WO2004022082A1 - 胚着床制御剤 - Google Patents

胚着床制御剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2004022082A1
WO2004022082A1 PCT/JP2003/011268 JP0311268W WO2004022082A1 WO 2004022082 A1 WO2004022082 A1 WO 2004022082A1 JP 0311268 W JP0311268 W JP 0311268W WO 2004022082 A1 WO2004022082 A1 WO 2004022082A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
embryo
activity
promotion
migration
activation
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011268
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhiko Imakawa
Kentaro Nagaoka
Fumiko Watanabe
Original Assignee
Proteinexpress Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proteinexpress Co., Ltd. filed Critical Proteinexpress Co., Ltd.
Priority to AU2003264378A priority Critical patent/AU2003264378A1/en
Priority to US10/526,543 priority patent/US20060234925A1/en
Priority to JP2004534145A priority patent/JPWO2004022082A1/ja
Priority to EP03794212A priority patent/EP1547609A1/en
Priority to CA002497497A priority patent/CA2497497A1/en
Publication of WO2004022082A1 publication Critical patent/WO2004022082A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)

Abstract

妊娠成立においては胚と母体とのコミュニケーションそして胚が母体の子宮壁に着床することが許容されることが重要である。この胚と母体とのコミュニケーションを仲介する因子を解明し、それを制御することが可能になれば、不妊症などの障害の治療や予防手段の開発が可能であり、一方では避妊を安全に行う途も開かれる。インターフェロン・ガンマで通常誘起される10KDaのタンパク質(IP-10)として知られていたタンパク質因子が胚の母体への着床時期に免疫過程や胚遊走活性化、胚の子宮壁への着床促進あるいはケモタキシス活性発揮などに関与し、胚が子宮壁に着床するのをコントロールしている因子であることが同定された。これを利用して不妊治療剤、妊娠効率促進剤、着床期に胚を子宮に誘因する剤、胚仔と母体との間の相互作用調整剤などが開発提供できる。

