JP2009022169A - 磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子が、ある範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体であって、そして、粒状多孔質架橋キトサンを、第一鉄イオンと第二鉄イオンを含む鉄イオン溶液中に添加混合した後、アルカリ水溶液により処理し、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
【選択図】なし
Description
したがって、本発明は、酵素固定化用担体等としての性能を維持しながらも、磁力による捕集が可能なキトサン系酵素固定化用担体、及びこれを効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
すなわち本発明は、粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が30mol%から80mol%の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン25mLに対して鉄塩の総モル数が0.4×10-2molから3.0×10-2molの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が2%〜23%の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させてなる、磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体およびその製造方法に係るものである。
本発明における粒状多孔質架橋キトサンは、例えば、キトサンを酸性水溶液に溶解した後、該溶液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キトサンを、エポキシ系やイソシアネート系等の架橋剤により架橋したものであれば、特に限定されない。ここで用いられる架橋剤としては、例えば、ヘキサメチレンビス−(2,3−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド)、ヘキサメチレンビス−(2,3−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド)、プロピレンビス−(2,3−エポキシプロピルジメチルアンモニウムクロライド)、プロピレンビス−(2,3−エポキシプロピルジエチルアンモニウムクロライド)、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリエチレングリコールジグリシジルエーテル、トリメチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレングリコールジグリシジルエーテル、エピクロロヒドリン等のエポキシ系架橋剤や、ヘキサメチレンジイソシアネート、4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート、2,4−トリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、1,4−シクロヘキサンジイソシアネート、1,4−フェニレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソフォロンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤、などが挙げられる。
孔径についても大きすぎると表面積が小さくなってしまい酵素反応の効率が悪くなり、小さすぎると、酵素反応における物質の多孔質内拡散速度が低下し、みかけの酵素活性が低下してしまう事から、100〜7500オングストロームが好ましく、1000〜2000オングストロームが特に好ましい。
本発明における鉄イオン溶液は、第一鉄イオンと第二鉄イオンの混合水溶液であり、第一鉄イオンと第二鉄イオンの比率としては、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が、30mol%から80mol%の範囲にある事が好ましく、45mol%〜80mol%の範囲にあることがより好ましい。第一鉄イオンが30mol%に満たないと十分な磁力が得られず、磁石に近付けてもその捕集は出来ない。逆に、第一鉄イオンの割合が80mol%より大きいと磁石で捕集は出来ても酵素の固定化量が減少する。
次に、本発明では、上記の添加、混合処理の後、アルカリ水溶液を加え、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させる。このとき用いるアルカリ水溶液としては、従来既存の塩基性物質の水溶液であれば何れも使用できるが、中でも、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液を使用することが好ましい。なお、アルカリ水溶液の量は、反応系のpHが8以上になるように適宜選択すればよいが、過度に用いると、粒状多孔質架橋キトサンの架橋基や改質基の脱離、および、孔の収縮が起こり、酵素固定化量が減少することがあるため好ましくない。
アルカリ水溶液を加えた後の処理についても、先の通り、30〜80℃位で100〜300ストロークで振とうしながら1〜6時間程度処理すれば良い。
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体の色調を目視観察し、その色斑から反応斑を評価した。色斑が無く均質性に優れる場合は○、色斑はあるが品質的に許容できる範囲内である場合は△、色斑が大きく、品質的に許容できない場合は×として評価した。
(2) 磁石への付着(外観評価)
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をガラスシャーレに移し、キトサン系酵素固定化用担体が水没するまでRO水を加えた後、磁束密度0.3Tの回転子取り出し棒(アズワン社製)を系中に挿入して磁石への付着状況、および、引き寄せられる状況を目視観察により評価した。評価結果は、付着する場合は○、付着しない、あるいは、系外に取り出すことが出来ない場合は×で示した。
(3) 走査型電子顕微鏡(SEM)観察
実施例に示す方法で調製したキトサン系酵素固定化用担体をRO水、メタノール、エタノール、そして、t−ブチルアルコールの順に洗浄、溶媒交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、表面に金をスパッタリングし、日本電子製JSM6060LVを用いて、5000倍で観察した。
