JP2008516260A - プリオンタンパク質結合物質と使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は米国特許出願第10/817,117号(2004年4月2日出願)の一部継続出願であって、予備特許出願第60/460,474号(2003年4月4日)の優先権を主張し、それらの内容は本明細書に参照により組み入れられる。
本発明は、タンパク質結合の分野に関し、さらに詳しくはプリオンタンパク質に結合する物質、および生体サンプルからプリオンを検出または除去するためのプリオンタンパク質結合物質の使用方法に関する。
天然のまたは細胞性プリオンタンパク質「PrPc」は哺乳類動物に広く分布しており、特によく保存されたアミノ酸配列とタンパク質構造とを有する。感染性プリオンは、正常な細胞性(PrPc)プリオンタンパク質の改変型からなると考えられており、「PrPsc」と呼ばれる。プリオンは他の感染性病原体と共通のいくつかの性質を有するが、核酸を含有しないようである。その代わりに、翻訳後のコンフォメーション変化が非感染性PrPcから感染性PrPscへの変換に関与し、その間にαへリックスへリックスがβシートに変換されると提唱されている。PrPcは3つのαへリックスを有し、βシート構造は少ししか有せず;対照的に、PrPscはβシートに富む。PrPcからPrPscへの変換は、伝染性海綿状脳障害(TSE)の発症に至り、その間にPrPscが中枢神経系中に蓄積され、神経病理的変化と神経機能不全とを伴うと考えられている。PrPsc(しばしば、プリオンタンパク質の「スクレーピー」型と呼ばれる)は、動物やヒトのこれらの伝染性神経変性疾患の伝染と病理発生に必要であり、かつおそらく充分であると見なされている。
プリオンタンパク質に結合する物質、およびプリオンタンパク質結合物質(以後「結合物質」)の使用方法が提供される。ある実施形態において結合物質は、プリオンアナライトに選択性と特異性を持って結合するポリマー粒子、好ましくはクロマトグラフィー樹脂である。別の実施形態において結合物質は、プリオン分析質に選択性と特異性を持って結合する無機物質である。結合物質は、細胞性プリオンタンパク質(PrPc)、感染性プリオンタンパク質(PrPsc)、および組換えプリオンタンパク質(PrPr)を含むプリオンタンパク質の1つ以上の型に結合することができる。様々な種(ヒトおよびハムスターを含む)からのプリオンは、結合物質により結合される。クロマトグラフィーカラムのような支持体上に結合物質を含有する組成物も提供される。
プリオンタンパク質に結合する物質と、プリオンタンパク質結合物質を使用する方法とが本明細書に記載される。結合物質は、特異性と親和性を持ってプリオンタンパク質に結合するポリマー物質(例えばクロマトグラフィー樹脂もしくはビーズ)または無機物質(例えば酸化アルミニウム)である。ポリマー物質は、1つ以上の次の官能基:陰性荷電部分;陽性荷電部分;非荷電部分および疎水性部分を含有する。好ましくはポリマー性結合物質は、メタクリレートまたはポリメタクリレートマトリックス骨格に結合した官能基を有する。
用語「a」、「an」および「the」は本明細書において「1つ以上の」を意味すると定義され、文脈から不適切でない場合は複数を含む。
用語「PrPres」は、プロテイナーゼK(PK)によるPrPscの部分分解後に残存する分子量27〜30kDaのPrPscタンパク質のプロテイナーゼ耐性誘導体を意味する。
用語「PrP」は、プリオンタンパク質一般を意味する。
本明細書において用語「サンプル」は、本発明のいくつかの態様および実施形態の方法によってプリオン結合物質と接触させる任意の溶液、懸濁物、抽出物、組成物、調製物、生成物、成分、組織、臓器、細胞、または他の物質を意味する。本発明のいくつかの態様および実施形態のサンプルには、特に限定されないが、生体サンプル、食品、環境サンプル、または水サンプルがある。生体サンプルには特に限定されないが、以下が含まれる:血液由来サンプル;脳由来サンプル;体液、例えば特に限定されないが、血液、血漿、血清、髄液、尿、唾液、ミルク、管液、涙または精液;生体抽出物、例えばコラーゲン抽出物、腺抽出物、または組織ホモジネートもしくは抽出物。生体サンプルは、ヒトまたは動物(特に限定されないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネズミ、またはシカ科(Cervidae)動物由来である。血液由来のサンプルには、特に限定されないが、血小板濃縮物、血漿タンパク質調製物、免疫グロブリン調製物、フィブリノゲン調製物、第XIII因子調製物、トロンビン調製物、第VIII因子調製物、フォンウィルブラント因子調製物、プロテインC調製物、または活性化プロテインC調製物がある。本発明のいくつかの態様および実施形態のサンプルにはまた、特に限定されないが、医薬組成物、治療用組成物、化粧品用組成物および製品、食物、または食品、または栄養補給組成物がある。食品サンプルの例には、特に限定されないが、ゼラチン、ゼリー、ミルク、酪農製品、コラーゲン、または乳児用調製粉乳がある。
本明細書に記載の結合物質は、プリオンタンパク質由来のペプチドまたはポリペプチド、またはプリオン完全分子に結合し、種々の分離法、特に限定されないが、クロマトグラフィー(例えば特に限定されないが、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、およびバッチクロマトグラフィー);固体支持体と膜分離;反応槽分離;磁気分離;免疫分離;およびコロイド分離で使用することができる。ある好適な実施形態において、結合物質はカラム(例えばクロマトグラフィーカラム)に含有され、サンプルはカラム中に導入され、そこを通過して、サンプル中のプリオンタンパク質が結合物質に結合してカラムに保持されるようになる。サンプルの他の成分はカラムを通過し、採取される。本明細書に記載の結合物質の使用は、バッチまたはカラムクロマトグラフィーに限定されないことを理解されたい。プリオンタンパク質を結合させるための結合物質の使用の種々の構成、修飾および変更が企図され、これは本発明の範囲に包含される。かかる変化および修飾には、特に限定されないが以下がある:バッチ法;連続法;移動床クロマトグラフィー法;低、中または高圧法;小、中または大規模な方法。別の実施形態において結合物質は、膜、繊維、ビーズ上にある、不織布メッシュ中に含浸される、繊維をコーティングする、フィルターハウジングに含有されるなどである。
