JP2008528466A - Ｃｄｋおよびｇｓｋ阻害ピラゾール誘導体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式（Ｉ）の化合物：またはその塩、互変異性体、溶媒和物およびＮ−オキシド；式中；Ｒ１は、２，６−ジクロロフェニルである；Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、いずれも水素である；そしてＲ３は、基である；Ｒ４は、Ｃ１−４アルキルである。この化合物は、ＣＤＫキナーゼ阻害剤としての活性を有し、そして、癌細胞の増殖を阻止する。

Description

本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）キナーゼの活性を阻害または調節するピラゾール化合物、このキナーゼによって介在される疾患症状または状態の処置または予防におけるこの化合物の使用、およびキナーゼ阻害または調節活性を有する新規化合物に関する。また、この化合物を包含する医薬組成物および新規な化学中間体が提供される。
発明の背景
プロテインキナーゼは、細胞内で広範にわたる様々なシグナルトランスダクションプロセスを制御する役目をしている、構造的に関連する酵素の大きな一団のファミリーから構成されている(Hardie, G. および Hanks, S. (1995) The Protein Kinase Facts Book. I およびII, Academic Press, San Diego, CA)。このキナーゼは、燐酸化される基質によってファミリーに類別されることができる（例えば、プロテイン−チロシン、プロテイン−セリン/トレオニン、脂質など）。こうしたそれぞれのキナーゼファミリーに通例対応する配列モチーフは、確認されてきた(例えば、Hanks, S. K., Hunter, T., FASEB J., 9:576-596(1995); Knighton, et al., Science, 253:407-414(199１）；Hiles, et al., Cell, 70:419-429(1992); Kunz, et al., Cell, 73:585-596(1993); Garcia-Bustos, et al., EMBO J., 13:2352-2361(1994))。
プロテインキナーゼは、それらの制御メカニズムによって特徴づけることができる。こうしたメカニズムには、例えば、自己リン酸化、他のキナーゼによるリン酸転移反応、蛋白質間相互作用、蛋白質−脂質相互作用、および蛋白質−ポリヌクレオチド間相互作用が含まれる。個々のプロテインキナーゼは、一つ以上のメカニズムによって制御され得る。
キナーゼは、ホスフェート基を標的プロテインに加えることによって、増殖、分化、アポトーシス、運動性、転写、翻訳および他のシグナルプロセス（これらに限定されない）を含む多くの異なる細胞プロセスを制御している。こうしたリン酸化現象は、標的プロテインの生物学的機能を調節したり、または制御することができる、分子のオン/オフスィッチとしての役目をする。標的プロテインのリン酸化は、様々な細胞外のシグナル（ホルモン、神経伝達物質、増殖および分化ファクターなど）、細胞周期現象、環境または栄養ストレスなどに応答して起こる。しかるべきプロテインキナーゼは、例えば、代謝酵素、制御蛋白質、受容体、細胞骨格プロテイン、イオンチャンネルまたはポンプ、または転写ファクターを（直接的または間接的に）活性化するか不活性化する経路をシグナリングする際に機能している。プロテインリン酸化の不完全な制御のための制御不可能なシグナリングは、例えば、炎症、癌、アレルギー/喘息、免疫系疾患および状態、中枢神経系疾患および状態、および腫瘍起因性血管形成を含む多くの疾患に関わってきている。
サイクリン依存性キナーゼ
真核細胞分裂のプロセスは、大まかに、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭと呼ばれる一連の連続的な相に分類される。細胞周期の様々な相を通る適当な進行は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）として知られているファミリーの蛋白質およびサイクリンと呼ばれている様々の組のそれらの同種蛋白質パートナーの立体的および時間的制御に決定的に依存しているが示されてきた。ｃｄｋは、配列依存性関係で様々なポリペプチドのリン酸化における基質としてのＡＴＰを利用することができるｃｄｃ２（ｃｄｋ１とも呼ばれている）同族体セリン−トレオニンキナーゼ蛋白質である。サイクリンは、特定のｃｄｋパートナー蛋白質に結合し、そしてこれに対する選択性(selectivity)を明確にするのに用いられる“サイクリンボックス”と呼ばれている、約１００個のアミノ酸を含んでいる相同領域によって特徴付けられている蛋白質のファミリーである。
細胞周期を介した様々なｃｄｋおよびサイクリンの発現レベル、分解率および活性化レベルの調節は、ｃｄｋが酵素的に活性である一連のｃｄｋ/サイクリン複合体の周期的形成に至る。こうした複合体の形成によって、個別的な細胞周期チェックポイントを経由しての移行が制御され、そして、それによって細胞分裂のプロセスが連続することを可能にする。前もって必要な生化学基準を所与の細胞周期チェックポイントで満足していない場合、すなわち、必要なｃｄｋ/サイクリン複合体を形成しない場合は、細胞周期の停止および/または細胞アポトーシスに至ることになる。癌で明らかなように、異常な細胞増殖は、しばしば、正しい細胞周期制御の喪失が原因であることがであると考えるられる。それ故、ｃｄｋ酵素活性の阻害によって、異常に分裂する細胞がそれらの分裂が停止し、および/または死滅させることが可能な手段が提供される。ｃｄｋ、およびｃｄｋ複合体の多様性、およびそれらの細胞周期を媒介する際の重要な役割は、確定している生化学的理論的根拠に基づいて選択される広範な範囲の可能性のある治療標的を提供する。
細胞周期のＧ１相からＳ相への進行は、主として、サイクリンのＤおよびＥタイプのメンバーとの結合を介して、ｃｄｋ２、ｃｄｋ３、ｃｄｋ４およびｃｄｋ６によって制御されている。Ｄ−タイプのサイクリンは、Ｇ１制限点を超える移行を可能にするのに役立つようであり、そこで、ｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体は、Ｇ１相からＳ相への移行の重要な鍵となっている。引き続いてＳ相を通過して移行し、Ｇ２相に入るには、ｃｄｋ２/サイクリンＡ複合体を必要とすると考えられる。有糸分裂、およびそのトリガーとなるＧ２からＭ相移行は、いずれもｃｄｋ１およびＡおよびＢタイプサイクリンの複合体によって制御されている。
Ｇ１相の間、網膜芽細胞腫蛋白（Ｒｂ）、およびｐ１３０のような関連ポケット蛋白(pocket proteins)は、ｃｄｋ（２、４、および６）/サイクリン複合体の基質である。Ｇ１を通過する進行は、ｃｄｋ（４/６）サイクリン−Ｄ複合体によるＲｂおよびｐ１３０の過剰リン酸化、すなわち不活性化によって幾分促進される。Ｒｂおよびｐ１３０の過剰リン酸化は、転写因子、例えば、Ｅ２Ｆの放出を引き起こし、こうしてＧ１を通過して移行しＳ相に入るのに必要な遺伝子、例えば、サイクリンＥのための遺伝子を発現させる。サイクリンＥの発現は、Ｒｂの更なるリン酸化を経由してＥ２Ｆレベルを増幅しまたは維持する、ｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体の形成を促進する。ｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体は、また、ヒストン生合成に関与している、ＮＰＡＴのようなＤＮＡ複製に必要な他の蛋白をリン酸化する。Ｇ１進行およびＧ１/Ｓ移行はまた、ｃｄｋ２/サイクリンＥ経路に供給される、分裂促進因子によって刺激されるＭｙｃ経路によって制御される。ｃｄｋ２はまた、ｐ２１レベルのｐ５３制御によって、ｐ５３によって介在されるＤＮＡ損傷応答経路に繋がっている。ｐ２１は、ｃｄｋ２/サイクリンＥのプロテイン阻害剤であり、従って、Ｇ１/Ｓ移行を遮断または遅延させることができる。従って、ｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体は、Ｒｂ、Ｍｙｃおよびｐ５３経路からの生化学的刺激がある程度集積されるポイントを表すことが可能である。それ故、ｃｄｋ２および/またはｃｄｋ２/サイクリンＥ複合体は、異常分裂細胞の細胞周期の停止または制御の回復を目的とした治療のための良好な標的を表す。
細胞周期におけるｃｄｋ３の正確な役割は、はっきりしていない。同族のサイクリンパートナーは、まだ特定化されていないが、ｃｄｋ３のドミナント・ネガティブ・フォーム(dominant negative form)がＧ１の細胞を遅延させ、それによって、ｃｄｋ３は、Ｇ１/Ｓ移行を制御するのにある役割をしていることが示唆されてきている。
大部分のｃｄｋは、細胞周期の制御に関与しているけれども、ｃｄｋファミリーのあるものは、他の生化学的プロセスに関与しているという証拠が存在する。このことは、正しい神経細胞増殖に必要であり、そしてまたＴａｕ、ＮＵＤＥ−１、シナプシン１、ＤＡＲＰＰ３２およびＭｕｎｃ１８/シンタキシン１Ａ複合体のようないくつかの神経細胞蛋白のリン酸化にも関与している、ｃｄｋ５によって例証されている。神経細胞のｃｄｋ５は、通例、ｐ３５/ｐ３９蛋白に結合することによって活性化される。しかしながら、ｃｄｋ５活性は、ｐ３５短縮版であるｐ２５の結合によって脱制御することができる。ｐ３５からｐ２５への変換、およびそれに続くｃｄｋ５活性の脱制御が、虚血、興奮毒性、およびβ−アミロイドペプチドによって誘発され得る。その結果、ｐ２５は、アルツハイマー病のような神経変性疾患の発病に関与しており、それ故、こうした疾患を対象とする治療の標的として関心がもたれている。
ｃｄｋ７は、ｃｄｃ２ ＣＡＫ活性を有し、サイクリンＨに結合する核蛋白質である。ｃｄｋ７は、ＲＮＡポリメラーゼ ＩＩ Ｃ−末端ドメイン（ＣＴＤ）活性を有しているＴＦＩＩＨ転写複合体の構成要素として同定されてきた。このことはＴａｔ介在生化学経路を介してＨＩＶ−１転写の制御に関連している。ｃｄｋ８は、サイクリンＣと結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤのリン酸化に関与している。同様に、ｃｄｋ９/サイクリン−Ｔ１複合体（Ｐ−ＴＥＦｂ複合体）はＲＮＡポリメラーゼＩＩの伸長制御に関与している。ＰＴＥＦ−ｂは、またサイクリンＴ１との相互作用を通して、ウイルスのトランス活性化因子 ＴａｔによるＨＩＶ−１ゲノムの転写活性化に必要である。それ故、ｃｄｋ７、ｃｄｋ８、ｃｄｋ９およびＰ−ＴＥＦｂ複合体は、抗ウイルス治療のための可能性のある標的である。
ｃｄｋ/サイクリン複合体活性の分子レベルでの介在には、一連の刺激性で且つ阻害性のリン酸化、または脱リン酸化事象が必要である。ｃｄｋリン酸化は、一群のｃｄｋ活性化キナーゼ（ＣＡＫｓ）および/またはwee 1、Myt1、Mik1のようなキナーゼによって行われる。脱リン酸化は、ｃｄｃ２５（ａおよびｃ）、ｐｐ２ａ、またはＫＡＰのようなホスファターゼによって行われる。
ｃｄｋ/サイクリン複合体活性は、内生細胞蛋白阻害剤の二つのファミリー：Ｋｉｐ/Ｃｉｐ ファミリー、またはＩＮＫ ファミリーによって更に制御されている。このＩＮＫ蛋白は、ｃｄｋ４およびｃｄｋ６と特異的に結合する。ｐ１６ｉｎｋ４（ＭＴＳ１とも呼ばれている）は、多くの原発性癌中で突然変異され、または欠失している潜在的癌抑制遺伝子である。Ｋｉｐ/Ｃｉｐファミリーは、ｐ２１Ｃｉｐ1，Ｗａｆｌ、ｐ２７Ｋｉｐｌ、およびｐ５７ｋｉｐ２のような蛋白質を含んでいる。以前に論じたように、ｐ２１は、ｐ５３によって誘導され、そして、ｃｄｋ２/サイクリン（Ｅ/Ａ）およびｃｄｋ４/サイクリン（Ｄ１/Ｄ２/Ｄ３）複合体を不活性化させることができる。異常に低いレベルのｐ２７発現は、乳癌、大腸癌、および前立腺癌において観察される。逆に、固形腫瘍におけるサイクリンＥの過剰発現は、患者の不良な予後に相関関係があることが示されてきた。サイクリンＤ１の過剰発現は、食道、乳、扁平上皮、および非小細胞肺癌に関連があるとされてきている。
増殖細胞における細胞周期を調整したり、進行させたりする際に、ｃｄｋおよびそれらの関連する蛋白の極めて重要な役割は、上記に概説してきた。ｃｄｋが重要な役割を演じる生化学経路のいくつかも説明してきた。それ故、一般的に標的をｃｄｋまたは特定のｃｄｋにした治療法を用いて、癌のような増殖疾患の処置のための単剤療法の発展が、潜在的に強く望まれる。ｃｄｋ阻害剤は、おそらく、とりわけウイルス感染症、自己免疫疾患および神経変性疾患のような他の状態を処置するのにも使用できるであろう。ｃｄｋ標的治療法は、また、既存のまたは新規な治療薬との併用療法で使用するときに、前に述べた疾患の処置において、臨床的利益をももたらすことができる。ｃｄｋ標的抗癌療法は、それらは、直接ＤＮＡと相互作用せず、それ故、二次的な腫瘍の進行の危険を減少させるであろうから、現在使用されている抗癌剤より潜在的に利益を有しているであろう。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、二つの遍在している発現されたヒトのアイソフォーム（ＧＳＫ３αおよびベータＧＳＫ３β）として存在しているセリン−トレオニンキナーゼである。ＧＳＫ３は、胎児発育、蛋白合成、細胞増殖、細胞分化、微小管動態、細胞運動および細胞アポトーシスにおいて役割を有しているとして関与している。こうしたＧＳＫ３は、糖尿病、癌、アルツハイマー病、卒中、癲癇、運動ニューロン疾患および/または頭部損傷のような疾患状態の進行に関与している。系統発生学的ＧＳＫ３は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に最も緊密に関連している。
ＧＳＫ３によって認識されるコンセンサスペプチド基質配列は、（Ｓｅｒ/Ｔｈｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（ｐＳｅｒ/ｐＴｈｒ）［ここで、Ｘは、任意のアミノ酸（（ｎ＋１）、（ｎ＋２）、（ｎ＋３）の位置）であり、そして、ｐＳｅｒおよびｐＴｈｒは、それぞれ、（ｎ＋４）ホスホ−セリン(phospho-serine)およびホスホ−トレオニン(phospho-threonine)である]である。ＧＳＫ３は、位置（ｎ）で、第１のセリンまたはトレオニンをリン酸化する。ホスホ−セリン、またはホスホ−トレオニンは、（ｎ＋４）の位置でＧＳＫ３をプライミング(priming)するのに必要であると思われ、そして基質のターンオーバーを最高にする。Ｓｅｒ２１のＧＳＫ３αまたはＳｅｒ９のＧＳＫ３βのリン酸化によって、ＧＳＫ３の阻害がもたらされる。突然変異誘発およびペプチド競合の検討を通して、ＧＳＫ３のリン酸化されたＮ末端が、自己抑制的機構を介して、ホスホ−ペプチド基質(phospho-peptide substrate)(Ｓ/ＴＸＸＸｐＳ/ｐＴ）と競合することが可能であるというモデルがもたらされる。また、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫβが、それぞれ、チロシン２７９および２１６のリン酸化によって微妙に制御され得るということを示唆するデータもある。こうした残基のＰｈｅへの突然変異は、イン・ビボにおけるキナーゼ活性の減少を引き起こす。ＧＳＫ３βのＸ線結晶構造は、ＧＳＫ３活性および制御の局面のすべてを解明するのに役立ってきた。
ＧＳＫ３は、哺乳類のインシュリン応答経路の一部を形成し、そしてリン酸化することを可能にし、そして、それによってグリコーゲン合成酵素を不活性化できる。ＧＳＫ３の阻害によるグリコーゲン合成酵素活性、従って、グリコーゲン合成の上方制御は、故に体組織がインスリン刺激に耐性を示すようになる状態であるＩＩ型または非インスリン依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)と戦う手段の可能性があると考えられている。肝臓、脂肪質または筋組織中の細胞のインスリン反応は、細胞外インスリン受容体と結合しているインスリンによって誘発される。これは、インスリン受容体基質(ＩＲＳ)タンパク質のリン酸化および、原形質膜への続く補充を誘発する。ＩＲＳタンパク質の更なるリン酸化は、原形質膜へのホスホイノシチド−３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)の補充を始め、そこでは、それが第２のメッセンジャーであるホスファチジルイノシチル３,４,５−トリスリン酸塩(ＰＩＰ３)を放出することが可能である。これは、膜への３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１(ＰＤＫ１)およびプロテインキナーゼＢ(ＰＫＢまたはＡｋｔ)の共同局在化を容易にし、そこでＰＤＫ１はＰＫＢを活性化させる。ＰＫＢは、リン酸化することが可能であり、そして、それ故に、Ｓｅｒ９またはＳｅｒ２１のリン酸化によって、それぞれ、ＧＳＫ３αおよび/またはＧＳＫβを阻害できる。次いで、ＧＳＫ３の阻害は、グリコーゲン合成酵素活性の上方制御の引き金を引く。ＧＳＫ３を阻害することが可能な治療薬は、このように、インスリン刺激において見られるのと類似している細胞反応を誘発できる可能性がある。ＧＳＫ３の更なる生体内基質は、真核生物タンパク質合成開始ファクター２Ｂ(ｅＩＦ２Ｂ)である。ｅＩＦ２Ｂは、リン酸化によって不活性化されて、このように、タンパク質生合成を抑制することが可能である。このように、ＧＳＫ３の阻害は、例えば、“ラパマイシンの哺乳類の標的”タンパク質(ｍＴＯＲ)の不活性化によって、タンパク質生合成を上方制御することができる。最後に、キナーゼ、例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ１(ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ１またはＲＳＫ)によるＧＳＫ３活性のリン酸化を介した、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)経路を経由して、ＧＳＫ３活性の調節についていくつかの証拠がある。これらのデータは、ＧＳＫ３活性が、マイトジェン、インスリンおよび/またはアミノ酸刺激によって調節できることを示唆する。
ＧＳＫ３βは、脊椎動物のウィント（Ｗｎｔ）シグナル経路における重要な構成要素であることもまた示されてきている。この生化学的経路は、正常な胎児発達にとって重大であり、正常な組織の細胞増殖を制御することが示されてきている。ＧＳＫ３は、Ｗｎｔ刺激に応答して阻害される。これは、アキシン、大腸腺腫ポリポーシス(adenomatous polyposis coli)(ＡＰＣ）遺伝子産物およびβ−カテニンのようなＧＳＫ３基質の脱リン酸化をもたらすことができる。Ｗｎｔ経路の異常な制御は、多くの癌に関連性がある。ＡＰＣ、および/またはβ−カテニンの突然変異は、大腸癌および他の腫瘍に共通である。β−カテニンはまた細胞接着に重要であることが示されてきている。従って、ＧＳＫ３は、また、細胞接着プロセスをある程度まで調節することができる。既に述べた生化学的経路のほかに、ｃ−Ｊｕｎ、ＣＣＡＡＴ/エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ/ＥＢＰα）、ｃ−Ｍｙｃのような転写因子および/または活性化Ｔ−細胞の核因子（ＮＦＡＴｃ）、熱ショック因子−１（ＨＳＦ−１）およびｃ−ＡＭＰ応答因子結合蛋白(c-AMP response element binding protein(ＣＲＥＢ）のような他の基質のリン酸化において、サイクリン−Ｄ１のリン酸化を介して細胞分裂の制御においてＧＳＫ３を含んでいるデータもある。ＧＳＫ３はまた、特異的な組織であるにもかかわらず、細胞アポトーシスを制御するのに役割を演じているように思われる。細胞アポトーシスを調節する際のＧＳＫ３の役割は、プロアポトーシス(pro-apoptotic)メカニズムを介して、ニューロンのアポトーシスが起こる可能性がある医学状態に大いに関連がある可能性がある。こうした例には、頭部損傷、卒中、癲癇、アルツハイマー病および運動ニューロン疾患、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病がある。イン・ビトロにおいて、ＧＳＫ３は微小管関連蛋白質タウ(Tau)を過剰にリン酸化することができることが示されてきている。タウの過剰リン酸化は、通常の微小管との結合を阻害し、また細胞内タウフィラメントの形成に至る可能性がある。こうしたフィラメントの進行性の蓄積によって、最終的には、ニューロンの機能不全および変性に至ることが信じられている。従って、タウリン酸化の阻害は、ＧＳＫ３の阻害によって、神経変性作用を制限しおよび/または防止する手段が提供され得る。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
細胞周期進行は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、およびネガティブな細胞周期制御剤であるＣＤＫ−阻害剤（ＣＤＫｉ）によって制御されている。ｐ２７ＫＩＰ１は、細胞周期制御におけるＣＤＫｉの重要なものであり、その分解(degradation)は、Ｇ１/Ｓ移行に必要である。増殖するリンパ球においてｐ２７ＫＩＰ１発現が存在しないにもかかわらず、攻撃的なＢ細胞リンパ腫には、異常なｐ２７ＫＩＰ１染色を示すものとして報告がなされているものもある。異常に高いｐ２７ＫＩＰ１の発現は、このタイプのリンパ腫中に発見された。こうした発見の臨床関連分析によると、このタイプの腫瘍における高レベルのｐ２７ＫＩＰ１発現は、一変数および多変数分析の両方とも、不良な予後のマーカーであることが示されている。こうした結果によって、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）には異常なｐ２７ＫＩＰ１発現があることが、こうした異常なｐ２７ＫＩＰ１蛋白は、他の細胞周期制御剤蛋白と相互作用を通じ機能しなくなり得るということを示唆し、不利な臨床的有意差をもって示される。(Br. J. Cancer. 1999 Jul; 80(9):1427-34。ｐ２７ＫＩＰ１は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において異常に発現され、不利な臨床的結果と結びついている。Saez A, Sanchez E, Sanchez-Beato M, Cruz MA, Chacon I, Munoz E, Camacho FI, Martinez-MonteroJC, Mollejo M, Garcia JF, Piris MA。病理学部、Virgen de la Salud Hospital, Toledo, Spain。)。
慢性リンパ球性白血病
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血球（ＣＬＬ）は、西半球では、最もよくある白血病であり、毎年約１０，０００の新しい症例が診断されている(Parker SL, Tong T, Bolden S, Wingo PA: Cancer statistics, 1997. Ca. Cancer. J. Clin. 47:5, (1997))。白血病の他の形態と比較して、中央値３年の生存を有している最も進行したステージの患者でさえ、ＣＬＬの全体的な予後は良好である。
