JP2008526971A - 結腸直腸癌およびその作用メカニズムに特に重点を置く、癌処置における標的としてのホスホリパーゼａ２の同定 - Google Patents
結腸直腸癌およびその作用メカニズムに特に重点を置く、癌処置における標的としてのホスホリパーゼａ２の同定 Download PDFInfo
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Abstract
ホスホリパーゼA2のペプチドを、ヒト血漿中で検出、および合成した。本ペプチドをマウスに注射し、多くの器官での遺伝子発現プロファイリングを行った。ホスホリパーゼA2は、肝臓での遺伝子発現の制御において有意な効果を示した。影響を受けた遺伝子は、インテグリンシグナル伝達経路、wnt経路およびPTEN経路のメンバーである。遺伝子発現の変化は、増殖および浸潤におけるホスホリパーゼA2の良い効果を示している。遺伝子アノテーションは、直腸結腸癌で示される。
Description
関連出願
本出願は、2005年1月14日に出願したUSSN60/643990に基づく優先権を主張し、その内容を引用により本明細書の一部とする。
本出願は、2005年1月14日に出願したUSSN60/643990に基づく優先権を主張し、その内容を引用により本明細書の一部とする。
技術分野
本発明は、一般に、組織試料のインビトロでの分析試験、および、より特には、癌における遺伝子発現の局面に関する。
本発明は、一般に、組織試料のインビトロでの分析試験、および、より特には、癌における遺伝子発現の局面に関する。
発明の背景
“心臓血管疾患血漿ポリペプチド”(CPP)、断片、およびCPPの翻訳後修飾種は、冠動脈疾患(CAD)に罹患した個体から取得した血漿中に低レベルで存在する。CPPは分泌因子であり、それ自体容易に検出でき、心臓血管疾患の薬剤開発、診断および予防に役立つ。2004年7月15日に出願したPCT/EP2004/007842、“心臓血管障害で減少する分泌ポリペプチド種”を参照のこと。ホスホリパーゼA2の断片を、ヒト血漿中で検出し、GeneProt, Inc.(Geneva, Switzerland)により合成した。このペプチドをGP_1221076(また、CPP51もしくはGPA071)と称した。
“心臓血管疾患血漿ポリペプチド”(CPP)、断片、およびCPPの翻訳後修飾種は、冠動脈疾患(CAD)に罹患した個体から取得した血漿中に低レベルで存在する。CPPは分泌因子であり、それ自体容易に検出でき、心臓血管疾患の薬剤開発、診断および予防に役立つ。2004年7月15日に出願したPCT/EP2004/007842、“心臓血管障害で減少する分泌ポリペプチド種”を参照のこと。ホスホリパーゼA2の断片を、ヒト血漿中で検出し、GeneProt, Inc.(Geneva, Switzerland)により合成した。このペプチドをGP_1221076(また、CPP51もしくはGPA071)と称した。
ヒト血漿中のホスホリパーゼA2およびその断片の機能について、当業者にはさらなる情報取得の必要性がある。
発明の要約
分泌型ホスホリパーゼA2、GPA071ペプチドをマウスに注射した。遺伝子発現プロファイリングを多くの器官で行った。驚くべきことに、GPA071ペプチドは、肝臓での遺伝子発現の制御において著しい効果を示した。影響を受けた遺伝子は、インテグリンシグナル伝達経路、wnt経路およびPTEN経路のメンバーである。遺伝子発現の変化は、GPA071ペプチド、および一般にはPLA2の細胞増殖および浸潤に対する良い効果を示し、遺伝子アノテーションは、直腸結腸癌で示される。我々の知る限りでは、これは、分泌型ホスホリパーゼA2がインテグリンシグナル伝達の上流に対する刺激効果を有する最初の報告であり得る。
分泌型ホスホリパーゼA2、GPA071ペプチドをマウスに注射した。遺伝子発現プロファイリングを多くの器官で行った。驚くべきことに、GPA071ペプチドは、肝臓での遺伝子発現の制御において著しい効果を示した。影響を受けた遺伝子は、インテグリンシグナル伝達経路、wnt経路およびPTEN経路のメンバーである。遺伝子発現の変化は、GPA071ペプチド、および一般にはPLA2の細胞増殖および浸潤に対する良い効果を示し、遺伝子アノテーションは、直腸結腸癌で示される。我々の知る限りでは、これは、分泌型ホスホリパーゼA2がインテグリンシグナル伝達の上流に対する刺激効果を有する最初の報告であり得る。
よって、本発明は、癌、特に結腸直腸癌のような増殖性疾患または状態の処置における使用のための医薬の製造に関するポリペプチド(分泌型ホスホリパーゼA2、例えば、GPA071ペプチド)の使用を提供する。
さらなる局面では、本発明は、疾患または状態を患うヒトを含むほ乳類に、上記した通りのポリペプチドの有効量を投与することを含む、癌、特に結腸直腸癌のような増殖性疾患または状態を処置する方法に関する。
他の局面では、本発明は、上記した通りのポリペプチドの有効量および薬学的に許容される担体を含む、癌、特に結腸直腸癌のような増殖性疾患または状態における使用のための医薬組成物に関する。
他の局面では、本発明は、癌処置、特に結腸直腸癌の処置における治療標的としてのホスホリパーゼA2の使用に関する。
好ましい態様の詳細な説明
ベローチェ遺伝学法(Velocegenomics approach）(2004年11月11日に出願したPCT/EP2004/012572、“有機化合物の使用”に記載している)を用いて、GPA071ペプチドをマウスに注射し、多くの器官で遺伝子発現プロファイリングを行った。驚くべきことに、GPA071ペプチドは、肝臓での遺伝子発現の制御において有意な効果を示した。影響を受けた遺伝子は、インテグリンシグナル伝達経路、wnt経路およびPTEN経路のメンバーである。表1を参照のこと。
表1
ベローチェ遺伝学法(Velocegenomics approach）(2004年11月11日に出願したPCT/EP2004/012572、“有機化合物の使用”に記載している)を用いて、GPA071ペプチドをマウスに注射し、多くの器官で遺伝子発現プロファイリングを行った。驚くべきことに、GPA071ペプチドは、肝臓での遺伝子発現の制御において有意な効果を示した。影響を受けた遺伝子は、インテグリンシグナル伝達経路、wnt経路およびPTEN経路のメンバーである。表1を参照のこと。
表1
遺伝子発現の変化は、増殖および浸潤におけるGPA071ペプチド、および一般にはPLA2の良い効果を示しており、遺伝子アノテーションは、直腸結腸癌で示される。
ホスホリパーゼA2ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造は既知である。増大しているシグナル伝達酵素であるホスホリパーゼA2スーパーファミリー:Dennis EA, Trends in Biochemical Sciences 22:1(1997)。ヒト血漿から同定したGPA071(同定番号GP_1221076)のペプチド配列は、AVWQFRKMIKCVIPGSDPFLEYNNYGCYCGLGGSGTPVDELDKCCQTHDNC YDQAKKLDSCKFLLDNPYTHTYSYSCSGSAITCSSKNKECEAFICNCDRNAAICFSKAPYNKAHKNLDTKKYCQS(配列番号1)である。2004年7月15日に出願した、PCT/EP2004/007842、“心臓血管障害で減少する分泌ポリペプチド種”(引用により本明細書の一部とする)を参照のこと。マウスGPA071の合成した124アミノ酸のペプチド配列は、AVWQFRNMIKCTIPGSDPLKDYNNYGCYCGLGGWGTPVDDLDRCCQTHDHCYSQAKKLESCKFLIDNPYTNTYSYSCSGSEITCSAKNNKCEDFICNCDREAAICFSKVPYNKEYKNLDTGKFC(配列番号2)である。
この遺伝子発現解析における発見に基づいて、ホスホリパーゼA2は、接着斑複合体およびインテグリンシグナル伝達経路の活性化を介して作用する。これは、間接的に、増加した胆汁酸の遊離を介して起こり得、それは次に、焦点接着キナーゼおよび下流のシグナル伝達事象を活性化し得、潜在的なプロ増殖性およびプロ移動性効果のつながり(netto)を導き出す。Debruyne PR et al., Oncogene 21(44):6740-50 (2002年10月3日)。胆汁酸とインテグリンシグナル伝達とが関連する可能性に関する証拠は、Haussinger D et al., Gastroenterology 124(5): 1476 87 (2003年5月)により示されている。しかしながら、遺伝子発現の変化は補償効果によるものであり、抗増殖性効果を覆い隠すことができる(下記を参照のこと)。例えば、本明細書で提供されるようなインビボでの確認実験が必要とされる。
結腸直腸癌での関与が証明された多くの遺伝子、例えば、ベータ-カテニン(Waterman ML, Cancer Metastasis Rev. 23(1 2): 41 52 (2004年1月-6月)を参照のこと)、APC、wnt11(腸の癌)は、GPA071の注射により影響を受けた。分泌型ホスホリパーゼA2は、結腸直腸癌に対して保護的であると考えられているが、ホスホリパーゼA2は、結腸直腸癌およびAPCシグナル伝達に同様に関与していた。Kennedy BP et al., Cancer Res. 58(3): 500-3(1998年2月1日)。
