JP2008541073A - Pvdf膜 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、予備活性化(preactivation)の必要をなくすためのPVDF膜の処理方法に関する。処理された膜はエリスポット(ELISpot)および他のアッセイにおいて有用である。
ポリビニルジフルオライド(PVDF)膜は、種々の免疫アッセイにおいて固体支持体として一般に使用されている。タンパク質に結合して保持するその高い能力ゆえに、PVDFは、特に固定化物質の高い局所濃度に依存するエリスポットやマイクロアレイアッセイなどに理想的な膜である。しかしながら、PVDF膜は本来の形態においては非常に疎水性であるという特性を有し、かつ比較的結合活性が乏しいため、その高い結合特性を達成するためにはPVDF膜を活性化する必要がある。活性化は通常、膜をより親水性にして水溶液が膜に浸透することを可能にし、それにより結合に利用できる表面領域を増加させる、エタノール処理またはメタノール処理により達成される。典型的には膜をエタノールで短時間処理し、その後コーティングする物質の添加前に数回洗浄する。疎水性で結合性が低いという特性を取り戻してしまうため、活性化とコーティングとの間に膜を乾燥させないことが必須である。
本発明者らは、使用者がコーティング前に予備活性化する必要をなくすように、PVDF膜を改良する方法を開発した。膜の改良により「過剰処理」のリスクが回避される。予め活性化する必要なしに、コーティング物質を直接プレートに添加することができるため、改良された膜の使用はアッセイプレートの調製における大幅な単純化も意味する。従って本発明は、
(a)膜をアルコールおよび湿潤剤と接触させる工程、ならびに
(b)該膜を乾燥させる工程
を含む、ポリビニルジフルオライド(PVDF)膜を処理する方法;
本発明の方法によって得られるPVDF膜;
(a)該膜をタンパク質と接触させる工程、
(b)任意で該膜を洗浄する工程、および
(c)任意で該膜を安定化剤の存在下で乾燥させる工程
を含む、本発明のPVDF膜をタンパク質でコーティングする方法;ならびに
免疫アッセイにおける本発明のPVDF膜の使用を提供する。
本発明は、エタノールを用いた活性化後または活性化中に膜をより親水性にする物質(「湿潤剤」)でポリビニルジフルオライド(PVDF)膜を飽和させると、永続的に「活性化」することができるという知見に基づく。こうして膜は、その高い結合特性をなお維持しながら、乾燥および長期保存することができる。本発明の方法は、エリスポットアッセイにおける使用に適した他の疎水性膜に適用することもできる。
(a)膜をアルコールおよび湿潤剤と接触させる工程;および
(b)該膜を乾燥させる工程
を含む、PVDF膜の処理または活性化の方法を提供する。
(a)乾燥した膜をタンパク質と接触させる工程;
(b)任意で該膜を洗浄する工程;および
(c)任意で、安定化剤の存在下で該膜を乾燥させる工程
をさらに含む、PVDF膜の処理方法も提供する。
(a)膜をタンパク質と接触させる工程;
(b)任意で該膜を洗浄する工程;および
(c)任意で、安定化剤の存在下で該膜を乾燥させる工程
を含む、本発明のPVDF膜をタンパク質でコーティングする方法も提供する。
比較例1
PVDFエリスポットプレートのエタノールでの処理および過剰処理の影響を実証するために、種々の従来のコーティング法を用いてIFN-γエリスポットアッセイを行った。
以下の実験において、2工程または1工程の方法のいずれかにより、エタノールおよび湿潤剤で96ウェルエリスポットプレートを処理した。
非処理プレート(抗体コーティングの前に予め湿潤させない)、従来法によりエタノールで処理したプレート(抗体でのコーティング前に100μl/ウェルの70%のエタノールで2分間新たに予め湿潤させた)、および、モノクローナル抗体である抗IL-10(9D7)、抗IL-12(IL-12-1)、および抗IL-13(IL-13-1)15μgml-1でそれぞれコーティングする前に、実施例1に記載の1工程法に従ってエタノールとトレハロースとの混合物で処理したプレートを用いてIL-10、IL-12、およびIL-13エリスポット試験アッセイを行った。
無処理プレート、記載された方法で処理したプレート、および新たにエタノールで活性化したプレートとの間でのタンパク質の吸収能の変化を実証するために、15μg/mlの濃度のモノクローナル抗体1D1Kを用いて室温で3時間コーティングした。表1に示すように、従来の方法に従ってコーティングしたウェルで最も結合が強く、これらのウェルにおいて得られる不良なエリスポットの結果(図1B)は、コーティングされた抗体の量の不足が原因でないことを示している。記載される方法に従って処理したウェルは、従来のコーティングを用いた場合と同等またはわずかに少ない量の抗体が結合したのに対し、非活性化膜への結合は実質的により少なかった。
Claims (14)
- (a)膜をアルコールおよび湿潤剤と接触させる工程、ならびに
(b)該膜を乾燥させる工程
を含む、ポリビニルジフルオライド(PVDF)膜を処理する方法。 - 工程(a)が、膜をアルコールと湿潤剤との混合物に接触させる工程を含む、請求項1記載の方法。
- 工程(a)が、
(i)膜をアルコールと接触させる工程;
(ii)該膜を洗浄する工程;および
(iii)該膜を湿潤剤と接触させる工程
を含む、請求項1記載の方法。 - アルコールがエタノールおよびメタノールから選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 湿潤剤が、リン酸緩衝生理食塩水、炭酸塩、糖質、タンパク質、およびアミノ酸から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 糖質が、ラクトース、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、マンノース、イノシトール、グルコサミン、アラビノース、およびキシロースから選択される、請求項5記載の方法。
- タンパク質がアルブミンまたは抗体である、請求項5記載の方法。
- アミノ酸がグリシンである、請求項5記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項記載の方法により得られるPVDF膜。
- (a)膜をタンパク質と接触させる工程;
(b)任意で該膜を洗浄する工程;および
(c)任意で、安定化剤の存在下で該膜を乾燥させる工程
を含む、請求項9記載のPVDF膜をタンパク質でコーティングする方法。 - タンパク質が抗体である、請求項10記載の方法。
- 抗体がサイトカインに対する抗体である、請求項11記載の方法。
- 免疫アッセイにおける請求項9記載のPVDF膜の使用。
- 免疫アッセイがELISAまたはエリスポット(ELISpot)アッセイである、請求項13記載の使用。
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