症状のあるＣＬＬ患者の最初の治療法としてフルダラビンを加えると、以前に使用されているアルキル化剤ベースの治療と比較して、より高い率の完全な応答（２７％ ν ３％）および無増悪進行生存存続期間（３３ ν １７ヶ月）に達している。治療後、完全な臨床的応答を成し遂げることは、ＣＬＬの生存を向上させる最初のステップであるけれども、大半の患者は、完全な寛解を成し遂げないか、あるいは、フルダラビンに応答しない。更に、フルダラビンで処置されたＣＬＬ患者のすべてが最終的には再発し、それにより、単に一時的に緩和する単剤としての役割しかしない(Rai KR, Peterson B, Elias L, Shepherd L, Hines J, Nelson D, Cheson B, Kolitz J, Schiffer CA: 以前に無処置であった慢性リンパ球白血病の患者のフルダラビンとクロラムブシルのランダム比較(A randomized comparison of fludarabine and chlorambucil for patients with previously untreated chronic lymphocytic leukemia)。 A CALGB SWOG, CTG/NCI-CおよびECOG Inter-Group Study. Blood 88:141a, 1996(abstr 552, suppl 1)。それ故、フルダラビンの細胞障害性を補完し、内在するＣＬＬの薬剤耐性因子によって誘発される抵抗性を阻止する、作用の新規なメカニズムを有する新規な薬剤を特定化することは、この疾患の治療における更なる進歩が実現されるとき、それは必要であろう。
最も広範囲に研究され、ＣＬＬ患者における治療にほとんど応答しない、そして劣っている生存率の均一予測因子は、点突然変異またはクロモゾーム １７ｐ１３削除によって特徴づけられているｐ５３の変種の機能である。確かに、実質的に、アルキル化剤あるいは、プリン類縁体治療のどちらにも応答しないことは、ｐ５３機能に異常性を有しているこうしたＣＬＬ患者の場合の、多くの単一機関の一連の症例で書類として立証されてきている。ＣＬＬ中でｐ５３突然変異に関連する薬剤耐性を解消することができる治療剤の導入は、潜在的にこの疾患の処置のための大きな進歩となるであろう。
サイクリン依存性キナ−ゼ阻害剤であるフラボピリドールおよびＣＹＣ ２０２は、イン・ビトロにおいてＢ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）に起源する悪性細胞のアポトーシスを誘発する。
フラボピリドール暴露によって、キャスパーゼ３(caspase3)活性の刺激およびＢ−ＣＬＬで過剰発現している細胞周期のネガティブ制御剤ｐ２７（ｋｉｐｌ）のキャスパーゼ依存性裂開がもたらされる(Blood. 1998 Nov 15; 92(10):3804-16 Flavopiridol induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells via activation of caspase-3 without evidence of bcl-2 modulation or dependence on functional p53, Byrd JC, Shinn C, Wassselenko JK, Fuchs EJ, Lehman TA, Nguyen PL, Flinn IW, Diehl LF, Sausville E, Grever MR)。
先行技術
ＷＯ ０２/３４７２１（デュポン）には、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤としての一群のインデノ[１,２−ｃ]ピラゾール−４−オンが開示されている。
ＷＯ ０１/８１３４８（ブリストルマイヤーズスクイブ）には、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤として５−チオ−、スルフィニル−およびスルホニルピラゾロ[３,４−ｂ]−ピリジンの使用が記述されている。
ＷＯ ００/６２７７８（同様にブリストルマイヤーズスクイブ）には、一群のタンパク質チロシン・キナーゼ阻害剤が開示されている。
ＷＯ ０１/７２７４５Ａ１（シクラセル(Cyclacel)）は、２−置換４−ヘテロアリール−ピリミジンおよびそれらの製造、それらを含む医薬組成物、そして、サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)阻害剤としてのそれらの使用、そして、それ故に、癌、白血病のような増殖性疾患、乾癬などの処置におけるそれらの使用が記載されている。
ＷＯ ９９/２１８４５（アグロン(Agouron)）は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６のようなサイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)を阻害するための４−アミノチアゾール誘導体が記載されている。本発明は、また、こうした化合物を含んでいる医薬組成物の治療的または予防的な使用、そして、こうした化合物の有効量を投与することによる悪性腫瘍および他の疾患を処置する方法を対象とする。
ＷＯ ０１/５３２７４（アグロン）には、ＣＤＫキナーゼ阻害剤として含窒素複素環基に結合したアミド置換ベンゼン環を含むことができる一群の化合物が開示されている。
ＷＯ ０１/９８２９０（ファルマシア・アンド・アップジョン）には、プロテインキナーゼ阻害剤として一群の３−アミノカルボニル−２−カルボキサミドチオフェン誘導体が開示されている。
ＷＯ ０１/５３２６８およびＷＯ ０１/０２３６９（アグロン）には、サイクリン依存性キナーゼまたはチロシンキナーゼのようなプロテインキナーゼの阻害によって細胞増殖を介在するかまたは阻害する化合物が開示されている。アグロン化合物はインダゾール環の３位に直接またはＣＨ＝ＣＨまたはＣＨ＝Ｎ基を介して結合しているアリールまたはヘテロアリール環を有する。
ＷＯ ００/３９１０８およびＷＯ０２/００６５１（いずれもデュポン製薬(Du Pont Pharmaceuticals)）には、トリプシン様セリンプロテアーゼ酵素、特に第Ｘａ因子およびトロンビンの阻害剤である複素環化合物が記載されている。本化合物は抗凝血剤としてまたは血栓塞栓性疾患の予防のために有用であると述べられている。
ＵＳ２００２/００９１１１６（Zhu et al.）、ＷＯ ０１/１９７９８およびＷＯ ０１/６４６４２には、それぞれ第Ｘａ因子阻害剤として様々な群の複素環化合物が開示されている。なかには１−置換ピラゾールカルボキサミドが開示され、例示もされている。
ＵＳ６,１２７,３８２、ＷＯ ０１/７０６６８、ＷＯ ００/６８１９１、ＷＯ ９７/４８６７２、ＷＯ ９７/１９０５２およびＷＯ ９７/１９０６２（すべてアラガン(Allergan)）には、癌を含む様々な過剰増殖疾患を処置する際に使用するレチノイド様活性を有する化合物がそれぞれ記載されている。
ＷＯ ０２/０７０５１０（バイエル）には、心臓血管疾患の処置に使用するための、一群のアミノ−ジカルボン酸化合物が記載されている。ピラゾールが一般的に言及されているにもかかわらず、この文献にはピラゾールの明確な具体例はない。
ＷＯ９７/０３０７１（クノールＡＧ）は、中枢神経系疾患の処置に使用するための、一群のヘテロシクリル−カルボキサミド誘導体が開示されている。複素環基の例としてはピラゾールが一般的に言及されているが、しかし特定のピラゾール化合物は開示も例示もなされていない。
ＷＯ ９７/４００１７（ノボ・ノルディスク）には、プロテインチロシンホスファターゼの調節剤である化合物が記載されている。
ＷＯ ０３/０２０２１７（コネティカット大学）には、神経学的状態を処置するためのカンナビノイド受容体調節剤として、一群のピラゾール３−カルボキサミドが開示されている。この化合物が癌化学療法に使用できることが言及されている(１５頁)が、しかしこの化合物が抗癌剤として活性かどうか、または、それらが他の目的のために投与されるかどうか明らかにされていない。
ＷＯ ０１/５８８６９（ブリストル−マイヤーズスクイブ）には、とりわけ、様々な疾患を処置するために使用できるカンナビノイド受容体調節剤が開示されている。癌の処置に言及されているけれども、想定される主たる使用は呼吸器疾患の処置である。
ＷＯ ０１/０２３８５（アベンティス・クロップ・サイエンス）には、抗真菌剤として１−(キノリン−４−イル)−１Ｈ−ピラゾール誘導体が開示されている。１−非置換ピラゾールが合成中間体として開示されている。
ＷＯ ２００４/０３９７９５(Fujisawa)には、アポリポタンパク質Ｂ分泌の阻害剤として１−置換ピラゾール基を含むアミドが開示されている。この化合物は、高脂血症のような状態を処置するのに役立つと述べられている。
ＷＯ ２００４/０００３１８(セルラー・ジェノミックス)には、キナーゼ調節剤として様々なアミノ置換された単環が開示されている。化合物の例示にはピラゾールはまったく
ない。
この出願の優先日の後に公開された我々の同時継続中の出願であるＷＯ ２００５/０１２２５６には、３，４−ジ置換ピラゾール化合物が、ＣＤＫおよびＧＳＫ−３ キナーゼ阻害剤として開示されている。
発明の概要
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害または調節活性およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害または調節活性を有しており、このキナーゼによって介在される疾患症状または状態を予防または処置するのに有用であると想定される化合物を提供する。
従って、例えば、本発明化合物は癌を軽減または減少させるのに有用であるということが想定される。
本発明は、一つの局面では、式（Ｉ）：
Figure 2008528466
 ［式中：
Ｒ１は、２，６−ジクロロフェニルであり；
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、いずれも水素であり；
そして、Ｒ３は、基：
Figure 2008528466
 （式中、Ｒ４は、Ｃ１−４アルキルである）である］
の化合物またはその塩、互変異性体、溶媒和物およびＮ−オキシドを提供する。
“アルキル”という用語は、直鎖および分枝状のアルキル基の両方を対象として含む。
このＣ１−４アルキル基は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３またはＣ４アルキル基であり得る。
Ｃ１−４アルキル基の群には、次のサブグループがある：
・Ｃ１−３アルキル基；
・Ｃ１−２アルキル基；
・Ｃ２−３アルキル基；および
・Ｃ２−４アルキル基。
一つの特定のサブグループは、Ｃ１−３アルキル基である。
特定のＣ１−４アルキル基には、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル基がある。
Ｃ１−４アルキル基の別のサブグループは、メチル、エチル、ｉ−プロピルおよびｎ−プロピル基から構成されている。
一つの好ましい基は、メチル基である。
他の特定の基Ｒ４には、エチルおよびイソプロピルがある。
従って、本発明の好ましい化合物は、４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドである。
本発明は、またとりわけ、次のものを提供する：
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態の予防または処置における使用のための本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物。
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態の予防または処置方法であって、その方法が、本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法。
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態の軽減または減少方法であって、その方法が、本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる方法。
・哺乳類の異常細胞増殖を含むか、または哺乳類の異常細胞増殖から生じる疾患または状態を処置する方法であって、その方法が本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物を、哺乳類に異常な細胞増殖を阻止するのに有効な量で投与することを含んでなる方法。
・哺乳類の異常な細胞増殖を含むか、哺乳類の異常な細胞増殖から生じる疾患または状態を軽減または減少処置する方法であって、その方法が本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物を、哺乳類に異常な細胞増殖を阻止するのに有効な量で投与することを含んでなる方法。
・哺乳類の異常な細胞増殖を含むか、哺乳類の異常な細胞増殖から生じる疾患または状態を処置する方法であって、その方法が本明細書に定義されている式（Ｉ）またはその任意のサブグループまたは実施例の化合物を、（ｃｄｋ１またはｃｄｋ２のような）ｃｄｋキナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３活性を阻害するのに有効な量で投与することを含んでなる方法。
・哺乳類の異常な細胞増殖を含むか、哺乳類の異常な細胞増殖から生じる疾患または状態を軽減または減少させる方法であって、その方法が、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物を、（ｃｄｋ１またはｃｄｋ２のような）ｃｄｋキナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３活性を阻害するために有効な量で哺乳類に投与することを含んでなる方法。
・サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３を阻害する方法であって、その方法が、キナーゼを本明細書に定義されている式（Ｉ）または任意の下位群または実施例のキナーゼ阻害化合物と接触させることを含んでなる方法。
・細胞プロセス（例えば、細胞分裂）を、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物を用いて、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の活性を阻害することによって調節する方法。
・本明細書に述べられている疾患状態の予防または処置における使用のための本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物。
・薬剤が本明細書に定義されている任意の一つまたはそれ以上の使用のためである、薬剤を製造するための本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物の使用。
・本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
・本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物および経口投与に適当な形態の薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
・薬剤に使用する、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物。
・サイクリン依存性キナーゼによって介在される疾患症状または状態の診断および処置方法であって、その方法が、（ｉ）患者が患っているあるいは患っているかもしれない疾患または状態がサイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物で処置が可能である疾患または状態であるか否かを決定するために患者をスクリーニングすること；および（ｉｉ）患者がこうして罹患している疾患または状態が示され、その後患者に本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物を投与することを含んでなる方法。
・スクリーニングされ、そしてサイクリン依存性キナーゼに対して活性を有している化合物で処置が可能である疾患または状態を患っているか、または罹患する危険にさらされているとして決定された患者の疾患症状または状態の処置または状態を予防または処置する薬剤を製造するための本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物の使用。
・哺乳類の腫瘍増殖を阻止する際に使用するための、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物。
・腫瘍細胞（例えば、哺乳類の）の増殖を阻止する際に使用するための、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物。
・哺乳類（例えば、ヒト）の腫瘍増殖の阻止方法であって、その方法が、哺乳類（例えば、ヒト）に、有効な腫瘍増殖を阻止する量の本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物を投与することを含んでなる方法。
・腫瘍細胞（例えば、ヒト）の腫瘍細胞増殖の阻止方法であって、その方法が、腫瘍細胞を、有効な腫瘍細胞増殖を阻止する量の本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物またはその任意の下位群または実施例の化合物と接触させることを含んでなる方法。
・上記に述べられている任意の使用および方法のために本明細書で定義されている、本明細書のいずれかに述べられている化合物。
一般的優先物および定義
本出願においては、文脈で別途指示しない限り、式（Ｉ）の化合物の言及は、本明細書で定義されている式（Ｉ）の下位群のすべてを含み、そして、‘下位群’という用語は、本明細書で定義されている優先物、実施形態、実施例および特定化合物をすべて含む。
文脈で別途指示しない限り、本明細書中の式（Ｉ）のいずれの言及もまた、式（Ｉ）の任意の下位群の化合物の言及およびその実施例のいずれかの言及ともみなされるものとする。
塩、溶媒和物、互変異性体、異性体、Ｎ−オキシド、エステル、プロドラッグおよび同位体
式（Ｉ）の化合物およびその下位群の化合物の言及は、また、そのイオン形態、塩、溶媒和物、異性体、互変異性体、Ｎ−オキシド、エステル、プロドラッグ、同位元素および、例えば、下記に議論するようなその保護された形態を含み；好ましくは、その塩または互変異性体、または異性体またはＮ−オキシドまたは溶媒和物；そしてより好ましくは、その塩または互変異性体またはＮ−オキシドまたは溶媒和物が含まれる。
式（Ｉ）の化合物の多くは、塩の形で、例えば、酸付加塩、すなわち、ある場合は、カルボキシラート、スルホナート、およびホスファナート塩のような有機および無機塩基の塩の形で存在することができる。この発明の範囲内のこうした塩のすべておよび式（Ｉ）の化合物の言及には、この化合物の塩形態が含まれる。
本発明の塩は、塩基または酸部分を含む親化合物から、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl(Editor), Camille G. Wermuth(Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388頁 August 2002. に述べられた方法のような通例の化学的方法によって合成することができる。通例、こうした塩は遊離の酸または塩基形態のこうした化合物を、水または有機溶媒中、またはこの二つの混合物中（通例、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体）のしかるべき塩基または酸と反応させることによって製造することができる。
酸付加塩は、広範・多種多様な、無機および有機両方の酸を用いて形成することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、２,２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸(例えば、Ｌ−アスコルビン酸)、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(＋)樟脳酸、カンファー−スルホン酸、(＋)−(１Ｓ)−カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマール酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸(例えば、Ｄ−グルクロン酸)、グルタミン酸(例えば、Ｌ−グルタミン酸)、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、イセチオン酸、(＋)−Ｌ−乳酸、(±)−ＤＬ−乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、(−)−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、(±)−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１,５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、蓚酸、パルミチン酸、パモン酸、リン酸、プロピオン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、(＋)−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸およびバレリアン酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸およびカチオン交換樹脂を用いて形成される塩が含まれる。
特定の群の塩には、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマール酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸（メシラート）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、バレリアン酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、およびラクトビオン酸から形成される塩が含まれる。
一つの下位群の塩には、塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、アジピン酸、Ｌ−アスパラギン酸およびＤＬ−乳酸から形成される塩が含まれる。
別の下位群の塩には、酢酸塩、メシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ＤＬ−乳酸塩、アジピン酸塩、Ｄ−グルグロン酸塩、Ｄ−グルコン酸塩、および塩酸塩が含まれる。
本明細書に説明されている式（Ｉ）の化合物およびその任意の下位群および実施例の化合物の液体（例えば、水溶性）組成物の製造に使用するための特定の塩は、所与の液体担体（例えば、水）中、１０μｇ/ｍｌ以上（液体担体）（例えば、水）、より典型的には、０．５ｍｇ/ｍｌ以上、そして好ましくは１ｍｇ/ｍｌより大きい溶解度を有する塩である。