Description

明 胚着床制御剤
技術分野
本発明は、 妊漏象の着床において胚と母体との間のコミュニケーシヨンを調 整制御する因子の利用技術に関する。 より具体的には、 本発明は、 IP- 10力く胚の 着床並びにその過程にぉ ゝて重要な機能を有することに基礎をおいた技術に関す る。 背
着床とは胚仔と母体システムとの間で細胞増殖や分化が協調的に進行し、 初期 胎盤の形成までも含んだプロセスである。 反芻動物では、 着床期に高い厳で胚 力く失われる事態力起こり（Roberts R. M. et al. , Oxf. Rev. Reprod. Biol. , ' 12: 147 - 180(1990))、 これは胚仔と母体組織との間のコミュニケーションカ不成功に 終わったためだと考えられている。一旦該コミュニケ一シヨンの確立が成功する と、 母体システムは生理的にも免疫学的にも胚仔の受容をすること力くできるよう になり、 胚仔が付着、 浸潤し、 その後に胎盤が形成されることとなる。
インタ一フエロン ·タウ（IFN-て； 反芻動物における着床前の栄養膜 （トロホ ブラス卜） 細胞により産生される抗黄体退行活性を持つタンパク質） は、 他のィ ンタ一フエロンと同様に抗ウイルス活性、 細胞増殖抑制活性を有し、 さらに免疫 調 乍用を有するのではないかと考えられている。 反芻動物では、 成長する胚仔によって産生される主要な胚仔タンパク質である インタ一フヱロン'タウ（IFN-て） 力、 母体の妊娠の認識過程に関与している （ Martal J. et al. , J. Reprod. Ferti l. , 56:63-72(1979) ; Godkin J. D. et al. ， J. Reprod. Fertil. , 65: 141-150(1982) ; Imakawa K. et al. , ature, 330:3 77-379(1987) ; Stewart H. J. et al. , J. Endocrinol. , 115:R13-R15(1987) ; R oberts R.M. et al., Endocr. Rev., 13:432-452(1992)) 0 ヒッジでは胚仔は妊 娠の 8〜 9日目から IFN-てを産生し始める。 16日目に最高に産生され、 その後 IF N- τの産生は胚仔が SI見の子宮内膜に付着し始めるにしたが Μ&Ύし始め、 22〜 23日目までには胚仔は IFN-てを産生しなくなる（Guillomot M. et al., Bio Cell .， 68:205-211(1990); Roberts R. M. et al., Proc. Soc. Exp. Biol Med., 200 :7-18(1992); Flint A.P.F. et al., Mol. Cell. Endocrinol. , 100:93-95(1994 ))。 IFN - τは黄体の退行を妨げ （エストロゲンレセプタ一の発現を阻害すること により少なくとも一部を妨げ） 、 ォキシトシンレセプタ一のエストロゲンによる 朿獵を防止し、 子宮内膜の PGF2alphaの間歇的な放出を抑制する (Flint A. P. F. et al., J. Reprod. Fertil. (S卿 1. )， 43:13-25 (1991); Spencer T. B. et al ·， Endocrinology, 136:4932-4944(1995); Spencer T. E. et al., Endocrinolog y, 137:1144-1147(1996)) 0 さらに、 IFN-てはリンパ球の分化及びサイト力イン 産生を制御しており （リンパ球の分化： Newton G.R, et al., Am. J. Reprod. I mmunol. , 19:99-107 (1989); Pontzer C.H. et al. , Cancer Res. , 51:5304 - 530 7 (1991); Skopets B. et al. , Vet. Immunol. I誦 unopathol.， 34:81-96 (1992 ); Assal-Meliani A. et al. , J. Reprod. Immunol., 25 :149 - 65 (1993) 、 サイ トカイン産生： Tuo W. et al., J. Interf erom Cytokine Res. , 19:79-87(1999) ； Emond V. et al., Biol. Reprod. , 62:1728-1737(2000))、 IFN-て力く反芻有蹄 動物の着床期の間局所的に免疫調整の過程にぉ 、て重要な役割を果たしているこ とを示している。
IP- 10 (interferon- r inducible protein 10 kDa)は、 主に白血球のサブセッ トに対するケモタクティック活性を介して炎症応答並びに免疫応答の多くの局面 を制御しているケモカインフアミリーの一員である。 マウス及びヒトにおける研 究から IP- 10は C- X- Cケモカイン類の一員であり、 例えばマクロファージ、 锥 芽細胞、 星状 （ァストロサイト） 細胞、 ケラチノサイト細胞、 上 細胞、 内 細 胞などを含めた様々なタイプの細胞にぉレ、て誘導されて 、る（Lus ter A. et al., Nature, 315:672-676 (1985)； Ohmori Y. et al.， Biochea Biophys. Res. Co 画 n,， 168:1261-1267 (1990)； Sauty A. et al. , J. Immunol. , 162:3549-3558 (1999)； Albanesi C. et al. , J. Immunol. , 165: 1395-1402(2000) ; Huang D. e t al,， Immunol. Rev. , 177 :52- 67(2000))こと力く示されている。 IP- 10は C- X- C 型ケモカインのレセプター 3 (CXCR3) を介して優先的に NK細胞並びに Thl表現型 の活性化された T細胞を標的としている。 発明の開示
胚仔 （コンセプタス又は受胎産物：胚並びに ffllを指す） と母体との間の生化 学的な '瞬 は着床の成功並びにその後に起こる胎盤形成にとって重要である o特に、 反芻動物では、 着床期に高い步破で胚が失われる事態が起こることから
、 妊娠の敝を制御している因子の解明は、 強く求められている。 特に、 妊娠成 立過程にぉレ、て、 胚仔側のシグナルに対する母体側の応答因子にっレ、ての解明が 待たれている。 上記妊 過程を制御する因子を解明するため、 鋭意研究を進め、 特にはヒ ッジの妊娠と相関しているという特徴を有する分子を決定するための研究の過程 で、 本発明者等は妊娠 17日目の子宮内膜及び発情周期 15日目の子宮内膜からそれ ぞれ RNAを抽出し、 該 RNAから cDNAを作出後、 cDNAサブトラクシヨン角晰からィ ンタ—フヱロン.ガンマで誘起される 10 KDaのタンパク質（IP- 10) を同定するの に成功した。 すなわち、 妊娠 17日目の雌ヒッジと発情周期 15日目の雌ヒッジの子 宫内膜組織の間での cDNAサブトラクション角斜斤の結果、 インタ一フヱロン 'ガン マで誘起される 10 KDaのヒッジのタンパク質 (ヒッジ IP- 10) (C - X - C型ケモカイ ンフアミリーに属し、 グルタミン-ロイシン-アルギニン（ELR)モチーフを欠い ている） が同定された。
さらに、 ノーザンブロット分析の結果、 妊娠初期の子宫内膜に IP- 10 mRNAが相 当量見出され、 そしてその量は発情周期の子宮内膜におけるよりもかなり多いも のであることも見出すことに成功した。 そして、 CXCR3 (IP- 10のレセプ夕一） mR NAの発現を RT-PCR法で検出してみると、 妊娠して 、る子宮の内膜では発情周期の 状態にある子宮内膜におけるよりも僅かながらその発現が大きいことも見出すこ とに成功した。 本発明者等は、 IFN-て及び IFN-ァ mRNA (これらは IP- 10 の発現を誘導してい る可能性がある） の変動についてもノーザンブロット分析及び RT-PCR法で測定し た。 その結果、 IFN-て及び IFN-ァ mRNA は胚仔ゃ妊娠している子宮の内膜では量 的に高レベルであつたことも見出した。 また、 IFN- r mRNA は発情周期の状態に ある子宮内膜においても検出された。 免疫糸職化学的解析の結果、 IP- 10と IFN- ァの双方のタンパク質は、 子宮の管腔上皮、 腺上皮、 上皮下間質に局在していた o IP- 10と IFN-ァの双方のタンパク質は、 発情周期の状態にある雌ヒッジにおい てその偏在が認められたが、 IP- 10染色の強度は周期性の状態にある子宮内膜で は最小限のものであった。 in si tuハイブリダィゼ一シヨン分析の結果、 IP- 10 mRNAは妊娠している子宮の上皮下間質に偏在していた。 一方、 発情周期の状態に ある雌ヒッジにおいては IP- 10 mRNAは検出されなかった。単球による IP- 10 mRNA の発現は、 用量依存的に IFN- ， IFN- 7及び IFN-てによって刺激されたが、 IFN- てが IP- 10 mRNAを増加するのに最も効果が高かった。 子宮内膜の細胞片培養実験 における角科斤の結果、 IP-10 mRNAはィ の IFN-てによっても朿 U激された。 これら の結果から、 妊娠初期の子宮において観察されるヒッジ IP- 10 の発現は IFN-てに よって誘導されていると考えられる。 こうして IFN-てと IP- 10 との間の相互作用 力く胚仔と母体 織との間での免疫学的 1t#伝達の ¾ϊϊに重要なものであるとの認 識に至った。 同様なことは、 ャギ IP-10 に関してもそれを観察することに成功し た。 本発明者等は、 IP- 10 は各種の動物に広くその存在力認められ、 その相同性 も、 例えばヒッジとヒトとの間では、 力、なりの禾 MS認められることから、 IP - 10 を利用した着床制御技術を樹共することができるとの認識を有するに至り、 本発 明を完成せしめた。 代表的には、 本発明は、
〔1〕 タンパク質 IP - 10及び IP - 10 において少なくとも 1以上のアミノ酸 残基が欠失、 付加及びダ又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP - 10 と実質的に同等又は同一の生物活性を有する ip- 10類縁体あるいは ip- 10 m から成る群から選ばれたものを有効成分として含有し、
(1) 胚遊走活性化剤、 (2) S の子宮壁への着床促進剤、 (3) 不妊治歸 lj、 (4)妊 娠促進剤、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調 (6) 免 細胞遊走活性化剤 、 及び (7) 子宮内免疫機能調觀
力、ら成る群から連ま'れたものであることを特徴とする医薬及び/又は動物医 薬；
〔2〕 IP- 10力く、 ヒト、 ゥシ、 スィギユウ、 ゥマ、 ロノく、 ヒッジ、 ャギ、 、 ラクタ"、 ブタ、 シカ、 トナカイ、 ャク、 ィヌ、 ネコ、 サルを包含する哺乳動物 由来のものであることを特徵とする上記 〔1〕 記載の医薬及び Z又は動物医薬；
〔 3〕 IP - 10及び IP - 10 にお 、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失 、 付加及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP- 10 と実質的に 同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘割本から成る群 から選ばれたもので、 試料を処理し、
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠促進 、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
力、ら成る群から連ま'れた生物学的活性を得ることを特徵とする方法； 〔 4〕 IP - 10及び IP- 10 にお 、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失 、 付加及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP- 10 と実質的に 同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘割本から成る群 から：！ばれたものを含有し、 上記 〔3〕 記載の方法に使用することを特徴とする
〔5〕 IP- 10活性を測定し、
(1) SS1走活性化、 （2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠促進 、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 3¾細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
から成る群力、ら選ばれた生物学的活性をァッセィすることを特徴とするァッ セィ ；
〔6〕 上記 〔5〕 記載のアツセィに iffflすることを #1：とする醒； 〔 7〕 IP - 10及び IP- 10 にお 、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失 、 付加及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP 10 と実質的に 同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘 本から成る群 力、ら遷 fれたものをコ一ドする塩基配列を含有する核酸を有効成分として含有し
(1)胚遊走活性化剤、 (2)胚の子宮壁への着床促進剤、 (3)不妊治療剤、 (4)妊 娠促進剤、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整剤、 (6)免疫細胞遊走活性化剤 、 及び (7)子宮内免疫機能調整剤
力、ら成る群から選ばれたものであることを特徵とする医薬及び Z又は動物医 薬；
〔 8〕 (i) 配列表の配列番号： 1で表される驢配列のうち、 少なくと もオープンリ—ディングフレーム部分を有するもの、
(i i) 少なくとも該 (i)の配列とストリンジヱン卜な条件でハイプリダイズする ことのできる塩基酉己列、
(i i i) 図 2あるいは酉己列番号： 2のポリペプチドと少なくとも 80%の相同性を有 するアミノ酸配列を持ち、且つ
(1)胚遊走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4)妊娠促進 、 （5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 田胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
から成る群から選ばれた生物学的活性を有するかある ヽは同等の抗原性を包 含した、 該 IP - 10 (例えば、 ヒッジ IP-10 ) と実質的に同等の生物学的活性を有 するぺプチドをコ一ドする塩基配列、
カヽら成る群から週ま'れた核酸を有効成分として含有し、
(1)胚遊走活性化剤、 (2)胚の子宮壁への着床促進剤、 (3)不妊治療剤、 (4)妊 娠促進剤、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調難 (6)免疫細胞遊走活性化剤 、 及び (7)子宮内免疫機能調觀 ϋ
カヽら成る群から運ま'れたものであることを碰とする医薬及び/又は動物医 薬；
〔 9〕 （Α) タンパク質 IP- 10及び IP- 10において少なくとも 1以上のァミ ノ酸残基が欠失、付加及び/又は置換されている IP - 10類縁体であって全長の IP -10 と実質的に同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘 稱から成る群から遷ま'れたもの若しくはその^ Xは
(B) (i) 酉己列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうち、 少なくともォ —プンリ一ディングフレーム部分を有するもの、
(i i) 少なくとも該 (i) の配列とストリンジヱントな条件でハイブリダィズする ことのできる塩基配列、
(i i i) 図 2あるいは配列番号： 2のポリペプチドと少なくとも 80%の相同性を有 するアミノ酸配列を持ち、 且つ
(1) 胚遊走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3)不妊治療、 (4)妊娠促進 、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 （6) 免 細胞遊走活性、及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
から成る群力、ら遷ま'れた生物学的活性を有するかあるいは同等の抗原性を包 含した、 該 IP- 10 (例えば、 ヒッジ IP- 10 ) と実質的に同等の生物学的活性を有 するぺプチドをコ一ドする塩基配列、
カヽら成る群から選ばれた核酸
の生物学的活性、例えば (1) 胚遊走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4)妊娠促進、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫 細胞遊走活性、 及び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学 的活性を促進又は阻害する化合物又はその塩を含有していることを籠とする医 薬；
〔10〕 (A) IP- 10及び IP- 10 において少なくとも 1以上のァミノ酸残基が 欠失、 付加及び/又は置換されている IP-10類縁体であって全長の IP-10 と実質 的に同等又は同一の生物活性を有する IP-10類縁体あるいは IP-10誘割本から成 る群から選ばれたもの若しくはその塩、 (B) 前記 (A) をコードする核酸及び該核 酸を含有するべクターあるいは該核酸又は該べクタ一で形質転換された宿主钿胞 力、ら成る群から： Sばれたものを使用し、前記 IP- 10又は IP- 10類縁体あるいは IP -10誘 本若しくはその ¾Xは前記核酸の生物学的活性、 例えば (1)胚遊走活性 ィ匕、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3)不妊治療、 (4)妊娠促進、 （5) S丕仔と母 体との間の相互作用調整活性、 (6)免疫細胞遊走活性、 及び (7)子宮内免疫機能 調整活性から成る群から選ばれた生物学的活性を促進又は阻害する化合物をスク リーニングする方法又はそのためのスクリーニングキット ；
〔11〕 IP- 10の産生を冗進し、 不妊症の発症及び/又は進展を防ぐ化合物 のスクリーニング方法又はスクリーニングキットである上記 〔10〕 記載のスクリ
—ニング方法又はスクリーニングキット；
〔12〕 上記 〔10〕 又は 〔11〕 記載のスクリーニング方法又はスクリ一ニン グキットを使用してスクリーニングすることにより得られる、 IP- 10産生制御ィ匕 合物；
〔13〕 IP- 10、 該遺伝子又は該 RNA に存在し、 IP- 10 の活 f4Xは発現を変 化させうる変異部位の存在を；^ 13するためのものであることを特徴とする IP- 10 関連疾患用遺伝子診断薬；
[14] IP- 10遺伝子、 mRNA、 hnRNAカヽら選ばれたものに存在しうる変異部 位を特異的に認識できる制限酵素及びそのアイソシゾマ一並びに IP- 10遺伝子、 mRNA、 hnRNAカヽら選ばれたものに存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅す るために利用されるオリゴヌクレオチドプライマ一から成る群から選ばれたもの を使用することを ¾とする上記 〔13〕 記載の診断薬；及び
〔15〕 工程 (a)：核酸試料を得る工程、
工程 ）:工程 (a) にて得られた核酸試料を遺 ί≤ί増幅して、 IP- 10遺伝子 に雜しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、 及び
工程 (c) :工程 (b) の核酸断片について、 変異の存在を調べる工程 を含むことを特徴とする IP-10遣 ^"関連疾患の遺伝子診断法を提供する。 さらなる態様では、 本発明は
〔16〕 被検試料における IP- 10 ポリヌクレオチドの存 を試験し、 IP - 1 0 ポリヌクレオチドの存在量を指標に使用して、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4)妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 （6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾1¾を判^は診断することを特徵とする被検体における生物活性の判定 又は診断方法； 〔17〕 被検^斗における IP- 10 タンパク質の を試験し、 IP- 10 タン パク質の存¾»を指標に翻して、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4)妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から連ま'れた生物活性
の程度を判定又は診断することを樹敦とする被検体における生物活性の判定 又は診断方法；
(18) IP- 10ポリヌクレ才チドとストリンジヱントな条件下でハイブリダ ィズするォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有する組成物であつて、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4)妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 田胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾 ISを判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検 体における生物活性の判定又は診断組成物；
〔19〕 (i) IP- 10ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブ リダイズするォリゴヌクレオチド又はボリヌクレオチド、 又は (i i) IP - 10ポリヌ クレオチドを備え、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 （2) S丕の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免;! ¾钿胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾 ISを判定又は診断するために使用するものであることを特徵とする核酸 アレイ ；
〔20〕 IP- 10ポリヌクレオチドを PCR増幅し、 被検体における以下： (1) 走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4)妊娠 促進、 (5) S丕仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 田胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から還ま'れた生物活性
の禾體を判定又は診断するために使用するものであることを特徵とするブラ ィマ一セット ； 〔21〕 少なくとも以下の要素：
IP - 10 を認識する抗体
からなるキットであって、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) S丕仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 钿胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から連ま'れた生物活性
の禾1¾を判定又は診断するために使用するものであることを ¾とする被検 体における生物活性の判定又は診断キット；
〔22〕 少なくとも以下の要素：
(a) 固相化した IP- 10を認識する抗体；および
(b) 標識化した且つ上記抗体とは異なるェピト一プと結合する抗体 からなるキッ卜であって、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫钿胞遊走活性ィ匕、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾號を判定又は診断するために使用するものであることを特徴とする被検 体における生物活性の判定又は診断キット；
〔23〕 すくなくとも以下の工程:
(a) 被検体の生体試料を IP-10 を認識する抗体を固定化した担体と接触するェ 枉 ；
(b) 該生体 1¾ と接触せしめた固相担体を洗滌する工程；
(c) 該生体試料と接触せしめた固相担体を標識化した且つ上記抗体とは異なる ェピト一プと結合する抗体と接触する工程；
(d) 固相化された標識あるいは遊離である標識を測定する工程；
(e) 工程 (d) で測定された標 It*を IP- 10量の指標とし、 正常な生体試料の結 果と比較する工程；および
(f) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 タンパク質存¾»を、 以 下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 （3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免¾細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から連ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 を示 旨標として TOする工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定 する方法；
〔24〕 すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体試料より匪を調製する工程；
(b) 工程 (a) で調製された RNAを電気泳動分離する工程；
(c) 工程 ） で分離された RNAを IP- 10 ポリヌクレオチドとストリンジェント な条件下で標識ヌクレオチドプローブとハイプリダイズする工程；
(d) 工程 (c) でハイプリダイズしている標 を IP- 10 ポリヌクレオチド発現 量の指標とし、 正常な生体試料の結果と比較する工程；および
(e) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 ポリヌクレオチド発現量 を、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 MSを示す指標として^fflする工程
を含むことを特徵とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定 する方法；
〔25〕 すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体試料より RNAを調製する工程；
(b) 工程 (a) で調製された RNAを鍀型に dTブラィマ一を使用して第 1鎖 cDNAを 調製する工程；
(c) 工程 (b) で調製された cDNAを錶型に IP- 10 ポリヌクレオチドを PCR増幅す るためのプライマ一セットを使用して PCR増幅する工程；
(d) 工程 (c) で得られた PCR産物を電気泳動分離する工程；
(e) 工程 (d) で分離された PCR産物を IP- 10 ポリヌクレオチドとストリンジヱ ン卜な条件下でハイプリダイズする標識ヌクレ才チドプローブとハイプリダイス、 する工程；
(f) 工程 (e) でハイプリダイズしている標 ft*を IP- 10 ポリヌクレオチド発現 量の指標とし、 正常な生体試料の結果と比較する工程；および
(g) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 ポリヌクレオチド発現量 を、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 田胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から連ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 Μ¾を示す指標として^ ffiする工程
を含むことを特徵とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定 する方法；
〔26〕 すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体試料を紙織固定化処理に付す工程；
(b) 工程 (a) で調製された糸織固定化標本を切片とする工程；
(c) 切片ィ匕した糸！ ^織を IP-10を認識する抗体による免 色に付す工程；
(d) 被検体の生体試料における免 色の程度を、 健常のもののそれらと 比較する工程；および
(e) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 タンパク質存在量を、 以 下：
(1) S$遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの ffiを示^ ί旨標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの禾 1¾を測定 する方法；
〔27〕 以下の工程：
(a) IP- 10 ポリヌクレオチドを PCR増幅するためのブライマ一セットをィ し て被検体の生体試料を PCR増幅する工程；
(b) (i) IP- 10 ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイ ズするオリゴヌクレ才チド又はポリヌクレ才チド、 又は（i i) IP-10ポリヌクレオ チドを備えた核酸ァレイを使用した分析に被検体の生体試料から分離した核酸分 画をかける工程；
(c) IP- 10 ポリヌクレオチドとストリンジユントな条件下でハイブリダイズす るォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと被検体の生体試料から分離した核 酸分画とをハイプリダイズする工程
カヽら成る群から遍 れた工程のすくなくとも一つを含み、 且つ
被検体の生体試料における IP- 10 ポリヌクレオチドの存在量を試験し、 IP- 10 ポ リヌクレオチドの存 が健常のもののそれらと比較することを含むことを特徴 とする、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4)妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 3¾細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性力、ら成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの程度を測定する方法；
〔28〕 定量的に IP- 10 タンパク質存標又は IP- 10 ポリヌクレオチド発現 量を測定することを特徵とする上記 〔23〕 〜 〔27〕 のいずれ力、一に記載の、 以下
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免！ ¾钿胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクを測定する方法；
〔29〕 上記 〔23〕 〜 〔27〕 のいずれか一に記載の、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 丕の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から還ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクを測定する方法にぉ 、て使用する、 (i) IP- 10を認識する抗体、 (i i) t it O とは異なるェピトープと結合する抗体、 （i i i) 固相ィ匕した抗体 (i) 又 は (i i)及び (iv)標識した抗体 (i) 又は (i i)のいずれか一に記載の抗体を含有する ことを特徵とする 〔30〕 IP- 10 を認識する抗体を使用し、 検体試料中の IP- 10 タンパク質量 又は IP- 10 ポリヌクレオチド発？ I*を測定することを特徴とする以下：
(1) 走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 （3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免！ ¾細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾號を測定又は診断する方法；及び
〔31〕 IP-10 を認識する抗体を含有し、 検体試料中の IP- 10 タンパク質量 又は IP- 10 ポリヌクレオチド発 を測定し、 以下：
(1) S丕遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷 れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 ¾gを測定又は診断するためのものであることを特徵とする測定 又は診断 を 共する。 本発明のその他の目的、 特徴、 優秀 'ί级びその有する観点は、 以下の記載より 当業者にとっては明白であろう。 しかしながら、 以下の記 ¾¾び具体的な実施例 等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、 説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。 本明細書に開示 した本発明の意図及び範囲内で、 種々の変化及び Ζ又は改変 （あるいは修飾） を なすことは、 以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、 当業者 には に明らかであろう。 本明細書で弓 I用されて 、る全ての特許文 «び参考 文献は、 説明の目的で引用されているもので、 それらは本明細書の一部としてそ の内容はここに含めて解釈されるべきものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒッジ IP- 10の塩基配列及びそれカヽら推定される了ミノ酸配列を示す o
図 2は、 ヒッジ、 ャギ、 ヒト及びマウスの IP- 10のアミノ酸配列を比較して示 した図である。 これらの動物の間では、 4個のシスティン残基が保存されている 力く、 N末端側の 2個のシスティン残基の前に位置するグノレタミン-ロイシン-了 ルギニン (ELR)モチーフはそこには存在して 、ないことがわかる。 ヒッジ IP- 10 は、 マウス IP- 10 よりヒト IP- 10 に対しより高い同一性を示している （表 1 ) o 図 3は、 着床期のヒッジ子宮における IP- 10 mRNAの発現レベルをノ一ザンブロ ット解析して調べた結果を示す電気泳動写真を左側に示す。 右側は、 IP - 10 mRNA についてのノーザンブロット解析を濃度解析した結果をグラフで示すものである。 図 4は、 CXCR3 mRNA, G3PDH mRNAを妊娠ヒッジ子宫にっき半定量的 PCRで調べ た結果を示す電気泳動写真を左側に示す。 右側は、 CXCR3 mRNAと G3PDH mRNAの半 的 PCR産物にっ 、ての濃度解析した結果をグラフで示すものである。
図 5は、 着床期の間のヒッジの胚仔と子宮における IFN-てと IFN- mRNAの量を 示す。 左側 (A) は、 妊娠ヒッジの胚仔における IFN-て mRNAのノーザンブロット 解析の結果を示す。 右側 (B) には、 ヒッジ子宮及び胚仔における IFN-ァ mRNAと G3DPH mRNAの半定量的 PCRの結果を示す電気泳動写真が示され、 右下側は、 濃度 角科斤した結果をグラフで示すものである。
図 6は、 ヒッジ子宮及び胚仔組織切片における IP- 10及び IFN- yについての免 疫組織化学解析の結果を示す生物紙織の写真である。 図中、 leは管腔上皮、 geは 腺上皮、 stは上皮下間質、 trは栄養膜 (トロホブラスト) 細胞を示す。 スケ一ノレ バ一は 100〃mを示す。
図 7は、 ヒッジ子宮における IP- 10についての in si tuハイブリダィゼ一ショ ン解析の結果を示す生物紙織の写真である。 図中、 leは管腔上皮、 geは腺上皮、 stは上皮下間質、 trは栄養膜 (トロホブラスト) 細胞を示す。 スケールバーは 写真 a， c及び dについては 40〃 Hi、 写真 bについては 10 mを示す。
図 8は、 A は IFN類が IP- 10 mRNAの量に及ぼす効果を調べた結果を示す電気泳 動の写真である。 B は、 発情周期中の雌ヒッジからの子宮内膜移 ¾ *について IF
N類が IP - 10 mRNAの量に及ぼす効果を調べた結果の電気泳動の写真である。 Bの 左側は、 特定の量の IFN類で刺激した時の子宮内膜移ネ litでの IP- 10 mRNAについ てのノーザンブロット角浙の結果を示す電気泳動写真である。 Bの右側は、 IP- 1 0 mRNA及び G3PDH mRNAについてのノーザンブロットを濃度角 |斤した結果をグラフ で示すものである。 Cは、 IFN類により朿隞された子宮内膜移 ¾j÷の培養培地中 の IP- 10 にっきゥヱスタンブロット角 斤した結果の電気泳動の写真である。
図 9は、 -てで刺激された子宮内膜培養培職び組換え IP- 10 の PBMCの移動 活性への影響を調べた結果を示す。 A は組換えャギ IP- 10 (rcIP-10) についての ウェスタンブロッ卜の糸吉果、 B は PBMCにおける CXCR3 m謂 Aのノーザンブロッ卜の 結果、 C は I FN-て処3¾び非処理子宫内膜培養培地、 及び rcIP- 10 の PBMCの移動 、 D は抗 IP- 10抗体の 下における IFN-てまたは rcIP_10朿 ij激子宫内膜培養培 地の PBMC移動を示す。
図 10は、 組換えャギ IP- 10タンパク質及びそれに対する抗体の作製について調 査した結果を示す。 A は、 組換えャギ IP- 10(rcIP- 10)を大腸菌 BL21- SI で発現し 、 その細胞溶解物を SDS- PAGEにかけた結果を示すものである。 レーン 1は、 ニッ ケルキレ一トカラムによる精製前のものを、 レーン 2は、 精製後のものを示す。 B は、 精製 rcIP- 10 タンパク質のウェスターンブロット分析の結果を示す。 レー ン 1は、 抗- His- Tag抗体の結果、 レーン 2は、 抗-ャギ IP-10抗体の結果を示す 。 Cの左側は、 CXCR3 mRNAについてのノーザンブロット分析の結果を示す。 RNA は、 pcDNA3.卜ャギ CXCR3 により一過性にトランスフヱクトされた KU-1細胞から 抽出されたもの（CXCR3)或いは親のベクタ一 pcDNA3. 1でトランスフヱク卜された KU - 1細胞から抽出された （Mock) 。 Cの右側は、 CXCR3 をトランスフヱク卜した KU- 1細胞に対する rcIP- 10の生物学的活性をケモタキシスァッセィにより調べた 結果を示す。 〇は、 CXCR3を発現しているもので、 □は、 CXCR3 を発現していな いものである。 D は、 rcIP-10 を添加した KU-1細胞におけるケモタキシスアツセ ィの糸吉果を示す。 anti IP- 10は、 抗 -ャギ IP-10抗体で前処理してある： 1¾を、 —は、 抗体による処理の一切ない^を、 そして control IgGは、 コントロール のゥサギ IgGで前処理した if^を示している。