第1の実施形態において結合物質は、無機化合物または成分(例えば特に限定されないが、アルミニウムまたはシリカ)を含む。好ましくはアルミニウムは酸化アルミニウムであり、シリカはヒュームドシリカである。最も好ましくは無機化合物は、Al2O3またはSiO2である。これらの結合物質は、種々の形(特に限定されないが、ビーズまたは樹脂)で提供することができる。結合物質は種々の分離方法で使用でき、クロマトグラフィーカラム、膜、または任意の適当な分離装置もしくは器具中に含有されるかまたはこれらに作り上げられ、またはバッチ法で使用されるか、または任意の分離法で使用され、プリオン結合物質とプリオンとの複合体形成を可能にする条件下で物質にサンプルを接触させることを可能にする。無機化合物を含有する結合物質は、種々の官能基を有することができる。官能基は親水性、例えば陽性荷電、陰性荷電、非荷電または中性、疎水性、両親媒性、またはこれらの組合せである。具体的な官能基は、詳細に後述される。官能基は無機化合物中に本質的に存在するか、または無機化合物は官能基を含むようにさらに修飾することができる。官能基は有機または無機官能基を含む。
第2の実施形態において結合物質は、ポリマー物質または成分を含み、好ましくはポリマーマトリックス(ポリマーマトリックス骨格とも呼ぶ)を含む。場合によっては1つ以上の官能基がポリマーマトリックスに結合される。好適な実施形態においてポリマー物質は樹脂、好ましくはクロマトグラフィー樹脂である。ポリマー性ポリマーマトリックス骨格は好ましくはメタクリレート骨格であり、特に限定されないが市販のTSK(登録商標)およびTOYOPERL(登録商標)またはFRACTOGEL(登録商標)樹脂(Tosoh Bioscience, Montgomeryville, ペンシルバニア州)である。これは特に限定されないが、陽性荷電、陰性荷電、非荷電、疎水性の官能基またはこれらの組合せである。特に好適な官能基は、後に詳述される。
本発明のいくつかの態様と実施形態のプリオン結合物質は官能基を含む。本明細書において用語「官能基」は、分子または物質に特徴的な化学的、物理的または物理化学的挙動を付与する化学基、サブ基またはサブ構造を意味する。本明細書に記載の官能基は、特に限定されないが、親水性(例えば陽性荷電、陰性荷電、または非荷電もしくは中性)または疎水性である。両親媒性または多官能性官能基もまた企図され、本発明の範囲に含まれる。官能基には有機および無機官能基がある。好適な官能基は、アミン、フェニルまたは亜硫酸基がある。好適なアミン基は、1級、2級、3級、または4級アンモニウムイオンであり、例えばジメチルアミノエチル(DMAE)またはトリメチルアミノエチル(TMAE)である。他の官能基の例には、特に限定されないが以下がある:-CH2-CHOH-CH2NH2;-C6H5;-(CH2)3-CH3;-CH2-CH2-N+H(C2H5)2;-SO2-CH2-CF3;-CH2-CH2-N+H(CH3)2;-CH2-CH2-N+(CH3)3;-SO3 2-。さらに、有用な官能基にはスルホニル基とトレシル基がある。
好適な実施形態において結合物質は、表面上に種々の官能基を有する。結合物質の表面上には固有に官能基が存在するか、または当業者に公知の方法により結合物質の表面に官能基を付加できることを理解されたい。種々の基または化合物を種々の表面に結合させる方法は公知であり、文献に多く例示されている。
好ましくは結合物質は1つ以上の以下の市販のクロマトグラフィー樹脂である:FRACTOGEL(登録商標)EMD;TOYOPEARL(登録商標)アミノ、ブチル、フェニル、またはAF-トレシル;またはTSK-GEL(登録商標)アミノ、フェニルまたはDEAE樹脂。さらに好ましくは結合物質には、特に限定されないが、以下がある:FRACTOGEL(登録商標)EMD TMAE、FRACTOGEL(登録商標)EMD SO3 2-、FRACTOGEL(登録商標)EMD DMAE、TOYOPEARL(登録商標)アミノ、TSK-GEL(登録商標)アミノ、TSK-GEL(登録商標)フェニル、TSK-GEL(登録商標)DEAE、TOYOPEARL(登録商標)ブチル、TOYOPEARL(登録商標)フェニル、酸化アルミニウム、TOYOPEARL(登録商標)AF-トレシル、およびシリカ樹脂。最も好適な実施形態において結合物質は、TOYOPEARL(登録商標)アミノ、TSK-GEL(登録商標)フェニル、またはFRACTOGEL(登録商標)EMD SO3 2-である。他の市販のクロマトグラフィー樹脂と支持体(無機支持体を含む)の使用が企図され、本発明の範囲に含まれる。
上記結合物質以外に、さらなる結合物質を以下のように同定することができる。プリオンアナライトへの結合能力について、結合物質をスクリーニングする。本明細書において用語「アナライト」は、多数の分子(特に限定されないが、タンパク質、多糖、および任意の凝集物、またはこれらの組合せを含む)を意味する。結合物質をプリオンタンパク質を含有することが公知のサンプルとインキュベートし、結合しなかったタンパク質を除去し、結合したタンパク質をプリオンタンパク質に特異的な標識抗体などの従来の方法を使用して検出する。アナライトが結合した結合物質を適当な結合物質として同定する。1次または2次抗体の無い対照も、非特異結合物質を排除するために使用する。
プリオンタンパク質またはプリオンタンパク質の断片に結合する結合物質は、種々の分析、調製、および診断上の応用に有用である。ある実施形態において結合物質は、サンプルからのプリオンタンパク質またはペプチドに結合し除去するために使用できるビーズまたは膜の形の固相、または固体表面を含有する。結合物質を、プリオン結合物質複合体の形成を引き起こすのに充分な条件下でサンプル(例えば生体液)と接触させると、サンプル中のプリオンタンパク質は結合物質に結合する。次に結合物質をサンプルから分離し、こうしてリガンドに結合したプリオンタンパク質はサンプルから除去される。タンパク質に結合するためのビーズや膜の使用法は当該分野で公知であり、例えばBaumbachらの米国特許第5,834,318号およびPCT/US01/11150に記載されている。
