CN101102790A - 对作为癌症治疗特别是结肠直肠癌治疗靶标的磷脂酶a2的鉴定及其作用机制 - Google Patents
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Abstract
已经在人血浆中检测到并且合成了磷脂酶A2的肽。将肽注射入小鼠，并且开展了许多器官的基因表达谱分析。磷脂酶A2对肝脏中基因表达的调节具有显著作用。所影响的基因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及PTEN途径的成员。基因表达的改变通常预示着，磷脂酶A2对细胞的增殖和侵袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌。
Description
相关申请
本申请要求2005年1月14日提出的USSN 60/643,990的优选权，其内容在此引用作为参考。
发明领域
本发明一般涉及组织样品的体外分析测试，并且更加具体而言涉及癌症中基因表达方面。
发明背景
“心血管疾病血浆多肽”(CPP)、CPP的片段以及翻译后修饰的形式以较低水平存在于患有冠状动脉疾病(CAD)的个体血浆中。CPP是分泌的因子，因此是容易检测的并且可用于药物开发、心血管疾病的诊断和预防。参阅于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842，“SECRETEDPOLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULARDISORDERS”。GeneProt公司(瑞士，日内瓦)在人血浆中检测到了磷脂酶A2(PLA2)的片段并且合成了该片段。该肽被命名为GP_1221076(还称作CPP-51或GPA071)。
在本领域还需要关于磷脂酶A2及其片段在血浆中的功能的额外信息。
发明简述
将分泌的磷脂酶A2，即GPA071肽注射人小鼠中。获得了许多器官中的基因表达谱。令人惊奇地是，GPA071肽显示出对肝脏中的基因表达调节具有显著的作用。所影响的基因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及PTEN途径的成员。基因表达的改变通常预示着，GPA071肽和PLA2对细胞的增殖和侵袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌。据我们所知，这是第一次发现分泌的磷脂酶A2对整联蛋白信号具有上游刺激作用。
因此，本发明提供了多肽(分泌磷脂酶A2，如GPA071肽)用于制造治疗增殖性疾病或病症，如癌症，特别是结肠直肠癌的药物的用途。
在进一步的方面，本发明涉及治疗增殖性疾病或病症，如癌症，特别是结肠直肠癌的方法，其包括向患有疾病或病症的包括人在内的哺乳动物施用有效量的如上所定义的多肽。
在另一个方面，本发明涉及用于增殖性疾病或病症，如癌症，特别是结肠直肠癌的药物组合物，其包含有效量的如上所定义的多肽以及可药用载体。
在另一个方面，本发明涉及磷脂酶A2用作癌症治疗，特别是结肠直肠癌治疗靶标的用途。
优选实施方案的详述
使用Velocegenomics方法(描述于2004年11月11日提出的PCT/EP2004/012572，“USE OF ORGANIC COMPOUND”)，将GPA071肽注射人小鼠中。获得了许多器官中的基因表达谱。令人惊奇地是，GPA071肽显示出对肝脏中的基因表达调节具有显著的作用。所影响的基因是整联蛋白信号途径、wnt途径以及PTEN途径的成员。见表1。
表1
| 变化 倍数 | 基因 | 基因名称 |
| 1.330.810.740.780.82 | Actn1Atf4Atf5ApcAnxa7 | 辅肌动蛋白，α1激活转录因子4激活转录因子5腺瘤性结肠息肉膜联蛋白A7 |
| 1.390.570.731.510.750.681.230.810.700.831.300.800.750.781.350.680.670.830.781.220.770.790.670.670.781.380.681.210.791.290.680.821.230.650.731.411.411.36 | CatnbCd151Ccl28Ccl9Crsp3CttnPscd1Dvl1DstFAKIhhIkbkgIlkIckLifrMadh4Mapkapk2Mknk1Mta1BC024131Mapk8Map3k12PrkclPrkclPpp2r1aArhu5133400C09RikSstr2Sos1Shc1Socs4Akt1TgfaTgm2Usf2CrkCrkWnt11 | 联蛋白βCD151抗原趋化因子(C-C基序)配体28趋化因子(C-C基序)配体9Sp1转录激活所需的辅因子，亚基3皮层肌动蛋白cytohesin1(血小板白细胞C激酶底物同系物，Sec7以及卷曲结构域1)dishevelled，dsh同系物1(Drosophila)肌动蛋白结合蛋白黏着斑激酶(PTK2蛋白质酪氨酸激酶2)Indian hedgehogκB激酶抑制剂γ整联蛋白偶联激酶肠细胞激酶白血病抑制因子受体MAD同系物4(Drosophila)MAP激酶活化的蛋白激酶2MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1转移相关1转移抑制基因1丝裂原活化蛋白激酶8丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶12蛋白激酶C，λ蛋白激酶C，λ蛋白磷酸酶2(以前为2A)，调节亚基A(PR65)，α同种型ras同系物基因家族，成员URIKEN cDNA 5133400C09基因促生长素抑制素受体2Son of sevenless同系物1(Drosophila)包含src同系物2结构域的转化蛋白C1细胞因子信号抑制蛋白4胸腺瘤病毒原癌基因1转化生长因子α转谷氨酰胺酶2，C多肽上游转录因子2v-crk肉瘤病毒CT10癌基因同系物(鸟类)v-crk肉瘤病毒CT10癌基因同系物(鸟类)无翅相关MMTV整合位点11 |
基因表达的改变通常预示着，GPA071肽和PLA2对细胞的增殖和侵袭具有积极作用，经基因注释指向了结肠直肠癌。