図 11は、 妊娠初期におけるャギ子宮内 IP- 10の発現について調査した結果を示 す。 Aは、 ャギ胚仔由来の培養培地中の IFN-ての存在をウェスターンブロット分 折した結果を示す。 D14 は、 妊娠 14日目ャギ胚仔由来の培養培地、 D17 は、 妊娠 17曰目のもの、 そして D20 は、 妊娠 20日目のものである。 B は、 子宮内膜 IP - 10 mRNAのノーザンブロットの結果を示す。 パネル左は、 妊娠ャギからの RNAで、 ノ、。 ネル右は、 rcIFN-てで刺激された発情周期ャギからの RNAである。 Cの左側は、 発情周期及び妊娠のャギ子宮フラッシング培地中の IP- 10 のウェスターンプロッ ト分析の結果を示す。 Cの右側は、 IP- 10 のウェスターンプロッ卜の濃度解析結 果を示す。 D は、 ャギ子宮における IP- 10 mRNAの in si tuハイブリダィゼ一ショ ンの結果を示す。
図 12は、 ャギ胚仔における CXCR3の発現と細胞内局在につ 、て調査した結果を 示す。 A は、 RT- PCRにより CXCR3 mRNAの発現レベルを調べた結果を示す。 B は、 ノーザンブロット分析により CXCR3 mRNAの発現を調べた結果を示す。 Cは、 抗- C XCR3抗体を用 、ての CXCR3発現につ 、て、 免疫蛍光検査分析した結果を示す。 図 13は、 ャギト口ホブラスト細胞への rcIP- 10の結合につ 、て調査した結果を 示す。 A は、 組換えタンパク質のピオチン化効率を調べた結果を示す。 B は、 IP -10 レセプタ一 CXCR3 mRNA及びリンフオタクチンレセプ夕一 XCR1 mRNAの発現を RT - PCRにより分析した結果を示す。 C は、 ピオチン化したタンパク質を妊娠 17日 目のャギ胚仔と反応させ、 ホースラディシュペルォキシダ一ゼ標識ストレプトァ ビジンで可視化した結果を示す。
図 14は、 CXCR3を発現している胚仔細胞に対する組換え cIP - 10の遊走活性刺激 について調査した結果を示す。 A の左側は、 HTS- 1から抽出した RNAのノーザン ブロットの結果を示している。 Aの右側は、 HTS-1のケモタキシスアツセィの結 果を示している。 B は、 CXCR3発現プラスミ ドでトランスフヱク卜した HTS- 1の 遊走活性に対する rcIP- 10 の作用について調査した結果を示す。 C は、 妊娠 17日 目の CXCR3を発現してレ、る初代ト口ホブラスト細胞にっ 、てケモタキシスァッセ ィを行った結果を示す。
図 15は、 フィブロネクチン及び子宮内 ±皮細胞へのトロホブラスト細胞の接 着性に及ぼす rcIP- 10の影響について調査した結果を示す。 A は、 ャギトロホブ ラスト細胞 （妊娠 17日目） の據性につき、 rcIP - 10で活性化した if^の効果を 試験した結果を示す。 B は、 トロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの S«'f生 に及ぼす rcIP- 10 の作用を調べた結果を示す。 C は、 ャギ CXCR3発現べクタ一を 導入した HTS-1細胞について、 フイブロネクチンへの 性に及ぼす rcIP- 10の 作用を調べた結果を示す。 D は、 ャギ CXCR3発現べクタ一を導入した HTS- 1 細胞 について、 子宮内^ Jife細胞に及ぼす rcIP- 10の作用を調べた結果を示す。 図 16は、 組換え cIP- 10により活性化されたャギトロホブラスト細胞におけるィ ンテグリンサブュニッ卜の発現について調査した結果を示す。 上側は、 ャギ CXCR 3発現ベクターを導入した HTS- 1細胞について、 インテグリンサブュニット： 5、 a Y 3 1、 /3 3及び yS 5 mRNAを RT-PCRにより分析した結果を示す。 IP10 +Abs : 組換え cIP- 10(20 ng/ml) +抗- IP- 10抗体 (30 g/ml)による前処理、 IP10 ： 組換え cIP- 10(20 ng/ml)o 下側は、 PCR産物をデンシオメ トリック分析した糸吉 果を示す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において 「IP- 10」 とは、 インタ一フエロン'ガンマで される 10 KDaのタンパク質（interferon-ァ inducible protein 10 kDa, IP - 10) を指して いる。 本タンパク質因子は、 主に白血球のサブセットに対するケモタクティック 活性を介して炎症応答並びに免;! 答の多くの局面を制御して 、るケモカインフ アミリーの一員であるものを指してよい。 IP-10は、 マウス及びヒトにおける研 究から C- X- C ケモカイン類の一員であり、 例えばマクロファージ、 ¾維芽細胞、 星状 （ァスト口サイト） 細胞、 ケラチノサイト細胞、 上 細胞、 内^；細胞などを 含めた様々なタイプの細胞にぉレヽて誘導されていることの知られたものであつて よい。 該 IP - 10は C- X-C型ケモカインのレセプタ一 3 (CXCR3) を介して優先的に NK細胞並びに Thl表現型の活性化された T細胞を標的としているものであつてよ い。 本発明では、 特にヒッジ IP- 10 を同定して、 その特徵的な着床期における活性 力認識されることになつていることから、 こうした特性という点では有蹄動物の IP - 10 のいかなるものを包含しているものであってよい。 また、 その着床期にお ける活性を利用する観点からは、 ヒト IP- 10及びその誘割本、 類縁体、 等価物な どを包含していてよい。
ヒッジ IP - 10 は、 102個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、 その中には 4個のシスティン残基が存在する。 当該 4個のシスティン残基は、 ケモカインフ ァミリ一において保存され、 その最初の 2個のシスティン残基は一個のァミノ酸 残基により分けられて c-x-c型のモチーフを形成していること力認められるカ^ 他の動物のものと同様にヒッジ IP- 10 は、 該最初の 2個のシスティン残基よりも 前に位置するグル夕ミン-ロイシン-アルギニン (ELR) モチーフを欠いており、 ヒト IP - 10 と高い類似性、 すなわちそれぞれヌクレオチド配列では 82. 7%及びァ ミノ酸配列では 75. 5%の相同性を示していることを特徵としている。 本発明のヒ ッジ IP- 10 を含めた IP- 10 は、 （1) 胚遊走活性、 (2) 胚の子宮壁への着床促進活 性、 (3) 不妊治薪乍用、 (4)妊娠促進活性、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調 整活性、 (6) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群カヽ ら選ばれた生物活性を有することが挙げられる。 典型的には、 本発明のヒッジ IP- 10ゃャギ IP- 10を含めた IP- 10 は、 生体内に 雜する天然型ペプチド （内在性ペプチドあるいは内因性ペプチド） であってよ い。 本発明の代表的な IP- 10 としては、 配列表の配列番号: 1の DMでコードされ て産生されるポリべプチド、 例えは 列表の配列番号: 2のァミノ酸配列またはそ れと実質的に同等なアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。 また、 本 発明の代表的な IP - 10 は、 配列表の配列番号： 2のアミノ酸配列のうちの少なく とも 1〜102個の連続したアミノ酸残基を有し且つ (1) 胚遊走活性、 (2) 胚の子 宫壁への着床促進活性、 (3) 不妊治»用、 (4) 妊娠促進活性、 (5) 胚仔と母体 との間の相互作用調整活性、 （6) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調 整活性から成る群から選ばれた生物活性を有するもの、 あるいはそれらの特徴を 有し且つ配列表の配列番号： 2のァミノ酸配列に対し少なくとも 60%の相同性、 より好ましくは 75. 5%より大きい相同性、 またある齢には 82. 7% より大きい相 同性、 さらに好適には 90%以上の相同性、 または 95%以上の相同性を有するもの などが挙げられる。 特に好ましくは、 新規なもの力挙げられる。 本発明の 「ポリペプチド」 としては、 特には IP- 10及びその関連ポリペプチド 、 特にはヒッジ IP-10ゃャギ IP- 10 を含めた有蹄動物由来の IP-10 を包含する。 該 IP- 10及びその関連ポリペプチドとしては、 妊娠に関連して着床期における活 性を利用する観点からは、 ヒト由来のもの力挙げられてよい。 例えばヒッジ IP - 1 0が挙げられ、 代表的には、 配列表の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列のう ち、 少なくとも 60% より高い相同性、 好ましくは 70%以上の相同性、 さらに好ま しくは 80%以上の相同性、 また好ましくは 85%以上の相同性、 もつと好ましくは 90%以上の相同性、 より好ましくは 95%以上の相同性、 特に好ましくは 97%以上 の相同性を有し且つ (1)胚遊走活性、 （2) 胚の子宮壁への着床促進活性、 (3) 不 妊治薪乍用、 (4)妊娠促進活性、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6 ) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた 活性あるいは同等の抗原性などといつた実質的に同等の生物学的活性を有するァ ミノ酸配列を有するものがすべて挙げられる。 本発明の IP- 10 としては、 妊娠に関連して着床期における活性を利用する観点 からは、 ヒト由来 IP- 10、 ヒッジゃャギなどの有蹄動物由来の IP- 10 あるいはそ こに存在する特徵あるドメインやモチーフあるいはその"^を有し且つ新規なァ ミノ酸配列を有するものも含まれてよい。 より好ましくは、 本発明のペプチドと しては、 妊娠に関連して着床期における上記したような活性を持つもので、 各 IP - 10 ファミリ一と少なくとも 60% より高 、相同性を持つァミノ酸配列を有するも の力く挙げられる。 代表的には、 本発明のペプチドは、 配列表の配列番号： 2で表 されるァミノ酸配列と実質的に同等のァミノ酸配列を有するものからなる群から 選ばれたものである。 さらに本発明のぺプチドとしては、 配列表の配列番号： 2 で表されるァミノ酸配列の または^ ¾を有して 、てもよい。 こうした配列を 有するものはすべて包含されてよい。 本明細書中、 「相同性」 とは、 ポリペプチド配列 （あるいはアミノ酸配列） 又 はポリヌクレオチド配列 （あるいは塩基配列） における 2本の鎖の間で該鎖を構 成している各ァミノ酸残基同士又は各塩基同士の互いの適合関係において同一で あると決定できるようなものの量 （数） を意味し、 二つのポリぺプチド配列又は 二つのポリヌクレオチド配列の間の酉 2^相関性の禾 を意味するものである。 相 同性は容易に算出できる。 二つのポリヌクレオチド配列又はポリぺプチド配列間 の相同性を測定する方法は数多く知られており、 「相同性」 ( 「同一性」 とも言 われる） なる用語は、 当業者には周知である （例えば、 Lesk, A. M. (Ed. )， Com putational Molecular Biology, Oxford Universi ty Press, New York, (1988)； Smi th, D. W. (Ed. ), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Acad emic Press, New York, (1993)； Grif in, A. M. & Grif in, H. G. (Ed. ), Compu ter Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994)； von Heinje, G. , Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987)； Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed. ), Sequence Analysis P rimer, M- Stockton Press, New York, (1991) 等） 。 二つの配列の相同性を測定 するのに用いる一般的な方法には、 Martin, J. Bishop (Ed. ), Guide to Huge C omputers, Academic Press, San Diego, (1994)； Cari llo, H. & Li man, D.， S IAM J. Appl ied Math. , 48: 1073 (1988) 等に開示されているもの力く挙げられる が、 これらに限定されるものではない。 相同性を測定するための好ましい方法と しては、 試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計した もの力く挙げられる。 このような方法は、 コンピュータ一プログラムとして組み立 てられているもの力く挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好まし いコンピュータープログラム法としては、 GCGプログラムパッケージ (Devereux , J. et al.， Nucleic Acids Research, ' 12(1) : 387 (1984)) 、 BLASTPヽ BLASTN 、 FASTA (Atschul, S. F. et al. , J. Molec. Biol. , 215: 403 (1990)) 等が挙 げられる力く、 これらに限定されるものでなく、 当該分野で公知の方法を使用する ことができる。 本発明で対象とするポリべプチドあるいはタンパク質をコードする核酸は、 妊 娠に関連して着床期における上記したような活性を利用する観点からは、 IP- 10 及びその関連ポリベプチド及びその一部の連続したァミノ酸配列をコ一ドする塩 基配列を含有するもの、 ヒッジゃャギなどの有蹄動物由来の IP- 10及びその関連 ポリぺプチド及びヒト由来の IP- 10及びその関連ポリぺプチド並びにその一部の 連続したアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を含有するもの、 ある代表的な; 1¾ には、 配列表の配列番号： 2で表されるペプチド及びその一部の連続したァミノ 酸配列をコ一ドする塩基配列を含有するもの、 例えば、 配列表の配列番号： 1で 表される塩基配列の少なくとも 63- 365位により構成される塩基配列を含有するも の、 及ぴ¾列表の酉 リ番号： 1で表される塩基配列の 60- 62位の ATGから 366 - 36 8位の TM より構成される塩基配列を含有するもの （終止コドン TMは、 TGAま たは TAGであってもよい） であること力くできるし、 塩基配列に開始コドン （Met をコ一ドするコドン） 及び終止コドンを付加したもの、 また、 該塩基配列がコ一 ドするタンパク質と少なくとも 80%、 85%、 90%、 95%, あるいは 98%の相同性 を有するアミノ酸配列を持ち且つ配列表の配列番号： 2のアミノ酸配列のうちの 少なくとも 1〜16個の連続したアミノ酸残基を有し、 尚且つ (1) 胚遊走活性、 (2 ) 胚の子宮壁への着床促進活性、 (3) 不妊治劇乍用、 (4) 妊娠促進活性、 (5) 胚 仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性、 及び (7)子宮内免 疫機能調整活性力、ら成る群から遷ま'れた活性を有するかあるレ、は同等の抗原性な どのそれと実質的に同等の生物学的活性を有するぺプチドをコ一ドするといつた それと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであつてもよい。 該 IP - 10 をコ一ドする核酸は、 一本鎖 DNA、 二本鎖 DNA、 RNA、 DNA:RNAハイプリ ッド、 合成 DNAなどの核酸であり、 またヒッジ、 ャギあるいはヒトゲノム DNA、 ヒッジ、 ャギあるいはヒトゲノミック DNA ライブラリ一、 ヒッジあるいはヒト組 織 '細胞由来の cDNA、 合成 DNAのいずれであってもよい。 該 IP-10 をコードする 核酸の塩基配列は、 修飾 （例えば、 付加、 欠失、 置換など） されることもでき、 そうした修飾されたものも包含されてよい。 さらには、 以下説明するように、 本 発明の核酸は、 本発明のぺプチドあるいはその一部をコ一ドするものであってよ く、 好ましいものとしては DNA力挙げられる。 また上記 「同効の塩基配列」 とは 、 例えばストリンジェント（stringent)な条件下で配列表の配列番号： 1の塩基 配列のうちの連続した 5個以上の塩基配列、 好ましくは 10個以上の塩基配列、 よ り好ましくは 15個以上の塩基配列、 さらに好ましくは 20個以上の塩基配列とハイ ブリダイズし、 該 IP-10 と実質的に同等のァミノ酸配列をコ一ドするものなどが 挙げられる。 ストリンジヱン卜な条件とは、 所定のボリヌクレオチドとォリゴヌ クレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプローブとの選択的力、つ検出可能な特 異的結合を可能とする条件である。 ストリンジヱント条件は、 塩濃度、 有機溶媒 (例えば、 ホルムアミ ドなど） 、 温度、 およびその他の公知の条件によって定義 される。 すなわち、 塩濃度を減じる力、、 有機溶媒濃度を増加させるか、 またはハ イブリダイゼ一シヨン温度を上昇させるかによつてストリンジヱンシ一（stringe ncy)は増加する。 例えば、 ストリンジェントな塩濃度は、 通常、 NaCl約 750 mMJ¾ 下およびクェン酸三ナトリウム約 75 «下、 より好ましくは NaCl約 500 π ¾下 およびクェン酸三ナトリウム約 50 «下、 最も好ましくは NaCl約 250 «下お よびクェン酸三ナトリゥム約 25 mMJ¾下である。 ストリンジヱン卜な有機溶媒濃 度は、 ホルムアミ ド約 35%以上、 最も好ましくは約 50%以上である。 ストリンジ ェントな温度条件は、 約 30°C以上、 より好ましくは約 37°C以上、 最も好ましくは 約 42°C以上である。 その他の条件としては、 ハイブリダィゼ一シヨン時間、 洗浄 剤 （例えば、 SDS などの界面活性剤など） の濃度、 およびキャリア一 DNAの存否 等であり、 これらの条件を組み合わせることによって、 様々なストリンジヱンシ 一を設定すること力くできる。 一つの好ましい態様としては、 例えばナトリウム濃 度が約 19〜20 mMで、 力、っ が約 60〜65°Cである条件が好ましく、 ナトリウム 濃度が約 19 mM の濃度で、 力、つ温度が約 65°Cの温度である条件が更に好ましい。 所定の遺伝子産物の確認を、 当該遺 をトランスフエクシヨンした、 293T細 胞、 COS- 1 胞などのそれに適した動物細胞などを用いて行うことカできる。 こ の外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知ら れた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うこと力《でき、 例えばリン酸カ ルシゥム法 （例えば、 F. L. Graham et al. , Virology, 52: 456, 1973など） 、 DBAE- デキストラン法 （例えば、 D. Warden et al. , J. Gen. Virol. , 3： 371, 1968など） 、 エレクトロボレ一シヨン法 （例えば、 E. Neumann et al. , EMB0 J, 1 : 841, 1982 など） 、 マイクロインジェクション法、 リボソーム法、 ウィルス 感染法、 ファージ粒子法などが挙げられる。 こうして所定の遺伝子、 例えば IP- 1 0遺イ^をトランスフエクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、 それ を角军析することもできる。
本発明で得られた DNAなど （例えば、 IP- 10遺伝子など） を糸 むプラスミ ド としては遺ィ 5^工学的に常用される宿主钿胞 （例えば、 昜菌、 枯草菌等の原核 細胞宿主、 酵母、 CH0細胞、 COS細胞等の 細胞宿主、 Sf21等の昆虫細胞宿主 ) 中で該 DNA力く発現できるプラスミ ドであればどのようなプラスミ ドでもよい。 こうした配列内には、 例えば選択した宿 細胞で発現するのに好適に修飾された コドン力く含まれていること力くできるし、 制限酵素部位が設けられていることもで きるし、 目的とする遺伝子の発現を にするための制御配列、 促進配列など、 目的とする遺伝子を結合するのに つリンカ一、 アダプタ一など、 さらには抗 生物質耐性などを制御したり、 代謝を制御したりし、 選別などに有用な配列 （ノ、 イブリ ドタンパク質や融合タンパク質をコードするものも含む） 等を含んでいる ことができる。 好ましくは、 適当なプロモータ一、 例えば大腸菌を宿主とするプ ラスミ ト"では、 トリプトファンプロモーター（trp) 、 ラク トースプロモーター（1 ac) 、 トリプトファン ·ラク ト一スプロモータ一（tac：) 、 リポプロテインプロモ —タ一（ΙΡΡ) 、 スファ一ジ PL プロモーター等を、 動物細胞を宿主とするプラス ミ ドでは、 SV40レートプロモータ一、 MMTV LTRプロモーター、 RSV LTRプロモー ター、 CMVプロモータ一、 SR プロモータ一等を、 酵母を宿主とするプラスミ ド では、 GAL1、 GAL10プロモータ一等を使用し得る。 大腸菌を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば pBR322、 pUC18、 p(JC19、 pUC118、 pUC119、 pSP64、 pSP65、 pTZ- 18R/- 18U、 pTZ-19R/- 19U、 pGEM - 3、 pGBM-4s pGEM- 3Z、 pGEM- 4Z、 pGEM- 5Zf (-)、 pBluescript KS™ (Stratagene ) などが挙げられる。 昜菌での発現に適したプラスミ ドベクタ一としては、 pA S、 pKK223 (Pharmacia), pMC1403、 pMC931、 pKC30、 pRSET-B (Invi trogen)な ども挙げられる。 動物細胞を宿主とするプラスミ ドとしては、 SV40ベクター、 ポ リオ一マ · ウィルスベクター、 ワクシニア ·ウィルスべクタ一、 レトロウイノレス ベクターなどが挙げられ、 例えば pcD、 pcD-SR a , CDM8、 pCEV4、 pME18S、 pBCl 2B I、 pSG5 (Stratagene) などが挙げられる。 酵母を宿主とするプラスミ ドとし ては、 Yip型べクタ一、 YEp型べクタ一、 YRp型ベクター、 YCp型ベクターなど 力挙げられ、 例えば pGPD- 2などが挙げられる。 宿主細胞としては、 宿 ±睡包が大 腸菌の 、 例えば大腸菌 K12株に由来するもの力挙げられ、 例えは 533、 XL 1 - Blue、 C600、 DH1、 DH5、 DH11Sヽ DH12Sヽ DH5 、 DH10B, 隱 1、 C1061 、 JM109、 STBL2、 B834株由来としては、 BL21 (DE3)pLysSなどが挙げられる。 宿 主钿胞が動物細胞の場合、 例えばァフリカミ ドリザル線維芽細胞由来の COS- 7細 胞、 COS- 1細胞、 CV- 1細胞、 マウス線維芽細胞由来の COP細胞、 MOP細胞、 W0P 細胞、 チャイニーズ'ハムスター細胞由来の CH0細胞、 CHO DHFR一細胞、 ヒト He La細胞、 マウス細胞由来 C127細胞、 マウス細胞由来 NIH 3T3細胞などが挙げられ る。 昆虫細胞としては、 カイコ核多角体病ウィルス （Bombyx mori nuclear poly hedrosis virus) あるいはそれに由来するものをべクタ一とし、 カイコ幼虫ある いはカイコ培養細胞、 例えば BM-N細胞などを用いること力く挙げられる。植物細胞 を宿主細胞として使用することも可能であり、 それに適するベクタ一と共に、 そ れらは当該分野で広く知られて、る。本発明の遺伝子工学的手法にお 、ては、 当 該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、 逆転写酵素、 DNA断片をク 口―ン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素である DN A修飾 ·分解酵素、 DNA ポリメラ一ゼ、 末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ 、 DNA リガーゼなどを用いることが出来る。 DNA遺伝子をクロ一ニングして DNA ライブラリ一をネ冓築するのに適したベクタ一としては、 プラスミ ド、 スファ一ジ 、 コスミ ド、 P1ファージ、 F因子、 YACなどが挙げられ、 好ましくはスファ一ジ 由来のベクタ一力く挙げられ、 例えば Charon 4A、 Charon 21A、 A tlOs A gtll, A DASHI K A FIXI k A EMBL3, λ ZAP I I™ (Stratagene) などが挙げられる。 本発明の夕ンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換され た形質転換体は、 必要に応じて適当な選択マーカーを用い、 繰り返しクロ一ニン グを行うことにより、 高レ、発現能を安定して有する細胞株を得ること力くできる。 例えば、 宿主細胞として動物細胞を用いた形質転換体において、 dhfr遺伝子を選 択マ一力一として利用した i ^、 MTX濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択 することにより、 本発明のタンパク質をコードする DNAを増幅させ、 より高い発 現を得られる細胞株を得ること力できる。本発明の形質転換体は、 本発明のタン パク質をコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、 目的物を生成、 蓄積せし めることができる。 該形質転換体は、 当該分野で汎用されている培地中で培養す ること力くできる。 例えば、 昜菌、 枯草菌等の原核細胞宿主、 酵母などを宿主と している形質転換体は、 液体培地を好適に使用すること力できる。培地中には、 該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無»その他が含有せしめられる 。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖な ど、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム^!、 石肖酸^！貢、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 麦芽エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出 液などの無機または有 質、 無機物としては， 例えば、 塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム、 炭酸カルシウムなどが挙げられる。 ま た、 酵母、 ビタミン類、 カザミノ酸、 生長促進因子などを添加してもよい。 また
、 必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 S—インドリ ル ァクリノレ酸のような薬斉 IJを加えることができる。 培地の p Hは約 5〜 8力く望 ましい。 培養は、 例えば大腸菌では通常約 15〜約 45°Cで約 3〜約 75時間行い、 必要によ り、 通気や攪拌を加えることもできる。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養 する際、 培地としては、 たとえば約 5〜約 20%の胎児牛血清を含む MEM培地、 PR MI 1640±咅地、 DMEM培地などが用いられる。 pHは約 6〜約 8であるの力《好まし 、。 培養は通常約 30°C〜約 40°Cで約 〜約 72時間行 、、 必要に応じて通気や攪拌を加 える。上記培 ¾細胞から抽出するに際しては、 ±咅鎌、 公知の方法で菌体あるい は細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/また は凍結融解などによつて菌体ぁるし、は細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によ り粗抽出液を得る方法などを適: tfflいること力くできる。緩衝液の中には尿素や塩 酸グァニジンなどの蛋白変性剤や、 Tr on X- 100 (商品名） 、 Tween-80 (商品名 ) などの界面活性剤を加えてあってもよい。 培養液中に目的生成物力く分泌される には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離 し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含ま れる目的生成物は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせてその精製を行 なうことができ、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿法などの塩析、 セフアデックスな どによるゲルろ過法、 例えばジェチルァミノエチル基あるいはカルボキシメチル 基などを持つ担体などを用いたィォン交換ク口マトグラフィ一法、 例えばブチル 基、 ォクチノレ基、 フエニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマ トグラフィ一法、 色素ゲルク口マトグラフィ一法、 電気泳動法、 透析、 限外ろ過 法、 ァフィ二ティ ·クロマトグラフィ一法、 高速液体ク口マトグラフィ一法など により精製して得ることができる。好ましくは、 ポリアクリルァミ ドゲル電気泳 動、 リガンドなどを固定化したァフィニティ一'クロマトグラフィーなどで処理 し精製分離処理できる。 例えば、 ゼラチンーァガロース ·ァフィ二ティ一 'クロ マトグラフィ一、 へパリンーァガロース ·クロマトグラフィ一などが挙げられる
さらに、 本発明に係わる所定の遺伝子: M配列を基に遺伝子工学的に常用され る方法を用いることにより、 IP- 10 (例えばヒト IP- 10、 ヒッジ IP - 10、 ャギ IP - 10 など） のァミノ酸配列中に 、 1個な 、し複数個以上のァミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するタンパク質を 製造することができる。 こうした変異 ·変換 ·修飾法としては、 日本生化学会編
、 「^化学実験講座 1、 遺ィ 5?研究法 I I 」、 P105 (広瀬進） 、 東京化学同人 (1986) ; 日本生化学会編、 「新生化学実験講座 2、 核酸 I I I (組換え DNA技術） 」、 p233 OS瀬進） 、 東京ィ！^同人 (1992)； R. Wu， L. Grossman, ed.， "Method s in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367， Academic Press, New York (1 987) ; R. Wu, L. Grossman, ed.， "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457
& p. 468， Academic Press, New York (1983)； J. A. Wel ls et al.， Gene, 3 4: 315， 1985 ; T. Grundstroem et al. , Nucleic Acids Res. , 13 : 3305, 1985 ;
J. Taylor et al. , Nucleic Acids Res. , 13 : 8765, 1985; R. Wu ed. , " etho ds in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987)； A . R. Oliphant et al. , Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。 例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変 入法 （部位特異的 変 入法） (Zoller et al. , Nucl. Acids Res. , 10: 6487, 1987; Carter et al. , Nucl. Acids Res. , 13: 4331, 1986), カセット変 入法 (cassette mut agenesis : Wells et al. , Gene, 34: 315， 1985), 制限部位選択変異導入法 (re striction selection mutagenesis : Wells et al. , Phi los. Trans. R. Soc. Lo ndon Ser A, 317: 415, 1986),ァラニン ·スキャンニング法 (Cunningham & Wei Is, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR変難入法， Kunkel法， dNTPC aS] 法 （Eckstein),亜硫酸や亜硝酸などを用いる領 ¾ί旨定変異導入法等の方法が挙げ れる。 さらに得られた本発明のタンパク質 （あるいはペプチド） は、 ィ匕学的な手法で その含有される了ミノ酸残基を修飾することもできるし、 ぺプチダ一ゼ、 例えば ペプシン、 キモトリブシン、 ノ、。パイン、 ブロメライン、 エンドぺプチダ一ゼ、 ェ キソぺプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、 部分分解したりしてその誘導 体などにすることができる。 本発明のタンパク質は、 C末端が通常カルボキシノレ 基 (- C00H) またはカルボキシレ一ト （- COO—) である力、 C末端がアミ ド (- C0NH 2)またはエステル (-C00R)であってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては 、 例えば、 メチル、 ェチル、 n-プロピル、 イソプロピルもしくは n-ブチルなどの ー6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8 シクロ アルキル基、 例えば、 フエニルヽ 一ナフチルなどの C6一 1 2 ァリール基、 例えば 、 ベンジル、 フヱネチルなどのフヱニルー C,— 2アルキル基もしくは α—ナフチル メチルなどの《—ナフチル - Ci— 2 アルキル基などの C 7 4 ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。 本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 ほたはカルボキシレート） を有している:^、 カルボキシル基がアミ ドィ匕またはエステル化されているもの も本発明のタンパク質に含まれる。 この^のエステルとしては、 例えば上記し た 末端のエステルなどが用 ゝられる。 さらに、 本発明のタンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメ チォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C！— 5 アルキル一カルボニル基などの C,一 6アシノレ基など） で保護されているもの、 N端 側力生体内で切断され生成したグノレタミノレ基がピログルタミノレ化したもの、 分子 内のァミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 - 0H、 - C00H、 アミノ基、 イミダゾ一 ノレ基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） 力く適当な保護基 （例えば、 ホノレミル基 、 ァセチノレ基などの —sァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。 また遺伝 且換え法で製造する時に融合夕ンパク質として発現させ、 生体内あるいは生体 外で天然の IP- 10 と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換 .加工 してもよい。 遺ィ 5?ェ学的に常用される融合産生法を用いること力くできる力、 こ うした融合タンパク質はその融^ ¾を利用してァフィ二ティ ·クロマトグラフィ —などで精製することも可能である。 こうした融合タンパク質としては、 ヒスチ ジンタグに融合せしめられたもの、 あるいは、 3-ガラクトシダ一ゼ （iS- gal) 、 マルト一ス結合タンパク (MBP), グルタチォン- S-トランスフヱラ一ゼ （GST) 、 チォレドキシン （TRX)又は Cre Recombinaseのアミノ酸配列に融合せしめられ たものなどが挙げられる。 同様に、 ポリペプチドは、 ヘテロジーニアスなェピト —プのタグを付加され、 該ェピトープに特異的に結合する抗体を用レ、てのィムノ ァフィ二ティ ·クロマトグラフィ一による精製をなし得るようにすることもでき る。 より適した実施態様においては、 該ェピトープタグとしては、 例えば AU5， c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41， Glu-Glu, HA, Ha. 11, KT3, FLAG
(registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni -probe, S - probe, T7， Lex A, V5， VP16, GAL4, VSV-Gなどが挙げられる。 (Field et al. ,' Molecular and Cel lular Biology, 8: pp. 2159-2165 (1988) ; Evan et al. , Molecular and Cellul ar Biology, 5: pp. 3610-3616 (1985)； Paborsky et al. , Protein Engineering ， 3(6) : pp. 547-553 (1990)； Hopp et al. , BioTechnology, 6: pp. 1204-1210 ( 1988)； Martin et al. , Science, 255: pp. 192-194 (1992) ; Skinner et al. , J . Biol. Chem. , 266: pp. 15163-15166 (1991) ; Lutz-Freyermuth et al. , Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp. 6393-6397 (1990)など)。
さらに融合タンパク質としては、 検出可能なタンパク質となるようなマーカ一 を付されたものであることもできる。 より好適な実施態様においては、 該検出可 能なマ一力一は、 ピオチン/ストレプトアビジン系の Biotin Avi Tag, 螢光を発 する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、 ォワンクラゲ （Aequ orea victorea)などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（green fluorescent protein: GFP)、 それを改変した変異体 (GFPバリアント）、例えば、 BGFP (Enha need-humanized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 黄色螢光タンパク質 （yellow f luorescent protein: YFP), 'Hfe螢光タンノヽ0ク質 (green f luorescent protein: GFP)，藍色螢光タンパク質 （cyan f luorescent protein: CFP), 螢光タンパ ク質 (blue fluorescent protein: BFP), ゥミシィタケ (Reni lla reniformis) 由来の GFP などが挙げられる （宫脇敦史編、 実験医学別冊ポストゲノム時代の実 験講座 3—GFP とバイオイメージング、 羊土社 （2000年))。 また、 上記融合タグ を特異的に認識する抗体 （モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む） を 使用して検出を行うこともできる。 酵母を利用した two- hybrid法も利用できる