他の実施形態において、特定のプリオン物質のみがサンプルから除去される。例えば感染性プリオン(PrPsc)のみがサンプルから除去されるか、または非感染性プリオン(PrPc)のみがサンプルから除去される。本明細書に記載の重要な発見は、異なるプリオン特異性を有する多数の結合物質の同定である。表4は、ハムスターおよびヒトの非感染性および感染性プリオンに対するいくつかの結合物質とその特異性を示す。ヒトPrPscの選択的除去のための好適な結合物質はアミノ基、例えばTOYOPEARL(登録商標)アミノ-650MまたはTSK-GEL(登録商標)アミノ750Cクロマトグラフィー樹脂またはその機能性同等物に含有されるアミノ基を含有するか、またはフェニル基、例えばTSK-GEL(登録商標)フェニル-5PWまたは機能性同等物に含有されるフェニル基を含有する。
本明細書に記載の結合物質はまた、生体サンプルまたは環境サンプル中のプリオンタンパク質またはペプチドの存在を検出または定量する方法において有用である。プリオンタンパク質が検出される生体サンプルには、特に限定されないが、全血、血液由来組成物もしくは成分、血清、髄液、尿、唾液、ミルク、管液、涙、精液、脳由来組成物、糞便、またはコラーゲンの抽出物、腺、組織(例えば扁桃または虫垂)、または臓器がある。定性的および定量的方法の両方が企図され、本発明のいくつかの態様と実施形態の範囲に含まれる。
結合物質−プリオン複合体、または代わりに、プリオンもしくは結合物質−プリオン複合体に対する抗体は、当業者に公知の任意の多くの方法の任意のものを用いて検出および定量することができる。これらには、特に限定されないが、分析的生化学的方法(例えば分光法、放射線写真法、電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高分散クロマトグラフィーなど)、および種々の免疫学的方法(例えば、特に限定されないが、流体またはゲル沈降反応、免疫拡散法(一重または二重)、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイなど)がある。
サンプルのプリオンタンパク質の検出のためのアッセイの成分として固体支持体を使用する時、固体支持体への非特異的結合を低下させることが好ましいことがしばしばあることを当業者は理解するであろう。かかる非特異的結合を低下させる手段は当業者に公知である。代表的にはこれは、固体支持体をタンパク質性組成物で被覆することを含む。特に、ウシ血清アルブミン(BSA)やヒト血清アルブミン、およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広く使用される。
後述するように正常なハムスター脳ホモジネートを使用して、NBT/BCIPクロモゲン(ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-1-ホスフェート-p-トルイジン塩)によりビーズ上プリオン結合試験を使用して、80個のポリマーまたは無機粒子を試験した。結合結果を表1に示すが、ここで「-」は結合無し、「+」は結合有りを示す。粒子評価において「+」が多いほど、強い結合が観察されたことを示す。「++」以上の結合結果を有する12個の粒子をさらに評価した。表2は、正常なハムスタープリオンに結合する12個の粒子の能力を要約する。スコアが大きいほど、プリオン結合量が多いことを示す。
1 DAP:ジアミノプロパン
2 DAB:ジアミノブタン
3 TETA:トリエチレンテトラミン
4 Amberchom(登録商標)は、Rohm and Haas Company(ペンシルバニア州フィラデルフィア)の登録商標である。
** PMMA:ポリマー性メタクリレート
NBT/BCIPによるビーズ上プリオン結合試験は以下のように行った。10%ハムスター脳ホモジネートからの正常なPrPで開始する時、サンプルを0.5% Sarkosyl(200μlの10%を4mlの脳に)で攪拌器上で室温で30分可溶化した。サンプルを14,000rpmで5分間遠心分離した。上清を取りだし、所望の培地中で上清の希釈物を作った。96ウェルマイクロタイタープレート(カタログ番号3075、Becton Dickinson、Franklin lanes, NJ)とMillipore MultiScreen-DVプレート(カタログ番号MADV N65 10, Millipore Corporation, Bedford, MA)を、まずPierce(Rockford, IL)の200μl/ウェルの1%(w/v)カゼインを用いて65℃で1時間ブロックした。10ミリグラム(mg)の乾燥ビーズを1mlの10mM PBS(pH7.4)中で膨潤させ、2回洗浄した。マイクロタイタープレートを空にし、各ウェルに20〜30μlの膨潤ビーズの懸濁物を加えた。懸濁物を沈降させ、過剰の水を除去した。
プリオン結合物質の同定は、ハムスター脳ホモジネートをバッチフォーマットで使用して、2つの異なる検出系を使用して行った。最初の方法では、物質に結合したプリオンの量を、標的物質とインキュベーション後にビーズを染色して検出した。第2の方法は、SDS-PAGEとウェスタンブロットを使用して、フロースルーと洗浄サンプル中に含有される非結合画分中に存在するプリオンの量を検出した。各方法の詳細な説明を以下に示す。
ビーズ上検出法については、96ウェルマイクロタイタープレート(カタログ番号3075、Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lanes, NJ)とMillipore Multiscreen-DVプレート(カタログ番号MADV N65 10、Millipore, Bedford, MA)を、200μl/ウェルの1%(w/v)カゼインで65℃で1時間ブロックした。各ポリマーの10mgのアリコートを1mlの10mM PBS(pH7.4)中に浸漬し、2回洗浄した。マイクロタイタープレートから水を切り、20〜30μlの樹脂の懸濁物を各ウェルに加えた。樹脂を沈降させ、過剰の溶液を除去した。樹脂に5%ヒト血清アルブミン中の正常なハムスター脳ホモジネートの1:10溶液の150μlを加えた。混合物を室温で1.5時間インキュベートした。ウェルから水を切り、1%カゼイン中の100μlの3F4抗体(1:4,000)を各ウェルに加え、冷蔵温度で静かに攪拌しながら一晩インキュベートした。次にビーズを10mM PBS+10μM CuCl2(pH7.4)で2回、次に100μl/ウェルの第2抗体である抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート(#A3688、Sigma, St. Louis, MO)を添加し、静かに攪拌しながら室温で1時間インキュベートした。