磷脂酶A2多核苷酸和多肽的结构是已知的。磷脂酶A2超家族信号转导酶日益增加：Dennis EA，Trends in Biochemical Sciences 22：1(1997)。从人血浆中分离的GPA071的肽序列(识别号GP_1221076)是AVWQFRKMIKCVIPGSDPFLEYNNYGCYCGLGGSGTPVDELDKCCQTHDNCYDQAKKLDSCKFLLDNPYTHTYSYSCSGSAITCSSKNKECEAFICNCDRNAAICFSKAPYNKAHKNLDTKKYCQS(SEQ ID NO：1)。参阅于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842，“SECRETEDPOLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULARDISORDERS”(在此引用作为参考)。所合成的124个氨基酸的小鼠GPA071的肽序列是AVWQFRNMIKCTIPGSDPLKDYNNYGCYCGLGGWGTPVDDLDRCCQTHDHCYSQAKKLESCKFLIDNPYTNTYSYSCSGSEITCSAKNNKCEDFICNCDREAAICFSKVPYNKEYKNLDTGKFC(SEQ ID NO：2)。
基于该基因表达分析发现，磷脂酶A2通过活化黏着斑复合物和整联蛋白信号途径而起作用。这可通过增加胆汁酸的释放直接发生，反过来胆汁酸激活了黏着斑激酶和下游信号事件，导致潜在的netto促增殖和促迁移作用。Debruyne PR等，Oncogene 21(44)：6740-50(2002年10月3日)。在胆汁酸和整联蛋白之间可能存在连接的证据由Haussinger D等，Gastroenterology 124(5)：1476-87(2003年5月)证明。然而，基因表达的改变可以源于补偿性作用并且掩盖了抗增殖作用(见下文)。体内验证试验，例如本文提供的那些试验是必需的。
通过注射GPA071影响到了结肠直肠癌所涉及的许多基因，例如β-联蛋白(参阅Waterman ML，Cancer Metastasis Rev.23(1-2)：41-52(2004年1-6月))、APC、wnt11(肠癌)。虽然认为分泌的磷脂酶A2可起到保护作用避免患有结肠直肠肿瘤，但是磷脂酶A2还是将结肠直肠癌与APC信号连接起来。Kennedy BP等，Cancer Res.58(3)：500-3(1998年2月1日)。
Velocegenomics方法
Velocegenomics方法描述于2004年11月11日提出的PCT/EP2004/012572，“USE OF ORGANIC COMPOUND”(在此引用作为参考)中。以300、600或1000μg/天的剂量向雄性C57BL/6小鼠皮下使用肽(在这里为GPA071)7-14天。处理阶段结束时，将来自所有器官的样品速冻并用GeneChip分析表达谱。
使用TRIzol试剂(Life Technologies)并根据产品说明书从这些冰冻组织中提取总RNA。通过λ＝260nm(A260nm)的吸收将总RNA定量，并且通过A260nm/A280nm比值评价纯度。通过变性凝胶电泳检查完整性。将RNA储存于-80℃直至分析。使用Superscript Choice System(LifeTechnologies)将质量好的总RNA合成双链cDNA。然后，将cDNA体外转录(MEGAscriptTM T7试剂盒，Ambion)形成生物素标记的cRNA。接着，将12-15mg标记cRNA与Affymetrix Mouse MOE430A表达探针列阵于45℃杂交16小时。然后按照EukGE-WS2方法(Affymetrix)洗涤阵列，并用10mg/ml链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(Molecular Probes)染色。用2mg/ml乙酰化BSA(Life Technologies)、100mM MES、1M[Na+]、0.05％Tween 20、0.005％ Antiofoam(Sigma)、0.1mg/ml山羊IgG和0.5mg/ml生物素化抗体将信号放大，然后用链霉亲和素溶液再次染色。洗涤后，用GeneArray扫描仪(Affymetrix)扫描阵列两次。
通过将用给定的寡核苷酸探针对测量的信号强度的差异平均(AvgDiff值)，来评估表达水平。在该研究中使用的图像获得和数字转换软件是Affymetrix Microarray Suite第5版(MAS5)。为了鉴定受处理影响的基因，在第一次波动分析中将数据集初次过滤以排除其数值系统性地处于试验噪音高情况下的低表达范围(在许多次试验中AvgDiff值为50，对应于任何试验点的最小拷贝数)的基因。在第二轮的选择中，阈值t-检验p-值(0.05)基于双组分误差模型(总体误差模型(Global Error Model))并且(如果可能)使用多假设检验的逐步下降修正(Benjamini和Hochberg错误发现率)鉴定在处理与非处理之间具有不同数值的基因。
然后使用Fisher′s精确检验将所选择的基因集与已经建立的对于途径和细胞成分的基因集相比较。使用Venn图表鉴定在不同的器官之间共同的基因改变。高度相关基因的表达谱用于使用几种距离度量(标准，Pearson)发现在各个试验点具有相关改变的基因。
认为特定基因具有相关性的结论是基于通过探测过滤所鉴定数值变化与如上所述统计学算法的结合以及与共同生物学主题所涉及的其它被调节基因的关系。
本发明的肽
如本文所使用，术语“多肽”指蛋白质、肽、寡肽或合成寡肽。这些术语可互换使用。这些术语中的任何一个是指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，而不管翻译后的修饰如糖基化或磷酸化。多肽还可以由一个以上的亚基组成，其中每一亚基由分开的DNA序列编码。
本发明的多肽可包括具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的GPA071。本发明多肽还包括本发明多肽的功能活性多肽片段。如本文所示，功能活性可通过在模型系统中测量肽调节基因表达的活性，例如通过Velocegeneomics方法来证明。如本文所使用，术语“生物活性的”指分子引起或影响生物事件。在一个优选的实施方案中，GPA071或其片段的生物活性水平通过检测表1中所列一个或多个基因的表达水平来测量。优选地，确定表1中多数基因的表达。本发明的“生物活性多肽”包括GPA071及其片段。还包括其氨基酸序列与GPA071及其功能活性片段的同一性至少50％的同系物。