ベローチェ遺伝学法(Velocegenomics Method)
ベローチェ遺伝学法は、2004年11月11日に出願したPCT/EP2004/012572、“有機化合物の使用”に記載している(引用により本明細書の一部とする)。ペプチド(ここではGPA071)を、7日から14日間、300、600または1000μg/日の用量で、雄C57BL/6マウスに皮下投与する。処理期間の終了後、すべての器官からの試料を検死で素早く凍結し、GeneChip(登録商標)発現プロファイリングで解析する。
ベローチェ遺伝学法は、2004年11月11日に出願したPCT/EP2004/012572、“有機化合物の使用”に記載している(引用により本明細書の一部とする)。ペプチド(ここではGPA071)を、7日から14日間、300、600または1000μg/日の用量で、雄C57BL/6マウスに皮下投与する。処理期間の終了後、すべての器官からの試料を検死で素早く凍結し、GeneChip(登録商標)発現プロファイリングで解析する。
全RNAを使用説明書に従い、TRIzol試薬(Life Technologies)を用いて、これらの凍結組織から抽出する。全RNAをλ=260nm(A260nm)の吸光度により定量し、純度をA260nm/A280nm比で概算する。完全性を、変性ゲル電気泳動により確認する。RNAは、解析まで−80℃で保存する。良質全RNAを、Superscript Choice System (Life Technologies)を用いて2本鎖cDNAを合成するために使用する。次いで、cDNAをインビトロで転写し(MEGAscriptae T7 Kit、Ambion)、ビオチン標識cRNAを形成する。次に、12mgから15mgの標識cRNAをAffymetrixマウスMOE430A発現プローブアレイに、16時間、45℃でハイブリダイズする。次いで、アレイをEukGE WS2プロトコール(Affymetrix)にしたがって洗浄し、10mg/mlのストレプトアビジン-フィコエリトリン複合体(Molecular Probes)で染色する。シグナルを2mg/mlアセチル化BSA(Life Technologies)、100mM MES、1M[Na+]、0.05% Tween20、0.005% Antiofoam(Sigma)、0.1mg/mlヤギIgGおよび0.5mg/mlビオチン化抗体を用いて抗体増幅し、ストレプトアビジン溶液で再染色する。洗浄後、アレイをGene Array(登録商標)スキャナー(Affymetrix)で2回スキャンする。
発現レベルは、特定のプローブのオリゴヌクレオチド対により測定された、シグナル強度における差異の平均により概算する(AvgDiff値)。この研究で使用する画像取得および数値翻訳のソフトウェアは、Affymetrix Microarray Suite version 5 (MAS5)である。処理により影響を受ける遺伝子を同定するため、最初に、値が、体系的により低い発現範囲にあり、その場所で実験ノイズが高いデータセットを、解析遺伝子の最初の波で除外するようにフィルターをかける(任意の実験ポイントの最も小さい数の複製に相当する多くの実験で、少なくとも、50のAvgDiff値)。2回目の選択で、2成分誤差モデル(大域的誤差モデル)に基づき、および可能であれば、複数仮説試験のためのステップダウン補正(Benjamini and Hochberg false discovery rate)を用いて、閾値t-検定p-値(0.05)は、処理したものと未処理のものとの間で異なった値を持つ遺伝子を同定する。
選択した遺伝子リストを、その後、フィッシャーの直接確率検定を用いて、経路および細胞内成分のために作製した遺伝子リストと比較する。異なった器官の間で共通の遺伝子変化を同定するために、ベン図を使用する。高関連遺伝子の発現プロファイルを、いくつかの距離測定基準(標準、ピアソン)を用いて、個々の実験ポイントで、相関した変化を有する遺伝子を発見するために使用する。
特定の遺伝子が関連していると見なす決定は、調査のフィルタリングおよび上記した通りの統計的アルゴリズム、ならびに共通の生物学的テーマを示す他の調節された遺伝子との関係により、同定した数的変化の結合に基づいている。
本発明のペプチド
本明細書で使用する“ポリペプチド”なる用語は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドまたは合成オリゴペプチドのことを言う。これらの用語は、交換可能に使用されることを意図する。該用語の任意の1個は、グリコシル化またはリン酸化のような翻訳後修飾に関係なく、ペプチド結合またはアミド結合で一緒に結合している2個またはそれ以上の鎖のことを言う。ポリペプチドはまた、2個以上のサブユニットを含み得、ここで、それぞれのサブユニットは別々のDNA配列をコードしていてもよい。
本明細書で使用する“ポリペプチド”なる用語は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチドまたは合成オリゴペプチドのことを言う。これらの用語は、交換可能に使用されることを意図する。該用語の任意の1個は、グリコシル化またはリン酸化のような翻訳後修飾に関係なく、ペプチド結合またはアミド結合で一緒に結合している2個またはそれ以上の鎖のことを言う。ポリペプチドはまた、2個以上のサブユニットを含み得、ここで、それぞれのサブユニットは別々のDNA配列をコードしていてもよい。
本発明によるポリペプチドは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するGPA071を含み得る。本発明のポリペプチドはまた、本発明のポリペプチドの機能的に活性なポリペプチド断片を含む。本明細書で示した通り、機能的な活性は、モデル系において遺伝子発現を調節するペプチドの活性を測定する(例えば、ベローチェ遺伝学法による)ことにより証明できる。本明細書で使用するとき“生物活性”なる用語は、生物学的事象を誘導するか、または影響を与える分子のことを言う。好ましい態様では、GPA071またはその断片の生物学的活性のレベルは、表1で説明した1個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより測定する。好ましくは、表1の大多数の遺伝子の発現を決定する。本発明の“生物活性ポリペプチド”は、GPA071およびその断片を含む。または、少なくともGPA071と50%の同一性割合および機能的活性を有するアミノ酸配列を有するホモログを含む。
そのようなポリペプチド断片は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と、全部ではなく、部分的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。そのようなポリペプチド断片は“独立(free-standing)”していてよく、または、そのようなポリペプチド断片が、一部または領域、最も好ましくは1つの連続領域を形成する大きなポリペプチドの一部であってよい。断片は、少なくとも10個のアミノ酸を含み、好ましくは、少なくとも、15個、20個または25個のアミノ酸を含み得る。より好ましくは、断片は、少なくとも、30個のアミノ酸を含む。他に好ましい断片は、少なくとも、40個、50個、60個、65個、70個または75個のアミノ酸を含む。最も好ましくは、断片は、配列番号1または配列番号2の12個、22個、32個、35個、39個、66個、72個または75個の連続したアミノ酸を含む。
そのようなポリペプチドは、また、例えば、プロテアーゼ(例えば、トリプシン)によって産生したタンパク質分解切断産物のような断片であり得る。本発明によるポリペプチドまたはポリペプチド断片は、配列番号1または配列番号2のC末端断片を含み得る。そのようなC末端断片は、C末端の少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも20個または25個、より好ましくは、少なくとも30個のアミノ酸または少なくとも65個、70個または75個のアミノ酸を含み得る。少なくとも10個のアミノ酸は、少なくとも10個のアミノ酸で最長のC末端を含み得る。ポリペプチドは、配列番号1または配列番号2の、少なくとも32個、35個、39個、66個、72個または75個の最長C末端アミノ酸を含み得る。断片はまた、内部断片oを含み得る。
ポリペプチドはまた、上記したポリペプチド、例えば、配列番号1または配列番号2のいずれか1個のアミノ酸配列と、少なくとも50%、好ましくは、少なくとも60%、より好ましくは、少なくとも70%または80%、および最も好ましくは、少なくとも90%、例えば、95%、97%、または99%同一である同一性割合を有するアミノ酸配列であり得る。
アミノ酸残基は、標準的な一文字表記または三文字表記法により本明細書で称す: A (Ala) アラニン; C (Cys) システイン; D (Asp) アスパラギン酸; E (Glu) グルタミン酸; F (Phe) フェニルアラニン; G (Gly) グリシン; H (His) ヒスチジン; I (Ile) イソロイシン; K (Lys) リジン; L (Leu) ロイシン; M (Met) メチオニン; N (Asn) アスパラギン; P (Pro) プロリン; Q (Gln) グルタミン; R (Arg) アルギニン; S (Ser) セリン; T (Thr) スレオニン; V (Val) バリン; W (Trp) トリプトファン; Y (Tyr) チロシン。