プリオン結合特異性の測定
一般に、異なる結合物質からなる湿潤ビーズを、個々のディスポーザブルカラムに定量的に入れた。カラムは、ビーズを保持するのに充分小さいが抗原添加(challenge)溶液のフロースルーを可能にするのに充分大きいフリット(frit)を含有した。抗原添加溶液は、赤血球濃縮液混合物中に加えたSarkosyl(Sigma)中のプリオン含有脳ホモジネートであった。さらに詳しくは抗原添加溶液は、TSE感染性ヒト脳ホモジネート、感染性ハムスター脳ホモジネート、非感染性ヒト脳ホモジネート、または非感染性ハムスター脳ホモジネートを含有していた。抗原添加溶液を一定時間、標的結合物質を通過させる一方、そのフロースルーを集めた。次にビーズをすすぎ洗い、それらのカラムから定量的に採取バイアルに移し、そこから、特異的プリオン結合と非特異的タンパク質結合を測定する以後の処理のために、既知量を取った。フロースルー溶液と反応したビーズの残りもまた、将来あるかも知れない分析のために保存した。
乾燥ビーズの調製
20%メタノール水溶液でビーズを湿潤させて、乾燥ビーズをまとめて調製した。使用前少なくとも24時間ビーズを放置した。乾燥ビーズの元々の量が0.5g〜2.5gである時、あらかじめ湿潤させたビーズスラリーを50mlのプラスチック円錐管に移した。過剰の液体を取り出し除去し、20%メタノール25mlを加えた。次にサンプルを30秒間静かに振盪または転倒させた。元々のビーズ重量が上記範囲外である時、0.5g未満の樹脂についてはメタノールの容量を10ml、そして2.5〜4.0gについては40mlを使用して調整した。ビーズを重力により約12〜15分間、またはほとんどのビーズがチューブの底に来るまで沈降させた。上清溶液(微粉を含む)を注意深く取り出し除去した。メタノールによるすすぎ洗いを再度繰り返し、次に20%メタノールを加えて、1:1(v/v)ビーズスラリーを作成した。ビーズを4℃で保存した。
440μlのビーズスラリーを15mlのプラスチック円錐管(使用したカラム当たり220μlの湿潤ビーズ)に移し、10mlのワーキングバッファー(20mM クエン酸バッファー/140mM NaCl、pH7.0)を加えた。サンプルを30秒間静かに振盪または転倒させた。ビーズを重力により約12〜15分間、またはほとんどのビーズがチューブの底に来るまで沈降させた。上清溶液(微粉を含む)を注意深く取り出し除去した。ワーキングバッファーによるすすぎ洗いをさらに2回繰り返し、次に充分量のワーキングバッファーを加えて、1:1容量比を作成した。サンプルを再度30秒間静かに振盪または転倒させ、室温で一晩放置した。必要であればワーキングバッファーを加えてワーキングバッファーの容量を1:1に維持し、水和したビーズをバッファーで4℃で、使用するまで保存した。
アミノToyopearl(登録商標)と他のビーズを20%エタノール中の湿潤スラリーとして得た。追加の水和工程は必要が無かった。しかしワーキングバッファーへの平衡化を以下のように行った。製造業者は市販のスラリーが約72%容量の樹脂を含有すると予測し、カラム当たり300μlのスラリーを使用した。ビーズを15mlのプラスチックチューブ(例えばFalcon)に移し、10mlのワーキングバッファーを加えた。サンプルを30秒間静かに振盪または転倒させた。ビーズを重力により約12〜15分間、またはほとんどのビーズがチューブの底に来るまで沈降させた。上清溶液(微粉を含む)を注意深く取り出し除去した。ワーキングバッファーによるすすぎ洗いをさらに2回繰り返し、次に充分量のワーキングバッファーを加えて、1:1容量比とした。サンプルを再度30秒間静かに振盪または転倒させ、室温で一晩放置した。必要であればワーキングバッファーを加えてワーキングバッファーの容量を1:1に維持し、水和したビーズをバッファーで4℃で、使用するまで保存した。
110mlのAdsol(登録商標)のバッグ(Baxter, Bloomington, IN)を、約250〜300mlのRBCと残存する白血球と血小板とを含有する赤血球濃縮液(RBC)の250mlバッグに加えた。得られるヘマトクリット(赤血球(RBC)の容量/総量)は約50〜55%であった。Adsol(登録商標):CPD(クエン酸リン酸デキストロース)およびRBCを転倒混和した。次に混合物を採取から8時間以内に室温でPall 白血球減少フィルター(Pall Corporation, East Hills, NY)に通し、新しいバッグに入れた。この操作は、RBC混合物中の白血球の数を低下させた。白血球ろ過したRBCを新しいバッグ中で4℃で42日間保持した。この調製物中のバッファー混合物の最終組成は、30.6% Adsol/8.5% CPD(v:v)であった。使用前に、遠心分離後の上清を415nmで吸光度を測定して、RBC調製物の溶血パーセントをチェックした。調製直後に得られた溶血値より2%以上多い溶血のあったRBC調製物は使用しなかった。
Maryland大学のRobert Rohwer博士と共同研究者により、彼らが確立した方法に従って、正常なハムスター脳ホモジネート(10%(w/v))が調製された。1.8ml容量でアリコートを調製し、使用するまで−80℃または液体窒素で凍結して維持した。あるいは、これらをアリコート作業のために1度解凍した。各実験でカラム当たり60μlの脳ホモジネートを使用した。
空の各カラムに、750μlの0.1%ツイーン(登録商標)20を加えた。次に各カラムに1mlの20%エタノール(v:v)を加え、重力で流した。さらに2×1mlの脱気した脱イオン水を各カラムに加えてエタノール溶液を洗い出し、フリット中に捕捉されている空気を除去した。定量的ピペッターを使用して、400μlの水和ビーズ懸濁物をカラムに移した。過剰のワーキングバッファーを移した湿潤ビーズ中を重力で流れさせ、次にカラムを1mlのワーキングバッファーで3回洗浄後、サンプルを導入した。