此种多肽片段意思是指这样的多肽，即其氨基酸序列与本发明多肽的氨基酸序列的部分(并非全部)完全相同。此类多肽片段可以是“无支撑的”或者可以是更长多肽的部分，其中此类多肽部分形成了所述更长多肽的一部分或区域，最优选作为单一连续区域。片段可以包含至少10个氨基酸、优选至少15、20或25个氨基酸。更优选地，片段包含至少30个氨基酸。另一优选片段包含至少40、50、60、65、70或75个氨基酸。最优选地，片段包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的12、22、32、35、39、66、72或75个连续氨基酸。
此类多肽还可以是这样的片段，例如通过蛋白酶如胰蛋白酶产生的水解产物。本发明的多肽或多肽片段可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的C末端片段。此C末端片段可包含C末端的至少10个氨基酸、优选至少20或25个氨基酸、甚至更优选至少30个氨基酸或者至少65、70或75个氨基酸。至少10个氨基酸可以包含最C末端的至少10个氨基酸。多肽可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少32、35、39、66、72或75个最C末端的氨基酸。片段还可包含内部片段。
多肽还可以具有这样的氨基酸序列，即其与上述多肽如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中任意一个的氨基酸序列具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％或80％并且最优选至少90％，如95％、97％或99％的同一性。
氨基酸残基在此以标准的单字母或三字母符号表示：A(Ala)丙氨酸；C(Cys)半胱氨酸；D(Asp)天冬氨酸；E(Glu)谷氨酸；F(Phe)苯丙氨酸；G(Gly)甘氨酸；H(His)组氨酸；I(Ile)异亮氨酸；K(Lys)赖氨酸；L(Leu)亮氨酸；M(Met)蛋氨酸；N(Asn)天冬酰胺；P(Pro)脯氨酸；Q(Gin)谷氨酰胺；R(Arg)精氨酸；S(Ser)丝氨酸；T(Thr)苏氨酸；V(Val)缬氨酸；W(Trp)色氨酸；Y(Tyr)酪氨酸。
用于比较参照序列和另一序列(即“候选”序列)的术语“同一性百分比(％)”或相似术语意思是指两个序列间的最佳比对，候选序列与相当于所指出百分比的亚单位位置中的参照序列相同，对于多核苷酸比较而言亚单位为核苷酸，对于多肽比较而言为氨基酸。如本文所使用，所比较序列的“最佳比对”是使亚单位间的匹配最大化和使建立比对时所采用缺口的数量最小化的比对。同一性百分比可使用商业可得的运算执行工具确定，如Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)所述算法(Wisconsin序列分析包中的“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)。本领域中用于构建比对和计算同一性百分比或其它的相似性度量的其它软件包包括“BestFit”程序，该程序基于Smith&Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)的算法(Wisconsin序列分析包，Genetics Computer Group，Madison，WI)。同一性百分比还可通过WU-BLAST-2产生。Altschul等，Methods in Enzymology 266：460-480(1996)。WU-BLAST-2使用几种搜索参数，其中大多数参数被设置成默认值。将可调整的参数设置成如下值：重叠跨度＝1，重叠片段＝0.125，字开端(T)＝11。氨基酸序列同一性百分比通过匹配的相同残基数量除以比对区残基总数确定。例如，为了得到具有与参照氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，在参照序列中，不多于5％的氨基酸残基被删除或者被另外的氨基酸取代，或者参照序列总氨基酸残基中不多于5％的氨基酸数量被插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位置或者这些末端位置间的任何位置，或者单独散布于参照序列的残基当中，或者以一个或多个连续基团散步于参照序列中。应当理解，在与本发明的参照序列比较过程中，候选序列可以是较长多肽或多核苷酸的组成成分或片段，并且以计算百分比同一性为目的的此种比较可以相对于相关组成成分或片段开展。
本发明还包括本文所述的多肽或多肽片段的功能保守性变体。此类变体可以使用本领域标准方法产生，例如通过保守氨基酸替代。一般地，此类替代是Ala、Val、Leu和Ile间的替代；Ser和Thr间的替代；酸性残基Asp和Glu间的替代；Asn和Gln间的替代；和碱性残基Lys和Arg间的替代；或者芳香族残基Phe和Tyr间的替代。特别优选的是其中几个、5-10、1-5或2个氨基酸以任意组合被取代、删除或加入的变体。
在多个其它实施方案中，多肽或其片段或多肽变体或同系物可以是线性的或分支的，其可包含修饰的氨基酸，其可被非氨基酸中断，和/或其可以装配成一个以上多肽链的复合物。如本领域众所周知，多肽可以是天然修饰或者通过介入修饰；例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意其它操作或修饰，例如与标记成分缀合。在一些实施方案中，多肽或多肽片段包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰。
本发明的多肽或多肽片段包括分离的天然存在多肽。优选地，此天然存在多肽在所选择群体中的频率为至少5％，最优选至少10％。所选择群体可以是群体遗传学领域研究的任何认可群体。优选地，所选择群体是高加索人、黑人或亚洲人。更加优选地，所选择群体是法国人、德国人、英国人、西班牙人、瑞士人、中国人、日本人、韩国人、华裔新加坡人、冰岛人、北美洲人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希腊人、意大利人、波兰人、太平洋岛人或印度人。
肽的重组合成
本发明的多肽或其片段还包括重组产生的多肽、合成产生的多肽以及此类本发明多肽和其片段的组合。制备此类多肽的方法在本领域众所周知。例如，本发明的多核苷酸片段或多肽可以从体液(包括但不限于血清、尿和腹水)分离，所述体液或者通过化学或生物学方法合成(例如细胞培养、重组基因表达)。在本文中，如果没有明确说明，“分离的”包括含义“从共存材料中分离”。