本発明の対象タンパク質 （例えば、 ヒト由来の IP- 10、 ヒッジ由来の IP- 10 な ど） は、 1個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、 1個 以上のァミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであつてもよいし、 特徴的 な着床期における活性、 例えば妊娠に関連しての着床期における活性、 より具体 的には、 （1) 胚遊走活'性、 （2) 胚の子宮壁への着床促進活性、 （3) 不妊治薪乍用 、 （4) 妊娠促進活性、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免! ¾細胞 遊走活性、 及び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性を 有するもの力 げられる。 本発明の文像タンパク質は、 上記したようなヒト由来 の IP- 10、 ヒッジ由来の IP- 10 などの、 特有なアミノ酸残基が 1個以上 （例えば 、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好ましくは 1〜40個、 さらに好ましく は 1〜20個、 特には 1〜10個など） 欠けている欠^縁体、 のアミノ酸残基 の 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好ましくは 1〜40 個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10個など） 力《他の残基で置換されて いる置換類縁体、 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好 ましくは 1〜40個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10個など） のァミノ 酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。 天然の IP - 10の斗纖であるドメ ィン構造あるいはレセプタ一結合能が纖されていれば、 上記のごとき変異体は 、 全て本発明に包含されてもよい。 また本発明の所定タンパク質は天然の IP - 10 と実質的に同等の一次構造コンフオメ一シヨンあるいはその一部を有して 、るも のも含まれてよいと考えられ、 さらに天然の IP- 10 と実質的に同等の生物学的活 性を有しているものも含まれてよいと考えられる。 さらに天然に生ずる変異体の 一つであることもできる。 本発明の対象タンパク質は、 例えば、 配列表の配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列のうち、 （1) 第 2位〜第 102位のアミノ酸配列を 有するもの、 （2) 同第 1位〜第 102位のアミノ酸配列を有するもの、 及び (3) 少 なくとも同第 20位〜第 80位のァミノ酸配列を有するものからなる群から選ばれた アミノ酸配列に対し、 60%、 J ^によっては 70% より高い相同性を有しているも の力く挙げられ、 より好ましくはそれに対し、 80%あるいは 90%以上の相同ァミノ 酸配列を有するもの力く挙げられる。 本発明の対象タンパク質の一部のものとは、 該タンパク質の一部のペプチド （すなわち、 該タンパク質の部分ペプチド） であ つて、 本発明のヒッジ IP- 10 と実質的に同等な活性を有するものであれば 、ずれ のものであってもよい。例えば、 該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、 本発 明のヒッジ IP- 10 の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 5個以上、 好ましくは 20 個以上、 さらに好ましくは 70個以上、 より好ましくは 80個以上、 もっと好ましく は 90個以上、 ある には 95個以上のァミノ酸配列を有するぺプチドが挙げられ 、 好ましくはそれらは連続したァミノ酸残基に対応するものである力、、 あるいは 、 例えば、 配列表の配列番号： 2で示されるアミノ酸酉己列のうち文寸応する領域に 対する相同性に関して、 上記と同様の相同性を有するものカ挙げられる。 本明細書において、 「実質的に同等」 や 「実質的に同一」 とは蛋白質の活性、 例えば、 着床期の活性、 生理的な活性、 生物学的な活性が実質的に同じであるこ とを意味する。 さらにまた、 その用語の意味の中には、 実質的に同質の活性を有 する: ^を包含していてよく、 該実質的に同質の活性としては、 （1) 胚遊走の活 性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治謝乍用、 (4) 妊娠促進作用、 (5 ) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫钿胞遊走活性、 及び (7) 子宮 内免疫機能調整活性から成る群から遍ま'れた活性などを挙げることができる。該 実質的に同質の活性とは、 それらの活性が性質的に同質であることを示し、 例え ば、 生理的に、 薬理学的に、 あるいは生物学的に同質であることを示す。 例えば 、 (1) 胚遊走の活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療作用、 (4) 妊娠促進作用、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫細胞遊走活 性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた活性などの活性が
、 同等（例えば、 約 0. 001〜約 1000倍、 好ましくは約 0. 01〜約 100倍、 より好ま しくは約 0. 1〜約 20倍、 さらに好ましくは約 0. 5〜約 2倍） であること力好まし 、が、 これらの活性の禾 ig、 タンパク質の分子量などの量的な要素は異なつてい てもよい。 次に、 アミノ酸の置換、 欠失、 あるいは付加は、 しばしばポリべプチ ドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、 あるいはブラ スの変ィ匕を生ぜしめる力、 こうした:! ¾、 その置換、 欠失、 あるいは付加を施さ れたポリペプチドは、 所定の目的からはそうした置換、 欠失、 あるいは付加のさ れていないものと実質的に同一であるとされてよい。 該ァミノ酸配列中のァミノ 酸の実質的に同一な置換体としては、 そのアミノ酸が属するところのクラスのう ちの他のアミノ酸類から選ぶこと力くできうる。 例えば、 非極性 （疎水性） ァミノ 酸としては、 ァラニン、 フヱニルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 バリン、 プロリン、 トリブトファン、 メチォニンなどが挙げられ、 極性 （中性） としては 、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グノレ タミンなどが挙げられ、 陽電荷をもつアミノ酸 （塩基性アミノ酸） としては、 ァ ルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどが挙げられ、 陰電荷をもつアミノ酸 （酸性ァ ミノ酸） としては、 ァスパラギン酸、 グノレ夕ミン酸などが挙げられる。 本発明のタンパク質及びその一部のぺプチドの合成には、 当該べプチド合成分 野で知られた方法、 例えば液相合成法、 固相合成法などの化学合成法を删する こと力くできる。 こうした方法では、 例えばタンパク質あるいはペプチド合自樹 脂を用い、 適当に保護したアミノ酸を、 それ自体公知の各種縮合方法により所望 のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。 縮合反応には、 好ましくはそ れ自体公知の各種活性化 ¾ ^を用いる力 そうした としては、 例えばジシク 口へキシルカルボジィミ ドなどカルボジィミ ド類を好ましく使用できる。 生成物 力保護基を有する には、 i S保護基を除去することにより目的のものを得る こと力くできる。
本発明のタンパク質及びその一部のぺプチドは、 それが遊離型のものとして得 られた齢には、 それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換する こと力《でき、 またそれらは塩として得られた:^には、 それ自体公知の方法ある いはそれに準じた方法で遊离 I のものあるいは他の塩に変換すること力《できる。 本発明のタンパク質及びその一部のぺプチドの塩としては、 生理的に許容され るものあるいは として許容されるもの力《好まし 、が、 これらに限定されない こうした塩としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 硝酸、 リン酸などの無 機酸との塩、 例えば ¾酸、 キ 、 マレイン酸、 フマール酸、 コハク酸、 クェン酸
、 酒石酸、 リンコ 、安息香酸、 メタンスルホン酸、 P-トルエンスルホン酸、 ベ ンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。 さらに該塩としては、 了ンモニゥム塩、 例えばェチルァミン、 ジメチルァミン、 トリメチルァミン、 ヒ ドロキシェチルァミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
こうした本発明の IP-10及びその変異体、 修飾体、 誘割本などは、 上記で説明 したような分離 ·精觀理を施すこと力できる。 本発明では、 「断片」 、 「誘導 体」 及び 「類縁体」 なる用語は、 例えば、 配列番号： 2のポリペプチド、 配列番 号： 1の配列から転写され且つスプラィシングされて 、ないか又は特異的にスプ ラィシングされた hnRNA又は mRNAによりコ一ドされるポリぺプチド、 又はゲノミ ック DNA によりコードされるポリペプチドに関連して、 その 「断片」 、 「誘 本 」 又は 「類縁体」 と称した： ti^、 このようなポリペプチドと本質的に同一の生物 学的機能又は活性を有しているポリぺプチドを意味する。 本発明ではこれまで知られていなかった哺乳動物のタンパク質 IP- 10の機能に 関する '歸! ¾を樹共しているから、 こうした it#を利用することも本発明に包含さ れる。 こうした利用としては、 例えば IP- 10及び関連タンパク質をコードする哺 乳動物、 特に好ましくはヒトの、 ゲノム DNA及び cDNAの単离|¾び検知などをして 、 該 IP- 10の解明された機能、 例えば胚遊走活性化、 胚の子宮壁への着床促進、 不妊治療、 妊膨カ率促進、 着床期に胚を子宮に誘因する活性、 胚仔と母体との間 の相互作用調整活性などを調べる手法ゃ觀の開発が挙げられる。
例えば、 ヒッジ IP-10 DNA配列などの IP- 10 DNA配列をプローブとして利用し て、 例えば IP-10及び関連タンパク質の機能角斜斤、 例えば胚遊走活性化、 胚の子 宫壁への着床促進、 不妊治療、 妊 ¾j率促進、 着床期に胚を子宮に誘因する活性 、 S丕仔と母体との間の相互作用調整活性などが可能である。 プローブは、 必要に 応じて、 当該分野で知られた標識を付与しておくこと力くできる。 標識は、 ラジオ ァイソトープ（RI) 法または非 RI法によって行うこと力くできる力、 非 RI法を用い ること力 子ましい。 非 RI法としては、 蛍^ ^謝去、 ピオチン標識法、 ィ匕学発光法 等が挙げられる力く、 蛍;) ΐ^Ι ^去を用いること力 子ましい。 蛍光物質としては、 ォ リゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いること力くで きる力く、 シァニン色素 (例えば、 Cy Dye™シリーズの Cy3、 Cy5等) 、 ローダ ミン 6GM¾、 N-ァセトキシ -N2-ァセチルアミノフノレオレン (MF)、 MIF(MFの ヨウ素誘割本） などをィ fflすること力くできる。 例えば、 遺伝子の単離にあたって は、 PCR法、 さらには逆転 素 (RT) を用いた PCR法 （RT- PCR) を利用するこ とが出来る。 IP- 10 cDNA及びその関連 DNA は、 クロ一ニングされ、 配列決定され た IP- 10 cDNA配列から推定されるァミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び 、 DNAプライマ一をデザインして化学合成し、 得られた DNAプライマ一（プライ マ一セットを含む） を用いて、 PCR法、 競合 PCR法、 RT- PCR、 Real-Time PCR (J ournal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193(2000)、 その他の方法を用い て IP- 10 関連遺伝子の単離、 検出などに利用することが出来る。 プライマーのサ ィズ （塩基数） は、 DNAとの間の特異的なァニ一リングを満足させることを 考慮し、 15-40塩基、 望ましくは - 30：^である。 ただし、 LA(long accurate ) PCRを行う: ff^には、.少なくとも 30塩基が効果的である。 センス鎖 （5'末端側 ) とアンチセンス鎖 （3'末端側） からなる 1組あるいは 1対 ( 2本） のプライマ —力互いにァニールしないよう、 両プラィマ一間の相補的配列を避けると共に、 ブラィマ一内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるよう にする。 さらに、 ,議 Aとの安定な結合を確保するため GC含量を約 50%にし、 プライマー内におし、て GC- r i chあるいは AT- r i chが偏在しないようにする。 ァニ —リンク？^は Tm (melting temperature)に依存するので、 特異性の高い PCR産 物を得るため、 Tm値が 55- 65°Cで互いに近似したプライマ一を選定する。 また、 PCRにおけるブラィマー使用の最終濃度が約 0. 1〜約 1 になるよう調整する 等を留意すうことも必要である。 また、 プライマ一設計用の市販のソフトゥヱァ 、 例えば Ol igo™ (National Bioscience Inc. , USA製)、 GENETYX (ソフトウ ヱァ開発 （株） （曰本） 製） 等を用いることもできる。 プライマ一には、 ュニバ —サルプライマ一として知られたもの、 例えば dTプラィマーなどの公知のブラィ マ一を使用することもできる。 例えば、 IP- 10 mRNAのヒト糸職中での発現を各種 の組織由来 poly (A)+ RNA に対するノーザンブロット分析により検討することが できる。 本発明にしたがって、 cDNAをプローブとして用いれば、 例えばノーザン •ブロティング、 サザン ·ブロティング、 in si tu ハイブリダィゼーション、 ド ット ·ブロット、 RNase プロテクシヨン'アツセィなどによりヒト糸!熾中での IP -10 mRNAの発現や IP- 10遺伝子自体などを検出 ·測定でき、 ヒト紙熾における細 胞内タンパク質代謝、 ホルモン前駆体の活性化、 さらには上記妊娠に関連した活 性を含む、 多くの正常な細胞のプロセスに関与する、 胚仔と母体との間の相互作 用における役割、 不妊症、 流産の様な多くの疾患等を含めた生理作用の研究の発 展に貢献できる。 IP- 10 に関連した疾患の遺 fe^診断にも利用できる。 そうした 診断は、 当該 IP- 10及び関連タンパク質をコードする核酸の異常、 例えば損傷、 突然変異、 発現低下、 発現過多などを診断するものであること力できる。
該 in si tuハイブリダィゼ一シヨンには、 例えばノン RI in si tuハイブリダ ィゼ一ション力含まれてよく、 そこには、 例えば直接法及び間接法が含まれてよ い。 該直接法は、 例えば核酸プローブに検出可能な分子 （レ一ポーター） 力く直接 結合しているものを删し、 該間接法は、 例えばレ一ポーター分子に対する抗体 などを iffflしてシグナルを増幅せしめているものである。 核酸プ口一ブ中のォリ ゴヌクレオタイドには、 官能基 （例えば、 第一級脂) ¾ァミノ基、 SH基など） が 導入されており、 こうした官能基にハプテス 螢光色素、 酵素などが結合せしめ られていてもよい。核酸プローブの標識としては、 代表的にはジゴキシゲニン (D IG) 、 ピオチン、 フルォレツセインなどが挙げられるが、 下記抗体のところで説 明する標識から舰選択して删すること力 きるし、 また多重ラベリングも利 用でき、 さらに標識抗体も利用できる。 核酸プローブの標識法としては、 当該分 野で知られた方法から 選択して使用できる力く、 例えばランダムプライム法、 ニック · トランスレーション法、 PCR による DNAの増幅、 ラベリング/ティリン グ法、 in vi tro transcription法など力挙げられる。 処理された試料の観察には 、 当該分野で知られた方法から ¾ 選択して使用できる力、 例えば暗視野顕微鏡 、 位相差顕微鏡、 5オコントラスト顕微鏡、 螢:) fe®微鏡、 デジタルイメージング 顕微鏡、 電子顕微鏡なども^ fflできるし、 さらにフローサイトメ トリーなどによ るしとも さる。 本発明に従えば、 本発明の IP- 10 に関連して着床期の生理現象の遺伝子診断法 (検出方法） 力く樹共できる。 該遺伝子診断法では、 （a) 核酸試料を得る工程、 (b ) 工程 (a) にて得られた核酸試料を、 例えば PCR法、 RNAポリメラ一ゼを利用し た核酸増幅法、 鎖置換増幅法などで遺伝子増幅し、 例えば該 IP- 10遺伝子に存在 しうる変異部位などを含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、 及び (c) 工程 (b) の核酸断片について変異の存在を調べる工程を含む態様が挙げられる。 核酸 増幅法としては、 PCR法 (RT- PCR法を含む)、 NASBN (Nucleic acid sequence b ased ampl if ication)^ TMA (Transcription-mediated ampl if ication)fe SD A (Strand Displacement Ampl if ication)法などの通常行われる遺伝子増幅法が 含まれる。 増幅の対象となるのは、 目的に応じて適: 1¾択でき、 例えば、 増幅の 対象となる変異部位を含む領域としては、 本発明の IP- 10の遺伝子の塩基配列の うち、 機能活性低下の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず 、 例えば、 配列表の配列番号： 1に示される塩基配列の中の任意の位置の塩基を 含む領域が挙げられる。 上記工程 (c) においては、 当該分野で当業者に知られて いる変異の存在に検出方法の中から適切な方法を選んでそれを適用でき、 特には 限定されないが、 例えば ASPCR (allele- speci f ic PCR) 法により得られた DNA断 片長を調べることにより検出すること力くできる。 DNA断片長を調べる方法は、 特 に限定されるものではな ヽが、 例えば螢光 DNA シークェンサ一などを して行 うこと力できる。 本工程で使用される変異検出法としては、 例えば制限酵素断片 長多型 （restriction fragment length polymorphism: RFLP) を検出して調べる 方法などが挙げられる。 また、 変異の検出には、 例えば変異部位を含む適当な DN A片をプローブに用いるハイブリダィゼーシヨン法や、 SSCP法 （単鎖高次構造多 型） のような公知の変異検出法を ί®¾してよい。 本発明の遺伝子診断に従い、 本 発明の IP- 10 に関係した遺伝子診断が可能であり、 例えば 妊症、 着床障害など 、 胚仔と母体との間の相互作用に関連した抵抗性 ·感受性決定の一素因と考えら れる本発明の IP- 10 の発現や多型を遺伝子診断し、 さらに、 当言徽断結果に基づ き関連した障害や問題のリスクを下げるような遺伝子治療を行うことが可能とな る。 本明細書中で対象とする IP - 10及びそれに関連したタンパク質、 そのフラグメ ント、 さらには DMを含めた核酸 (mRNAゃォリゴヌクレオチドを含む） は、 それ らを あるいは有機的に使用し、 更には当該分野で広く知られた遺 fe^操作技 術 -抗体操作技術 (例えば、 アンチセンス法、 モノクローナル抗体を含めた抗体 、 トランスジェニク動物など） とも適 祖合わせて、 ゲノミックス及びプロテオ ミックス技術に応用できる。 例えば、 IP- 10変異体は、 ドミナントネガティブ効 果を利用した機能角科斤にも利用可能である。 また、 ^llRNA (dsRNA) を使用し ての RNAi (RNA interference) 技術への応用の途もある。 力、くして、 一塩基多型 (SNP; single nucleotide polymorph isms)を中心とした遺伝子多型解析、 核酸ァ レイ（DNAマイクロアレイを含む； Mark Shena (Ed. ), "Microarray Biochip Tech no logy", Eaton Publ ishing, March 2000)、 タンパク質アレイをィ麵した遺伝子 発現解析、 遺伝子機能麟斤、 関連遺伝子解析、 タンパク質間相互作用角？！斤、 関連 疾患麟斤、 疾患治療薬解析をすること力河能となる。
RNAi技術を利用する場合、 例えば siRNA (short interfering RNA) をデザイン してそれを導人して行うことをしてもよい。 siRNAをデザインする if^、 代表的 な:^、 対 ^¾伝子のスタートコドンから約 50〜100塩基下流、 例えば 75塩基以 上下流の領域に存在する Mで開始する 19塩基の領域を選択する。 好ましくは 5' - や 3' - UTRやスタートコドン近傍はそれを避ける力く、 によっては UTR領域を対 象とすることもできょう。 該選択領域の GC含量が約 30〜70%程度、 例えば約 45〜 55%禾 MSの領域を選択すること力く好ましい。 2 ¾¾(M)+19塩基 =21塩基の配列 、 例えば M(N19) (N は任意のヌクレオチド） を DNA データベース、 例えば" CBIな どで検索 （例えば、 BLASTサーチなど） してその特異性を確認する。選択した配 列をもつ合成 RNAにはその 3'端に dTdT (あるいは UU) 力付加されていてよい。 セ ンス配列の合成 RNA とそれに対応するアンチセンス配列の合成 RNAを用意し、 該 合成 RNA は、 dsRNA とされて、 細胞などに導入される。 dsRNA作製で使用される 典型的なァニ一リングバッファとしては、 例えば 100 mM KOAcと 2 mM MgOAcを含 有する 30 mM HEPES-KOH, H 7. 4液、 50 mM NaClと 1 EDTAを含有する 10 mM Tris, pH 7. 5〜8. 0液など力く挙げられる力く、 これに限定されるものではない。 ァ 二一リングの代表的な条件は、 95°C 2〜 3分間とした後 45〜60分間カヽけて 37〜25 °Cにまで徐々に冷却するといぅ処 件が挙げられる力 これに限定されるもの ではない。 形成された dsRNA は、 例えばフェノール Zク口口ホルム抽出一エタノ ール沈殿で回収できる。 siRNAを哺乳動物などの細胞に導入する方法としては当 該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うこと力でき、 例 えばリン酸カルシウム法 （例えば、 F. L. Graham et al. , Virology, 52 : 456, 1973など） 、 DEAE-デキストラン法 （例えば、 D. Warden et al. , J. Gen. Viro l.， 3 : 371， 1968など） 、 カチオン幽旨質複合体形成法などのリボソーム法、 ェ レクト口ポレーシヨン法 （例えば、 E. Neumann et al. , EMB0 J, 1 : 841, 1982 など） 、 マイクロインジェクション法、 biol isti c粒子導入法などが挙げられる 。 核酸導入法は、 トランスフエクションにより効率的に行い得るような技術的改 良が図られており、 それに適した市販のキットを用いて行うこと力くでき、 例えば Invi trogen社、 QIAGEN社などのキット製造業者あるいはキット販売業者により明 らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。 siRNA技林 Ϊについ ては、 例えば、 Blbashir et al. , ature, 411 : 494-498 (2001)； Blbashir et al. , Genes Dev. , 15 : 188-200 (2001)；多比良和誠編、 「実験医学別冊プロトコ ールシリーズ.遺ィ 5?の機能阻害実験法」 、 羊土社、 2001年などを参照すること 力できる。
また、 核酸アレイ技術では、 DNAマイクロアレイなどが利用される。 マイクロ 了レイの作製方法としては、 固相担体表面で直接ォリゴヌクレオチドを合成する 方法 （オン'チップ法） と、 予め調製したォリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ ォチドを固相担体表面に固定する方法と力く知られている。 この発明で使用するマ イクロアレイは、 この 、ずれの方法でも作製すること力くできる。 オン'チップ法 としては、 光照射で選択的に除去される保護基の翻と、 半 本製造に利用され るフォトリソグラフィ一技術および固相合！ ¾s術とを組み合わせて、 微少なマト リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法 （マスキング技術：例えば、 Fo dor, S. P. A. Science 251 :767, 1991)等によって行うこと力くできる。 一方、 予め 調製したォリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する
： ¾には、 官能基を導人したォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを合成し
、 表面処理した固相担体表面にォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着 し、 結合させる （例えば、 Lamture, J. B. et al. Nucl. Acids Res. 22: 212
1-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22 : 5456-5465, 1994) 。 オリ ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、 的には、 表面処理した固相担体 にスぺーサ一ゃクロスリンカーを介して ¾ 結合させる。 ガラス表面にポリアク リルアミ ドゲルの微小片を整列させ、 そこに合成オリゴヌクレオチドを继結合 させる方法も知られている (Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:4913, 1996)。 また、 シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、 電§±にはストレプトアビジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし
、 この部位をブラスに荷電させることでビォチン化ォリゴヌクレオチドを固定し
、 部位の荷電を制御することで、 高速で厳密なノヽィブリダイゼ一ションを可能に する方法も知られている (Sosnowski, R. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 94: 1119- 1123， 1997)。 このように核酸アレイ技術では、 cDNAライブラリ一を ィ¾¾したり、 PCR技術で得た DNAを基 ¾±にスポッティング装置で高密度に配置 して、 ハイブリダィゼ一シヨンを利用して試料の角浙が行われる。 該アレイ化は
、 針あるいはピンを使用して、 あるいはインクジヱトプリンティング技術などで もって、 スライドガラス、 シリコン板、 プラスチックプレートなどの基板のそれ ぞれ固有の位置に DNA力《付着せしめられることによりそれを feすることができ る。該核酸ァレイ上でのハイブリダイゼ一ションの結果得られるシグナルを観察 してデータを取得する。 該シグナルは、 蟹光色素などの標識 （例えば、 Cy3, Cy5
， BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes (商品名)， Texas red (商品名） など） より 得られるものであってよい。 検知にはレーザースキャナ一などを利用することも でき、 得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンビ ュ一ターシステムで処理されてよい。 典型的なマイクロアレイを i^fflしての遺伝 子などの角科斤では、 例えば細胞などの謝から単離した mRNAを續として、 cDNA を合成し、 PCR増幅する。 その際に、 標識 dNTPを取り込ませて標識 cDNAとする。 この標識 cDNAをマクロアレイに接触させ、 マイクロアレイのキヤプチヤープロ一 ブ （ォリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド） にハイブリダイズした cDNAを 検出する。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレー トに分注して標識 cDNA水性液を、 マイクロアレイ上に点着することによつて実 施すること力できる。 点着の量は、 l〜100nl程度とすることができる。 ノ、イブ リダィゼーシヨンは、 室温〜 70°Cの温度範囲で、 6〜20時間の範囲で実施するこ とカ 子ましい。 ハイブリダィゼ一シヨン終了後、 界面活性剤と緩衝液との混合溶 液を用いて洗浄を行い、 未反応の標識 cDNAを除去する。 界面活性剤としては、 ド デシル硫酸ナトリウム （SDS) を用いること力 子ましい。 緩衝液としては、 クェ ン酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 トリス緩衝液、 グッド緩衝液等を用 いることができるが、 クェン酸緩衝液を用いること力好ましい。
また、 タンパク質アレイ技術では、 タグを付された組換え発現タンパク質産物 を利用してよく、 二次元電気泳動 (2- DE)、 酵素消化フラグメントを含めての質量 分析（MS) (これにはエレク トロスプレーイオンィ匕法（electrospray ionization: ESI), マトリックス支援レーザ一脱離イオンィ匕法 (matrix-assisted laser desor ption/ionization: MALDI)などの技術が含ま MALDI-T0F分析計、 ESI-3連四 重極分析計、 ESI-イオントラップ分析計などを使用してよい） 、 染色技術、 同位 籠識及び觸斤、 画像処理技術などが利用されること力くできる。 したがって、 本 発明には上記で得られるあるいは利用できる IP- 10及びそれに対する抗体などと 相関した胚仔と母体との間の相互作用に関連した機能解析に関連したソフトウェ ァ、 データベースなども含まれてよい。 本発明に従えば、 IP- 10遺伝子の発現を阻害することのできる- オリゴヌクレオチド (核酸) を、 クローン化したあるいは決定された IP - 10 をコ —ドする DNA の塩基配列'辭 gに基づき設計し、 合成して、 解明された IP- 10機能 を探査したり、 調節するのに使用しうる。 そうしたオリゴヌクレオチド （核酸） は、 IP - 10遺 の mRNAとハイブリダイズすること力くでき、 該 mRNAの機能を阻害 することができるか、 あるいは IP- 10関 iimRNAとの相互作用などを介して IP - 10 遺伝子の発現を調節 '制御すること力くできる。 またある齢には、 IP - 10発現制 御領域をコントロ一ルして、 IP- 10遺伝子の発現を調節 ·制御すること力くできる 。 IP- 10関連遺伝子の選択された配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及び IP - 1 0関舰好と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは 、 生体内及び生体外で IP- 10遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 ま たそれに関連した病気などの治療又は診断に有用である。 以上述べた、 本発明者らの研究)^により IP- 10の遺伝子及び組換え DNA を宿主に移人し、 IP- 10を発現させ、 目的とする IP- 10を得て、 それらを利用し て胚仔と母体との間の相互作用に関連した機能を研究 ·探査する方法か 共され る。 こうして本発明によれば、 該解明された機能に関連しての、 IP- 10の遺伝子 を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフヱクタント及びその製造法、 さ らにはその用途も 共される。
また、 本発明では、 胚仔と母体との間の相互作用に関連した現象や機能を研究
•探査するため、 IP- 10遺伝子、 それから誘導されたプローブを用い、 あるいは さらに必要に応じ、 IP-10に対する阻 ^質を用い、 被検試料中の IP - 10 あるい はその遺伝子、 さらには産生細胞を検知 ·分別 する優れた方法及びその為の キットを 共することにある。本発明はこうした IP-10あるいはその遺ィ 5?
、 さらには産生钿胞を検知 '分別 することのできる試薬キットのうちの各試 薬をすベてその 態様のうちに含むと理解される。 さらに本発明の目的は、上 記方法を用いて IP- 10あるいはその遺伝子、 さらには産生細胞を検知 ·分別 することにより、 細胞内タンパク質代謝、 ホルモン前駆体の活性化、 胚遊走活性 化作用、 胚の子宮壁への着床促進作用、不妊治療活性、 妊励率促進作用、 着床 期に胚を子宮に誘因する活性、 胚仔と母体との間の相互作用調整活性など、 さら にはそれらのプロセスに関与する因子や生理現象などをモニターし得る方法並び に ある ^は診断剤を iii共することができる。 したがって、 医学的 ·生理学的分野における上記 の各種利用、 胚仔と IP - 1 0 とのネ目互作用、 走活性化作用、 胚の子宮壁への着床促進作用、 不妊治療活 性、 妊励率促進作用、着床期に胚を子宮に誘因する活性、 胚仔と母体との間の 相互作用調整活性などに起因する応答 ·症状 ·疾患の研究 ·解析 ·測定、 診断、 予防、 治療などの目的で上記 を することは、 すべて本発明のその実施態 様のうちに含まれると理解される。
本発明で文像とする IP- 10及びその関連物質は、 着床期における胚と母体との 間において重要な働きを有する因子であると考えられる。 胚のシグナルに対して 母体が IP- 10 を適切な時期に鐘を分泌させ、 それによつて母体側の生理的、 免 疫的な応答 各が確立し、 その結果として妊娠 （着床） 力《進行し、 このシグナル に対する応答が不十分な には妊娠は Jteしない。 した力つて、 該タンパク質 は胚と母体との間のコミュニケ一シヨンに有用であると考えられる。 すなわち、
IP- 10、 変異体、 修飾体、 誘稱を含有する医薬を用いれば、 IP- 10 による活性 力く不充分であることに起因する不妊症患者を健常な状態にすることが可能である 。 本発明のポリペプチドは、 こうした問題の治療及び/又は予防剤などの医薬と して 用である。
例えば、 生体内において IP- 10力く減少あるいは欠損しているために、 細胞にお ける当該生物学的活性が十分に得られて 、ないか、 あるいは正常でない症状の患 者の; ti^には、 （A) 本発明のタンパク質等を該患者に投与することによる力、、 （B ) 本発明の DNAなどの核酸を該患者に投与して、 生体内で本発明のタンパク質等 を発現させることによるカヽ、 （C) 本発明の DNAなどの核酸を発現可能に導入した 細胞を該患者に移植することによって、 生体内に本発明の夕ンノ、°ク質等を補充す る等して、 該患者における当該症状を改善したりする。 つまり、 IP- 10産生を誘 起させることによって、 または IP- 10 を投与することによって妊娠率の向上をは かる。 本発明の IP- 10の生物学的活性などの機能の解明に基づいて、 該 IP-10 の機能 を促進する化合物 （ァゴ二スト、 あるいは促進剤） 又はその塩は、 IP- 10機能不 全による妊娠障害などの上記で指摘した生物活性に関連した症状などの各種の疾 病の治療及び Z又は予防剤として有用な (獣医薬を含む） として删できる 一方、 本発明の IP- 10の生物学的活性などの機能を阻害する化合物 （アンタゴ 二スト、 あるいは阻害剤） 又はその塩は、 過 IP- 10機能症、 妊娠制御などにおい て治療及び/又は予 l¾¾などの医薬として できる。
かくして、 本発明で明らかにされた IP- 10 の機能に着目して、 IP-10 などのポ リベプチド等は、 それの胚仔と母体との間の相互作用などに関連した生理現象を 促進する化合物 （ァゴ二スト） や阻害する化合物 （アンタゴニスト） 又はそれら の塩をスクリ一二ングするための «として有用である。 本発明は、 こうした生 理作用あるいは生物活性をを促進する化合物 （ァゴ二スト） や阻害する化合物 ( アンタゴニスト） 又はそれらの塩のスクリ一ニング方法を ifj共する。