“同一性割合(%)”なる用語または類似語は、参照配列および他の配列(すなわち、“候補”配列)の比較の観点で使用するとき、2個の配列間の最適アラインメントにおいて、候補配列が、示された割合と等しい数のサブユニット位置で参照配列と同一であることを意味する(サブユニットは、ポリヌクレオチド比較のためのヌクレオチド、またはポリペプチド比較のためのアミノ酸である)。本明細書で使用する、比較される配列の“最適アラインメント”は、アラインメントを構築するときに使用するサブユニット間の一致を最大にし、ギャップ数を最小にするアラインメントである。同一性割合は、Needle man & Wunsch、J. Mol. Biol. 48: 443 453 (1970)に記載された、市販で利用可能なアルゴリズムの実施を用いて決定し得る(“GAP” program of Wisconsin Sequence Analysis Package、Genetics Computer Group、Madison、WI)。当業者が、アラインメントを構築し、同一性割合または類似性の他の尺度を計算するための他のソフトウェアパッケージは、Smith & Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981) (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI)のアルゴリズムに基づく“BestFit”プログラムを含む。同一性割合はまた、WU BLAST2により作製し得る。Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460 480 (1996)。WU BLAST2は、いくつかの検索パラメーターを用いた(そのほとんどは、既定値に設定されている)。調節可能なパラメーターを、次の値に設定する: 重複範囲=1、重複部分=0.125、ワード閾値(T)=11。A%アミノ酸配列同一性値を、整列領域の全残基数で割った一致する同一残基の数により決定する。例えば、参照アミノ酸配列と、少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを取得するために、参照配列におけるアミノ酸残基の5%までが、欠失していたり、または他のアミノ酸で置換されていたりし得、もしくは、参照配列における全アミノ酸の5%までの多くのアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端、またはそれらの末端位置間の任意の場所で、個々に参照配列の残基中に散在して、または1個もしくはそれ以上の連続したグループで参照配列の間に起こり得る。本発明の配列を参照配列と比較することで、候補配列がより大きいポリペプチドまたはポリヌクレオチドの構成要素または断片であり得、同一性割合を計算する目的のためのそのような比較が、関連のある構成要素または断片に関して実行されるはずであることが理解される。
本発明はまた、本明細書で記載したポリペプチドまたはポリペプチド断片の機能的に保存された変異型を含む。そのような変異型は、当業者に標準的な方法を用いて作製し得る(例えば、保存的アミノ酸置換による)。典型的には、そのような置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間;SerおよびThr間;酸性残基AspおよびGlu間;AsnおよびGln間;および塩基性残基LysおよびArg間;または芳香族性残基PheおよびTyr間である。特に好ましいのは、数個の、5個から10個の、1個から5個の、または2個のアミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失、または付加している変異型である。
さまざまな他の態様では、ポリペプチドまたはその断片もしくはポリペプチド変異型またはホモログは、直鎖または分枝であり得、修飾アミノ酸を含み得、非アミノ酸により中断され得、および/または2個以上のポリペプチド鎖の複合体に会合し得る。当業者によく理解されている通り、ポリペプチドは、天然でまたは介入;例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識成分との結合のような任意の他の操作もしくは修飾により修飾され得る。ある態様では、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、当業者に既知の他の修飾と同様、1個またはそれ以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などを含む)を含む。
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片は、単離した天然で生じるポリペプチドを含む。好ましくは、そのような天然で生じるポリペプチドは、選択した集団で、少なくとも5%、および最も好ましくは、少なくとも10%の頻度を有する。選択集団は、集団遺伝学の分野で認識された任意の研究集団であり得る。好ましくは、選択集団は、白人、黒人、またはアジア人である。より好ましくは、選択集団は、フランス人、ドイツ人、英国人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、韓国人、中国系シンガポール人、アイスランド人、北米人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシャ人、イタリア人、ポーランド人、太平洋諸島系、またはインド人である。
ペプチドのリコンビナント合成
本発明のポリペプチドまたはその断片は、また、リコンビナントで産生したポリペプチド、合成的に産生したポリペプチドおよび本発明のそのようなポリペプチドの組合せ、ならびにその断片を含み得る。そのようなポリペプチドを製造するための手段を、当業者はよく理解している。例えば、本発明のポリヌクレオチド断片またはポリペプチドは、非限定的に、血清、尿、および腹水を含む体液から単離するか、または化学的もしくは生物学的方法により合成する(例えば、細胞培養、リコンビナント遺伝子発現)。本明細書で別に記載がなければ、“単離”は“共存物質からの分離”という意味を含む。
本発明のポリペプチドまたはその断片は、また、リコンビナントで産生したポリペプチド、合成的に産生したポリペプチドおよび本発明のそのようなポリペプチドの組合せ、ならびにその断片を含み得る。そのようなポリペプチドを製造するための手段を、当業者はよく理解している。例えば、本発明のポリヌクレオチド断片またはポリペプチドは、非限定的に、血清、尿、および腹水を含む体液から単離するか、または化学的もしくは生物学的方法により合成する(例えば、細胞培養、リコンビナント遺伝子発現)。本明細書で別に記載がなければ、“単離”は“共存物質からの分離”という意味を含む。
本発明のリコンビナントポリペプチドは、当業者に既知の工程により、発現系を含む遺伝学的に設計した宿主細胞から調製し得る。したがって、さらなる局面では、本発明は、リコンビナント技術によるポリペプチドの産生、核酸または本発明のポリペプチドをコードした核酸を含む発現系、遺伝学的に設計されたそのような発現系を有する宿主細胞、およびポリペプチドを単離する方法に関する。
“核酸”なる用語は、天然または半合成または合成もしくは修飾核酸分子を意味する。それは、デオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボ核酸(RNA)および/または修飾ヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことを言う。これらの用語は、交換可能に使用されることを意図する。RNAは、tRNA(運搬RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(リボソームRNA)、mRNA(メッセンジャーRNA)、アンチセンスRNA、およびリボザイムの形態であり得る。DNAは、プラスミドDNA、ウイルスDNA、直鎖DNA、染色体またはゲノムDNA、cDNA、もしくはこれらのグループの誘導体の形態であり得る。さらに、これらのDNAおよびRNAは、1本鎖、2本鎖、3本鎖、または4本鎖であり得る。用語はまた、PNA(ペプチド核酸)、ホスホロチオエート、および天然核酸のリン酸骨格の他の変異型を含む。
ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェントな条件”は、通常の技術を有する当業者により容易に決定でき、一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算値である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方で、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が融点の近くではあるがそれ以下ではない環境中に存在するとき、変性した核酸が再アニールする能力に依存している。プローブおよびハイブリダイズ可能な配列間の相同性の程度が高い程、より高い相対温度が必要とされる。結果として、当然、より高い相対温度がよりストリンジェントな反応条件を作り出し、より低い温度が、よりストリンジェントでない反応条件を作り出す傾向があることになる。さらに、ストリンジェンシーは、また、塩濃度に反比例する。“ストリンジェントな条件”は、次に特徴づけられるような反応条件により例示される:(1)洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、50℃で、0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム;(2)変性剤、例えば、ホルムアミド(例えば、42℃で、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム中、pH6.5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液中の、50%(体積/体積)ホルムアミド)。あるいは、ストリンジェントな条件は、42℃で、50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×Denhardt's溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50 □g/ml)、0.1%SDS、および10%硫酸デキストラン、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中、42℃、および50%ホルムアミド中、55℃で洗浄し、その後、55℃でEDTAを含む0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関するさらなる詳細および説明のために、Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology (1995)を参照のこと。
ポリペプチドは、当業者に既知の方法に従って、多くの発現系のいずれかで、リコンビナントに発現することができる。Ausubel et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley Sons, New York, 1990)。そのような発現系は、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系を含み、例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、パポバウイルス(例えば、SV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス)のようなウイルス由来のベクター、および、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレメント(例えば、コスミドおよびファージミド)のようなその組合せ由来のベクターを含む。
発現系は、発現を制御および誘導する制御領域を含み得る。一般に、宿主内で、ポリペプチドを産生する核酸を維持し、増殖し、または発現する任意の系またはベクターを使用し得る。適当なヌクレオチド配列を、既知で日常的なさまざまな技術のいずれかにより、発現系に挿入し得る(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)で説明されたもの)。一般に、DNAは、当業者に既知の技術を用いて、適当な制限エンドヌクレアーゼサイトに挿入される。
ベクター構成要素は、一般に、非限定的に、1個またはそれ以上の複製開始点、1個またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、シグナル配列または分泌配列、および転写終結配列を含む。
発現ベクターは2個の複製系を有し得、それ故、2種の生物、例えば、発現のためのほ乳類または昆虫細胞およびクローニングならびに増幅のための原核生物宿主で維持することが可能になる。そのような配列は、さまざまなバクテリア、酵母系統、およびウイルスに関して既知である。
好ましくは、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業者に既知であり、使用する宿主細胞で変わる。発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択遺伝子(また、選択可能マーカーと呼ばれる)を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンのような抗生物質または他の毒素に対する耐性を与えるタンパク質、(b)栄養要求性欠損を補償するタンパク質、または(c)例えば、D-アラニンラセマーゼ遺伝子のような重要な栄養を供給するタンパク質をコードしている。
プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターをコードしている。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。1個以上のプロモーターの要素を結合したハイブリッドプロモーターは、また、当業者に既知であり、本発明に役立つ。さらに、発現ベクターを統合するために、発現ベクターは少なくとも1個の宿主細胞ゲノムと相同な配列を含み、そして、好ましくは、発現コンストラクトの側面に位置する2個の相同配列を含む。統合ベクターは、ベクター中の適当な相同配列の挿入により、宿主細胞での特定の遺伝子座に向け得る。統合ベクターのためのコンストラクトは、当業者に既知である。
適当な分泌シグナルを、望むポリペプチドに組み込み得、それにより、小胞体ルーメン、ペリプラズムスペースまたは細胞外環境へのポリペプチドの分泌を可能にする。これらのシグナルはポリペプチドの内部にあってよく、またはそれらは異種シグナルであってよい。シグナル配列は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定エンテロトキシンIIリーダー(heat-stable enterotoxin II leaders)のグループから選択される、原核生物シグナル配列であってよい。酵母分泌のために、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromycesα因子リーダーを含む)であり得る。ほ乳類細胞発現系では、同種または関連種の分泌型ポリペプチドからのほ乳類シグナル配列およびウイルス分泌リーダーを、ペプチド、変異型またはそのホモログを分泌させるために使用する。適当な宿主細胞は、酵母、バクテリア、古細菌、菌類、および昆虫、ならびにほ乳類細胞を含む動物細胞（例えば、非限定的に幹細胞を含む初代培養細胞)を含む。適当な宿主の代表例は、バクテリア細胞、例えば、E. coli、Streptococci、Staphylococci、Streptomyces、およびBacillus subtilis;菌類細胞、例えば、Saccharomyces cerevisiae、他の酵母細胞またはAspergillus;昆虫細胞、例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞;動物細胞、CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293およびBowes黒色腫細胞;ならびに植物細胞を含む。
宿主細胞系統は、挿入配列の発現を調節する能力、または望む方法で発現したポリペプチドを加工する能力に関して、選択し得る。ポリペプチドのそのような修飾は、非限定的に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含む。ポリペプチドの“プレプロ”型を切断する翻訳後加工は、また、正確な挿入、フォールディングおよび/または機能のために重要であり得る。
形質転換宿主細胞は、非限定的に、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミックDNA発現ベクターで形質転換したバクテリアのような微生物、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、およびリコンビナント昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞、ならびにほ乳類発現系を含む。
ペプチドの発現に関する適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択で変わり、日常的な実験を通して、容易に、当業者により確定される。例えば、発現ベクターでの構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化するのに必要であり、一方で、誘導性プロモーターの使用は、誘導のために適当な成長条件を必要とする。さらに、ある態様では、収集のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞と一緒に使用されるバキュロウイルス系は、溶菌ウイルスであり、よって、収集時期の選択は収量のために重要である。
