとする。

上記アニオン性ポリマーブロックは、酸性官能基を有した側鎖を有することが好ましい。この酸性官能基としてはカルボキシル基が好適である。側鎖のｐｋａは１〜６程度であることが好ましい。

前記ポリマー材料は、少なくともカチオン性モノマーと酸性官能基を有したアニオン性モノマーとの共重合ブロックを有する重合体であることが好ましい。

アニオン性ポリマーブロックはポリカルボキシビニルベンゼン又はその誘導体が好適であり、特にアニオン性ポリマーブロックはポリカルボキシスチレン又はその誘導体が好適である。また、カチオン性ポリマーブロックの重合度はアニオン性ポリマーブロックの重合度の２〜１００倍が好適である。

多価陽イオンとしては多価金属イオンが好適であり、特にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが好適である。

このブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにカチオン性モノマーと、酸性官能基を有したアニオン性モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。そして、複数のこの分岐型重合体同士が多価陽イオンを介して架橋されていることが好ましい。

このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。

アニオン性モノマーとしては、４−ビニル安息香酸が好適である。カチオン性モノマーはビニル系モノマーが好適である。

このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される１種以上が好ましい。

本発明の核酸複合体は、かかる本発明の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものである。

本発明の遺伝子導入剤は、この核酸複合体を基材に担持させたものである。

本発明の遺伝子導入剤は、多価陽イオンによって架橋されたものである。本出願人らは特願２００７−１１４３３９号にスター型ポリマーを光架橋することで遺伝子導入効率を非架橋体の数倍に向上させることができることを記載している。ただし、光架橋されたスター型ポリマーは高分子量化され、かつ、この架橋結合は不可逆的なものであり、遺伝子導入効率の向上と同時に細胞内、生体内への蓄積の可能性を合わせ持つものであった。本発明による遺伝子導入剤は、強酸性のエンドソーム内でイオン結合の破壊によって解離して、イオン複合体からの遺伝子を拡散を促進できるほか、ポリマー自体も低分子量化が進み、細胞外への排除が容易に行われる。すなわち、本発明の遺伝子導入剤は、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、キレーションによる分子間架橋を維持しているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内では２価金属イオンのキレーションによる分子間結合は容易に解離し、架橋前のスター型ポリマーへ可逆的に戻ることができる。

なお、アニオン性ブロック鎖がｐＫａ＝１〜６程度の酸性官能基を側鎖に有するものである場合、強酸性のエンドソーム内で疎水変性し、エンドソームからの脱出効率の向上をも期待することができる。

本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックとアニオン性ポリマーブロックとを有しており、該カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されていることを特徴とするものである。好ましくは遺伝子導入剤は、該アニオン性ポリマーブロックは酸性官能基を有した側鎖を有する分岐型重合体が、複数個、多価陽イオンを介して架橋されたものである。

上記の分岐型重合体としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくともカチオン性モノマーと酸性官能基を有したアニオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。

なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。

Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。

上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。

このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。

酸性官能基としてはカルボキシル基が好適であり、酸性官能基を有したアニオン性モノマーとしては、カルボキシスチレン具体的には４−ビニル安息香酸（４−カルボキシスチレン）又は３，４−カルボキシスチレンなどのカルボキシビニルベンゼンが好適である。なお、カルボキシビニルベンゼンは置換基を有していてもよい。

本発明の一態様では、イニファターに対し、まずカチオン性モノマーを重合させてカチオン性ホモポリマーを得、これに酸性官能基を有したアニオン性モノマーをブロック共重合させる。

カチオン性ポリマーブロックの重合度はアニオン性ポリマーブロックの重合度の２〜１００倍が好適である。

イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。この溶液の溶媒としては、アルカン、アルケン、アロマチック、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、具体的にはベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素又は塩化メチレンが挙げられ、中でもトルエン又はクロロホルムが好適である。

このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。

照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ^２〜１０ｍＷ／ｃｍ^２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。

なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。

上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。

このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。

この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。

このカチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。

このようにして生成した分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーに対し、酸性官能基を有したアニオン性モノマーをブロック共重合させてカチオン性ポリマーブロック及びアニオン性ポリマーブロックを有した分岐型重合体とする。

酸性官能基を有したアニオン性モノマーをブロック共重合させるには、上記のようにして合成したカチオン性分岐型重合体（ホモポリマー）をメタノール等の溶媒に溶解させ、これにアニオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性分岐型ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、アニオン性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ^２程度が好適である。