該スクリーニングでは、 例えば (i) 本発明のタンパク質、 その一部のペプチド 又はそれらの塩 （該タンパク質を発現する形質転換体を含んでいてもよい、 以下 同様） などに胚を接触させた:^と、 （i i)本発明のタンパク質、 その一部のぺプ チド又はそれらの塩などに E¾び試験試料を接触させた: ^との比較を行う。 具 体的には、 上記スクリーニングでは、 当該生物学的活性 （例えば、 胚と子宮膜と の相互作用に関連した活性など） を測定して、 比較する。 スクリーニングでは、 胚に代えて、 適切な基質を使用することもでき、 該基質は、 そのまま使用しても よいが、 好ましくはフルォレツセインなどの堂光、 酵素や放射性物質で標識した ものを使用できる。 試験試料としては、 例えばタンパク質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 植物抽出物、 動物などの 織抽出物、 細胞抽出物などが挙 げられる。 試験試料に使用される試験化合物の例には、 好ましくは抗 IP- 10抗体 、 抗 CXCR3抗体、 抗 IFN-て抗体、 CXCR3 と IP- 10の結合阻害剤、 胚の着床に対す るインヒビタ一活性を有する化合物、 胚の着床に対する促進活性を有する化合物 、 特には合成化合物などを含んでいてよい。 これら化合物は、 新規な化合物であ つてもよいし、 公知の化合物であってもよい。 該スクリーニングは、 通常の結合 活性の測定法に準じて実施すること力《でき、 例えば当該分野で公知の方法などを 参考にして行うことができる。 また、 各種標識、 緩衝液系その 当な 等を ィ趟したり、 そこで説明した操作等に準じて行うこと力《できる。 使用ペプチドな どは、 活性化剤で処理したり、 その前駆体あるいは潜在型のものを活'醒のもの に予め変換しておくこともできる。 測定は通常トリス塩酸緩衝液、 リン酸塩緩衝 液などの反応に悪影響を与えないような緩衝液等の中で、 例えば、 pH約 4〜約 10 (好ましくは、 pH約 6〜約 8 ) において行うこと力くできる。 これら個々のスクリ 一二ングにあたっては、 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の 通常の技術的配慮を加えて、 本発明の IP- 10 あるいはそれと実質的に同等な活性 を有するポリぺプチドあるいはべプチドに関連した測定系を構築すればよレ こ れらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することがで きる 〔例えば、 ethods in Enzymology, Academi c Press社 （USA)発行） など参 照〕 。 本発明のスクリ一ニング方法又はスクリ一ニングキットを用いて得られる化合 物又はその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ぺプ チド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液などから遷ま'れた化合物であり、 本発明のタンパク質等の機能を促進あるし、 は阻害する化合物である。 該化合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容される 塩などが挙げられる。 例えば、 無機^ Sとの塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩 、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基 との塩の好適な例としては、 例えば、 ナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ 金属塩、 カノレシゥム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 並びにアル ミニゥム塩、 アンモニゥム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例とし ては、 例えば、 トリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6-ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N' - ジべンジルェチレンジ ァミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、 例えば、 塩 酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な 例としては、 例えば、 ギ 、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸 、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ豫、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸、 安息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例 としては、 例えば、 アルギニン、 リジ オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸 性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えば、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸 などとの塩が挙げられる。 本明細書中、 「抗体」 との用語は、 広義の意味で使用されるものであってよく 、 所望の IP- 10 ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体 の単一のものや各種ェピト一プに対する特異性を持つ抗体組成物であつてよく、 また 1価抗体または多価抗体並びにポリク口一ナル抗体及びモノク口一ナル抗体 を含むものであり、 さらに天然型（intact)分子並びにそれらのフラグメント及び 誘割本も表すものであり、 F(ab' ) 2, Fab' 及び Fab といったフラグメントを包含 し、 さらに少なくとも二つの抗原又はェピトープ （ep ope)結^^位を有するキ メラ抗体若しくは雑種抗体、 又は、 例えば、 クヮドローム (quadrome), トリオ一 ム（triome)などの二重特異' 組換え抗体、 種間雑種抗体、 抗イディォタイプ抗体 、 さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘缀本と考えられるも の、 公知の細胞融合又はハイプリ ドーマ技術や抗体工学を適用したり、 合成ある レ、は半合成技 ίポ ΐを使用して得られた抗体、 抗体生成の観点から公知である従来技 術を適用したり、 DNA組換え技術を用いて調製される抗体、 本明細書で記載する 標的抗原物質あるいは標的ェピト一プに関して中和特性を有したりする抗体又は 結合特性を有する抗体を包含していてよい。 特に好ましい本発明の抗体は、 天然 型の IP- 10 ポリべプチドを特異的に ftSiJできるものである。
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、 ±咅養中の一連のセルライ ンにより抗体好の産生をキ することのできる任意の方法を用いて産生される 。 修食 吾 「モノクロ一ナル」 とは、 実質上均質な抗体の集団から得られていると 、うその抗体の性格を示すものであつて、 何らかの特定の方法によりその抗体が 産生される必要があるとみなしてはならない。 個々のモノク口一ナル抗体は、 自 然に生ずるかもしれない変異体が僅力ヽな量だけ存在しているかもしれないという 以外は、 同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。 モノクローナル 抗体は、 高い特異性を持ち、 それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられ ているものである。 異なった 決定基 （ェピトープ） に対して向けられた種々 の抗体を典型的には含んでいる通常の （ポリクロ一ナル） 抗体調製物と対比する と、 それぞれのモノクロ一ナル抗体は当該抗原上の単一の ¾¾¾決 に対して向 けられているものである。 その特異性に加えて、 モノクローナル抗体は、 ノ、イブ リ ドーマ培養により合成され、 他のィムノグロブリン類の雄がないあるいは少 なレ、点でも優れて 、る。 モノクロ一ナル抗体は、 ハイブリッド抗体及びリコンビ ナント抗体を含むものである。 それらは、 所望の生物活性を示す限り、 その由来 やィムノグロブリンクラスゃサブクラスの @g!Jに関わりなく、 可変^!域ドメィン を定常領域ドメインで置き換えたり （例えば、 ヒト化抗体） 、 あるいは軽鎖を重 鎖で置き換えたり、 ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、 あるいはへ テロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ること力くできる （例えば、 米国特許第 4816567号； Monoclonal Antibody Production Techniques and Appl i cat ions, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987 など） 。 モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、 ハイプリ ドーマ法 (G. K ohler and C. Mi lstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)) ; ヒト B細胞ハイブ リ ドーマ法 (Kozbor et al. , Immunology Today, 4， pp. 72-79 (1983) ; ozbor,
J. Immunol. , 133， pp. 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody P roduction Techniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , Ne w York (1987)；トリオ一マ法； EBV -ハイブリ ドーマ法 (Cole et al. , Monoclona 1 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96 (1985)) (ヒ トモノクローナル抗体を産生するための方法）;米国特許第 4946778号（単鎖抗体 の産生のための技術） が挙げられる他、 抗体に関して以下の文献が挙げられる： S. Biocca et al. , EMBO J， 9, pp. 101-108 (1990)； R. E. Bird et al. , Scienc e, 242, pp. 423-426 (1988)； M. A. Boss et al.， Nucl. Acids Res. , 12， pp. 37 91-3806 (1984)； J. Bukovsky et al. , Hybrid隱, 6, pp. 219-228 (1987)； M. DAIN0 et al. , Anal. Biochem. , 166, pp. 223-229 (1987)； J. S. Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， pp. 5879-5883 (1988)； P. T. Jones et al. ， ature, 321, pp. 522-525 (1986)； J. J. La曜 ne et al. (ed. ), "Methods in
Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I： Hybridoma Tec hnology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986)； S. Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81， pp. 6851-6855 (1984)； V. T. Oi et al. , BioTechniques, 4, pp. 214-221 (1986) ; L. Riechmann et al. , Nature, 332 pp. 323-327 (1988)； A. Tramontano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6736-6740 (1986) ; C. Wood et al. , Nature, 314, pp. 446-4 49 (1985)； Nature, 314, pp. 452-454 (1985) あるいはそこで引用された文献 ( それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる
) o 本発明に係るモノクローナル抗体は、 それらカ所望の生物活性を示す琅り、 重 鎖及び/又は軽鎖の一部カ啭定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しく はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモ口一ガスである力く、 一方、 鎖の残部は、 別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属 する抗体の対応配列と同一又はホモ口一ガスである、 「キメラ」 抗体 （免疫グロ ブリン） を特に包含する （米国特許第 4816567号明細書； orrison et al. , Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 81 pp. 6851-6855 (1984)) 。
抗体は、 それをトリプシン、 、。ィン、 ぺプシンなどの酵素により処理して、 ^により還元して得られる Fab Fab' F(ab' ) 2 といった抗体フラグメントで あってもよい。
抗体は、 職 Dの任意の検定法、 例えば競合的結合検定、 直接及び間接サンドィ ツチ検定、 及び免疫沈 P斜食定に^ fflすること力くできる （Zola, Monoclonal Ant ib odies : A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. , 1987) 。 抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲ一卜するには、 当分野で知られ る任意の方法を使用することができ、 例えば、 David et al. , Biochemistry, 13 卷， 1014-1021 頁 (1974)； Pain et al, J. Immunol. Meth. , 40 : pp. 219-231 ( 1981) ;及び "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp. 138-163 (1990) により記 載の方法が挙げられる。 標識物を付与する抗体としては、 IgG画分、 更にはぺプ シン消ィ匕後還元して得られる特異的結 Fab'を用いること力できる。 これらの 齢の標識物の例としては、 下記するように酵素 (ペルォキシダ一ゼ、 アルカリ ホスファタ一ゼあるいはS-D-ガラクトシダーゼなど） 、 ィ匕学物質、 蛍光物質あ る 、は放射性同位元素などがある。 本発明で 検知.測定は、 ィムノ染色、 例えば糸職あるいは細胞染色、 免疫電 子顕微鏡解析、 ィムノアツセィ、 例えば競合型ィムノアッセィまたは非競合型ィ ムノアッセィで; ί亍うこと力くでき、 ラジオィムノアッセィ（RIA)、 堂光ィムノアツ セィ（FIA：)、 ルミネッセントィムノアッセィ（LIA：)、 ェンザィムィムノアッセィ (EIA)、 BLISA (enzyme l inked immunosorbent assay) などを用いること力くでき 、 B-F分離を行ってもよいし、 あるいは行わないでその測定を行うこと力くできる 。好ましくは RIA， EIA, FIA, LIAであり、 さらにサンドイッチ型アツセイカく挙げ られる。 サンドイッチ型アツセィには、 同時サンドイッチ型アツセィ、 フォヮ一 ド （forward)サンドィツチ型ァッセィあるいは逆サンドィツチ型ァッセィなどが 包含されてよい。
標識としては、 酵素、 酵素基質、 酵素インヒビター、 補欠^ ¾、 補酵素、 酵 素前駆体、 アポ酵素、 蛍光物質、 色素物質、 ィヒ学ルミネッセンス化合物、 発光物 質、 発色物質、 磁気物質、 金属粒子、 例えば金コロイドなど、 放射性物質などを 挙げることができる。 酵素としては、 素酵素、 還元酵素、 酸化酵素などの酸 ィ匕還元酵素、 例えばアミノ基、 カルボキシル基、 メチル基、 ァシル基、 リン酸基 などを転移するのを 某する転移酵素、 例えばエステル結合、 グリコシド結合、 エーテル結合、 ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、 リア一ゼ、 イソ メラ一ゼ、 リガ一ゼなどを挙げること力できる。酵素は複数の酵素を複合的に用 いて検知に利用することもできる。 例えは 素的サイクリングを利用することも できる。
酵素標識は、 ピオチン標識体と酵素標識アビジン （ストレプトアビジン） に置 き換えることも可能である。 標識は、 複数の異なった麵の標識を使用すること もできる。 こうした ± ^、 複数の測定を連続的に、 あるいは非違続的に、 そして 同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。
標識するには、 チオール基とマレイミ ド基の反応、 ピリジルジスルフィ ド基と チオール基の反応、 了ミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して亍ぅこと力で き、 公知の方法あるいは当該分野の当業者カ^^になしうる方法、 さらにはそれ らを修飾した方法の中から 選択して適用できる。
例えば、 本発明で IP- 10などの測定系としては、 例えば組織に対しては免;^ 色、 免疫電子顕微鏡などの蛋白測定系、 in si tu hybridizationなどの発現遺伝 子測定系力く、 紙織抽出物に対しては EIA， RIA, FIA, LI A, ウェスタンプロッティ ングなどの蛋白測定系、 ノーザンブロッテイング、 サザンブロッテイング、 ドッ トブロッ ト、 RNase プロテクションアツセィ、 RT- PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). Real-Time PCR、 競合 PCRなどの発現遺伝子測定 系カ そして血中、 体液などに対しては EIA， RIA, FIA, LIA, ウェスタンブロッ ティングといった蛋白測定系力有利に利用できる。 EIA の測定系において、 例え ば競合法では、 抗 IP- 10抗体を固相化抗体として使用し、 標識抗原及び非標識抗 原 （抗原としては、 IP- 10あるいはそのフラグメントぺプチドなどが挙げられる ) を使用するし、 また非競合法で、 例えばサンドイッチ法では、 固相化抗 IP- 10 抗体や標識抗 IP- 10抗体を利用できる他、 抗 IP- 10抗体を直接標識したり、 固相 ィ匕せずに、 抗 IP - 10抗体に対する抗体を標識したり、 固相ィ匕して行うこともでき る。 感度増幅法としては、 例えば、 非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、 高 分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの （Envision を応用したもの； Enhanced polymer one-step staining (EPOS))が挙げられ、 非酵素標識二次抗体 との組合せでは、 例えば PAP (peroxidase- ant i peroxidase)法などの酵素と抗酵 素抗体複合体の組合せ、 ABC (avi din- bio tin complex) 法などのピオチン標識二 次抗体とピオチン標識酵素一アビジン複合体の組合せ、 SABC (streptavidin-bio tinylated peroxidase complex) 法、 LSAB (labeled str^ptavidin- biotin)法な どのピオチン標 次抗体とピオチン標識酵素ーストレプトアビジン複合体の組 合せ、 CSA (catalyzed signal ampl if ication)法などの SABCとピオチン標識タイ ラマイドと酵素標識ストレプトァビジンの組合せ、 高 ^ポリマ一で二次抗体と 酵素を標識してあるものなどが挙げられる。 これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析 . 法を本発明の測定方法 に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞ れの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、 本 発明の当 象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した 測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、 成書などを参照すること 力くできる 〔例えば、 入江 寛編， 「ラジオィムノアツセィ」 ， 講談社， 昭禾ロ 49年 発行；入江 寛編， 「続ラジオイムノアツセィ」 ， 講談社， 昭和 54年発行；石川 栄治ら編， 「酵素免疫測定法」 ， 医学書院， 昭和 53年発行；石川栄治ら鼴 「酵 素免疫測定法」 （第 2版）， 医特院， 昭和 57年発行；石川栄治ら鼴 「酵素免 疫測定法」 （第 3版）， 医 書院， 昭和 62年発行； H. V. Vunakis et al. (ed. ) ， "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in
Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Pres s， New York (1981)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymology",
Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C)， Academic Press, New York ( 1981)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Iran 細 chemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vo 1. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and Gene ral Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniq ues, Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic P ress, New York (1986)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymolog y", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Pre ss, New York (1989)； . Wi lchek et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", V ol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990) ； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular De sign and Model ing: Concepts and Appl ications, Part B: Anibodies and Anti gens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New Yo rk (1991) などあるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを 参照することにより本明細書の開示に含められる）〕 。 本発明の活性]^ 〔例えば、 (a) IP- 10 ポリぺプチド、 その一部のぺプチドま たはそれらの塩、 それに関連するペプチド等、 (b) 該 IP- 10 あるいは IP- 10 ポリ ペプチドをコードする DNAなどの核酸等、 （c) 本発明で対象とする抗体、 その一 部断片 (モノクローナル抗体を包含する) またはその誘 本、 (d) IP- 10 による 胚と母体との間の着床などの相互作用を促:！ ¾ぴゾ又は活性化するなどの現象あ る 、はそれに関連した紙熾あるいはタンパク質の変質 ·過剰生産ある 、は分角親 象といつた生物学的活性を促級び Z又は活性化する化合物またはその塩、 IP - 1 0産生を制御する化合物またはその塩、 あるいは IP-10 による胚と母体との間の 着床などの相互作用を抑制及び Z又は阻害するなどの現象あるいはそれに関連し た糸且織あるいはタンパク質の変質 ·過剰生産あるいは分角親象といった生物学的 活性を抑制及び/又は阻害する化合物またはその塩、 (e) 本発明で対象とする DN Aなどの核酸に対するアンチセンス 'オリゴヌクレオチドなど、 (f) 本発明を使 用して見出された活性物質など〕 を医薬として用いる:^、 例えば胚と母体との 間の相互作用促進剤またはそれらの塩等は、 通常壊虫或いは薬理的に許容される 各薩剤補助剤と混合して、 医薬組成物又は医薬調製物などとして投与すること 力くできる。 好ましくは、 経口投与、 局所投与、 または非経口投与等の使用に適し た製剤調製物の形態で投与され、 目的に応じていずれの投与形態 （吸入法、 ある いは直腸投与も包含される） によってもよい。
また、 本発明の活'誠分は、 ホルモン作用剤、 ビタミン剤、 サイトカイン類、 インターフェロン類、 その他の生理活性物質及び Z又は免疫調 ¾ ^と配合して使 用することもでき、 それらは、 有利な働きを持つものであれば制限なく^ fflでき 、 例えば当該分野で知られたものの中から選択することができる。 そして、 非経口的な投与形態としては、局所、 経皮、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内もしくは駟空内投与を包含し得るが、 患部への直接投与も可能であり、 また ある: t ^には好適でもある。好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、 あるい は非経口的 （例、 細胞内、 組織内、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 劂空内、 胸腔 内、 脊髄腔内、 点滴法、 翻昜、 経劃募、 点耳、 点眼や点鼻、 歯、 皮膚や粘膜への 塗布など） に投与することができる。 具体的な製剤調製物の形態としては、 赚 製剤、 分散製剤、 半固形製剤、 粉粒体製剤、 成型製剤、 浸出製剤などが挙げられ 、 例えば、 錠剤、被覆錠剤、 糖衣を施した剤、 丸剤、 トローチ剤、 硬カプセル剤
、軟カプセル剤、 マイクロカプセル剤、 剤、 粉末剤、散剤、 顆粒剤、細粒剤 、 ί¾寸剤、 液剤、 エリキシル剤、 ェマルジヨン剤、 灌注剤、 シロップ剤、 水剤、 乳剤、 懸濁剤、 リニメント剤、 ローション剤、 エアゾール剤、 スプレー剤、 吸人 剤、 噴霧剤、 軟膏製剤、 硬膏製剤、 貼付剤、 パスタ斉 ϋ、 パップ剤、 クリーム剤、 油剤、 坐剤 （例えば、 劇昜 ij) 、 チンキ剤、 皮膚用水剤、 点眼剤、 点鼻剤、 点 耳剤、 塗布剤、輸液剤、 測用液剤などのための粉末剤、 凍結乾 剤、 ゲル調 製品等が挙げられる。
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化すること力できる。例えば、 適宜 必要に応じて、生理学的に認められる担体、 医薬として許容される担体、 アジュ バント剤、 貝離剤、 補形剤、 希釈剤、 香味剤、 香料、 甘味剤、 べヒクル、 防腐剤 、 安定化剤、 結合剤、 p H調節剤、 緩衝剤、 界面活性剤、 基剤、 溶剤、 充塡剤、 増量剤、 溶觸甫助剤、 可溶化剤、 等張化剤、 乳化剤、 懸濁化剤、 分散剤、 増粘剤 、 ゲル化剤、 硬化剤、 吸収剤、 粘着剤、弾性剤、 可塑剤、 崩壊剤、 噴射剤、 保存 剤、 抗酸化剤、遮光剤、 保湿剤、緩和剤、 帯電防止剤、 無痛化剤などを網虫もし くは組合わせて用い、 それとともに本発明のタンパク質等を混和することによつ て、 一般に認められた製剤実施に要求される単位用 β態にして製造することが できる。
非経口的使用に適した製剤としては、 活'賊分と、 水もしくはそれ以外の薬学 的に許容し得る媒体との無菌性溜夜、 または懸濁液剤など、 例えば ί¾寸剤等が挙 げられる。一般的には、水、 ^JK, デキストロース水激夜、 その他関連した糖 の謙、 ェタノ一ノレ、 プロピレングリコーノレ、 ポリエチレングリコールなどのグ リコール類が好ましい測剤用液体担体として挙げられる。測剤を調製する際 は、 蒸留水、 リンゲル液、生理 液のような担体、適当な分散化剤または湿ィ匕 剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、 溜夜、 懸濁液、 エマ ルジョンのごとき ¾寸しうる形に調製する。 ポリエチレングリコール.（PEG)は、 哺乳動物中で極めて毒性が低いことから、 それを結合させることは特に有用である。 また、 PEGを結合せしめると、 異種性 ィ匕合物の免 び抗原性を効果的に減少せしめることができる ± がある。 該化合物は、 マイクロ力プセノ ^置の中に入れて与えてもよい。 PEGのようなポ リマーは、 ァミノ末端のァミノ酸の アミノ基、 リジン側鎖の ε -アミノ基、 ァスパラギン酸又はグルタミン酸側鎖の力ルボキシノレ基、 力ルボキシ末端の了ミ ノ酸の -カルボキシル基、 又はある種のァスパラギン、 セリン又はトレォニン 残基に付着したグリコシノ 141の活性化された誘 本に、 簡便に付着させることが できる。
タンパク質との直接的な反応に適した多くの活性化された形態の PEG力く知られ ている。 タンパク質のァミノ基と反応させるのに有用な PEG としては、 カル ボン酸、 カルボネート誘 本の活性エステル、 特に、 脱離基が N-ヒドロキシスク シンィミ ド、 p-ニトロフヱノ一ル、 ィミダゾ一ル、 又は 1-ヒドロキシ- 2 -二ト口 ベンゼン- 4-スルフォネ一トであるもの力く挙げられる。 同様に、 アミノヒドラジ ン又はヒドラジド基を含有する PEG は、 タンパク質中の過ヨウ素酸酸化によ つて生成したアルデヒドとの反応に有用である。 さらに、 本発明の DNAなどの核酸を上記したような治療及び/又は予防剤とし て用いる: if^、 該核酸はそれを期虫で用いることもできるし、 あるいは上記した ような遺伝 ¾且換え技術で使用される適当なベクタ一、 例えばレトロウイルス由 来べクタ一などゥィルス由来のべク夕一などに結合させるなどして用いることが できる。 本発明の DNAなどの核酸は通常の知られた方法で投与でき、 そのままで 、 あるいは、 例えば細胞内への嫩が促進されるように、 適当な補助剤あるいは 生理的に許容される担体などと共に、 製剤化されて用いること力でき、 上記した ような、 医薬組成物又は醒調製物などとして投与すること力くできる。 また遺伝 子治療として知られた方法を適用することもできる。
本発明の活 'ί铺分は、 その投与量を広範囲にわたつて選択して投与できるが、 その投与 4¾び投与回数などは、 処置患者の f4¾U、 年齢、 体重、 一般的健康状態 、 食事、 投与時間、 投与方法、 ぉ隨速度、 薬物の組み合わせ、 患者のその時に治 療を行なつている病状の禾 ¾gに応じ、 それらあるいはその他の要因を考慮して決 められる。 医薬品製造にあたっては、 その添加剤等や調製法などは、 例えば日本薬局方解 説書編集委員会編、 第十四改正 日本薬局方解説書、平成 13年 6月 27日発行、 株 式会社廣川書店；一番ケ瀬 尚 他編 医薬品の開発 12巻（製剤素剤 〔I〕 ） 、 平成 2年 10月 15日発行、株式会擴川書店；同、 医薬品の開発 12巻 （製剤素材 〔 I I〕 )平成 2年 10月 28日発行、 株式会ネ谓川書店などの記載を参考にしてそれら のうちから必要に応じて ¾選択して適用することができる。
本発明の活'賊分は、典型的には、 胚と母体との相互作用を促進あるいは活性 ィ匕するといつた生物学的活性をもつものであれば特に限定されないが、好ましく は有利な作用を持つもの；^挙げられる。本発明の活性成分は、 例えば、 （a) IP- 1 0、 その変異体ポリペプチド、 その一部のペプチドまたはそれらの塩等、 (b) 該 IP- 10をコ一ドする DNA、 IP- 10変異体ポリべプチドをコ一ドする DNAなどの核 酸等、 （c)本発明の抗体、 その一部断片（モノクロ一ナル抗体を包含する） また はその誘 本、 (d) IP- 10 による、胚遊走活性化、 胚の子宮壁への着床促進、 不 妊治療、 妊 率促進、着床期に胚を子宮に誘因する活性、胚仔と母体との間の 相互作用調整活性などの活性のうちの少なくとも一つあるいはそれ以上を有する といつた有利な作用をもつ化合物またはその塩などが包含される。
本発明の活 分は、 例えば胚遊走活性化、 S丕の子宮壁への着床促進、 不妊 治療、 妊^ ί率促進、 着床期に胚を子宮に誘因する活性、 S丕仔と母体との間の相 互作用調整活性などの生物活性を利用した薬物並びにそれを用 、た予防あるいは 治療法に有用と期待される。
本発明では、 「遺伝 且換え技術」 を利用して所定の核酸を単離 .配列決定し たり、 組換え体を作製したり、 所定のペプチドを得ることができる。本明細書中 使用できる遺伝 ¾S換え技術としては、 当該分野で知られたもの力挙げられ、 例 えば J. Sambrook, E. F. Fri tsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Lab oratory Manual", (2nd edi tion, 1989 & 3rd edi tion, 2001), Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; D. M. Glover et al. ed. , 'DNA Cloning", 2nd ed.， Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Serie s), IRL Press, Oxford Universi ty Press (1995)； "Methods in Enzymology" シリーズ， Academic Press, New York、 例えば R. Wu ed.， ibid. , Vol. 68 (Re comb i nan t匪)， (1980)； R. 衡 et al. ed. , ibid. , Vol. 100 (Recombinant D NA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C)， (1983)； R. Wu et al. ed.， 丄 bid. , Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D)， 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F)， (1987) ; J. H. Mi ller ed.， ibid. , Vol. 2 04, (1991) ; R. Wu ed. , ibid. , Vol. 216 (Recombinant DNA, Part G), (1992) ； R. Wu ed. , ibid. , Vol. 217 (Recombinant DNA, Part H) & 218 (Recombinan t DNA, Part I), (1993)； J. L. Campbel l ed. , ibid. , Vol. 262 (DNA Repl ica tion), (1995)； P. M. Conn ed.， ibid. , Vol. 302 (Green Fluorescent Protei n), (1999)； S. Weiss醒 ed.， ibid. , Vol. 303 (cDNA Preparation and Chara cterization), (1999) ; J. C. Glorioso et al. ed. , ibid. , Vol. 306 (Expres si on of Recombinant Genes in Eukaryotic Systems), (1999)； . Ian Phi l l ip s ed. , ibid. , Vol. 313 (Ant i sense Technology, Part A: General Methods, M ethods of Del ivery and RNA Studies) & 314 (Ant i sense Technology, Part B:
Appl ications), (1999) ; J. Thorner et al. ed.， ibid. , Vol. 326 (Appl icat ions of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part A: Gene Expression and Protein Purif ication), 327 (Appl ications of Chimeric Genes and Hybrid Pr oteins, Part B: Cel l Biology and Physiology) k 328 (Appl ications of Chim eric Genes and Hybrid Proteins, Part C: Protein-Protein Interactions and
Genomi cs)， (2000)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法 あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる （それらの中にある 記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる） 。本発明の診断 方法等に使用可能な薬剤の調製は、 例えば A. Gennaro ed. , "Remington' s Pharm aceutical Sciences", 18th Edi tion, Mack Publ ishing Co. , East on, PA, 1990 等に、 好生物学的技術は、 例えば Ausubel, F. M. et al.， "Current Protocol s in Molecular Biology", John Wi ley & Sons, New York, N. Y, 1995等に記載 の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様 な方法や改変法により行うこと力くできる （それらの中にある記載はそれを参照す ることにより本明細書の開示に含められる） 。 明細書及び図面において、 用語は、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical No menclatureによる力、、 あるいは当該分野にお 、て慣用的に使用される用語の意味 に基づくものである。 難例
以下に歸包例を掲げ、 本発明を具体的に説明するが、 この実施例は単に本発明 の説明のため、 その具体的な態様の参考のために提供されて 、るものである。 こ れらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものである力、 本願 で開示する発明の範囲を限定したり、 あるいは制限することを表すものではない 本発明では、 本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解 されるべきである。
全ての実施例は、 他に詳細に記載するもの以外は、 標準的な技術を用いて実施 したもの、 又は することのできるものであり、 これは当業者にとり周知で慣 用的なものである。
なお、 以下の実施例において、 特に指摘が無い齢には、 具体的な操作並びに 処王!^件などは、 DNA クロ一ニングでは J. Sambrook, E. F. Fri tsch & T. Man iatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (2nd edi tion, 1989 & 3r d edi tion, 2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo r， New York及び D. M. Glover et al. ed.， "DNA Cloning", 2nd ed.， Vol. 1 to 4， (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford Universi ty Pre ss (1995) ； 特に PCR法では、 H. A. Erl ich ed.， PCR Technology, Stockton P ress, 1989 ； D. . Glover et al. ed. , "DNA Cloning", 2nd ed.， Vol. 1， (T he Practical Approach Series), IRL Press, Oxford Universi ty Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed.， "PCR Protocols", Academic Press, New York ( 1990) に記載の方法に準じて行っているし、 また市販の あるいはキットを用 いている: ^はそれらに添付の指示書 (protocols) や添付の薬品等を使用してい る。 実施例 1