望むGPA071ペプチド断片を、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、リコンビナントに産生し得る。そのような異種ポリペプチドは、一般に、GPA071ペプチドまたは断片のアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれており、抗-タグ抗体が選択的に結合できるエピトープタグを提供し得る。したがって、そのようなエピトープタグは、抗-タグ抗体またはエピトープタグに結合する他のタイプの親和性マトリックスを用いて、ペプチドまたはその断片を容易に精製できるようにする。エピトープタグの実施例は、6×Hisまたはc-mycタグである。あるいは、GPA071ペプチドまたはその断片を、例えば、GST融合タンパク質の形態で発現し得る。適当なコンストラクトは、一般に、当業者に既知であり、Invitrogen (San Diego, Calif., USA)、Stratagene (La Jolla, Calif., USA), Gibco BRL (Rockville, Md., USA)またはClontech (Palo Alto, Calif., USA)のような商業的供給業者から入手できる。
遺伝子発現の評価
遺伝子発現を、当業者に既知の標準的な技術、例えば、本明細書で提供する配列に基づく適当な標識プローブを用いた、DNA検出のためのサザンブロッティング、mRNAの転写を決定するためのノザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA)、もしくはインサイチュハイブリダイゼーションにより、直接、試料を評価し得る。あるいは、抗体を、核酸、例えば、DNA2本鎖、RNA2本鎖、およびDNA-RNAハイブリッド2本鎖またはDNA-タンパク質2本鎖を含む、特異的2本鎖の検出のためのアッセイで使用し得る。そのような抗体を標識し得、そして、2本鎖が表面に結合している所でアッセイを行った結果、表面における2本鎖の形成で、2本鎖に結合した抗体の存在を検出できる。あるいは、遺伝子発現は、直接、GPA071ペプチドまたは断片の発現を評価するために、細胞または組織切片の免疫組織学的染色および細胞培養または体液のアッセイにより測定し得る。そのような免疫学的アッセイのために使用する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、本明細書で提供したDNA配列に基づいて、ホスホリパーゼA2またはGPA071断片の天然の配列に対して製造し得る。
遺伝子発現を、当業者に既知の標準的な技術、例えば、本明細書で提供する配列に基づく適当な標識プローブを用いた、DNA検出のためのサザンブロッティング、mRNAの転写を決定するためのノザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA)、もしくはインサイチュハイブリダイゼーションにより、直接、試料を評価し得る。あるいは、抗体を、核酸、例えば、DNA2本鎖、RNA2本鎖、およびDNA-RNAハイブリッド2本鎖またはDNA-タンパク質2本鎖を含む、特異的2本鎖の検出のためのアッセイで使用し得る。そのような抗体を標識し得、そして、2本鎖が表面に結合している所でアッセイを行った結果、表面における2本鎖の形成で、2本鎖に結合した抗体の存在を検出できる。あるいは、遺伝子発現は、直接、GPA071ペプチドまたは断片の発現を評価するために、細胞または組織切片の免疫組織学的染色および細胞培養または体液のアッセイにより測定し得る。そのような免疫学的アッセイのために使用する抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、本明細書で提供したDNA配列に基づいて、ホスホリパーゼA2またはGPA071断片の天然の配列に対して製造し得る。
発現タンパク質の精製
発現したGPA71またはGPA71断片を、当業者に既知のさまざまな方法のいずれかを用いて、発現後、精製または単離し得る。適当な技術は、GPA71またはGPA71断片の発現様式に依存して変わる。例えば、ポリペプチドを、分泌タンパク質の形態で培養培地から回収するか、または宿主細胞ライセートから回収する。細胞を、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊のようなさまざまな物理的、化学的手段によるか、または細胞溶解剤の使用により破壊でき、一方で、膜結合ポリペプチドは、適当な界面活性剤溶液(例えば、Triton-X 100)を用いるか、または酵素的切断により膜から遊離し得る。ポリペプチドの精製または単離のための適当な技術は、また、他にどんな成分が試料中に存在しているかに依存して変わる。必要な精製の程度は、また、GPA71またはその断片の使用に依存して変わる。単離または精製により除去される不純成分は、典型的に、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他の溶質を含み得る。選択される精製工程は、例えば、使用される産生プロセスおよび産生される特定の断片の性質に依存する。
発現したGPA71またはGPA71断片を、当業者に既知のさまざまな方法のいずれかを用いて、発現後、精製または単離し得る。適当な技術は、GPA71またはGPA71断片の発現様式に依存して変わる。例えば、ポリペプチドを、分泌タンパク質の形態で培養培地から回収するか、または宿主細胞ライセートから回収する。細胞を、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊のようなさまざまな物理的、化学的手段によるか、または細胞溶解剤の使用により破壊でき、一方で、膜結合ポリペプチドは、適当な界面活性剤溶液(例えば、Triton-X 100)を用いるか、または酵素的切断により膜から遊離し得る。ポリペプチドの精製または単離のための適当な技術は、また、他にどんな成分が試料中に存在しているかに依存して変わる。必要な精製の程度は、また、GPA71またはその断片の使用に依存して変わる。単離または精製により除去される不純成分は、典型的に、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他の溶質を含み得る。選択される精製工程は、例えば、使用される産生プロセスおよび産生される特定の断片の性質に依存する。
通常、単離GPA071またはその断片は、少なくとも1つの精製工程により製造される。精製に関する既知の方法は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む。最も好ましくは、親和性クロマトグラフィーを精製のために使用する。限外濾過または透析技術は、また、タンパク質濃度と連動して使用する。例えば、Scopes R、Protein Purification (Springer Verlag, New York, N.Y., 1982)を参照のこと。ポリペプチドが、単離および/または精製の間に変性するとき、リフォールディングタンパク質に関する既知の技術を、活性なコンホメーションを再生するために使用し得る。
発現ポリペプチドの標識
本発明の核酸、タンパク質および抗体は、標識し得る。本明細書で標識されるとは、化合物が、化合物の検出が可能になるように結合した少なくとも1個のエレメント、放射性同位体または化合物を有することを意味する。一般に、標識は3つのクラスに分類する:a)放射能または重同位体であり得る、放射性同位体標識;b)抗体または抗原であり得る、免疫標識;およびc)着色または蛍光染色。標識を、生物学的活性を妨害しないか、または検出される化合物に特徴的な、任意の位置で化合物に組み込み得る。
本発明の核酸、タンパク質および抗体は、標識し得る。本明細書で標識されるとは、化合物が、化合物の検出が可能になるように結合した少なくとも1個のエレメント、放射性同位体または化合物を有することを意味する。一般に、標識は3つのクラスに分類する:a)放射能または重同位体であり得る、放射性同位体標識;b)抗体または抗原であり得る、免疫標識;およびc)着色または蛍光染色。標識を、生物学的活性を妨害しないか、または検出される化合物に特徴的な、任意の位置で化合物に組み込み得る。
断片の化学的製造
ポリペプチドまたはその断片は、リコンビナントな方法によってだけではなく、また、当業者に既知の化学的方法を用いて産生し得る。固相ペプチド合成は、バッチ式または連続して、α-アミノ酸および側鎖保護アミノ酸残基を不溶性高分子支持体にリンカー基を介して加えていく、連続的な流れ工程で実行し得る。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールのようなリンカー基を、樹脂支持体を形成するために、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)に接続する。アミノ酸残基は、酸不安定Boc(t-ブチルオキシカルボニル)または塩基不安定Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)により、Nアルファ保護される。保護したアミノ酸のカルボキシル基は、リンカー基のアミンに結合し、残基を固相支持樹脂に固定する。トリフルオロ酢酸またはピペリジンを、それぞれ、BocまたはFmocの場合に、保護基を除去するのに用いる。それぞれの付加アミノ酸を、カップリング剤またはプレ活性化アミノ酸誘導体を用いて固定した残基に加え、樹脂を洗浄する。十分な長さのペプチドを、連続した脱保護、誘導体化アミノ酸のカップリングおよびジクロロメタンおよび/またはN,N-ジメチルホルムアミドを用いた洗浄により合成する。ペプチドを、ペプチドカルボキシ末端とリンカー基の間で切断し、ペプチド酸またはアミドを産生する。Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook (San Diego, Calif.) pp. S1 S20。自動合成はまた、例えば、ABI 431Aペプチド合成機(Applied Biosystems)のような機械で行い得る。ポリペプチドまたはその断片を、分取型高性能液体クロマトグラフィーにより精製し得、その組成物をアミノ酸解析またはシークエンシングにより確認し得る(Creighton T.E. Proteins, Structures and Molecular Properties (W H Freeman, New York N.Y., 1984)。