本発明の一つの実施形態では、１０μｇ/ｍｌ（液体担体）（例えば、水）、より典型的には、０．５ｍｇ/ｍｌ以上、そして好ましくは１ｍｇ/ｍｌより高い濃度で塩の形態で本明細書に説明されている式（Ｉ）の化合物およびその任意の下位群および実施例の化合物を含んでいる水溶液を含んでなる医薬組成物を提供する。
化合物が、アニオンである場合、またはアニオンであり得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−になり得る）を有している場合は、その場合は塩が適当なカチオンで形成される。適当な無機カチオンの例としては、Ｎａ＋およびＫ＋のようなアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のようなアルカリ土類金属カチオン、およびＡｌ３＋のような他のカチオンが含まれるが、これらに限定はされない。適当な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４ ＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２ ＋、ＮＨＲ３ ＋、ＮＲ４ ＋）が含まれるが、これらに限定されない。適当な置換アンモニウムイオンのいくつかの例を挙げれば、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン並びにリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸から誘導される置換アンモニウムイオンがある。普通の四級アンモニウムイオンの例には、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋がある。
式(Ｉ)の化合物がアミン官能基を含む場合、これらは、例えば、当業者にとってよく知られている方法によるアルキル化剤を用いる反応に従って、四級アンモニウム塩を形成することができる。こうした四級アンモニウム化合物は、式(Ｉ)の範囲内である。
本発明の化合物の塩の形態は、一般に薬学的に許容される塩であり、そして、薬学的に許容される塩の例は、Berge et al., 1977, “Pharmaceutically Acceptable Salts,” J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19において述べられている。しかしながら、薬学的に許容されない塩もまた、薬学的に許容される塩にその次に変換できる中間体として製造できる。例えば、本発明の化合物の精製または分離に役立つことができる、この種の薬学的に許容されない塩の形もまた、本発明の一部を形成する。
アミン官能基を含む式（Ｉ）の化合物もまた、Ｎ−オキシドを形成できる。アミン官能基を含む式（Ｉ）の化合物の本明細書での言及も、またＮ−オキシドを含む。
化合物がいくつかのアミン官能基を含んでいる式(Ｉ)の化合物は、一つまたはそれ以上の窒素原子が酸化され、Ｎ−オキシドを形成することができる。Ｎ−オキシドの特定の例は、三級アミンのＮ−オキシドであるか、または窒素含有複素環の窒素原子のＮ−オキシドである。
Ｎ−オキシドは、対応するアミンを過酸化水素または過酸のような酸化剤(例えば、過酸化カルボン酸)で処理することによって形成できる、例えば、Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages参照。より詳しくは、Ｎ−オキシドは、アミン化合物を、例えば、ジクロロメタンのような不活性溶媒中でｍ−クロロ過酸化安息香酸(ＭＣＰＢＡ)と反応させる、L. W. Deady (Syn. Comm. 1977, 7, 509-514)の手順によって製造できる。
式(Ｉ)の化合物は、多くの様々な幾何学的な異性体および互変異性体の形で存在でき、そして、式(Ｉ)の化合物の言及はこうした形態をすべて含む。不確かなことを避けるために、化合物がいくつかの幾何学的な異性体または互変異性体の形のうちの一つとして存在でき、そして、一つだけが具体的に記載され、または示される場合である場合であっても、しかしながら他のものもすべて式(Ｉ)によって包含される。
例えば、式(Ｉ)の化合物において、ピラゾール環は、下記の二つの互変異性体ＡおよびＢが存在する。簡単にするため、一般式(Ｉ)は、形状Ａを図解するが、しかしその式は両方の互変異性体の形を包含するとみなすべきである。
Figure 2008528466
互変異性体の形の他の例は、例えば、次の互変異性体の対：ケト/エノール(下記に図解される)、イミン/エナミン、アミド/イミノアルコール、アミジン/アミジン、ニトロソ/オキシム、チオケトン/エンチオール、およびニトロ/アシ−ニトロ(aci-nitro)におけるように、具体的にケト−、エノール−、およびエノラート−の形態を含む。
Figure 2008528466
式(Ｉ)の化合物が１またはそれ以上のキラル中心（例えば、Ｒ４が２−ブチルである化合物の場合のように）を含み、そして二つまたはそれ以上の光学異性体の形で存在できる場合、文脈に特段の定めをしない限り、式(Ｉ)の化合物の言及は、個々の光学異性体、または混合物(例えば、ラセミ混合物)か、または二つまたはそれ以上の光学異性体のように、その光学的異性体の形態(例えば、エナンチオマー、エピマーおよびジアステレオアイソマー)のすべてを含む。
光学異性体は、それらの光学活性(すなわち、＋および−異性体、またはｄおよびｌ異性体として)によって特徴付けられ、そして同定でき、または、それらは、Cahn, Ingold and Prelogによって開発された“ＲおよびＳ”命名法を使用して、それらの絶対的立体化学面から特徴付けられる、Advanced Organic Chemistry by Jerry March, 4th Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, pages 109-114参照、およびまた、Cahn, Ingold & Prelog, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1966, 5, 385-415参照。
光学異性体はキラルクロマトグラフィー(キラル支持体を用いるクロマトグラフィー)を含む多くの技法によって分離でき、そして、この種の技法は当業者にとって周知である。
キラルクロマトグラフィーの代替手段として、光学異性体は、（＋）−酒石酸、（−）−ピログルタミン酸、（−）−ジ−トルオイル−Ｌ−酒石酸、（＋）−マンデル酸、（−）−リンゴ酸、および（−）−カンファースルホン酸のようなキラル酸で、ジアステレオマー塩を形成させ、このジアステレオアイソマーを選択的結晶化によって分離し、次いでこの塩を解離し、個々の遊離塩基のエナンチオマーを生じさせることによって分離することができる。
式(Ｉ)の化合物が二つまたはそれ以上の光学的異性体形態として存在する場合、一対のエナンチオマーの一つのエナンチオマーが、他方のエナンチオマーより利点（例えば生物活性の面で）を示すことがあり得る。従って、ある状況では、一対のエナンチオマーの一つのみ、または複数のジアステレオアイソマーの一つのみを治療薬として使用することが望ましいことがあり得る。それ故、本発明は、一つまたはそれ以上のキラル中心を有する式(Ｉ)の化合物を含んでなる組成物を提供し、そこでは、式(Ｉ)の化合物の少なくとも５５％(例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％)が単一の光学異性体(例えば、エナンチオマーまたはジアステレオアイソマー)として存在する。一つの一般的な実施態様において、式(Ｉ)の化合物の総量の９９％またはそれ以上(例えば、実質的に全て)が、単一の光学異性体(例えば、エナンチオマーまたはジアステレオアイソマー)として存在してもよい。
本発明の化合物は、一つまたはそれ以上の同位体置換した化合物を含み、そして特定の元素の言及は、その範囲内にその元素の同位体のすべてを含む。例えば、水素の言及は、その範囲内に１Ｈ、２Ｈ(Ｄ)、および３Ｈ(Ｔ)を含む。同様に、炭素および酸素の引用は、その範囲内に、１２Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃ、そして１６Ｏおよび１８Ｏをそれぞれ含む。
同位体は、放射性があってよいし、または非放射性であってもよい。本発明の一つの実施態様においては、化合物は放射性同位体を含まない。こうした化合物は、治療の用途のために好ましい。しかしながら、もう一つの実施態様では、化合物は一つまたはそれ以上の放射性同位体を含んでいてもよい。こうした放射性同位体を含んでいる化合物は、診断の関連で有用であり得る。
カルボン酸基またはヒドロキシル基を持っている式(Ｉ)の化合物のカルボン酸エステルおよびアシルオキシエステルのようなエステル類もまた式(Ｉ)によって包含される。エステル類の例は、基−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲを含んでいる化合物であり、ここでＲは、エステル置換基、例えば、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−２０複素環基またはＣ５−２０アリール基、好ましくはＣ１−７アルキル基である。エステル基の具体例は、これらに限定されるものではないが、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＣＨ３、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ(＝Ｏ)ＯＣ(ＣＨ３)３、および−Ｃ(＝Ｏ)ＯＰｈを含む。アシルオキシ(逆エステル)基の例は、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｒによって示され、そこでは、Ｒはアシルオキシ置換基、例えば、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−２０複素環基またはＣ５−２０アリール基、好ましくはＣ１−７アルキル基である。アシルオキシ基の具体例は、これに限定されるものではないが、−ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ３(アセトキシ)、−ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｃ(ＣＨ３)３、−ＯＣ(＝Ｏ)Ｐｈおよび−ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ２Ｐｈを含む。
いかなる多形態形の化合物、溶媒和物(例えば、水和物)、化合物の複合体(例えば、シクロデキストリンのような化合物との複合体包接化合物、あるいは金属との複合体を含む)、および化合物のプロドラッグもまた式(Ｉ)によって包含される。“プロドラッグ”とは、例えば、生体内で式(Ｉ)の生物学的活性化合物に変換される任意の化合物を意味する。
例えば、いくつかのプロドラッグには、活性化合物のエステル類(例えば、生理的に許容される代謝的に変化しやすいエステル)がある。代謝中に、エステル基(−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ)は切断されて活性薬物を与える。例えば、こうしたエステル類は、親化合物におけるいずれかのカルボン酸基(−Ｃ(＝Ｏ)ＯＨ)に、必要に応じて、親化合物に存在するいずれかの他の反応性基を事前に保護した上、エステル化を行い、必要であれば、引き続いて脱保護を続けることにより形成できる。
こうした代謝的に変化しやすいエステル類の例には、式−Ｃ(＝Ｏ)ＯＲのエステル類が含まれる：
ここでＲは：
Ｃ１−７アルキル(例えば、−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＰｒ、−ｉＰｒ、−ｎＢｕ、−ｓＢｕ、−ｉＢｕ、−ｔＢｕ)；
Ｃ１−７アミノアルキル(例えば、アミノエチル；２−(Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノ)エチル；２−(４−モルホリノ)エチル)；そして、
アシルオキシ−Ｃ１−７アルキル(例えば、アシルオキシメチル；アシルオキシエチル；ピバロイルオキシメチル；
アセトキシメチル；
１−アセトキシエチル；
１−(１−メトキシ−１−メチル)エチル−カルボニルオキシエチル(carbonxyloxyethyl)；
１−(ベンゾイルオキシ)エチル；イソプロポキシ−カルボニルオキシメチル；
１−イソプロポキシ−カルボニルオキシエチル；シクロヘキシル−カルボニルオキシメチル；
１−シクロヘキシル−カルボニルオキシエチル；
シクロヘキシルオキシ−カルボニルオキシメチル；
１−シクロヘキシルオキシ−カルボニルオキシエチル；
(４−テトラヒドロピラニルオキシ)カルボニルオキシメチル；
１−(４−テトラヒドロピラニルオキシ)カルボニルオキシエチル；
(４−テトラヒドロピラニル)カルボニルオキシメチル；そして
１−(４−テトラヒドロピラニル)カルボニルオキシエチル
である。
また、いくつかのプロドラッグの中には、酵素的に活性化すると活性化合物が生じ、または、更に化学反応により、活性化合物(例えば、ＡＤＥＰＴ、ＧＤＥＰＴ、ＬＩＤＥＰＴ、など)を生じる化合物を生成することもある。例えば、プロドラッグは、糖誘導体または他の配糖体接合体(glycoside conjugate)であってもよいし、あるいはアミノ酸エステル誘導体であってもよい。
生物学的活性
式（Ｉ）およびその下位群の化合物は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤である。例えば、本発明化合物は、サイクリン依存性キナーゼ、そして特にＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ９から選択されるサイクリン依存性キナーゼ（より詳細にはＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５およびＣＤＫ９から選択される）の阻害剤である。
好ましい化合物は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ９から選択される一つまたはそれ以上のＣＤＫキナーゼ（例えば、ＣＤＫ１および/またはＣＤＫ２）を阻害する化合物である。
本発明化合物はまた、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）に対する活性を有する。
ＣＤＫおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼを調節しまたは阻害する際のこうした活性の結果として、これらは異常分裂細胞における細胞周期の進行を止めるか、または細胞周期の制御を回復させる手段を提供するのに有用であることが期待される。それ故、この化合物は、癌のような増殖疾患を処置し、または予防する際に有用であることが判明するであろう。また、本発明化合物がウイルス性感染症のような状態、タイプＩＩまたは非インシュリン依存性糖尿病、自己免疫疾患、頭部外傷、卒中、癲癇、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病のような神経細胞変性疾患、例えば、自己免疫疾患および神経変性疾患を処置するのに有用であることが想定される。
本発明化合物が有用であると想定される、一つの下位群の疾患状態および状態は、ウイルス感染症、自己免疫疾患および神経細胞変性疾患から構成される。
ＣＤＫは、細胞周期、アポトーシス、転写、分化およびＣＮＳ機能の制御に役割を演じる。それ故、ＣＤＫ阻害剤は、癌のように、増殖、アポトーシス、または分化の異常がある疾患の処置に有用であり得る。特に、ＲＢ＋ｖｅ腫瘍はＣＤＫ阻害剤に特別に感受性があり得る。ＲＢ−ｖｅ腫瘍はまたＣＤＫ阻害剤にも感受性があり得る。
阻害できる癌の例は、これらに限定されるものではないが、癌、例えば、膀胱、乳房、大腸の癌(例えば、大腸腺癌および大腸腺腫のような結腸直腸癌)、腎臓、表皮、肝臓、肺の癌（例えば、腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、食道、胆嚢、卵巣、膵臓の癌（例えば、外分泌性膵癌）、胃、頸部、甲状腺、前立腺または皮膚の癌（例えば、扁平上皮癌）を含む；リンパ血統の造血腫瘍（例えば、白血病、急性リンパ球白血病、慢性リンパ球白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫またはバーケットリンパ腫；脊髄血統の造血腫瘍（例えば、急性および慢性骨髄性白血病、脊髄形成異常症候群またはプロ骨髄性白血病）；甲状腺小胞癌；間充織起源腫瘍、例えば、線維肉腫または横紋筋肉腫(habdomyosarcoma)；中枢または末梢神経系腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫または神経鞘腫）；黒色腫；精上皮腫；奇形癌；骨肉腫；色素性乾皮症；角化棘細胞腫(keratoctanthoma)；甲状腺小胞癌；またはカポジ肉腫を含む。
癌はＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５およびＣＤＫ６から選択されるいずれかの一つまたはそれ以上のサイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５（例えばＣＤＫ１および/またはＣＤＫ２）から選択される、一つまたはそれ以上のＣＤＫキナーゼ）の阻害に感受性がある癌であり得る。
特定の癌がサイクリン依存性キナーゼの阻害に感受性がある癌であるかどうかは、下の実施例に記載の細胞増殖アッセイによって、または表題「診断方法」の段落に記載の方法によって決定できる。
ＣＤＫは、また、アポトーシス、増殖、分化および転写において役割を果たすことで知られており、従ってＣＤＫ阻害剤は、また、癌以外の下記の疾患の処置に役立つであろう；ウイルス感染症、例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、シンドビスウイルス、アデノウイルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶおよびＨＣＭＶ；ＨＩＶ感染個体のエイズ進行の防止；慢性炎症性疾患、例えば、全身エリテマトーデス、自己免疫介在糸球体腎炎、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患および自己免疫糖尿病；心臓血管疾患、例えば、心肥大、再狭窄、アテローム性動脈硬化症；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、エイズ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄筋萎縮および小脳性退化；糸球体腎炎；脊髄形成異常症候群、虚血性損傷に伴う心筋梗塞、卒中および再還流損傷、不整脈、アテローム性動脈硬化症、毒素誘発またはアルコール関連肝疾患、血液病、例えば、慢性貧血症および無形成性貧血；筋骨格系の変性疾患、例えば、骨粗鬆症および関節炎、アスピリン過敏副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎臓病および癌疼痛。
また、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の中には、他の抗癌剤と組み合わせて使用できるものがあることも見出された。例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドール(flavopiridol)は、併用療法において他の抗癌剤と共に使用されている。
したがって、異常細胞増殖を含んでなる疾患または状態を処置する本発明の医薬組成物、使用または方法において、一つの実施態様における異常細胞増殖を含んでなる疾患または状態は、癌である。
癌の一つの群には、ヒト乳癌(例えば、原発性乳房腫瘍、リンパ節転移陰性乳癌、乳房の浸潤性導管腺癌、非子宮内膜乳癌)；およびマントル細胞リンパ腫が含まれる。加えて、他の癌には、結腸直腸および子宮内膜癌がある。
他の下位組の癌には、リンパ系の造血器腫瘍、例えば、白血病、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型細胞型リンパ腫）が含まれる。
一つの特定の癌は、慢性リンパ性白血病である。
別の特定の癌は、マントル細胞リンパ腫である。
別の特定の癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
別の下位組の癌には、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、食道癌、扁平上皮癌および非小細胞肺癌が含まれる。
サイクリン依存性キナーゼおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害剤としての本発明の化合物の活性は、下記の実施例に述べられているアッセイを使用して測定できる、そして、所与の化合物によって示される活性のレベルは、ＩＣ５０値の点から見て定義できる。本発明の好適な化合物は、ＩＣ５０値 １マイクロモル未満、より好ましくは、０.１マイクロモル未満を有している化合物である。
本発明化合物の利点
本明細書中で定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物、例えば、化合物、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドは、先行技術化合物より有利な点を有している。
おそらく、本発明化合物は、経口摂取に適当な生理学的特性を有している。
本発明化合物は、ＨＣＴ−１１６細胞では、増殖の場合のＩＣ５０に比較して、より高い転写の場合のＩＣ５０を有しており：すなわち、例えば、転写の場合のＩＣ５０は、増殖の場合のＩＣ５０と比較して、〜１００倍高い。このことは、化合物がより良好な耐容性を示し、したがって、より高い用量で且つ長期間投与することを可能にするという点で有利である。
特に、式（Ｉ）の化合物は、先行技術化合物と比較して、改善された経口生物学的利用性を示す。経口生物学的利用性は、経口ルートによって投与されるときの化合物の血漿曝露(plasma exposure)の、静脈(i.v.)ルートによって投与されるときの化合物の血漿曝露に対する比率（Ｆ）として定義することができ、それはパーセントで表される。
３０％以上、より好ましくは、４０％を越える経口生物学的利用性（Ｆ値）を有する化合物は、非経口投与のみならず、むしろ経口投与することができるという意味で特に有利である。
化合物、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドは、例えば、マウスに経口ルートによって投与する場合に、４０〜５０％の生物学的利用性を有している。
本発明化合物、例えば、化合物、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドは、イン・ビトロにおいて癌細胞株に対してより高いキナーゼ（ＣＤＫ２）阻害活性およびより効果のある抗増殖効果を有している。加えて、この化合物は、ＧＳＫ３βに対してより低い活性を有しており、そして、ＧＳＫ３βに比べてＣＤＫ２に対してより選択的である。
それ故、この化合物の作用は、ＣＤＫ阻害を介して細胞周期によって支配されており、そして、例えば、インスリン感受性、増殖因子作用に対するＧＳＫ３ベータ阻害の付加的な結果によって複雑化されない。この化合物は、よりクリーンな細胞周期阻害プロフィルを有しており、ＧＳＫ３ベータによる付加的な効果からの副作用をほとんど有していない。化合物、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドの、その２，６−ジフルオロベンゾイルアミノ・アナログの特性との生物学的特性の比較は下記の実施例１１中に説明されている。