本发明的重组多肽可以通过本领域众所周知的方法从包含表达系统的基因工程宿主细胞制备。因此，在进一步的方面，本发明涉及通过重组技术产生多肽，涉及包含编码本发明多肽的一个或多个核酸的表达系统，涉及用此类表达系统进行基因工程改造的宿主细胞，以及涉及分离多肽的方法。
术语“核酸”意思是指天然的或半合成的或合成的或修饰的核酸分子。其指包含脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)和/或修饰核苷酸的核苷酸序列、寡核苷酸或多核苷酸。这些术语旨在互换使用。RNA可以是tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA和核酶形式。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA、染色体或基因组DNA、cDNA或者它们的衍生物。此外，这些DNA和RNA可以是单链的、双链的、三链的或四链的。术语还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸磷酸主链的其它变体。
杂交反应的“严格条件”可通过本领域普通技术人员容易地确定，一般是基于探针长度、洗涤温度以及盐浓度进行经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度来正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交一般取决于已变性核酸与环境中的互补链在大约但低于解链温度下重新退火的能力。探针与可杂交序列之间的同源性程度越高，可使用的相对温度就越高。结果，由此可见，较高的相对温度将使反应条件更加严格，而较低的温度则使反应条件严格程度较差。此外，严格性与盐浓度成反比。“严格条件”示例如下：(1)洗涤时用低离子强度和高温度条件，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)使用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(体积/体积)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，42℃。备选地，严格条件可以是：50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，超声降解的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS以及10％硫酸葡聚糖，42℃；于42℃在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺，55℃洗涤；接着用由包含EDTA的0.1×SSC组成的高严格洗涤液于55℃洗涤。对于杂交反应严格性的额外细节和解释参见Ausubel等，Protocols in Molecular Biology(1995)。
多肽可以根据本领域已知的方法在诸多表达系统中的任何系统中重组表达。Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology(John WileySons，New York，1990)。此类表达系统包括染色体、附加体和病毒衍生的系统，例如从细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒衍生的载体，以及从它们的组合衍生的病毒，例如从质粒和噬菌体遗传元件衍生的那些载体，例如粘粒和噬菌粒。
表达系统还包含调节和引起表达的控制区。一般，可以使用能够使核酸在宿主中维持、增殖或表达以产生多肽的任何系统或载体。适宜的核苷酸序列可以通过任何多种众所周知的和常规的技术，如描述于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)中的那些插入到表达系统中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入到适宜的限制性内切核酸酶位点。
载体成分一般包括但不限于一个或多个复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子、信号序列或分泌序列以及转录终止序列。
表达载体可有两个复制系统，因此允许其维持于两种生物中，例如用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中和用于克隆和扩增的原核宿主中。众所周知多种细菌、酵母菌株和病毒的此类序列。
优选地，表达载体包含用于筛选所转化宿主细胞的标志基因。选择基因在本领域众所周知并且随着所使用的宿主细胞而变化。表达和克隆载体通常包含选择基因，其也称作选择标记。一般，选择基因编码(a)赋予抵抗抗生物和其它毒素如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的蛋白质，(b)补足营养缺陷的蛋白质，或者(c)供应关键营养物的蛋白质，如D-丙氨酸消旋酶基因。
启动子序列或者编码组成型启动子，或者编码诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或者杂合启动子。杂合启动子组合了一个以上启动子的元件，其在本领域是已知的并且可用于本发明。此外，对于整合表达载体，表达载体包含至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选包含位于表达构建体侧翼的两个同源序列。通过将适宜同源序列插入到载体中可将整合载体靶向宿主细胞的特定基因座。整合载体的构建在本领域众所周知。