シリンジと18ゲージ(またはそれ以上)の針を使用して、540μl RBC/カラムをポリプロピレン円錐管に入れた。円錐管を3,000rpmで10分間遠心分離して、Adsol(登録商標)層を上に分離した。Adsol(登録商標)層の上に60μlの10%処理脳ホモジネートを加え、こうしてRBC調製物と高濃縮添加物質、すなわち脳ホモジネートとSarkosyl試薬との直接接触を減らした。共混合物を転倒混和し、湿潤氷上に維持し、調製して4時間以内に使用した。カラムアッセイで使用する前に、混合物を10分間室温に戻した。
すべてのカラムにいったん水和ビーズを充填すると、抗原添加溶液を混合し、非常に注意深く0.5ml/カラムの容量でビーズ上に重層した。溶液を重力によりカラムを流した。総フロー時間は約5〜20分間であった。
各カラムに0.75mlのワーキングバッファーを加えた。ピペットを使用してカラムをフラッシュしてビーズを懸濁し、懸濁物をすばやく目盛り付チューブに移した。ビーズ懸濁物をチューブ中で沈降させ、ビーズ層を乱すことなくできるだけ多くの上清を取りだした。次に上清を同じカラムに戻し、上記工程を2回繰り返して、残存するビーズをカラムからチューブに移した。次にビーズを10分間重力により沈降させ、目盛り付チューブ中のビーズ層の容量を記録した。
まず各チューブ中のワーキングバッファーのレベルを1mlに調整し、チューブを静かにボルテックス混合してビーズの懸濁物を作製した。ピペットを使用して500μlの懸濁物を取り出し、小エッペンドルフ(登録商標)(Brinkmann instruments, Westbury, NY)マイクロフュージ管に移した。懸濁物を10分間沈降させ、沈降したビーズの容量を100μlに調整した。次に、移したビーズを遠心分離し、上清を除去した。直ちにビーズアリコートを、電気泳動とウェスタンブロット解析のために調製した。
沈降したビーズの容量と膨潤比に基づき、以下のように乾燥重量を算出した:
ビーズの乾燥重量=沈降した容量/膨潤比
膨潤比=水和ビーズ容量(μl)/乾燥重量(mg)
Toyopearl(登録商標)について42.5mg乾燥重量=20%メタノール中の200μl湿潤ビーズ
膨潤比(20%メタノール中)=200/42.5=4.71
実施例4 ウェスタンブロット解析
赤血球濃縮物(RBC)中に加えた脳ホモジネートの溶液から回収したまたは成分が減少した感染性および非感染性プリオンタンパク質の評価を可能にするために、以下のウェスタンブロット法を計画した。これらの方法は、実施例3で上記したカラムプリオン結合アッセイから得られたサンプル(抗原添加溶液に暴露したビーズのサンプルとカラムを流れ出て採取された抗原添加溶液のサンプルを含む)に適用された。
以下の工程は好ましくは、実施例3のカラムアッセイの直後に行われる。
12%のビストリスNuPAGE SDS-PAGEゲルに上記サンプルを添加後、ゲルを200Vの一定電圧で45分間電気泳動し、エレクトロブロットトランスファー法を行った。次に、タンパク質を移した膜をFisher Square Dish中に入れ、振盪台の上で室温で25mlのWestern Breezeブロッキング剤(12.5mlの水、5mlの希釈液A、および7.5mlの希釈液B)中で1時間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨てた。
膜を乾燥トレイに移し、5mlのWestern Breezeを前混合した化学発光基質(CDP Star(登録商標)基質、Applied Biosystems, Foster City, CA)に静かに攪拌しながら5分間浸漬した。ペーパータオルで軽く膜の水気を取り、次にシートプロテクターに入れた。次に膜をシートプロテクター中でフィルムカセット(強化スクリーンは無し)に移して室温で30分間保持し、室温で5分間オートラジオグラフィーに暴露した。
内因性の、PrPcをスパイクしていないヒト血漿からPrPcを除去するプリオン結合樹脂の能力を証明するために、以下の実験を行った。
実験結果は、ヒト血漿からの内因性PrPcに結合する樹脂の能力を証明し、従ってヒトまたは動物から得られたサンプルのPrPの除去について、樹脂が有用であるという証拠を提供している。
図1に示すように、Toyopearl(登録商標)アミノ650-M樹脂はヒト血漿からの内因性PrPcに結合した。この樹脂の少なくとも一部は、Tosoh(登録商標)に独自のスペーサーアームまたは基を含有した。PrPc結合のためのスペーサーの重要性を調べた。
種々のタンパク質を含有する治療用製品からPrPを除去する樹脂の能力を証明するために、ヒト血清アルブミンの存在下でのPrPcの結合を調べた。
カラムI−ワーキングバッファー中の1%nHaBH(正常なハムスター脳ホモジネート)、
カラムII−ワーキングバッファー中の1%HaBH、25%HSA(Sigma)、
カラムIII−ワーキングバッファー中の1%HaBH、25%HSA(Sigma)および20mM N-Ac-Trp(Acros Organics、ベルギー)、
カラムIV−1% HaBH、アメリカ赤十字調製物(ARC prep)。
アルブミンに添加した感染性PrPscの結合が以下の実験で証明された。12個のPIKSIカラム(各0.5ml)に、Toyopearl(登録商標)アミノ650M樹脂を充填した。2mlの10%SBH(スクレーピー脳ホモジネート)を0.5% Sarkosylで処理した。
目的
本研究は、PRDT(Pathogen Removal and Detection Technologies)社が選択した樹脂フォーマットにより得られる伝染性海綿状脳症感染性除去のレベルを評価するために実施した。樹脂に対する抗原添加は、ハムスタースクレーピー脳ホモジネートをスパイクした低白血球濃度のヒト赤血球濃縮物のユニットで行った。
伝染性海綿状脳症(TSE)感染性は、いくつかの研究室において実験および自然感染した動物の血液で実証されている。BREF/UMは、263K株のスクレーピーに感染したハムスター全血液の1ミリリットル当たり4〜20 ID(感染用量)の感染性を一貫してかつ再現性良く測定している。さらに、vCJD(TSEのヒト型)の血液によるヒトからヒトへの伝染の疑われる2例が既に報じられている。これらの結果は、ヒトへの血液および血液製品によるTSE伝染の潜在的リスクについて問題を提起した。TSE作用物質は通常の病原体不活性化手順に対して耐性がありかつ感受性のある前臨床TSE診断試験が存在しないので、TSE作用物質の除去が血液によるTSE伝染に対する最も有望な解決法である。
実験設計
樹脂適合性