式（Ｉ）の化合物の製造方法
この段落においては、特に文脈に特段の定めをしない限り、この出願の他の段落のすべてと同様に、式(Ｉ)の言及は、また、本明細書に定義されているように、その下位群および実施例のすべてを含むものである。基Ｒ１およびＲ３または任意の他の“Ｒ”基の言及がなされている場合は、当該基の定義は、特に文脈で特段の定めをしない限り上記に説明され、そしてこの出願の次の段落中で述べられている通りである。
式（Ｉ）の化合物は、当業者によく知られている合成方法に従い、そして、下記に述べられている方法により、そして我々の出願であるＰＣＴ/ＧＢ２００４/００３１７９（ＷＯ ２００５/０１２２５６）（この内容は、引用によって本明細書に込みこまれている）に述べられているように、製造することができる。
例えば、式（Ｉ）の化合物は、スキーム１に示されている反応の順序によって製造することができる。
スキーム１に示されている合成ルートの出発物質は、商業的に得ることができるか、または該当する４−無置換ピラゾールカルボキシ化合物のニトロ化によって製造することができる、４−ニトロ−ピラゾール−３−カルボン酸（Ｘ）である。
Figure 2008528466
ニトロ−ピラゾールカルボン酸（Ｘ）を対応するエステル（ＸＩ）、例えば、メチルまたはエチルエステル（そのエチルエステルが示されている）に、酸触媒または塩化チオニルの存在下でエタノールのようなしかるべきアルコールと反応させることによって、変換させる。この反応は溶媒としてエステル化するアルコールを用いて、周囲温度で行うことができる。
このニトロ−エステル（ＸＩ）は、ニトロ基をアミノ基に変換するための標準的な方法によって対応するアミン（ＸＩＩ）に還元することができる。すなわち、例えば、ニトロ基はパラジウム・炭触媒で水素添加することによってアミンに還元することができる。この水素添加反応は、周囲温度で、エタノールのような溶媒中で行うことができる。
この結果生じたアミン（ＸＩＩ）は、トリエチルアミンのような直接関与しない塩基の存在下で、式 Ｒ１ＣＯＣｌの酸クロリドと反応せしめてアミド（ＸＩＩＩ）に変換せしめる。この反応は、室温付近でジオキサンのような極性溶媒中で行われる。この酸クロリドは、カルボン酸 Ｒ１ＣＯ２Ｈを塩化チオニルで処理するか、あるいは、触媒量のジメチルホルムアミドの存在下で塩化オキサリルと反応させるか、あるいは、酸のカリウム塩を塩化オキサリルと反応させることによって製造することができる。
上記に述べられた酸クロリド法を用いる代替手段としては、このアミン（ＸＩＩ）を、ペプチド結合の形成の際に通例使用される種類のアミドカップリング剤の存在下でカルボン酸 Ｒ１ＣＯ２Ｈと反応させることによってアミド（ＸＩＩＩ）に変換することができる。こうした試薬の例には、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）(Sheehan et al., J. Amer. Chem Soc. 1955, 77, 1067)、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（本明細書ではＥＤＣまたはＥＤＡＣと称するが、本技術分野ではＥＤＣＩおよびＷＳＣＤＩとしても知られている）(Sheehan et al;, J. Org. Chem., 1961, 26, 2525)、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）のようなウロニウムを主材料とするカップリング剤(uronium-based coupling agents)そして１−ベンゾ−トリアゾリルオキシトリス−（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）(Castro et al, Tetrahedron Letters, 1990, 31, 205)のようなホスホニウムを主材料とするカップリング剤が含まれる。カルボジイミドを主材料とするカップリング剤は、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）(L. A. Carpino, J. Amer. Chem. Soc., 1993, 115, 4397)または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）(Konig et al, Chem. Ber., 103, 708, 2024-2034)との組み合わせで有利に使用される。好ましいカップリング剤としては、ＨＯＡｔまたはＨＯＢｔとの組み合わせのＥＤＣ（ＥＤＡＣ）およびＤＣＣが含まれる。
カップリング反応は、通例、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドまたはＮ−メチルピロリジンのような非水性、非プロトン性溶媒中または水溶性溶媒中（所望により、一つまたはそれ以上の混和性の共溶媒と一緒に）で行われる。この反応は、室温で行うか、または反応物が反応性がより低い場合（例えば、スルホンアミド基のような電子吸引基を持っている電子不足なアニリンの場合）は、適当な高い温度で行う。この反応は、例えば、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンのように、妨害しない塩基(non-interfering base)の存在下で行われる。
次にアミド（ＸＩＩＩ）を、水酸化ナトリウムのような水溶性アルカリ金属水酸化物で処理して、カルボン酸（ＸＩＶ）に加水分解する。このケン化(saponification)反応は、アルコール（例えば、メタノール）のような有機共溶媒を用いて行われ、そしてこの反応混合物は、通例、例えば、約５０−６０℃までの過度でない温度まで加熱する。
次いでカルボン酸（ＸＩＶ）を、上記で述べたアミド形成条件を用いて、アミンＲ３−ＮＨ２と反応させることによって式（Ｉ）の化合物に変換する。すなわち、例えば、アミドカップリング反応は、ＤＭＦのような極性溶媒中でＥＤＣおよびＨＯＢｔの存在下で行うことができる。
Ｒ２ｂが水素である式（Ｉ）の化合物の別の通例のルートは、スキーム２に示される。
Figure 2008528466
スキーム２において、このニトロ−ピラゾール−カルボン酸（Ｘ）または酸クロリドのようなその活性誘導体を、上記に述べたようなアミド形成条件を用いてアミン Ｒ３−ＮＨ２と反応させ、ニトロ−ピラゾール−アミド（ＸＶ）を生成し、次いでこれをニトロ基を還元する標準的な方法（例えば、上記に述べたようなＰｄ/Ｃ触媒での水素添加を含む方法）を用いて相当するアミノ化合物（ＸＶＩ）に還元する。
次いでこのアミン（ＸＶＩ）を、式 Ｒ１−ＣＯ２Ｈのカルボン酸または酸クロリドまたは酸無水物のようなその活性誘導体とスキーム１に関連して上記に述べたアミド形成条件の下で結合させる。すなわち、例えば、酸クロリドを用いることの代替手段として、このカップリング反応は、ＤＭＦのような溶媒中でＥＤＡＣ（ＥＤＣ）およびＨＯＢｔの存在下で行い、Ｒ２ｂが、水素である式（Ｉ）の化合物に相当する式（Ｉ’）の化合物を生成させる。
式（Ｉ）の化合物は、また、式（ＸＶＩＩ）：
Figure 2008528466
 の化合物からも、例えば、塩化メタンスルホニルのような適当なスルホニル化剤と反応させることによって製造することができる。
式（ＸＶＩＩ）の化合物を式（Ｉ）のスルホニル誘導体に変換することを示す図解した反応順序は、スキーム３に説明されている。
Figure 2008528466
スキーム３に示されているように、Ｒ３がスルホニル基−ＳＯ２Ｒ４（すなわち、式（ＸＩＸ）の化合物）を持っているピペリジン環である式（Ｉ）の化合物は、式（ＸＶＩＩ）の化合物を、ジイソプロピルエチルアミンのような非妨害性塩基の存在下で塩化スルホニル Ｒ４ＳＯ２Ｃｌ（例えば、塩化メタンスルホニル）と反応させることによって製造することができる。この反応は、通例、ジオキサンおよびジクロロメタンのような非水系、非プロトン性溶媒中で室温で行われる。
式 Ｒ４ＳＯ２Ｃｌの塩化スルホニル(sulphonyl chloride)は、商業上の供給源から得ることができるか、またはいくつかの手順によって製造することができる。例えば、塩化アルキルスルホニルは、ハロゲン化アルキルを、水/ジオキサンのような水溶性有機溶媒中で加熱して、亜硫酸ナトリウムと反応させて、対応するスルホン酸を形成させ、引き続いて、ＤＭＦの存在下で塩化チオニルで処理し、塩化スルホニルを生成させる。
別の製造方法では、チオール Ｒ４ＳＨ/Ｒ４ａＳＨは、硝酸カリウムおよび塩化スルフリル(sulphuryl chroride)と反応させ、目的物の塩化スルホニルを生成させることができる。
上記に述べた多くの反応では、反応が分子上の好ましくない位置で起こることを防止するために、一つまたはそれ以上の基を保護する必要があり得る。保護基の例、そして官能基の保護方法、および脱保護方法は、Protective Groups in Organic Synthesis (T. Green and P. Wuts; 3rd Edition; John Wiley and Sons, 1999)において見出すことができる。例えば、アミン基は、アミド(−ＮＲＣＯ−Ｒ)またはウレタン(−ＮＲＣＯ−ＯＲ)として保護することができる［例えば、メチルアミド(−ＮＨＣＯ−ＣＨ３)；ベンジルオキシアミド(−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｃｂｚとして；ｔ−ブトキシアミド(−ＮＨＣＯ−ＯＣ(ＣＨ３)３、−ＮＨ−Ｂｏｃ)；２−ビフェニル−２−プロポキシアミド(−ＮＨＣＯ−ＯＣ(ＣＨ３)２Ｃ６Ｈ４Ｃ６Ｈ５、−ＮＨ−Ｂｐｏｃ)として；９−フルオレニルメトキシアミド(−ＮＨ−Ｆｍｏｃ)として；６−ニトロベラトリルオキシアミド(−ＮＨ−Ｎｖｏｃ)として；２−トリメチルシリルエチルオキシアミド(−ＮＨ−Ｔｅｏｃ)として；２,２,２−トリクロロエチルオキシアミド(−ＮＨ−Ｔｒｏｃ)として；アリルオキシアミド(−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ)として；または２(−フェニルスルホニル)エチルオキシアミド(−ＮＨ−Ｐｓｅｃ)として］。環状アミンおよび複素環Ｎ−Ｈ基のようなアミンの他の保護基には、トルエンスルホニル（トシル）およびメタンスルホニル（メシル）基およびパラ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）基のようなベンジル基が含まれる。カルボン酸基は、エステルとして、例えば、Ｃ１−７アルキルエステル(例えば、メチルエステル；ｔ−ブチルエステル)；Ｃ１−７ハロアルキルエステル(例えば、Ｃ１−７トリハロアルキルエステル)；トリＣ１−７アルキルシリル−Ｃ１−７アルキルエステル；またはＣ５−２０アリール−Ｃ１−７アルキルエステル(例えば、ベンジルエステル；ニトロベンジルエステル)として；または、アミドとして、例えば、メチルアミドとして保護することができる。チオール基は、例えば、チオエーテル(−ＳＲ)として、例えば、ベンジルチオエーテル；アセトアミドメチルエーテル(−Ｓ−ＣＨ２ＮＨＣ(＝Ｏ)ＣＨ３)として保護することができる。
上記に述べられている工程および実施例中で使用されている新規な化学中間体（例えば、新規化合物、式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）および（ＸＶＩ））は、本発明の別の局面である。
精製方法
この化合物は、当業者によく知られているいくつかの方法によって、単離および精製でき、こうした方法の例には、ガスクロマトグラフィー（例えば、フラッシュクロマトグラフィー）のようなクロマトグラフィー技法およびＨＰＬＣが含まれる。分取ＬＣ−ＭＳは、本明細書で述べられた化合物のような小さい有機分子の精製のために使用する標準的でかつ効果的な方法である。液体クロマトグラフィー(ＬＣ)および質量分析(ＭＳ)の方法は、ＭＳによる粗製物質をより適切に分離することおよびサンプルの検出が改善されることがもたらされるために、多様に修正をすることができる。分取グラジエントＬＣ法の最適化は、多様なカラム、揮発性溶出剤および調節剤およびグラジエントを含むであろう。分取ＬＣ−ＭＳ法を最適化し、次いで化合物を精製するためにこれらを使用する方法は、当分野で周知である。こうした方法は、Rosentreter U, Huber U.; Optimal fraction collecting in preparative LC/MS; J Comb Chem.; 2004; 6(2), 159-64 および Leister W, Strauss K, Wisnoski D, Zhao Z, Lindsley C., Development of a custom high-throughput preparative liquid chromatography/mass spectrometer platform for the preparative purification and analytical analysis of compound libraries; J Comb Chem.; 2003; 5(3); 322-9に記載されている。
当業者は記載されているそれらのものの代替のシステムおよび方法を使用することができることを理解できるであろうが、分取ＬＣ−ＭＳによって化合物を精製するこうしたシステムの例は、下記の本出願の実施例の部分で述べられている。特に、本明細書に記載されている逆相法の代わりに、通常相分取ＬＣを主体とした方法が用いられるだろう。このアプローチが小分子の精製に非常に効果的であり、そして溶出剤が陽イオン電子スプレー質量分析と互換性を持つので、大部分の分取ＬＣ−ＭＳシステムは逆相ＬＣおよび揮発性で酸性の調節剤(modifier)を利用する。上述した分析法において概説される、他のクロマトグラフィー溶液、例えば、通常相ＬＣ、あるいは、基本的調節剤などを使用することが、化合物を精製するために代わりに用いられるであろう。
薬剤製剤
活性化合物は単独で投与することが可能であるが、一つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、助剤、賦形剤、希釈剤、増量剤、バッファー、安定剤、保存剤、滑沢剤または、当業者に公知の他の材料、および所望により他の治療または予防剤（例えば、化学療法に伴ういくつかの副作用を減少または軽減する薬剤）と一緒に、少なくとも一つの本発明の活性化合物を含んでなる医薬組成物(例えば、製剤)としてそれを提示することが好ましい。こうした薬剤の特定の例には、制吐剤、および化学療法に伴う好中球減少の期間を阻止しまたは減少させる薬剤および赤血球または白血球細胞レベルの減少から生じる合併症（例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））を阻止する薬剤が含まれる。
このように、本発明は、更に、上述の医薬組成物、および、ひとつまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、バッファー、助剤、安定剤または、本明細書中に記述の、他の材料と一緒に、少なくとも一つの、上述の活性化合物を混合することからなる医薬組成物を製造する方法を提供する。
本明細書中で使用される“薬学的に許容される”という用語は、思慮分別のある医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題または合併症なしに、対象(例えば、ヒト)の組織と接触させる使用に適切である、合理的な利益/危険率に見合った、化合物、材料、組成物および/または投与量の形態に関連する。それぞれの担体、賦形剤、その他は、また、製剤の他の成分と適合性であるという意味において“許容され”なければならない。
従って、更なる局面では、本発明は、本明細書中に定義されている式(Ｉ)の化合物およびその下位群を、医薬組成物の形で提供する。
医薬組成物は、経口、非経口、局所、鼻腔内、眼、耳、直腸、膣内または経皮投与に適した、任意の形状であり得る。組成物が非経口投与を意図している場合、それらは静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下の投与のために、または注射、注入または他の送達手段によって標的器官または組織への直接送達のために製剤化できる。この送達は、ボーラス・インジェクション、短時間注入またはより長期間注入によってなされることができ、そして、受動的送達を介して、または適当な注入ポンプの利用を通じてなされることができる。
非経口投与に適した薬剤製剤には、抗酸化剤、バッファー、細胞発育抑制剤、共溶媒、有機溶媒混合物、シクロデキストリン、複合体生成剤、乳化剤（乳化製剤を形成および安定化用）、リポソーム形成のためのリポソーム構成要素、ポリマーゲルを形成するためのゲル化可能なポリマー、凍結乾燥保護剤およびとりわけ、溶解形態の活性成分を安定化し、製剤を、意図するレシピエントの血液と等張にするための助剤の組み合わせを含むことができる水溶性および非水溶性無菌注入溶液が含まれる。非経口投与用医薬組成物は、または懸濁化剤、および増粘剤を含むことができる水溶性および非水溶性無菌懸濁液の形態をとることもできる(R. G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, Vol 21(2)2004, p201-230)。
イオン化可能な薬剤分子は、薬剤のｐＫａが十分に製剤のｐＨ値から離れている場合は、ｐＨ調整によって所望の濃度に可溶化することができる。許容可能な範囲は、静脈内および筋肉内投与用ではｐＨ２−１２であるが、皮下での範囲は、ｐＨは、２．７−９．０である。この溶液ｐＨは、薬剤の塩の形態、塩酸または水酸化ナトリウムのような強酸/強アルカリ、あるいは、グリシン、シトラート、アセタート、マレアート、サクシナート、ヒスチジン、ホスフェート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、またはカルボナートから形成されるバッファー溶液を含む（これらに限定はされない）バッファーの溶液によって制御される。
水溶液および水溶性有機溶媒/界面活性剤（すなわち、共溶媒）の組み合わせは、しばしば注射可能な製剤に用いられる。注射可能な製剤中に使用されるこの水溶性有機溶媒および界面活性剤には、プロピレングリコール、エタノール、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、グリセリン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ；Pharmasolve)、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ソルトール ＨＳ１５、クレモファーＥＬ(Cremophor EL)、クレモファーＲＨ６０、およびポリソルベート８０が含まれるが、これらに限定はされない。こうした製剤は、通例、注射前に希釈することができるが必ずしも常にではない。
プロピレングリコール、ＰＥＧ ３００、エタノール、クレモファー ＥＬ、クレモファー ＲＨ６０、およびポリソルベート８０は、商業的に入手できる注射可能な製剤中で使用されている完全に有機の水と混和可能な溶媒および界面活性剤であり、互いに組み合わせて使用することができる。この結果生じる有機製剤は、ＩＶ ボーラスまたはＩＶ 注入の前に通例少なくとも２倍に希釈する
あるいは水溶解度増加は、シクロデキストリンを用いて分子複合体を通して達成することができる。
リポソームは、外側の脂質二重層膜と内部の水のコア(core)から成る、全体の直径が＜１００μｍである密閉された球状の小胞である。薬剤がカプセルに封入されるか、またはリポソーム内に挿入されている場合、疎水性のレベル次第で、適度の疎水性薬剤はリポソームによって可溶化することができる。疎水性薬剤は、また、薬剤分子が脂質二重層膜の構成部分になる場合、リポソームによって可溶化することができ、そして、このような場合、疎水性薬剤は、脂質二重層の脂質部分に溶解される。通例のリポソーム製剤は、水を、−５−２０ｍｇ/ｍｌでリン脂質、等張化剤(isotonicifier)、ｐＨ５−８バッファー、および所望によりコレステロールと共に含む。
製剤は、一回用量(unit-dose)または多数回容量(multi-dose)容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに供給することができ、そして、滅菌した液体担体、例えば、使用前に速やかに注射用水を添加することだけを必要とする凍結乾燥条件で保存することができる。
医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物またはその酸付加塩を凍結乾燥することによって製造することができる。凍結乾燥(Lyophilisation)は、組成物を凍結乾燥(freeze-drying)する手順を意味する。それ故、フリーズドライングとリオフィリゼーションは、本明細書では同義語として使用される。通例の工程では、化合物を可溶化することであり、そしてこの結果生じた製剤を不純物を除き、無菌ろ過し、そして、凍結乾燥に適当な容器（例えば、バイアル）に無菌で移す。バイアルの場合、それらは部分的に凍結乾燥栓(lyo-stoppers)で栓をする。この製剤は、凍結するまで冷却することができ、そして、標準的な条件のもとで凍結乾燥を付し、次に密閉栓とし、安定な乾燥凍結製剤とすることができる。この組成物は、通例、低い残存水含量、例えば、凍結乾燥物の質量を基準にして５％以下、例えば、１％以下（重量）を有するであろう。
凍結乾燥製剤は、他の賦形剤、例えば、増粘剤、分散剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、および等張化剤を含むことができる。通例の緩衝剤には、ホスフェート、アセタート、シトラートおよびグリシンが含まれる。抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム(sodium bisulphite)、メタ重亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、チオ尿素、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシルアニソール、およびエチレンジアミンテトラ酢酸塩が含まれる。保存剤は、安息香酸およびその塩、ソルビン酸およびその塩、パラ−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化セチルピリジニウムを含むことができる。上記に言及した緩衝剤およびデキストロースおよび塩化ナトリウムは、必要ならば、等張化剤に使用することができる。
凍結乾燥技術では、通例、増量剤が、工程を容易にし、および/または凍結乾燥ケークに対するバルクおよび/または機械的結着性を提供するために使用される。増量剤は、化合物またはその塩を用いて共凍結乾燥した場合に、物理的に安定な凍結乾燥ケーク、より最適の凍結乾燥工程および急速・完全な復元を提供する、水に溶けやすい、固体の粒子希釈剤である。この増量剤もまた、溶液を等張化するのに利用することができる。