适宜分泌信号可整合到目的多肽中，允许多肽分泌至内质网腔、周质空间或细胞外环境中。这些信号可以是相对多肽而言为内源的，或者是外源的。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母酵母属(Kluyveromyces)α-因子前导序列)。在哺乳动物细胞表达系统钟，来自同一物种或相关物种的分泌多肽的哺乳动物信号序列以及病毒分泌信号前导序列可用于指导肽、其变体或同系物的分泌。适宜的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、以及昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞，例如原代细胞，包括但不限于干细胞。适宜宿主的代表性实例包括：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、其它酵母细胞或曲霉属(Aspergillus)；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293以及Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。
可根据其调节所插入序列表达的能力或者以所希望的方式加工所表达多肽的能力选择宿主细胞株。此类多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。剪切“前多肽原”形式的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也是重要的。
转化的宿主细胞包括但不限于用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌；用酵母表达载体转化的酵母；和用重组昆虫病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞和哺乳动物表达系统。
用于肽表达的适当条件会随着表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且可通过本领域技术人员经常规实验容易地确定。例如，在表达载体中使用组成型启动子会要求对宿主细胞的生长和繁殖进行优化，而使用可诱导启动子则需要用于诱导的适当生长条件。此外，在一些实施方案中，重要的是收获时机。与昆虫细胞一同使用的杆状病毒系统是裂解病毒，因此收获时机的选择对产物产量而言是至关重要的。
目的GPA071肽片段不但可以通过重组方法直接产生，而且还可以作为与异源多肽的融合多肽产生。此类异源多肽一般置于GPA071肽或其片段的氨基末端或羧基末端，并且提供了用于抗标签抗体选择性结合的表位标签。因此，此标签使得能够通过使用抗标签抗体或者其它类型的结合表位标签的亲和基质容易地纯化肽或其片段。表位标签的实例是6xHis或c-myc标签。备选地，GPA071肽或其片段可以以例如GST融合蛋白的形式表达。适当的构建体一般为本领域已知并且可从商业供应商如Invitrogen(San Diego，Calif.，美国)、Stratagene(La Jolla，Calif.，美国)、Gibco BRL(Rockville，Md.，美国)或Clontech(Palo Alto，Calif.，美国)获得。
基因表达的评估
可通过本领域技术人员已知的标准技术直接评估样品中的基因表达，所述方法例如使用适当的基于本文所提供序列的标记探针进行的Southern印迹(检测DNA)、Northern印迹(确定mRNA的转录)、斑点印迹(DNA或RNA)或原位杂交。备选地，在分析中可以使用抗体来检测核酸，例如特异双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。此类抗体可以是标记的，并且在双链体结合至一个表面的情况下进行分析，因此当在表面上形成双链体时，可以检测结合至双链体的抗体的存在。备选地，基因表达可通过细胞或组织切片的免疫组织化学染色以及细胞培养或体液分析法测量以直接评估GPA071肽或其片段的表达。用于此类免疫分析法的抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，并且可以针对天然磷脂酶A2序列或者基于本文所提供DNA序列的GPA071片段制备。
所表达蛋白质的纯化
所表达GPA71或GPA71片段可以在表达后使用本领域技术人员已知的多种方法中的任何方法纯化或分离。合适的技术会取决于GPA71或GPA71片段的表达方式而改变。多肽可以例如以分泌蛋白质的形式从培养基回收或者从宿主细胞裂解液回收。可通过多种物理或化学手段破坏细胞，例如冻融循环、超声、机械破坏或使用细胞裂解剂，而膜结合的多肽可以使用适宜去污剂溶液(例如Triton-X 100)或酶解从膜中释放。用于多肽纯化或分离的适宜技术也会取决于样品中存在什么样的其它成分而变化。所需要的纯化程度也取决于GPA71或其片段的使用而变化。通过分离或纯化去除的污染物成分是一般干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，包括酶、激素及其它溶质。所选择的纯化步骤会取决于例如所使用的产生过程的性质和所产生的特定片段。
通常，分离的GPA071或其片段会通过至少一个纯化步骤制备。用于纯化的众所周知的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、高效液相色谱、羟磷灰石色谱和凝集素层析。最优选地，采用亲和层析用于纯化。还可使用超滤和透析以及相关联的蛋白质浓缩。参阅例如，Scopes R，Protein Purification(Springer-Verlag，New York，N.Y.，1982)。在分离或纯化过程中多肽变性的情况下，可使用用于蛋白质重折叠的众所周知的技术再生活性构象。
所表达多肽的标记
可以标记本发明的核酸、蛋白质和抗体。本文所说的“标记的”意思是指化合物至少具有连接的一个元件、同位素或化合物使得能够检测化合物。通常，标记为一下三类：a)同位素标记，其可以是放射性的或者重金属同位素；b)免疫标记，其可以是抗体或者抗原；以及c)生色或荧光染料。标记可以掺入到不干扰待检测化合物的生物学活性或特征的化合物的任何位置中。
片段的化学产生
多肽或其片段不但通过重组方法产生，而且还可使用本领域众所周知的化学方法产生。固相肽合成可以在分批或连续流动加工过程中开展，其中在该过程中通过连接基团向不溶性多肽支持物相继加入α-氨基和侧链保护的氨基酸残基。连接基团如甲胺衍生化聚乙二醇连接至聚(苯乙烯-共-二乙烯苯)形成支持物树脂。氨基酸残基是被酸敏感Boc(叔丁氧羰基)或碱敏感Fmoc(9-芴甲氧羰基)进行Nα-保护的。被保护氨基酸的羧基与连接基团的胺偶联，将残基锚定在固相支持物树脂上。三氟乙酸或哌啶分别用于去除Boc或Fmoc保护基。使用偶联剂或预先活化的氨基酸衍生物，将每一个额外氨基酸加入到锚定残基上，洗涤树脂。通过连续的脱保护、衍生化氨基酸的偶联以及用二氯甲烷和/或N，N-二甲基甲酰胺洗涤合成全长肽。在肽羧基端和连接基之间将肽水解下来，得到肽酸或酰胺。Novabiochem1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook(San Diego，Calif.)第S1-S20页。还可在机器如ABI 431A肽合成仪(Applied Biosystems)上自动合成。多肽或其片段可以是通过制备型高效液相色谱纯化的，并且其组成成分是通过氨基酸分析或测序证实的(Creighton T.E.Proteins，Structuresand Molecular Properties(W H Freeman)，New York N.Y.，1984)。