ポリペプチドまたはその断片は、リコンビナントな方法によってだけではなく、また、当業者に既知の化学的方法を用いて産生し得る。固相ペプチド合成は、バッチ式または連続して、α-アミノ酸および側鎖保護アミノ酸残基を不溶性高分子支持体にリンカー基を介して加えていく、連続的な流れ工程で実行し得る。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールのようなリンカー基を、樹脂支持体を形成するために、ポリ(スチレン-コ-ジビニルベンゼン)に接続する。アミノ酸残基は、酸不安定Boc(t-ブチルオキシカルボニル)または塩基不安定Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)により、Nアルファ保護される。保護したアミノ酸のカルボキシル基は、リンカー基のアミンに結合し、残基を固相支持樹脂に固定する。トリフルオロ酢酸またはピペリジンを、それぞれ、BocまたはFmocの場合に、保護基を除去するのに用いる。それぞれの付加アミノ酸を、カップリング剤またはプレ活性化アミノ酸誘導体を用いて固定した残基に加え、樹脂を洗浄する。十分な長さのペプチドを、連続した脱保護、誘導体化アミノ酸のカップリングおよびジクロロメタンおよび/またはN,N-ジメチルホルムアミドを用いた洗浄により合成する。ペプチドを、ペプチドカルボキシ末端とリンカー基の間で切断し、ペプチド酸またはアミドを産生する。Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook (San Diego, Calif.) pp. S1 S20。自動合成はまた、例えば、ABI 431Aペプチド合成機(Applied Biosystems)のような機械で行い得る。ポリペプチドまたはその断片を、分取型高性能液体クロマトグラフィーにより精製し得、その組成物をアミノ酸解析またはシークエンシングにより確認し得る(Creighton T.E. Proteins, Structures and Molecular Properties (W H Freeman, New York N.Y., 1984)。
天然ポリペプチドの変異型は、さまざまな状況で望まれ得る。例えば、望まない副作用を、ある変異型により減少させ得る(特に、該副作用活性が、ポリペプチドの望む活性とは異なる部分と関連している場合には)。ある発現系では、天然のポリペプチドは、プロテアーゼにより容易に分解され得る。そのような場合には、影響を受けやすい配列を変えるアミノ酸の選択的置換および/または欠失により、有意に収量を高めることができる。変異型はまた、精製手順において収量を増やし、および/または酸化、アシル化、アルキル化、または他の化学修飾を受けやすいアミノ酸を除去することにより、タンパク質の貯蔵寿命を延ばし得る。好ましくは、そのような変異型は、コンホメーション的に中立である(すなわち、それらは、変異型ポリペプチドの3次構造において、天然のポリペプチドと比較したとき、最小限の変化しかもたらさないように設計されている)、そして(ii)抗原性が中立である(すなわち、それらは、変異型ポリペプチドの抗原決定基において、天然のポリペプチドと比較したとき、最小限の変化しかもたらさないように設計されている)変化を含む。
本発明にしたがって前述のポリペプチドは、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態、特に癌、より特に結腸直腸癌の処置における使用に関する医薬の製造のために使用し得る。
本発明のさらなる局面は、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態の処置のための方法を提供し、該方法は、ポリペプチドの有効量を疾患または状態に罹患したヒトを含むほ乳類に投与することを含む(ここで、ポリペプチドは、a)GPA71(配列番号1または配列番号2)もしくはGPA71の断片;b)(a)のポリペプチドのいずれか1個のアミノ酸配列と、少なくとも50%の同一性割合を有する生物活性ポリペプチド;またはc)(a)または(b)のポリペプチドのいずれか1個の生物活性変異型からなるグループから選択される)。したがって、上記した通りのポリペプチドを投与し得る。好ましくは、ポリペプチドは、GPA71またはその断片を含む。
処置の目的のための“ほ乳類”は、ヒト、家畜、ならびに動物園、競技用、またはペット動物を含む、ほ乳類として分類された全ての動物のことを言う(例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど)。好ましくは、ほ乳類はヒトである。
“処置”なる用語は、治療的処置および防止的または予防的手段のことを言う。処置を必要とするヒトは、すでに障害を有するヒトおよび障害を予防すべきヒトを含む。
“疾患”または“状態”は、上記および、さらに下記した通り、GPA71またはGPA71断片を用いた処置により利益を有する任意の状態である。これは、慢性および急性の疾患ならびに状態、および、問題となっている疾患または状態にかかりやすくなる病的状態を含む。
本明細書の処置すべき疾患または状態の非限定的な例は、過度の細胞増殖、特に癌、および、より特には結腸直腸癌から生じる全ての状態を含む。過剰増殖性疾患の例は、非限定的に、大腸、腹部、骨、胸部、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頸部、神経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器に位置する腫瘍を含む。他の過剰増殖性疾患、障害、および/または状態は、非限定的に、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、障害、および/または状態、異タンパク血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症を含む。他の増殖性疾患は、医学分野の当業者に既知である。
本発明の他の局面では、GPA71またはGPA71の断片を、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態の処置のための適当な治療法として提供し、これは、GPA71またはその断片の有効量を、該疾患に罹患しているヒトを含むほ乳類に投与することを含む。
医薬組成物は、前述の処置法において使用し得る。そのような組成物は、好ましくは、滅菌されており、そして、患者への投与に適した重さまたは体積の単位で望む応答を誘導するために、GPA71またはその断片もしくはポリペプチドまたは断片をコードした核酸の有効量を含む。
GPA71またはその断片、化合物、もしくは医薬組成物の“有効量”は、細胞増殖性疾患のような臨床結果を含む、有益なまたは望むべき結果に影響を与えるのに十分な量である。そのような量はまた、処置される特定の状態、状態の重篤性、年齢、身体状態、身長および体重を含む個々の患者のパラメーター、処置の期間、併用治療の性質(あるとしたら)、特定の投与経路および医療関係者の知識と経験の範囲内の同様の要因に依存している。これらの要因は、医学分野の当業者に既知であり、通常の実験のみで対応することができる。
有効量を1回またはそれ以上の投与で投与でき、他の薬物、化合物、または医薬組成物と併せてまたはなしで達成し得る。よって“有効量”は、1個またはそれ以上の治療剤を投与することとの関連で検討し得、そして、単剤は、1個またはそれ以上の他の薬剤と併せて、望む結果が得られそうであるか、または達成されるならば、有効量で投与したと考え得る。
本発明のポリペプチドを、単独、または、他の薬物、化合物、もしくは医薬組成物とともに含む、GPA71またはGPA71断片もしくは医薬組成物の有効量を、注射または経時的な逐次の輸液を含む、任意の慣用的な経路により投与できる。例えば、投与は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、局所または経皮的であり得る。
投与するとき、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される製剤で投与される。本明細書で使用する、“薬学的に許容される担体”なる用語は、ヒトを含むほ乳類への投与のために適当な1個またはそれ以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。“担体”なる用語は、有機または無機成分、天然または合成であることを示しており、それと活性成分を、適用を促進するために結合させる。