水溶性増量剤は、通例、凍結乾燥に使用される任意の薬学的に許容される不活性固体材料であり得る。こうした増量剤には、例えば、グルコース、マルトース、スクロースおよび乳糖のような糖類；ソルビトールまたはマンニトールのようなポリアルコール；グリシン、のようなアミノ酸；ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidine)のようなポリマー；およびデキストランのようなポリサッカライドが含まれる。
増量剤・重量の活性化合物・重量に対する割合は、通例、約１〜約５までの範囲内、例えば、約１〜３、例えば、約１〜２の範囲内である。
あるいは、それらは、濃縮し、適当なバイアル中に密封することができる溶液形態で提供することができる。投与形態の滅菌は、ろ過を介して、または製剤工程の適当なステージでバイアルおよびその内容物のオートクレービングによって行うことができる。提供された製剤は、例えば、希釈液を適当な滅菌注入パックに供給する前、更に希釈または調製を必要とし得る。
即時注射溶液(extemporaneous injection)および懸濁液は、滅菌パウダー、顆粒および錠剤から製造することができる。
本発明の一つの好ましい実施態様は、医薬組成物が静脈投与、例えば、注射または点滴・注入に適当な形である。
本発明の非経口注入医薬組成物には、また、薬学的に許容される滅菌された水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、および使用直前に復元して滅菌注入可能な溶液または分散液にするための滅菌パウダーが含まれる。適当な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒または賦形剤の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその適当な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、およびオレイン酸エチルのような注射・注入可能な有機エステルが含まれる。例えば、レシチンのような被覆剤を用い、分散液の場合は、必要な粒子サイズを維持し、そして、界面活性剤を用いることによって適当な流動性を保つことができる。
本発明の組成物は、また、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のような補助剤を含むことができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含むことによって確実にすることができる、また、蔗糖、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を含むことも望ましいといえる。注射・注入可能な薬剤形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含めることによって可能である。
化合物が水性媒体中で安定でない場合、あるいは、水性媒体中で溶解度が低い場合は、有機溶媒中で濃縮液として製剤化することができる。次いでこの濃縮液は、水性系でより低い濃度まで希釈することができ、服薬の短時間十分に安定であることができる。それ故、他の局面では、もっぱら一つまたはそれ以上の有機溶媒から構成されている非水性溶液を含んでなる医薬組成物を提供することであり、これは、そのままの状態で投与するか、または、通例は、投与前に、適当なＩＶ賦形剤（生理的食塩水、デキストロース；緩衝剤で処理若しくは非処理）で希釈することができる(Solubilizing excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, 21(2), 2004, p201-230)。溶媒および界面活性剤の例には、プロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、エタノール、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ，Pharmasolve)、グリセリン、クレモファーＥＬ、クレモファーＲＨ６０およびポリソルベートがある。特定の非水性溶液は、７０−８０％プロピレングリコール、および２０−３０％エタノールで構成されている。特定の一つの非水性溶液は、７０％プロピレングリコール、および３０％エタノールで構成されている。もうひとつは、８０％プロピレングリコール、および２０％エタノールである。通例、こうした溶媒は、組み合わせて使用され、通常は、ＩＶボーラスまたはＩＶ注入前に、少なくとも２倍に希釈する。ボーラスＩＶ製剤の標準的な量は、グリセリン、プロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００の場合は、〜５０％であり、エタノールの場合は、〜２０％である。ＩＶ注入製剤の標準的な量は、グリセリンの場合、〜１５％であり、ＤＭＡの場合は、〜３％であり、そしてプロピレングリコール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００およびエタノールの場合は、〜１０％である。
本発明のひとつの好ましい実施態様では、医薬組成物は、静脈内投与、例えば、注射または点滴・注入に適する形態である。静脈投与の場合、溶液は、そのまま投与するか、または投与前に、点滴バッグ（０．９％生理食塩水または５％デキストロースのような薬学的に許容される賦形剤を含んでいる）の中に注入することができる。
もう一つの好ましい実施態様では、医薬組成物は皮下投与に適した形態である。
経口投与に適した薬剤投与形態は、錠剤、カプセル、カプレット、ピル、トローチ錠、シロップ、溶液、散剤、顆粒、エリキシルおよび懸濁液、舌下錠、ウェーハまたはパッチおよび口内パッチを含む。
式(Ｉ)の化合物を含んでいる医薬組成物は、公知の技術に従って製剤化でき、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA参照。
このように、錠剤組成物は、不活性希釈剤または担体、例えば、糖または糖アルコール、例えば；ラクトース、蔗糖、ソルビトールまたはマンニトール；および/または、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムのような無糖誘導希釈剤、またはヒメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロースまたはその誘導体、そしてコーンスターチのような澱粉と一緒に単位投与量の活性化合物を含有できる。錠剤は、また、ポリビニルピロリドンのような結合剤および造粒剤、崩壊剤(例えば、架橋カルボキシメチルセルロースのような膨張可能な架橋ポリマー)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸塩)、防腐剤(例えば、パラベン)、酸化防止剤(例えば、ＢＨＴ)、緩衝剤(例えば、リン酸またはクエン酸塩バッファー)および発泡剤、例えば、クエン酸塩/重炭酸塩混合物のような標準的成分を含むことができる。こうした賦形剤は、周知であり、本明細書で詳細に述べることは必要でない。
カプセル製剤は、ハードゼラチンであってもソフトゼラチンであってもよく、そして活性成分を固体、半固体または液体の形態で含有することができる。ゼラチンカプセルは、動物性ゼラチンまたはその合成または植物由来の等価物から形成することができる。
固体投与形態(例えば；錠剤、カプセルなど)は、被覆してもよいし、または被覆しなくてもよいが、通例、コーティング、例えば、保護フイルムコーティング(例えば、ワックスまたはニス)または放出制御コーティングを有する。コーティング(例えば、オイドラギット（商標）型ポリマー)は、消化管内の所望の位置で活性成分を放出するように設計できる。すなわち、コーティングは、消化管内で特定のｐＨ条件下で分解し、それによって選択的に胃または回腸または十二指腸内中に化合物を放出するように選択することができる。
コーティングの代わりに、またはコーティングに加えて、薬剤は、消化管内の様々な酸性度またはアルカリ度の条件下に化合物を選択的に放出するように調節できる、放出制御剤、例えば、放出遅延剤を含有してなる固体マトリックスとして提供できる。あるいは、マトリックス材料または放出遅延コーティングは、投与形態が消化管を通過するに従って、実質的に連続して浸食される、浸食性ポリマー(例えば、無水マレイン酸ポリマー)という形をとることができる。さらなる別法として、活性化合物は、化合物を放出を浸透圧制御することを提供する、送達システムとして製剤化可能である。浸透圧放出およびその他の遅延放出、または持続性放出製剤は、当業者に周知の方法に従って製造できる。
医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは、約２０％から約９０％の活性成分を含んでなる。本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、座剤、糖衣錠、錠剤またはカプセルのような単位服用形態であることができる。
経口投与用医薬組成物は、活性成分を固体担体と混合し、所望により、この結果生じた混合物を顆粒化し、そしてこの混合物を、所望または必要ならば、適当な賦形剤を加えた後、錠剤、糖衣錠またはカプセルに加工することにより得ることができる。また、これらは、活性成分を拡散させるプラスティック担体に挿入するか、正確に調整された量で放出することも可能である。
本発明化合物はまた、固体分散剤として製剤化することができる。固体分散剤は、二つまたはそれ以上の固体の均一の微細な分散相である。固溶体（分子分散システム(molecularly disperse systems)）は、固体分散の一つの種類であるが、薬剤技術における使用は周知であり(参照(Chiou and Ricegelman, J. Pharm. Sci., 60, 1281-1300(1971))そして、溶解率を向上させ、水にあまり溶解しない薬剤の生物学的利用率を増加させるのに有益である。
薬剤の固体分散は、通例、融解または溶媒蒸発方法によって製造する。融解プロセスでは、通常、実際に半固体および蝋状である材料（賦形剤）を加熱して、薬剤物質を融解および溶解し、引き続いて、非常に低い温度まで冷却し硬化させる。次いでこの固体分散物を微粉状にし、篩い分けし、賦形剤を混和し、そして、ハードゼラチンカプセルの中に封入するか、錠剤に圧縮する。あるいは、界面活性剤および自己乳化性担体を使用すると、固体分散物がハードゼラチンカプセルの中へ溶解物として直接封入される。固体の栓は、溶解物が室温まで冷却されると、このカプセルの中に形成される。
固溶体はまた、薬物および必要な賦形剤を水溶性溶液かまたは薬学的に許容される有機溶媒のどちらかに溶解し、引き続いて、噴霧乾燥のような薬学的に許容される方法を用いて、溶媒を取り除くことによって製造することができる。この結果生じる固体は、必要ならば、粒子サイズにすることができ、所望により、賦形剤と混和し、錠剤にするか、カプセルに充填することができる。
こうした固体分散物または固溶体を製造するための特に適したポリマー補助剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
本発明は、実質的にアモルファスの固溶体を含んでなる医薬組成物を提供し、前記固溶体は、
（ａ）式（Ｉ）の化合物、例えば、実施例１の化合物；そして、
（ｂ）ポリビニルピロリドン（ポビドン）、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリエチレンオキシド、ゼラチン、架橋ポリアクリル酸（カルボマー）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、メタクリル酸共重合体、メタクリレート共重合体、およびメタクリル酸およびメタクリレート共重合体のナトリウムおよびアンモニウム塩、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびアルギン酸プロピレングリコールのような水溶性塩から成る群より選択されるポリマー；（上記において、前記ポリマーに対する前記化合物の割合は、約１：１〜約１：６、例えば、１：３の割合であり、クロロホルムまたはジクロロメタンのうちの一つと、メタノールまたはエタノールのうちの一つの混合物、好ましくは、１：１割合のジクロロメタン/エタノールから噴霧乾燥される）から成る群より選択されるポリマー、
を含んでなる。
この発明はまた、上記に述べたような固溶体を含んでなる固体服薬形態を提供する。個体服薬形態には、錠剤、カプセルおよび咀嚼錠が含まれる。公知の賦形剤は、所望の服薬形態を提供するために固溶体と混和することができる。例えば、カプセルは、（ａ）崩壊剤および滑沢剤、または（ｂ）崩壊剤、滑沢剤および界面活性剤と混和した固溶体を含むことができる。錠剤は、少なくとも一つの崩壊剤、滑沢剤、界面活性剤および流動促進剤(glidant)と混和した固溶体を含むことができる。咀嚼錠は、増量剤、滑沢剤、そして所望により付加甘味料（例えば、人口甘味料）および、適当なフレーバーと混和した固溶体を含むことができる。
この薬剤製剤は、患者に一つの包装、通常、ブリスター包装で全クールの処置を含んでいる“患者パック”の形で、供給することができる。患者パックは、薬剤師がバルク供給から薬剤の患者への供給を分割する、在来の処方指示より、患者が常に患者パックに含まれている能書(package insert)（通例、患者の処方箋はない）を利用する機会を有するという点で利点がある。能書が含まれるということは、医者の指示に患者が従うことを改善するものであることが示されている。
局所使用のための組成物は、軟膏、クリーム、スプレー、パッチ、ゲル類、液体点滴薬および挿入物(例えば、眼内挿入物)を含む。こうした組成物は、公知の方法に従って製剤化できる。
非経口投与のための組成物は、無菌水性または油性の溶液または微細な懸濁液として一般的に提供されるか、あるいは注射用無菌水を用いて即座に作成するために粉砕された無菌粉末形態として提供できる。
直腸または膣内投与のための製剤の例は、例えば、活性化合物を含んでいる成形した成形可能または蝋状材料から形成できる、膣坐薬および坐薬を含む。
吸入による投与のための組成物は、吸入可能な粉末組成物または液体または粉末スプレーの形をとることができ、そして粉吸入装置またはエアゾール分配器具を用いて、標準形態で投与できる。こうした装置は周知である。吸入による投与のために、粉末製剤は、一般的にラクトースのような不活性固体粉末希釈剤と共に活性化合物を含有してなる。
式（Ｉ）の化合物は、通常、単位服薬形態で提供され、そして、それ自体、一般的に、所望のレベルの生物学的活性を提供するのに十分な化合物を含む。例えば、製剤は、１ナノグラムから２グラムまで、例えば、１ナノグラムから２ミリグラムの活性成分を含むことができる。この範囲内で、特に、化合物の下位範囲は、０．１ミリグラムから２グラムの活性成分（より通常的には、１０ミリグラムから１グラム、例えば、５０ミリグラムから５００ミリグラム）、または１マイクログラムから２０ミリグラム（例えば、１マイクログラムから１０ミリグラム、例えば、０．１ミリグラムから２ミリグラムの活性成分）である。
経口組成物の場合は、単位投薬形態は、１ミリグラムから２グラムまでの活性成分、より通例的には１０ミリグラムから１グラム、例えば、５０ミリグラムから１グラム、例えば、１００ミリグラムから１グラムの活性化合物を含むことができる。
活性化合物は、所望の治療効果を達成するのに十分な量で、それを必要とする患者(例えば、ヒトまたは動物の患者)に投与される。
治療方法
本明細書中で定義されている式(Ｉ)およびその下位群の化合物は、サイクリン依存性キナーゼおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される一連の疾患の症状または状態の予防または治療に有用であることが想定される。こうした疾患の症状および状態の例は、上記に説明されている。
化合物は、通例、こうした投与を必要とする対象、例えば、ヒトまたは動物の患者、好ましくはヒトに投与される。
化合物は、通例、治療的または予防的に有用でありそして一般に非毒性である量で投与される。しかしながら、特定の状況(例えば、生命に脅威となる疾患の場合)で、式(Ｉ)の化合物を投与する利点は、いかなる毒性効果もまたは副作用の不利な点より価値が高いことがあり、その場合には、ある程度の毒性を伴う量の化合物を投与することが望ましいと考慮できる場合がある。
化合物は、有益な治療効果を維持するために長期の期間にわたって投与でき、または短い期間だけでも投与できる。あるいは、それらは、規則的(pulsatile)または連続方法で投与できる。
式（Ｉ）の化合物の通例一日量は１００ｐｇ〜１００ｍｇ/ｋｇ体重、より通例的には５ｎｇ〜２５ｍｇ/ｋｇ体重、そしてより通例的には１０ｎｇ〜１５ｍｇ/ｋｇ体重(例えば、１０ｎｇ〜１０ｍｇ)/ｋｇ体重、そしてより通例的には１μｇ/ｋｇ〜２０ｍｇ/ｋｇであり、例えば、１μｇ〜１０ｍｇ/ｋｇ体重）の範囲内にあり得るが、但し、必要な場合、上記より多い量またはより少ない量が投与できる。式（Ｉ）の化合物は、一日ベースまたは反復ベースで、例えば、２、または３、または４、または５、または６、または７、または１０、または１４、または２１、または２８日毎に投与することができる。
本発明化合物は、経口では、投与量が例えば、１〜１５００ｍｇ、２〜８００ｍｇ、または５〜５００ｍｇ、例えば、２〜２００ｍｇまたは１０〜１０００ｍｇの範囲内で投与することができ、投与量の特定の例では、１０、２０、５０および８０ｍｇを含んでいることができる。この化合物は、毎日１回または１回以上投与することができる。この化合物は、連続して投与することができる（すなわち、処置投薬計画の期間中、中断なく毎日投与する）。あるいは、この化合物は、処置投薬計画(treatment regimen)の期間中、断続的に投与することもできる（すなわち、１週間のような所与の期間中は連続投与し、次いで１週間のような期間中止し、次いで例えば、１週間などのような更なる期間は連続的に投与する。断続的投与を含む処理投薬計画の例としては、投与を、一週間投与し、一週間非投与とする周期；または２週間投与し、１週間非投与とする周期；または３週間投与し、１週間非投与とする周期；または２週間投与し、２週間非投与とする周期；または４週間投与し、２週間非投与する周期、または１週間投与し、３週間非投与とする周期があり、一つまたはそれ以上の周期、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０またはそれ以上の周期である投与計画が含まれる。
６０キログラムのヒトに静脈投与する服薬の例は、スタートする用量を４．５−１０．８ｍｇ/６０ｋｇ/日（７５−１８０μｇ/ｋｇ/日に相当）とし、次に有効用量４４−９７ｍｇ/６０ｋｇ/日（０．７−１．６ｍｇ/ｋｇ/日に相当）か、または有効用量７２−２７４ｍｇ/６０ｋｇ/日（１．２−４．６ｍｇ/ｋｇ/日に相当）として、本明細書で定義されている式（Ｉ）の化合物を投与することを含んでなるが、必要な場合は、これより高い用量またはより低い用量で投与することができる。このｍｇ/ｋｇ用量は、所与の体重に比例して調整することになるであろう。
一つの特定の投与量スケジュールでは、患者は、１０日までの場合、毎日１時間の期間、特に１週間に５日まで、式（Ｉ）の化合物の注入・点滴を与えられるであろうが、処置は、２〜４週間、特に３週間ごとのような所望の間隔で繰り返されることになる。
より詳しくは、患者は、５日の場合毎日１時間の期間、式（Ｉ）の化合物の注入・点滴を与えられ得るが、この処置は３週間毎に繰り返される。
別の特定の投薬スケジュールでは、患者は、３０分〜１時間に亘って、注入・点滴を与えられ、引き続いて、様々な期間の注入・点滴（例えば、１〜５時間、例えば、３時間）が維持される。
更に特定の投薬スケジュールでは、患者は、１２時間から５日の期間連続して、特に２４時間〜７２時間まで連続的に注入・点滴が与えられる。
しかしながら、最終的には、投与される化合物の量および使用される組成物の種類は、疾患の性質または処置される生理学的な条件に見合ったおり、そして医師の裁量に委ねられるであろう。
本明細書で定義されている式(Ｉ)および下位群の化合物は単独の治療剤として投与できるし、または、それらは特定の疾患症状の処置のため（例えば、上記に説明した癌のような新生物形成疾患）の処置に一つまたはそれ以上の化合物と組み合わせて治療（併用療法）に投与することができる。本発明化合物と一緒に投与または使用することができる(同時にそれとも様々な時間間隔で)他の治療剤または治療法の例には、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化薬、代謝拮抗物質、ＤＮＡ結合剤および微小管阻害剤(チューブリン標的薬剤)、モノクローナル抗体、およびシグナル伝達阻害剤（特定の例しては、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イリノテカン、フルダラビン、５ＦＵ、タキサン、マイトマイシンＣ）および放射線療法が含まれるが、これに限定されるものではない。
他の治療法と組み合わせるＣＤＫ阻害剤の場合は、二つまたはそれ以上の処置を個々に服薬スケジュールを変更し、そして様々なルートによって提供することができる。
式（Ｉ）の化合物を一つ、二つ、三つ、四つまたはそれ以上の他の治療剤（好ましくは、一つまたは二つ、より好ましくは一つ）と組み合わせた療法で投与する場合は、この化合物は、同時または順に投与することができる。順に投与される場合、それらは、正確な服薬計画を治療薬(複数もある)の特性にあわせて、非常に近い間隔(例えば、５〜１０分間にわたって)か、またはより長い間隔(例えば、１、２、３、４時間またはそれ以上の間隔で、あるいは、必要な場合は、さらにより長い期間離して)で投与できる。
本発明の化合物は、また、非化学療法的処置、例えば、放射線療法、光線力学的療法、遺伝子治療；外科手術および食事療法管理と連携して投与できる。
他の化学療法剤との併用療法に使用の場合、式(Ｉ)の化合物および一つ、二つ、三つ、四つまたはそれ以上の他の治療剤は、例えば、二つ、三つ、四つまたはそれ以上の治療剤を含んでいる投与形態中の一緒に製剤化できる。あるいは、個々の治療剤は、別々に製剤化され、そして、所望によりその使用のための指示書と共に、キットの形で一緒に提供できる。
当業者は、その共通の一般知識を通じて、使用する服薬計画および併用療法を知っている。
診断方法
式(Ｉ)の化合物の投与前に、患者を、患者が罹患しているか、または罹患する可能性がある疾患または状態が、サイクリン依存性キナーゼに対して活性を有する化合物による処置に感受性があるかどうかを決定するためにスクリーニングすることができる。
例えば、患者から採取した生物学的サンプルを、患者が罹患しているか、または罹患する可能性がある疾患または状態、例えば、癌が、ＣＤＫの過度の活性化または正常のＣＤＫ活性に反応して経路の敏感化に至る、遺伝子の異常または異常なタンパク質の発現によって特徴付けられるものであるかどうか決定するために分析できる。ＣＤＫ２シグナルの活性化または敏感化に結びつく、こうした異常の例は、サイクリンＥの上方制御(up-regulation)、(Harwell RM, Mull BB, Porter DC, Keyomarsi K.; J Biol Chem. 2004 Mar 26;279(13):12695-705)またはｐ２１またはｐ２７の損失、またはＣＤＣ４変異体の存在(Rajagopalan H, Jallepalli PV, Rago C, Velculescu VE, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C.; Nature. 2004 Mar 4;428(6978):77-81)を含む。ＣＤＣ４の突然変異体またはサイクリンＥの上方制御、特に過剰発現、またはｐ２１またはｐ２７の欠失を伴う腫瘍は、ＣＤＫ阻害剤に特に感受性がある。用語「上方制御」は、転写効果による遺伝子増幅(すなわち多数の遺伝子コピー)および増加した発現を含んでいる、上昇した発現または過剰発現、ならびに突然変異による活性化を含んでいる、活動亢進および活性化を含む。