本発明の別の一態様では、上記イニファターに対し、まず酸性官能基を有したアニオン性モノマーを重合させてアニオン性ホモポリマーを形成し、その後、このアニオン性ホモポリマーに上記ビニル系モノマーなどのカチオン性モノマーをブロック共重合させて遺伝子導入剤を得るようにしてもよい。

本発明のさらに別の一態様では、モノマーとして、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、非イオン性モノマーとを用いる。イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、アニオン性モノマーのブロック、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。

非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。非イオン性ポリマーブロックの分子量は、２，０００〜５００，０００が好適である。

この分岐型重合体の分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。

本発明の遺伝子導入剤は、好ましくはｐＫａ＝３〜５程度の酸性官能基を側鎖に有するアニオン性ポリマーブロック（好ましくは４−ビニル安息香酸のポリマーブロック）をカチオン性ポリマーへ重合、好ましくはブロック重合した分岐型重合体を多価陽イオンで架橋したものである。

この多価陽イオンとしては多価金属イオン特に２価の金属イオンとりわけカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが好適である。

多価陽イオンを介して分岐型重合体同士を架橋させるには、多価陽イオン好ましくは多価陽イオンの塩の水溶液を分岐型重合体の水溶液に添加し、常温又は加温下で１０〜６０分程度撹拌するのが好ましい。この塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩などが好適であり、具体的には塩化カルシウム、塩化マグネシウムが好ましい。この塩の水溶液の濃度は通常は０．１ｗｔ％〜飽和濃度程度が好ましい。添加する塩の量は、分岐型重合体の酸性官能基の当量の０．１倍〜１０倍程度が好ましい。

架橋反応させた後は、水を透析液として透析処理し、未反応の塩や残留する酸根を除去するのが好ましい。

このようにして生成したカチオン性ポリマーブロックを有した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。

この遺伝子導入剤は、強酸性のエンドソーム内でイオン結合の破壊によって解離して、イオン複合体からの遺伝子を拡散を促進できるほか、ポリマー自体も低分子量化が進み、細胞外への排除が容易に行われる。すなわち、ＤＮＡとの混合時、細胞への作用時である生理的ｐＨにおいては、多価陽イオンのキレーションによる分子間架橋を維持しているが、細胞内へ取り込まれた後、強酸性のエンドソーム内ではこのキレーションによる分子間結合は容易に解離し、架橋前のスター型ポリマーへ可逆的に戻ることができる。

なお、アニオン性ブロック鎖がｐＫａ＝１〜６程度のカルボキシル基などの酸性官能基を側鎖に有するものである場合、強酸性のエンドソーム内で疎水変性し、エンドソームからの脱出効率の向上をも期待することができる。

本発明のベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してベクターを過剰量添加し、ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。

核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。

また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。

核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。

核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。

所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。

本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。

当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。

この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。

また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。

投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。

この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。

また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。

上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり厚さが０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましい。円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。

この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ^２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。

核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。

実施例１
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。

１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ_３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ_２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。

ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。

即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を２０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５００ｍＷ／ｃｍ^２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより４０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ_２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。

iii)カチオン性ホモポリマーへの４−ビニル安息香酸のブロック共重合によるカチオン性／アニオン性分岐型重合体（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＣＳ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（４−カルボキシスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＣＳと記すことがある。）の合成を行った。

即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー４．８ｍｇを約５０ｍＬのメタノールへ溶解した。ガラス容器中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、同様に高純度窒素ガスでパージを行ったメタノールにて全量を４８ｍＬに調整した。溶液を３．５ｍＬ分取し、４−ビニル安息香酸１．０ｇを７ｍＬのメタノールへ溶解した溶液３．５ｍＬと混合した。ii)と同様の手法で光照射重合を行い、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行い、１５ｍＬの水へ溶解した後に水酸化ナトリウム０．１グラムを加えて３日間透析して精製し、テトラキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（４−カルボキシルスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＣＳブロックポリマー）を得た（重合率３８％）。