予備研究において、最初に各樹脂候補をRBCC機能と安定性に対する現行規格との適合性について試験した。全ての樹脂はRBCCについて適合性があることがわかったのでTSE感染性除去研究に用いた。一実施形態においては、PRDT樹脂を直列の2カラムを用いて試験した。各カラム(またはデバイス)はほぼ10mLの樹脂を含有した。直列のカラムを用いた理論的根拠は、除去のタイプを確認して推計学的または選択的捕捉機構の間の区別をすることにあった。推計学的機構では、樹脂が飽和条件下でない限り、第2デバイスはさらなる感染性を除去する。選択的機構では、第2のデバイスはさらなる感染性を除去しない。
1) ハムスタースクレーピー脳ホモジネートは高力価を有し、スパイク物質を何倍にも希釈しなければならないスパイクの研究にとって理想的であること、
2) ハムスターモデルは、色々なTSE株の実験モデルのなかで、潜伏時間が最も短いものの1つであること、
3) 選択されるリガンドは既にハムスタースクレーピー脳ホモジネートからのPrPresの結合について選択されていること、および
4) ハムスターモデルは本発明者らの研究室においてよく確立されており、大量のスパイク物質を容易に調製できること。
理論的は樹脂容量の計算を感染性研究後に実施した。一般に、研究に用いた樹脂は、理論的に、樹脂1グラム(膨潤樹脂4.7ml)当たり30〜40mgのタンパク質と結合することができる。この容量は、抗原添加において全合計(PrPc+PrPres)と結合するように選んだものである。しかしこの容量は理想的挙動を有するタンパク質(例えば、樹脂ビーズ孔の内部/外部に分配する)に対して計算された。PrPは理想的なタンパク質でなく、抗原添加の際に界面活性剤処理後ですら、様々な次元のサイズをもつかまたは他のタンパク質と複合した凝集形態で存在する。また、PrPはビーズ孔に貫入しないで樹脂ビーズの表面と結合するだけであることも示されている。この制限にも関わらず、50mLの樹脂(組み合わせた5つのデバイスの全体積)は抗原添加物中の全PrPと結合するのに十分であることが見出された。
血液プール
10ユニットのヒトRBCCをARC(オランダ研究室)にて採取し、当技術分野で公知の標準手順に従いPallフィルター上で白血球濾過を行った。バッグ中の血液は、実験前日に研究室に輸送し、一晩4℃にて冷蔵庫で保存した。実験日に、血液を大きい血液バッグ中にプールした。全ての希釈と体積測定は重量基準で行い、RBCCの密度として1.06g/mLを用いて体積に変換した。
スパイクしてない血液プールのアリコートを取出し、力価測定用連続希釈物を調製する希釈剤として使用した。PRDTスクレーピー脳ホモジネート(SBH)プールのアリコートを0.5%Sarkosylを用いて30分間氷上で処理した。そのサンプルを遠心分離し、上清「Sarkosyl処理した10%SBH」を取出して血液プールとゆっくり混合した。スパイクの体積を血液重量に基づいて計算し、血液中の最終濃度0.1%w/vに調製した(10%SBHの1:100希釈)。スパイクした血液を注意深く混合した後、血液プールバッグを予め準備したマニホールドに結合して、スパイクした血液を10個の血液バッグにそれぞれほぼ1ユニットづつ再分配した。移動は重力により行い、充填するバッグを秤の上に置いて重量を監視した。ほぼ1ユニット重量の血液を各バッグ中に移動し、最終重量を抗原添加1として記録した。スパイクした血液のアリコートを取り出して力価測定した。
スパイクしたRBCCを含有する血液バッグを予め準備した濾過装置と結合した。各濾過装置は直列の同じ樹脂(1カラム当たりほぼ10mL樹脂)の5つのカラムおよび各濾過からのフロースルーを採取する5つの血液バッグを含有する。血液バッグは吊るされ、カラムはフローに垂直に固定され、そして受器バッグはある表面上に平たく置かれた。濾過は、カラムの直ぐ上と下に置かれた2つのクランプを緩めることにより開始した。各カラムの濾過の時間を測りバッグとカラムの間の高さを記録した。カラムと受器の間の距離は全ての濾過装置に対して同じであることに注意しなければならない。いくつかの事例においては、濾過中、血液バッグとカラムの間の高さを減少するかまたは増加して流速を調節した。各カラムの濾過後に受器バッグを秤量し、フロースルーのアリコートを取出してバッグを再び秤量し、そして次の濾過に備えた。
各濾過の後、カラムを装置の残部から取り外して傍らに置き、続いて樹脂を取出す。バッファーをゆっくりとカラム中に溜めて樹脂が出てくるのを待つと、各カラムからほぼ60mLのバッファーに全10mLの樹脂を採取することができた。ほぼ3〜5mLの樹脂を使い捨てクロマトグラフィカラムへ移してクエン酸バッファーを用いて洗浄した。残りの樹脂は廃棄した。
樹脂をPrPresの捕捉についてウェスタンブロットにより分析した。その結果は、SYA、アミノ650M、DVR、YVHEAおよび(D)ES(nal)PRQ-EacaがPrPresを検出限界まで第2カラムによって除去したことを示した。言い換えると、第3、第4および第5カラムと結合したPrPresシグナルは検出されなかった。
力価測定のための、樹脂およびフロースルーの選択
樹脂結合したPrPresのウェスタンブロット結果に基づいて、5種のリガンドが第3カラム後に検出限界までPrPresを除去したことを見出した。これらの5種のリガンドは、DVR、アミノ650M、SYA、YVHEAおよび(D)ES(nal)PRQ-Eacaであった。これらの5種のリガンドの感染性除去を、対照としてTMAEおよびアセチル化SYA樹脂と一緒に実施した。研究における動物の全数を減らすために、フロースルー溶液の全てを力価測定しなかった。ウェスタンブロット結果に基づいて、カラム2のPrPresシグナルが強くて全PrPresおよびおそらくは感染性がカラム1により除去されないことを示したので、フロースルー#1は廃棄した。選ばれて試験したフロースルー溶液は2と5であった。フロースルー溶液2を選んだ理由は、全事例(対照を除く)において、カラム3がほとんどシグナルを示さず、フロースルー2における有意なPrPresの濃度低下を示したからである。フロースルー溶液5を選んだ理由は、全感染性を除去する最良の機会を有するからであった。後の研究において、フロースルー溶液3および4も力価測定した。しかし、本報告は最初の感染性研究だけに関するものである。