このように、患者は、サイクリンＥの上方制御、またはｐ２１またはｐ２７の欠失、またはＣＤＣ４変異体の存在を特徴付ける、マーカーを検出するための診断試験を受けることができる。用語「診断」は、スクリーニングを含む。マーカーは、例えば、ＣＤＣ４の突然変異を識別するためのＤＮＡ構成物の測定を含んでいる遺伝子マーカーを含む。用語マーカーもまた、上述したタンパク質の酵素活性、酵素濃度、酵素状態(例えば、リン酸化されているかどうか)およびｍＲＮＡ濃度を含んでいる、サイクリンＥの上方制御を特徴付ける、マーカーを含む。サイクリンＥの上方制御、またはｐ２１またはｐ２７の欠失を伴う腫瘍は、特にＣＤＫ阻害剤に感受性であり得る。腫瘍は、治療に先立って、サイクリンＥの上方制御またはｐ２１またはｐ２７の欠失の有無をスクリーニングすることが優先されてもよい。このように、患者は、サイクリンＥの上方制御、またはｐ２１またはｐ２７の欠失を特徴付けるマーカーを検出するために、診断試験を受けることができる。
診断試験は、腫瘍生検サンプル、血液サンプル(落ちた(shed)腫瘍細胞の単離および濃縮)、糞生検、痰、染色体分析、胸水、腹膜流体または尿から選択される生物学的サンプルについて一般的に行われる。
ヒト結腸直腸癌および子宮体癌中のＣＤＣ４(別名Ｆｂｗ７またはArchipelago)に突然変異が存在することが分かった(Rajagopalan et al (Nature. 2004 Mar 4;428(6978):77-81))(Spruck et al, Cancer Res. 2002 Aug 15;62(16):4535-9)。ＣＤＣ４の突然変異を有する個体の同定は、その患者が特にＣＤＫ阻害剤による治療に適していることを意味し得る。腫瘍は、処置の前にＣＤＣ４変異体の存在に対して優先してスクリーニングできる。スクリーニングプロセスは、一般的に、直接の塩基配列決定、オリゴヌクレオチドのマイクロアレイ分析または変異体特異的抗体を含む。
タンパク質の突然変異および上方制御についての同定および分析方法は、当業者にとって公知である。スクリーニング方法は、これに限定されるものではないが、標準的方法、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)またはインサイチュハイブリダイゼーション(in situ hybridisation)を含む。
ＲＴ−ＰＣＲによりスクリーニングする際は、腫瘍中のｍＲＮＡの濃度は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作成し、次いでＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅することによって評価される。
ＰＣＲ増幅の方法、プライマーの選択および増幅のための条件は、当業者にとって公知である。核酸操作およびＰＣＲは、例えば、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc.、または Innis, M.A. et-al., eds. PCR Protocols: a guide to methods and applications, 1990, Academic Press, San Diegoに記述の標準的方法によって実施される。核酸技術を含む、反応および操作もまたSambrook et al., 2001, 3rd Ed, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記述されている。
あるいは、ＲＴ−ＰＣＲのための市販のキット(例えば、Roche Molecular Biochemicals)が使用でき、あるいは米国特許４,６６６,８２８；４,６８３,２０２；４,８０１,５３１；５,１９２,６５９；５,２７２,０５７；５,８８２,８６４；および６,２１８,５２９に記載の方法が、ここに引用して組み込まれる。
ｍＲＮＡ発現を評価するためのインサイチュハイブリダイゼーションテクニックの例は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)である(Angerer, 1987 Meth. Enzymol., 152: 649参照)。
通常、インサイチュハイブリダイゼーションは、下記の主要な工程を含む：(１)分析する組織の固定；(２)目標核酸の接近性を増やし、そして非特異的結合を減らすために、サンプルの前ハイブリダイゼーション処理；(３)生物学的構造または組織の核酸に対する核酸混合物のハイブリダイゼーション；(４)ハイブリダイゼーションにおいて結合されていない核酸断片を除くために、ハイブリダイゼーション後の洗浄、そして(５)ハイブリダイズした核酸断片の検出。この種の利用で使用するプローブは、一般的に、例えば、放射性アイソトープまたは蛍光リポーターでラベルする。好適なプローブは、ストリンジェントな条件下で目標核酸による特異的ハイブリダイゼーションを可能にするために、十分に長く、例えば約５０、１００または２００のヌクレオチド〜約１０００またはそれ以上のヌクレオチドまたはそれ以上である。ＦＩＳＨを実施する標準的方法は、Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc 、そして Fluorescence In Situ Hybridization: Technical Overview by John M. S. Bartlett in Molecular Diagnosis of Cancer, Methods and Protocols, 2nd ed.; ISBN: 1-59259-760-2; March 2004, pps. 077-088; Series: Methods in Molecular Medicineに記載される。
あるいは、ｍＲＮＡから発現するタンパク質生成物は、腫瘍サンプルの免疫組織化学、マイクロタイター・プレートを用いる固相免疫検定、ウエスタンブロット法、二次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、および特異的タンパク質検出のための公知技術の他の方法によって検定できる。検出方法は、サイト特異的抗体の使用を含む。当業者は、サイクリンＥの上方制御、またはｐ２１またはｐ２７の損失の検出、またはＣＤＣ４変異体の検出のために、こうした周知技術のすべてが、本件で適用できることを認識する。
従って、こうした技術の全ては、また特に本発明化合物で処置するのに適当な腫瘍を識別するために使用できるであろう。
ＣＤＣ４の変異体またはサイクリンＥの上方制御、特に過剰発現、またはｐ２１またはｐ２７の欠失を有している腫瘍は、特にＣＤＫ阻害剤に感受性があり得る。腫瘍については、サイクリンＥの上方制御、特に過剰発現 (Harwell RM, Mull BB, Porter DC, KeyomarsiK.; J Biol Chem. 2004 Mar 26; 279(13):12695-705)またはｐ２１またはｐ２７の欠失または処置前のＣＤＣ４変異体の有無が優先的にスクリーニングされ得る(Rajagopalan H, Jallepalli PV, Rago C, Velculescu VE, Kinzler KW, Vogelstein B, Lengauer C.; Nature. 2004 Mar 4; 428(6978):77-81)。
マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)患者は、本明細書中に概説される診断試験を使用して、本発明化合物を用いて治療のために選定できるであろう。ＭＣＬは、攻撃的で不治の臨床経過である、ＣＤ５およびＣＤ２０の共発現を伴う、小型〜中型のリンパ球の増殖、および頻繁な転座(１１；１４)(ｑ１３；ｑ３２)によって特徴づけられる、非ホジキン−リンパ腫の明瞭な臨床病理実体である。マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)に見られる、サイクリンＤ１ ｍＲＮＡの過剰発現は、重大な診断用マーカーである。Yatabe et al (Blood. 2000 Apr 1;95(7):2253-61)は、サイクリンＤ１陽性度がＭＣＬの標準基準のうちの一つとして含まれなければならないこと、そして、この不治の疾患の革新的な治療が新しい基準の基礎として探索されなければならないことを提案した。Jones et al (J Mol Diagn. 2004 May;6(2):84-9)は、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)の診断を補助する、サイクリンＤ１(ＣＣＮＤ１)発現のリアルタイムで、定量的な逆転写ＰＣＲ検定法を開発している。Howe et al.(Clin Chem. 2004 Jan;50(1):80-7)は、サイクリンＤ１ ｍＲＮＡ発現を評価するために、リアルタイムで定量的なＲＴ−ＰＣＲを使用し、そしてＣＤ１９ ｍＲＮＡに対して標準化したサイクリンＤ１ ｍＲＮＡのための定量的なＲＴ−ＰＣＲは、血液、髄および組織におけるＭＣＬの診断に使用できることを見出した。あるいは、乳癌患者は、上の診断試験アウトラインを使用する、ＣＤＫ阻害剤による治療のために選択されることができるであろう。腫瘍細胞は共通してサイクリンＥを過剰発現させ、そして、サイクリンＥが乳癌において過剰発現することが示された(Harwell et al, Cancer Res, 2000, 60, 481-489)。従って、乳癌は、本明細書で提供されているように、特にＣＤＫ阻害剤を用いて処置できる。
抗真菌剤としての使用
別の局面おいて、本発明は、本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物の抗真菌剤としての使用を提供する。
本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物は、動物用医薬(例えば、ヒトのような哺乳類の処置において)において、または植物の処置(例えば、農業および園芸において)において、または一般的な抗真菌剤として、例えば、防腐剤および消毒薬として使用できる。
一つの実施態様では、本発明は、哺乳類、例えば、ヒトの真菌感染の予防または処置に使用するために、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物およびその下位群の化合物を提供する。
哺乳類、例えば、ヒトの真菌感染の予防または処置用の使用のための薬剤を製造するための、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物およびその下位群の化合物の使用もまた提供される。
例えば、本発明の化合物は、他の生物の中で、カンジダ種、白癬菌、小胞子菌属または表皮菌属によって引き起こされる局所の真菌感染症、またはカンジダ・アルビカンスによって生じる粘膜感染症(例えば、口腔カンジダ症および膣カンジダ症)に罹患している、またはこれに感染する危険があるヒト患者に投与できる。本発明化合物は、また、例えば、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、黄色アスペルギルス、アスペルギルス・フミガタス、コクシジオジエス、パラコクシジオジエス、ヒストプラスマまたはブラストミセスによって引き起こされる全身性真菌感染症の処置または予防のために投与できる。
別の局面においては、本発明は、農業上許容できる希釈剤または担体と一緒に、本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物を含んでなる、農業上(園芸を含む)の使用のための農業用抗真菌組成物を提供する。
本発明は、更に真菌感染症を有する動物(哺乳類、例えば、ヒトを含む)、植物または種子を処置する方法であって、上述の動物、植物または種子、または上述の植物または種子の遺伝子座(locus)を、有効量の本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物で処置することを含んでなる、上述の動物、植物または種子を処置する方法を提供する。
本発明はまた、植物または種子を抗真菌的に有効量の、本明細書に定義されている式（Ｉ）の化合物および下位群の化合物を含んでいる殺真菌組成物で処置することを含んでなる、植物または種子の真菌感染を処置する方法を提供する。
示差スクリーニングアッセイは、ヒト以外のＣＤＫ酵素のための特異性を有する本発明の化合物を選択するために使用できる。真核生物病原体のＣＤＫ酵素に特異的に作用する化合物は、抗真菌剤または抗寄生虫剤として使用できる。カンジダＣＤＫキナーゼ、ＣＫＳＩの阻害剤はカンジダ症の処置に使用できる。抗真菌剤は、上述の定義の種類の感染症に、または衰弱し、そして免疫抑制した患者、例えば、白血病およびリンパ腫の患者、免疫抑制療法を受けている人々、および、かかりやすい状態の患者、特に糖尿病またはＡＩＤＳならびに非免疫抑制患者に対して、共通して起こる日和見性感染症に対して使用できる。
従来技術において記載されているアッセイは、真菌症、例えば、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、分芽菌症、ゲオトリクム症、クリプトコックス症、クロモ分芽菌症、コクシジオイデス症、分生子柄症、ヒストプラスマ症、マズラミコーシス、リノスポリジウム症、ノカルジア症、パラ放線菌症(para-actinomycosis)、ペニシリウム症、モニリア症またはスポロトリクム症に関係する少なくとも一つの真菌を阻害することに有用であり得る薬剤をスクリーニングするために使用できる。示差スクリーニングアッセイは、イースト、例えば、アスペルギルス・フミガタス、黄色アスペルギルス、黒色アスペルギルス、偽巣性コウジ菌またはアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)からクローンをつくるＣＤＫ遺伝子を利用することによって、アスペルギルス症の処置において治療的な価値を有することができる、抗真菌薬を識別するために使用でき、あるいは、真菌感染症がムコール症,である場合、ＣＤＫ検定はイースト、例えば、リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)、アブシジア・コリンビフェラ(Absidia corymbifera)、アブシジア・ラモサ(Absidia ramosa)またはムコルプシラス(Mucorpusillus)に由来できる。他のＣＤＫ酵素の供給源は、カリニ肺炎病原菌を含む。
例示を通して、化合物の抗真菌性活性の生体外(in vitro)評価は、適当な媒体中で、特定の微生物の増殖ができない、試験化合物の濃度である最小阻害濃度(Ｍ.Ｉ.Ｃ.)を決定することによって実施できる。実施に際して、それぞれ試験化合物を特定の濃度で添加された、一連の寒天プレートに、例えば、カンジダ・アルビカンスの標準的培養菌を接種し、そしてそれぞれのプレートを、次いで３７℃で適当な期間インキュベートする。それから、プレートを、真菌の増殖の存在または不存在の有無を調べ、そして適当なＭ.Ｉ.Ｃ.値を記す。あるいは、液体培養における濁度アッセイが行われ、このアッセイの実施例を概説しているプロトコールが下記の実施例に見出すことができる。
化合物の生体内(in vivo)評価は、真菌、例えば、カンジダ・アルビカンスまたは黄色アスペルギルスの菌株を接種されたマウスに、腹膜内または静脈内注射によって、あるいは経口投与による一連の用量レベルで行われる。化合物の活性は、処置と無処置のマウス群に真菌感染の増殖をモニタリングする（組織学のよってまたは感染から真菌を回収することによって）ことによって評価することができる。活性は、化合物が感染症の致死効果に対して５０％保護を提供する、用量レベル(ＰＤ５０)の点から見て測定できる。
ヒトの抗真菌剤の使用の場合は、本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物は、単独でまたは、意図した投与ルートおよび標準的薬剤実務に従って選択される薬剤担体と混合して投与できる。このように、例えば、それらは、表題部分「医薬製剤」の段落において上述した製剤によって、経口的に、非経口的に、静注で、筋注でまたは皮下注で投与できる。
ヒト患者への経口および非経口投与のために、本発明の抗真菌化合物の１日の投与量レベルは、経口または非経口ルートのいずれかによって投与される場合、とりわけ、化合物の効力に依存して、０.０１〜１０ｍｇ/ｋｇ(分割量で)であり得る。化合物の錠剤またはカプセルは、例えば、適当な時間に１回または２回またはそれ以上投与するための、５ｍｇ〜０.５ｇの活性化合物を含むことができる。医師は、いずれにしても、個々の患者に最も適している実際の投与量(有効量)を決め、そして、それは特定の患者の年齢、体重および応答によって変更があるであろう。
あるいは、抗真菌化合物は、坐薬または膣坐薬(pessary)の形で投与でき、あるいは、それらはローション剤、溶液、クリーム、軟膏または散布用粉末の形で局所的に適用できる。例えば、それらは、ポリエチレングリコールまたは流動パラフィンの水性乳剤からなるクリームに添加できる；あるいは、それらは、必要となり得る安定化剤および防腐剤と共に、白蝋または白い柔軟パラフィンベースからなる軟膏に、１〜１０％の濃度で添加できる。
上述の治療的な使用に加えて、こうした示差スクリーニングアッセイよって開発される抗真菌剤物質は、例えば、食品の防腐剤、家畜の体重増加を促進するための飼料サプリメント、または非生命体の処置のための、具体的に病院用設備および部屋を除染するための殺菌性製剤における防腐剤として使用できる。同様にして、哺乳類のＣＤＫおよび昆虫のＣＤＫ例えば、Drosophilia ＣＤＫ５遺伝子(Hellmich et al. (1994)FEBS Lett 356:317-21)の阻害の並行した比較は、ヒト/哺乳類および昆虫の酵素を識別する、阻害剤について、ここにおける化合物間で、選択ができるようにする。従って、殺虫剤における本発明の化合物の使用および製剤を、例えば、ミバエのような昆虫の管理における使用を本発明は明白に意図している。
さらに別の実施態様では、対象であるＣＤＫ阻害剤のある種のものは、哺乳類の酵素に比較して、植物ＣＤＫに対する阻害特異性を基づいて選択できる。例えば、植物ＣＤＫは、植物酵素を阻害するための最大の選択性を有する化合物を選ぶために、ひとつまたはそれ以上のヒト酵素による示差スクリーンに配置できる。このように、本発明は、特に農業上の利用のための、例えば、枯葉剤などの形による、対象であるＣＤＫ阻害剤の製剤を意図している。
農業および園芸の目的のために、本発明の化合物は、特定の用途および意図された目的に適当なように、製剤された組成物の形で使用できる。このように、化合物は、散布用粉末剤、または顆粒、種子ドレッシング、水溶液、分散液またはエマルジョン類、浸液、スプレー、エアゾールまたは煙剤の形で利用できる。組成物も、また、分散可能な粉末、顆粒または粒状物、あるいは、使用前に希釈するための濃縮物の形で供給できる。こうした組成物は、農業および園芸において公知で、そして許容できる従来の担体、希釈剤または佐剤を含有でき、そして、それらは従来の手順に従って製造される。組成物は、また、他の活性成分、例えば、除草または殺虫活性を有する化合物、またはさらなる抗真菌剤を混合できる。化合物および組成物は、多くの方法で適用でき、例えば、それらは直接植物葉、茎、枝、種子または根に、あるいは土壌または他の成長する媒体に適用でき、そして、それらは病気を根絶するだけでなくて、予防して植物または種子を攻撃から保護もするために使用できる。例えば、組成物は、０.０１〜１重量％の活性成分を含むことができる。野外使用のために、活性成分の適当な適用率は、５０〜５０００ｇ/ヘクタールであってもよい。
本発明はまた、木材腐敗菌の制御、そして、植物が成長する土壌、苗のための水田または潅流のための水の処理に、本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物の使用をも意図している。また、本発明は、菌類の侵襲から貯蔵した穀物および他の非植物の場所を保護するために、本明細書に定義されている式（Ｉ）およびその下位群の化合物の使用をも意図している。
本発明は、以下の実施例に記載されている特定態様を言及することによりここで説明するが、これに限定されるものではない。
この実施例では、次の略語が使用される。
ＡｃＯＨ 酢酸
ＢＯＣ ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＣＤＩ １，１−カルボニルジイミダゾール
ＤＭＡＷ９０ 溶媒混合物：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，ＡｃＯＨ，Ｈ２Ｏ（９０：１８：３
：２）
ＤＭＡＷ１２０ 溶媒混合物：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，ＡｃＯＨ，Ｈ２Ｏ（１２０：１８：
３：２）
ＤＭＡ２４０ 溶媒混合物：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，ＡｃＯＨ，Ｈ２Ｏ（２４０：２０：
３：２）
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ １−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
Ｅｔ３Ｎ トリエチルアミン
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
Ｅｔ２Ｏ ジエチルエーテル
ＨＯＡｔ １−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
Ｐ．Ｅ． 石油エーテル
ＳｉＯ２ シリカ
ＴＢＴＵ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１
−イル）ウロニウム テトラフルオロボラート
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
分析ＬＣ−ＭＳシステムおよび方法の説明
この実施例では、製造する化合物は、下記に記述したシステムおよび操作条件を用いて液体クロマトグラフィーおよび質量分析によって特徴づけられた。引用されている化合物の質量は、様々な同位体を有する原子が存在し、そして、一つだけの質量が引用されている場合は、化合物の単一の同位体の質量（すなわち、３５Ｃｌ；７９Ｂｒなど）である。下記に述べられており、それらが備え付けられているシステムがいくつか使用され、きわめて類似した操作条件の下で作動するように設定された。使用した作動条件も以下に示されている。下記に述べられた、幾つかのシステムが使用され、そして、それらは、極めて類似した操作条件を備え、それらの下で作動させる。
ウオータープラットフォーム・ＬＣ−ＭＳシステム:
ＨＰＬＣシステム：Waters 2795
質量検出器： Micromass Platform LC
ＰＤＡ検出器： Waters 2996 PDA
分析酸条件;
溶出剤Ａ： Ｈ２Ｏ(０.１％ギ酸)
溶出剤Ｂ： ＣＨ３ＣＮ(０.１％ギ酸)