“薬学的に許容される”なる用語は、活性成分の生物学的活性の効果を妨害しない、非毒性物質を意味する。そのような製剤は、通常、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、補助的免疫増強剤、例えば、アジュバントおよびサイトカインならびに、所望により、他の治療剤(例えば、化学療法剤)を含み得る。
医薬で使用するとき、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、便利には、その薬学的に許容される塩を製造するのに使用し得、発明の範囲から除外しない。
医薬組成物は、酢酸塩;クエン酸塩;ホウ酸塩;およびリン酸塩を含む、適当な緩衝剤を含み得る。
医薬組成物は、所望により、適当な防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウム;クロロブタノール;パラベンおよびチメロサールを含み得る。
対象に投与するポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードした核酸の用量は、異なったパラメーター、特に、使用する投与形態および対象の状態にしたがって選択できる。他の要因は、望む処置期間を含む。対象の応答が、適用した最初の用量で不十分な場合には、患者の耐容性が許す程度まで、より高用量(または、異なった、より局所的な運搬経路による効果的な高用量)を使用し得る。
医薬組成物は、便利に、単位用量形で提供され得、薬学の当業者に既知の任意の方法により製造し得る。すべての方法は、活性剤を、1個またはそれ以上の補助成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般に、組成物は、均一および密接に、活性化化合物を液体担体、微細分割固体担体、またはその両方と結合させ、次いで、必要ならば、製品を成形することにより製造する。
経口投与のための適当な組成物は、それぞれ活性化合物の所定量を含む不連続単位、例えば、カプセル、錠剤、トローチ剤として提供し得る。他の組成物は、例えば、シロップ、エリキシル剤またはエマルジョンのような、水性液体懸濁液または非水性液体懸濁液を含む。
非経腸投与のための適当な組成物は、便利には、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸の滅菌水性または非水性製剤を含み、好ましくは、受容者の血液と等張である。この製剤は、分散または湿潤剤および懸濁剤を用いた既知の方法にしたがって製剤化し得る。滅菌注射可能製剤は、また、滅菌注射可能溶液または非毒性の非経腸的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、1,3-ブタンジオール(butandiol)中の懸濁液であり得る。使用し得る、許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油は、便利には、溶媒または懸濁化剤として使用し得る。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の固定油を、使用し得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注入物質の製造において使用し得る。
経口、皮下、静脈内、筋肉内投与などのための適当な担体製剤は、Remington's Pharma ceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton、PA.)で発見できる。
本発明の他の局面は、過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予後診断もしくは診断のための方法を提供し、これは、診断すべき対象から取得した生物学的試料中のGPA71またはその断片のレベルを検出することを含む(ここで、変化したレベルは、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態を示している)。本発明の1つの態様は、ある対象における過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予後診断もしくは診断のための方法を提供し、これは、工程(i)最初の値を提供するために、対象から取得した生物学的試料中のGPA71またはその断片のレベルを検出し;そして、工程(ii)最初の値を、疾患または状態ではない対象からのGPA71またはその断片のレベルと比較する(ここで、疾患ではない対象からの試料中のGPA71またはその断片のレベルと比較して、対象からの生物学的試料中のレベルの変化は、対象が過度の細胞増殖と関連した疾患または状態に罹患しやすくなっているか、または有することを示している)ことを含む。
そのような生物学的試料は、血液、血漿または組織試料を含む。適当な組織試料は、血液、精液、唾液、涙、尿、便物質、汗、口腔スメア、皮膚、および特定器官組織、例えば、筋肉、脳、または神経組織および髪の生検を含む。最も好ましくは、適当な生物学的試料は、血液または血漿を含む。組織試料はまた、そのような生物学的試料から単離した細胞および細胞型を含む。GPA71またはその断片のレベルの変化は、本発明の好ましい態様にしたがって、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態に罹患していない個人で見られる通りのGPA71またはGPA71断片血漿レベルと比べて、本発明の範囲内のGPA71またはその断片の増加した血漿レベルを含む。増加は、少なくとも1.2倍、より好ましくは、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、5倍または10倍である。
さらなる局面にしたがって、本発明は、過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予後診断もしくは診断のための方法を提供し、これは、i)最初の値を提供するために、対象から取得した適当な組織試料中の、表1で同定した少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを検出すること;およびii)最初の値を、非疾患対象からの該遺伝子の発現レベルと比較すること(ここで、非疾患対象からの試料と比較して、対象試料中のより大きいまたはより小さい発現レベルは、対象が過度の細胞増殖と関連した疾患または状態に罹患しやすくなっているか、または有することを示している)を含む。遺伝子発現をmRNAまたはタンパク質レベルで検出し得る。適当な技術は、非限定的に、肝臓、心臓、十二指腸のような腸、脾臓、骨髄を含む。mRNA発現レベルを、任意の適当な技術、例えば、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、逆転写PCRおよび実時間定量的PCRにより検出し得る。同様に、タンパク質レベルを、任意の適当な技術、例えば、タンパク質に特異的な標識プローブを利用することによるウエスタンブロッティングにより検出し得る。
上記の局面の好ましい態様では、遺伝子は、上方調節または下方調節される表1で明示した遺伝子から選択される。好ましくは、遺伝子は、1.2倍またはそれ以上、1.3倍またはそれ以上、もしくは1.5倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍またはそれ以上、上方調節される表1で説明した遺伝子から;または、0.8倍またはそれ以下、0.7倍またはそれ以下、もしくは0.6倍またはそれ以下、下方調節される表1で説明した遺伝子から選択される。上記の局面のまた他の好ましい態様では、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、10個、20個、30個の発現を測定する。本発明の他の態様では、表1から選択した少なくとも40個、50個、または60個の遺伝子の発現を測定する。本発明のまたさらなる態様は、表1から選択した大部分の遺伝子の発現、例えば、65個、70個、80個、90個、100個または少なくとも110個の発現を決定するか、または表1のすべての遺伝子の発現を決定する。
また、本発明のさらなる局面は、過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態のモジュレーターを同定する方法を提供し、これは、(i)試験化合物を、GPA71またはGPA71断片のうち少なくとも1個の生物学的活性を許容する試料条件下で、GPA71またはその断片と接触させ、(ii)該少なくとも1個のGPA71/GPA71断片生物学的活性レベルを決定し、(iii)該レベルを、該試験化合物を欠いた対象試料のレベルと比較する工程を含む。好ましい態様において、該レベルの変化を引き起こす該試験化合物は、過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予防的および/または治療上の処置のためのGPA71またはGPA71断片モジュレーターとして、さらなる試験のために選択する。好ましい態様において、GPA71またはGPA71断片の生物学的活性のレベルを、1個またはそれ以上もしくは、例えば、表1で説明した少なくとも61個、70個、または100個の遺伝子のような複数個の遺伝子の発現レベルを検出することにより測定する。