熱風循環式乾燥器中、105℃、4時間の条件で絶乾した試料を風袋重量既知のセラミックるつぼに入れた後、電気炉中で600℃、5時間の条件で灰化した。灰化後は、速やかにデシケータに入れ、デシケータ中で室温まで放冷後、重量を計測し、下式から灰分率を求めた。
灰分率(%)=焼成残分重量(g)/絶乾試料重量(g)×100
(5) アルブミンの吸着
0.01Mリン酸水素二ナトリウムと0.01Mリン酸二水素ナトリウムより調製した0.01Mリン酸バッファー(pH7.4)で置換した各酵素固定化用担体5mlをプラスチック製の密閉容器に量り取り、1%のウシ血清アルブミン(MP Biomedicals, Inc.製)の0.01Mリン酸バッファー(pH7.4)溶液50mlを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、25℃で4時間振とう(振とう速度:125rpm)した。
(6) ヘモグロビンの吸着
0.01Mリン酸バッファー(pH7.4)で置換した各酵素固定化用担体5mlをプラスチック製の密閉容器に量り取り、1%のウシ血液由来ヘモグロビン(和光純薬製、試薬特級) の0.01Mリン酸バッファー(pH7.4)溶液50mlを加え、恒温ロータリーシェーカーを使用して、25℃で4時間振とう(振とう速度:125rpm)した。
(7) タンパク質吸着率の測定
アルブミン、あるいは、ヘモグロビンを所定時間、各酵素固定化用担体に吸着させた後、反応液5mLを10倍に希釈し、分光光度計(島津製作所製UV-2450)を用いて、280nmの吸光度より吸着量を測定し、下記の式1に基づいて算出した。
粒径840〜1,190μm、比表面積110〜130m2/gのキトサン系酵素固定化用担体(富士紡ホールディングス社製キトパールBCW−2510)25mLをプラスチック製の密閉容器に量り取り、スポイトで水分を軽く除去した。ここに、あらかじめ調製しておいた磁性化溶液(塩化第一鉄・四水和物2.78g(1.40×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物4.17g(1.54×10-2mol)、および、デキストラン1.81gを40.0gのRO水に溶解させた溶液)を全量投入し、良く混合した。次いで、反応系を振とう恒温水槽を用いて60℃に昇温し、125ストローク/分で2時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、反応系に28%アンモニア水(和光純薬製)5.75gを43.61gのRO水で希釈した溶液を添加し、良く混合した。なお、この時点で系は褐色化した。その後、再び、振とう恒温水槽を用いて反応系を60℃に昇温し、125ストローク/分で1時間、浸とう、混合した。所定時間経過後、系を濾別、水洗して目的物を得た。目的物は、RO水中、5℃で保管した。
アルブミン、および、ヘモグロビンの吸着率を評価したところ、それぞれ46.9mg/ml、22.8mg/mlであり、酵素固定化用担体としての性能を十分に保持していた。よって、本願の目的である磁性と酵素固定可能の同時具備が達せられたといえる。実施例1〜3及び比較例1〜3による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表1にまとめた。
磁性化酵素固定化用担体5mlに対し、RO水に150Uの力価を持つように溶解、調製した水溶液(天野エンザイム株式会社製アシラーゼアマノ水溶液)10mlを加え、室温で2時間振とうしてアシラーゼを固定化した。反応液5mlを系から量り取り、10倍に希釈した後、280nmにおける吸光度を測定した。磁性化酵素固定化用担体を入れずに同様の操作を行ったものをブランクとし、ブランク吸光度との差から固定化アシラーゼ量を求めた。
上記操作により調製したアシラーゼ固定化担体を280nmにおける吸光度が0.025以下になるまで充分に洗浄し未反応の酵素を除去した。得られた磁性化担体、あるいは、非磁性化担体1mlをスクリュー管に入れ、クエン酸バッファー(pH5.0)2ml、0.5mM塩化コバルト水溶液1mlを加え、37℃で5分間反応させた。続いて、基質溶液として、N−アセチル−DL−メチオニン溶液1mlを系に加え、試験管ミキサーで攪拌後、37℃で15分間反応させた。反応混合物をろ過した後、ろ液から1mlを分取し、3分間80℃の湯浴中で加熱することにより反応を停止させた。反応液を流水で冷却後、後述する方法で調製したニンヒドリン溶液1ml、および、第一塩化スズ溶液0.05mlを加え、90℃の湯浴中で20分間強熱した。流水で冷却後、50%2−プロパノール水溶液を5ml加え、570nmにおける吸光度を測定した。酵素固定化用担体を入れないで同様の操作を行った系をブランクとして用意し、吸光度を測定した。なお、反応に使用したN−アセチル−DL−メチオニン、ニンヒドリン溶液、および、第一塩化スズ水溶液は以下の様に調製した。
N−アセチル−DL−メチオニン溶液:N−アセチル−DL−メチオニン(和光純薬工業株式会社製試薬特級、MW=191.25)0.478gを量り、RO水10mlと1N−水酸化ナトリウム液2mlを加え、溶解した。その後、系中にN/10−水酸化ナトリウム液を加えることによって、pHを8.0に調整し、さらにRO水を加え25mlとした。
ニンヒドリン溶液:ニンヒドリン(和光純薬工業株式会社製アミノ酸自動分析用、8.14)1.0gを量り、25mlのエチレングリコールモノメチルエーテル(和光純薬工業株式会社製試薬特級、MW=76.1)を加え、溶解した後、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.0)を25ml加えて振とうした。
第一塩化スズ水溶液:塩化第一スズ(和光純薬工業株式会社製試薬特級、MW=225.63)0.1gを量り、クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.0)を6.2ml加えて溶解した。
塩化第一鉄・四水和物1.39g(0.70×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物2.09g(0.77×10-2mol)、および、デキストラン0.90gを42.5gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例1と同様の作業を行った。表1に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