グラジエント：５〜９５％溶出剤Ｂ（３．５分にわたり）
流速： ０．８ｍｌ/分
カラム： Phenomenex Synergi 4μ MAX-RP 80A、2.0 x 50mm
分析長時間酸条件:
溶出剤Ａ： Ｈ２Ｏ(０.１％ギ酸)
溶出剤Ｂ： ＣＨ３ＣＮ(０.１％ギ酸)
グラジエント：０５〜９５％溶出剤Ｂ（１５分にわたり）
流速： ０．４ｍｌ/分
カラム： Phenomenex Synergi 4μ MAX-RP 80A、2.0 x 150mm
プラットフォームＭＳ条件:
キャピラリー電圧：３.６ｋＶ（３．４０ｋＶ・ES ネガティブ）
コーン電圧： ２５Ｖ
電源温度： １２０℃
スキャン範囲： １００−８００ａｍｕ
イオン化方式 エレクトロスプレイ ポジティブ(ElectroSpray Positive)または
エレクトロスプレイ ネガティブ または
エレクトロスプレイ ポジティブおよびネガティブ
Waters Fractionlynx ＬＣ−ＭＳシステム:
ＨＰＬＣシステム：2767 autosampler-2525 binary gradient pump
質量検出器： Waters ZQ
ＰＤＡ検出器： Waters 2996 PDA
分析酸条件：
溶出剤Ａ： Ｈ２Ｏ(０.１％ギ酸)
溶出剤Ｂ： ＣＨ３ＣＮ(０.１％ギ酸)
グラジエント：５〜９５％溶出剤Ｂ（４分間にわたり）
流量： ２．０ｍｌ/分
カラム： Phenomenex Synergi 4μ MAX-RP 80A, 4.6x50mm
Fractionlynx ＭＳ 条件：
キャピラリー電圧：３.５ｋＶ（３．２ｋＶ・ES ネガティブ）
コーン電圧： ２５Ｖ（３０Ｖ・ES ネガティブ）
電源温度： １２０℃
スキャン範囲： １００−８００ａｍｕ
イオン化方式 エレクトロスプレイ ポジティブ(ElectroSpray Positive)または
エレクトロスプレイ ネガティブ または
エレクトロスプレイ ポジティブおよびネガティブ
ＭＡＳＳ誘導精製ＬＣ−ＭＳシステム
分取ＬＣ−ＭＳは、本明細書に述べられている化合物のような有機低分子の精製のために使用されている標準的で且つ効果的な方法である。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および質量分析法（ＭＳ）を使用するこの方法は、粗物質の分離をよりよくし、ＭＳによるサンプルの検証を改善することをもたらすために、変更することができる。分取グラジエントＬＣ法の最適化のために、カラム、揮発性溶出剤および調節剤(modifiers)、およびグラジエントを変更することが含まれるであろう。分取ＬＣ−ＭＳ方法を最適化し、次いでそれらを使用して化合物を精製する方法は、本技術分野で周知である。こうした方法は、Rosentreter U, HuberU.; Optimal fraction collecting in preparative LC/MS; J Comb Chem., 2004; 6(2), 159-64and Leister W, Strauss K, Wisnoski D, Zhao Z, Lindsley C., Development of a custom high-throughput preparative liquid chromatography/mass spectrometer platform for the preparative purification and analytical analysis of compound libraries; J Comb Chem.; 2003; 5(3); 322-9に述べられている。
当業者であれば、こうした述べられた方法に対する代替システムおよび方法は使用することができるであろうということを理解するであろうが、分取ＬＣ−ＭＳを介して化合物を精製する一つのこうした方法は、下記に述べられている。特に、順相分取ＬＣ対応方法が、本明細書で述べられている逆相方法の代わりに使用できる場合があり得るであろう。この手法は低分子を精製するのに大変効果的であり、そして溶出剤は、陽イオンエレクトロスプレー質量分析法に適合しているので、分取ＬＣ−ＭＳシステムの大部分は、逆相ＬＣおよび揮発性酸性調節剤を利用する。他のクロマトグラフィー溶液、例えば、順相ＬＣ、代わりになるべきものとして上記に述べられている分析方法に概説されている緩衝移動相、塩基性調節剤などを使用することは、もう一つの選択肢として化合物を精製するのに使用されることができるであろう。
分取ＬＣ−ＭＳシステム：
Waters Fractionlynx system:
・ハードウエア：
2767 Dual Autosampler/Fraction Collector
2525 preparative pump
カラム選択のためのＣＦＯ(カラム流体オーガナイザー)
ポンプを構成するＲＭＡ(水中試薬マネージャー)
Waters ZQ Mass Spectrometer
Waters 2996 Photo Diode Array detector
Waters ZQ Mass Spectrometer
・ソフトウエア：
Masslynax 4.0
・Waters MS を実行する条件:
毛細管の電圧： ３．５ｋＶ（３．２ｋＶ ＥＳネガティブ）
コーンの電圧： ２５Ｖ
熱源温度： １２０℃
マルチプライアー：５００Ｖ
スキャン範囲： １２０−８００ａｍｕ
イオン化方式： エレクトロスプレーポジティブ または
エレクトロスプレーネガティブ
Agilent 1100 LC-MS 分取システム：
・ハードウエア：
Autosampler：１１００ シリーズ“prepALS”
ポンプ:分取フローグラジエント用１１００ シリーズ“PrepPump”および１１００シリーズ
“QuatPump”分取フロー中のpumping modifier用
ＵＶ検出器： １１００シリーズ“ＭＷＤ”Multi Wavelength Detector
ＭＳ検出器： １１００シリーズ“ＬＣ−ＭＳＤ ＶＬ”
フラクションコレクター：２דPrep-FC”
構成ポンプ： “Waters RMA”
Agilent Active Aplitter
・ソフトウエア
Chemstation：Chem32
Agilent MS 実行条件：
毛細管の電圧： ４０００Ｖ（３５００Ｖ ＥＳネガティブ）
Fragmentor/Gain： １５０Ｖ/ｌ
乾燥ガスフロー： １３．０ Ｌ/分
ガス温度： ３５０℃
Nebuliser Pressure：５０ｐｓｉｇ
スキャン範囲： １２５−８００ａｍｕ
イオン化方式： エレクトロスプレーポジティブ または
エレクトロスプレーネガティブ
クロマトグラフィー条件：
・カラム
１. 低ｐＨカラムクロマトグラフィー：
Phenomenex Synergy MAX-RP,10μ,150 x 21.2mm
（あるいは、より極性化合物の場合は、Thermo Hypesil-Keystone HyPurity Aquastar, 5μ, 100 x 21.2mmを用いた)。
２. 高ｐＨカラムクロマトグラフィー：
Phenomenex Luna C18(2),10μ,100 x 21.2mm
(あるいは、Phenomenex Gemini, 5μ,100 x 21.2mm)
・溶出剤：
低ｐＨクロマトグラフィー：
溶媒Ａ： Ｈ２Ｏ＋０.１％ギ酸、ｐＨ〜１.５
溶媒Ｂ： ＣＨ３ＣＮ＋０.１％ギ酸
２.高ｐＨクロマトグラフィー：
溶媒Ａ： Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３＋ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ＝９.２
溶媒Ｂ： ＣＨ３ＣＮ
３. 溶媒形成：ＭｅＯＨ＋０.２％蟻酸(両クロマトグラフィータイプ用)
・方法：
分析するトレースによって、最も適当な分取クロマトグラフィータイプが選択された。通常的な手順は、化合物の構造に最も適当なクロマトグラフィーのタイプ（低ｐＨまたは高ｐＨ)を用いている分析ＬＣ−ＭＳを実行させることであった。一旦分析トレースが良好なクロマトグラフィーを示すと、同一タイプの適当な分取方法が選択される。低および高ｐＨクロマトグラフィー法の両者に対する典型的実行条件は、以下のとおりである：
流速：２４ｍｌ/分
グラジエント：一般にすべてのグラジエントは、９５％Ａ＋５％Ｂによる最初０.４分工程である。次いで分析トレースに従って、３.６分勾配は、良好な分離(例えば、初期保持の化合物に対して５％〜５０％Ｂ；中期に保持の化合物に対して３５％〜８０％Ｂ、その他)を得るために、３.６分グラジエントが選択される。
洗浄：グラジエントの終わりに、１．２分の洗浄工程が行われる。
再平衡：次の作業に対するシステムを準備するために２.１分の再平衡工程が行われる。
流速形成：１ｍｌ/分
・溶媒：
化合物のすべては、通常１００％ＭｅＯＨまたは１００％ＤＭＳＯに溶解した。
当業者から提供された情報から分取ＬＣ−ＭＳによって、本明細書で述べられた化合物を精製することができた。
特段の記載のない限り、それぞれの実施例に用いた出発物質は市販品である。
実施例１
１Ａ．４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル
Figure 2008528466
 塩化チオニル（２．９０ｍｌ，３９．８ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ）中の４−ニトロ−３−ピラゾールカルボン酸（５．６８ｇ，３６．２ｍｍｏｌ）の混合物に周囲温度でゆっくり加え、この混合物を４８時間撹拌した。この混合物を真空中で濃縮し(reduced)トルエンと共沸乾燥(dried through azeotrope)すると、４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルが白色固体として得た。
１H NMR (400 MHz, DMSO-d６) δ 14.4 (s, 1H), 8.9 (s, 1H), 3.9 (s, 3H)
１Ｂ．４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル
Figure 2008528466
 ４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルとエタノール中の１０％Ｐｄ/Ｃの混合物を水素雰囲気下で２０時間撹拌した。この混合物をセライトプラグに通し、真空で還元し、トルエンと共沸乾燥すると、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステルが生成された。
１H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.2 (s, 1H), 3.9 (s, 3H)
１Ｃ．４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸
Figure 2008528466
 ２，６−ジクロロベンゾイルクロリド（８．２ｇ；３９．０５ｍｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）中の４−アミノ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸メチルエステル（５ｇ；３５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５．９５ｍｌ；４２．６ｍｍｏｌ）の溶液に注意深く加え、次いで室温で５時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、次にこのろ液をメタノール（５０ｍｌ）および２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１００ｍｌ）で処理し、５０℃で４時間過熱し、次いで蒸発させた。１００ｍｌの水をこの残渣に加え、次いで濃塩酸で酸性にした。この固形物をろ過により回収し、水（１００ｍｌ）で洗浄し、吸引乾燥すると、４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸 １０．０５ｇが淡いすみれ色の固体として得られた。
（ＬＣ/ＭＳ：Ｒｔ ２．２６，［Ｍ＋Ｈ］＋ ３００/３０２）
１Ｄ．４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ＤＭＦ（７５ｍｌ）中の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（６．５ｇ，２１．６ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ＢＯＣ−ピペリジン（４．７６ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５．０ｇ，２５．９ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（３．５ｇ，２５．９ｍｍｏｌ）の混合物を室温で２０時間撹拌した。この反応混合物を真空中で濃縮し、次にこの残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）と飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍｌ）の間で分配した。この有機相を塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。この残渣を５％ＭｅＯＨ−ＤＣＭ（〜３０ｍｌ）中に加えた。この不溶性の物質をろ過により収集し、次にＤＣＭで洗浄し、真空中で乾燥し、４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．３８ｇ）を白色固体として得た。ろ液を真空中で濃縮し、次にこの残渣をグラジエント溶出液 １：２ ＥｔＯＡｃ/ヘキサンからＥｔＯＡｃを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製すると、更に、４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．５４ｇ）を白色固体として得た。
１Ｅ．４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド・塩酸塩
Figure 2008528466
 メタノール(５０ｍＬ)と酢酸エチル（５０ｍｌ）中の４−｛［４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７．９ｇ）の溶液を飽和ＨＣｌ−ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で処理し、次いで終夜室温で撹拌した。この生成物はメタノールの存在のために結晶化しなかった、それ故、この反応混合物を蒸発させ、次に残渣をＥｔＯＡｃでトリチュレートした。この結果生じた、オフホワイトの固体をろ過により収集し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、焼結吸引乾燥し(sucked dry on the sinter)、６．３ｇの４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミドを塩酸塩として得た。
（ＬＣ/ＭＳ：Ｒｔ ５．８９，［Ｍ＋Ｈ］＋ ３８２/３８４）
１Ｆ．４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミド
Figure 2008528466
 アセトニトリル（１０ｍｌ）中の４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸ピペリジン−４−イルアミド・塩酸塩（１ｍｍｏｌ）の混合物にジイソプロピルエチルアミン（２．２ｍｍｏｌ）を加え、引き続いて、メタンスルホニルクロリド（１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を周囲温度で１６時間撹拌し、次に真空中で濃縮した。この残渣を酢酸エチルと水の間で分配し、相分離させ、次に有機部分を塩水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮すると、表題化合物を得た。
［Ｍ＋Ｈ］＋ ４６０ Ｒｔ ２．６７、ＬＣ/ＭＳ r.t.２．６７分；ｍ/ｚ ４６０．１１
１H NMR: (400 MHz, DMSO-d６) δ 13.51 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 8.50 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.66 - 7.56 (m, 3H), 3.95 - 3.89 (m, 1H), 3.61 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.84 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 1.89 - 1.86 (m, 2H), 1.79 - 1.70 (m, 2H)
実施例２
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−イソプロピル−スルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミド
Figure 2008528466
 この表題化合物は、実施例１に述べられた方法によって製造された。ただし、メタンスルホニルクロリドの代わりにイソプロピルスルホニルクロリドを用い、分取ＬＣ/ＭＳによって精製した。r.t.２．８３分；ｍ/ｚ ４８８．２２
１H NMR: (400 MHz, DMSO-d６) δ 13.42 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.60 - 7.51 (m, 3H), 3.92 - 3.87 (m, 1H), 3.65 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 3.35 - 3.27 (m, 1H), 2.95 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 1.80 - 1.76 (m, 2H), 1.66 - 1.59 (m, 2H), 1.22 (d, J = 8.0 Hz, 6H)
実施例３
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−エチル−スルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミド
Figure 2008528466
 この表題化合物は、実施例１に述べられた方法によって製造された。ただし、メタンスルホニルクロリドの代わりにエチルスルホニルクロリドを用い、Ｐ．Ｅ．−ＥｔＯＡｃ（１：１−０：１）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＬＣ/ＭＳ．r.t.２．７４分；ｍ/ｚ ４７４．１７
１H NMR (400 MHz, DMSO-d６) δ 13.45 (s, 1H), 10.17 (s, 1H), 8.51 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.60 - 7.51 (m, 3H), 3.91 - 3.85 (m, 1H), 3.61 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 3.04 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 1.80 - 1.78 (m, 2H), 1.69 - 1.60 (m, 2H), 1.21 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
実施例４
４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−プロピル−スルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミド
Figure 2008528466
 この表題化合物は、実施例１に述べられた方法によって製造された。ただし、メタンスルホニルクロリドの代わりにプロパンスルホニルクロリドを用い、分取ＬＣ/ＭＳによって精製した。r.t.３．１１分；ｍ/ｚ ４８８．１８
１H NMR: (400 MHz, DMSO-d６) δ 13.42 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.60 - 7.51 (m, 3H), 3.91 - 3.84 (m, 1H), 3.60 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 1.82 - 1.78 (m, 2H), 1.72 - 1.62 (m, 4H), 0.99 (t, J = 8.0 Hz, 3H)
生物学的活性
実施例５
活性化ＣＤＫ２/サイクリンＡキナーゼ阻害活性アッセイ(ＩＣ ５０ )の測定
本発明化合物について以下のプロトコールを使用して、キナーゼ阻害活性の有無が試験された。
活性化ＣＤＫ２/サイクリンＡ(Brown et al, Nat. Cell Biol., 1, pp 438-443, 1999; Lowe, E.D., et al Biochemistry, 41, pp15625-15634, 2002)を、２.５Ｘ強度アッセイ緩衝液(５０ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７.２、６２.５ｍＭ β−グリセロリン酸、１２.５ｍＭ ＥＤＴＡ、３７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１２．５ｍＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、０.２５ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミン)中で１２５ｐＭに希釈し、そして１０μｌに１０μｌのヒストン基質ミックス(６０μｌ ウシ・ヒストンＨ１(Upstate Biotechnology, ５ｍｇ／ｍｌ)、９４０μｌ Ｈ２Ｏ、３５μＣｉγ３３Ｐ−ＡＴＰ)と混合し、次いで５μｌの様々な希釈度のＤＭＳＯ中の試験化合物(最高２.５％まで)とともに９６ウェルプレートに加える。反応を２〜４時間進行させ、その後過剰量のオルトリン酸(２％で５μｌ)で停止させる。
ヒストンＨ１に取り込まれていないままであるγ３３Ｐ−ＡＴＰは、ミリポアＭＡＰＨフィルタープレート上でリン酸化したヒストンＨ１から分離される。ＭＡＰＨプレートのウェルを０.５％オルトリン酸で湿らせ、そして次に、反応の結果は、ウェルによるミリポア減圧ろ過装置でろ過する。ろ過後に、この残渣を０.５％オルトリン酸２００μｌで２回洗浄する。フィルターを乾燥すると、Microscint ２０シンチラント２０μｌを加え、そして次に、３０秒間パッカード・トップカウント上で計数する。
ＣＤＫ２活性の％阻害率は、ＣＤＫ２活性の５０％を阻害するのに必要とする試験化合物の濃度(ＩＣ５０)を決定するために算出され、そしてプロットされる。
実施例６
ＣＤＫ１/サイクリンＢキナーゼ阻害活性検定（ＩＣ ５０ ）の測定
ＣＤＫ１/サイクリンＢ(Upstate Discovery)を使用すること、および酵素を６.２５ｎＭまで希釈することを除いては、ＣＤＫ１/サイクリンＢ検定は、上記のＣＤＫ２/サイクリンＡと同一である。