〔動物及び組織調製〕
US Meat Animal Research Center, Clay Center, NE (米国） において維持さ れてきたホワイト ·フヱ一ス雑種雌ヒッジを用い、 羊についての実験プロトコル は USDAの 「実験動物 （使用）委員会」 により承認されている手法に従った。
Imakawa K. et al. , Bndocr. J. , 45 : 441-450 (1998) に記載のようにして、 動物の飼育及び発情の同期化を行った。発情周期の 15日目 （n=9)のヒッジからの 子宮、及び妊娠 14日目 （n=3)、 17日目 （n=9)、 20日目 （n=3)、 25日目 （n=3)、 そ して 30日目 （n=3)のヒッジからの子宮を、 屠殺後に直ちに取り出した。発情周期 の 15日目のヒッジ及び妊娠 17日目のヒッジからのそれぞれの三つの子宫にっき、 Imakawa K. et al. , Endocr. J. , 45 : 441-450 (1998) に記載のようにして、 全 子宫を固定化処理に付し、 そして in si tuノ、イブリダィゼーシヨン用にさらに発 情周期の 15日目のヒッジ及び妊娠 17日目のヒッジからの三つの子宮全体を直ちに 凍結した。妊娠した残りのヒッジ （調査の各日あたり IF3 ) 力、ら集められた子宮 内膜組織及び胚仔（コンセプタス又は受胎産物：胚並びに Ml莫を指す）組織につ いて凍結し、 一 70°Cで保存した。 これら凍結された組織は RNA抽出処理に付され た。東京大学農場で三頭の ffi周期雌ヒッジから全血を集め、 それから末梢血多 核細胞 (PBMC)を得た。 これらの試料は、 IFN類 に対する応答性ゃケモタキシス ァッセィに翻された。 さらに 3頭の発情周期の雌ヒッジから全子宮を摘出し、 子宮内^ 1)†を IP - 10産生に対する IFNの朿 カ果を調べるために培養した。 羊の籠法は、 東京大学の 「実験動物 （使用）委員会」 により承認されている。 Aida H. et al. , J Peprod Dev. , 45 :249-257(1999) に従って動物の飼育及び発 情の同期化を行った。
[in vi tro 培養〕
Domenech A. et al. , J Gen Virol. , 81 : 109- 118(2000)に記載の方法を幾分か 改良した方法を使用して発情周期 15曰目のヒッジから初代単球並びにリン/ m 胞を単離した。 EDTA処理した血液 (80 ml)より密度勾酉 心法 (800 x g, 20°C , 30分間， OptiPrep™, Nycomed, Roski lde、 デンマーク） でもって PBMCを分 離し、 10% FCS, 40ュニット /ml のペニシリン， 40〃/ml のストレプトマイシン 及び抗胸臓市炎様微生物 (PPL0)剤（Invi trogen Corp. , Carlsbad, CAヽ 米国） を 添加した RPMI 1640' ±咅地の中に懸濁した。 3 X 107個/ ml になるようにして PBMC を 6-ゥエルのコ一スタープレート（3 ml/ゥヱル） に播種し、 37°Cで 5% C02- 95%空 ^囲気でもって 2時間培養した。非接着' 钿胞 （リンパ球細胞） カヽら 钿 胞 （TO細胞） を分離し、上記のように添加物を補ってある新鮮な RPMI 1640培 地中で培養した。 IP- 10発現に及ぼす 類の有効量を決定するため、 102, 103 又は 104 IU/ml の組換えヒト IFN - （rhIFN - ， シグマ， St. Louis，ミズリ一州 、 米国)， 組換えヒト IFN - y (rhIFN- r , Upstate biotechnology, Lake Placid 、 ニューヨーク州、米国）又は組換えゥシ IFN -て（rblFN-て， Katakura Industo ries Co. , Inc. ) でもって単球を処理した。 37°C 5% CO 2 - 95%空気条件下でもつ て 20時間維持した後、 ±咅養液を集めて、 一 70°Cで保存した。 一方、 細胞は直ぐさ ま全 RNA抽出のため処理された。加えて、 ヒッジの子宮の上皮钿胞及び間質細胞 (stroma cell) (Johnson G. A. et al. , Biol. Reprod. , 61 : 1324-1330 (1999) を 40ュニット /ml のペニシリン， 40 ///ml のストレプトマイシン及び 10% FCSを 添加したダルベッコズ改良イーグルズ培地（Dulbecco' s modif ied Eagle' s medi um; 丽 EM) 中で培養した （前記細胞は、 Dr. Bazer, Texas A腿よりの贈与物であ る） 。 発情周期 15日目のヒッジからの子宮内膜組織（おおよそ 600 mg湿 M*/培養皿 ) は、 40ュニッ卜/ ml のペニシリン及び 40 / g/mlのストレプトマイシンを添加し た DME謹 0 ml 中で培養し、 102 IU/ml の rh圆- a, rhIFN-ァ又は rblFN-ての何 れかにより処理した。 これらの IFN類の濃度は、上記の単球についての有効量に ついての実験により決められたものである。 37°C 5% C02含有空気条件下でもつ て 20時間維持した後、培養通び子宮内膜組織はそれぞれぞれ別々に?東結し、 そ の後のゥヱスターンブロット及びノーザンブロット分析のために一 70°Cで保存し ノ ο 〔ヒッジ IP- 10のクロ一ニング〕
妊娠 17日目のヒッジの子宮内膜 RNA及び発情周期 15曰目のヒッジの子宮内膜 RN Aを使用し、 Akopyants N. S. et al.， Proc Natl Acad Sci USA.， 95: 13108-131 13 (1998) に記載の方法に従って、 cDNAライブラリ一の構築並びにサブトラクシ ョン実験を遂亍した。 数多くの cDNAサブトラクション試験から、 ヒッジ IP- 10 を コードしている cDNA断片を同定し、 次に 5， -RACE, 3， RACE並びに完全長 PCR法 (K uraishi T. et al.， Biochem J. , 347 :579-583 (2000))を使用して完全長の IP - 1 0 cDNAを取得した。 完全長の IP-10 cDNAの PCR産物は、 ベクター pCRI I™ (Invi trogen) に組み込み、 Perkin- Elmerシークェンサ一(model ABI Prism 377 XL,口 ッシュ 'モレキュラー ' システムズ， Branchburg, 二ユージャ一ジ一州、 米国） を使用して自動配列解析にかけた。 ヒッジ IP- 10 cDNAの塩基配列は、 Genetyx so f tware program (Sof tware Development Co. , Ud、 東京、 日本） により角晰し
1
〔プロ一ブの作) び RT- PCRによる半定量角 I斤〕
ヒッジの IFN-て、 IP- 10及び G3PDH に対して特異的な cRNAプローブを調製する ため、 子宮内膜紙織 RNA又は胚仔紙織 RNA力、ら RT- PCRを使用してそれぞれの cDNA を調製した。 すなわち、 先ず全 RNA試料を SuperScriptl l™ (Invi trogen) 及び オリゴ- dTプライマ一 (20 β \ 反応液容量） でもって逆転写し、 表 1に示したプ ライマ一を して PCR により増幅せしめた。
表 1
Name Sequence Length (bp) oIP-10 Foward . 5 ' -C¾CSCqTCA^CTC gAGG -3 1 262
Reverse 5 ， -CCATTCC1TTTCAT GTGGC-3 '
oCXCR3 Foward 5 ' -GCATCAGCTTCGATCGGTAC-3 ' 283
Reverse 5 , -GATGCGGGCG AGCAATAGG- 3 '
οΙΕΝ-τ Fowawi 603
Reverse
Figure imgf000061_0001
oIFN-γ Po病 a 5 ' -CGATGAAM^eMmGCTCC 3 に 504
Reverse 5 ' -GATTACATTGA GCTCTCCG-3 '
oG3PDH Foward 5 1 -A GGG(5AAGGTGAAGGTCGG-3 ' 901
Reverse 5 , -AT<3 G<3GpCATGAGGTCCAC- 3 *
Foward 5 ' -ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG- 3 ' 149
Reverse 5 ' -A GTGG©CCATGAGGTGGAC-3 ' 表 1は、 PCR に使用されたプライマ一セットを示すもので、 表中 Name はブラ イマ一セッ卜で PCR増幅の対象とされた遺伝子の名称、 Sequenceは、 使用プライ マーの^ S配列、 Lengthは、 増幅対象遺伝子の鎖長をそれぞれ示している。
RT - PCRにより得られた断片のそれぞれは、 ベクタ一 pCRI I™にサブクロ一ニン グし、 次に自動配列解析に付した。 BLASTネットワークプログラム （National C enter for Biotechnology Informat ion, NIH, Bethesda, MD, USA)を鶴して酉己 列を比較したところ、 正しいヒッジの cDNAであることを示していた。 ノーザンブ ロット角斜斤のため、 DIG -標識 cRNAプローブを、 T7 RNAポリメラ一ゼ又は SP6 RNA ポリメラ一ゼを使用して上記 cDNA構築物から作成した (Kuraishi T. et al. ， Bio chem J. , 347 :579-583 (2000))。
オリゴヌクレオチドプライマー (表 1 ) を使用して PCR増幅して子宮の IFN-ァ mRNA及び CXCR3 mRNAの量を測定した。 IFN-ァ /G3PDH又は CXCR3/G3PDHに対す るブラィマー対を含有して 、るそれぞれの反応液に RT用铸型 (1〃 1)及び Ampl iTaq
Gold™ (1. 25ュニット； Roche Molecularf Systems) を添加し、 最終の容量を 25 1 にして反応を行つた。 それぞれの PCR産物を fi泉的に与えるようなプライ マー対の比率を決定した。 該比は、 IFN-ァ： G3PDHでは 6 : 1で、 CXCR3 :G3PDHでは 5 :2であった。 PCRの条件は、 次の通りであった： 最初に 95°Cで 11分間加熱し、 次に 95°Cで 1分間、 57°Cで 1分間、 そして 72°Cで 1分間のサイクルを 40サイクル を行った。 そして最後に 72°Cでの延長反応を 5分間行った。 PCR産物は、 Quant i ty one v3. 0 ソフトウエアを備えたイメージ角？ ί斤システム （ΤοΥοΒο、 大阪、 日本 ) を使用して定量した。
〔ノーザンブロット解析〕
幾つかの子宫内膜ゃ胚仔の組織や細胞からの全 RNAを Isogen (Ni pon Gene,東 京） を使用して単離した。 また、 PBMCから単離した全 RNAから poly(A)+RNAを 取得した （TaKaRa、 東京、 日本） 。 これらの RNAは 1. 0%ァガロース- ホルムアル デヒドゲル上の電気泳動により分離し、 ナイロン膜 (Biodyne-B ; Pal l, East Hi l is，二ュ一ヨーク州、 米国） に転写した。 該ナイロン膜を 65°Cで 1. 5時間、 5 X SSC, 50%ホルムアミ ド， 50 mM PBS, 7¾ SDS, 0. 1% N-ラウロイルザルコシン， 50 g/idサケ精子 DNA (ssDNA) 及び 2% ブロッキング試薬 (Roche Diagnosti cs, M annheim, ドィッ） を含有するハイブリダイゼーシヨ ンバッファ中でプレハイブリ ダイゼーションを行レ 次に cRNAプローブと一緒に新しいハイブリダイゼ一ショ ンノくッファ中で 63°Cで 12時間ハイブリダイゼ一ションを行つた。 ノ、ィブリダイゼ ーシヨン後、 該ナイロン膜を 2 X SSC-0. 1% SDSでもって 65°Cで 30分間洗浄処理 を一回 ί亍ぃ、 0. 1 X SSC-0. 1% SDSでもって 65°Cで 30分間洗浄処理を二回行って、 次に 37°Cで 1時間 RNase-A (20〃g/ml) と共にインキュベーションした。 該ナイ ロン膜を室温で 1時間 ブロッキングバッファ （1%ブロッキング 中でイン キュベ一シヨンし、 ついで抗 DIG抗体 （1 : 10， 000希釈、 Roche Diagnostics, Man nheim, ドイツ） を添加した。該ナイロン膜を 100 mMマレイン酸 (pH 7. 5)， 150 mM NaCl及び 0. 3% Tween 20 中で 10分間の洗浄処理を 3回行い、 最後に 100 mM Tris-HCl (pH 9. 5) 及び 100 mM NaCl 液中でリンスした。 CSPD (1 : 100希釈 ； oche Diagnostics, Mannheim, ドイツ） を含有する 100 mM Tris-HCl (pH 9. 5) 及び 100 mM NaCl 液中でケミルミネッセンス反応を実施し、 X線フィルムを露光 せしめて該ナイ口ン膜を角斜斤した。
〔in si tu ハイブリダィゼーション〕
in sUuハイブリダィゼーシヨンを、 公知の方法 (Kanai Y. et al. , J Cel l Biol. , 133 : 667-681 (1996))に少し改変を加えて行った。 すなわち、 切片 (10 n mM匕した凍結組織をシランコートされたスライド上にのせ、 PBS 中 4% 、。ラホル ムアルデヒドで固定化した。 スライド切片は順次 0. 2N HC1 及び Tris - HC1 (pH 7 . 6) 中の 20 g/ml proteinase K、 4%パラホルムアルデヒド、 そして 0. 2% グ リシンでもって前処理した。 次に切片は 50%ホルムアミ ド、 5 X SSC, 1 X Denha rdt' s, 100〃g/mlへパリン， 10 m DTT， 10%デキストランサルフェート， そして
0. 1 mg/mlの変成された tRNA及び ssDNAを含有しているプレハイブリダィゼ一シ ヨン液で処理し、 次に DIG標識されたアンチセンス及びセンス cRNAプローブとと もに 45°Cで 16時間ハイブリダイゼ一シ aンを行つた。 、ィブリダイゼーション後 、 42°Cで 20分間 4 X SSCでもって 1回洗い、 次に切片を 37°Cで 30分間 RNase- A ( 10 zg/ml) と共にインキュベーションし、 65°Cで 30分間 2 x SSCでもって 2回洗' い、 次に 65°Cで 30分間 0. 1 SSCでもって 2回洗った。 該スライドをブロッキン グ試薬 （Boehringer Mannheim)によりブロッキング処理し、 次にアルカリホスフ ァタ一ゼ標識化抗 DIG抗体 (Boehringer Mannheim) と共にィンキュベーシヨンし た。 5-ブロモ -4-ク口口- 3 -ィンドリルホスフヱ一ト及び二トロブル一テトラゾ リウム （Promega, Madison, WI、 米国） でもってシグナルを検出した。
〔組換えャギ IP- 10の発現及び精製〕
ヒッジ IP- 10 と同様のプライマ一セットを用いた RT- PCRにより、 ャギ IP-10 (c aprine IP-10 ; cIP-10) cDNAをャギの子宮内膜の RNA力、ら増幅した。 該 cDNAは、 プラスミ ド pSTBlue (商品名、 TaKaRa) にクロ一ニングせしめた。 成熟 cIP- 10の領 域をコードして 、る: ¾配列を PCR増幅せしめ、 発現べクタ一 pET-14b (商品名、 Novagen, Madison, WI、 米国） にクローニングせしめた（cIP - 10の N-末端側にヒ スチジンタグを有しており、 得られた発現べクタ一は、 pET- 14b- cIP- 10と呼称し た） 。該得られた発現ベクターでもって大腸菌 BL2;L- SI (Invi trogen)を形質転換 せしめ、 培菌麦菌体を収穫して、 50 mM NaH2P04, 500 mM NaCl及び 10 mMイミダ ゾ一ル (pH 7. 4)に懸濁し、 氷上で超音波による破砕処理を行った。遠心して細胞 破 ¾及び不溶性タンパク質を除去した後、 上澄液中の cIP- 10について SDS- PAGE で調べた。組換え cIP- 10はニッケルキレート化カラム (Hi- trap Chelating HP, A mersham Pharmacia Biotech)を使用したクロマトグラフィ一システム（AKTA, Ame rsham Pharmacia Biotech)により精製した。 ィミダゾ一ルグラジェント（20-500 mM) によりカラムからタンパク質を溶出せしめ、 PBS に対して透析処理し、 イミ ダゾールを除いた。 .
'、口ッ卜觸斤〕
子宮内膜細载をインビトロ培養した び組換え IP- 10 を産生せしめた後、 そ の培養液試料並びに透析されたタンパク ¾|斗をゥエスタンブロッ卜で分析して、 IP- 10カ雜する力、否を調べた。 該培養液試料（40 l)あるいは組換えタンパク 質試料 (50 ng/40 n \ 又は 200 ng/40 1)を SDS サンプルバッファ中で 5分間煮 沸処理し、 還 件下 15% SDS- PAGE ゲル上の電気泳動にかけ、 ニトロセル口— スメンブレン (Immunobi lon; Mi l l ipore, Bedford, MA，米国） に転写した。 該ニ トロセルロースメンブレンを室温で 1時間 Block Ace (大日本觀、 大阪） でも つてブロッキング処理し、 次に 4 °Cで 12時間ヒト IP - 10 に対するマウスモノクロ —ナル抗体 (Genzyme/Techne, Minneapol is, 謂、 米国） あるいはヒスチジンタグ に対するゥサギポリクロ一ナル抗体 (Sigma) と共にインキュベーションした。 ィ ンキュベ一シヨン後、 メンブレンを TBS- Tween 20液中で 3回 （それぞれ 10分間 ) 洗浄処理し、 室温で 1時間ホ一スラデイシュペルォキシダ一ゼで標識された口 バ抗マウスあるいは抗ゥサギ IgGと共にインキュベーションし、 次に TBS - Tween 20液中で 3回 （それぞれ 15分間） 洗浄処理した。 SuperSignal West Femto Maxim ■ Sensi tivi ty Substrateキット (Pierce, Pockford, IL, 米国) によりノ ンド を検出処理した。 〔免舰熾化学的分析〕
子宮内膜 織及び胚仔糸！ ϋの双方を含んでいるヒッジの子宮全体を 4%パラホ ルムアルデヒド中で固定ィ匕し、 パラフィンに包埋し、 6 ΐαの切片とした。 脱パ ラフィンィ匕した後、 切片は 0. 01 Μ クェン酸ナトリウム緩衝液 ( H 6. 0) に浸し 、 121 °Cで 15分間オートクレープ処理した。 切片を室温で 1時間 4. 5% H202のメ タノ一ル液中でィンキュベ一シヨンし、 湿度を高めたチャンバ一内で 1時間 Bio ck Aceと共にインキュベーションした。 次に、 一次抗体、 すなわち、 マウスの抗 ヒト IP - 10 モノクローナノレ抗体（l〃g/ml ; Genzyme/Techne) あるいはゥサギポリ クローナル抗ヒト IFN-ァ（500 ng/ml； Peprotech, London、 英国） と一緒に切片 を 4 °Cで一晚ィンキュベ一シヨンした。 本ィンキュベ一ション後、 切片を二次抗 体（Vectas tain ABC Ki t ; Vector Labs, Burl ingame, CA、 米国） でもって 1時 間処理し、 っ 、で室温で 30分間 PBS中でァビジン-ビォチンコンプレックスと一 緒にインキュベーションした。 Metal Enhanced DAB Substrateキット （Pierce) により切片に結合している抗体を可視化した。 等しい濃度の正常マウスあるいは ゥサギ IgGを 異的結合 （ネガティブコントロール） を 面するために同じ組 織のセミシリァノ 1/¾]片に使用した。 組織切片は次にへマトキシリンでカゥンター 染色せしめられた。
[in vi tro ケモタキシスアツセィ〕
96穴の修飾ボイデンチヤンバー（96 wel l-modi f i ed Boyden chamber ; NeuroP robe, Cabin John, MD、 米国） 内でポリビニルピロリ ドンを含まないポリカルボ ネ一ト製メンブレン (5 //mの孔径、 NeuroProbe) (これは、 使用前に 2時間 10 / g/mlゥシ血漿フイブロネクチンでコートせしめられた） を使用して PBMCの移動に ついて調べた。 アツセィは、 Gasperini S. et al. , J. Immunol. , 162 :4928-493 7(1999) に記載の方法にすこし改変を加えた方法で^ ffiした。 すなわち、 ケモタ キシス用チャンバ一のゥエルの下部に、 FCS を含まない DMEM、 糸且換え IP- 10(0. 2 〜500 ng/ml)を含有する同じ培地、 あるいは IFN -てで処理したあるいは処理して いない子宮内膜の培難の上清液を加えた。 該チャンバ一のゥエルの上部に、 FC Sを含まない DMEM中の PBMC(5 X 106 個/ ml)を添加した。 チャンバ一を 37°Cで 5% C 02含有空気雰囲気でもって 2時間培養した後、 メンブレンを取り除いて、 PBSで 洗い、 固定ィ匕した後、 Dif-Qui ckで染色した。 下側の層に移動した細胞の数をラ ンダムに選ばれた六つの high power f ields のもとで顕微鏡下にカウントした。 プロック実験としては、 IFN-てあるいは 5 ng/ml の組換え IP-10で刺激された 子宮内膜カヽら得られた上清液を 30〃g/mlの抗 IP- 10 IgGあるいはコントロールの マウス IgG とともにチャンバ一の ±1部に添加する前に 37°Cで 1時間プレインキ ュベーシヨンした。 それぞ 立に 3回アツセィを行った。
〔統計学的應
それぞれのデータポイントは互いに独立な 3つの試料を示し、 平均士 SEM とし て表した。 これらのデータは one- way AN0VA、 そして次に Duncan' s mul tiple r angeテストを して分析された。 加えて、 妊娠ヒッジカ'集められたノーザンブ ロットデータは最小二乗法を用いて回帰分析により分析された。 Pく 0. 05 の値 をもつ差異はすべて有意なものとした。
(IP-10 cDNAのクロ一ニング〕
妊娠 17日目に集められた子宮内膜紙織からヒッジ IP- 10 の cDNA断片を得て、 5' -RACE及び 3' - RACEにより完全長のヒッジ IP- 10 cDNAをクローニングした。 得ら れたヒッジ IP- 10 cDNAは、 102個のアミノ酸残基からなるオープンリ一ディング フレーム (0RF)を持っている 1172 bpを有しているものであつた。 図 1に、 クロ —二ングされて単離されたヒッジ IP- 10の塩基配列及びそれ力、ら推定される了ミ ノ酸配列を示す。 図 1において、 102個のアミノ酸に相当するオープンリーディ ングフレームを有する 1172 bpの cDNA配列 (GenBank™ Accession No. AB07071 7)が示されており、 該コードアミノ酸配列 （ヒッジ IP - 10 ; GenBank™ Accessio n No. BAB63958) のうち、 1〜9番目までのァミノ酸配列部分はシグナルぺプチ ドと推定される。
また、 cIP- 10 cDNA は、 ヒッジ IP- 10 cDNAカヽらデザインされたプライマーセッ トを した RT- PCRによりャギ子宫内膜 RNA力、らクローニングされた。 cIP- 10 c DNAは、 99番目の残基がヒッジ IP- 10のグルタミンからャギ IP- 10 のアルギニン になっていることを除いては同じ 102個のアミノ酸からなるものをコ一ドするも のであった。
各種の動物間でそのァミノ酸配列を比較麟斤した結果を図 2に示す。 4個のシ スティン残基は、 ケモカインファミリ一において保存され、 その最初の 2個のシ スティン残基は一個のァミノ酸残基により分けられて C- X-Cとなっている。 この システィンモチーフはヒッジ IP- 10 cDNA及びャギ IP- 10 cDNAから推定されるアミ ノ酸残基の中に見いだすことができる。 該 C - X - Cケモカイン類は該最初の 2個の システィン残基よりも前に位置するグルタミン-ロイシン-アルギニン（ELR) モ チ一フカ 在する力、否かにより二つのクラスに分けられている（Rol l ins B. J.， C hemokines, 90 : 909 - 928(1997)) 。 他の動物のものと同様にヒッジ IP - 10 は、 該 ELRモチーフを欠いており、 ヒト IP- 10 と高い類似性、 すなわちそれぞれヌクレ ォチド配列では 82. 7%及びァミノ酸配列では 75. 5¾の相同性を示している （表 2
) o
Figure imgf000067_0001
表 2中、 Ovine はヒッジ、 Caprine はャギ、 Human はヒト、 Mouse はマウスを 示し、 Amino Acidは、 アミノ酸配列について、 Nucleotide Sequnece は、 塩基配 列について、 それぞれその相同性 （同一性） の體を表す。 〔着床期における IP- 10， CXCR3, I FN- て及び IFN -ァ mRNAの発現の変動〕 妊娠 14日目、 17日目、 20日目、 25日目及び 30日目の子宮の IP- 10 mRNA*をノ一 ザンブロット角科斤により調べた （図 3 ) 。 図 3は、 ヒッジ子宮における IP - 10 mR NAの発現レベルを示すもので、 そこの図 3左側に妊娠している雌ヒッジ （3頭、 14, 17， 20, 25及び 30曰目） の子宮、 発情周期雌ヒッジ （15日目， n=3 ) の子宮 及び 17日目の胚仔 （Con)における IP-10 mRNAについての結果が示されている。 図 3左側には、 独立した 3つのブロットのうち一つを示してある。 図 3右側に示さ れたシグナルの比率 IP-10/G3PDH はすべてのノーザンブロット実験の結果より求 めたもので、 各棒線は平均値土 SEMを示してレヽる。 図 3右側における *は、 発情 周期 15日目の子宮についての値と比較しての統計的な違い (pく 0. 05)を表す。 IP- 1 0 mRNAと妊娠日についての回帰分析の結果は、 -51. 5X2 + 288. 2x - 131. 2 (R2 =0. 823, pく 0. 01) というものであった。
その結果はヒッジ IP- 10 cDNAクロ一ニングの結果と一致するもので、 妊娠して レ、る雌ヒッジの子宫内膜で IP-10 mRNAに対応する単一の転写産物 （おおよそのサ ィズ 1. 1 kb)を検出した。 IP-10 mRNAの発現は、 発情周期雌ヒッジと比べると妊 娠 14日目、 17日目、 20日目及び 25日目ではかなり高いものであった。 IP- 10 のレ セプタ一である子宮内膜 CXCR3 mRNAの発現は、 17日目及び 20日目の妊娠して 、る 雌ヒッジにおいてより高いものであった （図 4 ) 。 図 4は、 CXCR3 mRNAの発現レ ベルを示すもので、 そこの図 4左側に妊娠している雌ヒッジ （3頭、 14， 17, 20 ， 25及び 30日目） の子宮及び発情周期雌ヒッジ （15日目， ιι=3 ) の子宮における CXCR3 mRNAと G3PDH mRNAの半 的 PCRの結果を示す。 そこでは ¾ Ϊした 3つの 角？ ί斤のうち一つを示してある。 図 4右側は、 CXCR3 mRNAと G3PDH mRNAの半定量的 PCR産物についての濃度角科斤した結果が示され、 G3PDH mRNAに対する CXCR3 mRNA の量 (CXCR3 mRNA/G3PDH mRNA比） として示してある。 各棒線は平均値土 S層を 示している。 該図 4右側中の *は、 発情周期 15日目の子宮についての値と比較し ての編十的な違い (Pく 0. 05)を表す。 CXCR3 mRNAと妊娠日についての回帰分析の結 果は、 y=-8. 9 2 + 45. 8x + 61. 4 (Rz=0. 431, pく 0. 01)というものであった。 次に、 図 5に、 着床期の間のヒッジの胚仔と子宮における I FN-てと IFN- rの量 を調べた結果を示す。 図 5の左側 (A) には、 妊娠している雌ヒッジ （3頭、 14， 17及び 20日目） の胚仔における IFN -て mRNA についてのノーザンブロット角斜斤の 結果が示され、 右側 (B) には、 妊娠している雌ヒッジ （3頭、 14， 17， 20， 25及 び 30曰目） の子宮、 発 '清周期 ύ唯ヒッジ （15曰目， η=3 ) の子宮及び 17曰目の月丕仔 (Con) における IFN-ァ mRNAと G3PDH mRNAの半定量的 PCRの結果が示されており 、 そこには独立した 3つの解析のうち一つ力示してある。 図 5の右下側には、 IF N- r mRNAと G3PDH mRNAの半 的 PCR産物についての濃度角渐した結果が示さ れ、 そこでは G3PDH mRNAに対する IFN- y mRNAの量（IFN-ァ mRNA/G3PDH mRNA比 ) として示してある。 各棒線は平均値士 SEMを示している。 *は、 発情周期 15曰 目の子宮についての値と比較しての統計的な違い (Pく 0. 05)を表す。 IFN- r mRNA と妊娠日についての回帰分析の結果は、 y=- 10. 6x2 + 56. 6x + 81. 3 (R2二 0. 762， pく 0. 01) というものであった。
IFN -て mRNAの発現は、 胚仔中で検出され、 この発現のレベルは 14日目の胚仔 においてより高いものであった （図 5 A) 。 IFN -ァ mRNAの発現は、 妊娠してい る雌ヒッジ並びに発情周期の雌ヒッジの子宮内膜で検出され、 この発現のレベル は 14日目、 17日目、 20日目及び 25日目の妊娠している雌ヒッジにおいてより高い ものであった （図 5 B) 。
(IP-10及び IFN- rタンパク質の分布〕
IP- 10及び IFN-ァの細胞内の局在部位を調べるため、 発情周期 15日目の雌ヒッ ジ及び妊娠 17日目の雌ヒッジから調製された子宮及び胚仔組織切片にっ 、て免疫 組織化学解析を実施した （図 6 ) 。 図 6において、 発情周期 15日目の雌ヒッジ （ 左側 A-C) 及び妊娠 17日目の雌ヒッジ （右側 D-F) についてほぼ一連の切片とし て示してある。 写真 A及び Dは、 IP- 10について、 写真 B及び Eは、 IFN-ァにつ ヽて、 そして写真 C及び Fはコント口一ノレである。
IP - 10及び IFN- yの双方のタンパク質は、 胚仔及び妊娠している子宮の管^ 皮、 肚皮、 上皮下間質に局在していた。 発情周期中の雌ヒッジの子宮内膜にお I、ては検出された I FN -ァタンノ、°ク質の量は妊娠してレ、る雌ヒッジにおけると同様 であった （図 6 )。 IP- 10タンパク質は発情周期中の子宮内膜において見いださ れたが、 その染色の禾 は最小のものであった。
CIP-10 mRNAの分布〕
ヒッジ子宮内膜中の IP- 10 mRNAの細胞内の産生場所を決定するため、 発情周期 15日目の雌ヒッジ及び妊娠 17日目の雌ヒッジから調製された子宫糸職切片におけ る in si tuハイブリダィゼ一シヨンを行った （図 7 A ) 。 図 7において、 写真 a 及び b は、 妊娠 17日目の雌ヒッジ子宫内における IP-10 mRNAの局在を D IG標識ァ ンチセンス IP- 10 cRNAを用いて示し、 写真 c は、 妊娠 17日目の此佳ヒッジ子宮内に おける IP- 10 mRNAを DIG標識のセンス cRNAで角晰し、 写真 dは、 発情周期 日目 の雌ヒッジ子宮内における IP- 10 mRNAの局在を DIG標識アンチセンス IP- 10 cRNA で解析した。
妊娠している子宮の上皮下間質には IP- 10 mRNAが検出された力管腔上颇び腺 上皮には検出されなかつた。 より強度を高めて行つた場合には、 免; ¾細胞にもシ グナルが存在するように見えた。 発情周期の子宮では IP- 10 mRNAの発現は検出さ れなかった。 カロえて、 ノーザンブロット角斜斤を IP - 10 を発現している糸織及び Z 又は細胞のタイプを同定するために行った。 IP- 10 mRNAは単球細胞から抽出され た RNA に見出されたが、 リンパ球細胞、 上皮細胞や間質細胞からの RNAには見出 されなかった （図 7 B)。
〔IP - 10発現に及ぼす IFN-ての作用効果〕
IFN類につき、 単球細 S包における IP- 10 mRNA発現の誘導刺激に対するその活性 及び有効量を調べた。 雌ヒッジから単離された TO細胞を 102〜104 IU/ml の IF N - ， IFN -ァ又は IFN-ての存在下又は非 下に in vi troで 20時間培養した。 図 8に幾つかの IFN類が IP - 10 mRNAの量に対して及ぼす効果を調べた結果を示す 。 図 8 A には、 IFN類により朿 1獵された 細胞における IP- 10 mRNA発現につき その I FN添加量を変えて見たときの結果力《示されており、 そこでは独立した 3つ のノ一ザンブロット角斜斤結果のうちの一つが示してある。
IFN類はすべてヒッジ単球細胞にお 、て IP - 10 mRNAの発現を刺激できた力く、 そ の有効量はこれら IFN間で異なっていた （図 8 A)。 IFN-ては、 102 IU/ml の量で IP - 10 mRNAの発現を朿隨文し、 それは他の I FN類よりも有効性の高いものであつ 発情周期の状態の雌ヒッジで、 子宮内膜の IP- 10 mRNAの量が IFN類の影響を受 けて 、る力、否かを調べた。 発情周期 15日目の雌ヒッジから得られた子宮内膜の体 外移植片を 102 IU/ml の IFN- a, IFN-ァ、 あるいは I FN-ての存在下又は非 下に in vi troで 20時間培養した。 IFN朿隞された子宮内膜組織から抽出された 全 RNA にっき IP- 10 mRNAをノーザンブロット解析でもって調べた。 コント口一ノレ 並びに I FN- a朿 I撒あるいは I FNi朿隨文された試料でわずかながら I P-10 mRNAが検 出されたが、 IFN-てで刺激された後にお てのみ高 、レベルの IP - 10 mRNAが検知 された （図 8 B ) 。 また、 子宮内膜での IP- 10の産生は IFN-てにより朿纖を受け ていることがウェスタンブロット解析により示された （図 8 C )
図 8 B には、 発情周期の状態の雌ヒッジからの子宮内膜移ネ imこついて IFN類 が IP- 10 mRNAの量に及ぼす効果が示してある。 図 8 B の左側は、 102 IU/mlの IFN- a IFN-ァ、 あるいは IFN-てで刺激した時の子宮内膜移植片での IP- 10 mRNAにつ いてのノ一ザンブロット解析の結果を示し、 そこでは独立した 3つのノ一ザンブ ロット角斜斤結果のうちの一つが示してある。 図 8 Bの右側には、 IP-10 mRNA及び G3PDH m Aにつ 、てのノーザンプロットを濃度角？!斤した結果が示してあり、 シグ ナルの比率 IP- 10/G3PDH はすべてのノーザンブロット実験の結果より求めた。 各 棒線は平均値土 SEMを示している。 *は、 IFNを添加しないで培養した移植片に ついての値と比較しての統計的な差異 (Pく 0. 05) を表す。 また、 図 8 C には、 IF N類により朿隞された子宮内膜移ネ 1^の培養培地中のタンパク質につきウェス夕 ンブロット解 i斤した結果が示されている。
CPBMCの移動に及ぼす IP- 10の作用効果〕
組換えャギ IP - 10(rcIP- 10)及び子宮内膜で誘導 ·分泌された IP - 10力《生物学的 に活性を持つものであるの力、否かを確認するため、 in vi tro ケモタキシスアツ セィをして PBMCに対する走化性、 遊走性を rcIP - 10や I FN-てで刺激された子宮内 膜より分泌された分泌物力く持っている力、否かを調べた。 組換え cIP- 10を二ッゲル キーレティング カラムを用いて精製し、 IP- 10及びヒスチジンタグに対する 抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した （図 9 A) o PBMCに IP- 10受容 体 CXCR3の mRNA力く存在することを確認した （図 9 B ： レーン Tは全 RNA 10〃g、 レーン M は poly(A)+ RNA 2 を示す） 。 ケモタキシスアツセィの結果、 PB C は 0. 2〜5ng/mlの rcIP- 10 に応答していた力、 その反応はより高濃度の rcIP- 10 においては減少した。 その結果、 特徴的なベノ^状の用量応答曲線 （図 9 C) と なった。 IFN-てで刺激された子宮内膜紙熾培養物からの培地は PBMCに対し顕著な ケモタクティック活性を示したが、 一方非処理の子宮内膜から得られた ±咅養液で は効果はなかった （図 9 C) 。 各棒線は平均土 SEM、 *は IFN-て非処理子宮内膜 ±咅養培地での PBMC移動からの値 (Pく 0. 05) であり、 * *は rcIP- 10不存在におけ る PBMC移動からの値 (Pく 0. 05) を示す。 免疫中和試験の結果、 抗 IP- 10抗体は rc IP - 10及び IFN-てで刺激された子宮内膜からの培養液のケモタクティック活性を 60〜70%を減少せしめ、 これは IFN-てで刺激された子宮内膜からの培養液により 示されるケモタクティック活性は主に IP- 10 によるものであることを示している (図 9 D) 。 各棒線は平均土 SEM、 *は P<0. 05での抗 IP - 10抗体非 下にお ける I FN -て処理子宮内膜培養培地における PBMCの移動値であり、 * *は Pく 0. 05 における抗 IFN- τ非存在下における IP- 10 による PBMCの移動値を示す。
本発明により、 ヒッジ IP- 10 は、 妊 tl?宫内に存在し、 発情周期の子宮にはほ とんど存在していないことが明らかにされた。 IP- 10 は、 C- X-C型ケモカインの 一員に属するものである。 このケモカインファミリ一は、 IP- 10 のレセプタ一で ある CXCR3及び 又は白血球のサブセッ卜に対するケモタクティック活性を介し て様々な炎症反応や免; ^答を制御している （Farber J. M. et al. , J Leukoc B iol.， 61 :246-257 (1997))。 さらに、 本発明は I FN -ての存在下において子宮内膜 ±咅養培地は IP- 10 を含有していること、 これら培地の上清は PBMCの移動を誘導す ること、 また抗 IP- 10抗体によってその活性が 70%まで阻害されたという事実に 基づいている。 本発明では、 聯を使用した用量に対する応答試験により、 IFN - a， IFN- γ及 び IFN-て 、 IP- 10 mRNAの発現を刺激すること力できることを示した力、 また、 該活性に及ぼす有効量は I FN類の間で異なつていることを示すことにも成功して いる。 IFN -ては、 102 lU/ml の量で ¾で IP - 10の発現を効果的に刺激すること 力《できる力 \ 一方、 rhlFN- yはそれと同じ用量では有効ではなかった。 rhIFN-ァ による IP - 10 mRNAの発現刺激が低レ、のが、 IFN- γ力く他の IFN類と比較して高度に 種特異性を持っている （Pestka S. et al. , Ann. Rev. Biochem. , 56:727-777 ( 1987))ということによる力、否かは明らかにされてはいない。 し力、しな力 ら、 高用 量の rhIFN- r GO4 IU/ml)は単球で IP - 10 mRNAの発現を朿 lj激することができると の結果に注意しなければならない。 すなわち、 rhIFN -ァにより IP - 10を効果的に 誘導すること力できなかったのは、 その活性がなかったことによるものではない 子宮内膜の IP- 10 mRNAの発現パターンは着床期の胚仔、 I FN -て mRNAのレベルに 続 、て発現して 、るようにみえるもので、 IP - 10発現の変動は、 例えば、 MCP-1 や MCP- 2 といつた他の子宮内膜のケモカィン類と類似して 、る。 in si tuハイブリダィゼ一シヨンにおいて、 上皮下間質の領域に IP- 10 mRNAを 観察した。 そして免 細胞にぉ 、てそのシグナルがあるようであった。 ヒト及び マウスにおけるこれまでの研究 (Luster A. et al. , Nature, 315:672-676 (1985 ) ; Ohmori Y. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 168: 1261-1267 (1990 ))で単球により IP- 10が分泌されていること力く、 そして本発明で IP- 10がヒッジ 単球において発現されているが、 リンパ球、 上戯田胞、 及び間質細胞では発現し ていないことが見出された。加えて、 MCP mRNAも上皮下間質に偏在しており、 MC P陽 ¾細胞は好酸球である（Assel in E. et al. , Biol Peprod. , 64:992-1000 (2 001)) 。 これらの観察結果は、 上皮下間質に偏在している IP- 10は常在性のマク 口ファ一ジ及び/又は該領域に集められたマクロファージによつて産生されて 、 ることが示唆された。 上皮下間質の領域に IP- 10夕ンパク質力く局在していること に加えて、 IP - 10は子宮の管^ J:皮や腺上皮にも していた。胚仔においては 、 極くわずかな IP-10 タンパク質が検出された力^ IP- 10 mRNAは検出されなかつ た。 上皮下領域のマクロファージにより産生された IP-10は表面の上皮の中に拡 散してゆき、 それは CXCR3発現免疫細胞を着床部位に移動させることを誘引する こと力示唆される。 糸鵠侖として、 本発明により、 ヒッジの子宮において着床期の間には IP - 10及び IFN-て mRNAの経時的、細胞特異的に意味のある発現があること、 そして胚仔の IFN-てでは子宮内膜の IP - 10の発現を制御する能力があることを示しており、 IF N -てにより制御された IP - 10が反芻動物における着床期には免 細胞の補 び /又は再分配に重要な役割を果たしているとの可能性を樹共している。