ＧＰＣによる分子量測定は、両イオン性の高分子化合物であることによってイオン排除・イオン吸着作用により正確には測定できなかった。示差屈折率計−紫外可視分光光度計のタンデム式検出システムにて、ポリマー分子の強いＵＶ吸収が確認され、芳香環が導入されたことが示唆された。ブロック化前の溶出曲線において、吸光度と屈折率の曲線が重なるように軸スケールを調整したＧＰＣチャートを図２に示す。図２の上側の曲線がii）のカチオン性ホモポリマーの溶出曲線であり、下側の曲線がiii）のカチオン性／アニオン性分岐型重合体の溶出曲線である。図２の通り、ブロック化後のＵＶ吸収が跳ね上がっており、ブロック化によってポリマーに芳香環が導入されたことが分かる。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）、δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３)、δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ）、δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ_２）、δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｄ，０．１Ｈ，３−，５−ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｒｉｎｇ）、（ｄ，０．１Ｈ，２−，６−ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｒｉｎｇ）と測定された。以上より、４分岐型ポリマーのポリマー鎖に２５２個モノマー単位からなる３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、１９個モノマー単位からなる４−ビニル安息香酸のポリマーブロックが導入された４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＣＳブロックポリマーが合成されたことが確認された。

iv)架橋処理
４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＣＳブロックポリマー０．４グラムを４０ｍＬの水へ溶解し、塩化カルシウム飽和溶液４０ｍＬを混合して２４時間攪拌した後、水を透析液として３日間透析を行った。透析完了後に凍結乾燥を行って４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＣＳブロックポリマーのカルシウムイオン架橋体を得た。図１（ａ）の通り、ＧＰＣによるピークの歪と高分子量側へのシフトが確認された。これより分子間に結合が形成されたことが示唆された。

次に、このカルシウムイオン架橋体０．５グラムを１Ｎ塩酸５０ｍＬへ溶解し、６０分間攪拌後、３日間水で透析処理を行った後に凍結乾燥を行った。

塩酸で処理したカルシウムイオン架橋体のＧＰＣチャートは、図１（ｂ）の通り、架橋処理によって歪んだピーク形状及び高分子量側へのシフトが架橋前の元の溶出曲線に近づき、カルシウムイオン性架橋が酸性の環境下で可逆的に解離することが確認された。

これによって、ＤＮＡとのイオン複合体形成及び細胞への作用の際（生理的ｐＨにおいては）は架橋体を形成してスターポリマー架橋体の構造的優位性を発現し、細胞内のエンドソーム内（強酸性下）で解離し、架橋体よりも低分子量化され代謝や蓄積性に有利となることが分かった。

実施例の結果を示すＧＰＣチャートである。 合成したポリマーのＧＰＣチャートである。

Claims (15)

1. 分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、
   該分岐鎖は、カチオン性ポリマーブロックとアニオン性ポリマーブロックとを有しており、
   該カチオン性ポリマーブロックの重合度がアニオン性ポリマーブロックの重合度よりも大きく、
   複数の分岐鎖が多価陽イオンを介して架橋されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
2. 請求項１において、該アニオン性ポリマーブロックは酸性官能基を有した側鎖を有することを特徴とする遺伝子導入剤。
3. 請求項２において、前記酸性官能基はカルボキシル基であり、側鎖のｐｋａが１〜６であることを特徴とする遺伝子導入剤。
4. 請求項３において、前記アニオン性ポリマーブロックはポリカルボキシビニルベンゼン又はその誘導体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
5. 請求項４において、前記アニオン性ポリマーブロックはポリカルボキシスチレン又はその誘導体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
6. 請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーブロックの重合度はアニオン性ポリマーブロックの重合度の２〜１００倍であることを特徴とする遺伝子導入剤。
7. 請求項１ないし６のいずれか１項において、前記多価陽イオンは多価金属イオンであることを特徴とする遺伝子導入剤。
8. 請求項７において、該金属イオンはカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくとも一方であることを特徴とする遺伝子導入剤。
9. 請求項１ないし８のいずれか1項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを光照射リビング重合させた分岐型重合体であり、
   複数の分岐型重合体が前記多価陽イオンを介して架橋されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
10. 請求項９において、アニオン性モノマーが４−ビニル安息香酸であることを特徴とする遺伝子導入剤。
11. 請求項９又は１０において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
12. 請求項９ないし１１のいずれか１項において、カチオン性モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
13. 請求項１２において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
14. 請求項１ないし１３のいずれか１項の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とする核酸複合体。
15. 請求項１４の核酸複合体を基材に担持させてなる遺伝子導入材料。

Images