本発明化合物は、２０μＭ未満のＩＣ５０値を有するか、あるいは、１０μＭの濃度でＣＤＫ２活性の少なくとも５０％阻害を提供する。本発明の好ましい化合物は、ＣＤＫ２またはＣＤＫ１アッセイで１μＭ未満のＩＣ５０値を有する。
実施例７
ＧＳＫ３−Ｂキナーゼ阻害活性検定
ＧＳＫ３−β(Upstate Discovery)を、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．００、２５ｍｇ/ｍｌ ＢＳＡ、０．００２５％ Ｂｒｉｊ−３５、１．２５％ グリセロール，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％ β−メルカプトエタノール、３７．５ｍＭ ＡＴＰおよび基質混合物１０μｌと混和した１０μｌ中で７．５ｎＭに希釈する。このＧＳＫ３−βの基質混合物は、３５μＣｉγ３３Ｐ−ＡＴＰを含む水１ｍｌ中の１２．５μＭのホスホ−グリコーゲン合成酵素ペプチド−２(Upstate Discovery)である。酵素と基質をＤＭＳＯ（最高２．５％まで）中の試験化合物の様々な希釈液５μｌと一緒に９６ウェルのプレートに加える。この反応を過剰のオルトリン酸（２％で５μｌ）で停止する前に、３時間（ＧＳＫ３−β）進行させる。ろ過手順は上記の活性化ＣＤＫ２/サイクリンＡアッセイの通りである。
実施例８
抗増殖活性
本発明の化合物の抗増殖活性は、いくつかの細胞系の細胞増殖を阻止する化合物の能力を測定することによって決定することができる。細胞増殖の阻止は、Alamar Blueアッセイを使用して測定される(Nociari, M. M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167)。この方法はレサズリンをその蛍光生成物レゾルフィンに還元する、生存可能細胞の能力に基づく。それぞれの増殖アッセイに対して、細胞を９６ウェルプレート上にプレーティングし、そして１６時間回復させ、その後に阻害化合物を添加し、次いで更に７２時間経過させる。培養期間の終わりに、１０％(ｖ/ｖ)Alamar Blueを加え、更に６時間培養して、その後５３５ｎＭ励起/５９０ｎＭ放出で蛍光生成物を測定する。非細胞増殖のアッセイの場合、細胞をコンフルエンスで９６時間維持し、その後に阻害剤化合物を添加して更に７２時間維持する。生存可能細胞の数を、前の通りAlamar Blueアッセイで決定する。細胞株は、ＥＣＡＣＣ(European Collection of cell Cultures)から得られる。
特に、本発明化合物は、ヒト大腸癌に由来するＨＣＴ−１１６細胞株（ＥＣＡＣＣ Reference： ９１０９１００５）に対して試験された。
本発明化合物の多くは、このアッセイでは２０μＭ未満のＩＣ５０値を有し、そして好ましい化合物は１μＭ未満のＩＣ５０値を有することが見出された。
実施例９
経口生物学的利用率の決定
式（Ｉ）の化合物の経口生物学的利用率を次のように決定することができる。
試験化合物をbalb/cマウスにI.V.および経口の溶液として、次の投薬量レベルおよび投薬製剤で投与する。
・１０％ＤＭＳＯ/９０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン（２５％ ｗ/ｖ）中で製剤化される１ｍｇ/ｋｇ ＩＶ；および
・１０％ＤＭＳＯ/２０％水/７０％ＰＥＧ２００中で製剤化される５ｍｇ/ｋｇＰＯ。
投薬後様々な時点で、血液サンプルをヘパリン化チューブに取り、次に血漿画分を分析のため回収する。この分析は、蛋白沈殿後ＬＣ−ＭＳ/ＭＳによって行われ、そしてこのサンプルを試験化合物に作成される標準的な検量線と比較することによって定量化する。この血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）が標準的方法によって血漿レベル対時間プロファイルから計算される。パーセンテージとしての経口生物学的利用率は、次の等式から計算される：
Figure 2008528466
 このプロトコールに従うことによって、化合物４−（２，６−ジクロロ−ベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミドは、経口ルートによってマウスに投与したときに４０−５０％の生物学的利用率を有していることが見出された。
実施例１０
異種移植研究(Xenograph Studies)
実施例１の化合物は、ヒト癌由来の細胞株で移植されるヌードマウス中で抗癌作用を有している。実施例１の化合物で処置すると、腫瘍生物マーカーの阻害を引き起こす用量で経口的に投与されるとき、皮下に移植されたこうした異種移植中の腫瘍増殖の阻止がもたらされる。こうした生物マーカーには、サイクリン依存性キナーゼの基質（例えば、網膜芽腫）のリン酸化の抑制が含まれる。実施例１の化合物は、数週間、長期間の服薬を含む様々なスケジュールの範囲で提供されるときに効果がある。
実施例１１
比較実施例
２，６−ジクロロフェニル基を含んでいる実施例１の化合物の生物学的活性が、その２，６−ジフルオロフェニルアナログの生物学的活性と比較された。この２，６−ジフルオロフェニルアナログは、我々の先の出願 ＰＣＴ/ＧＢ２００４/００３１７９（公開番号ＷＯ ２００５/０１２２５６）の実施例１３１に述べられており、次の構造を有している。
Figure 2008528466
 より詳しく述べれば、この化合物を、ＣＤＫ２キナーゼおよびＧＳＫ３βキナーゼに対するその活性に関して、そしてＨＣＴ−１１６ヒト大腸癌細胞の増殖を阻止する能力に関して比較した。このキナーゼ阻害活性およびＨＣＴ−１１６阻害活性は、上記に述べられたアッセイ方法を用いて決定され、その結果が下記の表に示されている。
Figure 2008528466
本出願の実施例１の化合物は、ジフルオロアナログの化合物よりも次の理由により利点を有している：
・実施例１の化合物は、ジフルオロアナログと比較する時、ヒト大腸癌ＨＣＴ−１１６細胞株に対して６−７倍のより強力な抗増殖効果を有している。
・実施例１の化合物は、ジフルオロアナログと比較して、より大きいイン・ビトロでのキナーゼ（ＣＤＫ２）阻害活性を有している。
・実施例１の化合物は、ジフルオロアナログ（０．０１４μＭ）と比較してＧＳＫ３β（０．２２μＭ）に対してはより低い活性を有している。
・実施例１の化合物は、ジフルオロアナログと比較して（〜６倍）、ＧＳＫ３β（＞２００倍）以上のＣＤＫ阻害のより大きい選択性を有している。
薬剤製剤
実施例１２
（ｉ）錠剤製剤
式(Ｉ)の化合物を含んでいる錠剤組成物は、化合物５０ｍｇに希釈剤としてラクトース(ＢＰ)１９７ｍｇおよび滑沢剤としてステアリン酸マグネシウム３ｍｇを混合し、そして公知の方法で圧縮して錠剤を形成することによって製造される。
（ｉｉ）カプセル製剤
カプセル製剤は、式(Ｉ)の化合物１００ｍｇにラクトース１００ｍｇを混合し、そして得られる混合物を標準的な不透明な硬質ゼラチンカプセルに充填することによって製造される。
（ｉｉｉ）注射製剤Ｉ
注射による投与のための非経口組成物は、１０％プロピレングリコールを含んでいる水に、式(Ｉ)の化合物を(例えば、塩の形で)溶解し、活性化合物の濃度１.５重量％を得ることによって製造できる。次いで溶液をろ過によって滅菌し、アンプルに充填し、次に密封する。
（ｉｖ）注射製剤ＩＩ
注射用非経口組成物は、式(Ｉ)の化合物(例えば、塩の形で) (２ｍｇ/ｍｌ)およびマンニトール(５０ｍｇ/ｍｌ)を水に溶解し、溶液を無菌濾過し、そして密封可能な１ｍｌのバイアルまたはアンプルに充填することによって製造される。
（ｖ）注射剤ＩＩＩ
注射または点滴による静脈送達の製剤は、水の中に式（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形で）を２０ｍｇ/ｍｌで溶解することによって製造することができる。次いでバイアルを密封し、オートクレービングによって滅菌する。
（ｖｉ）注射剤ＩＶ
注射または点滴による静脈送達の製剤は、式（Ｉ）の化合物（例えば、塩の形で）を緩衝剤（例えば、０．２Ｍ アセタート ｐＨ ４．６）を含んでいる水に２０ｍｇ/ｍｌで溶解することによって製造することができる。次いでバイアルを密封し、オートクレービングによって滅菌する。
（ｖｉｉ）皮下注射製剤
皮下投与のための組成物は、式(Ｉ)の化合物に、製剤グレードのトウモロコシ油を混合して濃度５ｍｇ/ｍｌとすることによって製造される。製剤を滅菌し、そして適当な容器に充填する。
（ｖｉｉｉ）凍結乾燥製剤
式（Ｉ）の製剤化した化合物の一部を５０ｍＬのバイアルに入れ、そして、凍結乾燥する。凍結乾燥の間、組成物は、一工程凍結プロトコールを用いて（−４５℃）で凍結する。この温度をアニーリングのため−１０℃まで上げ、次いで−４５℃に下げて凍結し、引き続いて、＋２５℃で約３４００分一次乾燥し、引き続いて、温度が５０℃までの時は、増加工程で二次乾燥を行う。一次乾燥および二次乾燥の間圧力は、８０millitorにセットする。
（ｉｘ）固溶体製剤
実施例１の化合物をジクロロメタン/エタノール（１：１）に５〜５０％（例えば、１６または２０％）の濃度で溶解し、下記の表に述べられている種々の条件に相当する条件を用いてこの溶液を噴霧乾燥する。この表で与えられているデータは、実施例１の化合物の濃度、噴霧乾燥器の入口と出口の温度、噴霧乾燥固体の全体の収率、噴霧乾燥固体（アッセイ）中の実施例１の化合物の濃度、および噴霧乾燥固体を構成する粒子サイズ分布（P.S.D.)を含んでいる。
Figure 2008528466
実施例１の化合物およびＰＶＰの固溶体は、直接ハードゼラチンまたはＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）カプセル中に充填することができるし、または増量剤、潤滑剤または分散剤のような薬学的に許容される賦形剤と混和することができる。カプセルは、２ｍｇと２００ｍｇの間、例えば、１０、２０および８０ｍｇの量で実施例１の化合物を含むことができるであろう。
実施例１３
抗真菌活性の決定
式(Ｉ)の化合物の抗真菌活性は、以下のプロトコールを使用して決定される。
化合物は、カンディダ・パルプシロシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・アルビカンス−ＡＴＣＣ３６０８２およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む一連の菌類に対して試験される。試験微生物は、４℃でサブロー・デキストロース寒天傾斜培地上に維持する。それぞれの微生物のシングレット懸濁液は、０.０５Ｍモルホリンプロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)でｐＨ７.０、アミノ酸(Difco, Detroit, Mich.)を有するイースト−窒素ベース・ブロス(ＹＮＢ)中で回転ドラム上にて２７℃で終夜イーストを増殖させることによって、調製される。それから、懸濁液を、遠心分離機で分離し、０.８５％ＮａＣｌで２回洗浄し、その後洗浄した細胞を超音波で４秒間破壊する(Branson Sonifier, model 350, Danbury, Conn.)。シングレットの分芽胞子を、血球計で計数し、そして０.８５％ＮａＣｌ中で所望の濃度に調節する。
試験化合物の活性は、ブロス微量希釈技術の変法を使用して決定される。試験化合物を、ＤＭＳＯ中で１.０ｍｇ/ｍｌの割合にまで、次いで、ＭＯＰＳでｐＨ７.０にしたＹＮＢブロス中で６４μｇ/ｍｌにまで希釈し(フルコナゾールを対照として使用する)、それぞれの化合物の作用溶液を得る。９６−ウェルプレートを使用して、ウェル１および３〜１２を、ＹＮＢブロスにて調製し、化合物溶液の１０倍希釈剤をウェル２〜１１中に調製する(濃度範囲は、６４〜０.１２５μｇ/ｍｌである)。ウェル１は、分光光度検定用の無菌対照およびブランクとして用いる。ウェル１２は、増殖対照として用いる。マイクロタイター・プレートに、ウェル２〜１１のそれぞれに１０μｌで接種する(最終的な接種原サイズは、１０４微生物／ｍｌである)。接種されたプレートは、３５℃で４８時間培養される。ＩＣ５０値は、プレートをボルテックス−ミキサー(Vorte-Genie 2 Mixer, Scientific Industries, Inc., Bolemia, N.Y.)で２分間振盪後に、４２０ｎｍで吸収度(Automatic Microplate Reader, DuPont Instruments, Wilmington, Del.)を測定することにより、分光光度法で定量される。ＩＣ５０終了点は、対照ウェルと比較して増殖のほぼ５０％(またはそれ以上)減少を示している最低薬剤濃度として定義される。濁度検定では、これは、ウェルの濁度が対照の５０％未満である、最低薬剤濃度として定義される(ＩＣ５０)。最小細胞溶解濃度(ＭＣＣ)は、９６−ウェルプレートから全てのウェルをサブロー・デキストロース寒天培地(Sabourahd Dextrose Agar)(ＳＤＡ)プレート上へ継体培養し、３５℃で１〜２日間培養し、そして、次に生存度を点検することによって定量される。
実施例１４
生体内(in vivo)全植物体の菌感染の制御についての生物学的評価のためのプロトコール
式(Ｉ)の化合物をアセトン中に溶解し、引き続きアセトンで順次希釈して、希望する濃度範囲を得る。最終処理容量は、病原体によって、９容量の０.０５％水性ツイーン−２０(商標）(Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）)をまたは０.０１％トリトンＸ−１００（商標）(Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）)を加えることによって得られる。
次いで、組成物を、以下のプロトコールを用いて、トマトべト病(Phytophthora infestans)に対する本発明の化合物の活性の有無を試験するために使用する。トマト(栽培品種ラトガーズ)は、苗が１０〜２０ｃｍの高さになるまで、土壌のない、ピートを主とした鉢植え混合物中で種子から育成される。次いで、植物体に、１００ｐｐｍの割合で試験化合物を流れ出すまで散布する。２４時間後、試験植物にPhytophthora infestansの胞子水性懸濁液を散布することにより接種し、そして一晩露室(dew chamber)に放置する。次いで未処理の対照植物が発病するまで、植物を温室に移す。
同様のプロトコールは、また、用いて、本発明の化合物の下記の菌類を駆除する際の活性の有無を試験するために用いる：小麦赤錆病(Puccinia)、小麦うどん粉病(Ervsiphe vraminis)、小麦(cultivar Monon)、小麦の褐紋病(Septoria tritici)、および小麦菌核病(Leptosphaeria nodorum)。
均等物
上述の実施例は、本発明を説明するための目的のために提供されているものであり、そしてどんな限定でも本発明の範囲に課すものとして解釈されてはならない。上記に述べられ、そして実施例中に説明されている本発明の特定の実施態様に対して、本発明の基礎をなしている原理から逸脱することなく、多数の修正および変更がなされることができることは、容易に明らかであろう。こうしたあらゆる修正および変更は、この出願によって包含されることを意図している。

Claims (30)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2008528466
     ［式中：
    Ｒ１は、２，６−ジクロロフェニルであり；
    Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、いずれも水素であり；
    そして、Ｒ３は、基：
    Figure 2008528466
     （式中、Ｒ４は、Ｃ１−４アルキルである）である］
    の化合物またはその塩、互変異性体、溶媒和物およびＮ−オキシド。
  2. Ｒ４が、Ｃ１−３アルキルである請求項１記載の化合物。
  3. Ｒ４が、メチルである請求項２記載の化合物。
  4. Ｒ４が、エチルである請求項２記載の化合物。
  5. Ｒ４が、ｎ−プロピルである請求項２記載の化合物。
  6. Ｒ４が、イソプロピルである請求項２記載の化合物。
  7. 塩またはＮ−オキシド形態でない請求項１〜６のいずれか一つに記載の化合物。
  8. 塩、溶媒和物またはＮ−オキシド形態である請求項１〜６のいずれか一つに記載の化合物。
  9. サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態の予防または処置における使用のための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  10. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態の予防または処置方法。
  11. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３によって介在される疾患症状または状態を軽減または減少させる方法。
  12. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を、異常細胞増殖を阻止するのに有効な量で哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類の異常細胞増殖を包含するか、または哺乳類の異常細胞増殖から生じる疾患または状態を処置する方法。
  13. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を、異常細胞増殖を阻止するのに有効な量で哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類の異常細胞増殖を包含するか、または哺乳類の異常細胞増殖から生じる疾患または状態を軽減または減少させる方法。
  14. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を、（ｃｄｋ１またはｃｄｋ２のような）ｃｄｋキナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３活性を阻害するのに有効な量で哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類の異常細胞増殖を包含するか、または哺乳類の異常細胞増殖から生じる疾患または状態を処置する方法。
  15. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を、（ｃｄｋ１またはｃｄｋ２のような）ｃｄｋキナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３活性を阻害するのに有効な量で哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類の異常細胞増殖を包含するか、または哺乳類の異常細胞増殖から生じる疾患または状態を軽減または減少させる方法。
  16. キナーゼを請求項１〜８のいずれか一つに記載のキナーゼ阻害化合物と接触させることを含んでなる、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の阻害方法。
  17. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を用いて、サイクリン依存性キナーゼまたはグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３の活性を阻害することにより、細胞過程（例えば、細胞分裂）を調節する方法。
  18. 明細書中に述べられている疾患状態の予防または処置において使用するための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  19. 明細書で定義されている任意の一つまたはそれ以上の使用のための薬剤の製造のための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物の使用。
  20. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物と薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
  21. 請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物と経口投与に適当な形態の薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
  22. 薬剤に使用のための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  23. 上記に述べられている任意の使用および方法、および明細書のどこかの箇所で述べられている他の任意の使用および方法のための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  24. 請求項１〜８のいずれか一つに定義されている化合物の製造方法であって、式（ＸＶＩＩ）：
    Figure 2008528466
     の化合物を、基ＳＯ２Ｒ４を導入するのに適当なスルホニル化剤（例えば、塩化メタンスルホニルのようなスルホニルクロリド）と反応させることを含んでなる方法。
  25. サイクリン依存性キナーゼによって介在される疾患症状または状態の診断および処置方法であって、その方法が、（ｉ）患者が罹患しているかまたは罹患している可能性がある、疾患または状態が、サイクリン依存性キナーゼに対する活性を有する化合物での処置に感受性があるものか否かを決定するために、患者をスクリーニングすること、そして（ｉｉ）このように、患者が疾患または状態に罹患しているということが示される場合、その後請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を患者に投与することを含んでなる方法。
  26. スクリーニングされそしてサイクリン依存性キナーゼに対する活性を有している化合物での処置に感受性があるであろう疾患または状態に罹患しているか、または罹患するおそれがあると判定された患者の疾患の症状または状態を処置または予防する薬剤の製造のための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物の使用。
  27. 哺乳類の腫瘍増殖を阻止するのに使用するための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  28. （例えば、哺乳類中の）腫瘍細胞の増殖を阻止するのに使用するための請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物。
  29. 腫瘍の増殖を阻止する有効量の請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物を哺乳類（例えば、ヒト）に投与することを含んでなる哺乳類（例えば、ヒト）の腫瘍増殖を阻止する方法。
  30. 腫瘍細胞を腫瘍細胞の増殖を阻止する有効量の請求項１〜８のいずれか一つに記載の化合物と接触させることを含んでなる、腫瘍細胞（例えば、ヒトのような哺乳類中に存在する腫瘍細胞）の増殖を阻止する方法。
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