本発明により、 IP- 10と IFN-てとの間の関係並びに子宮における IP-10の機能 を解明する途が開拓されてし、るものである。 実施例 2
〔動物組織の調製〕
発情周期 14日目と 17日目、及び妊娠 U日目、 17日目及び 20曰目のャギの子宮を イソフルレン麻酔下に摘出した。 発情周期 14日目、 及び妊娠 14日目及び 17日目の ャギから摘出した全適子宮を in si tu ノヽイブリダィゼーシヨン分析用に凍結した 。 妊娠 14日目及び 17日目、 及び発情周期 14日目及び 17日目のャギの子宮を灌流処 置し、 胚仔の単離ゃ灌流液の収細とした。 PBS(15ml) を該子宮に穏やかに注入 させ、 収集した子宫灌流液を濃縮（Macros印、 Pall Corporations Bast Hi lls. NY) し、 IP- 10検出のウェスターンプロット分析に使用した。胚仔紙織は妊娠 14 日目 （全胚仔） 、 17曰目 （1丕仔の約半分）及び 20日目 （トロホブラスト部分のみ ) のャギから採取し、 in vUro培養した。妊娠 17日目及び 20日目の胚仔の残存部 分は RNA抽出及び免 色用に凍結した。 In vi tro培養培地は IFN-ての検出用ゥ エスターンブロット分析に删した。上 钿胞は発情周期 14日目のャギの子宮か ら単離した。 IFN -ての IP - 10産生刺 ¾¾果の試験用に発情周期 14日目のャギの子 宫内„ を培養した。胚仔を取り除いたャギ子宮内膜組熾は凍結し RNA抽出 Kimした。 [In W troi咅養〕
全胚仔 （14日目、 n = 3 )及び細片ィ匕した胚仔 （17日目及び 20日目、 約 200mg/ ±咅養皿、 各 n二 3 ) を Imakawa の方法 (Endocrine (1995), 3, 511-517) に基 づいた条件下に培養した。
子宮内^ 皮钿胞の分离1¾びその特徵づけは Takahashiらの方法 (J. Reprod. Dev. (2001) 47， 181-187) により行った。 発情周期 14日目のャギの子宫角を 0, 76¾の EDTA- PBSで満たし、 37°Cで 1時間プレインキュベ一トした。 子宮内膜上皮 を外科用ナイフで擦り取り、 0. 1%のコラゲネース (Sig 、 St. Louis, M0) 中で 37°Cs 8分間ィンキュベ一トした。 細胞懸濁液をナイ口ンメッシュ （70 m)に通 し、 密度勾酉 St心分離法にかけた。 回収した上皮細胞を 40 uni ts/ml のべニシリ ン、 40 /g/mlのストレプトマイシン及び 10% FCS を加えた Dulbecco' s Modif ied Eagle' s Medium/Ham' s F-12 (DMEM/Ham' s F12 、 Sigma)中に再懸濁した。 該細胞 をブタ皮タイプ Iコラーゲン （Ni tta gelatin, 大阪、 日本） でコートした 24 - 穴プレートに添加し、 細胞力く増磁包和した段階で接着試験 (adhesion assay)を行 つ Ί乙
17日目のャギ胚仔から細胞を分離した。 該胚仔は細片ィ匕し、 0. 2%のコラゲネー ス (Sigma) で 37°C、 30分間ィンキュベ一トした。 該細胞をナイ口ンメッシュ （70 〃m)に通し、 ½物質を含有する DMEMに再懸濁し、 直ちにケモタキシスアツセィ あるいは接着試験に使用した。 更に、 ゥシ B-細胞 （KU- 1、 33) 及びャギトロホブ ラストクローン細胞 (HTS- 1、 33) を 10- 20%の FCS及び 物質を含有する匪 EM(S i ma) 中でィンキュベ一トした。
発情周期 14日目のャギ子宮内膜纖 （約 600mg wet weight/培地皿） を¾物 質を含有する 2(Mの DMEM中で培養し、 5 nMの組換えゥシ I -て （rblFN-て、 Rata kura Industries Co. , Inc. 、 東京、 日本） で処理した。 37° ( 、 5 % C02 含有空 気条件下に 24時間培 «m、 子宮内膜紙織を 結し、 RNA抽出及びノーザンブロッ ト分析に用し、るため一 70°Cに保存した。
〔ャギ IP- 10及び CXCR3 cDNAのクローニング〕
¾例 1と同様に RT- PCRを利用してャギ子宮内膜の RNAからャギ IP- 10及び CX CR3の cDNAを増幅し、 pSTBlueベクタ一 （TaKaRa、 東京、 曰本） にサブクロ一二 ングしてパーキン一エルマーシークェンサ一 （モデル ABI Prism 377 XL、 Roche Molecular system, Branchburg, NJ) を使って自動塩基配列分析を行った。 ャギ IP- 10及び CXCR3の塩基配列比較を BLASTネットワークプログラム (National Ce nter for Biotechnology Informati oi NIH BethesdaN D) を用いて行った結 果、 GenBank登録番号 AB099892及び AB099893を得た。
〔CXCR3発現プラスミ ドのトランスフエクシヨン〕
ャギ CXCR3のオープンリーディングフレームをコードしている塩基酉己列を PCR 増幅し、 哺乳类魏現べクタ一 PCDNA3. 1 (Invi trogen Corp. , Carlsbad, CA) にク ローニングした。 得られたプラスミ ドを Transfast™ (Promega, Madison, WI) によりその使用説明書にしたがって KU- 1細胞及び UTS- 1細胞に導入した。 導入 2 日後の細胞をケモタキシス又は 試験に使用した。
〔組換えャギ IP- 10及びそれに対する抗体の作製〕
ャギ IP- 10(cIP - 10) の全配列をコ一ドしているヌクレオチド配列 cDNAを PCR増 幅し、 cIP- 10の N-端末にヒスチジン-タグを組み込んで 、る発現ブラスミ ド pET_ 14b(Novagen, Madison, WI) にクロ一ニングした。 得られた発現ベクター、 pET - 14b- cIP-10で大腸菌 BL2ト Sl (Invi trogen) 細胞を形質転換し、 一夜培養した。 培 養細胞を集め、 50mM NaH2P04 、 500mM NaCl 及び lOmMィミダゾ一ル (pH7. 4) に 再懸濁し、 氷冷下音波破砕した。遠心分離により細胞片及び不溶性タンパク質を 除去した後、 上清中の組換え cIP- 10(rcIP - 10) を SDS-PAGEにより検出した。 組換 え cIP— 10をニッケノレ—キレ一トカラム (Hi - trap Chelating HP, Amersham Pharma cia Biotech Inc. , Buckinghamshire, UK) を使用してクロマトグラフィーシステ ム（A TA, Amersham Pharmaci s Biotech Inc. ) により精製した。 目的のタンパク 質をカラムからイミダゾ一ル (20- 500mM)濃度勾配溶離した後 PBSで透析しイミダ ゾールを除去した。
200 zgの rcIP- 10 タンパク質を含む PBS をフロイント^アジュバント（Sig ma) と混合しゥサギ (n=2) に皮下 S寸した。 rcIP-10 タンパク質を 2週間毎に更 に 2回 ¾寸した。 最後の 寸の 1週間後に抗体価を調べ、 次の日に全血採取した o 抗-ャギ IP - 10 ί几体を Hi trap Protein G column (Amersham Pharmacia Bi otec h Inc. ) を用いて Klin清から精製した。
〔SDS- PAGE及びゥエスタ一ンブロット分析〕
プロテインアツセィキット I KProtein assay ki t I I； Bi o-Rad, Hercules, CA ) を使用してタンパク質濃度を測定した後、 培養培地 (3〜8 μΛ、 10 /gタンパ ク質/レーン、 3)、 濃縮子宮フラッシング培地 （10〃gタンパク質 レーン、 各日 n=3)または組換え IP- 10(50または 200ng /レーン） を Nagaokaらの方法 (Bi o 1. R印 rod. (2003) 68, 1413- 1421)に従ってウェスターンプロット分析を行った o タンパク質検体は SDSサンプルバッファ一中で 5分間煮沸し、 還 件下で 10 %または 15%の SDS - PAGEゲルにて電気泳動した後ゲルをクマシ一ブノレ一で染色し た。 ウェスターンブロット用にゲノレ上のタンパク質をニトロセルロース膜（I腿 ob i lon, Mi l l ipore, Bedford, MA) に転写した。該膜を室温で 1時間、 ブロックェ —ス （Block Ace ：大日本製薬、 大阪、 日本） でブロック処理した後、 ヒッジ IF N-てに対するゥサギポリクロ一ナノレ抗体 （1 : 5000、 Dr. Bazerからの贈呈） 、 ヒ スチジン-タグ (Sigma) またはャギ IP- 10(1 : 1000) と共に 4 °Cで 12時間インキュ ペートした。 インキュベーション後、 該膜を TBS- Tween 20で 3回洗浄し、 ホース ラデイシュペルォキシダ一ゼ標識抗ゥサギ IgGロノく抗体 (Amersham Pharmacia Bi otech Inc. ) と室温で 1時間インキュベートし、 TBS- Tween 20で 3回洗浄した。 バンドは ECL ウェスターンブロッテイング検出 (Amersham Pharmacia Biotec h Inc. ) を使用して検出した。
〔RT - PCR分析〕
Isogen (二ツボンジーン、 東京、 日本） を使って、 子宮内膜組織、 胚仔組織及 び培養細胞 （それぞれ n=3) から全 RNAを抽出した。全 RNA検体はまず SuperScr ipt l l (Inv rogen)及び ol igo-dTプライマ一 （20 l 反応液容量） により逆転 写した。 CXCR3、 XCR1及びィンテグリンレセプターの mRNA量はオリゴヌクレオチ ドプライマ一 （表 3 ) を使って PCR増幅により測定した。 表 3
Name Sequence of foward and reverce primer Length (bp)
CXCR3 5 ' -GCATCAGCTTCGATCGGTAC- 3 ' 283
5， - GATGCGGGCGTAGCAATAGG - 3 '
XCR1 5 ' - ATGGAGCCCTCAGACATCCC - 3 ' 627
5■ -GAGGATCTCCACGTAGCAGA- 3 '
Integrin 5 5、 -TGCTGTGAACCAGAGTCGTC- 3 ' 809
5 ' -ATCCACTGCACAGCTGTGGC- 3 '
Integrin aV 5、 -GAAGCAGGAAAGAGAGCCTG- 3 ' 890
5 ¾ - CTATATCCGTGGCTCCTTTC - 3 '
Integrin βΐ 5 l - CTCAAATCCAGGCACAGCAG - 3 ' 523
5、 - CCAGCGAAGTGAAACACAGC - 3 '
Integrin β3 5 ' ■AGATTGGAGACACGGTGAGC- 3 ' 392
5 ' ■GTACTTGAAAGTGATCTTGC- 3 '
Integrin β5 5、 - GTCTGAAGATTGGGGACAGC - 3 ' 285
•GGTACACGCTCTGGTTCTCC- 3 '
G3PDH 5、 ■ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG- 3 ' 150
5 λ ■ATCATATTGGAACATGTAAA- 3 '
-ペアによる各反応は RTテンプレート（1〃1)及び Ampl iTaq Gold(0. 62 5 U; Roche Molecular System)により最終容量 25〃 1 で亍つた。 全 PCR反応は、 95°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 及び 72°Cで 1分間のサイクルを 40サイクノレ行 最後に 72°Cで 12分間 させた。 ァガロースゲル電気泳動およびェチジゥムブ口 マイドによる可視化後、 PCR産物は、 Quanti ty 0ne(v3. 0 sof tware ; PDI, Inc. , Huntington Station, NY)を備えたイメージ解析システム （ATTO Corp. , 東京、 日本） を^ fflして定量した。
〔ノーザンブロット分折〕
ノーザンプロット分析は Nagaoka らの方法 (Biol. R印 rod. (2003) 68, 1413-1 421)に従って行った。 DIG標識 cRNAプローブは T7 または SP6 RNA ポリメラ一ゼ (Promega) を使って IP - 10及び CXCR3 cDNAプラスミ ドから作製した。 IP- 10 mRNA の検出には全 RNAを使用し、 CXCR3 mRNAの試験にはポリ（A)+ RNAを使用した。 01 igotex-dT30(TaKaRa) を删して PBMCから単離した全 RNA力、らポリ（A) + RNA を取得した。 全 RNA(20〃g /レース 各 n=3)あるいはポリ（A)+ RNA (2〃gZレ ース 各 n=3) を電気泳動により分離し、 ナイロン膜 (Biodyne- B ; Pall Corpora tion) に転写した。該ナイ口ン膜に cRNAプローブを 63°Cで 12時間ハイプリダイズ させた後、 D I G検出システムを用いてシグナルを検出した。
〔免疫蛍光検査法〕
凍結胚仔組織切片 (10 zm、 各試験日それぞれ IF3) をシラン-コートスライ ド上に載せ、 ァセトンで固定した。 4寺異的結合をプロックするために Block Ac eで室温、 1時間処理した後、 スライドをヒト CXCR3 に対するマウスモノクロ一 ナノレ抗体 (10 / g/mU R&D Systems Inc. , Minneapol is, 匪）または正常マウス Ig G(Sigma)と 4 °C、 12時間インキュベートした。 一次抗体との反応後、 スライ ドを FITC結合杭-マウス IgG ャギ抗体 (15 /g/mU Jackson I腿 unoResearch Laborat ories Inc. , West Grove, PA) で室温、 1時間処理した。 細胞核をヨウ化プロピ ジゥム (2 /g/ml、 Sigma)で染色し、 デジタル画像を共焦点レーザ一顕微鏡 (FV300 、 OLYMPUS、 東京、 日本） に記録した。
〔タンパク質のビォチン化及び検出〕
組換え cIP- 10タンパク質を EZ -遮桔ビォチン化試薬 (Pierce, Rockford、 IL) を使用してピオチン化した。 コントロールとして組換え GST及び組換えャギリン ホタクチン -GST (lymphotac tin-GST) タンパク質をピオチンで標識した。 ビォチ ン化はこれらのタンパク質を 0. 3mg/ml EZ- 锆ビォチン化 I ^の 1 mlと共に PBS 中で氷冷下 時間ィンキュベ一トして行なつた。 インキュべ一ション後、 透析し て未反応のピオチンを除去した。 タンパク質濃度を測定し、 ピオチン化タンパク 質 （2 zg/レーン） を還 件下 15%の SDS- PAGEゲルで展開しホースラデイシュ ペルォキシダ一ゼ標識ストレプトアビジン（Amersham Pharmacia Biotech Inc. ) により可視化し、 標識効率を確認した。
锆胚仔組織切片 （lO zm、 それぞれ n=3) をシラン-コートスライドに載せ 、 ァセトンで固定ィヒした。 スライドを Block Ace で室温、 1時間プロック処理し た。 ピオチン化タンパク質 (100 zg/ml) と室温で 1時間インキュベートした後、 スライドをホ一スラディシュペルォキシダ一ゼ '標識ストレプトアビジン（1 :5000 、 Amersham Pharmacia Biotech Inc. )と室温で 1時間、 反応させた。 ピオチン化 タンパク質の糸且織への結合を DAB激夜 (Sig ) を使って可視化した。 組 «片を へマトキシリンにより対比染色した。
〔ケモタキシスアツセィ〕
KU - 1細胞、 HTS- 1細胞及び初代トロホブラスト細胞の遊走活性を 96ゥエル-修 飾ボイテンナヤンノ、 '一 (modif ied Boyden chamber； NeuroProbe Cabin John、 MD) 内でポリビニルピロリ ドンを含まないポリカルボネート膜 (5 m ポアサイズ 、 NeuroProbe) を使って調べた。 該ポリカルボネート膜は予め 10〃 g/mlのゥシ血 漿フイブロネクチン （和光純薬、 大阪、 日本） によりコートして使用に供した。 アツセィは Nagaoka らの方法 (Biol. Reprod. (2003) 68， 1413- 1421)にしたがつ て亍つた。 すなわち、 ケモタキシス用チャンバ一のゥエルの下部に rcIP-10の所 を含有する D M - 0. 1%BSA (フエノールレツド及び FCS不含） を添加し、 チ ヤンバーのゥエルの上部に細胞 (5 X 106 cel ls/ml) を含有する DMEM-0. 1%BSA ( フエノールレツド及び FCS不含） を添加した。 チャンバ一を 37で、 5 %C02 含有 空気雰囲気下で 2時間インキュベーション後、 膜を取り除き、 PBSで洗浄、 固定 ィ匕後、 Dif-Quick (国際 ¾、 神戸、 日本） で染色した。 下層へ移動した細胞の 数を無作為に選んだ 6つの領域にぉ 、て顕微鏡下で力ゥントした。 ！Eih試験は、 チャンバ一下部への添加前に rcIP- 10 を抗- IP- 10抗体またはコントロ一ルゥサギ IgG(Sigma)と 37°C、 1時間プレインキュベ一シヨンして行った。 これらの試験は それぞれ 3回ずつ行った。
〔接着性試験〕
24 -穴プレートにタイプ I コラーゲン (Ni tta gelatin) またはフイブロネクチ ンを 10 /g/ml濃度で室温、 2時間コートする力、、 あるいはャギ上 細胞を貼り付 ける。 PBSで 3回洗浄後、 プレートを 1 %BSAで室温、 30分間ブロック処理した 。 HTS-1細胞または初代トロホブラスト細胞を細胞内蛍光色素、 力ルセイン-細（ calsein-AM; Molecular Probes Inc. , Eugene 、 OR) 4 M と 37。C、 30分間標識 反応させた。 PBSで 3回洗浄した後、 細胞を所 の rcIP- 10 と 37°Cで 1時間反 応させ、 各ゥエルに添加し、 プレートを 37°Cで 1時間ィンキュベ一トした。 ィン キュベ一ション後、 PBSで 3回洗浄し、 ゥエルに結合しなかつた細胞を除去し、 ゥエルに結合した細胞を 1 %Td ton X- 100、 10%エタノーノ哈有 PBSで処理した 細胞の蛍光を蛍光読取装置 （励起フィルタ一 485nm、 発光フィルタ一 535nm ) (ARVO™ SX 1420 Mul ti label Counter、 PerkinElmer Li fe Sciences Inc. , Bo ston、 MA) を使って SiJ定した。 胆业試験は、 rcIP - 10 を 30〃g/mlの抗 -IP- 10抗体 またはコントロールゥサギ IgG(Sigma)と 37°C、 1時間プレインキュベ一シヨンし て亍った。 フィブロネクチンへの細胞の 性に対する IP - 10 の関与にっ 、て更 に調べるために、 50mMの Gly- Arg- Gly- Asp- Ser- Pro- Lys(GRGDSPK、 Sigma)合成べ プチド、 そのコントロール、 Arg- Gly- Glu-Ser(RGES、 Si ma). または 5 mMの EDTA を細胞及び rcIP-10 とプレインキュベーションした。 これらの試験はそれぞれ 3 回ずつ亍った。
〔統計学的膨〕
光学密度 （ウェスターンブロット） 及び光度 (RT-PCR) の測定は、 統計学的解 析システム （version 6. 0 ； SAS Insti tute、 Cary、 NY) の一般線形モデルを採 用した最小二乗法 （LS) AN0VAで行った。 G3PDHの PCR産物の:)^は RT - PCR分析 の共 »として使用した。 ケモタキシスアツセィでは、 遊走あるいは処理により 付着した細胞の数は、 未処理の細胞と比較した数として算出し、 前述のように統 計学的に角晰して求めた。 LS - AN0VAに用 、られて 、るモデルは変動値の母集団と して処置及び複製を含んでいる。 図中に描かれた最小二乗平均 (LSM)及び標準誤 差 (S. E. )は、 この角浙から得られた。
〔組換えャギ IP- 10タンパク質及びそれに対する抗体の作製結果〕
pET- 14b- cIP- 10プラスミ ドで形質転換された大腸菌 BL2;L- SI に組換えャギ IP- 1 0(rcIP- 10)を発現させ、 His - Tagを利用して精製し、 SDS- PAGEにより確認した。 ニッケルキレ一トカラムによる細胞溶解物の精製前 （レーン 1 ) と精製後 （レ一 ン 2 ) の SDS- PAGEの結果を図 10Aに示す。 抗- His- Tag抗体 （レーン 1 ) 及び杭- ャギ IP- 10抗体 （レーン 2 ) による精製 rcIP-10 タンパク質 （50及び 200ng/レ一 ン） のウェス夕一ンブロット分析の結果を図 10Bに示す。 特異的なバンドが約 14 kDaのところに見られた。
rcIP-10 の生物学的活性を調べるために、 in vi troケモタキシスアツセィをャ ギ CXCR3 cDNAを導入したゥシ B-細胞株 KU-1細胞を使用して行った。 遺ィ の導 入された細胞による CXCR3 mRNAの発現をノーザンブロット分析により確認した。 RNA は pcDNA3.卜ャギ CXCR3 (CXCR3) 或いは親のベクター pcDNA3. 1 (Mock) 力導 入された KU-1細胞から抽出した （図 10C、 左） 。 CXCR3 に対する rcIP- 10 の生物 学的活性を CXCR3 を発現している （〇） および発現していない （□) KU- 1細胞を 用いてケモタキシスアツセィにより調べた。 各棒線は LSM土 S. E.を示している。 アツセィの結果は、 CXCR3 トランスフエクト細胞が卜 20ng/ml の rcIP_10 に対し 常に応答したことを示していた。 更に高濃度の rcIP- 10 に対しては応答の度合い 力《低下しており円膨の用量反応曲線を示した （図 10C、 右） 。 更に、 免疫中和 試験として 20ng/ml の rcIP- 10を添加した KU-1細胞によるケモタキシスアツセィ を行った （図 10D) 。 アツセィは抗体無添加 （一） 、 30〃g/mlの抗-ャギ IP- 10 抗体で前処理 (anti IP- 10) 及びコントロールとしてゥサギ IgGで前処理 (cont rol IgG)により行った。 アスターリスク（*)は有意差 (Pく 0. 05) を示す。 免疫 中和試験では、 抗- rcIP- 10抗体が rdP-10 のケモタキシス活性を低減することを 示した。
〔妊娠初期におけるャギ子宮内 IP- 10の発現〕
妊娠 14日目、 17日目及び 20日目のャギ胚仔由来の培養培地 （10 gタンパク質 /レーン） における IFN-てをウェスターンブロッ ト分析により調べた。 IFN-て夕 ンパク質産生は妊娠 17日目で最も高濃度を示した （図 11A) 。 子宮内膜 IP- 10 mR NAのノーザンブロッ卜の結果を図 11Bに示す。 妊娠ャギ （パネル左） の胚仔 (17 日目： Con) 、 子宮内膜 （14日目： D14、 17日目： D17、 20日目： D20) 及び rc IFN -てで 24時間刺激した発情周期ャギ （14日目、 パネル右） 力ヽらの RNA(20〃g/レ —ン） を 1. 2%ァガロースゲルで電気泳動した。 ノーザンプロット分析の結果は、 ャギ子宮内膜の IP- 10 mRNAのレベルが妊娠 17日目から上昇してくること、 及び胚 仔因子 IFN-てが in vi troで発情周期 14日目の子宫内膜における IP- 10 mRNAレベル を朿瞎 ίしていることを示した （図 11B)。 IP- 10 タンパク質はゥエスタ一ンブロ ット分析により発情周期及び妊娠 14日目、 17日目のャギ （それぞれ n=3) 子宮灌 流溜夜中 （10 zg タンパク質/レーン） に検出された （図 11C、 左） 。 IP-10の ウェスターンブロットの濃度解析結果 （図 11C、 右） の各棒線は LSM土 S. E.を示 し、 アスターリスク（*)は発情周期 14日目の子宮における値と比較した if^の 有意差 (Pく 0. 05) を示している。 妊娠 17日目の子宫灌流溜夜は他の試験日の培地 中よりも多量の IP- 10 を含有していた。 ャギ子宮における IP - 10 mRNAの in si tu ハイブリダィゼ一シヨンの結果を図 11Dに示す。 パネル a、 b及び c はそれぞれ 発情周期 14日目、 妊娠 14日目及び 17日目のャギについての DIG-標識ァンチセンス ャギ IP- 10 cRNAの結果である。 パネル d は妊娠 17日目のャギについてのセンス IP - 10 の結果である。 ここで、 leは管 細胞、 stは間質細胞、 trはトロホブラ ストを示し、 スケールバ一 （一） は 50〃111を示す。 IP - 10 mRNA力く妊鮮宫内膜の 上皮下間質領域に見られ、 妊娠 17日目の子宮内膜では発情周期 14日目または妊娠 14日目の子宫内膜に比べて高いレベルの IP- 10 mRNAが検知された （図 11D) 。
〔ャギ胚仔における CXCR3の発現と細胞内局在〕
妊娠 14、 17または 20曰目のャギ子宮内膜 （D14、 D17及び D20、 n=3 ) 及び 17 日目の S丕仔組織 (Con、 n=3)における CXCR3 mRNAの発現を RT- PCRにより測定した（ 図 12A)。 更に 17及び 20日目の胚仔 ( 2 ii g ポリ（A)+ RNA /レーン、 それぞれ n=3 ) における CXCR3 mRNAの発現をノーザンブロット分析により確認した （図 12B) o 免疫蛍光検査分析を席锆胚仔及び抗- CXCR3抗体を用いて行った。 抗-ヒト CXCR 3 モノクローナル抗体 (a) 、 正常マウス IgG (ネガティブコントロール、 d )、 及び同一の領域の細胞核をヨウ化プロビジゥムで染色 、 e)、 及び抗- CXCR3抗体 とヨウ化プロビジゥムによる染色結果を重ねた画像 (c) を図 12Cに示した。 スケ —ルバ一は 100 。 トロホブラスト層に斑点状の蛍光が観察され、 核とははつ きり異なる局在性を示している。
〔ャギトロホブラスト細胞への rcIP- 10の結合〕
組換え cIP- 10タンパク質、 組換え GST及びャギリンフオタクチン （リンフオタ クチン- GST) をピオチンィ匕し、 ホースラデイシュペルォキシダ一ゼ標識ストレブ トァビジンによりピオチン化を確認した (図 13A)。 妊娠 17日目のャギ胚仔 (Con ) 、 子宫内膜 (Endo)または末梢血単核細胞 (PBMCs) における IP- 10 レセプタ一 CX CR3 mRNA及びリンフオタクチンレセプ夕一 XCR1 mRNAの発現を RT- PCRにより確認 した （図 13B) 。 リンフオタクチンは Cケモカインファミリ一に属し、 IP- 10 と 同様に妊娠初期のャギ子宮内膜に発現する。 しかしながら、 リンフオタクチンレ セプタ一 XCR1 mRNAは CXCR3 とは異なり胚仔には検出されなかった。 これらの理 由により、 リンフオタクチン /XCRをネガティブコントロ一ルとして使用した。 ピオチンィ匕したタンパク質を妊娠 17日目のャギ胚仔と反応させ、 ホースラディシ ュペルォキシダ一ゼ標識ストレプトアビジンで可視化した。 CXCR3 の存在は rcIP - 10 とインキュベートしたトロホブラスト細胞においてのみ観測された （図 13C ) 。 スケールバ一は 200〃m。
〔CXCR3を発現している胚仔細胞に及ぼす組換え cIP- 10の遊走活性刺激〕 図 14A、 左は、 HTS-1細胞 （―） 、 空プラスミ ドを導入した HTS - 1 (Mock)及び ャギ CXCR3 cDNAを導人した HTS- KCXCR3)から抽出した RNAのノーザンブロッ卜の 結果を示している。 HTS- 1細胞のケモタキシスアツセィを行った。 CXCR3発現プ ラスミ ドでトランスフエクトされていない HTS-1 (□) は rcIP- 10 に反応しなカヽ つた力、 CXCR3発現プラスミ ドでトランスフヱクトした HTS- 1 (〇） は卜 20 n g/ mlの rcIP- 10 に対し常に応答した。 rcIP- 10 の濃度が上昇するにしたがって反応 性は低下し、 円 ί膨の用量反応曲線を示した （図 14Α、 右） 。 CXCR3発現プラス ミ ドでトランスフヱク卜した HTS-1 (黒棒) および空プラスミ ドでトランスフエ ク卜した HTS- 1(白棒） の遊走活性に対する rcIP- 10 の作用を調べた （図 14B)。 30〃g/mlの抗- cIP- 10抗体 (Abs : IP- 10)または 30〃g/mlの正常ゥサギ IgG(Abs : I gG) で前処理した rcIP- l(20ng/ml) をこれら HTS - 1 細胞と反応させた。 rcIP - 10 で処理された細胞の遊走細胞数を未処王里細胞の遊走細胞数で割つた数を遊走細胞 率とした。 アスターリスク（*)は有意差 (Pく 0. 05) を示す。 抗- rcIP- 10抗体が rcIP-10 のケモタキシス活性を低減することを示した。 次いで、 妊娠 17日目の CX CR3 を発現している初代トロホブラスト細胞についてケモタキシスアツセィを行 つた。 該トロホブラスト細胞の遊走性は rcIP- 10 タンパク質によって促進され、 ケモタキシス活性は抗 -IP- 10抗体により中和された （図 14C) o
〔フィブロネクチン及び子宮内 :皮細胞へのト口ホブラスト細胞の g¾性に及 ぼす rcIP - 10の影響〕
コラーゲン I またはフイブロネクチンでコートした或いは何もコ一トされてい ないプレートへの rcIP-10(20ng/ml)で活性化した （+) または活性化していない (一） ャギトロホブラスト細胞（妊娠 17日目） の 性試験の結果、 フイブロネ クチンをコ一トしたプレー卜への rcIP- 10活性化細胞の接着率が非常に高かった (図 15A) 。 £±試験として、 抗- cIP- 10抗体（IP - 10) または正常ゥサギ IgG(Ig G)で rcIP- 10 を前処理してトロホブラスト細胞のフィブロネクチンへの 性試 験を行った （図 15B) 。 更に、 50mMの RGDペプチド （フイブロネクチンの RGD (Arg-Gly-Asp) サイトを介して起こる細胞 を [SJIIする） 、 50mMの RGEぺプ チド (不活性コントロ—ル) または 5 mMの EDTA (ィンテグリンシグナルのィンヒ ビター） をトロホブラスト細胞に添加してケモタキシスアツセィを行った （図 15 B) 。 組換え cIP- 10で活性化されたトロホブラスト細胞のフイブロネクチンへの 性を RGEペプチドは阻止しなかったが、 RGDペプチドは阻止した。 EDTAもま たト口ホブラスト細胞のフィブロネクチンへの を阻止した。
CXCR3 cDNAでトランスフエクトした HTS- 1細胞 （黒棒） は、 フイブロネクチン への細胞の婦性が rcIP- 10 タンパク質により活性化され、 抗 -IP- 10抗体により その活性化が抑制された （図 15C) 。 RGDペプチドまたは EDTAの添加により CXCR 3 トランスフヱクト細胞のフイブロネクチンへの 性は抑制された （図 15C) 。 空プラスミ ドでトランスフヱク卜した細胞 （白棒） の遊走活性もまた RGDぺプ チド及び EDTAで抑制された。
CXCR3 プラスミ ドでトランスフヱク卜した HTS- 1細胞 （黒棒） 及び空プラスミ ドでトランスフヱク卜した HTS- 1細胞 （白棒） の子宮内 細胞に対する接着 性試験を行った （図 15D) 。 CXCR3 を発現している HTS- 1 の子宮内 Riife細胞へ の鶴性は rcIP- 10 タンパク質によって上昇し、 IP - 10 に対する抗体による中和 試験により Plihされた。 EDTA処理トロホブラスト細胞では上 細胞に対する鐘 活性は失われた。 RGDペプチドは接着活性を抑制した。 各棒線は LSM土 S. E.を表 し、 アスターリスク（*)は有意差 (Pく 0. 05) を示す。
〔組換え cIP- 10により活性化されたャギトロホブラスト細胞におけるィンテグリ ンサブュニットの発現〕
組換え c IP- 10により活性化された HTS - 1細胞によるインテグリンサブュニッ 卜の発現を調べた。 インテグリンサブユニッ ト、 5、 V、 β 5 3及び3 5の転写を RT- PCRにより検出した。 トロホブラスト細胞におけるィンテグリン α 5、 V及び3 3サブユニット mRNAの発現が rcIP- 10により促進され、 この促進 は抗- IP- 10抗体により中和された （図 16) 。 インテグリン /3 1及び； S 5サブュニ ット mRNAの発現は rcIP- 10 により影響されなかった。各棒線は LSM土 S. E.を表す。 以上の結果より、 ヒッジと同様、 ャギの子宫において着床期の間には IP- 10及 び IFN -て mRNAの経時的、 細胞特異的に意味のある発現があること、 そして胚仔 の IFN-てが子宫内膜の IP- 10の発現を制御する能力があること力《示され、 IFN -て により制御された IP - 10カ谱床期に免 細胞の補 3¾¾び/又は再分配に重要な役 割を果たしている可能性が示されている。
本発明により、 IP- 10と IFN-てとの間の関係並びに子宮における IP- 10の機能 を解明する途が開拓される。 産 の利用可能性
本発明により、 IP- 10が、 胚が子宮に着床する現象や過程を制御することを利 用する技林 Ϊが樹共されたことにより、 聰の妊娠認 程を制御する医薬、 動物 薬、 治療法、 活性測定法、 アツセィ法、 それらに使用される難などを提供する 途を開くものである。本発明に従い、妊娠現象の調整制御力、可能となり、 ヒト及 び家畜を含めた動物について、 妊娠を確実に成功せしめたり、 妊娠を防いだりす ること力く可能となるし、 そうした目的に重要な物質や薬物の開発が容易になる。 本発明は、 前述の説明及び難例に特に記載した以外も、 実行できることは明 らカヽである。上述の教示に鑑みて、 本発明の多く,の改¾¾ぴ¾0が可能であり、 従つてそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。 <配列表フリ - -テキスト >
SBQ ID NO: 3, Description of Artif icial Sequence : 01 go脈 leotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 4， Description of Artificial Sequence: 01 gonucleotide to act as a primer for PCR
SBQ ID NO: 5， Description of Artif icial Sequence: 01 go露 leotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 6, Description of Artif icial Sequence: 01 gonucleotide to act as a primer for PCR
SBQ ID NO: 7, Description of Artif icial Sequence: 01 gonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 8, Description of Artif icial Sequence: 01 gonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 9, Description of Artif icial Sequence: 01 gonucleotide to act as a primer for PCR
SBQ ID NO: 10 ， Description of Artif icia 1 Sequence: 0 igonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 11： ， Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 12: , Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 13; Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 14 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 15 ， Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 16 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 17 Description of Artif icia 1 Sequence： 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 18 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 19 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 20 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 21 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 22 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 23 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 24 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 25. Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 26 Description of Artif icia 1 Sequence: 0 gonucleot de to ac t as a primer for PCR