在多种环境中天然多肽的变体是期望的。例如，某些变体可能会降低不良副作用，特别是当与副作用活性相关的部分与多肽的目的活性部分不同时。在一些表达系统中，天然多肽易受蛋白酶的降解。在此情况下，所选择的改变易感序列的氨基酸的替代和/或缺失可明显增加产量。通过消除对氧化、酰基化、烷基化或其它化学修饰敏感的氨基酸，变体还可以提高纯化过程的产量和/或提高蛋白质的货架期。优选地，此类变体包括(i)构象中性的改变，即将它们设计成与天然多肽相比变体多肽的三级结构变化最小，以及(ii)抗原性中性的改变，即将它们设计成与天然多肽相比变体多肽的抗原决定簇变化最小。
本发明肽的用途
可根据本发明将上述多肽用于制造治疗细胞过度增殖相关疾病或病症、特别是癌症、更加特别是结肠直肠癌的药物。
本发明的另一方面提供了用于治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的方法，所述方法包括向患有疾病或病症的包括人在内的哺乳动物施用有效量的多肽，其中多肽选自a)GPA71(SEQ.ID NO：1或SEQ ID NO：2)或GPA71片段；b)与(a)中任意一个多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性的生物活性多肽；或者c)(a)或(b)的任意一个多肽的生物活性变体。因此，可以施用如上所述的多肽。多肽优选包含GPA71或其片段。
用于治疗目的的“哺乳动物”指作为哺乳动物(包括人、家养动物和农场动物)以及动物园动物、体育动物或宠物动物(例如狗、马、猫、绵羊、猪、牛等)分类的任何动物。优选地，哺乳动物是人。
术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防御性措施。需要治疗者是已经患有疾病或者预防其发生疾病的那些。
“疾病”或“病症”是将从上面所定义以及下面进一步定义的GPA71或GPA71片段受益的任何状况。这包括慢性和急性疾病和病症，以及倾向于所述疾病或病症的那些病理状况。
待治疗的疾病或病症的非限定性实例包括源自细胞过度增殖的任何疾病，特别是癌症，并且更加特别地是结肠直肠癌。过度增殖疾病的实例包括但不限于位于下列部位的肿瘤：结肠、腹、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器。其它过度增殖性疾病、紊乱和/或病症包括但不限于高丙种球蛋白血症；淋巴增生性疾病、紊乱和/或病症；副球蛋白血症；紫癜；结节病；塞泽里综合症；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；戈谢病；组织细胞增多病。其它过度增殖性疾病是医学领域技术人员已知的。
在本发明的另一方面，GPA71或GPA71片段作为适宜治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的治疗剂提供，所述治疗包括向患有该疾病的包括人在内的哺乳动物施用有效量的GPA71或其片段。
药物组合物可用于前述治疗方法中。此类组合物优选是无菌的并且在适宜向患者施用的单位重量或体积内包含用于诱导目的反应的有效量的GPA71或其片段或者编码多肽或其片段的核酸。
GPA71或其片段、化合物或药物组合物的“有效量”是足以产生有利结果或目的结果，包括如细胞增殖性疾病的临床结果的量。此量也将取决于健康从业者已知的待治疗特定病症、病症的严重性、各个患者参数包括年龄、身体状况、个体大小和体重、治疗持续时间、同时治疗(如果有的话)的种类、特定施用途径等因素。这些因素是医学领域普通技术人员众所周知的，并且仅通过常规实验即可找到。
有效量可一次施用或者多次施用，并且可以与或不与另一药物、化合物或药物组合物联合施用达到。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下可以考虑“有效量”，并且如果单一药剂与一种或多种其它药剂联合实现了目的结果，则认为所给出的单一药剂的量是有效量。
有效量的包含单独的本发明多肽或者包含本发明多肽以及其它药物、化合物或药物组合物的GPA71或GPA71片段或者药物组合物可通过任何常规途径施用，包括注射或者随时间逐渐灌注。施用可以是例如口服、静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下、局部或经皮施用。
当施用时，本发明的药物组合物以可药用制剂的形式施用。如本文所使用的术语“可药用载体”意思是指适宜向包括人在内的哺乳动物施用的一种或多种兼容的固体或液体填充物、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示活性成分与之结合以利于使用的天然或合成的有机或无机成分。
术语“可药用”意思是指不干扰活性成分的生物学活性效力的无毒物质。此制剂可常规包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、兼容的载体、辅助免疫增强剂如佐剂和细胞因子以及任选的其它治疗剂。
在医药中使用的盐应该是可药用盐，但是非药用盐可常规用于制备可药用盐，因此并不排除在本发明范围之外。
药物组合物可以包含适宜的缓冲剂，包括盐中的醋酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸以及盐中的磷酸。
药物组合物还可任选包含适宜的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
向受试者施用的多肽或编码多肽的核酸的剂量可以依据不同的参数选择，特别是依据所施用的方式和受试者的状态选择。其它因素包括目的治疗阶段。在所应用的最初剂量不足以使受试者产生反应的情况下，可应用患者耐受所允许的较高的剂量(或者是通过更加局部化的不同递送途径施用的有效的较高剂量)。