フロースルー溶液の力価測定は潜伏時間法を用いて実施した。本方法は2つの近い力価(2-log10以下)の間を区別するには十分正確でないが、3-log10以上異なる力価の感染性に対しては理想的であって、その理由は、さらに正確な終点力価測定法よりも迅速でありかつ少ない動物しか必要としないからである。本研究の目標は、3-log10以上の感染性を除去する樹脂を選択することにあったので、潜伏時間法が正しい選択であると決定した。潜伏時間はハムスター中に接種した感染性の用量と逆比例する。この関係は感染性の用量の高さに対して直線的でありかつその直線性は低用量の感染性では低下して外れる。スパイクしなかったRBCC中に希釈されたスパイクしたRBCCプールの2つの独立した10倍希釈シリーズ(全脳に対して相対的に10-3〜10-11)を力価測定して、潜伏時間に基づく2つの用量応答曲線を作成した。
同じ実験において、10%スクレーピー脳ホモジネートならびにSarkosyl上清を終点力価測定法により力価測定した。これらの力価測定を加えた理論的根拠は、PRDTのSBHプールの出発力価およびRBCCなしの実スパイクの力価の正確な測定値を得ることにあった。
フロースルー溶液は無希釈で接種した。2かごの動物(8ハムスター)にフロースルー溶液を、そして4かごの動物(16ハムスター)に抗原添加溶液を接種した。アミノ樹脂によるフロースルー2を4かご(16ハムスター)に接種した。独立した希釈シリーズの用量応答曲線を調製した。2かごの動物をそれぞれ、10-3で開始して10-11までの希釈(希釈は、全脳を100希釈と呼ぶ)で接種した。SBHおよびSarkosyl SBHの力価測定については、1かごの動物を10-1〜10-11の希釈で接種した。
従来の研究はスクレーピーを患う動物が疾患の進行とともに体重を失うことを示していた。この判定基準を潜伏時間の終点を決定するために用いることに決めた。潜伏時間の終点は、動物がその最大体重の80%に低下する日として設定した。この方法の利点は偏りがなくかつ人的誤差を受けないことにある。各動物を毎週1回、そして疾患の最初のサインが出ると毎週2回体重測定して体重を記録し、そして各動物の接種後の日数に対してプロットした。フロースルー溶液を接種した各動物と標準曲線の動物に対する最終潜伏時間は「最大の80%」の標題の最終列で合体される。「PI日数」と「最大の80%」のもとで記録された接種後日数は常に整合するわけではない、その理由は、いくつかの動物は最大体重の80%に低下した日に犠牲になるわけではなく、数日遅くなるからである。しかし、動物は目標体重に到達する前に犠牲になることはなかった。「最大の80%」列の接種後日数は体重表から決定し、動物が目標体重に到達した最初の日を示した。これらの数字の平均値および標準偏差も測定して以下の表6に示した。
フロースルー溶液を接種した動物は接種後239日以内に死亡した。終点力価測定はまだ進行中であり、365日まで継続してSBHの正確な力価は決定する予定である。しかし、これらの残りの動物の体重測定はもう行わなかった。介入性死亡はなく、7動物は接種後最初の2週間内に血液毒性が原因で死亡した。これらの動物は最終の力価計算から除外した。
計算と結果
終点力価測定
SBHの力価の計算はReedおよびMuenchの方法を用いて1gの脳に対して実施した。終点力価測定法において、4データセットを作製した:標準曲線2セット、10%SBHの希釈1セットおよびSarkosyl処理後の10%SBH上清の希釈1セット。後者はRBCC中の実スパイクである。表7は力価測定結果を表にまとめものである。PRDT 10% SBHプールの力価は109.18 ID/mLである。Sarkosyl処理および不溶性ペレットの除去後に、力価は108.10 ID/mLまで低下し、ほぼ1-logの感染性(90%)が可溶化手順に関わらず遠心分離により除去されたことを示す。二重で実施した抗原添加溶液(0.1% SBH)の力価測定は完全に整合し、力価は両方とも106.72 ID/mLであった。この力価は、バッファーに100倍希釈して0.1%(108.1/100=106.1)としたSarkosyl処理したSBHの計算力価より僅かに高い。何によってこの差を生じうるのかは明らかでない。
潜伏時間力価測定
潜伏時間力価測定においては、希釈のlog10値を用いた。用量応答曲線は、抗原添加の各希釈10-3〜10-8に対する実験潜伏時間を用いて作成した。表6に報じた2つの曲線間の平均値を平均化した(表8)。
表8の値に最も適合した曲線を引き、それを式:
y=a+b(-x/c)
[式中、a、bおよびcは報じられた値をもつ定数であり、yは全脳に対する希釈であり(すなわち0.1%SBHは10-3全脳希釈である)そしてxは潜伏時間である]の指数曲線に対応させた。フロースルー潜伏時間の平均および標準偏差は表9に報じた。それぞれの潜伏時間に対応する希釈は上記式を用いて計算した。除去は各フロースルーの希釈と抗原添加の希釈との間の差として計算した。
結論
本研究は、有効なTSE除去についての2次スクリーニングから選択したリガンドのなかに、最良のPRDTリガンドを同定した。2次スクリーニングがPrPresの捕捉と除去を実証した一方、本研究は上記リガンドがRBCC中にスパイクされた感染性を除去することを確認した。これらの樹脂は研究の目標を達成し、ほとんどのリガンドが脳由来の感染性の3-log10超を除去する一方、アミノ650MおよびSYAはほぼ4-log10を除去した。さらにこの除去は特異的であり、また、ネガティブ対照リガンドが感染性を除去しなかったので、大きい凝集物のサイズ排除によるものでなかった。データはまた、上記リガンドが抗原添加物中に存在する全ての感染性を除去しないことも示した。これは極く高濃度の感染性を用いて抗原添加したので、当然のことである。ReedおよびMuenchの方法により測定した力価に基づいて、樹脂を106.72 ID/mLまで暴露したが、これはTSEに感染したげっ歯類モデルの血液で測定した感染性のレベル(10 ID/mL)より100,000倍高かった。
アミノ650Uはアミノ650Mを含む異なるビーズサイズの混合物であって、650Mを製造するより安価である。アミノ650Uを内因性PrP、および現在使用している全てのマトリックス、すなわちバッファー、濾過血漿および全血液中のPrPscと結合する能力について試験して、スパイクした全血液を用いて抗原添加したアミノ650Mとの結合と比較した。実験は、スパイクしたバッファー、血漿、および全血液中のPrPscのアミノ650Uとの結合を比較し、かつ血漿および全血液中の内因性PrPcのアミノ650Uとの結合を確立するように設計した。さらに、実験は、PrPcの除去における白血球濾過の効果を定量するように設計した。