Claims

請 求 の 範 囲
1 . タンパク質 IP - 10及び IP - 10 において少なくとも 1以上のァミノ酸残 基が欠失、 付加及び/又は置換されて 、る IP - 10類縁体であつて全長の IP- 10 と 実質的に同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘 本力、 ら成る群から選ばれたものを有効成分として含有し、
(1) 胚遊走活性化剤、 (2) 胚の子宮壁への着床促進剤、 (3) 不妊治療剤、 (4) 妊 娠促進剤、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整剤、 (6) 免 細胞遊走活性化剤 、 及び (7) 子宮内免疫機能調整剤
から成る群から選ばれたものであることを特徵とする医薬及び/又は動物医 薬。
2. IP- 10力く、 ヒト、 ゥシ、 スィギユウ、 ゥマ、 ロノ \ ヒッジ、 ャギ、 ラ クダ、 ブタ、 シカ、 トナカイ、 ャク、 ィヌ、 ネコ、 サルを包含する哺乳動物由来 のものであることを特徴とする請求項 1記載の医薬及び/又は動物医薬。
3. IP- 10及び IP- 10 にお 、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失、 付加及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP- 10 と実質的に同 等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘 f本から成る群力、 ら選ばれたもので、 試料を処理し、
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4)妊娠促進 、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免！ ¾細胞遊走活性化、 及び (7 ) 子宮内免疫機能調整活性
力、ら成る群から；！ばれた生物学的活性を得ることを特徴とする方法。
4. IP- 10及び IP- 10 におレ、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失、 ィ 口及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP- 10 と実質的に同 等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘 {本から成る群力、 ら選ばれたものを含有し、 請求項 3記載の方法に使用することを'樹敫とする謹
5. IP- 10活性を測定し、 . (1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠促進 、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 钿胞遊走活性化、 及び (7 ) 子宮内免疫機能調整活性
力、ら成る群から選ばれた生物学的活性をァッセィすることを糊敫とするアツ セィ。
6. 請求項 5のァッセィに使用することを特徴とする ¾。
7. IP- 10及び IP - 10 にお 、て少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠失、 付加及び/又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP-10 と実質的に同 等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘割本から成る群力、 ら選ばれたものをコ一ドする塩基配列を含有する核酸を有効成分として含有し、 (1) 胚遊走活性化剤、 (2) 胚の子宮壁への着床促進剤、 (3) 不妊治療剤、 （4) 妊 娠促進剤、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整剤、 (6) 免 細胞遊走活性化剤 、 及び (7) 子宮内免疫機能調整剤
カヽら成る群から選ばれたものであることを特徴とする医薬及び/又は動物医
8. (i) 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうち、 少なくとも オープンリ一ディングフレーム部分を有するもの、
(i i) 少なくとも該（i) の配列とストリンジヱントな条件でハイブリダイズする ことのできる塩基酉己列、
(i i i) 図 2あるいは配列番号： 2のボリぺプチドと少なくとも 80%の相同性を有 するアミノ酸配列を持ち、 且つ
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠促進 、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
から成る群から運ま'れた生物学的活性を有するかある 、は同等の抗原性を包 含した、 該 IP- 10 (例えば、 ヒッジ IP- 10 ) と実質的に同等の生物学的活性を有 するぺプチドをコ一ドする塩基酉 B^【J、
力、ら成る群から選ばれた核酸を有効成分として含有し、
(1) 胚遊走活性化剤、 (2) 胚の子宮壁への着床促進剤、 (3) 不妊治歸 ij、 （4) 妊 娠促進剤、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調 ¾¾、 (6)免疫細胞遊走活性化剤 、及び (7)子宮内免疫機能調翻
から成る群から選ばれたものであることを特徵とする医薬及び/又は動物医
9. (A) 夕ンパク質 IP- 10及び IP- 10 において少なくとも 1以上のァミノ 酸残基が欠失、 及び/又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP - 1 0 と実質的に同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP- 10誘導 体から成る群から選ばれたもの若しくはその: は
(B) (ί) 配列表の配列番号： 1で表される塩基配列のうち、 少なくともォ ープンリ—ディングフレーム部分を有するもの、
(i i) 少なくとも該 (i) の配列とストリンジヱントな条件でハイブリダイズする ことのできる塩基配列、
(i i i) 図 2あるいは配列番号： 2のポリぺプチドと少なくとも 80%の相同性を有 するアミノ酸配列を持ち、且つ
(1) E¾走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3)不妊治療、 (4)妊娠促進 、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6)免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調整活性
から成る群から連ま'れた生物学的活性を有するかある 、は同等の抗原性を包 含した、 該 IP- 10 (例えば、 ヒッジ IP- 10 ) と実質的に同等の生物学的活性を有 するぺプチドをコ一ドする塩基配列、
から成る群力、ら運ま'れた核酸
の生物学的活性、 例えば (1)胚遊走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4)妊娠促進、 (5)胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6)免疫 細胞遊走活性、 及び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物学 的活性を促進又は阻害する化合物又はその塩を含有していることを特徴とする医 。
10. (A) IP- 10及び IP - 10において少なくとも 1以上のァミノ酸残基が欠 失、 付加及び Z又は置換されている IP- 10類縁体であって全長の IP-10 と実質的 に同等又は同一の生物活性を有する IP- 10類縁体あるいは IP-10誘 本から成る 群から週ま'れたもの若しくはその塩、 (B) 前記 (A) をコードする核酸及び該核酸 を含有するべクタ一あるいは該核酸又は該ベクタ一で形質転換された宿主細胞か ら成る群から選ばれたものを使用し、 前記 IP- 10又は IP- 10類縁体あるいは IP - 1 0誘割本若しくはその:^は前記核酸の生物学的活性、 例えば (1) 胚遊走活性化 、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠促進、 (5) 胚仔と母体 との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性、 及び (7) 子宮内免疫機能調 整活性から成る群から遷ま'れた生物学的活性を促進又は阻害する化合物をスクリ 一二ングする方法又はそのためのスクリーニングキット。
11. IP-10 の産生を亢進し、 不妊症の発症及び Z又は進展を防ぐ化合物の スクリ一ニング方法又はスクリ—ニングキットである請求項 10記載のスクリ一二 ング方法又はスクリ—ニングキット。
12. 請求項 10又は 11記載のスクリ一ニング方法又はスクリ一ニングキット を翻してスクリーニングすることにより得られる、 IP- 10産生制御化合物。
13. IP- 10、 該遺伝子又は該 RNAに存在し、 IP - 10の活 ttXは発現を変化 させうる変異部位の存在を検知するためのものであることを特徴とする IP- 10関 連疾患用遺伝子診断薬。
14. IP - 10遺伝子、 mRNA. hnRNA力、ら選ばれたものに被しうる変異部位 を特異的に認識できる制限酵素及びそのアイソシゾマー並びに IP- 10遺伝子、 mR NA hnRNA力、ら選ばれたものに存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅する ために利用されるオリゴヌクレオチドプライマ一から成る群から選ばれたものを 使用することを特徵とする請求項 13記載の診断薬。
15. 工程 (a)：核酸試料を得る工程、
工程 (b) :工程 (a) にて得られた核酸 斗を遺伝子増幅して、 IP- 10遺伝子 に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、 及び
工程 (c) :工程 ） の核酸断片について、 変異の存在を調べる工程 を含むことを特徵とする IP- 10遺伝子関連疾患の遺伝子診断法。
16. 被検試料における IP- 10 ポリヌクレオチドの存 ¾*を試験し、 IP - 10 ポリヌクレオチドの存 ¾»を指標に して、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾敏を判定又は診断することを樹 とする被検体における生物活性の判定 又は診断方法。
17. 被検試料における IP - 10 タンパク質の 量を試験し、 IP-10 タンパ ク質の存¾*を指標に使用して、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 （2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾 1¾を判定又は診断することを特徵とする被検体における生物活性の判定 又は診断方法。
18. IP- 10ポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイブリダイ ズするォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有する組成物であって、 被 検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2)胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から;！ 1ばれた生物活性
の禾 MSを判定又は診断するために i fflするものであることを特徴とする被検 体における生物活性の判定又は診断組成物。
19. (i) IP- 10ポリヌクレオチドとストリンジヱン卜な条件下でハイプリ ダイズするォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、 又は（i i) IP-10ポリヌク レオチドを備え、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免！ ¾钿胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた生物活性
の程度を判 ¾Xは診断するために使用するものであることを樹敷とする核酸 アレイ。
20. IP- 10ポリヌクレオチドを PCR増幅し、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から Sばれた生物活性
の禾1¾を判定又は診断するために使用するものであることを とするブラ ィマ一セット。
21. 少なくとも以下の要素：
IP - 10 を認識する抗体
からなるキッ卜であって、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 （6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の程度を判定又は診断するために使用するものであることを特徵とする被検 体における生物活性の判定又は診断キット。
22. 少なくとも以下の要素：
(a) 固相化した IP-10 を認識する抗体；および
(b) 標識化した且つ上記抗体とは異なるェピトープと結合する抗体 からなるキットであって、 被検体における以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 （6) 免 g田胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性
の禾 ^を判定又は診断するためにィ¾1するものであることを特徴とする被検 体における生物活性の判定又は診断キット。
23. すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体試料を IP- 10 を認識する抗体を固定化した担体と接触するェ 程；
(b) 該生体試料と接触せしめた固相担体を洗滌する工程；
(c) 該生体試料と接触せしめた固相担体を標識化した且つ上記抗体とは異なる ェピト一プと結合する抗体と接触する工程；
(d) 固相化された標識あるいは遊離である標識を測定する工程；
(e) 工程 (d) で測定された標 ϋ*を IP- 10量の指標とし、 正常な生体試料の結 果と比較する工程；および
(0 正常な生体識斗と比較して有意に相違する IP- 10 タンパク質存 を、 以 下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの を示す指標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの程度を測定 する方法。
24. すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体謝より RNAを調製する工程；
(b) 工程 (a) で調製された RMを電気泳動分離する工程；
(c) 工程 (b) で分離された RMを IP - 10 ポリヌクレオチドとストリンジヱント な条件下で標識ヌクレオチドプローブとハイプリダイズする工程；
(d) 工程 (c) でハイブリダィズしている標 fH»を IP-10 ポリヌクレオチド発現 量の指標とし、 正常な生体試料の結果と比較する工程；および
(e) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 ポリヌクレオチド発 ij* を、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの を示す指標として使用する工程
を含むことを糊数とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの禾號を測定 する方法。
25. すくなくとも以下の工程:
(a) 被検体の生体 ¾f斗より RNAを調製する工程；
(b) 工程 (a) で調製された RNAを铸型に dTブラィマ一を使用して第 1鎖 cDNAを 調製する工程；
(c) 工程 (b) で調製された cDNAを铸型に IP- 10 ポリヌクレオチドを PCR増幅す るためのプライマ一セットを使用して PCR増幅する工程；
(d) 工程 (c) で得られた PCR産物を電気泳動分離する工程；
(e) 工程 (d) で分離された PCR産物を IP- 10 ポリヌクレオチドとストリンジヱ ントな条件下でハイブリダイズする標識ヌクレオチドプローブとハイブリダイズ する工程；
(f) 工程。） でハイブリダイズして 、る標 H*を IP- 10 ポリヌクレオチド Ί 量の指標とし、 正常な生体試料の結果と比較する工程；および
(g) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP-10 ポリ
を、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 田胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 ISを示 旨標として使用する工程
を含むことを特徴とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの禾 を測定 する方法。
26. すくなくとも以下の工程：
(a) 被検体の生体試料を糸職固定化処理に付す工程；
(b) 工程 (a) で調製された ¾熾固定化標本を切片とする工程；
(c) 切片化した組織を IP- 10 を認識する抗体による免¾¾«色に付す工程；
(d) 被検体の生体試料における免疫組 «色の程度を、 健常のもののそれらと 比較する工程；および
(e) 正常な生体試料と比較して有意に相違する IP- 10 タンパク質被量を、 以 下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免攝睡包遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 MSを示す指標としてィ¾¾する工程
を含むことを特徵とする当該生物活性に伴う異常又はそのリスクの を測定 する方法。
27. 以下の工程：
(a) IP-10 ポリヌクレオチドを PCR増幅するためのプライマ一セットを使用し て被検体の生体試料を PCR増幅する工程；
(b) (i) IP-10 ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズするォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、 又は（i i) IP-10ポリヌクレオ チドを備えた核酸ァレイを使用した分析に被検体の生体試料から分離した核酸分 画をかける工程；
(c) IP-10 ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズす るォリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと被検体の生体試料から分離した核 酸分画とをハイプリダイズする工程
カヽら成る群から選ばれた工程のすくなくとも一つを含み、 且つ
被検体の生体試料における IP- 10 ポリヌクレオチドの存在量を試験し、 IP- 10 ポ リヌクレオチドの 量が健常のもののそれらと比較することを含むことを特徵 とする、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 （2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免¾睡包遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から遷ま'れた生物活性における異常又 はそのリスクの禾 を測定する方法。
28. 定量的に IP - 10 タンパク質存¾» ^は IP- 10 ポリヌクレオチド発現量 を測定することを特徴とする請求項 23~27の れか一に記載の、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクを測定する方法。
29. 請求項 23〜27のいずれか一に記載の、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免疫細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクを測定する方法において する、 （0 IP- 10を認識する抗体、 （i i) 該抗体 (i) とは異なるェピトープと結合する抗体、 （i i i) 固相化した抗体 (i) 又 は（i i)及び (iv)標識した抗体 (i) 又は (i i)のいずれか一に記載の抗体を含有する ことを特徵とする ¾¾。
30. IP- 10 を認識する抗体を使用し、 検体試料中の IP- 10 タンパク質 *X は IP-10 ポリヌクレオチド発 を測定することを寺 ί数とする以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 (4) 妊娠 促進、 （5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 （6) 免 細胞遊走活性化、 及 び (7)子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの程度を測定又は診断する方法。
31. IP- 10 を認識する抗体を含有し、 検体試料中の IP- 10 タンパク質 »X は IP- 10 ポリヌクレオチド発現量を測定し、 以下：
(1) 胚遊走活性化、 (2) 胚の子宮壁への着床促進、 (3) 不妊治療、 （4) 妊娠 促進、 (5) 胚仔と母体との間の相互作用調整活性、 (6) 免；! ¾細胞遊走活性化、 及 び (7) 子宮内免疫機能調整活性から成る群から選ばれた生物活性における異常又 はそのリスクの程度を測定又は診断するためのものであることを特徴とする測定 又は診断霞。
PCT/JP2003/011268 2002-09-04 2003-09-03 胚着床制御剤 WO2004022082A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003264378A AU2003264378A1 (en) 2002-09-04 2003-09-03 Embryo implantation inhibitor
US10/526,543 US20060234925A1 (en) 2002-09-04 2003-09-03 Embryo implantation inhibitor
JP2004534145A JPWO2004022082A1 (ja) 2002-09-04 2003-09-03 胚着床制御剤
EP03794212A EP1547609A1 (en) 2002-09-04 2003-09-03 Embryo implantation inhibitor
CA002497497A CA2497497A1 (en) 2002-09-04 2003-09-03 Regulators for implantation

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-259268 2002-09-04
JP2002259268 2002-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004022082A1 true WO2004022082A1 (ja) 2004-03-18

Family

ID=31973064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/011268 WO2004022082A1 (ja) 2002-09-04 2003-09-03 胚着床制御剤

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20060234925A1 (ja)
EP (1) EP1547609A1 (ja)
JP (1) JPWO2004022082A1 (ja)
AU (1) AU2003264378A1 (ja)
CA (1) CA2497497A1 (ja)
WO (1) WO2004022082A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007066708A1 (ja) * 2005-12-07 2007-06-14 Osaka Industrial Promotion Organization Wnt5a／SFRP4シグナル系に基づく硬組織形成誘導

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994004670A1 (en) * 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
WO1997000691A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Modulation of endothelial cell proliferation
WO1998005323A2 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 The Children's Medical Center Corporation Method of regulating the female reproductive system through angiogenesis inhibitors
WO1998058962A1 (en) * 1997-06-23 1998-12-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Prolactin secretion modulator
WO2000047228A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 The Scripps Research Institute Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies
WO2001074841A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-11 The Scripps Research Institute Human aminoacyl-trna synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0790061A1 (en) * 1995-08-28 1997-08-20 Toray Industries, Inc. Fertility agent

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994004670A1 (en) * 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
WO1997000691A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Modulation of endothelial cell proliferation
WO1998005323A2 (en) * 1996-08-02 1998-02-12 The Children's Medical Center Corporation Method of regulating the female reproductive system through angiogenesis inhibitors
WO1998058962A1 (en) * 1997-06-23 1998-12-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Prolactin secretion modulator
WO2000047228A1 (en) * 1999-02-12 2000-08-17 The Scripps Research Institute Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies
WO2001074841A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-11 The Scripps Research Institute Human aminoacyl-trna synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGIOLILLO A.L. ET AL.: "Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo", J. EXP. MED., vol. 182, no. 1, 1995, pages 155 - 162, XP002916077 *
CELLA M. ET AL.: "Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon", NAT. MED., vol. 5, no. 8, 1999, pages 919 - 923, XP002243857 *
FARBER J.M. ET AL.: "Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes", J. LEUKOC. BIOL., vol. 61, no. 3, 1997, pages 246 - 257, XP002048973 *
INNGJERDINGEN M. ET AL.: "Expression and regulation of chemokine receptors in human natural killer cells", BLOOD, vol. 97, no. 2, 2001, pages 367 - 375, XP002974998 *
JINQUAN T. ET AL.: "CXCR3 expression and activation of eosinophils: role of IFN-gamma-inducible protein-10 and monokine induced by IFN-gamma", J. IMMUNOL., vol. 165, no. 3, 2000, pages 1548 - 1556, XP002974999 *
KAI K. ET AL.: "Expression of interferon-gamma-inducible protein-10 in human endometrial stromal cells", MOL. HUM. REPROD., vol. 8, no. 2, February 2002 (2002-02-01), pages 176 - 180, XP002974995 *
LUSTER A.D. ET AL.: "gamma-Interferon transcriptionally regulates an early-response gene containing homology to platelet proteins", NATURE, vol. 315, no. 2, 1985, pages 672 - 676, XP002004832 *
NAGAOKA ET AL.: "Chakushoki no hitsuji shikyunai no okeru IFN-gamma-inducible protein 10kDa (IP10) chemokine no hatsugen to sono kino", JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE GAKUJUTSU SHUKAI KOEN YOSHISHU, vol. 134, no. 73, 20 August 2002 (2002-08-20), XP002974994 *
NAGAOKA ET AL.: "Nishin.chakusho katei no kaimei no mukete", JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE GAKUJUTSU SHUKAI KOEN YOSHISHU, vol. 135, no. 24, 25 March 2003 (2003-03-25), pages 24, XP002974993 *
NAGAOKA K. ET AL.: "A chemokine, interferon(IFN) - gamma-inducible protein 10kDa, is stimulated by IFN-tau and recruits immune cells in the ovine endometrium", BIOL. REPROD., vol. 68, no. 4, April 2003 (2003-04-01), pages 1413 - 1421, XP002974992 *
NAGAOKA K. ET AL.: "Regulation of blastocyst migration, apposition and initial adhesion by a chemokine, interferon gamma-inducible protein 10 kDa (IP-10), during early gestation", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 31, 1 August 2003 (2003-08-01), pages 29048 - 29056, XP002974991 *
REZAIE P. ET AL.: "Expression of beta-chemokines and chemokine receptors in human fetal astrocyte and microglial co-cultures: Potential role of chemokines in the developing CNS", GLIA, vol. 37, no. 1, January 2002 (2002-01-01), pages 64 - 75, XP002974997 *
WOOD GARY W. ET AL.: "Relative role of CSF-1, MCP-1/JE and RANTES in macrophage recruitment during successful pregnancy", MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, vol. 46, no. 1, 1997, pages 62 - 70, XP002974996 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007066708A1 (ja) * 2005-12-07 2007-06-14 Osaka Industrial Promotion Organization Wnt5a／SFRP4シグナル系に基づく硬組織形成誘導

Also Published As

Publication number Publication date
CA2497497A1 (en) 2004-03-18
US20060234925A1 (en) 2006-10-19
JPWO2004022082A1 (ja) 2005-12-22
AU2003264378A1 (en) 2004-03-29
EP1547609A1 (en) 2005-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nagaoka et al. Regulation of blastocyst migration, apposition, and initial adhesion by a chemokine, interferon γ-inducible protein 10 kDa (IP-10), during early gestation
Nevalainen et al. Prolactin and prolactin receptors are expressed and functioning in human prostate.
Yamada et al. Perspectives in mammalian IGFBP-3 biology: local vs. systemic action
JP4486187B2 (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、そのｄｎａおよびそのリガンド
JP4659736B2 (ja) スクリーニング方法
JP2006143745A (ja) 新規なポリペプチド及びそれをコードする核酸
EP1879604B1 (en) Pif tetrapeptides
JPH08511419A (ja) 組成物およびＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体を用いる診断方法
JPH08504577A (ja) ＴＧＦ−βの制御活性を改変するための組成物および方法
WO2004064857A1 (ja) ガレクチン９含有医薬
JP2005527235A (ja) デフェンシン：抗ウイルス剤の使用
WO2004080479A1 (ja) 性腺機能改善剤
De Miguel et al. Ontogeny and localization of an oncostatin M-like protein in the rat testis: its possible role at the start of spermatogenesis
JP2001231578A (ja) Ｉｌ−１ファミリーに属する蛋白質
US7833972B2 (en) Proteins and use thereof
Shiratori et al. Molecular cloning and functional characterization of guinea pig IL-12
WO2004022082A1 (ja) 胚着床制御剤
EP1179540A1 (en) Novel polypeptide
WO2001046415A1 (fr) Polypeptides de type tachykinine et utilisation associee
JP2004073182A (ja) インスリン抵抗性改善剤
US20050074754A1 (en) Novel protein and use thereof
JP4169651B2 (ja) 新規蛋白質およびその用途
JP4346540B2 (ja) 絨毛外栄養膜細胞特異的蛋白質
EP1600165A1 (en) Medicinal use of mip-3alpha inhibitor and method of screening brain/nerve cell protective agent
JP4535670B2 (ja) 新規ポリペプチド、そのｄｎａおよびそれらの用途

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2497497

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004534145

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003264378

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003794212

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003794212

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006234925

Country of ref document: US

Ref document number: 10526543

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10526543

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003794212

Country of ref document: EP