药物组合物常规为单位剂量形式，并且可以通过药剂学领域众所周知的任意方法制备。所有方法均包括将活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体混合的步骤。通常，将活性化合物与液体载体、细碎固体载体或者两者均一且均匀地混合然后(如果需要)将产品成型来制备组合物。
适宜口服施用的组合物可以是不连续的单位形式，例如胶囊剂、片剂、锭剂，其中每一种包含预定量的活性化合物。其它组合物包括水液体或非水液体混悬剂，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。
适宜肠胃外施用的组合物包括多肽或编码多肽的核酸的无菌水制剂或无菌非水制剂，其优选地与接受者的血液是等渗的。该制剂可以根据众所周知的方法使用适宜分散剂或润湿剂以及混悬剂配制。无菌注射制剂还可以是无毒的肠胃外用稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，如1，3-丁二醇溶液。可以采用的可用媒介物和溶剂是水、Ringer’s溶液和氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可采用任何刺激性小的不挥发油，包括合成的单或双甘油酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
适宜口服、皮下、静脉内、肌内等施用的载体制剂可在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA.)中找到。
本发明的另一方面提供了细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断方法，包括检测来自待诊断受试者的生物学样品中的GPA71或其片段水平，其中水平改变预示者存在细胞过度增殖相关疾病或病症。本发明的一个实施方面提供了对受试者中细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断方法，包括步骤：(i)检测来自受试者的生物学样品中的GPA71或其片段的水平，得到第一个数值；和(ii)将第一个数值与来自无疾病或无病症受试者的GPA71或其片段的水平相比较，其中与来自无疾病受试者样品中的GPA71或其片段的水平相比，来自受试者的生物学样品中GPA71或其片段水平的改变预示者受试者易患或者患有细胞过度增殖相关疾病或病症。
此类生物学样品包括血液、血浆或组织样品。适宜的组织样品包括全血、精液、唾液、眼泪、尿、排泄物、汗、口腔涂片、皮肤、特定器官组织如肌肉、脑或神经组织的活组织检查以及毛发。最优选地，适宜的生物学样品包括血液或血浆。组织样品还包括从此生物学样品中分离的细胞和多种类型细胞。根据本发明优选的实施方案，GPA71或其片段水平的改变包括：与未患有细胞过度增殖相关疾病或病症的个体血浆中本发明GPA71或GPA71片段水平相比，GPA71或其片段的血浆水平提高。提高优选至少1.2倍、更优选至少1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
根据进一步的方面，本发明提供了细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断方法，包括i)检测自受试者得到的适宜组织样品中至少一个在图1中所确定基因的表达水平，得到第一个数值；和ii)将第一个数值与来自无疾病受试者的所述基因的表达水平相比较，其中与来自无疾病受试者的样品相比，受试者样品中表达水平更高或更低预示者受试者易患或者患有细胞过度增殖相关疾病或病症。基因表达可在mRNA或蛋白质水平检测。适宜的组织包括但不限于肝脏、心脏、肠如十二指肠、脾、骨髓。MRNA表达水平可以通过任何适宜技术检测，例如微阵列分析、Northern印迹分析、反转录PCR以及实时定量PCR。同样，蛋白质水平可通过任何适宜技术检测，例如通过利用蛋白质特异性标记探针的western印迹。
在上述方面的优选实施方案中，基因选自表1所列的被上调或下调的基因。优选地，基因选自表1所列的上调1.2倍或更高、1.3倍或更高或者1.5、1.7、1.8、1.9倍或更高的基因；或者选自表1所列的下调0.8倍或更低、0.7倍或更低或0.6倍或更低的基因。在上述方面的另一个优选实施方案中，测量了至少1、2、3、4、5、10、20、30个基因的表达。在本发明的另一个实施方案中，测量了选自表1的至少40、50或60个基因的表达。在本发明的另一实施方案中，确定了选自表1的大多数基因的表达，例如确定了至少65、70、80、90、100或至少110个或者表1所列全部基因的表达。
本发明的另一方面提供了鉴定细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物的方法，包括步骤i)将测试化合物与GPA71或其片段在允许发挥GPA71或GPA71片段的至少一种生物学活性的样品条件下接触；ii)测定GPA71/GPA71片段的所述至少一种生物学活性水平；iii)将所述水平与缺乏所述测试化合物的对照样品的水平相比较。在优选实施方案中，选择导致所述水平变化的所述测试化合物，进一步测试其能否作为预防性和/或治疗性治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的GPA71或GPA71片段调节物。在优选的实施方案中，通过检测一个或多个或者多数个基因，如表1所列的至少61、70或100个基因的表达水平，测量GPA71或GPA71片段的生物学活性水平。
细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物的实例包括但不限于反义核苷酸、核酶、双链RNA和拮抗剂。
至少一个编码本发明多肽的核酸的“双链RNA”，即正义-反义RNA可用于干扰至少一个所公开基因的表达。已经在多种生物中表现出通过双链RNA干扰内源基因的功能和表达，例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)，如Fire等，Nature 391：806-811(1998)中所述；果蝇，如Kennerdell等，Cell95(7)：1017-1026(1998)中所述；以及小鼠胚胎，如Wianni等，Nat.Cell Biol.2(2)：70-75(2000)所述。此双链RNA可以如下合成：以两个方向从模板上体外转录成单链RNA，将有义链和反义链RNA体外退火。双链RNA还可从cDNA载体构建体合成，其中以相反的方向将目的基因克隆入构建体中，通过倒转重复隔开。在转染细胞之后，RNA被转录并且互补链重新退火。