比較結合実験を、一連の樹脂(例えば、AMN-13、14、15、16、および17、アミノ650Mおよびアミノ650U)について実施した。上記樹脂はスパイクしたバッファー、血漿、および全血液由来のPrPscと結合した。その結果は、スパイクしたバッファーおよびスパイクした全血液の両方を用いて抗原添加したときに、全てのAMN樹脂が等しくよく結合することを実証した。さらに、AMN樹脂によるシグナルはアミノ650Mおよび650Uによるシグナルと同じであった。スパイクした血漿由来のPrPの樹脂結合を比較すると、全ての他の樹脂と比較して、アミノ650Mから若干より強いシグナルがあった。AMN樹脂のなかで、#13は弱いPrPシグナルを有すると思われたが、アミノ650Uと非常に比較しうるものである一方、#15、16、17は全てアミノ650Uより優れた性能を有した。AMN14、15、16、17樹脂の間には認めうる相違は観察されなかった。
樹脂に包埋されカレンダーされた膜を用いる新しいデバイスの開発によって、結合したタンパク質を樹脂から抽出する新手法を開発する必要が生じた。物質の取扱い、ならびに抽出液の組成、濃度および体積に変更を加えなければならなかった。実験はまた、Toyopearlアミノ650Mおよびそのアセチル化型の両方の包埋膜を用いる、新しいフォーマットにおける結合評価も行うように設計した。
スパイクしたバッファー、濾過血漿、および全血液由来のPrPresのD4樹脂との結合と内因性PrPcのD4との結合を比較する実験を実施した。スパイクしたRBCC(UM-R-T-SE-180603)を用いて試験したPrometicのミメチック樹脂のなかで、D4はPrPscと最良の結合を示した。この樹脂を内因性感染性研究に使用した。スパイクした脳由来のPrPresのD4との結合性能を、血漿、全血液、および対照としてのバッファーの存在のもとで試験した。この試験はまた、血漿または全血液中の内因性PrPc単独を用いて、D4に抗原添加もした。
本研究は、アミノ650Mのアセチル化がPrPresとの結合に与える効果を比較した。色々なレベルのアセチル化を、(1)全アセチル化と非アセチル化樹脂のブレンドを用いて、および(2)同じビーズに対する部分的化学反応により実施した。結果は、樹脂が化学反応による20%アセチル化に耐えることができ、そしてさらにPrPと結合することを示した。さらに、アセチル化樹脂の50%混合物のブレンドもPrPと結合することができる。
Claims (20)
- プリオンタンパク質とポリマー性プリオンタンパク質結合物質の結合を可能にする条件下でサンプルにポリマー性プリオンタンパク質結合物質を接触させることを含んでなる、サンプル中のプリオンタンパク質を検出しかつ分離する方法であって、上記ポリマー性プリオンタンパク質結合物質は官能基と結合したマトリックスを含み、そして上記官能基は親水性、疎水性、または両親媒性官能基を含むことを特徴とする上記方法。
- 上記官能基が陽性荷電の基、陰性荷電の基または非荷電の基である、請求項1に記載の方法。
- 上記官能基がアミン基、亜硫酸基、スルホニル基、トレシル基、アルキル基、芳香族基、シロキサン基、またはフッ素化基である、請求項1に記載の方法。
- 上記芳香族基がフェニル基である、請求項3に記載の方法。
- 上記アルキル基がブチル基である、請求項3に記載の方法。
- 上記官能基がアミン基である、請求項1に記載の方法。
- 上記アミン基が1級アミン基、2級アミン基、3級アミン基、または4級アミン基である、請求項6に記載の方法。
- 上記4級アミン基がジエチルアミノエチル基、ジメチルアミノエチル基またはトリメチルアミノエチル基である、請求項7に記載の方法。
- 上記官能基が
a)-OCH2-CHOH-CH2NH2;
b)-C6H5;
c)-(CH2)3-CH3;
d)-CH2-CH2-N+H(C2H5)2;
e)-SO2-CH2-CF3;
f)-CH2-CH2-N+H(CH3)2;
g)-CH2-CH2-N+(CH3)3;または
h)-SO3 2-
を含む、請求項1に記載の方法。 - 上記マトリックスがポリメタクリレートまたはメタクリレートである、請求項1に記載の方法。
- 上記マトリックスがFRACTOGEL(登録商標)EMD、TOYOPEARL(登録商標)、またはTSK-GEL(登録商標)ポリマーマトリックスである、請求項1に記載の方法。
- 上記ポリマーマトリックスがTOYOPEARL(登録商標)アミノ650である、請求項11に記載の方法。
- 上記プリオンタンパク質がPrPc、PrPsc、PrPrまたはPrPresである、請求項1に記載の方法。
- 上記ポリマー性プリオンタンパク質結合物質がクロマトグラフィカラム中に、膜、繊維、ビーズ上に、不織メッシュに含浸されて、繊維をコーティングして、フィルターハウジング内に含有されて、またはそれらの組合せで存在する、請求項1に記載の方法。
- 上記サンプルが生体サンプル、食品、環境サンプル、または水サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 上記生体サンプルがヒトまたは動物由来である、請求項15に記載の方法。
- 上記動物がウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはシカ科(Cervidae)動物である、請求項16に記載の方法。
- 上記プリオンタンパク質がヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウス、またはシカ科(Cervidae)動物のプリオンタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 上記生体サンプルが血液由来のサンプル、脳由来のサンプル、体液サンプル、コラーゲン抽出物;腺抽出物、組織ホモジネートまたは抽出物である、請求項18に記載の方法。
- 上記体液が血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、乳、管液、涙、または精液である、請求項19に記載の方法。
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