塩化第一鉄・四水和物0.70g(0.35×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物1.04g(0.38×10-2mol)、および、デキストラン0.45gを43.8gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例1と同様の作業を行った。表1に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を1.27g(0.64×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物を0.43g(0.16×10-2mol)使用し、デキストラン0.45gを42.9gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例1と同様の作業を行い、本発明の目的を満足する担体を得た。実施例4〜6及び比較例4,5による磁性化処理後のキトサン系酵素固定化用担体の性状及び評価結果を、表2にまとめた。
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を0.85g(0.43×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物を0.85g(1.27×10-2mol)使用し、デキストラン0.45gを42.9gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例1と同様の作業を行った。表2に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物を0.43g(0.22×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物を1.27g(0.47×10-2mol)使用し、デキストラン0.45gを42.9gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例1と同様の作業を行った。表2に示す様に、本発明の目的を満足する担体が得られた。
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径840〜1,190μm、比表面積120〜150m2/gのキトサン系酵素固定化用担体(富士紡ホールディングス社製キトパールBCW−3010)を用いた以外、実施例1と同様にして磁性化酵素固定化用担体を作製した。
330.94:L−メチオニンで作成した検量線より求めた吸光度差1.000となるL−メチオニン量
149:L−メチオニン1μmolに対する重量(μg)
16:試料希釈倍数×単位換算係数
W:活性測定に用いた固定化酵素担体量(g)
キトサン系酵素固定化用担体として、粒径840〜1,190μm、比表面積150〜200m2/g)のキトサン系酵素固定化用担体(富士紡ホールディングス社製キトパールBCW−3510)を用いた以外は、実施例7と同様の操作を行い磁性化アシラーゼ固定化担体の性能を評価した。結果、表3から明らかなように、本発明による磁性化担体は、磁性化していない担体と各種性能が同程度であり、磁性化による性能低下がないことが示された。
塩化第一鉄・四水和物11.1g(5.58×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物16.7g(6.18×10-2mol)、および、デキストラン7.23gを25.0gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例1と同様の作業を行った。結果、表1に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
塩化第一鉄・四水和物5.56g(2.80×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物8.35g(3.09×10-2mol)、および、デキストラン3.62gを35.0gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例1と同様の作業を行った。結果、表1に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
塩化第一鉄・四水和物0.35g(0.18×10-2mol)、塩化第二鉄・六水和物0.50g(0.18×10-2mol)、および、デキストラン0.23gを44.4gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は、実施例1と同様の作業を行った。結果、表1に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
鉄イオン源として、塩化第一鉄・四水和物1.70g(0.86×10-2mol)のみ使用し、デキストラン0.45gを42.9gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例1と同様の作業を行った。結果、表2に示す様に、磁性化は可能であったが、ヘモグロビンの吸着率が低下し、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
鉄イオン源として、塩化第二鉄・六水和物1.70g(0.63×10-2mol)のみ使用し、デキストラン0.45gを42.9gのRO水に溶解させた磁性化溶液を用いた以外は実施例1と同様の作業を行った。結果、表2に示す様に、磁石への付着が観られず、本発明の目的を満足する担体は得られなかった。
Claims (2)
- 粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が30mol%から80mol%の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン25mLに対して鉄塩の総モル数が0.4×10-2molから3.0×10-2molの範囲で接触、析出させて得られる第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が2%〜23%の範囲である磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体。
- 粒状多孔質架橋キトサンに、第一鉄イオンと第二鉄イオンの総モル数に対する第一鉄イオンの割合が30mol%から80mol%の範囲にある鉄イオン溶液を、粒状多孔質架橋キトサン25mLに対して鉄塩の総モル数が0.4×10-2molから3.0×10-2molの範囲で接触させた後、アルカリ溶液で処理して、第一鉄イオンと第二鉄イオンよりなる磁性化粒子の灰分率の増分が2%〜23%の範囲となるように、粒状多孔質架橋キトサンに磁性化粒子を形成させることを特徴とする磁性を有するキトサン系酵素固定化用担体の製造方法。
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