過度の細胞増殖と関連した疾患または状態のモジュレーターの実施例は、非限定的に、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、2本鎖RNAおよびアンタゴニストを含む。
“2本鎖RNA”、すなわち本発明のポリペプチドをコードした少なくとも1個の核酸に相当するセンス-アンチセンスRNAなる用語は、また、開示した遺伝子の少なくとも1個の発現を妨害するのに利用できる。内因性遺伝子の2本鎖RNAによる機能および発現の妨害は例えば、Fire et al., Nature 391: 806 811 (1998)で記載したような線虫;例えば、Kennerdell et al., Cell 95(7): 1017 1026 (1998) で記載したようなショウジョウバエ;および、例えば、Wianni et al., Nat. Cell Biol. 2(2): 70 75 (2000)で記載した通りのマウス胚のようなさまざまな生物で示されている。そのような2本鎖RNAは、鋳型の両方向から読まれる1本鎖RNAのインビトロ転写、およびセンスならびにアンチセンスRNA鎖のインビトロアニーリングにより合成できる。2本鎖RNAはまた、興味ある遺伝子を、逆方向反復により分離した反対の方向にクローン化する、cDNAベクターコンストラクトから合成できる。細胞へのトランスフェクション後、RNAを転写し、そして相補鎖をリアニールする。
“アンタゴニスト”なる用語は、本発明のポリペプチドまたはその断片が結合したとき、該ポリペプチドの少なくとも1個の生物学的活性を減らすか、または阻害する分子のことを言う。アンタゴニストは、非限定的に、ペプチド、タンパク質、炭水化物、および小分子を含むことができる。
特に役立つ態様では、アンタゴニストは、ホスホリパーゼA2に特異的な抗体である。抗体を、また、例えば、化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素などのような試薬に結合し得、そして標的薬剤として役立ち得る。
また、他の態様では、アンタゴニストは、例えば、癌、より特には、結腸直腸癌のような過度の細胞増殖と関連した疾患または状態を処置するための治療として役立つ。
“単離した”核酸分子なる用語は、核酸分子が、もとの環境(例えば、自然に存在するならば、天然の環境)から移動することを意味する。例えば、自然に存在する核酸分子は、単離していないが、同じ核酸分子で、自然系の中の共存する物質のいくつかまたはすべてから分離したものは、その後、自然系の中に再導入されたとしても、単離している。そのような核酸分子は、ベクターの一部または組成物の一部であり、そして、そのようなベクターまたは組成物が自然環境の一部ではないという点で、なお単離されている。
リボザイムまたは2本鎖RNA分子を用いた処置に関して、方法は、リボザイムをコードしたヌクレオチド配列、または2本鎖RNA分子の治療上有効量を投与することを含み、ここで、リボザイムをコードしたヌクレオチド配列/2本鎖RNA分子は、転写/翻訳GPA71またはその断片を減らす能力を有する。
アンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードしたヌクレオチド配列、2本鎖RNA、またはアンタゴニストを含む単離した核酸分子の“治療上有効量”は、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態を処置するために、これらの治療剤のうち1個の十分な量のことを言う。
治療上有効量の決定は、十分、当業者の能力の範囲内にある。任意の治療のために、治療上有効量は、最初は、細胞培養アッセイか動物モデル(通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ)で概算できる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用し得る。そのような情報は、その後、ヒトにおける投与のための実用的な用量および経路を決定するのに使用できる。
治療的適用のために、アンチセンスヌクレオチド、リボザイムをコードするヌクレオチド配列、2本鎖RNA(リポソームに封入されていてもいなくても、またはウイルスベクターに含まれていてもいなくても)および抗体を、好ましくは、治療剤を1個またはそれ以上の薬学的に許容される担体と組合せて含む医薬組成物として投与する。組成物は、単独で、または少なくとも1個の他の薬剤、例えば、安定化化合物との組合せで投与し得て、それは、非限定的に、生理食塩水、デキストロース、および水を含む、任意の滅菌生体適合性医薬担体中で投与し得る。組成物を単独で、または、他の薬剤、薬物もしくはホルモンとの組合せで、対象に投与し得る。
本明細書で引用したすべての文献は、それぞれ個々の文献、特許、または特許出願が、具体的におよび個々に、その全体をあらゆる目的のために、引用により本明細書の一部とすることが示されたのと同じ程度まで、それらの全体をおよびあらゆる目的のために引用により本明細書の一部とする。
本発明は、本出願に記載した特定の態様(それは、本発明の個々の局面の単なる例示であることを意図している)の観点において限定するものではない。本発明の多くの修飾および変形は、当業者に明らかな通り、その精神および範囲から逸脱することなく成すことができる。本明細書で列挙したものに加えて、本発明の範囲内の機能的に同等な方法および装置は、前述の記載から当業者には明らかである。そのような修飾および変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。本発明は、そのような特許請求の範囲が権利化されるのと同等の十分な範囲と共に、添付の特許請求の範囲の観点によってのみ制限すべきである。
Claims (14)
- 過度の細胞増殖と関連した疾患または状態の処置での使用に関する医薬の製造のためのGPA071ポリペプチドの使用であって、該ポリペプチドが配列番号1、配列番号2またはその生物活性断片から選択される配列を有するペプチドを含む、使用。
- 過度の細胞増殖と関連した疾患または状態が癌である、請求項1記載のポリペプチドの使用。
- 過度の細胞増殖と関連した疾患または状態が結腸直腸癌である、請求項2記載のポリペプチドの使用。
- 配列番号1、配列番号2またはその生物活性断片から選択される配列を有するペプチドを含むポリペプチドの有効量を、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態を有するほ乳類に投与することを含む、過度の細胞増殖と関連した疾患または状態の処置のための方法。
- 過度の細胞増殖と関連した疾患または状態が癌である、請求項4記載の方法。
- 過度の細胞増殖と関連した疾患または状態が結腸直腸癌である、請求項4記載の方法。
- ポリペプチドの有効量を静脈内、筋肉内、皮下、経口または局所的に投与する、請求項4記載の方法。
- ある対象における過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予後診断もしくは診断のための方法であって、
(i)最初の値を提供するために、対象から取得した生物学的試料中のGPA71またはその断片のレベルを検出し;そして、
(ii)最初の値を、疾患または状態を有さない対象からのGPA71またはその断片のレベルと比較する(ここで、疾患ではない対象からの試料中のGPA71またはその断片のレベルと比較して、対象からの生物学的試料中のレベルの変化は、対象が過度の細胞増殖と関連した疾患または状態に罹患しやすくなっているか、または有することを示している)、
工程を含む方法。 - 生物学的試料が血漿である、請求項8記載の方法。
- 表1で同定した1個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出する、請求項8記載の方法。
- 表1で同定した大多数の遺伝子の発現レベルを検出する、請求項8記載の方法。
- 過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態のモジュレーターを同定する方法であって、
(i)試験化合物を、GPA71またはGPA71断片の少なくとも1個の生物学的活性を許容する試料条件下で、GPA71またはその断片と接触させ、
(ii)GPA71またはGPA71断片の該少なくとも1個の生物学的活性レベルを決定し、
(iii)該レベルを、該試験化合物を欠いた対象試料のレベルと比較し、
(iv)過度の細胞増殖と関連した、疾患または状態の予防的および/または治療的処置のためのGPA71モジュレーターとして、さらなる試験のために、該レベルの変化を生じる試験化合物を選択する、
工程を含む方法。 - GPA71またはGPA71断片の生物学的活性レベルを、表1で明示した1個またはそれ以上の遺伝子の発現レベルを決定することにより測定する、請求項12記載の方法。
- 表1で同定した大多数の遺伝子の発現レベルを検出する、請求項12記載の方法。
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