术语“拮抗剂”指当结合本发明多肽或其片段时降低或抑制所述多肽的至少一种生物学活性的分子。拮抗剂可以包括但不限于肽、蛋白质、糖类和小分子。
在特别有用的实施方案中，拮抗剂是磷脂酶A2特异性抗体。抗体还可缀合试剂，如化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等，并且还可作为靶向剂起作用。
在另一实施方案中，拮抗剂用作治疗细胞过度增殖相关疾病或病症，如癌症，更加特别地是结肠直肠癌的治疗剂。
术语“分离的”核酸分子意思是指核酸分子离开其最初环境(例如，天然环境(如果其是天然存在的话))。例如，不分离天然存在的核酸分子，而是分离与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同一核酸分子，即便是随后再将其引入天然系统中也是如此。此类核酸分子可以是载体的部分或者组合物的部分，并且仍然是分离的，因为此载体或组合物不是其天然环境的部分。
关于用核酶或双链RNA分子进行治疗，方法包括施用治疗有效量的编码核酶或双链RNA分子的核苷酸序列，其中编码核酶/双链RNA分子的核苷酸序列具有降低GPA71或其片段转录/翻译的能力。
包含反义核苷酸、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA的分离的核酸分子或者拮抗剂的“治疗有效量”是这些治疗剂足以治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的量。
对治疗有效量的确定是本领域技术人员力所能及的。对于任何治疗剂，可以在细胞培养分析中或者动物模型中，通常为小鼠、兔、狗或猪中初步评估。动物模型还可用于确定合适的浓度范围以及施用途径。然后，此类信息可用于确定向人施用时的剂量和途径。
对于治疗应用，反义核苷酸、编码核酶的核苷酸序列、双链RNA(不管是包在脂质体中还是位于病毒载体上)以及抗体优选作为包含治疗剂和一种或多种可药用载体的药物组合物施用。组合物可单独施用，或者与至少一种其它试剂如稳定化合物一起施用，其可以在任何无菌的生物相容性药物载体中施用，所述载体包括但不限于盐、缓冲盐、葡萄糖和水。组合物可以单独向受试者施用，或者与其它试剂、药物或激素组合向受试者施用。
本文引用的所有参考文献在此全文引用作为参考并适用于任何目的，这与每一单独出版物、专利或专利申请被明确且单独指出全文引用作为参考并适用于任何目的相同。
本申请不限于本申请所述的特定实施方案，这些实施方案旨在单个说明本发明的各个方面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出许多修改和改变，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。根据前述描述，除了本文所列举的那些之外，本发明范围内的功能等效方法和装置对于本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改和改变处于后附权利要求书范围内。本发明仅通过后附权利要求书以及此权利要求的全部等效范围来限制。
Claims (14)
1.GPA071多肽用于制造治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的药物的用途，其中多肽包含具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列的肽或其生物活性片段。
2.权利要求1所述多肽的用途，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是癌症。
3.权利要求2所述多肽的用途，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是结肠直肠癌。
4.治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的方法，包括向患有细胞过度增殖相关疾病或病症的哺乳动物施用有效量的多肽，所述多肽包含具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的序列的肽或其生物活性片段。
5.权利要求4所述的方法，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是癌症。
6.权利要求4所述的方法，其中细胞过度增殖相关疾病或病症是结肠直肠癌。
7.权利要求4所述的方法，其中静脉内、肌内、皮下、口服或局部施用有效量的多肽。
8.对受试者中细胞过度增殖相关疾病或病症的预后或诊断方法，包括步骤：
(i)检测来自受试者的生物学样品中的GPA71或其片段的水平，得到第一个数值；和
(ii)将第一个数值与来自无疾病或无病症受试者的GPA71或其片段的水平相比较，其中与来自无疾病受试者样品中的GPA71或其片段的水平相比，来自受试者的生物学样品中GPA71或其片段水平的改变预示者受试者易患或者患有细胞过度增殖相关疾病或病症。
9.权利要求8所述的方法，其中生物学样品是血浆。
10.权利要求8所述的方法，其中检测表1所确定的一个或多个基因的表达水平。
11.权利要求8所述的方法，其中检测表1所确定的大多数基因的表达水平。
12.鉴定细胞过度增殖相关疾病或病症的调节物的方法，包括步骤：
(i)将测试化合物与GPA71或其片段在允许发挥GPA71或GPA71片段的至少一种生物学活性的样品条件下接触；
(ii)测定GPA71或GPA71片段的所述至少一种生物学活性水平；
(iii)将所述水平与缺乏所述测试化合物的对照样品的水平相比较；
和
(iv)选择导致所述水平变化的测试化合物，进一步测试其能否作为预防性和/或治疗性治疗细胞过度增殖相关疾病或病症的GPA71调节物。
13.权利要求12所述的方法，其中通过确定表1所列一个或多个基因的表达水平测量GPA71或GPA71片段的生物学活性水平。
14.权利要求12所述的方法，其中检测表1所确定的大多数基因的表达水平。
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